Gonzalo Gonzlez Silva - Operaciones Bsicas de Laboratorio M1

PRCTICA 7: CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

RESUMEN
Se trata de familiarizar al alumno con los fundamentos de la cromatografa, y con las
manipulaciones que se realizan en la cromatografa en capa fina.
INTRODUCCIN
La cromatografa se utiliza para separar componentes de una mezcla homognea. En este tipo
de tcnicas existen dos fases en contacto, la fase mvil y la fase estacionaria. La estacionaria
est formada por un slido finamente dividido, o por un lquido retenido sobre un slido, y la
mvil est compuesta por un lquido o un gas que fluye por los poros de la fase estacionaria.
En nuestra prctica utilizaremos una fase estacionaria en forma de una fina pelcula
depositada sobre un sustrato (aluminio, plstico o vidrio), tcnica denominada como
cromatografa en capa fina. El flujo de la fase mvil ocurre gracias a las fuerzas capilares, que
impulsan el lquido a travs de la red de microcanales de la fase estacionaria.
Los componentes de la mezcla tienen una afinidad distinta por cada una de las fases. Tendern
a repartirse entre las dos fases en una proporcin dada por el valor de la constante del
equilibrio de intercambio (K). Una vez repartidos los componentes, la separacin se produce
gracias al efecto de retencin de la fase estacionaria sobre los componentes que estn en
contacto, y el efecto de desplazamiento propio de la fase mvil sobre esos componentes que
se encuentran disueltos. Cuanto mayor sea la afinidad de un componente por la fase
estacionaria, ms tiempo pasar en contacto con esta, sin moverse, y tardar ms en recorrer
una distancia dada sobre dicha fase. Al desplazamiento de los componentes a lo largo de la
fase estacionaria, arrastrados por la fase mvil, se le llama elucin.
En la cromatografa en capa fina se hace uso de las diferencias entre las constantes del
equilibrio de adsorcin/desorcin de los componentes. Se emplea una fase estacionaria slida
(adsorbente) de carcter polar, y una fase mvil lquida (eluyente) de polaridad variable. El
adsorbente es un slido poroso granulado, que tiene centros polares aptos para adsorber las
molculas polares de la mezcla (uno de los adsorbentes ms utilizados es el gel de slice). La
fase mvil ser un disolvente en el que los componentes debern ser solubles. La velocidad de
elucin se incrementa al aumentar la polaridad de la fase mvil. En resumen, los solutos ms
polares quedan retenidos, ya que se adsorben mejor sobre la fase estacionaria, mientras que
los no polares eluyen con mayor facilidad. Para desplazar a los componentes polares har falta
utilizar disolventes muy polares.
A continuacin, se detallarn todos los pasos para realizar correctamente la cromatografa en
capa fina:
En la fase estacionaria se seala con un lpiz tantos puntos como muestras se vayan a
emplear, todos ellos a una altura de 1 cm desde la base de la placa.
Se disuelve la muestra a analizar en un disolvente, a ser posible voltil.
Utilizando las pipetas Pasteur, se aade una gotita de la disolucin en los puntos
sealados anteriormente. Despus desecharemos estas pipetas.
Se introduce la placa en la cubeta, apoyndose en la pared para que quede inclinada.
Se cierra la cubeta y se deja en reposo para que eluya.
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Una vez el frente del disolvente est cerca del borde superior de la placa, la sacaremos
y haremos una seal con un lpiz del supuesto frente.
Si los compuestos son coloreados, marcaremos con lpiz las manchas que se originan.
En caso contrario, utilizaremos un agente revelador, con el que conseguiremos
colorear los productos.
Una vez hemos hecho todo esto, determinaremos el R
f
(rate factor) de cada
compuesto, que relaciona las distancias recorridas por cualquier compuesto y la
distancia recorrida por el disolvente, y tiene un valor caracterstico para cada
compuesto en unas condiciones cromatogrficas dadas. Para calcular R
f
se tiene que:

Cuanto ms polar es un compuesto, ms retenido queda en el adsorbente polar y
menos ser su R
f
. Tambin tenemos que un incremento en la polaridad del eluyente
aumentar su desplazamiento, y por tanto su R
f
ser mayor.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Dividiremos la prctica en dos partes:
a. Mezcla de colorantes (Rodamina B, Fluorescena y azul de metileno)
Preparamos 12 mL de una mezcla de acetona/etanol/agua (3:2:1), y lo aadiremos a la
cubeta, la cual taparemos. Marcaremos 4 puntos en la placa cromatogrfica, una para
cada compuesto: la primera para el Azul de Metileno, la segunda para la Rodamina B, la
tercera para la Fluorescena, y la cuarta para una mezcla de los tres.
Una vez preparada la placa, la introducimos en la cubeta y volvemos a cerrarla. Una vez el
frente haya alcanzado la cercana del borde superior sacamos la placa y marcamos con un
lpiz el frente del eluyente. Ahora mediremos la altura alcanzada por el eluyente y los
distintos colorantes, y calcularemos los valores de R
f
:
1. Azul de Metileno:

2. Rodamina B:

3. Fluorescena:

4. Mezcla de los tres colorantes: presentan
los mismos valores de R
f
que los colorantes
individualmente.
b. Mezcla de aminocidos
Haremos lo mismo que en la primera parte de la prctica, pero en vez de usar colorantes,
esta vez utilizaremos aminocidos. Para ello, prepararemos tres eluyentes diferentes: 11
mL de acetonitrilo/agua (10:1), 14 mL de acetonitrilo/agua/hidrxido amnico
concentrado (5:1:1) y 13 mL de acetonitrilo/agua/hidrxido amnico concentrado (5:3:5).
Vertemos cada eluyente en una cubeta distinta.
Ahora tenemos que preparar tres placas con cuatros gotas en cada una: la primera ser
de L-arginina, la segunda de L-alanina, la tercera de L- prolina y una cuarta que ser un
aminocido problema, el cual deberemos de averiguar de cul de los tres anteriores se
trata, buscando el que su R
f
sea ms prximo. Ya preparadas las placas, las introducimos
cada una en una cubeta y repetimos los pasos que hicimos antes con las placas de
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colorantes. Una vez sacamos las placas, las rociamos con la disolucin de ninhidrina
(agente revelador) y calentamos en la estufa para acelerar el revelado. Determinamos los
valores de R
f
:
a. Primer eluyente:
1. L-arginina:

2. L-alanina:

3. L-prolina:

4. Aminocido problema 5:

b. Segundo eluyente:
1. L-arginina:

2. L-alanina:

3. L-prolina:

4. Aminocido problema 5:

c. Tercer eluyente:
1. L-arginina:

2. L-alanina:

3. L-prolina:

4. Aminocido problema 5:

Una vez tenemos hecho todos los clculos, podemos determinar que el aminocido problema
5 se trata de L-prolina, ya que tiene valores de R
f
similares.
CONCLUSIN
Con los resultados obtenidos podemos deducir que:
1. Teniendo en cuenta los valores de R
f
de la primera placa, podemos deducir que: el Azul
de Metileno se trata de un compuesto polar, la Rodamina B es polar pero en menor
cantidad, y la fluorescena es muy poco polar o apolar.
2. Fijndonos en la tercera placa, observamos que la L-arginina es polar porque eluye
menos que los otros dos aminocidos, que son apolares.
3. Una vez conocido esto, clasificamos la polaridad de los eluyentes teniendo en cuenta
que a mayor polaridad del eluyente, mayor ser el desplazamiento recorrido de los
aminocidos en la placa, y por tanto, mayor sern sus valores de R
f
. Ordenando los
eluyentes de mayor a menos polaridad nos queda: tercer eluyente > segundo eluyente
> primer eluyente.