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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR


ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET
SCIENCES DE LA TERRE ET DE LUNIVERS
Dpartement des Sciences de la Nature et de la Vie
Mmoire
Prsent par GACEM Mohamed Amine
En vue de lobtention du Diplme de Magister en biologie
Option : Microbiologie applique.
THEME:
Soutenu publiquement le : 01/12/2011
Devant le jury:
Mr OULD EL HADJ M.D. Prof U.K.M. Ouargla Prsident
Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. MCa U.K.M. Ouargla Encadreur
Mme BISSATI S. MCa U.K.M. Ouargla Examinateur
Mme SIBOUKEUR O. MCa U.K.M. Ouargla Examinateur
Mr GACEMI A. MAa U.M.T. Saida Invit
Contribution ltude de lactivit antifongique et
antimycotoxinogne des extraits mthanolique et aqueux des
graines de Citrullus colocynthis sur la croissance de quelque
moisissure daltration de bl tendre stock.
Anne universitaire : 2011 / 2012


Remerciements
Le prsent travail est ralis au laboratoire de Protection Des Ecosystmes En Zones Arides Et
Semi-Arides de luniversit de Ouargla et au laboratoire de Microbiologie de luniversit de
Saida.
Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, de mavoir donn la force et la patience
pour achever ce travail.
Jexprime dabord mes profonds remerciements et ma vive reconnaissance Mme OULD EL
HADJ- KHELIL- Aminata, Matre de confrences A la facult des Sciences de la Nature et
de la Vie et Sciences de la Terre et de lUnivers, Universit de Ouargla pour avoir encadr et
dirig ce travail avec une grande rigueur scientifique. Sa disponibilit, ses conseils et la
confiance quelle ma accord mont permis de raliser ce travail.
Je tiens exprimer galement ma profonde reconnaissance Mr GACEMI Abou Abd Allah
Matre assistant A l'universit de Saida pour sa contribution la ralisation de ce travail et
ses prcieux conseils quil trouve ici mes sincres remerciements.
Jadresse mes sincres remerciements Mr OULD EL HADJ Mohamed Didi, Professeur
l'Universit de Ouargla davoir accept de prsider le jury de ma soutenance.
Jexprime mes vifs remerciements Mme SIBOUKEUR Oumlkhir et Mme BISATI Samia
Matres de confrences A lUniversit de Ouargla pour lhonneur quelles nous ont fait en
acceptant dexaminer ce mmoire.
A Mr ADLI Djelel, Matre assistant l'universit de Saida et Mr AZZIZ Rachid Matre
assistant l'universit de Tlemcen qui m'ont accueilli au sein de leurs laboratoires de
substances bioactives et activits antifongiques et qui ont mis ma disposition les conditions
matrielles ncessaires pour la ralisation de ce travail tout au long de la priode de
recherche. Quils trouvent ici mon respect et ma reconnaissance.

Table des matires
Page
Liste des abrviations I
Liste des figures II
Liste des photos III
Liste des tableaux IV
Rsum V
Abstract VI
VII
Introduction 01
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.
I. Bl tendre et facteurs daltration 03
I. 1. Classification du bl tendre 03
I. 2. Utilisation du bl tendre 04
I. 3. Varits de bl tendre cultives en Algrie 04
I. 4. Structure et composition du grain de bl tendre 05
I. 4.1. Structure du grain de bl tendre 05
I. 4.2. Composition du grain de bl tendre 05
I. 5. Stockage du bl tendre 06
I. 5.1. Stockage traditionnel du bl en Algrie 06
I. 5.2. Stockage du bl en silos 07
I. 5.3. Autres mthodes de stockage 07
a- Stockage en gerbes 07
b- Stockage en pis 07
c- Stockage des grains avec leurs balles 07
I. 6. Traitements obligatoires pour une bonne conservation 07
I. 6.1. Triage et nettoyage des grains 08
I. 6.2. Nettoyage des locaux 08
I. 7. Facteurs daltration du bl tendre 08
I. 7.1. Altrations enzymatiques 08
I. 7.2. Altration dorigine mcanique ou physique 09
I. 7.3. Altration dorigine biologique 09
a- Les macro organismes 09
b- Les microorganismes 10
b1- Moisissures des crales 11
- Myctes de champ 11
- Myctes de stockage 11
- Flore intermdiaire 12
I. 8. Effets nfastes des altrations 12
II. Mycotoxines et cotoxignse 13
II. 1. Mycotoxines 13
II. 1.1. Aflatoxines 14
a- Dfinition et structure chimique 14
b- Proprits physico-chimiques des Aflatoxines 14
c- Profil toxicologique de laflatoxine 15
c1- Hpatotoxicit 15

c2- Gnotoxicit et Mutagnicit 15
c3- Immunotoxicit 16
c4- Tratognicit 16
c5- Effets antibactriens 16
II. 1.2. Ochratoxines 16
a- Dfinition et structure chimique 16
b- Proprits physico-chimiques de lOchratoxine A 17
c- Profil toxicologique de lochratoxine A 17
c1- Nphrotoxicit 17
c2- Gnotoxicit 17
c3- Immunotoxicit 17
c4- Tratognicit 18
c5- Neurotoxicit 18
c6- Cancrogense 18
II. 2. Ecotoxignse 18
II. 2.1. Biosynthse des mycotoxines 18
II. 2.2. Facteurs de biosynthses 19
a- Facteurs physiques (facteurs extrinsques) 19
a1- Temprature 19
a2- Activit de leau (A
w
) 19
a3- pH 20
a4- Endommagement des grains 20
b- Facteurs chimiques (facteurs extrinsques) 20
b1- Composition gazeuse 20
b2- Traitements agricoles 20
b3- Nature du substrat 20
c- Facteurs biologiques (facteurs intrinsques) 20
II. 3. Mtabolisme des aflatoxines dans lorganisme 21
III. Gnralits sur les plantes mdicinales 22
III. 1. Facteurs de variabilit des substances bioactives dans les plantes mdicinales 22
III. 1.1. Influence du cycle vgtatif 22
III. 1.2. Influence des facteurs extrinsques 22
III. 1.3. Influence de la rcolte du matriel vgtal 22
III. 1.4. Influence des transformations du matriel vgtal 23
III. 1.5. Influence des hybridations 23
III. 1.6. Influence du procd dobtention 23
III. 2. Prsentation de la coloquinte 23
III. 2.1. Noms vernaculaires 23
III. 2.2. Taxonomie 24
III. 2.3. Description morphologique 24
III. 2.4. Rpartition gographique 24
III. 2.5. Actions thrapeutiques 25
III. 2.6. Composition chimique 25
a- Flavonodes 26
b- Saponosides 26
c- Alcalodes 36
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. Matriel et mthodes 27

I. 1. Matriel vgtal 27
I. 1.1. Bl tendre local et import 27
I. 1.2. Fruit de Citrullus colocynthis 27
I. 2. Matriel fongique 27
I. 3. Mthode dchantillonnage 28
I. 3.1. Prcautions dchantillonnage 28
I. 4. Etude de la qualit physicochimique, microbiologique et mycotoxicologique du bl
tendre local et import
29
I. 4.1. Etude de la qualit physicochimique du bl tendre local et import 29
a- Dtermination du pourcentage des grains briss (tat physique des grains) 29
b- Dtermination de lhumidit 29
c- Mesure du pH 29
I. 4.2. Etude de la qualit microbiologique du bl tendre local et import 29
a- Dnombrement de la flore fongique 29
b- Identification des moisissures 30
b1- Identification des genres de moisissures 31
- Identification des genres par la technique de scotch 31
- Identification des genres par la technique de micro-culture 31
b2- Identification des espces Aspergillus et Penicillium 31
- Identification des espces Aspergillus 31
- Identification des espces Penicillium 32
I. 4.3. Analyses mycotoxicologiques 32
a- Dtection visuelle des souches productrices de mycotoxine 32
b- Dtection des mycotoxines par la chromatographie sur couche mince (CCM) 33
c- Dtection des mycotoxines au niveau du substrat 33
I. 5. Prparation des extraits et tude phytochimique 34
I. 5.1. Dtermination de la teneur en eau des graines de Citrullus colocynthis 34
I. 5.2. Prparation des extraits mthanolique et aqueux 34
a- Extraction au mthanol 34
b- Extraction par macration leau 35
I. 5.3. Dtermination du rendement des extraits secs 35
I. 5.4. Tests phytochimiques 35
a- Dtection des polyphnols 36
a1- Dtection des tanins 36
a2- Dtection des coumarines 36
a3- Dtection des anthocyanes 36
a4- Dtection des flavonodes 36
a5- Dtection des anthraquinones 36
a6- Dtection des saponosides 36
b- Dtection des terpnes 37
b1- Dtection des strodes 37
c- Dtection des alcalodes 37
I. 6. Essai dactivit biologique des extrait mthanolique et aqueux 37
I. 6.1. Souches fongiques testes 37
I. 6.2. Prparation des pr-cultures 37
I. 6.3. Essai dactivit antifongique par la mthode de micro-dilution en milieu solide 38
I. 6.4. Test d'activit antimycotoxinogne 39
II. Rsultats et discussions. 40
II. 1. Qualit physicochimique et microbiologique du bl tendre local et import 40
II. 1.1. Qualit physicochimique du bl tendre local et import 40

a- Pourcentage des grains casss (tat physique des grains) 40
b- Humidit (H) 40
c- pH 40
II. 1.2. Qualit microbiologique du bl tendre local et import 41
II. 1.3. Identification des moisissures 41
a- Genres fongiques identifis par la mthode de micro-culture et de Scotch 41
b- Espces fongiques identifies par la mthode de Single spore 42
II. 1.4. Dnombrement de la flore fongique 45
II. 1.5. Rvlation mycotoxicologiques 48
a- Rvlation des souches productrices de mycotoxines par milieu CEA 48
b- Rvlation des souches productrices de mycotoxines par CCM 48
c- Rvlation des mycotoxine au niveau des substrats 48
Discussion 49
Conclusion 52
II. 2. Etude phytochimique des graines de Citrullus colocynthis 53
II. 2.1. Taux dhumidit des graines de Citrullus colocynthis 53
II. 2.2. Rendements des extractions mthanoliques et aqueuses 53
II. 2.3. Tests phytochimiques des extraits des graines de Citrullus colocynthis 54
Discussion 54
Conclusion 56
II. 3. Activit biologique des extraits mthanolique et aqueux 57
II. 3.1. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux 57
a- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus flavus 58
b- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus fumigatus 59
c- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus niger 60
d- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus ochraceus 61
II. 3.2. Activit antimycotoxinogne des extraits mthanolique et aqueux 62
a- Effet des extraits mthanolique et aqueux sur la biomasse fongique forme 62
b- Effet des extraits mthanolique et aqueux sur la synthse de lAFB1 et lOTA 63
Discussion 63
Conclusion 66
Conclusion gnrale et perspectives 68
Rfrences bibliographiques 70
Annexe
I
Liste des abrviations.
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
AFM1
AFNOR
AGPI
A
max
A
w
CCM
CEE
CMF
Da
DMSO
Eaq
EMeOH
HR
IANF
MeOH
Milieu AFPA
Milieu CDA
Milieu CEA
Milieu CYA
Milieu DRBC
Milieu G25N
Milieu MEA
Milieu PDA
Milieu PDAa
Milieu YES
OAIC
OEPP
OTA
OTB
OTC
PM
ppb
Rd
RF
UF
UV

Aflatoxine Blue 1.
Aflatoxine Blue 2.
Aflatoxine Green 1.
Aflatoxine Green 2.
Aflatoxine Milk 1.
Association franaise de normalisation.
Acide gras polyinsatur.
Absorbance maximale.
Activit de leau.
Chromatographie couche mince.
Communaut conomique europenne.
Concentration minimale fongicide.
Dalton.
Dimthylsulfoxyde.
Extrait aqueux.
Extrait mthanolique.
Humidit relative.
Indice antifongique.
Mthanol.
Milieu Aspergillus Flavus Parasiticus Agar.
Milieu Czapek Dox Agar.
Milieu Coconut Extract Agar.
Milieu Czapek Yeast Agar.
Milieu Dichloran Rose Bengal Chlorottracycline.
Milieu Glycrol Nitrate Agar.
Milieu Malt Extract Agar.
Milieu Potatoes Dextrose Agar.
Milieu Potatoes Dextrose Agar acidifi.
Milieu Yeast Extract Sucrose.
Office algrien interprofessionnel des crales.
Organisation europenne et mditerranenne pour la protection des plantes.
Ochratoxine A.
Ochratoxine B.
Ochratoxine C.
Poids molculaire.
Partie par billion.
Rendement.
Facteur de rtention.
Unit fongique.
Ultra-violet.
Coefficient de distinction molaire.
II
Liste des figures.
page
Figure 01. Coupe schmatique d'un grain de bl 05
Figure 02. Structure chimique des aflatoxines 14
Figure 03. Structure chimique des ochratoxines 16
Figure 04. Voies de biosynthse des mycotoxines 18
Figure 05. Biotransformation de laflatoxine dans lorganisme humain 21
Figure 06. Schma des diffrentes parties de Citrullus Colocynthis 24
Figure 07. Situation des diffrentes stations de prlvements des chantillons 27
Figure 08. Techniques disolement et de dnombrement des souches fongiques 30
Figure 09. Inoculation des isolats dAspergillus (sur les diffrents milieux de cultures) 32
Figure 10. Inoculation des isolats de penicillium (sur les diffrents milieux de cultures) 32
Figure 11. Procd dextraction des mycotoxines 33
Figure 12. Procd dextraction des mycotoxines partir du substrat solide 34
Figure 13. Prparation de la poudre des graines de Citrullus colocynthis 34
Figure 14. Extraction mthanolique partir des graines de Citrullus colocynthis 35
Figure 15. Extraction aqueuse partir des graines de Citrullus colocynthis 35
Figure 16. Schma des tests phytochimiques pour la dtection des polyphnols 36
Figure 17. Schma du test phytochimique pour la dtection des strodes 37
Figure 18. Schma du test phytochimique pour la dtection des alcalodes 37
Figure 19. Dtermination de la CMF des extraits des graines de Citrullus colocynthis 38
Figure 20. Moyennes des grains casss des chantillons de bl tendre local et import 40
Figure 21. Humidit relative moyenne des chantillons de bl tendre local et import 40
Figure 22. pH moyen des chantillons de bl tendre local et import 40
Figure 23. Moyennes de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu PDA 45
Figure 24. Moyennes de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu PDA 45
Figure 25. Moyennes de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu CDA 46
Figure 26. Moyennes de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu CDA 46
Figure 27. Moyennes de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu DRBC 47
Figure 28. Moyennes de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu DRBC 47
Figure 29. Humidit relative de la poudre des graines sches de Citrullus colocynthis 53
Figure 30. Rendements des extractions mthanolique et aqueuse 53
Figure 31. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus flavus 58
Figure 32. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus
fumigatus
59
Figure 33. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus niger 60
Figure 34. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus
ochraceus
61
Figure 35. Biomasses fongiques formes par Aspergillus flavus et Aspergillus ochraceus
en prsence et en absence dextrait mthanolique
62
Figure 36. Biomasses fongiques formes par Aspergillus flavus et Aspergillus ochraceus
en prsence et en absence dextrait aqueux
62
III
Liste des photos.
page
Photo 01. Sige de loffice algrien interprofessionnel des crales de la wilaya de Saida 27
Photo 02. Fruit de Citrullus colocynthis 27
Photo 03. Mthode didentification microscopique des moisissures 31
Photo 04. Micro-culture des moisissures pour lidentification microscopique 31
Photo 05. Dnombrement des souches fongiques sur les milieux disolements 41
Photo 06. Aspect microscopique des souches dAspergillus et de Penicillium 42
Photo 07. Identification des espces Penicillium par la mthode de Single Spore 43
Photo 08. Identification des espces Aspergillus par la mthode de Single Spore 44
Photo 09. Dtection sous UV des souches productrices de mycotoxines sur milieu CEA 48
Photo 10. Dtection des souches productrices de mycotoxines par CCM 48
Photo 11. Dtection de mycotoxines du bl tendre local et import 48
Photo 12. Extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis 53
Photo 13. Effet du DMSO sur les diffrentes souches fongiques 57
Photo 14. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus flavus 58
Photo 15. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus flavus 58
Photo 16. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus fumigatus 59
Photo 17. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus fumigatus 59
Photo 18. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus niger 60
Photo 19. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus niger 60
Photo 20. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus ochraceus 61
Photo 21. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus ochraceus 61
Photo 22. Activit antimycotoxinogne des extraits des graines de Citrullus colocynthis 63










IV
Liste des tableaux
page
Tableau 01. Classification du bl tendre 03
Tableau 02. Composition chimique dun grain de bl tendre 05
Tableau 03. Principaux genres bactriens rencontrs sur le grain du bl tendre 10
Tableau 04. Moisissures et mycotoxines retrouves dans certains aliments 14
Tableau 05. Proprits physicochimiques des aflatoxines 15
Tableau 06. Activit de leau optimale pour la croissance de certaines espces
dAspergillus sp et de Penicillium sp
19
Tableau 07. Origines et dates de prlvements des chantillons 27
Tableau 08. Identification des espces Penicillium par la mthode de Single Spore 43
Tableau 09. Identification des espces Aspergillus par la mthode de Single Spore 44
Tableau 10. Tests phytochimiques effectus sur les extraits mthanoliques et aqueux des
graines de Citrullus colcoynthis
54


















V
Rsum
Contribution ltude de lactivit antifongique et antimycotoxinogne des extraits
mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis sur la croissance de quelque
moisissure daltration de bl tendre stock.
Les extraits de plantes et leurs constituants ont une longue histoire comme agents
antifongique. Cependant, leur utilisation comme prservateurs de bl tendre a t rarement
rapporte. Ce travail porte sur ltude in vitro de lactivit antifongique et antimycotoxinogne
des extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis (L.) Schard, une plante
aromatique et mdicinale de la flore du Sahara algrienne, vis--vis de quelques champignons
pathognes de contamination de bl tendre stock.
Ltude de la qualit du bl tendre local et import a montr que le taux de contamination
de la varit importe est trs lev. Le genre Aspergillus reprsent par des espces diffrentes a
t retrouv dans les deux varits analyses avec une frquence et une abondance allant de 41
plus de 86% de la flore totale identifie sur milieu CDA et PDA. Les genres Penicillium et
Alternaria sont peu frquents. Enfin, Les genres Cladosporium, Ulocladium et Fusarium sont les
moins abondants dans les deux varits de bl tendre analys. Parmi ces moisissures au moins
deux espces du genre Aspergillus sont potentiellement toxinognes.
Lanalyse phytochimique des extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus
colocynthis a rvl la prsence de quelques groupes chimiques (polyphnols totaux, strodes et
alcalodes) susceptibles dexprimer les activits antifongiques recherches. Lactivit
antifongique des extraits est teste par la mthode de micro-dilution en milieu solide afin de
calculer lindice antifongique. Les rsultats suggrent que lextrait mthanolique a empch
totalement la croissance myclienne dA. fumigatus et A. niger avec une CMF de 2.5%
(25mg/ml) et A. ochraceus avec une CMF de 0.5% (5 mg/ml) enregistrant un indice antifongique
de 100%. A la mme concentration 2.5% (25mg/ml) lextrait aqueux a inhib la croissance dA.
ochraceus. Les deux extraits possdent un bon pouvoir antimycotoxinogne. La synthse
dAFB1 et dOTA produites par A. flavus et A. ochraceus est bloque en prsence des extraits
dans le milieu YES. Les rsultats montrent que les extraits mthanolique et aqueux des graines
de Citrullus colocynthis utiliss faible concentration pourraient avoir un potentiel important
pour le contrle biologique des champignons dans les denres alimentaires.
Mots cls : Bl tendre, Citrullus colocynthis, extrait aqueux, extrait mthanolique, analyse
phytochimique, indice antifongique, pouvoir antimycotoxinogne.
VI
Abstract
Contribution to study of the antifungal and antimycotoxigenic activity of methanol
and aqueous extract of seeds of Citrullus colocynthis against some fungi isolated from wheat
stored.
Plant extracts and their constituents have a long history as antifungal agents. However,
their use to preserve wheat has rarely been reported. This work is based on in vitro study of the
antifungal and antimycotoxinognic activity of methanol and aqueous extracts of the seeds of
Citrullus colocynthis (L.) Schard, an aromatic and medicinal plant of the flora of the Algerian
Sahara, against some pathogenic fungi contaminated the stored wheat.
The study of the quality of local and imported wheat has shown that the rate of
contamination of the imported variety is very high. The genus Aspergillus represented by
different species was found in two varieties which had been analyzed with a frequency and an
abundance ranging from 41 to more than 86% of the total flora in CDA and PDA. Whereas
Penicillium and Alternaria are uncommon. Finally, the genus Cladosporium, Fusarium and
Ulocladium are less abundant in the wheat varieties analyzed. Among these molds at least two
species of the genus Aspergillus are potentially toxigenic.
The phytochemical analysis of methanol and aqueous extracts of the seeds of Citrullus
colocynthis revealed the presence of some chemical groups (total polyphenols, steroids and
alkaloids) that can express the desired antifungal activities. To calculate the index antifungal, the
antifungal activity of extracts was tested by the method of micro-dilution in a solid medium. The
results suggest that the methanol extract has completely inhibited mycelial growth of A.
fumigatus and A. Niger with MFC = 2.5% (25mg/ml) and A. ochraceus with MFC = 0.5% (5 mg
/ ml), the index antifungal is 100%. At the same concentration of 2.5% (25mg/ml) the aqueous
extract inhibited mycelial growth of A. ochraceus. Both extracts have good power
antimycotoxinognic. The synthesis of AFB1 and OTA is blocked in the presence of extracts in
the mid YES. The results show that the methanol and aqueous extracts of the seeds of Citrullus
colocynthis used at low concentrations can have great potential for biological control of fungi in
food.
Key words: wheat, Citrullus colocynthis, aqueous extract, methanol extract, phytochemical
analysis, index antifungal, antimycotoxinognic power.

VII








Aspergillus
% 41 % 86 CDA PDA Penicillium
Alternaria Cladosporium Ulocladium Fusarium

Aspergillus



A.fumigatus A.niger 2.5 % ) 25 ( A.ochraceus
0.5 % ) 5 ( 2.5 % ) 25 (
A . ochraceus OTA 1 AFB
A.ochraceus A.flavus YES


:















o


1
Introduction
Les graines de crales constituent, depuis toujours, la principale ressource alimentaire de
lHomme et de lanimal et possdent un pouvoir nutritionnel important. Dans la plupart des cas,
la production des crales est assure par une seule rcolte dans lanne alors que la
consommation est prolonge toute au long de lanne, do la ncessit du stockage.
Malheureusement, de nombreux agents de dtriorations (vertbrs, insectes, moisissures,
acariens,) sont la cause de la perte dune grande partie des rcoltes de crales. Les
moisissures et leurs mtabolites secondaires entranent, lchelle mondiale, des pertes de
crales et leurs drives estimes de 5 10% (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).
La scrtion des mtabolites secondaires hautement toxiques, par les champignons
mycotoxinognes au cours de leur prolifration sur les crales stockes, constitue un danger rel
pour la scurit sanitaire de l'Homme et de l'animal. En Angleterre, en 1960, l'ingestion dune
farine importe du Brsil, contamine par Aspergillus flavus a entran la mort brutale d'une
centaine de milliers de volailles. Cet vnement dnomm autrefois tout simplement Turkey-
X- Disease a donn le dpart d'une srie d'tudes et de recherches sur les substances actives
labores par les moisissures. Dailleurs, dans la mme anne (1960), le nom daflatoxine est
attribu cette nouvelle toxine (TANTAOUI, 1977).
D'aprs STEYN (1998), les aflatoxines sont scrtes par des souches d'Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus et Aspergillus nomius, alors que pour les ochratoxines, elles sont
labores par Aspergillus ochraceus. Ces mycotoxines sont caractrises par leur fluorescence
sous les rayons UV et par leur thermorsistance (KURTZMAN et al., 1987).
La toxicit chronique des aflatoxines et des ochratoxines survient aprs lingestion rpte
de doses trs faibles de ces mycotoxines. Des rsultats in vivo ont montr que laflatoxine B1
provoque trs frquemment des mutations. Les aflatoxines et les ochratoxines provoquent un
ensemble de pathologies animales surtout chez les animaux qui se nourrissent des crales
contamines (AGUILLAR et al., 1993).
La recherche de nouvelles stratgies de prvention contre les infections et les maladies
dorigine fongique, comporte un intrt majeur, dune part pour la scurit sanitaire des aliments
et la sant du consommateur et dautre part, pour la protection de lconomie du pays.


2
Malgr les tudes multiples sur lutilisation de la coloquinte dans le domaine culinaire et
celui de la mdecine traditionnelle, peu de travaux ont t ralis sur leffet antifongique et
antimycotoxinogne des graines de cette espce.
Lutilisation des substances naturelles dans la lutte contre les moisissures des crales
stockes est lorigine du choix de notre thme qui consiste en lextraction de quelques
mtabolites des graines de Citrullus colocynthis et la recherche de leurs effets antifongiques par
la mthode de micro-dilution en milieu solide sur des souches fongiques potentiellement
toxinogne isoles et identifies partir du bl tendre local et import stock. Lactivit
antimycotoxinogne a t teste seulement sur les souches fongiques productrices daflatoxines
B1 et G1 et dochratoxines A.
Pour se faire, une synthse bibliographique reprsentant la premire partie de notre tude a
t ralise afin de regrouper les informations essentielles sur le bl tendre et les ventuelles
moisissures toxiques pouvant se dvelopper lors de son stockage et une tude sur Citrullus
colocynthis et ses activits biologiques.
Dans la seconde partie de notre tude, la mthodologie est reprsente par les techniques
utilises pour la ralisation de ce travail suivie des principaux rsultats et leurs discussions.
Ltude est acheve par une conclusion gnrale et des perspectives.









































p :
b






























t e
d



3
Etude
I. Bl tendre et facteurs daltration
Les crales sont un groupe de plantes cultives appartenant, botaniquement parlant, la
famille des poaces dont les graines prsentent par leur abondance et leur composition un intrt
majeur pour lalimentation de lHomme et des animaux. Les graines alimentaires appartiennent
une dizaine despces vgtales. Les plus employes sont : le bl, le mas et lorge (REED,
1992).
Le choix de conditions convenables dentreposage des graines de crales pendant des
priodes prolonges revt une grande importance conomique ; cela est particulirement vrai
dans les rgions sous-dveloppes, ou il nest pas rare de perdre prs de 30% de la rcolte du fait
des rongeurs, des insectes et dautres facteurs de dtrioration (DRUVEFORS, 2004).
De mauvaises conditions dentreposage peuvent provoquer divers phnomnes
indsirables. La germination, qui peut intervenir une fois termine la priode de dormance,
entraine une protolyse et une amylolyse dfavorable en panification. La prolifration de
moisissures provoque non seulement une hydrolyse de glycolipides et de phospholipides, mais
peut donner lieu aussi la formation de mycotoxines (CHEFTEL et CHEFTEL, 1977).
I. 1. Classification du bl tendre
Les principales espces de crales cultives appartiennent la famille des poaces (bl
tendre, bl dur, mas, riz, avoine, seigle, millet, sorgho) ou des polygonaces (sarrasin)
(MOLINIE et al., 2005). Daprs DOUMANDJI et al (2003), le bl tendre appartient la
classification illustr dans le tableau 01.
Tableau 01. Classification du bl tendre (DOUMANDJI et al., 2003).
Classification Bl tendre
Rgne Plantae (Rgne vgtale)
Division Magnoliophyta (Angiospermes)
Classe Liliopsida (Monocotyldons)
S/Classe Commelinidae
Ordre Poale
Famille Poaceae (ex Gramines)
S/Famille Triticeae
Tribu Tritceae (Tritices)
S/Tribu Triticinae
Genre Triticum
Espce Triticum aestivum L. ou Triticium vulgare


4
Etude
I. 2. Utilisation du bl tendre
Le bl est l'origine mme de l'agriculture. Il reste, aprs des millnaires, la premire
plante cultive au monde (DURON, 1999). Il existe deux espces de bl : le bl tendre (Triticum
vulgare) et le bl dur (Triticum durum).
Lespce la plus cultive est le Triticum vulgare qui est celle de tous les bls dits tendres
(CHEFTEL et CHEFTEL, 1977). Il est essentiellement utilis par lindustrie meunire pour la
fabrication de farines destines lalimentation humaine (panification, biscuiterie, ptisserie
etc) et animale (sons) (DURON, 1999).
Lespce Triticum durum ou bl dur renferme une forte teneur en protines (13%). Cette
espce est utilise dune part par les semouleries et les industries de ptes alimentaires et dautre
part, pour en faire des aliments pour les animaux (DURON, 1999).
I. 3. Varits de bl tendre cultives en Algrie
Selon linstitut technique des grandes cultures, 3 4 varits sur une vingtaine de varits
de bl tendre sont cultives en Algrie (DOUMANDJI et al., 2003) ; il s'agit de :
Mahon Demias : C'est un bl introduit par les premiers colons franais en
Algrie. Il est rustique et tardif. Dot dune paille haute, cette varit est semer en
zones sches et sur les sols lgers.
Anza : Dorigine amricaine (Californie), est la varit de bl tendre
connu partout en Algrie. Cest une varit prcoce (plus prcoce que Hidhab), elle est
productive grce son tallage pi lev.
Florence Aurore : C'est une varit obtenue par le Pr. Schribaux. La
varit se caractrise surtout par la prsence de trois arrtes longues bien diffrencies
au sommet de l'pi. Elle est de moins en moins cultive en Algrie.
Hidhab : La varit prcoce paille moyenne et pi long. Elle est
rsistante la verse et la rouille brune. Hidhab prsente de bonnes caractristiques
technologiques pour la panification (DOUMANDJI et al., 2003).


5
Etude
I. 4. Structure et composition du grain de bl tendre
I. 4.1. Structure du grain de bl tendre
Physiologiquement, le grain des poaces est un caryopse blanc ou roux, ovode, pesant de
35 45 mg (le grain est soud aux parois de lovaire) jouant le rle dun fruit renferment une
graine, (cotyldon qui reprsente 82 85% du grain) (GODON, 1991).
Lespce Triticum vulgare est compose de trois parties essentielles (l'enveloppe, l'amande
farineuse et le germe). Chacune de ces parties est forme de rseaux trs complexes qui font
encore l'objet de nombreuses recherches (CHEFTEL et CHEFTEL, 1977).
Le germe qui donne la plantule, lamande appele endosperme ou albumen, tissu de
stockage qui fournit au germe les rserves ncessaires pour sa croissance et les enveloppes
protectrices sont composes par la paroi de la graine (testa) et par la paroi du fruit (pricarpe)
(DOUMANDJI et al., 2003).
La structure des grains de diverses crales est assez semblable. La figure 01 illustre les
diffrentes parties composant une graine de bl.
I. 4.2. Composition du grain de bl tendre
Selon ALAIS et LINDEN (1997) les graines cralires sont surtout amylaces. Le
tableau 02 rsume la composition chimique dun grain de bl tendre.
Tableau 02. Composition chimique dun grain de bl tendre (GODON, 1991 ; CHEFTEL et
CHEFTEL, 1977).
Eau (%)
Glucides
totaux (%)
Matire
protique (%)
Matire
grasse (%)
Matire
minrale (%)
Bl entier 13 68 - 72 10 I,5 - 2 1,7 - 2.1
Enveloppe 13 65 - 68 17 - 19 4 - 5 6 - 7
Amande farineuse 13 74 - 76 9 - 12 0,7 - 1 0,4 - 3
Germe 13 37 - 43 22 - 32 15 - 18 4 - 5
En nutrition humaine, les crales constituent la base de la pyramide alimentaire
puisqu'elles reprsentent la principale source de calories (BOURGEOIS et al., 1996). Ils sont
une source d'nergie car l'amidon est le glucide le plus consommable (CHEFTEL et
CHEFTEL, 1977).


Etude
Figure 01. Coupe schmatique d'un grain de bl (CHEFTEL et CHEFTEL, 1977).
(1) : poils (stigmates). (2) : tguments (corce). Le caryopse est un fruit car l'corce est le rsulat de la fusion des tguments de la
graine et de la paroi de l'ovaire. (3) : albumen. (4) : cotyldon unique. (5) : picotyle (capuchon recouvrant la gemmule). (6) :
premire feuille. (7) : scutelum. (8) : gemmule. (9) : tigelle. (10) : radicule. (11) : coiffe. (12) : colorhize (capuchon recouvrant
la radicule).


6
Etude
Chacune des parties de graine fournit d'importants nutriments. L'endosperme fournit des
glucides, le germe fournit des protines, des acides gras polyinsatur (AGPI) et des vitamines du
groupes B (BOURGEOIS et al., 1996).
Les graines, qui constituent l'organe de rserve des vgtaux, sont donc des corps riches en
glucides (65 85%). La matire azote est la deuxime en importance et se retrouve surtout dans
le germe. Les graines de bl constituent une source importante de protines comprise entre 8% et
14% et notamment un faible pourcentage d'acides amins tels que la lysine, le tryptophane, la
valine et la mthionine. Les lipides des crales ont un rle limit sur le plan nutritionnel, mais
jouent un rle important sur les qualits de gluten. Quant aux facteurs vitaminiques, les grains de
bl renferment une quantit importante de vitamines BI, B2, B6 et la vitamine E (CHEFTEL et
CHEFTEL, 1977).
I. 5. Stockage du bl tendre
La consommation quotidienne est assure par une seule rcolte, quelquefois deux dans
lanne do la ncessit du stockage. En outre, les grains stocks sont utilises comme des
semences en attendant la saison suivante (DRUVEFORS, 2004).
Plus lhumidit des grains est importante la rcolte, plus les conditions sont favorables au
dveloppement des microorganismes. De bonnes pratiques de conservation consistent viter
son altration en contrlant les principaux facteurs de dtrioration (MOLINIE et al., 2005).
Autrement dit, le but des technologies de conservation est de prserver par des moyens
appropris lintgrit des principales qualits des graines qui ne peuvent pas tre amliores
pendant le stockage (CHAWLA, 1984).
Les premiers systmes de stockage taient de grands paniers faits de roseaux ou fioles
d'argiles qui sont enfonces dans le sol, ainsi que des puits, des structures de bois et des puits
garnis de paille (DRUVEFORS, 2004).
I. 5.1. Stockage traditionnel du bl en Algrie
Le paysan algrien, sur les hauts plateaux, conservait surtout le produit de ses champs
dorge et de bl, dans des enceintes creuses dans un sol argileux ; cest ce quon appelle El
matmour ou dans des sacs en toile de jute, entreposs dans divers locaux, magasins ou hangars.
La trop forte humidit et les eaux dinfiltration sont les inconvnients majeurs de cette mthode
de stockage favorisant le dveloppement des moisissures et les phnomnes de fermentations
bactriennes (DOUMANDJI et al., 2003).


7
Etude
I. 5.2. Stockage du bl en silos
De nos jours, les silos permettent de stocker les diffrents types de crales en mme
temps ; ils sagit de multi-produits (DURON, 1999). Ce sont des enceintes cylindriques en bton
arm ou en mtal inoxydable. Lemploi des silos rduit la main duvre, augmente laire de
stockage et supprime lutilisation des sacs onreux (DOUMANDJI et al., 2003).
I. 5.3. Autres mthodes de stockage
a- Stockage en gerbes
Cest la mthode traditionnelle applique depuis le haut Moyen age au moins dans presque
toute lEurope non mditerranenne. On peut entasser les gerbes en plein air (gerbiers, meules),
mais cette variante semble plutt rcente (18me sicle) car lusage le plus courant tant le
stockage en grange. En gerbes, le grain est labri de lchauffement et du charanon
(MULTON, 1982).
b- Stockage en pis
Le stockage en pis est une technique trs rpandue pour toutes sortes de crales dans le
monde. Il demande bien moins de volume que le stockage en gerbes, do un cot moindre en
btiments et par consquence le contrle de lambiance du stockage est plus facile (MULTON,
1982).
c- Stockage des grains avec leurs balles
Bien quil soit assez peu frquent, ce mode de stockage nest pas sans intrt. Il semble que
la prsence des balles ralentisse la propagation des insectes ou celle de lchauffement par
rapport ce qui se passe dans le grain en vrac, sans exiger beaucoup de volume supplmentaire.
Le mlange grains-balles est parfois stock en grenier, comme le grain en vrac. Plus souvent,
semble-t-il, il est stock dans un contenant clos, quoiqu parois non tanches au gaz
(MULTON, 1982).
I. 6. Traitements obligatoires pour une bonne conservation
Les bonnes pratiques de conservation des crales consistent maintenir le plus longtemps
possible la qualit du produit en agissant sur les divers facteurs d'altration. Le nettoyage des
grains de bl tendre et des locaux est tant une excellente mesure prventive qui vite la
contamination (COTTY et BHATNAGAR, 1994).


8
Etude
Deux types de traitement sont connus :
Ceux appliqus directement sur les aliments ;
Ceux qui visent limiter les sources de contamination (BOURGEOIS et
al., 1996).
I. 6.1. Triage et nettoyage des grains
Le schage et la dsinfection des grains avant le stockage sont indispensables pour une
bonne conservation. Il sagit de pr-nettoyer les grains lors de la mise en stockage. Le principe
d'aspiration d'air au travers du flux de grains est utilis pour liminer les poussires et les
impurets lgres. Les grains sont ensuite tris et nettoys en choisissant judicieusement la
dimension des grilles (MULTON, 1982).
Il est galement souhaitable d'liminer les grains bless ou cass. La dcontamination
microbiologique de la surface des grains, y compris celle des enveloppes enfouies au sein du silo
est un autre objectif parfois recherch (un nettoyage standard permet de rduire jusqu 60% de
la flore microbienne du grain), de plus, il faut viter de blesser et de casser les grains
(CHEFTEL et CHEFTEL, 1977).
Pour la dsinfection, il est conseill selon MULTON (1982) d'utiliser les acides
organiques tels que l'acide propionique et l'acide formique, qui permettent d'inhiber ( titre
prventif) pendant des dures importantes, les moisissures, sans aucun risque pour le
consommateur.
I. 6.2. Nettoyage des locaux
Le nettoyage des parois des locaux de stockage est une excellente mesure prventive qui
vite la contamination des lots sains. C'est ainsi que les parois des silos, les appareils de transport
devraient tre rgulirement nettoys, en liminant les poussires et les dchets vgtaux et
ventuellement dsinfects en pulvrisant les pesticides tel que les fumignes qui permettent une
lutte biologique et un assainissement immdiat des lots de stockage (MULTON, 1982).
I. 7. Facteurs daltration du bl tendre
I. 7.1. Altrations enzymatiques
Les altrations enzymatiques dues aux enzymes propres aux grains se manifestent de faon
varie. Ce sont dabord des hydrolases, agissant sur les protines, les lipides et les glucides
donnant des produits qui peuvent se dgrader ensuite par autres voies (MULTON, 1982).


9
Etude
Cest ainsi que les lipases librent des acides gras qui sont ensuite oxyds par la
lipoxygnase. Les amylases hydrolysent lamidon en sucres fermentescibles. Il ne faut pas
ngliger cette altration enzymatique car certains produits peuvent tre toxiques tel que les
produits de la fermentation (AFNOR, 1986).
Les ractions de Maillard donnent aussi un grand nombre de composs intermdiaires
(dont lactivit physiologique a t reconnue) aboutissant dans leur stade ultime la formation
de composs bruntres avec une destruction des vitamines B1, E et les carotnodes (AFNOR,
1986).
I. 7.2. Altration dorigine mcanique ou physique
Les altrations dorigine mcanique sont dues des chocs entrainant des cassures et
favorisant les autres causes daltration. Lutilisation des radiations telles que les rayons gamma
et les rayons ultra-violet (UV) peuvent provoquer des altrations radiochimiques tels que la
pyrolyse, redistribution de leau dans le grain et ladhsion de lamidon et des constituants
protiques (AFNOR, 1986).
I. 7.3. Altration dorigine biologique
Un lot de grains entrepos comporte invitablement au moins deux entits vivantes : les
grains eux-mmes et les micro-organismes. De faon non obligatoire, mais cependant frquente,
on y trouve galement associs des insectes, des acariens, voire de petits vertbrs (rongeurs,
oiseaux) (MULTON, 1982).
La microflore des grains est banale, tendance xrophile et cosmopolite. Les bactries, les
levures et les myctes filamenteux constituent un envahisseur interne et/ou contaminant externe
qui font lobjet daltration biologique (MAGAN et al., 2003). Les virus paraissent ngligeables,
et les lichens sont parmi les rares organismes vivants capables de supporter sans dommage une
grande siccit : leurs teneurs en eau se situent entre 5 et 40%, contre 75 97% pour le reste du
monde vivant (MULTON, 1982).
a- Les macro organismes
Divers petits vertbrs rongeurs (souris, rats et oiseaux) peuvent vivre aux dpends des
stocks de grains mal protgs, dont ils peuvent consommer des quantits considrables
(MULTON, 1982). De plus ils peuvent jouer le rle dun vecteur de germes pathognes
provoquant des contaminations et des lsions physiques dans les tissus vgtaux qui favorisent
donc la pntration des spores (JOUANY et YIANNIKOURIS, 2002).


10
Etude
La prsence de la plupart des arthropodes, et singulirement dacariens, est rvlatrice de
mauvaises conditions de conservation. Les acariens vivant sur les grains moisis, rcuprent et
transportent les spores de champignons sur leur corps, mais galement dans leur tube digestif et
leurs fces. Beaucoup dacariens consomment les moisissures, prfrant dailleurs les espces les
plus abondantes (MOLINIE et al., 2005).
Les insectes, endommagent lenveloppe des grains, ce qui favorise la pntration des
moisissures lintrieur de la graine. Quelques insectes dissminent des espces
mycotoxigniques. L o les insectes et les rongeurs sont contrls, les moisissures sont souvent
la cause unique de la dtrioration (MAGAN et al., 2003).
b- Les microorganismes
Les grains fraichement rcolts constituent une niche cologique pour plusieurs types de
bactries (Tableau 03). La population bactrienne est essentiellement constitue par des
eubactries qui renferment une trs forte proportion dentrobactries, notamment de coliformes
qui sont toujours abondantes sur les crales (WITHLOW et HAGLER, 2001).
Tableau 03. Principaux genres bactriens rencontrs sur le grain du bl tendre
(BOURGEOIS et al., 1996).
Familles Genres et espces Pourcentage des grains contamins
Bacillaceae
B.cereus
B.subtilis
18
36
Entrobactriaceae
Acrobacter sp
Escherichia coli
Paracolobacterium sp
54
9
90
Lactobactriaceae
Leuconostoc sp
Lactobacillus sp
Streptococcus sp
9
prsence
prsence
Micrococcaceae
M.candidus
M.caseolyticus
48
48
Pseudomonadaceae Pseudomonas sp
73
Comme pour les bactries, les populations de levures dpendent fortement des conditions
climatiques au moment de la rcolte. Les genres rencontrs sont : Saccharomyces, Candida,
Hansenulaetc. Ces genres ne donnent gnralement lieu qu de faibles niveaux de
contaminations, ne dpassant que rarement quelques centaines de germes par gramme de grain.
Au contraire, des quantits leves de levures sont souvent le signe dune humidit leve
(BOURGEOIS et al., 1996).


11
Etude
Des trs grands nombres de moisissures sont capables de dtriorer les denres
alimentaires. Ces moisissures sont le plus souvent des saprophytes banaux. La mycoflore est
estime entre 200 000 et 300 000 espces (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999). Les plus rpandues
sont les Penicilliums et les Aspergillus qui sont arobies strictes (omniprsentes dans la nature),
htrotrophes, peu exigeantes et possdant un potentiel lev de scrtion denzymes exo-
cellulaires. Ces types de moisissures sont capables de se dvelopper sur toutes sortes de
nourriture : crales, viande, lait, fruits, lgumes, etc (FILTENBORG et al., 1996).
b1- Moisissures des crales
Plus de 150 espces de moisissures filamenteuses ont t trouves sur les grains de crales
comme contaminants extrieures. Les graines sont naturellement en contact avec des spores
fongiques avant, pendant et aprs la rcolte, durant le transport et le stockage. La croissance
fongique est rgie par de nombreux paramtres physico-chimiques, notamment la quantit d'eau
libre (A
w
), la temprature, la prsence doxygne, la nature du substrat et le pH (JOUANY et
YIANNIKOURIS, 2002).
Les moisissures se dveloppant aux champs ncessitent une forte humidit pour leur
croissance (20 25%), alors que les moisissures de stockage sont capables de crotre sur des
substrats contenant de 10 18 % dhumidit (MOLINIE et al., 2005).
Les myctes colonisant le grain ont t classifis dans trois groupes, connus sous le nom de
moisissures de champ, de stockage et la flore intermdiaire (MAGAN et LACEY, 1988).
- Myctes de champ
Les crales sont contamines par des espces rassemblant les moisissures qui simplantent
sur le grain avant la rcolte. La plupart de ces espces appartenant notamment aux genres
Alternaria, Chaetomium, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Helminthosporium,
Trichoderma, etc. Beaucoup de ces champignons sont fortement cellulotiques, provoquant
certaines maladies telle que la fusariose provoque par le Fusarium (AKINSANMI et al., 2004).
- Myctes de stockage
Les facteurs environnementaux peuvent exercer une pression slective influenant la
structure de la communaut et la dominance de quelques espces mycotoxigniques (MAGAN
et al., 2003).


12
Etude
Au cours du stockage en silo, se dveloppe une flore compose de champignons moins
cellulotiques et plus osmophiles, liminant peu peu les champignons du champ et provoquant
une acidification du substrat ; ce sont essentiellement des Aspergillus (A. candidus, A. ochraceus,
A. versicolor), des Eurotiums (E. amstelodami, E. chevalieri, E. repens) et des Penicilliums (P.
cyclopium, P. glabrum, P. spinulosum, P. stoloniferum) ainsi que Absidia, Mucor et Rhizopus.
Lvolution de cette charge fongique sest rvle proportionnelle la teneur en eau et donc
lactivit de leau (lA
w
) (LARPENT, 1990).
- Flore intermdiaire
Une troisime catgorie de moisissures constitue la flore intermdiaire et regroupe des
germes capables dun dveloppement limit, mais qui peuvent prdominer largement en
conditions particulires, tels que ; Cladosporium, Trichoderma et surtout les mucorales comme
Rhiropus, Absidia, Mucor, accompagne avec des levures du genre Candida et Torulopsis
(GODON et LOISEL, 1997).
I. 8. Effets nfastes des altrations
Les grains de crale forment un excellent milieu de culture pour les moisissures. Pendant
le stockage, les crales subissent gnralement une perte de qualit, assure par une infection
des myctes, des insectes et des acariens. Cette dtrioration est caractrise par une diminution
de la germination, une dcoloration, des changements chimiques et nutritionnels, un
durcissement et de mauvais gots qui ont comme consquence le rejet du produit (MILLS,
1990).
Lactivit fongique mne galement aux pertes de matire sche et de la valeur nutritive
ainsi qu des problmes de sant dus la formation des mycotoxines et des spores allergniques
(OLSSON, 2000), et aussi aux modifications des proprits rhologiques du grain (MOLINIE
et al., 2005).
Certaines espces fongiques sont responsables de mycoses et de ractions allergiques chez
lHomme et lanimal. Les effets les mieux connus sont ceux provoqus par Aspergillus
fumigatus responsable daspergillose pulmonaire et de mammites chez les animaux (BAUER et
GARIES, 1987).


e




13
Etude
II. Mycotoxines et cotoxignse
II. 1. Mycotoxines
Ds le moyen ge, les chroniques dcrivent les effets mortels de l'ergot du seigle dont
l'agent causal Claviceps purpurea, est responsable de l'laboration d'une toxine mortelle :
l'ergotamine. Ensuite des tudes permettaient d'isoler du mas contamin par Penicillium, l'acide
pnicillique premire mycotoxine identifie (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).
En Angleterre en 1960, l'ingestion dune farine d'arachide importe du Brsil et
contamine par Aspergillus flavus a entran la mort brutale d'une centaine de milliers de
dindonneaux aprs lapparition des premiers symptmes. Cet vnement dnomm autrefois tout
simplement Turkey-X-Disease a donn le dpart d'une srie d'tudes et de recherches
physicochimiques et toxicologiques sur les substances actives labores par les moisissures.
Ainsi, en 1960, le nom daflatoxine est attribu cette nouvelle matire toxique (MILLER et
TRENHOLM, 1994).
L'enqute ralise l'chelle mondiale montre que 40 % des crales sont contamines par
des mycotoxines (JOUANY et YIANNIKOURIS, 2002).
Les crales peuvent tre contamines plusieurs moments (en plein champ ou lors du
stockage) (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999). Ces toxines sont des mtabolites secondaires
labores par diverses moisissures ( faible poids molculaire PM < 1000 Da). Elles sont trs
stables dans les milieux acides et aux tempratures leves, peu solubles dans leau et
difficilement mtabolises par les organismes vivants (ADEBANJO et BANKOLE, 2003).
La prsence de moisissures ne signifie pas ncessairement la formation de mycotoxines
(PFOHL-LESZKOWICZ, 1999). Il existe des souches produisant des mycotoxines et des
souches qui nen produisent pas ou peu. La plus dangereuse de ces mycotoxines est laflatoxine
B1 (AFB1) cause de ces dgts pathologiques svres, elle est produite par Aspergillus flavus
et Aspergillus parasiticus (GODON et LOISEL, 1997).
Les mycotoxines possdent des effets aigus court terme ainsi que des effets long terme
(MOLL et MOLL, 1995). Elles peuvent tre ingrs, inhals ou absorbs par la peau humaine.
On y trouvera globalement des activits hmorragiques, immunotoxiques, hpatotoxiques,
nphrotoxiques, neurotoxiques, oestrogniques, tratogne ainsi que des effets mutagnes et
cancrognes (ADEBANJO et BANKOLE, 2003).


14
Etude
Les mycotoxines sont produites par 5 genres de champignons : Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Claviceps et Alternaria. Plusieurs sortes de mycotoxines peuvent se retrouver dans les
denres alimentaires (MILLER et TRENHOLM, 1994). Le tableau 04 reprsente les
moisissures et les mycotoxines retrouves dans divers aliments.
Tableau 04. Moisissures et mycotoxines retrouves dans certains aliments (MOLINIE et
al., 2005).
Denres alimentaires Espces toxiques Mycotoxines probables
Bl, Farine, pain, mas,
chips.
Aspergillus flavus, A ochraceus,
Penicillium, Fusarium.
Aflatoxines, Ochratoxine,
Fumonisine.
Viande, viande cuite,
fromage.
Aspergillus flavus,
Penicillium roqueforti.
Aflatoxines,
Acide pnicillique.
Pomme et produits
drivs de pomme.
Penicillium expansum. Patuline.
II. 1.1. Aflatoxines
a- Dfinition et structure chimique
En 1965, laflatoxine tait la premire mycotoxine isole et caractrise. Elle prsente le
profil toxicologique le plus srieux et le plus clbre. Par la suite, des drivs secondaires de
lAFB1 ont t identifis tels que AFB2, AFG1, AFG2 et AFM1 (PFOHL-LESZKOWICZ,
1999). Leurs structures sont reprsentes dans la figure 02.
b- Proprits physico-chimiques des Aflatoxines
Les mycotoxines sont peu soluble dans leau mais trs solubles dans les solvants
organiques. Les aflatoxines sont dgrades par lammoniaque et lhypochlorite de sodium en
formant des composs toxiques (COLE et COX, 1981). Le Poids molculaire (PM), facteur de
rtention (RF) calcul sur gel de silice 60 (0.25 mm), points de fusion et spectre dabsorbtion
sous Ultra-Violet des aflatoxines sont rsums dans le tableau 05.


Etude
Figure 02. Structure chimique des aflatoxines (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).


15
Etude
Tableau 05. Proprits physicochimiques des aflatoxines (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).
Aflatoxines
PM RF Point de fusion C
Spectre
A
max
(nm)

Proprit type
- Cristaux
fluorescents.

- Ces couleurs de
fluorescence sont
lorigine du
nom des
mycotoxines.

B1

312 0.56
268-269 (dcomposition)
(cristallisation dans le
chloroforme).
223
265
362
25 600
13 400
21 800
B2 314 0.53
287-289 (dcomposition)
(cristallisation dans un mlange
de chloroforme et de pentane).
222
265
363
17 000
11 700
23 400
G1 328 0.48
244-246 (dcomposition)
(cristallisation dans un mlange
de chloroforme et de mthanol).
243
257
264
362
11 500
9 900
10 000
16 100
G2 330 0.46
237-239 (dcomposition)
(cristallisation dans une solution
dactate dthyle).
214
265
363
28 100
11 600
21 000
M1 328 0.40
299 (dcomposition)
(cristallisation dans une solution
de mthanol).
226
265
357
23 100
11 600
19 000
c- Profil toxicologique des aflatoxines
L'AFB1 est la plus toxique, suivie par ordre dcroissant de toxicit par l'AFM1, l'AFG1,
l'AFB2 et l'AFG2 (BILGRAMI et SINHA, 1992). L'aflatoxine provoque des toxicits aigus au
niveau de cellules divulgues comme suit :
c1- Hpatotoxicit
Selon NEWBERNE et BUTLER (1969), la toxicit chez le rat dpend de l'ge et du sexe.
Les jeunes rats et les mles sont plus sensibles que les femelles. LAFB1 provoque une ncrose
hpatique au niveau centrilobulaire. Le foie devient enfl, ple, friable et hmorragique.
c2- Gnotoxicit et Mutagnicit
Ladduction des aflatoxines au niveau cellulaire se fait, soit lADN dorigine animale ou
humaine, soit des oligonuclotides. Le site privilgi dadduction est la guanine (KUMAGAI
et al., 1995). Dautres tudes effectues sur le rat ont montr galement que laflatoxine se lie
lalbumine plasmatique (WILD et al., 1986).


16
Etude
c3- Immunotoxicit
Les tudes ont dmontr que des doses relativement importantes en aflatoxine (0,3 - 6 mg /
kg de poids corporel), provoquent une dpression de la rponse immunitaire. L'AFB1 supprime
l'activit du complment C4 et diminue la production des interleukines. Elle provoque aussi une
hypoplasie du thymus (PIER et al., 1980). Une exposition de faibles doses chroniques d'AFB1
augmente la sensibilit de l'individu aux infections (JAKAB et al., 1994).
c4- Tratognicit
Les aflatoxines sont tratognes une dose de 4mg/kg de poids corporel. Durant la
gestation, elle conduit une forte proportion de malformations, voire des avortements.
(ARORA et al., 1981).
c5- Effets antibactriens
LAFB1 est considre par plusieurs auteurs comme un antibiotique vu ses proprits
dinhibition de la croissance bactrienne. LAFB1 bloque la multiplication cellulaire chez les
espces sensibles des concentrations ltales. Alors qu des concentrations subltales, elle
produit des aberrations morphologiques et physiologiques (JAKAB et al., 1994). Les aflatoxines
inhibent la croissance des bactries par inhibition de la synthse ou blocage de la rplication de
lADN et par blocage de la synthse protique (BILGRAMI et SINHA, 1992).
II. 1.2. Ochratoxines
a- Dfinition et structure chimique
Lochratoxine A (OTA) est dcouverte pour la premire fois chez Aspergillus ochraceus
(VAN DER MERVE et al., 1965). Elle est produite par deux genres fongiques : Aspergillus (A.
ochraceus, A. cabonarius, A. niger, etc.) et Penicillium (P. verrucosum, P. nordicum, etc.). Il
existe dautres ochratoxines comme lOTB qui est le driv non chlor de lOTA et lOTC qui
est son ester thylique. L'OTA est la plus rpandue. Elle est plus toxique que lOTB, mais moins
virulente que lOTC (COLE et al., 2003). Leurs structures sont reprsentes dans la figure 03.
LOTA est partiellement dgrade dans des conditions normales de cuisson (MLLER,
1982). Elle est compltement dgrade par un traitement lhypochlorite de sodium (4%)
(CASTEGNARO et al., 1991).


Etude
Figure 03. Structure chimique des ochratoxines (COLE et al., 2003


17
Etude
b- Proprits physico-chimiques de lochratoxine A
LOTA est un acide organique faible une masse molaire de 403,8 g et de structure
cristalline variant de lincolore au blanc. Elle possde une intense fluorescence en lumire UV,
de couleur verte en milieu acide et bleue en milieu alcalin (MILLER et TRENHOLM, 1994).
LOTA est soluble dans les solvants organiques polaires (alcools, ctones, benzne,
chloroforme) mais faiblement soluble dans leau et insoluble dans lther de ptrole et les
hydrocarbures saturs. Cette molcule possde un point de fusion proche de 90C. Ce point
slve 169C lorsquelle est cristallise dans le xylne (IARC, 1993).
Lochratoxine possde une stabilit leve, elle est rsistante lacidit et aux hautes
tempratures. Ainsi, une fois contamines, les denres alimentaires peuvent difficilement tre
dbarrasses de cette molcule. lOTA peut rsister pendant 3 heures un autoclavage de 121C
(TRIVEDI et al., 1992), mme 250C, sa destruction nest pas complte (BOUDRA et al.,
1995).
c- Profil toxicologique de lochratoxine A
c1- Nphrotoxicit
La nphropathie est leffet toxique majeur de lochratoxine A. Cette molcule est
potentiellement nphrotoxique chez tous les mammifres non ruminants (RIBELIN et al.,
1978). Des tudes pidmiologiques effectues au Danemark, ont montr que lOTA joue un rle
majeur dans ltiologie de la nphropathie porcine (ELLING et al., 1985).
c2- Gnotoxicit
LOTA a longtemps t considre comme gnotoxique. Les tests de mutagnicit donnant
des rsultats positifs. Dautres travaux publis confirment que lactivit cytotoxique de lOTA
conduirait des lsions de lADN (HENNING et al., 1991).
c3- Immunotoxicit
LOTA prsente, dans certaines conditions, un effet immunosuppresseur puissant. Cet effet
est observ faible ou forte dose. Des ncroses des tissus lymphodes ont t rapportes,
indiquant la grande sensibilit de ces tissus lOTA, mais aussi une atteinte de limmunit
humorale et cellulaire a t mise en vidence (CREPPY et al., 1991).


18
Etude
c4- Tratognicit
Ladministration dOTA chez lanimal est tratogne. Elle peut traverser le placenta et
provoque des anomalies morphologiques diverses chez les embryons de rat, souris, porc et poulet
(PFOHL-LESZKOWICZ, 1999). Toutefois, la gravit des malformations dpend de la voie
dadministration et de la priode gestative.
c5- Neurotoxicit
Chez le rat, ladministration dOTA (pendant la priode de gestation) induit des
malformations du systme nerveux central. De mme, les chercheurs ont rapport que lOTA
peut tre considre comme cause possible de certaines lsions ainsi que des dgts au niveau
crbral. Cette substance savre donc hautement toxique pour les cellules nerveuses et aptes
atteindre le tissu neural (cerveau, rtine) (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).
c6- Cancrogense
Plusieurs tudes ont port sur le dveloppement de cancers exprimentaux chez des
animaux nourris pendant quelques semaines avec des doses dOTA variables. Il sagit de
tumeurs hpatiques mais surtout rnales (HUFF et al., 1992 ; ESKOLA, 2002).
II. 2. Ecotoxignse
Les mycotoxines peuvent tre produites tous les stades de la chane alimentaire depuis le
champ jusquau produit fini. La mycotoxine peut aussi tre prsente alors que lagent
responsable a disparu, soit du fait de lvolution de la mycoflore, soit du fait des traitements
technologiques. La scrtion par les moisissures de mtabolites toxiques dans les aliments
dpend de plusieurs facteurs qui peuvent tre intrinsques (nature de la souche) ou bien
extrinsques (conditions de lenvironnement) (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999).
II. 2.1. Biosynthse des mycotoxines
Les mycotoxines sont des mtabolites secondaires synthtises aprs les stades de
multiplication et de croissance. D'aprs STEYN (1998), les aflatoxines sont formes partir des
polyctoacides (Figure 04). Selon un processus complexe, l'ergotamine est forme partir des
peptides et des acides amins. L'ochratoxine A est bio-synthtise partir de la phnylalanine et
le dihydroisocoumarine (LEYRAL et VIERLING, 2001).


Etude
Figure 04. Voies de biosynthse des mycotoxines (LEYRAL et VIERLING, 2001).


19
Etude
II. 2.2. Facteurs de biosynthses
a- Facteurs physiques (facteurs extrinsques)
Les principaux facteurs physiques constituent lensemble des conditions
environnementales telles que ; la temprature, la disponibilit en eau, linfestation par les
insectes et lattaque des rongeurs (MIRETE et al., 2004).
a1- Temprature
La temprature joue un rle prpondrant sur la croissance et la physiologie des
moisissures et en outre sur la comptition entre les espces. La plupart des champignons sont
msophiles avec des optima de croissance variant de 25 C 35C. Pour dautres, ils sont
psychrophiles ou psychrotolrantes (BOTTON et al., 1990).
La temprature permettant une toxignse optimale est en gnral voisine de la
temprature optimale de croissance (PFOHL-LESZKOWICZ, 1999). Par ailleurs, les
mycotoxines peuvent tre labores des tempratures gnralement infrieures celle de la
croissance (SAMSON et al., 2004). En ce qui concerne les Aspergillus de la section Nigri, de
faon gnrale, la production dOTA se fait dans un trs large intervalle de temprature
(ESTEBEN et al., 2004).
a2- Activit de leau (A
w
)
Quelle que soit la nature de laliment, aucun micro-organisme ne peut se dvelopper une
A
w
infrieure 0.65. Il sagit dun paramtre dont linfluence est dterminante sur le
dveloppement des moisissures ainsi que sur la production de mycotoxine (BELLI et al., 2004).
Le tableau 06 rsume lA
w
optimale pour la croissance de certaines espces de champignons.
Tableau 06. Activit de leau optimale pour la croissance de certaines espces dAspergillus
sp et Penicillium sp (BELLI et al., 2004).
Espces fongiques A
w
(minimale) A
w
(maximale)
Aspergillus niger 0.90 0.98
Aspergillus ochraceus 0.83 0.87
Aspergillus parasiticus 0.82 0.98
Penicillium flavus 0.84 0.99


20
Etude
a3- pH
Le pH du milieu est un facteur important pour la croissance des moisissures et la
production des mycotoxines. La plupart des moisissures croissent dans des pH acides et peuvent
tolrer des valeurs de pH trs basses (LE BARS et LE BARS, 1987).
a4- Endommagement des graines
Les grains casss, fissurs ou altrs par les insectes et les acariens constituent des foyers
favorables pour le dveloppement des moisissures qui, aprs leur envahissement librent les
toxines (LE BARS et LE BARS, 1987).
b- Facteurs chimiques (facteurs extrinsques)
b1- Composition gazeuse
La plupart des moisissures sont arobies. La rduction de la pression partielle en oxygne
et surtout laccroissement de la teneur en CO
2
a un effet dpresseur important sur la toxignse
(DERACHE, 1986). Toutefois, aprs conservation dans une atmosphre confine, la remise
lair libre ou la ventilation provoque rapidement une intense toxignse (LE BARS et LE
BARS, 1987).
b2- Traitements agricoles
La production des mycotoxines dans le champ peut tre influence par le labour, la rotation
de rcolte, les fongicides utiliss, la varit de la plante et les diffrences gographiques (LE
BARS et LE BARS, 1987).
b3- Nature du substrat
La toxignse dpend beaucoup plus troitement de la denre sur laquelle les moisissures
se dveloppent. Sur une denre alimentaire, on trouve souvent une espce dominante et donc ses
toxines. Cependant, en gnral, la biognse des aflatoxines et de lOTA, est favorise tout
dabord par la prsence des glucides dans le substrat, puis des lipides et enfin la prsence des
protides (LUND et FRISVARD, 2003).
c- Facteurs biologiques (facteurs intrinsques)
Les facteurs biologiques peuvent tre lis lespce fongique, la spcificit de la souche
et linstabilit des proprits toxiques. Une mme toxine peut tre labore par diffrentes
espces quelque fois appartenant diffrents genres et une mme espce peut produire plusieurs
mycotoxines.


21
Etude
De plus, la prsence de plusieurs espces fongiques sur la mme denre a gnralement un
effet dpressif sur la production de toxine. Cela sexplique dune part, par la comptition pour le
substrat et dautre part, par le fait que certaines souches peuvent dgrader la toxine (LE BARS et
LE BARS, 1987).
II. 3. Mtabolisme des aflatoxines dans lorganisme
Une fois dans lorganisme, lAFB1 subit plusieurs ractions dlimination plusieurs
niveaux. Ainsi dans la cellule hpatique, laflatoxine est mtabolise par un arsenal enzymatique
qui facilite son limination par augmentation de ses proprits hydrophiles (FREMY, 1982). La
figure 05 illustre les diffrentes ractions de biotransformations de lAFB1 dans lorganisme
humain.
Il existe deux mthodes dlimination de l'AFB1. Le processus dhydroxylation qui
constitue la voie principale et qui conduit la formation du driv hydroxyl de laflatoxine B1
qui est laflatoxine M1. Alors que par oxydorduction, il y a formation de laflatoxicol qui est
moins toxique et de pouvoir mutagne faible. Dautres aflatoxines peuvent tre formes partir
de AFB1, il sagit notamment des aflatoxines B2a, H1, P1 et Q1 (JAQUET et al., 1982).


Etude
Figure 05. Biotransformation de laflatoxine dans lorganisme humain (RICHARD, 1998).

s l
m



22
Etude
III. Gnralits sur les plantes mdicinales
Les plantes mdicinales taient employes pendant des sicles comme remdes pour les
maladies humaines parce qu'elles contiennent des composants de valeur. Rcemment, le
dveloppement de la rsistance microbienne aux antibiotiques disponibles ainsi que les effets
secondaires ngatifs infligs par les drogues modernes a men les chercheurs tudier l'activit
antimicrobienne des plantes mdicinales (GARNERO, 1991).
Les substances naturelles issues des vgtaux ont des intrts multiples mis profit dans
lindustrie, en alimentation, en cosmtologie et en pharmacologie. Parmi ces composs on
retrouve dans une grande mesure les mtabolites secondaires qui sont surtout utiliss en
thrapeutique. La pharmacie utilise encore une forte proportion de mdicaments dorigine
vgtale et la recherche est oriente vers la dcouverte de nouvelles molcules bioactives, ou des
matires premires pour la semi synthse (BAHORUN, 1997).
III. 1. Facteurs de variabilit des substances bioactives dans les plantes mdicinales
III. 1.1. Influence du cycle vgtatif
Des variations importantes peuvent se produire au cours du cycle vgtal autant en ce qui
concerne le rendement et la composition chimique des substances bioactives (GARNERO,
1991).
III. 1.2. Influence des facteurs extrinsques
Il sagit de lincidence des facteurs de lenvironnement tels que la temprature, lhumidit
relative, la dure totale dinsolation, le rgime de vents exercent une influence directe et les
pratiques culturales (lapport dengrais et le rgime hydrique) (BRUNETON, 1999). Les
facteurs gographiques et daphiques influencent aussi la composition des substances bioactives
(GARNERO, 1991).
III. 1.3. Influence de la rcolte du matriel vgtal
Le ramassage du matriel vgtal pose trs souvent un problme de contamination par
dautres espces vgtales surtout sil sagit de plantes croissance rapide ou de vgtaux qui
poussent dans des lieux o se trouvent de nombreuses autres espces vgtales (GARNERO,
1991).


23
Etude
III. 1.4. Influence des transformations du matriel vgtal
Le matriel vgtal qui va subir lextraction nest pas toujours trait immdiatement. Des
modifications physiques et biochimiques dues laction de lair, du soleil et lchauffement en
tas peuvent se produire et se rvler fcheuses pour la qualit de lextrait, surtout sil sagit de
fleurs (GARNERO, 1991).
III. 1.5. Influence des hybridations
Les hybridations introduisent lhtrognit dans un peuplement vgtal. Une race
chimique peut apparatre par mutation. Ce cas a t signal avec lexemple du Houblon
(Humulus lupulus L) (GARNERO, 1991).
III. 1.6. Influence du procd dobtention
La labilit des constituants de la plante explique que la composition du produit obtenu par
les mthodes dextractions, est diffrente de celle du mlange initialement prsent dans les
organes scrteurs du vgtal. Au cours de lextraction, leau, lacidit et la temprature peuvent
induire des rarrangements, des isomrisations, des racmisations et des oxydations.
(BRUNETON, 1999).
III. 2. Prsentation de la coloquinte
La coloquinte (Citrullus colcoynthis L. Schard, Linnaea 12 : 414 (1838)) vraie est une
plante herbace vivace de la famille des Cucurbitaces. Elle est cultive dans les pays tropicaux
comme plante mdicinale pour la pulpe de ses fruits, qui est amre et toxique (SINCICH, 2002).
III. 2.1. Noms vernaculaires
Arabe : Handal, Hadag, Handhal ; Hantal, Hadjj. Berber : Taberka, Tefersite, Tadjellet.
Franais : coloquinte, chicotin. Anglais : Colocynth, bitter apple, bitter gourd. Allemand :
Bitterzitrulle, Bitterapfel. Inde : Tumba ou Gartoomba. Italien : coloquintida, popone amaro
coloquinte (SINCICH, 2002).


24
Etude
III. 2.2. Taxonomie
Rgne Vgtale
Sous rgne Plantes vasculaires
Super division Spermaphytes
Division Angiospermes
Classe Dicotyldones
Sous classe Dialyptales
Ordre Violales
Famille Cucurbitaces
Genre Citrullus
Espce Citrullus colocynthis (ZORO et al., 2003).
III. 2.3. Description morphologique
La coloquinte est une plante rampante herbace, annuelle ou vivace. Les tiges sont
angulaires, rugueuses, rampantes ou migrantes et rudes. Les feuilles de 5 10 cm de longueur,
ont un limbe dcoup en 5 7 lobes. Les fleurs jaune verdtre, monoques sexes spars,
solitaires, apparaissent entre Mai et aot l'aisselle des feuilles. La corolle de couleur jaune
comporte cinq lobes. Les fruits sphriques de 7 10 cm de diamtre, ressemblant une petite
pastque, de couleur verte panache de jaune clair, devient compltement jaune maturit. La
chair lgre, spongieuse, de couleur jaune orang. Une plante produit 15 30 fruits. Les graines
de petite taille (6mm de longueur), ovodes et aplaties, lisse, de couleur variant de l'orange au
brun noirtre et ont une saveur amre (DUKE, 1983). Les diffrentes parties de la plante sont
illustres dans la figure 06.
III. 2.4. Rpartition gographique
La coloquinte, originaire des sols arides, est trs frquente dans les rgions tropicales
humides ou modrment sches, elle est peu prsente dans les zones tempres (BRUNETON,
1996). Elle occupe une rgion trs vaste qui stend du Nord-Africain, du Sahara, Egypte, Arabie
Saoudite jusquen Inde, ainsi que la rgion mditerranenne (sud europen) (BATANOUNY et
al., 1999).


Etude
Figure 06. Schma des diffrentes parties de Citrullus Colocynthis (ZORO et al., 2003).
(a : rameau, b : fruit, c : fleur mle, d : vrille, e : feuille)


25
Etude
III. 2.5. Actions thrapeutiques
Pendant des priodes bibliques, les fruits de la coloquinte ont t recueillis et considrs
comme poison mortel. Ils sont largement rpandus dans la mdecine traditionnelle, car ils
possdent diverses proprits thrapeutiques : purgatives, anti-tumorale et immunostimulant
(ABDEL-HASSAN et al., 2000 ; BENDJEDDOU et al., 2003), anti-inflammatoire et
antioxydant (AL-GHAITHI et al., 2004 ; MARZOUK et al., 2010), antirhumatismal
(BOUKEF et SOUISSI, 1982), laxative et contre les trouble urognitaux, la leucmie, lictre la
fivre, lascite, les dsordres biliaires et les hmorrodes (ZIYYAT et al., 1997). Elle est aussi
utilise contre les maladies hpatiques (GEBHARDT, 2003). Lextrait thanolique du fruit de la
coloquinte exerce un effet anti-microbien sur Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus
epidermis et un effet antifongique sur plusieurs genres de champignons (GURUDEEBAN et al.,
2010).
L'huile extraite partir des graines est employe pour traiter des morsures de serpent et de
scorpion, pour favoriser la croissance des cheveux et pour noircir les cheveux gris (ROY et al.,
2007 ).
Plusieurs tudes ethno-pharmacologiques classent la coloquinte comme tant une plante
traditionnelle utilise pour traiter le diabte (BNOUHAM et al., 2006). Une enqute
ethnobotanique effectue par BENMEHDI en 2000 sur 80 plantes traditionnellement utilises
pour traiter le diabte dans la rgion de Tlemcen (Algrie), rvle que la coloquinte est la plante
la plus utilise aprs le fenugrec.
III. 2.6. Composition chimique
Le screening phytochimique des diffrentes parties de la coloquinte (racines, tiges, graines
et feuilles) a permis de caractriser les familles de composs chimiques existants dans la plante.
Les rsultats dexamen phytochimique prsents par BENMEHDI en 2000, montrent la
prsence des alcalodes dans toutes les parties de la coloquinte surtout dans les graines et
lpicarpe. Les strodes et les tanins sont retrouvs dans toutes les parties, et des quantits
moindres les flavonodes et les saponines. Il a aussi mentionn que les coumarines, les
anthracnosides, les anthraquinones, les ergolines et les modols sont totalement absents
(BENMEHDI, 2000).


26
Etude
Les Graines de coloquinte contiennent 26,6% dhuile, 13,5% de protine, 2,1% de cendre,
52,9% de fibre brute, 4,9% dazote libre et contiennent 322 mg/100 g de potassium, 119 mg/100
g de phosphore et 3,3 mg/100 g de fer (SAWAYA et al., 1986). Elles contiennent aussi la
phytosteroline, phytosterols, hydrocarbures, saponines, alcalodes, polysaccharides, glycosides et
des tannins (DUKE, 1978).
a- Flavonodes
Le terme flavonode rassemble une trs large gamme de composs naturels appartenant la
famille des polyphnols. Leur fonction principale semble tre la coloration des fleurs, des fruits
et parfois des feuilles (au-del de la chlorophylle, des carotnodes et des btanes)
(BRUNETON, 1999). Tous les flavonodes ont une origine biosynthtique commune et
possdent le mme lment structural de base. Elles se divisent gnralement en cinq classes :
flavonols, flavones, anthocyanidines, flavonones et chalcones (PETERSON, 1998).
Les fruits de la coloquinte contiennent trois flavonodes : 3-mthoxy-iso-orientine, iso-
orientine et iso-vitexine. Les feuilles contiennent aussi trois flavonodes : 8-C-p-
hydroxybenzoyl- iso-vitexine, 6-C-p-hydroxylvitexine et 8-C-p-hydroxybenzoyl-iso-vitexine 4-
o-glucoside (MAATOOQ et al., 1997).
b- Saponosides
Les Saponosides constituent un vaste groupe dhtrosides trs frquents chez les
vgtaux. Ils sont caractriss par leurs proprits tensioactives. Ils se dissolvent dans leau en
formant des solutions moussantes. La plupart des saponosides prsentent des proprits
hmolytiques (SEGER et al., 2005).
Les saponosides peuvent tre classs en deux groupes selon la nature de leur gnine:
Saponosides gnine strodiques et Saponosides gnine triterpniques (BRUNETON, 1999).
Au niveau de la coloquinte quatre triterpnes tetra cyclique ont t isols partir du fruit : 2-O-
B-D glucopyranosylcucurbitacins I, J, K et L (SEGER et al., 2005).
c- Alcalodes
En plus de la choline qui est connue comme constituant des cucurbitaces, DARWISH-
SAYED et al (1973), a rvl la prsence de trois autres alcalodes : (C
10
H
15
N O
3
et C
20
H
32
NO) considrs comme des drivs de la pyridine, tandis que le troisime (C
16
H
24
NO
7
) a t
suggr tre le driv de la pyridine ou de la quinoline.


p :
e


e




27
I. Matriel et mthodes
I. 1. Matriel vgtal
I. 1.1. Bl tendre local et import
Les chantillons de bl tendre local et import sont prlevs le mois de dcembre 2010 au
niveau des silos en bton arm situs au sein de lOAIC (office algrien interprofessionnel des
crales) de la wilaya de Saida (Photo 01) (Figure 07).
I. 1.2. Fruit de Citrullus colocynthis
Les fruits matur de Citrullus colocynthis proviennent de Oued Nsa situ environ 70 km
de la ville de Ouargla (Photo 02) (Figure 07).
Les dates, les lieux dchantillonnages, le nombre et le poids des chantillons tudis sont
consigns dans le tableau 07.
Tableau 07. Origine et date de prlvement des chantillons.
Echantillons
Date de
prlvement
Lieu du prlvement
Nombre
dchantillon
Quantit de chaque
chantillon (g)
Bl tendre local 29/12/2010 OAIC (Saida) 01 3000
Bl tendre import 29/12/2010 OAIC (Saida) 01 3000
Fruit de Citrullus
colocynthis
19/12/2010 Oued Nsa (Ouargla) 70 500
Lidentification botanique des espces vgtales est effectue au niveau du laboratoire de
physiologie vgtale luniversit de Saida par Monsieur Dr. Hasnaoui sur lappui de son
exprience et de certaines documentations relatives la taxonomie de cette espce au sein du
rgne vgtal, telles que la caractrisation botanique et agronomique de trois espces de
cucurbites consommes en sauce en Afrique de lOuest : Citrullus sp., Cucumeropsis mannii
Naudin et Lagenaria siceraria (Molina) Standl.
I. 2. Matriel fongique
Les souches fongiques utilises pour tester lactivit biologique des extraits ont t isoles,
partir du bl tendre local et import, purifies et identifies. Il sagit dAspergillus flavus,
dAspergillus ochraceus, dAspergillus niger et dAspergillus fumigatus.


Photo 01. Sige de loffice algrien interprofessionnel des crales de la wilaya de Saida.
Photo 02. Fruit de Citrullus colocynthis.
Figure 07. Situation des diffrentes stations de prlvements des chantillons (Encarta,
1998).
A
B
A
Station de prlvement
de bl tendre local et
import (OAIC de
Saida)
Station de prlvement
des fruits de Citrullus
colocynthis Oued Nsa
(Ouargla)


28
I. 3. Mthode dchantillonnage
I. 3.1. Prcautions dchantillonnage
Avant toute analyse, il convient de prlever un chantillon reprsentatif du produit
analyser. Nanmoins, les techniques de prlvements habituellement recommandes pour
dautres analyses ne sont gure probantes quand il sagit danalyses microbiologiques. En
gnral, sur les produits secs, granuleux et pulvrulents, la microflore est toujours repartie de
faon trs htrogne (DUNOYER, 1989).
A ce titre, il faut noter que les rsultats des examens microbiologiques nont de valeur que
si certaines prcautions dchantillonnage ont t respectes :
Prises dchantillons avec des instruments striles ;
mise de lchantillon dans des rcipients ou sachets striles ;
respect des rgles dhygine gnrale pour la personne effectuant le prlvement ;
rapidit de lacheminement des chantillons dans lattente de leurs analyses ;
conservation des chantillons dans un endroit frais et sec (8 15C) mais jamais des
tempratures ngatives (DUNOYER, 1989)..
SUTRA et al (1998), stipulent que les chantillons doivent tre prlevs rigoureusement
au hasard, en vitant les biais (par exemple, viter des prlvements systmatiques en dbut ou
en fin de production).
La rpartition trs htrogne des mycotoxines dans le champ, dans les silos et dans les
graines elles-mmes laisse entrevoir des doutes sur les rsultats de dosage et de dtection de ces
toxines. Ces doutes proviennent de lchantillonnage. cet gard, UGRINOVITS et
ZUCKERANALYSEN (2002), recommandent de constituer un chantillon de grain assez
grand, partir des divers petits prlvements dans la masse en mouvement. MULTON (1982),
ajoute que bien des fois la prparation de lchantillon est laisse lapprciation de lanalyste.
Dans cette tude et afin davoir un chantillon reprsentatif, trois chantillons de bl tendre
local et import ont t prlevs au hasard. Les chantillons sont mlangs puis diviss en trois
sous chantillons masse gale. Ils sont ensuite transports au laboratoire de luniversit (dans
des sacs en papier Kraft) o ils sont soumis des analyses physicochimiques, microbiologiques
et mycotoxicologiques.


29
I. 4. Etude de la qualit physicochimique, microbiologique et mycotoxicologique du bl
tendre local et import
I. 4.1. Etude de la qualit physicochimique du bl tendre local et import
a- Dtermination du pourcentage des grains briss (tat physique des grains)
Les atteintes mcaniques du grain durant le stockage sont favorables aux dveloppements
des champignons et lattaque des insectes. Les grains endommags deviennent un terrain
favorable linfestation et la pntration de linoculum dAspergillus et de Penicillium
lintrieur de la graine, do limportance de llimination des grains briss. Il sagit donc de
comptabiliser les grains casss par rapport une prise dessai de 100 grains reprsentative de
chaque sous chantillon de bl tendre analyser.
b- Dtermination de lhumidit
Cest une mthode dtuvage qui consiste effectuer un schage dune prise dessai de
chaque sous chantillon une temprature de 105 + 2 C jusqu lobtention dun poids constant.
Lhumidit est mesure par la formule :
x H%: humidit en (%).
x P
t
: poids de la tare.
x P
0
: poids de la tare avec chantillon.
x P
1
: poids constant aprs schage multiple.
c- Mesure du pH
Pour lestimation de lacidit ou lalcalinit de nos chantillons, une solution est prpare
base de 45 ml deau distille additionne 5 g dchantillon. Aprs une heure de repos avec une
agitation continue, la mesure du pH est ralise laide du pH mtre type (HANNA pH 209)
(MULTON, 1982).
I. 4.2. Etude de la qualit microbiologique du bl tendre local et import
a- Dnombrement de la flore fongique
La mthode de dilution (ou mthode indirecte) consiste dnombrer les microorganismes
des grains de crales mises en suspension avec 45 ml deau physiologique (le diluant) et
quelques gouttes de Tween 80 (Figure 08).
H% = ((P
0
P
t
) (P
1
P
t
))/ (P
0
P
t
)

100.


30
Lintrt de cette mthode rside dans le fait que les propagules fongiques sont
dnombres partir de la mme suspension mre et quelles intgrent la flore interne et externe
(MULTON, 1982).
A partir de la dilution mre, des dilutions dcimales sont ralises pour chaque sous
chantillon de varit de bl tendre prleve (local et import). Deux boites pour chaque dilution
sont ensemences avec 1 ml dinoculum tal en surface. Lincubation se fait 25 2C pendant
5 7 jours (Figure 08). Trois milieux sont couramment utiliss pour le dnombrement de ces
propagules fongiques :
PDAa (Potatoes Dextrose Agar acidifi) ;
CDA (Czapek Dextrose Agar) ;
DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphnicol).
Afin dviter la contamination bactrienne, le milieu PDA est acidifi jusqu un pH de 4,5
5 en ajoutant 1 ml dacide lactique 25% par flacon de milieu. On peut galement utiliser le
rose Bengale pour inhiber la croissance bactrienne et limiter la taille des moisissures dans la
boite de Ptri ce qui facilite le comptage (LARPENT, 1990).
En vue de lobtention disolats purs servant lidentification des souches, plusieurs
repiquages successifs sur milieu PDA acidifi ont t raliss. Les isolats purs sont repris sur des
tubes de PDA acidifi inclins et incubs 25 2C pendant une semaine ou plus. Ces tubes
sont ensuite gards 4C afin dassurer leur conservation.
b- Identification des moisissures
Lidentification fait essentiellement appel aux caractres culturaux et morphologiques des
moisissures isoles ltat pure (BOTTON et al., 1990).
Caractres culturaux : ce sont les critres macroscopiques tels que la vitesse de
croissance, texture et couleur du thalle, couleur du revers de la culture, odeur de lexsudat et
prsence ou absence dun pigment diffusible.
Caractres morphologiques : cest ltude microscopique du myclium, nature des
organes diffrencis et ltude biomtrique.



























Figure 08. Techniques disolement et de dnombrement des souches fongique
(LANSBOROUGH, 2004).
Sous chantillon 3 Sous chantillon 2 Sous chantillon 1
Echantillon de bl tendre.
45 ml deau physiologique
+ des gouttes de tween 80 +
5g de bl tendre
Solution
mre 10
-1
1 ml 1 ml
10
-4
10
-3
10
-2
1 ml
PDA
Incubation 25 + 2C
chantillon 1 Sous
Ensemencement
Ensemencement
PDA PDA
PDA
CDA
CDA CDA CDA
DRBC DRBC DRBC
DRBC
(2 essais)
(2 essais)
(2 essais)


31
b1- Identification des genres de moisissures
- Identification des genres par la technique de scotch
La technique de scotch consiste adhrer laide dun bout de scotch une fraction
myclienne partir dune culture jeune et de la coller sur une lame contenant quelques gouttes
de lactophnol (Photo 03) (CHABASSE, 2002). Les observations microscopiques sont
effectues aux grossissements 10, 40 et 100 laide dun microscope type (Motic digital
microscope DMB srie).
- Identification des genres par la technique de micro-culture
Dcrite par HARIS (1989), la technique de micro-culture consiste inoculer les spores des
moisissures sur une lame mene de petits carrs, de milieu PDA acidifi et les recouvrir par une
lamelle. Les spores sont ensemences sur les limites priphriques du milieu pour leur fournir un
potentiel doxygne lev afin quelles puissent germer. Lensemble est conditionn dans une
chambre strile et humide puis incub 25 2C pendant 3 5 jours (Photo 04).
Aprs incubation, les lamelles auxquelles sadhrent le myclium sont transfres sur
dautres lames striles contenant quelques gouttes de lactophnol. Les observations
microscopiques sont effectues aux grossissements 10, 40 et 100. Les genres sont dtermins
par les caractres culturaux et microscopiques en se rfrant au manuel de BARNETT et
HUNTER (1972).
b2- Identification des espces Aspergillus et Penicillium
Lidentification des espces Aspergillus et Penicillium est ralise par la mthode de PITT
(1973) et RAMIREZ (1982). Cette mthode est dite Single Spore , base sur la relation entre
lactivit de leau du milieu de culture et la temprature dincubation. Elle consiste en
linoculation de quelques spores dune culture jeune dans des tubes hmolyse contenant une
suspension semi solide base de 0,2% dAgar et quelques gouttes de Tween 80. A partir de cette
suspension, diffrents milieux de cultures sont ensemencs.
- Identification des espces Aspergillus
Lidentification des espces Aspergillus se fait sur trois milieux de cultures diffrents
savoir :
MEA (Malt Extract Agar) 25 C,
G25N (Glycrol Nitrate Agar) 25 C,
CYA (Czapek Yeast Agar) deux tempratures diffrentes : 5C et 37C.



Photo 03. Mthode didentification microscopique des moisissures (CHABASSE, 2002).
Photo 04. Micro-culture des moisissures pour lidentification microscopique (CHABASSE,
2002).


32
Inoculation se fait par dpt centrale dune goutte de la suspension prpare prcdemment
sur la surface des milieux de cultures solidifis (Figure 09).
Une confirmation des souches prsumes Aspergillus flavus et Aspergillus parsiticus est
faite par une inoculation sur le milieu AFAP 25C. Ce dernier donne un revers de culture
orange caractristique ce groupe.
- Identification des espces Penicillium
Lidentification des espces Penicillium se fait sur quatre types de milieux de cultures
savoir :
CDA (Czapek Sucrose Agar) 25 C,
MEA (Malt Extract Agar) 25 C,
G25N (Glycrol Nitrate Agar) 25 C,
CYA (Czapek Yeast Agar) 37C.
Ces milieux sont inoculs avec les diffrents isolats de Penicillium de la mme faon que
linoculation des diffrents isolats dAspergillus (Figure 10).
La lecture se fait aprs 7 et 14 jours dincubation en se rfrant aux clefs didentification
de PITT (1973) et RAMIREZ (1982). Le CDA (milieu minral A
w
leve) et le G25N (milieu
base de glycrol A
.w
faible) donnant une vitesse de croissance variant en fonction de lA
w

une temprature constante de 25C. Le CYA donne une croissance variant selon lA
w
des
tempratures variables de 5C et 37C. Le MEA informe sur la couleur du thalle 25C.
I. 4.3. Analyses mycotoxicologiques
Toutes les souches dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus identifies partir des
prlvements analyss sont cultives sur milieu PDA acidifi pendant 5 jours 25 2C pour
pouvoir rechercher la capacit de ces souches produire des mycotoxines.
a- Dtection visuelle des souches productrices de mycotoxine
Les souches dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus sont rensemences sur des
boites de Ptri contenant 20 ml de milieu CEA (Coconut Extract Agar) et le dsoxycholate de
sodium raison de 0,8%. Les boites de Ptri sont incubes 25 + 2C pendant 3 7 jours. Des
botes de Ptri en verre non fluorescent ont t utilises. Les zones de diffusion daflatoxine et
dochratoxine sont dtectes en utilisant une lampe UV une longueur donde de 365 nm
(LEMKE et al., 1989).


MEA 25 C G25N 25 C CYA 05C CYA 37C
Figure 09. Inoculation des isolats dAspergillus (sur les diffrents milieux de cultures).
CDA 25C MEA 25 C G25N 25 C CYA 37C
Figure 10. Inoculation des isolats de Penicillium (sur les diffrents milieux de cultures).
Suspension semi solide base de 0,2%
dAgar + 2 gouttes de Tween 80 + les
spores fongiques.
Ensemencement
Suspension semi solide base de 0,2%
dAgar + 2 gouttes de Tween 80 + les
spores fongiques.
Ensemencement


33
b- Dtection des mycotoxines par la chromatographie sur couche mince (CCM)
Les souches dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus sont rensemences
sparment sur milieu YES (Yeast Extract Sucrose) ; riche en vitamines du groupe B complexes,
ce milieu favorise la mtabolisation secondaire et induit les ractions anabolisantes conduisant
la production des mycotoxines. Lincubation se fait 27 2 C pendant 14 jours.
Aprs 14 jours dincubation, la biomasse forme est limine en filtrant le milieu YES
travers du papier filtre type Wattman N 01. Les 50 ml du filtrat obtenu sont additionns 100
ml de chloroforme, le mlange est rigoureusement agit pendant 10 min puis laiss dcanter en
utilisant une ampoule dcantation. Cette opration est rpte en additionnant successivement
50 et 30 ml du solvant la phase aqueuse rcupre chaque sparation.
La phase chloroformique ainsi obtenue est filtre sur du papier Wattman N 01 puis
concentre par vaporation sous vide laide dun rotavapor type (Heidolph laborota 4000
efficient) jusqu lobtention dun volume de 2 3 ml (indice dune vaporation acheve).
La chromatographie sur couche mince constitue la mthode de base qui permet une
sparation efficace des mycotoxines et leur identification avec une bonne prcision. Elle se fait
sur une plaque de silicagel (gel de silice 60 F254) sur laquelle est dpos un spot de 20 l et un
autre de 40 l de chaque extrait chloroformique concentr. 5 l de chaque solution standard
daflatoxine et dochratoxine sont dposs sur la mme ligne droite (ligne de dpt). La plaque
est ensuite place dans une cuve chromatographique et trempe dans un mlange de solvant
dlution constitu de tolune, actate dthyle et lacide formique de volume (5 : 4 : 1)
respectivement (MULTON, 1982).
Aprs migration et vaporation du produit dlution sec, la plaque est examine sous une
lampe UV une longueur donde de 365 nm. La prsence daflatoxine et dochratoxine se
traduit par des fluorescences caractristiques aux spots standards et dun mme RF (facteur de
rtention) que ltalon. La figure 11 rsume les diffrentes tapes dextraction des mycotoxines.
c- Dtection des mycotoxines au niveau du substrat
A 50 g de chaque varit de bl tendre finement broy sont additionns 100 ml dun
mlange de solvants (chloroforme mthanol V/V), le mlange est agit pendant 10 min, la
phase liquide est spare du culot par filtration. Cette opration est rpte en additionnant
successivement 50 et 30 ml du solvant au marc rcupr chaque fois aprs filtration.


Figure 11. Procd dextraction des mycotoxines (MULTON, 1982).
+ 100 ml
de chloroforme
Incubation 27 2 C pendant 14
Filtration sur papier Watman N 01
Biomasse myclienne
Filtrat
Agitation pendant 10 min
Sparation par ampoule dcantation
7 2 C
nd
Schage
Pes
Les souches dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus
sont rensemences sparment dans 50 ml de milieu YES
t
se myclienne
Filtrat
Agitation pend
Sparation par ampou
n pend
chage
Pes
Filt
ch chage
myclie
ampou
Phase chloroformique Phase aqueuse ase aque hlorof
+ 50 ml
de chloroforme
Agitation pendant 10 min
Sparation par ampoule dcantation
Phase chloroformique Phase aqueuse aqueus hlorof
+ 30 ml
de chloroforme
Agitation pendant 10 min
Sparation par ampoule dcantation
Phase chloroformique
Phase aqueuse ase aque
hlorof
Evaporation
C.C.M
Observassions sous lampe UV
C.C.M
Observ
Collection des
phases
chloroformiques
Evapor
Pe Pes


34
Le filtrat est ensuite concentr jusqu un volume de 2 3 ml par vaporation au rotavapor.
Lextrait obtenu est tal sur un gel dagar 2 % et pH 7 coul pralablement sur boites de
ptri puis solidifi. Les boites sont laisses entrouvertes afin de permettre lvaporation du
solvant dextraction, puis elles sont gardes 4C pendant 24 heures.
Aprs la diffusion des mycotoxines lintrieur de la glose, la surface est essuye
plusieurs reprises avec du papier filtre imbib dhexane pour liminer les macromolcules de la
matire organique. Le gel dAgar est ensuite dcoup en petits carreaux et mlang avec 100 ml
de chloroforme. Le tout est agit pendant 10 minutes puis filtr.
Le marc est ensuite additionn 50 et 30 ml de chloroforme et agit chaque fois quil est
rcupr aprs filtration. Les filtrats obtenus sont galement mlangs puis concentrs laide
dun rotavapor jusqu' un volume de 2 3 ml. Une sparation par CCM est enfin effectue de la
mme faon que pour les souches productrices de mycotoxines (ZUBER et al., 1987). La figure
12 rsume les diffrentes tapes dextraction des mycotoxines partir du substrat solide.
I. 5. Prparation des extraits et tude phytochimique
Dans ce volet de notre travail, nous avons essay de recueillir un ensemble dinformations
sur notre deuxime matriel vgtal qui est les graines de Citrullus colocynthis. Les graines ont
t nettoyes et laves avec de leau du robinet puis sches lombre. Elles ont ensuite t
peses et broyes grossirement (Figure 13).
I. 5.1. Dtermination de la teneur en eau des graines de Citrullus colocynthis
Le taux dhumidit dans nos chantillons (graines sches), a t dtermin par le procd
de dessiccation une temprature de 105 2C dans une tuve isotherme ventile type
(Memmert) jusqu' lobtention dun poids constant (LINDEN et LORIENT, 1994).
I. 5.2. Prparation des extraits mthanolique et aqueux
a- Extraction au mthanol
Les extractions ont t effectues seulement sur les graines de Citrullus colocynthis. La
technique applique pour lextraction au mthanol est celle utilise par SENHAJI et al (2005).
Une quantit de 20 g est prise dans un erlenmeyer, laquelle nous avons ajout 100 ml de
solvant (mthanol). Aprs 3 heures de macration sous agitation continue 200 tours/min, le
mlange est filtr sur papier filtre Wattman N 01.
H% = ((P
0
P
t
) (P
1
P
t
))/ (P
0
P
t
)
X
100.


Figure 12. Procd dextraction des mycotoxines partir du substrat solide (ZUBER et al.,
1987).
Figure 13. Prparation de la poudre des graines de Citrullus colocynthis (photo originale).
Echantillon de
bl tendre
Broyage fin
Mesurer
50g
Addition de 100 ml : CHCL
3
et CH
3
OH (V/V)
Homognisation : 10 min 1
re
filtration Filtrat
Addition de 50 ml de CHCL
3
Rsidus Rsidus
Homognisation : 10 min n : 10 mi 2
re
filtration 2 Filtrat
Rsidus Rsidus
Addition de 30 ml de CHCL
33
Homognisation : 10 min n : 10 mi 3
re
filtration 3 Filtrat
Rsidus Rsidus
Collecte des filtrats trats
Concentration au rotavapor Filtration sur gel el
Rcupration de la partie diffuse dans la glose par CHCL
3
Rcu
Concentration au rotavapor ation au r
Sparation par CCM
Obtention des graines
de Citrullus colocynthis.
Broyage des graines.


35
Cette opration est rpte quatre fois avec renouvellement du solvant afin dpuiser le
marc et augmenter le rendement. La figure 14 rsume les tapes de lextraction mthanolique.
b- Extraction par macration leau
Un extrait aqueux est galement prpar par macration dans de leau distill froide
raison de 10 % pendant 24 heures. Le mlange est ensuite centrifug 3600 g pendant 30min.
Le surnagent est rcupr puis filtr sur papier filtre Wattman N 01. Cette opration est rpte
quatre fois. A la fin de lextraction, les fractions obtenus sont rcupres dans un flacon et
conserves 4C labri de la lumire jusquau moment de leurs utilisations (SHENG-HSIEN
et al., 2007). La figure 15 rsume les tapes de lextraction aqueuse.
I. 5.3. Dtermination du rendement des extraits secs
Afin de pouvoir calculer le rendement de chaque extrait (mthanolique et aqueux), lextrait
aqueux est rcupr sec par vaporation de leau dans une tuve 50C. Pour lextrait
mthanolique, le rotavapor est utilis une temprature de 50C pour vaporer le mthanol.
Le rendement est dtermin par le rapport du poids de lextrait sec aprs vaporation sur le
poids de la matire vgtale sche utilise pour lextraction, multipli par 100% (BEKHECHI-
BENHABIB, 2001).
m
1
: masse en gramme de lextrait sec ;
m
0
: masse en gramme de la matire vgtale sche ;
Rd : rendement.
I. 5.4. Tests phytochimiques
Les composs chimiques sont dtermins par une tude phytochimique qui consiste
caractriser les diffrentes catgories de molcules existantes dans les graines de la plante. Ces
dernires vont servir obtenir des principes actifs utiliss comme agents thrapeutiques
(BRUNETON, 1999).
Pour ce faire, les diffrents extraits obtenus ont t soumis aux tests phytochimiques. Ces
derniers sont bass sur des essais de solubilit, des ractions de colorations et de prcipitations,
ainsi que des examens en lumire ultraviolette. Les diffrentes familles de composs chimiques
recherches dans cette tude sont les suivantes :
Rd % = (m
1
X 100) / m
0


Figure 14. Extraction mthanolique partir des graines de Citrullus colocynthis (SENHAJI
et al., 2005).
Figure 15. Extraction aqueuse partir des graines de Citrullus colocynthis (SHENG-
HSIEN et al., 2007).


Extraction au MeOH (100 ml de
MeOH pour 20g de poudre)

Poudre de graines (200g)
Rsidu vgtal
(marc)
Extrait mthanolique
Filtrat
Evaporation par
rotavapor 60C
Dcantation
Filtration
Extraction froid par 2 L deau
distill pendant 24 h
Poudre de graines (200g)
Rsidu vgtal
(marc)
Extrait aqueux
Evaporation
Filtration
Centrifugation


36
a- Dtection des polyphnols
a1- Dtection des tanins
Les tanins sont mis en vidence partir de 1 ml dextrait plac dans un tube en prsence
de quelques gouttes de FeCl
3
(1% prpar au mthanol). Aprs agitation de lextrait, la couleur
vire au bleu noir en prsence de tanins galliques et au brun verdtre en prsence de tanins
catchiques (Figure 16) (KARUMI et al., 2004).
a2- Dtection des coumarines
Les coumarines sont rvls partir de 5 ml dextrait plac dans un tube port bullition
jusqu lobtention dun volume de 1 ml, ce volume est ajout 1ml deau chaude. Aprs
agitation, le volume total est devis en deux volume, lun sert de tmoin et lautre est ajout 0.5
ml de NH
4
OH (10%) puis examin sous lampe UV. Lmission de la fluorescence indique la
prsence des coumarines (Figure 16) (BRUNETON, 1999)
a3- Dtection des anthocyanes
Les anthocyanes sont dtects en plaant 5 ml dextrait dans un tube auquel en ajoute 15
ml dH
2
SO
4
(10%) (milieu acide), aprs agitation, le mlange est ajout 5 ml NH
4
OH
(10%) (milieu basique). La prsence danthocyanes est affirme par une coloration bleu-violace
en milieu basique (Figure 16) (BRUNETON, 1999).
a4- Dtection des flavonodes
Un mlange de quelques gouttes de mg
2+
et de gouttes dHCL concentr, plac dans un
tube, est ajout 2ml dextrait. Lapparition de la coloration rose, orange ou rouge indique la
prsence des flavonodes (Figure 16) (MALEC et PAMELIO, 2003).
a5- Dtection des anthraquinones
Pour la dtection des anthraquinones, 10 ml dextrait sont ajouts 5 ml de NH
4
OH
(10%). Aprs agitation, lapparition dun anneau rouge indique la prsence danthraquinone
(Figure 16) (OLOYEDE, 2005).
a6- Dtection des saponosides
Pour la dtection des saponosides, 10 ml dextrait plac dans un tube essais sont agits
pendant 15 secondes puis dposs durant 15 minutes. Une hauteur de mousse persistante,
suprieure 1 cm indique la prsence de saponosides (KOFFI et al., 2009).




37
b- Dtection des terpnes
b1- Dtection des strodes
Les strodes sont rvls aprs addition de 5 ml danhydride actique 5 ml dextrait
chaud. Le mlange est ajout 0,5 ml dacide sulfurique concentr. Aprs agitation lapparition,
linterphase, dun anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis au vert, indique une raction
positive (Figure 17) (BRUNETON, 1999).
c- Dtection des alcalodes
Les alcalodes ont t caractriss partir des ractifs de Mayer ou Wagner. 10 ml dextrait
sont vapors jusqu' lobtention dun volume de 0,2ml, sur lequel 1,5 ml de HCl (2%) sont
ajouts. Aprs agitation de la solution acide, 1 2 gouttes du ractif de Mayer ou Wagner sont
ajout. Lapparition dun prcipit blanc jauntre ou brun indique la prsence dalcalodes
(Figure 18) (MOJAB et al., 2003).
Toutes les expriences sont ralises en triplicata pour vrifier la reproductibilit des
rsultats. Les figures (16, 17 et 18) rsume les diffrentes tapes de dtermination de ces
composs phytochimiques.
I. 6. Essai dactivit biologique des extraits mthanolique et aqueux
I. 6.1. Souches fongiques testes
Parmi les souches fongiques isoles purifies et identifies pralablement partir du bl
tendre, quatre souches ont t slectionnes pour servir dceler lactivit antifongique des
extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis savoir :
x Aspergillus flavus,
x Aspergillus ochraceus
x Aspergillus niger.
x Aspergillus fumigatus.
Les souches sont conserves 4C dans des tubes contenant 10 ml de milieu PDA inclin.
I. 6.2. Prparation des pr-cultures
Le PDA est le milieu de culture utilis pour lentretien des souches fongiques et la
ralisation des tests antifongiques, alors que la ralisation des tests antimycotoxinognes est
effectue sur milieu liquide YES.




38
Afin de prparer des cultures jeunes, les souches fongiques utilises ont t cultives dans
des boites de Ptri contenant 20 ml de milieu PDA suivi dune incubation de trois sept jours
25 + 2C.
I. 6.3. Essai dactivit antifongique par la mthode de micro-dilution en milieu solide
Avant dvaluer lactivit antifongique des extraits, la toxicit du solvant peut galement
tre critique. A cet effet, nous avons test (test control) linnocuit du DMSO (dimthyl
sulfoxyde) utilis a la place du mthanol pour solubiliser les fractions sches de Citrullus
colocynthis. Cette substitution de solvant a t base sur les travaux prcdents indiquant leffet
positif du mthanol sur la croissance de certaines souches fongiques.
La mthode de micro-culture en milieu solide permet la dtermination de la concentration
minimale fongicide (CMF) partir d'une gamme variable de concentrations de notre extraits
(aqueux et mthanolique) dans le milieu de culture. La CMF est dfinit comme tant la plus
petite concentration d`antiIongique qui tue _ 99.9 de l`inoculum (LASS-FLORL et al.,
2010).
D'aprs la mthode de BILLERBECK et al (2002), une solution-mre de chaque extrait
est ralise avec du DMSO pour lextrait mthanolique et de leau distille strile pour lextrait
aqueux. Une srie de dilutions raison gomtrique de 2 est ensuite ralise pour pouvoir tudier
leffet antifongique de nos extraits sur les souches fongiques slectionnes
La fourchette de concentrations finales ainsi obtenue correspond 5- 2.5- 1- 0.5 - 0.25 -
0.125 - 0.0625 - 0.0312 - 0.0156 - 0.0078 - 0.0039 - 0.0019 et 0.0010 %. Aprs solidification du
milieu PDA, linoculation se fait par le dpt dun disque myclien denviron 0,6 cm de diamtre
dune pr-culture de 3 7 jours au centre de la boite de Ptri (Figure 19).
Des tmoins de croissance sont raliss pour chaque souche et chaque srie d'essais. Tous
les essais sont raliss double reprise. Aprs incubation 25 2C pendant cinq jours, la
croissance est compare celle du tmoin (sans extrait).
A partir des rsultats obtenus, on peut donc dterminer lindice antifongique (IAF) de
chaque extrait par la formule dcrite par WANG et al (2005).
Avec :
Da : le diamtre de la zone de croissance de lessai
Db : le diamtre de la zone de croissance du tmoin.
Indice antifongique = (1 ( Da / Db)) x100%.



























Figure 19. Dtermination de la CMF des extraits des graines de Citrullus colocynthis
(BILLERBECK et al., 2002 ; MULTON, 1982).

Incubation 25 2C
Ensemencement du disque myclien de 0.6 cm.
Extrait mthanolique ou
aqueux 20% (0.2g/ml)
0.5 %
0.25 %
0.125 %
0.0625 %
0.0312 %
0.0156 %
0.0078 %
0.0019 %
0.0010 %
0.0039 %
Dilution de lextrait dans les milieux de cultures.
0.00125 % 0.2 %
0.1 %
0.02 %
0.005 %
1 %
2.5 %
5 %
Culture jeunes
dAspergillus flavus
Milieu PDA Milieu YES
Dpt du disque
dAspergillus flavus
Incubation 27 2C


39
Pour les boites qui ne prsentent pas de croissance, le disque myclien est transfr sur un
milieu PDA neuf pour confirmer sil sagit dun effet fongistatique ou fongicide.
I. 6.4. Test d'activit antimycotoxinogne
Suivant la mthode dcrite par MULTON en 1982, ltude de leffet antimycotoxinogne
des extraits mthanolique et aqueux a t test contre deux espces Aspergillus sur le milieu YES
afin de pouvoir extraire les mycotoxines produites. A titre individuel, chacun des deux extraits
(des graines de Citrullus colocynthis) a t additionn 50 ml de milieu YES mais des
concentrations finales variables de lordre de 0.2%, 0.1%, 0.02%, 0.005% et 0.00125%. Aprs
une rigoureuse agitation, les diffrents milieux sont inoculs de disques de 0.6 cm de diamtre
contenant des cultures jeunes de 3 7 jours dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus. Des
tests tmoins et de contrle sont raliss pour chaque souche et chaque srie d'essais (Figure 19).
Aprs une dure d'incubation de 14 jours 27 + 2C, les mmes tapes cites
prcdemment pour lextraction des mycotoxines ont t suivies.


e




40
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. Rsultats et discussions.
II. 1. Qualit physicochimique et microbiologique du bl tendre local et import
Durant cette premire partie, ltude est porte sur le contrle (qualitatif et quantitatif) du
bl tendre local et import stock. A cet effet, les analyses effectues visent de prs laspect
physicochimique, microbiologique et mycotoxicologique du bl tendre utilis.
II. 1.1. Qualit physicochimique du bl tendre local et import
a- Pourcentage des grains casss (tat physique des grains)
Sur les 100 grains prlevs (au hasard), une constatation de ltat physique a t effectue.
Le rsultat en relation est reprsent par les valeurs moyennes des grains casses en fonction des
deux types de bl tendre. En matire de chiffre, le bl tendre local prsente un taux de grains
casss lgrement suprieur (5.34%) au bl tendre import (4.32%) (Figure 20).
b- Humidit (H)
Daprs les rsultats affichs sur la figure 21, les deux varits de bl tendre rvlent des
taux dhumidits plus ou moins importantes. Les valeurs moyennes des deux types de bl sont
plus ou moins proches mais avec un lger avantage pour le bl import. Elles sont
respectivement de lordre de 10.23% et 11.57% pour celui du local et import.
c- Le pH
Les valeurs moyennes du pH des diffrents chantillons du bl tendre illustres sur la
figure 22 dmontrent que l'ensemble des chantillons prsente un pH lgrement acide
avec des valeurs moyennes de 6.71 pour le bl tendre import et de 6.60 pour le bl
tendre local.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 20. Moyennes des grains casss des chantillons de bl tendre local et import.
Figure 21. Humidit moyenne des chantillons de bl tendre local et import.
Figure 22. pH moyen des chantillons de bl tendre local et import.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bl tendre local Bl tendre import
5.34%
4.32%
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e
s

g
r
a
i
n
s

c
a
s
s

s


(
%
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Bl tendre local Bl tendre import
10,23%
11,57%
H
u
m
i
d
i
t


(
%
)

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bl tendre local Bl tendre import
6,6
6,71
p
H


41
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 1.2. Qualit microbiologique du bl tendre local et import
Le dnombrement de la flore fongique a t estim sur trois types de milieux de culture
savoir : PDA, CDA et DRBC, afin de contrler la diversit fongique de nos chantillons (Photo
05). Il est effectu aprs lidentification de chaque espce fongique apparut.
II. 1.3. Identification des moisissures
a- Genres fongiques identifis par la mthode de micro-culture et de Scotch
Selon BARNETT et HUNTER (1972) et en se basant sur ltude des caractres
macroscopiques (couleur, aspect de colonie et le revers des boites ) et microscopiques (forme
de thalle et des spores) des souches fongiques isoles, nous avons identifi plusieurs genres
(Photo 06).
Sur la base de lobservation microscopique de la souche fongique A mettant en vidence
les ttes conidiennes, unisries ou bisries, dabord radies, puis reparties en plusieurs
colonnes de spores mal individualises, jauntres au dbut, puis vert-jaune fonc. Les
conidiophores sont verruqueux. Les vsicules sont sub-globuleuses. Les phialides sont insres
directement sur la vsicule ou portes par des mtules. Les conidies sont globuleuses sub-
globuleuses, de couleur verte ple, verruqueuses. Les sclrotes, frquents dans les isolats rcents,
sont globuleux sub-globuleux, dabord blanc puis virant au brun-rouge fonc et au noir. Nous
pouvons dduire quil sagit dAspergillus flavus (Photo 06).
Lobservation microscopique de la souche fongique B mettant en vidence les ttes
conidiennes, bisries, radies, sont disposes en plusieurs colonnes bruntres ou noires. Les
conidiophores sont lisses, hyalins ou bruntres dans leur moiti suprieure. Les vsicules sont
globuleuses. Les phialides sont portes par des mtules bruntres, de dimensions variables. Les
conidies sont habituellement globuleuses, parfois lgrement aplaties. Elles sont brunes,
chinules trs verruqueuses. Les sclrotes parfois diffrencis, sont crme chamois fonc au
dbut, puis virent au chamois vinac. Nous pouvons dduire quil sagit dAspergillus niger
(Photo 06).
Sur la base de lobservation microscopique de la souche fongique C mettant en vidence
Les ttes conidiennes, strictement unisries, en colonne compacte sont dabord bleu-vert puis
virant au vert bronze. Les conidiophores sont courts, lisses, slargissent insensiblement au
sommet en formant des vsicules subhmisphriques vertes. Les phialides dresses, sont
densment groupes, de couleur verte. Les conidies sont globuleuses sub-globuleuses et sont
chinules. Nous pouvons dduire quil sagit dAspergillus fumigatus (Photo 06).


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.


Souches fongiques isoles du bl tendre import la dilution 10
-2

Souches fongiques isoles du bl tendre local la dilution 10
-2
Photo 05. Dnombrement des souches fongiques sur les milieux disolements (photo
original). (1) :Aspergillus flavus, (2) : Penicillium sp, (3) : Aspergillus ochraceus, (4) : Alternaria, (5) : Aspergillus
fumigatus, (6) : Aspergillus niger, (7) : Cladosporium, (8) : Ulocladium.

Milieu DRBC
Milieu DRBC
Milieu DRBC
Milieu CDA Milieu DRBC
Milieu CDA Milieu PDA
Milieu PDA Milieu PDA Milieu PDA
Milieu PDA
Milieu PDA
1
3
2
4 2
3
5
2
6
7 1
5
6
8


42
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Lobservation microscopique de la souche fongique D permet de distinguer les ttes
conidiennes bisries, dabord globuleuses puis se sparent en 2 ou 3 colonnes divergentes, bien
individualises, de couleur jaune, ocre-jaune ou chamois. Les conidiophores sont rugueux,
jaunes brun ple et longs. Les vsicules sont globuleuses, hyalines. Les phialides sont portes
par des mtules, de dimensions variables. Les conidies sont sub-globuleuses globuleuses. Elles
sont finement chinules ou lisses. Les sclrotes, souvent prsents, de couleur lavande pourpre,
sont globuleux, ovales ou cylindriques. Nous pouvons dduire quil sagit dAspergillus
ochraceus (Photo 06).
Lobservation microscopique de la souche fongique E permet de distinguer des
organisations en pinceau. Le thalle, form de filaments mycliens septs et hyalins, porte des
conidiophores lisses ou granuleux, simples ou ramifis qui se terminent par un pnicille. Les
conidiophores peuvent tre isols, groups en faisceaux lches ou agrgs en cormies bien
individualiss. Nous pouvons dduire quil sagit du genre Penicillium (Photo 06).
b- Espces fongiques identifies par la mthode de Single spore
Par le biais de cette mthode et en se rfrant aux clefs didentification de PITT (1973)
pour les Aspergillus et RAMIREZ (1982) pour les Pnicillium, on a pu identifier les espces
dmontr dans les photos 07 et 08. Les principaux caractres des diffrentes souches identifies
sont galement rsums dans les tableaux 08 et 09.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Photo 06. Aspect microscopique des souches dAspergillus et de Penicillium (photo
original). (1) : Conodiophore, (2) : Vsicule, (3) : Mtule, (4) : conidies, (5) : Phialide.
A
B
C
D
E
Aspergillus flavus Aspergillus niger
Penicillium. spp
Aspergillus ochraceus
Aspergillus fumigatus
1
2
3
4
1
1
2
4
4
5
2
3


43
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Tableau 08. Identification des espces de Penicillium par la mthode de Single Spore.
LECTURE
GENRES ESPECES MILIEU COULEUR
Diamtre en
mm
Penicillium expansum
MEA 25C VERT FONCE 40
CYA 25C BLANC AVEC FISSURES 37
CDA 25C VERT BLANCHATRE 29
G25N 25C BEIGE 45
Penicillium indicum
MEA 25C VERT FONCE 38
CYA 25C BLANC JAUNATRE 33
CDA 25C VERT BLANCHATRE 24
G25N 25C MARRON VERDATRE 35
Penicillium funiculosum
MEA 25C VERT FONCE 44.5
CYA 25C ROUGE VERDATRE 44
CDA 25C VERT PALE 54
G25N 25C Absence
Penicillium restrictum
MEA 25C VERT FONCE 47.5
CYA 25C
ROSE + CONTOURS BLANC
VERDATRE
32
CDA 25C Absence
G25N 25C BEIGE 30
Penicillium hispanicum
MEA 25C VERT FONCE 33
CYA 25C BLANC + FISSURES 32
CDA 25C BLANC BLANCHATRE 44
G25N 25C BEIGE COTTON 38
Penicillium griseo-
purpurum
MEA 25C
VERT +CONTOUR BLANC+
SCLEROTES
38
CYA 25C BLANC VERDATRE 37
CDA 25C VERT FONCE 37
G25N 25C BLANC 30
Penicillium pelacinicum
MEA 25C
VERT GRISATRE+CONTOUR
BLANC+SCLEROTE
30
CYA 25C BLANC VERDATRE 39
CDA 25C
VERT GRISATRE+CONTOUR
BLANC
34
G25N 25C Absence
Penicillium obscurum
MEA 25C VERT GRISATRE+ SCLEROTE 37
CYA 25C VERT GRISATRE 30
CDA 25C BLANC / BEIGE 33
G25N 25C Absence
Penicillium lilacinium
MEA 25C
VERT +CONTOUR BLANC+
SCLEROTES
33
CYA 25C BLANC VERDATRE 32
CDA 25C BLANC +SCLEROTES ROUGES 30
G25N 25C BLANC 38


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Photo 07. Identification des espces Penicillium par la mthode de Single Spore (photo
originale).
Penicillium expansum. MEA Pnicillium sp. CDA
Penicillium lilacinium. CDA
Penicillium restrictum. G25N
Penicillium pelacinicum. MEA Penicillium expansum. MEA MM Pnicillium sp. CDA Penicillium pelacinicum. MEA
A
MEA
E
A


44
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Tableau 09. Identification des espces Aspergillus par la mthode de Single Spore.
LECTURE
GENRES ESPECES MILIEU COULEUR Diamtre en mm
Aspergillus flavus
MEA 25C VERT PISTACHE 58
CYA 37C MARRON FONCE 52
CYA 5C Absence
G25N 25C JAUNE VERDATRE 50
AFAP BLANC+ REVERS ORANGE 48
Aspergillus clavatus
MEA 25C BLANC GRISATRE 48
CYA 37C ROSE PALE 58
CYA 5C Absence
G25N 25C JAUNE VERDATRE 60
Aspergillus fumigatus
MEA 25C BLANC 45
CYA 37C JAUNE PALE a JAUNE 50
CYA 5C Absence
G25N 25C JAUNE BLANCHATRE 51
Aspergillus parasiticus
MEA 25C VERT PISTACHE 77
CYA 37C VERT /JAUNE 55
CYA 5C Absence
G25N 25C JAUNE PALE 57
AFAP BLANC+ REVERS ORANGE 50
Aspergillus niger
MEA 25C NOIR 45
CYA 37C GRIS A NOIRS 56
CYA 5C 30
G25N 25C Micro colonie
Aspergillus terreus
MEA 25C MARRON 45
CYA 37C MARRON PALE 56
CYA 5C Absence Absence
G25N 25C BLANC JAUNATRE 40
Aspergillus fischeri
MEA 25C NOIR 73
CYA 37C GRIS 50
CYA 5C Absence
G25N 25C MARRON GRIS 56
Aspergillus ochraceus
MEA 25C JAUNE DORE 70
CYA 37C JAUNE 53
CYA 5C BEIGE 20
G25N 25C JAUNE PALE 55



Etude exprimentale. Rsultats et discussions.

Photo 08. Identification des espces Aspergillus par la mthode de Single Spore (photo
originale).
Aspergillus terreus. CYA Aspergillus fischeri. CYA
Aspergillus parasiticus. PDA
Aspergillus flavus. PDA
Aspergillus fumigatus. CYA Aspergillus parasiticus. AFAP
Aspergillus flavus. MEA
Aspergillus parasiticus. MEA Aspergillus ochraceus. MEA Aspergillus flavus. AFAP
Aspergillus fumigatus. PDA Aspergillus niger. CDA Aspergillus ochraceus. PDA
Aspergillus clavatus. CYA
Fusarium sp. PDA Aspergillus terreus. CYA pergillus fischeri. C ri ri YA Aspergillus flavus. PDA PD PD
Aspergillus flavus. MEA
Aspergillus parasiticus. ss MEA Aspergillus ochraceus. ss MEA Aspergillus flavus. AFAP
Aspergillus fumigatus. ss PDA Aspergillus niger. C rr DA CC Aspergillus ochraceus. ss PDA
Aspergillus clavatus. CYA
Fusarium sp. PDA
SS


45
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 1.4. Dnombrement de la flore fongique
Lutilisation du milieu PDA a permis de rvler les mmes souches fongiques chez les
deux varits de bl tendre des taux diffrents (Figure 23 et 24).
Les genres les plus prdominants sont les Aspergillus et les Penicillium. Le taux de
contamination par les Aspergillus chez la varit locale est plus important, il est de 24.1310
UF/g (Figure 23). Par contre, le taux de contamination par le mme genre chez la varit import
est de 18.9810 UF/g (Figure 24). Le taux de contamination par le Penicillium est plus lev
chez la varit importe que chez la varit locale. Il est respectivement de 13.510 UF/g et
8.3310 UF/g (Figure 23 et 24).
Les Aspergillus de la varit locale sont reprsents essentiellement par Aspergillus
fumigatus avec un taux de contamination de 11.8310 UF/g et Aspergillus flavus avec un taux
de contamination de 4.3310 UF/g (Figure 23). La varit de bl tendre importe est surtout
contamine par Aspergillus fischeri avec un taux de contamination de 6.510 UF/g et
Aspergillus fumigatus avec un taux de contamination de 5.8310 UF/g. Lespce Aspergillus
parasiticus est totalement absente sur cet chantillon (Figure 24).
Les genres Cladosporiums, Alternarias, Ulocladiums et Fusariums rvler sur les deux
varits de bl tendre appartiennent la flore du champ et la flore intermdiaire. Pour le
Rhizopus, les figures 23 et 24 tmoignent nettement quil est difficile de dnombrer ce genre
cause de son aspect cultural.
Il ressort aussi des figures 23 et 24 que la mycoflore totale du bl tendre import est plus
leve que celle de la varit locale. Elle est respectivement de 45.4610 UF/g et 36.9510
UF/g.




Etude exprimentale. Rsultats et discussions.

Figure 23. Moyenne de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu PDA.
ND* : indnombrable

Figure 24. Moyenne de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu PDA.
ND* : indnombrable
24,13
1,66
1,16
4,33
1,33
11,83
1,66
0,66
1,5
8,33
0,33 0,5
0,16
3,5
ND*
36,95
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n




x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies
18,98
6,5
1
2,16
1,83
5,83
0,33
0
1,33
13,5
1,5
1,16 1,16
9,16
ND*
45,46
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n



x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies


46
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Sur le milieu CDA, le bl tendre import prsente une mycoflore totale plus leve que
celle du bl local. Elle est respectivement 48.9810 UF/g et 20.1110 UF/g (Figure 25 et 26).
La mycoflore de la varit locale est reprsent essentiellement par le genre Aspergillus
dont le taux de contamination est de 11.9610 UF/g. Il est reprsent essentiellement par trois
espces, Aspergillus flavus (3.1610 UF/g), Aspergillus parasiticus (2.8310 UF/g) et
Aspergillus fischeri (210 UF/g) (Figure 25). Ce genre prdomine aussi dans la varit importe
ou il est mme plus important (42.3210 UF/g) (Figure 26). En effet ce genre est reprsent
essentiellement par Aspergillus ochraceus (1410 UF/g), Aspergillus fumigatus (13.6610
UF/g), Aspergillus flavus (8.3310 UF/g), Aspergillus niger (3.8310 UF/g) et Aspergillus
fischeri (2.510 UF/g).
Il ressort aussi de la figure 26 que certaines espces du genre Aspergillus de la varit
importe sont absentes, il sagit dAspergillus clavatus, Aspergillus parasiticus et Aspergillus
terreus.
Le taux de contamination par le genre Penicillium est lgrement lev dans la varit
locale. Il est respectivement de 7.3310 UF/g et 510 UF/g pour celui du local et import
(Figure 25 et 26).
Les figures 25 et 26 dmontre labsence du genre Ulocladium sur les deux varits de bl
tendre. Les genres Alternarias et Fusariums rvl sur les deux varits de bl tendre sont
considrs de la flore du champ et la flore intermdiaire.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.

Figure 25. Moyenne de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu CDA.
ND* : indnombrable

Figure 26. Moyenne de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu CDA.
ND* : indnombrable
11,96
2
0,66
3,16
0,33
1,16
1,66
2,83
0,16
7,33
0,16 0,33
0
0,33
ND*
20,11
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n



x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies
42,32
2,5
3,83
8,33
14
13,66
0 0 0
5
0,5
1,16
0 0 ND*
48,98
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n




x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies


47
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Les rsultats relatifs au milieu DRBC illustrs sur les figures 27 et 28 tmoignent environ la
mme charge fongique pour les deux varits de bl tendre avec une lgre diffrence entre la
diversit des souches fongiques. La moyenne de la mycoflore totale est 8.9610 UF/g pour la
varit locale et 9.8110 UF/g pour celle de limporte.
Les genres les plus prdominants sont les Aspergillus et les Penicillium. Le taux de
contamination par les Aspergillus est de 6.1410 UF/g chez la varit locale (Figure 27) et
6.3310 UF/g chez la varit importe (Figure 28). Le taux de contamination par les Pnicillium
est plus lev chez la varit importe que chez la varit locale. Il est respectivement de
2.1610 UF/g et 0.8310 UF/g (Figure 27 et 28).
Les Aspergillus de la varit locale sont reprsents essentiellement par Aspergillus
fumigatus avec un taux de contamination de 3.8310 UF/g et Aspergillus flavus avec un taux de
contamination de 110 UF/g (Figure 27). La varit de bl tendre importe est surtout
contamine par Aspergillus fumigatus avec un taux de contamination de 410 UF/g. Les espces
Aspergillus parasiticus, A, fischeri et A. terreus sont totalement absentes sur cette varit (Figure
28).
Les genres Cladosporiums, Alternarias, Ulocladiums et Fusariums dtects sur le bl
tendre appartiennent la flore du champ et la flore intermdiaire. Pour le Rhizopus, les mme
figures (27 et 28) confirment clairement quil est difficile de dnombrer ce genre cause de son
aspect cultural.
La comparaison effectue entre les flores fongiques rvles sur les trois milieux de culture
PDA, CDA et DRBC permet de conclure que la flore fongique de la varit locale dnombre
sur le milieu PDA est plus leve que celle dnombre sur milieu CDA. Pour la mme varit de
bl tendre, la flore fongique dnombre sur milieu DRBC est trs inferieure en la comparant
avec celles rvles sur les deux autres milieux dcrit prcdemment.
Pour la varit de bl tendre import, la flore fongique dnombre sur milieu CDA est plus
leve que celle dnombre sur milieu PDA. Sur le milieu DRBC, la moyenne de la mycoflore
de la mme varit est plus faible en la comparant avec celles dnombres sur milieu PDA et
CDA.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.

Figure 27. Moyenne de la mycoflore de bl tendre local dtecte sur milieu DRBC.
ND* : indnombrable

Figure 28. Moyenne de la mycoflore de bl tendre import dtecte sur milieu DRBC.
ND* : indnombrable
6,14
0,5
0,16
1
0,33
3,83
0,16 0 0,16
0,83
0,5
0,83
0
0,66
ND*
8,96
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n




x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies
6,33
0
0,5
1
0,5
4
0,33
0 0
2,16
0 0 0,16
1,16
ND*
9,81
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T
a
u
x

d
e

c
o
n
t
a
m
i
n
a
t
i
o
n




x

1
0
2
U
F

/

g

Souches fongiques identifies


48
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 1.5. Rvlation mycotoxicologiques
a- Rvlation des souches productrices de mycotoxines par milieu CEA
Dans cette approche, nous avons appliqu la mthode dcrite par LEMKE et al (1989)
afin de dtecter visuellement les souches productrices de mycotoxines, isoles des deux varits
de bl tendre, directement sur le milieu de culture (CEA).
Les colonies dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus sont obtenues par la mthode
de Single Spore aprs incubation 25 C pendant 3 7 jours sur milieu CEA (contenant le
dsoxycholate de sodium 0,8% comme retardateur de croissance) (Photo 09).
Daprs la photo 09, le rsultat est prsent par des colonies moyennes de 3 40 mm de
diamtre. Cest la zone sur laquelle on a essay de dtecter la prsence des mycotoxines lors de
lexamen visuel sous UV une longueur d'onde de 365 nm. Ces zones fluorescentes sont
spcifiques aux aflatoxines produites par Aspergillus flavus et aux ochratoxines produites par
Aspergillus ochraceus.
b- Rvlation des souches productrices de mycotoxines par CCM
La sparation chromatographique sur couche mince permet de confirmer le rsultat obtenu
avec la technique de LEMKE et al (1989). Les mycotoxines de types aflatoxine et ochratoxine
produites par les souches isoles des deux varits de bl tendre, dveloppent une fluorescence
marque sur le chromatogramme (Photo 10).
Daprs la photo 10, les espces Aspergillus flavus isoles des deux varits de bl tendre
produisent une seule toxine (Aflatoxine B1) qui apparait avec une fluorescence bleue. Les
espces Aspergillus ochraceus produisent lochratoxine A qui dvoile une fluorescence verte
sous lampe UV.
c- Rvlation des mycotoxines au niveau des substrats
Le rsultat de la dtection des mycotoxines niveau du bl tendre local et import est affich
sur la photo 11.
Daprs ce rsultat, nous constatons labsence de spots fluorescents corresponds aux
aflatoxines B1 et aflatoxines G1 produites par Aspergillus flavus et aux ochratoxines A produites
par Aspergillus ochraceus. Les deux varits de bl tendre (local et import) sont dpourvues de
mycotoxines recherches (Photo 11).


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.


Photo 09. Dtection sous UV des souches productrices de mycotoxines sur milieu CEA
(photo originale).

Aspergillus flavus
Aspergillus flavus sous UV
Aspergillus ochraceus
Aspergillus ochraceus sous UV
Photo 10. Dtection des souches
productrices de mycotoxines par CCM
(photo originale).
Photo 11. Dtection de mycotoxines du
bl tendre local et import (photo
originale).

Souches fongiques de
bl tendre local.
Souches fongiques de
bl tendre import.


49
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
DISCUSSION
Laltration des crales stocks a fait lobjet de nombreuses tudes ayant mis en vidence
que la contamination fongique compte parmi les principales causes de dtrioration des grains de
crales explique par des variations dans les paramtres technologiques du grain et par les
pertes considrables (ATALLA et al., 2003 ; MOLINIE et al., 2005).
Lors de la contamination du bl, les paramtres rgulant la croissance fongique et
permettant la production de toxines sont nombreux. On cite principalement la charge initiale en
mycoflore, la prsence de grains briss, le taux dhumidit relative lev, le pH et la temprature
de stockage des grains (ZIA-UR-RAHMAN, 2006).
Dans un premier volet, les rsultats attribus la qualit physicochimique indiquent que les
prlvements analyss du bl tendre (local et import) renferment un pourcentage de grains
casss suprieur au pourcentage fix par les normes commerciales qui imposent quun bl tendre
de qualit ne doit pas dpasser un pourcentage de 3% de grains casss (MOLINIE et al., 2005).
Cette augmentation dans le nombre des grains casss pouvait tre explique par plusieurs
facteurs pouvant influencer ltat physique du grain de bl, notamment celui du local, tels que les
mauvaises conditions de rcolte, les caractristiques de chaque varit, les dfaillances
mcaniques des appareils et surtout aux chocs infligs aux grains lors du transport mcaniques
aux silos. La prsence de grains briss ne peut que favoriser le dveloppement de foyer de
contamination et par consquent, elle ne peut tre que en dfaveur dun stockage de longue dure
(TAHANI et al., 2008).
L'humidit relative qui est la quantit deau libre disponible dans lchantillon est
responsable de plusieurs phnomnes daltration biologique de laliment notamment
mycologique. Les faibles teneurs en humidit relative permet dc classer nos chantillons dans la
catgorie des produits peu hydrats ; avantage qui n'exclut pas leur contamination par une flore
fongique xrotolrante prpondrante (BELLI et al., 2004). Notant que beaucoup de produits
pauvres en eau libre non altrables par les bactries peuvent donc tre altrs par les
champignons (DURON, 1999).
Le taux dhumidit relative lev enregistr pour le bl tendre import peut tre d au
transport maritime des bls tendres d'importations et les conditions climatiques des pays
dexportation (DURON, 1999).


50
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Les meures de pH de tous nos chantillons ont rvl un pH lgrement acide neutre.
Selon DURON (1999), les champignons peuvent se dvelopper des pH compris entre 3 et 8
avec un optimum de croissance compris entre 5 et 6, de ce fait, nos chantillons constituent un
milieu favorable pour le dveloppement des champignons.
Ltude de la qualit microbiologique du bl tendre (local et import) a rvl un taux de
contamination totale diffre dune varit une autre. Le bl tendre import prsente un taux
considrablement lev sur le milieu organique et minral par rapport au bl tendre local, ce qui
tait rapport dans les travaux de TAHANI et al (2008).
La diffrence de contamination fongique entre les deux varits de bl tendre peut tre
explique par la composition biochimique diffrente du bl tendre import par apport au bl
tendre local. Cette diffrence est influence parfois par les conditions climatiques, les conditions
de stockage (humidit, temprature et systme de ventilation) et linstallation dune charge
fongique importante, ce qui peut entraner une modification qualitative et quantitative de la
mycoflore (LE BARS et LE BARS, 1987). MILLER (2002), WILSON et al (2002),
rapportent que la contamination fongique des crales au champ ou pendant le stockage est
directement li aux conditions hydrothermiques.
De plus, la varit importe prsente un taux dhumidit lev et selon BENMANSOUR-
BRIXI (2005), les moisissures de stockage sont capables de crotre sur des substrats contenant
10 18 % d'humidit, avec un optimum de croissance compris entre 11 et 13 %. MULTON
(1982), BERTHIER et VALLA (1998), indiquent que ce dveloppement fongique est favoris
par la relation entre la temprature et lhumidit.
Les milieux PDA et CDA nous ont donn une croissance variable, cela est peut tre
expliqu par la diffrence dans la composition des deux milieux de cultures et le choix des
substrats prfrs par les souches fongiques, tel que rapport par lorganisation europenne et
mditerranenne pour la protection des plantes (OEPP, 2003), que le milieu PDA est prpar
base dlment organique et le milieu CDA est prpar base dlment minral.
La flore fongique totale du bl tendre stock est constitue essentiellement de moisissures
filamenteuses, trs sporulantes, dotes dun grand pouvoir de dissmination dont les genres
Aspergillus et Penicillium sont les plus rencontrs.


51
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Cest genres de moisissures que nous avons pu identifier sont des contaminants des
denres alimentaires maltraites mais surtout mal conserves, ils sont considrs comme
contaminants de stockage des crales et leurs drivs (BERTHIER et VALLA, 1998 ;
MULTON, 1982).
La dominance du genre Aspergillus dans la flore contaminante des crales a t reporte
dans plusieurs travaux (RIBA et al., 2005 ; LE BARS et LE BARS, 1987). Ainsi, les espces
du genre Aspergillus sont considres comme des moisissures de stockage (WITHLOW et
HAGLER, 2001).
Parmi les espces fongiques appartenant au genre Aspergillus, il faut souligner la grande
dominance dAspergillus fumigatus suivi dAspergillus flavus. Cette frquence de contamination
importante est accompagne aussi par une production de mycotoxines. Si cette prsence de flore
fongique est surprenante, ce nest pas la premire fois quune telle contamination est observe.
En effet, des enqutes rcentes menes en Italie ont dmontr la prsence de flore productrice de
mycotoxine dans les certaines matires premires et aliments (PIETRI et al., 2004).
Les autres souches isoles des chantillons analyss appartiennent aux genres Rhizopus,
Alternaria et Fusarium sont naturellement prsents sur les cultures au niveau des champs et dans
le sol (WITHLOW et HAGLER, 2001). La forte frquence du genre Alternaria dans le bl
tendre import semble tre due lhumidit leve de cet chantillon (WEINDENBRNER,
2000).
Le genre Fusarium est retrouv sur les deux varit de bl tendre, ce qui confirme ce
rsultat les travaux de CURTUI et al (1998). Ce rsultat est aussi en accord avec ceux obtenus
dans les pays du nord de lEurope comme le nord de la France, lAllemagne, la Norvge, la
Belgique, la Pologne ou les Pays-Bas (ISEBAERT et al., 2005 ; KRYSINSKA-TRACZYK et
al., 2007 ; SCHOLLENBERGER et al., 2006).
Dans lensemble, le taux de contamination lev, ainsi que la biodiversit assez importante
constats dans les diffrentes varits du bl tendre peuvent tre expliqus probablement par la
qualit, la dure et les conditions de stockage (DAVIS et DIENER, 1987).
Du point de vu mycotoxicologique, certaines souches dAspergillus purifies et identifies
sont potentiellement toxinognes (LEMKE et al., 1988). Lapparition de la fluorescence autour
des colonies dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus cultives sur milieu CEA aprs leur
examination sous UV, est un indicateur positif pour les souches fongiques productrices de
mycotoxines, ce qui est en accord avec les travaux de LEMKE et al (1989).


52
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Lutilisation du milieu CEA est certainement avantageux dans la prsente enqute. Ce
milieu est opaque et la blancheur de sa surface est utile en tant que toile de fond pour distinguer
les diffrences entre les colonies. La surface du milieu CEA est galement trs absorbante de la
lumire UV et constitue un arrire-plan efficace pour dtecter les zones fluorescentes entourant
les colonies correspondant aux aflatoxines et aux ochratoxines. Cette mthode et analogue la
dtection des souches fongiques productrices de mycotoxines par chromatographie sur couche
mince sous une lumire UV avec lavantage de cette dernire dans la distinction du type de
mycotoxine en la comparant avec le standard de la mycotoxine en question.
Nos rsultats mycotoxicologiques obtenus avec la chromatographie sur couche mince
dmontrent donc, que les souches dAspergillus flavus et dAspergillus ochraceus taient
productrices dAFB1 et dOTA, ce qui concorde avec les travaux de BENMANSOUR-BRIXI
(2005) et AMROUCHE (2007).
Le dosage qualitatif (par CCM) des aflatoxines et des ochratoxines au niveau des
chantillons de bl tendre local et import sest rvl ngatif (absence de mycotoxine dans le
substrat) pour lensemble des chantillons. Labsence de mycotoxines peut tre explique soit
par la possibilit que les souches dAspergillus isoles de ces chantillons sont toxinognes et les
conditions de temprature et dhumidit ntaient pas favorables lcotoxignse, soit les taux
daflatoxines et dochratoxines sont infrieurs au seuil de dtection de cette mthode qui est de
0.5 ppb (poids par billion) (ZAKARIA et MAJERUS, 1992).
Autrement dit, mme si les chantillons analyss contiennent des aflatoxines et des
ochratoxines, ces derniers sont peut tre ltat de traces et leur quantit est infrieure 2ppb
(g/kg) qui constitue le seuil de tolrance des aflatoxines dans les crales destines lHomme
fix par la communaut europenne en 2001.
CONCLUSION
La prsence des grains casss, dans nos prlvements, constitue un point dentrer
facile et trs probable de plusieurs microorganismes notamment les moisissures attires
par la matire organique prsente dans le bl tendre.
Depuis la rcolte jusquau son arriv aux silos de stockage, plusieurs paramtres
doivent tre pris en compte tels que les moyens de transport, les conditions de stockage, le
lieu de stockage, le nettoyage des grains, les traitements effectus au niveau des silos et
enfin la dure de stockage.


53
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Tous ces paramtres influes considrablement sur le taux des contaminants en
particulier les moisissures surtout lorsquil sagit dun pH qui tend vers lacidit et dune
humidit relative leve.
La possibilit davoir des souches productrices de mycotoxines est toujours prsente
mais nanmoins, nos chantillons sont acceptables et ils sont prts la consommation.
En gnral, la prcaution doit tre toujours maintenue et la dmarche assurance
qualit doit tre suspecte lors de toutes les tapes de la production cralires depuis la
rcolte jusquau produit fini et surtout au niveau du stockage, la phase la plus sensible et la
plus longue.
II. 2. Etude phytochimique des graines de Citrullus colocynthis
II. 2.1. Taux dhumidit des graines de Citrullus colocynthis
Le rsultat de cette analyse a rvl que la poudre des graines de Citrullus colocynthis
renferme un taux dhumidit infrieure 10%, soit une valeur de 6.77 %, alors que le taux de la
matire sche est suprieur 90% (Figure 29).
II. 2.2. Rendements des extractions mthanolique et aqueuse
Le rsultat de cette exprimentation a permis lobtention de deux extraits diffrents au
moins dans leur aspect et leur couleur (Photo 12). Pour lextrait mthanolique, la couleur
ressemble est le jaune avec un aspect pteux aprs lvaporation du mthanol. Pour lextrait
aqueux, la couleur correspondue est le marron avec un aspect poudreux aprs lvaporation de
leau.
Le calcul du rendement par rapport au poids total de la poudre sche des graines Citrullus
colocynthis utilise dans les deux types dextractions montre que, la plante a donn des masses
en extraits secs suprieures 1 g / 100 g de graines en poudre. Du point de vue rentabilit en
poids, lextrait mthanolique a donn les proportions les plus leves en le comparant avec
lextrait aqueux, les proportions sont respectivement 4.89% et 2.70% (Figure 30).


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 29. Humidit relative de la poudre des graines sches de Citrullus colocynthis.
Photo 12. Extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis (photo
originale).
Figure 30. Rendements des extractions mthanolique et aqueux.
Matire sche
93,23%
Eau 6,77%
0%
1%
2%
3%
4%
5%
Extrait mthanolique Extrait aqueux
4,89%
2,70%
R
e
n
d
e
m
e
n
t

d
e
s

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n
s

(
%
)
Extrait mthanolique. Extrait aqueux.


54
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 2.3. Tests phytochimiques des extraits des graines de Citrullus colocynthis
Le rsultat des tests phytochimiques effectus sur la poudre des graines Citrullus
colcoynthis est report sur le tableau 10.
Tableau 10. Tests phytochimiques effectus sur les extraits mthanolique et aqueux des
graines de Citrullus colcoynthis.
Groupes chimiques
Extraits
Extrait mthanolique Extraits aqueux
Polyphnols
Tanins hydrolysables + +
Anthraquinones + -
Flavonodes + +
Anthocyanes - +
Coumarines - -
Saponosides + +
Terpnes Strodes + +
Alcalodes + +
Les rsultats obtenus rvlent que les deux extraits (mthanolique et aqueux) possdent
presque la mme composition chimique. Pour lextrait mthanolique, la caractrisation chimique
a dmontr la prsence des polyphnols sous forme de tanins hydrolysables, de flavonodes,
danthraquinones et de saponosides alors que les anthocyanes et les coumarines sont entirement
absents (Tableau 10).
Le mme extrait (extrait mthanolique) a ragi positivement vis--vis du test chimique
recherchant les strodes (appartenant au groupe des terpnes) et les alcalodes (Tableau 10).
La composition chimique de lextrait aqueux indique la prsence de tous les composs ou
familles chimiques retrouves dans lextrait mthanolique avec en plus, une quantit
indtermine danthocyanes et labsence danthraquinones et de coumarines (Tableau 10).
DISCUSSION
La faible humidit relative des graines de Citrullus colocynthis en poudre constitue un
avantage pouvant intervenir dans leur conservation. Selon PARIS et MOYSE (1965), une bonne
conservation est assure une humidit relative inferieur ou gale 10 %.


55
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
La mthode dextraction effectue sur la poudre des graines de de Citrullus colocynthis
mene une temprature ambiante permet dextraire le maximum de composs et de prvenir
leur dnaturation ou modification probables. En fonction de leur solubilit ou de leur polarit,
deux solvants diffrents ont t utiliss afin de pouvoir extraire les diffrents phytoconstituents
prsents dans les graines de cette plante (YAGOUB, 2008).
Il est difficile de comparer les rsultats dextraction avec ceux de la bibliographie. Le
rendement nest que relatif et dpend de la mthode et des conditions dans lesquelles lextraction
a t effectue (LEE et al., 2003).
Le rendement dextraction mthanolique que nous avons obtenu est nettement plus faible
que ceux obtenus par MARZOUK et al (2011). Par contre, nos rsultats dextraction aqueuse
sont similaires ceux de MARZOUK et al (2009) et (2011).
Le screening phytochimique des extraits mthanolique et aqueux rvle que les graines de
Citrullus colcoynthis sont une source importante de polyphnols. Cette classe regroupe
essentiellement les tanins, les flavonodes et les saponosides avec labsence des coumarines dans
les deux extraits organiques. Les anthocyanes et les anthraquinones font lobjet de diffrence
entre les deux sortes dextraits. Les strodes et les alcalodes sont galement prsents dans la
composition chimique des deux extraits.
Les rsultats obtenus dvoilent la richesse des graines de Citrullus colocynthis du point de
vue qualitatif en mtabolites secondaires tels que les tanins. Ces composs ont t signals dans
le fruit de Citrullus colocynthis par NAJAFI et al (2010). GURUDEEBAN et al (2010) ont
marqu la prsence des tannins dans les extraits aqueux et mthanolique de Citrullus colocynthis.
Par ailleurs, Le scrennig phytochimique effectu par ADEBAYO-TAYO et al (2010) sur
le Citrullus colocynthis a rvl la prsence des tanins et des anthraquinones.
La prsence des flavonodes dans les deux extraits des graines de Citrullus colocynthis est
galement rapporte par plusieurs auteurs (NAJAFI et al., 2010 ; GURUDEEBAN et al.,
2010 ; ADEBAYO-TAYO et al., 2010 ; AMBI et al., 2007). Il sagit dune classe trs
diversifie ayant une multitude de structures distinctes par leurs proprits chimiques (DERBEL
et GHEDIRA, 2005).
Pour les anthocyanes, ils sont trs proches des flavonodes (HENNEBELLE et al., 2004).
La richesse des graines de Citrullus colcoynthis en anthocyane a aussi t signale par
BENMEHDI (2000).


56
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Lexistence des saponines dans nos extraits a t rapporte par plusieurs tudes. Les
feuilles et les fruits de Citrullus colcoynthis sont riches en saponine (NAJAFI et al., 2010 ;
GURUDEEBAN et al., 2010 ; ADEBAYO-TAYO et al., 2010).
Plusieurs tudes ont montr que les terpnes sont largement rpandus dans le genre
Citrullus (ALI et PANDEY, 2007 ; GURUDEEBAN et al., 2010). ADEBAYO-TAYO et al
(2010) ont rvl leur existence dans les feuilles de cette espce. Cette classe de mtabolite
secondaire regroupe galement des substances stroliques qui sont prsents sous forme dalcools
libres ou sous forme desters associs dautres molcules.
Les rsultats relatifs au criblage phytochimique de la dernire classe de mtabolites
secondaires, montrent que les alcalodes sont prsents dans les deux extraits de graines de
Citrullus colcoynthis. Ce rsultat est confirm par AMBI et al (2007) qui ont dtect les
alcalodes au niveau des graines de cette espce et MARZOUK et al (2010) qui ont dmontr
que, les graines de Citrullus colcoynthis contiennent 1.64 mg dalcalode par 100g de matire
sche.
La prsence des alcalodes dans les graines de Citrullus colcoynthis indique son intrt
pharmacologique et mdicinale tel que signal par ISERIN et al (1997). Certains de ces
mtabolites secondaires ont aussi t identifis, tel que signal par DARWISH-SAYED et al
(1973) qui ont pu identifier la prsence de trois alcalodes dans les graines de cette espce.
CONCLUSION
La mthode dextraction temprature ambiante permet dextraire le maximum de
molcules bioactives avec une ventuelle protection contre les dnaturations ou les
modifications probables des constituants chimiques de la plante.
Les examens phytochimiques effectus sont dune extrme importance. Ils
dmontrent que les graines de Citrullus colocynthis sont une source privilgie de molcules
biologiquement actives tels que les polphnols, les strodes et les alcalodes.


57
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 3. Activit biologique des extraits mthanolique et aqueux
II. 3.1. Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux
Les rsultats que nous avons obtenus sur linnocuit du DMSO vis--vis Aspergillus
flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger et Aspergillus ochraceus sont regroups dans la
photo 13.
Daprs ces prises de photos, nous constatons que le solvant utilis pour solubiliser les
fractions obtenues aprs vaporation du mthanol na aucun effet sur la croissance myclienne
des differentes souches fongiques selectionnes. En effet, les differentes souches arrivent
croitre normalement en prsence du DMSO dans le milieu de culture (Photo 13).
Les rsultats de lactivit antifongique des extraits mthanolique et aqueux des graines de
Citrullus colocynthis tests sparment in vitro sur les souches fongiques slectionnes sont
reprsents dans les figures 31, 32, 33 et 34. Cest figures enregistrent les indicent antifongique
nots pour chaque concentration dextrait teste.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Photo 13. Effet du DMSO sur les diffrentes souches fongiques.
Aspergillus niger. Aspergillus ochraceus.
Aspergillus flavus. Aspergillus fumigatus.


58
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
a- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus flavus
Le rsultat obtenu avec lextrait aqueux, test contre les diffrentes espces du genre
Aspergillus sur milieu PDA par la mthode de micro-dilution, indique une activit antifongique
positive sur la quasi-totalit des souches fongiques, lexception Aspergillus flavus ou lindice
antifongique enregistr est apparu nul pour toute la gamme de concentration effectue (Figure
31, Photo 15).
Le rsultat obtenu avec lextrait mthanolique dvoile une activit antifongique importante
sur la quasi-totalit des souches Aspergillus slectionnes, lexception Aspergillus flavus qui
sest manifest plus ou moins rsistante avec un indice antifongique maximal de 4.76% not
pour 5% dextrait mthanolique dans le milieu PDA (Figure 31, Photo 14).
Lextrait mthanolique perd cet effet inhibiteur de la croissance contre Aspergillus flavus
avec la diminution de sa concentration dans le milieu PDA. Daprs la figure 31, en dessous de
la concentration 1%, aucun indice antifongique nest enregistr pour cet extrait.
Les photos 14 et 15 regroupent laspect des colonies dAspergillus flavus. Daprs ces
photos, la couleur des colonies a chang en prsence des diffrentes concentrations dextrait
mthanolique. Elle vire du vert fonc au vert claire.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 31. Activit antifongique de lextrait mthanolique et aqueux sur Aspergillus flavus.
I ANF EMeOH : indice antifongique de lextrait mthanolique.
I ANF EAq : indice antifongique de lextrait aqueux.
Photo 14. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus flavus (photo
originale).
Photo 15. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus flavus (photo originale).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I
n
d
i
c
e

a
n
t
i

f
o
n
g
i
q
u
e

(
%
)
Concentration des extraits en pourcentage (%)
I ANF EMeOH
I ANF EAq
5% 0.5% 2.5%
5% 1% 0.5%


59
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
b- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus fumigatus
Pour le deuxime essai effectu sur Aspergillus fumigatus, la figure 32 montre dune part,
quAspergillus fumigatus est plus sensible lextrait mthanolique qu lextrait aqueux et
dautre part, que lindice antifongique des deux extraits diminue avec la diminution de leur
concentration dans le milieu PDA, suggrant une relation directe entre lactivit antifongique et
le type et la concentration de lextrait .
A 5% et 2.5% dextrait mthanolique, la figure 32 tmoigne dune inhibition totale de la
croissance myclienne ce qui augmente lindice antifongique 100%. En dessous de la
concentration 2.5%, cet indice antifongique commence diminuer jusqu la concentration
0.0019% ou on enregistre un indice antifongique nul.
Le repiquage des disques mycliens dAspergillus fumigatus incapables de croitre dans le
milieu PDA contenant 5 et 2.5% dextrait mthanolique sur dautres boites contenant le milieu
PDA seul na donn aucune croissance fongique aprs 3 7 jours dincubation 25C.
La photo 16 illustre les dimensions des colonies dAspergillus fumigatus aux diffrentes
concentrations dextrait mthanolique.
Lextrait aqueux enregistre une faible activit antifongique contre Aspergillus fumigatus
pour toute la gamme de concentrations ralises. Le maximum dindice antifongique enregistr
est de 16.44% not pour 2.5% dextrait. En dessous de cette concentration, lindice antifongique
diminue jusqu sa disparition 0.125% (Figure 32).
La photo 17 dmontre la couleur et les dimensions des colonies fongiques qui ont chang
en prsence dextrait aqueux dans le milieu PDA. Elle vire du vert fonc au vert claire.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 32. Activit antifongique de lextrait mthanolique et aqueux sur A. fumigatus.
I ANF EMeOH : indice antifongique de lextrait mthanolique.
I ANF EAq : indice antifongique de lextrait aqueux.

Photo 16. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur A.fumigatus (photo originale).
Photo 17. Activit antifongique de lextrait aqueux sur A. fumigatus (photo originale).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I
n
d
i
c
e

a
n
t
i

f
o
n
g
i
q
u
e

(
%
)
Concentration des extraits en pourcentage (%)
I ANF EMeOH
I ANF EAq
5%
0.0078%
0.0019%
5% 2.5% 5%


60
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
c- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus niger
Suivant le rsultat affich sur la figure 33, Aspergillus niger apparait plus sensible aux
deux types dextraits avec une dissemblance remarquable. Cette sensibilit est en relation
proportionnelle avec les concentrations des deux types dextraits.
Au-del de la concentration 2.5%, lextrait mthanolique a entirement inhib la croissance
myclienne dAspergillus niger (Figure 33). Le repiquage de ces disques mycliens incapables
de poursuivre leur croissance sur le milieu PDA contenant lextrait mthanolique sur dautre
milieu PDA seul na donn aucune croissance aprs 3 7 jours dincubation 25C.
En dessous de cette concentration, leffet de lextrait mthanolique commence saffaibli
jusqu la concentration de 0.0312% ou on enregistre une disparition complte de son effet
(Figure 33). La photo 18 dmontre lactivit antifongique de lextrait mthanolique sur
Aspergillus niger diffrentes concentrations.
Lextrait aqueux a marqu une inhibition importante sur Aspergillus niger. A 5%, cet
extrait a inhib prs de 50% de la croissance myclienne. Cet indice antifongique diminue avec
la diminution de la concentration de lextrait dans le milieu jusqu 0.125% ou la la croissance
myclienne nest plus inhib (Figure 33).
La photo 19 dmontre leffet de lextrait aqueux sur Aspergillus niger diffrentes
concentrations.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 33. Activit antifongique de lextrait mthanolique et aqueux sur lAspergillus niger.
I ANF EMeOH : indice antifongique de lextrait mthanolique.
I ANF EAq : indice antifongique de lextrait aqueux.
Photo 18. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur Aspergillus niger (photo
originale).
Photo 19. Activit antifongique de lextrait aqueux sur Aspergillus niger (photo originale).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I
n
d
i
c
e

a
n
t
i

f
o
n
g
i
q
u
e

(
%
)
Concentration des extraits en pourcentage (%)
I ANF EMeOH
I ANF EAq
5% 1% 0.0625%
5%
1%
0.0312%


61
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
d- Activit antifongique des extraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus ochraceus
Daprs les rsultats affichs sur la figure 34 Aspergillus ochraceus sest prsente trs
sensible aux deux types dextraits. Linhibition de cette espce fongique est totale partir de
0.5% pour lextrait mthanolique et 2.5% pour lextrait aqueux.
Le repiquage de ces disques mycliens pralablement trait en prsence des deux extraits
sur dautre milieu PDA seul na donn aucune croissance aprs 3 7 jours dincubation 25C..
En dessous de ces deux concentrations, leffet inhibiteur commence diminu jusqu labsence
totale de tout indice antifongique 0.0039% dextrait mthanolique et 0.0156% dextrait aqueux.
Les photos 20 et 21 dmontrent lactivit antifongique diffrentes concentrations
dextraits mthanolique et aqueux sur Aspergillus ochraceus.
La comparaison de la sensibilit des diffrentes souches fongiques aux deux extraits
(mthanolique et aqueux) rvle que Aspergillus ochraceus est la plus sensible avec un indice
antifongique de 100 % marqu pour les deux types dextraits suivie dAspergillus niger et
Aspergillus fumigatus qui nont dvelopp aucune rsistance en prsence dextrait mthanolique,
alors que pour lextrait aqueux la croissance myclienne des deux souches fongiques tait
seulement ralentie. Pour Aspergillus flavus, les deux types dextrait nont pas inhib la
croissance fongique de cette espce.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 34. Activit antifongique de lextrait mthanolique et aqueux sur Aspergillus
ochraceus.
I ANF EMeOH : indice antifongique de lextrait mthanolique.
I ANF EAq : indice antifongique de lextrait aqueux.
Photo 20. Activit antifongique de lextrait mthanolique sur A.ochraceus (photo originale).

Photo 21. Activit antifongique de lextrait aqueux sur A.ochraceus (photo originale).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I
n
d
i
c
e

a
n
t
i

f
o
n
g
i
q
u
e

(
%
)
Concentration des extraits en pourcentage (%)
I ANF0 EMeOH
I ANF Eaq
5%
5%
2.5% 0.0078%
0.125% 0.0312%


62
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
II. 3.2. Activit antimycotoxinogne des extraits mthanolique et aqueux
a- Effet des extraits mthanolique et aqueux sur la biomasse fongique forme
Le rsultat de leffet des extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus
colocynthis sur les biomasses mycliennes d'Aspergillus flavus et dAspergillus ochraceus
formes en milieu liquide est illustr dans les figures 35 et 36.
Ces figures font ressortir les poids des biomasses mycliennes formes par Aspergillus
flavus et Aspergillus ochraceus en fonction des diffrentes concentrations des extraits
mthanolique et aqueux
Selon les rsultats, Les deux types dextraits exercent un effet remarquable sur la
croissance myclienne dAspergillus ochraceus, influenant ngativement la biomasse
myclienne forme qui diminue avec laugmentation de la concentration des extraits dans les
milieux (Figure 35 et 36). Par ailleurs, on assiste une rduction de biomasse myclienne de
lordre de 95% en prsence de lun des deux extraits (Figure 35 et 36).
La souche Aspergillus flavus sest rvle plus rsistante que la prcdente vu que la
production de biomasse myclienne par cette dernire na pas t perturbe en prsence des deux
extraits tests (Figure 35 et 36).


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Figure 35. Biomasses fongiques formes par Aspergillus flavus et Aspergillus ochraceus en
prsence et en absence dextrait mthanolique.
Figure 36. Biomasses fongiques formes par Aspergillus flavus et Aspergillus ochraceus en
prsence et en absence dextrait aqueux.
A.flavus
A.ochracus
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Tmoin
0,00125%
0,005%
0,02%
0,10%
0,20%
0,21
0,19
0,16
0,16
0,157
0,15
1,65
0,93
0,421
0,137
0,09
0,026
P
o
i
d

d
e

l
a

b
i
o
m
a
s
s
e

f
o
r
m

e

(
g
)
Concentration de l'extrait mthanolique
A.flavus
A.ochracus
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Tmoin
0,00125%
0,005%
0,02%
0,10%
0,20%
0,21
0,27
0,29
0,25
0,30
0,20
1,65
1,2
0,9
0,4
0,12
0,074
P
o
i
d

d
e

l
a

b
i
o
m
a
s
s
e

f
o
r
m

e

(
g
)
Concentration de l'extrait aqueux


63
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
b- Effet des extraits mthanolique et aqueux sur la synthse de lAFB1 et lOTA
Les rsultats de la dernire tentative dmontrant leffet des extraits mthanolique et aqueux
sur la synthse des mycotoxines rvl par la chromatographie sur couche mince sont prsents
sur la photo 22.
Daprs les photos A et B, la synthse daflatoxine B1 et dochratoxine A produites
respectivement par Aspergillus flavus et Aspergillus ochraceus est inhibe dans la quasi-totalit
des concentrations dextraits testes dans le milieu YES.
Les diffrentes concentrations finales obtenues avec les deux types dextraits ont
totalement inhib la synthse dochratoxine A. La synthse daflatoxine B1 produite par
Aspergillus flavus est-elle mme inhibe aux diffrentes concentrations obtenues avec lextrait
mthanolique. Cependant, La chromatographie sur couche mince a rvl la prsence dAFB1
dans le milieu YES aux faibles concentrations dextrait aqueux (0.00125% et 0.005%) (Photo
22).
DISCUSSION
La recherche des effets antifongiques de la coloquinte sur les souches rencontres dans le
bl tendre stocks a rvl une efficacit des extraits aqueux et mthanolique des graines de cette
plante sur la majorit des souches fongiques slectionnes, ce qui confirme que les substances
bioactives des plantes sont considres comme des composs non phytotoxiques et
potentiellement efficaces contre les champignons pathognes (PRABAVATHY et al., 2006 ;
CHANG et al., 2008). Le dveloppement de la scurit des agents antifongiques pour le
contrle des phytopathognes dans l'agriculture connait une place importante dans la recherche
(FIELD et al., 2006 ; LEE, 2007).
La prsente exprimentation rvle que lextrait mthanolique des graines de Citrullus
colocynthis possde un effet plus antagoniste que lextrait aqueux. En effet, lextrait
mthanolique a dmontr un remarquable effet fongicide contre A. fumigatus, A. niger et A.
ochraceus isoles du bl tendre, expliqu par labsence de croissance fongique aprs le
repiquage des disques dans les milieux PDA seul. Ces concentrations inhibant totalement la
croissance myclienne de ces souches fongiques sont les concentrations minimales fongicides
(CMF). Toutefois, Aspergillus flavus a montr une rsistante mme des concentrations leves
dextraits.


Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Photo 22. Activit antimycotoxinogne des extraits des graines de Citrullus colocynthis
(photo originale).
A. flavus A. ochraceus
A B
A : Extrait mthanolique. B : Extrait aqueux.
0.1% 1% 0.005%
0.2% 2% 0.02%
0.00125%
0.1% 1% 0.005%
0.2% 2% 2% 0.02%
0.00125%
A. flavus A. ochraceus
0.1% 1% 0.005%
0.2% 2% 2% 0.02% 0.00125%
0.1% 1% 0.005%
0.2%
0.02%
0.00125%


64
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Labsence dinhibition totale de la part dextrait aqueux est explique par le fait que la
concentration fongicide ou fongistatique est suprieure aux concentrations effectues dans cette
tude.
La forte activit antifongique de lextrait mthanolique a aussi t rapporte par
HADIZADEH et al (2009) qui ont dmontr que les extraits alcooliques de Citrullus
colocynthis possdent une bonne activit antifongique. GURUDEEBAN et al (2010) ont signal
que lextrait mthanolique des parties ariennes de Citrullus colocynthis est menu dune
importante activit antifongique sur Aspergillus fumigatus alors que lextrait aqueux na aucune
activit antifongique sur cette souche. En outre, Aspergillus flavus sest rvl rsistante aux
deux types dextraits. Ces deux souches fongiques sont moins rsistantes en prsence dextrait
thanolique.
Les effets antifongiques des extraits aqueux et mthanolique des graines de la coloquinte
peuvent tre attribus aux diffrentes substances phytochimiques dtectes lors du screening
phytochimique. Dans leur tude, ABDEL GHANI et al (2008) mettent aussi en relation
lactivit antifongique des extraits des graines de Citrullus colocynthis avec les substances
bioactives de la plante. La tendance de ces substances phytochimiques d'avoir une activit plus
leve sur l'ensemble des souches est en fonction de leurs concentrations dans les extraits
(FOGLIANI et al., 2005 ; YAN et al., 2008).
Limportance de ces familles phytochimiques est influence par la rpartition
gographique de Citrullus colocynthis, ce qui influe par la suite sur leurs activits biologiques.
Lactivit antimicrobienne des extraits dpend donc de la plante, de sa composition, de lorgane
vgtal tester, de la nature de l'extrait et de la souche tudier (GRAVEN et al., 1992).
Parmi les substances phytochimiques doues dune activit antifongique, on cite
principalement les alcalodes, les flavonodes, les polyphnols et les strodes (IROBI et
DARANOLA, 1994 ; BRANTNER et al., 1996 ; YAN et al., 2008).
Les travaux de SCALBERT (1991) et BANSO et ADEYEMO (2007) ont dmontr que
les tanins isols des plantes mdicinales possdent une activit toxique contre les champignons.
Les saponines sont une classe spciale de glycosides qui ont dune part, une caractristique
savonneuse et dautre part, une trs bonne activit antifongiques (SADIPO et al., 1991).


65
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Plusieurs tudes ont t menes pour comprendre le mcanisme d'action des extraits de
plantes. Plusieurs chercheurs attribuent cette fonction aux composs phnoliques. Ces composs
peuvent interfrer avec les biomembranes en causant des dommages cellulaires et provoquant la
fuite de matriaux cellulaires et finalement la mort des microorganismes (MSHVILDADZE et
al., 2000 ; VELDHUIZEN et al., 2006 ; ABDEL GHANI et al., 2008). Cest un mcanisme
possible par lequel la croissance myclienne peut tre rduite ou totalement inhibe par leffet
des extraits en agissant sur la fonctionnalit et la structure de la membrane cellulaire
(SIKKEMA et al., 1995).
Les composants des extraits tels que les terpnes affectent non seulement la permabilit
mais aussi d'autres fonctions dans les membranes cellulaires. Ces composs peuvent traverser les
membranes cellulaires, pntrent ainsi l'intrieur de la cellule et interagissent avec des sites
critiques intracellulaire tels que les enzymes et les protines, ce qui conduit la mort cellulaire.
(OMIDBEYGI et al., 2007 ; CRISTANI et al., 2007),
Selon FARAG et al (1989), la prsence des groupements OH dans les composs
phnoliques est capable de former des liaisons hydrognes avec les sites actifs des enzymes et
d'accrotre l'activit antimicrobienne.
Les flavonodes sont galement responsables de linhibition des microbes rsistants aux
antibiotiques (LINUMA et al., 1994). Ils sont responsables des processus de balayage ou
chlateurs et peuvent galement perturber les membranes microbiennes (KESSLER et al., 2003).
Par ailleurs, les alcalodes renferment un effet dtoxifiant et possdent une trs bonne activit
antifongique (ZEE-CHENG, 1997).
Selon SADIPO et al (1991), les tannins sont responsables de la prcipitation des protines
indispensables des micro-organismes.
L'avantage des extraits de plantes est donc leur bioactivit, une caractristique qui les rend
attrayants pour la protection des produits stocks tels que les grains de crales contre lattaque
des champignons et mme le blocage de leur cotoxignse (TRIPATI et DUBEY, 2004).
Les extraits obtenus partir des parties suprieures de plantes possdent la capacit de
supprimer la croissance des champignons toxinognes et par consquent, la production de
toxines dans les supports synthtiques (THANABORIPAT et al., 1997 ; BHATNAGAR et
MCCORMICK, 1988). Ils peuvent aussi bloquer entirement la biosynthse des mycotoxines
alors que la croissance fongique n'est pas affect (BHATNAGAR et MCCORMICK, 1988).


66
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Linhibition de la synthse des mycotoxines en prsence dextraits est due essentiellement
aux composs phytochimique. Ltude effectue par SIDHU et al (2009) rvle que La
combinaison dhuile essentielle de Citronnelle avec de l'extrait mthanolique de Citrullus
colocynthis inhibent jusqu 90% de la production d'aflatoxine, y compris lAFB1 alors que
d'autres combinaisons ninhibaient que prs de 70% des aflatoxines.
HUA et al (1999) rapportent que les composs phnoliques inhibent au dbut plutt qu' la
fin les tapes de la voie de biosynthse dAFB1. GHORBANIAN et al (2008) rapportent que
l'inhibition de la synthse des aflatoxines est en relation avec le temps de contact et la dose de
lextrait.
Le dpistage dagents bioactifs partir des plantes est l'un des axes les plus intensif dans la
recherche des produits naturels aujourd'hui, car l'activit des extraits de plantes prsente un
grand intrt en particulier contre les souches multi rsistantes, mais le domaine est loin d'tre
puis et seulement 10% de toutes les plantes avaient t tudies en dtail pour leur agents
bioactifs (ABDEL-GHANI et al., 2008).
Citrullus colocynthis peut galement tre utilise comme un facteur de premier plan dans
un large ventail dactivits contre de nombreux phytopathognes, o ces pathognes ont
dvelopp une rsistance contre les fongicides spcifiques (idazoles benzim, dicarboximides,
diethofuncarband et les inhibiteurs de la biosynthse des strols) (ELAD, 1991).
CONCLUSION
Ltude de lactivit antifongique des extraits des graines de Citrullus colocynthis par
la mthode de micro-dilution en milieu solide a rvl que les deux extraits mthanoliques
et aqueux possdent une remarquable activit antifongique lie leur richesse en composs
bioactifs largement rpandus dans les plantes mdicinales. Lextrait mthanolique possde
une activit fongicide sur la majorit des souches fongiques slectionnes lexception
dA. flavus qui sest rvle rsistante. Lextrait aqueux a dmontr son effet fongicide
uniquement sur A. ochraceus.
Les extraits bruts des graines de Citrullus colocynthis tests montrent une activit
antimycotoxinogne leve puisquils ont pu atteindre les sites de synthse des toxines. Les
deux extraits ont inhib la synthse dochratoxine A produite par Aspergillus ochraceus et
daflatoxine B1 produite par Aspergillus flavus malgr que les deux types dextraits nont
pas affect la croissance de cette dernire.


67
Etude exprimentale. Rsultats et discussions.
Les extraits des graines de Citrullus colocynthis peuvent constituer donc une nouvelle
stratgie de dcontamination pour la lutte contre les mycotoxines.



g r
p



68
Conclusion gnrale et perspectives
Au cours de notre tude, mene sur lactivit antifongique et antimycotoxinogne des
extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis sur quelques souches isoles
du bl tendre stock, le premier objectif identifi fut ltude de la qualit physicochimique,
microbiologique et mycotoxicologique du bl tendre local et import stock lOAIC de la
wilaya de Saida.
Pour rpondre cet objectif, un chantillon reprsentatif de chaque varit de bl a t
analys.
Selon les analyses mycologiques, la charge fongique la plus leve est celle du bl tendre
import, qui reprsente un substrat trs favorable pour la croissance des moisissures vu sa teneur
en eau leve provenant du transport maritime.
Le genre Aspergillus reprsent par diffrentes espces a t retrouv dans les deux
varits analyss avec une frquence et une abondance leve suivi de Penicillium et
Cladosporium qui sont peu frquents et enfin, le genre Fusarium qui est le moins frquent.
Parmi les espces du genre Aspergillus, deux espces ont t rvles productrices de
mycotoxines.
La recherche daflatoxine B1 (AFB1) et dochratoxine A (OTA) sur les diffrents substrats
analyss sest rvle ngative. Labsence des aflatoxines et des ochratoxines sur le bl tendre
local et import malgr la prsence des souches productrices de ces toxines pourrait tre
explique par les conditions dun environnement dfavorable pour la synthse de ces dernires.
Pour rpandre au second objectif valuant lactivit biologique des extraits des graines de
la coloquinte, des examens phytochimiques ont t effectus. Ils dmontrent que les graines de
Citrullus colocynthis sont une source privilgie de molcules biologiquement actives, parmi ces
composs on cite les polyphnols reprsents par les tanins hydrolysables, les anthraquinones,
les flavonodes, les anthocyanes et les saponosides. Les strodes et les alcalodes y sont aussi
prsents.
Ltude de lactivit antifongique des extraits des graines de Citrullus colocynthis a rvl
que les deux extraits, mthanolique et aqueux, possdent une activit antifongique lie leur
richesse en composs bioactifs largement rpandus dans les plantes mdicinales. Lextrait
mthanolique possde une activit fongicide sur la majorit des souches fongiques slectionnes
lexception dA. flavus qui sest rvle rsistante. Lextrait aqueux a dmontr son effet
fongicide uniquement sur A. ochraceus.


69
Les extraits bruts des graines de Citrullus colocynthis tests montrent une activit
antimycotoxinogne leve puisquils ont pu atteindre les sites de synthse des toxines. Les deux
extraits ont inhib la synthse dochratoxine A produite par Aspergillus ochraceus et
daflatoxine B1 produite par Aspergillus flavus malgr que les deux types dextraits nont pas
affect la croissance de cette dernire. Les extraits des graines de Citrullus colocynthis peuvent
donc constituer une nouvelle stratgie de dcontamination pour la lutte contre les mycotoxines.
A lissue de cette tude et afin dlucider certains points rests peu claires, il apparait
ncessaire deffectuer dautres tudes approfondies qui se rsument dans les points suivants :
- Identification molculaire des souches fongiques isoles du bl tendre pour connaitre leur
origine et leur toxicit (et mme la possibilit de mutation).
- Une tude in vivo pour obtenir une vue globale sur lactivit antifongique des extraits de
graines de Citrullus colocynthis tests.
- Extraction et caractrisation des composs actifs par des mthodes plus spcifiques
- Ralisation dune tude toxicologique avant lapplication des extraits au niveau des silos
de stockage.







70
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I. Composition des milieux de culture
Milieu PDA (Potatoes Dextrose agar)
Pomme de terre (macration 500ml de filtrat) 200 g
Dextrose 10 g
Agar 15 g
Eau distille 1000 ml
Milieu CDA (Czapek Dox Agar)
Sucrose 30 g
KH2PO4 1 g
KCL 0.5 g
MgSO4 0.5 g
FeSO4 0.01 g
NaNO3 3 g
Agar 15 g
Eau distille 1000 ml
(Czapek Concentre)
NaNO3 30 g
KCL 5 g
MgSO4 5 g
FeSO4 0.1 g
Eau distille 100 ml
Milieu MEA (Malt Extract Agar)
Matire Sche 50 g
Agar 5 g
Eau distille 1000 ml
Milieu YES (Yeast Extract Sucrose)
Sucrose 40 g
Extrait de Levure 20 g
Eau distille 1000 ml
Milieu CYA (Czapek Yeast Agar)
Czapek Concentre 10 ml
KH2PO4 1 g
Extrait de levure 5 g
Sucrose 30 g
Agar 15 g
Eau distille 1000 ml
Milieu G25N (25 % Glycrol Nitrate Agar)
KH2PO4 0.75 g
Czapek Concentre 7.5 ml
Extrait de levure 3.7 g
glycerol 250 g
Agar 12 g
Eau distille 750 ml

Milieu AFPA (Milieu Selectif pour A.flavus et A.parasiticus)
Extrait de levure 20 g
peptone 10 g
Citrate ferrique ammoniacal 0.5 g
chloramphenicol 0.1 g
Dichloran solution ethaolique 0.2% 1 ml
Agar 15 g
Eau distille 1000 ml
Eau physiologique
NaCl 9 g
Eau distille 1000 ml
Lactophenol
Phnol pur cristallis 20 g
Acide lactique 20 ml
Glycrol pur 20 ml
Eau distille 40 ml
Rose Bengal
Rose bengal 1 g
Eau distille 100 ml
Bleu de coton
Lactophnol
bleu de mthylne
0,5 g
Coconut extract agar (CEA)
Cent grammes de la noix de coco dchiquete ont t homogniss pendant 5 minutes avec 300
ml d'eau distille chaude. La solution est filtre l'aide du tissu. L'agar a t ajout (20 g/liter).
Le mlange a t alors strilis l'autoclave 121C/15 minutes. Le pH final est de 7,0.
II. Rglements des teneurs en mycotoxines dans les denres alimentaires
Tableau 11. Valeurs recommandes par le Codex Alimentarius pour les changes mondiaux de
denres alimentaires destines lhomme
Mycotoxines Denres
Teneurs maximales
admissibles (g/kg)
Aflatoxine B1 Alimentation infantile 1
Aflatoxine M1 Lait 0.5
Ochratoxine A Crales 5
Patuline
Pommes (jus et produits base
de)
50

Tableau 12. Rglements europens pour la limitation des teneurs en mycotoxines dans les denres
alimentaires destines lhomme (N 466 du 8/03/2001, JOCE L77 ; N 472 du 12/03/2002, JOCE
L75 ; N 257 du 12/02/2002, JOCE L41).
Mycotoxines Denres
Teneurs maximales
admissibles (g/kg)
Aflatoxine B1
Arachides, fruits coque et schs, et
produits drivs
Arachides soumises traitement
physique avant consommation ou
ingrdients
Fruits coque et schs soumis
traitement physique avant consommation
ou ingrdients
Crales et drivs, consommation
directe ou ingrdients
Crales soumises traitement
physique avant consommation ou
ingrdients
2
8
5
2
2
Aflatoxine B1
pices (poivre, piments, paprika, noix
de muscade, gingembre, safran)
5
Aflatoxine M1 Lait 0.05
Ochratoxine A
Crales (dont riz et sarrasin) et
produits drivs, grains bruts
Produits drivs et grains
consommation directe
Raisins secs
5
3
10
Patuline
Jus de fruits (pomme) et nectar de
fruits
Boissons spiritueuses, cidres et
boissons fermentes
Produits base de morceaux de
pomme (compote et pure)
Jus de pomme et produits base de
morceaux de pomme (compote et pure
50
50
25
10

Rsum :
Contribution ltude de lactivit antifongique et antimycotoxinogne des extraits mthanoliques et aqueux des graines de Citrullus colocynthis
sur quelques souches fongiques isoles du bl tendre stock.
Les extraits de plantes et leurs constituants ont une longue histoire comme agents antifongique. Cependant, leur utilisation comme prservateurs de bl
tendre a t rarement rapporte. Ce travail porte sur ltude in vitro de lactivit antifongique et antimycotoxinogne des extraits mthanolique et aqueux des
graines de Citrullus colocynthis (L.) Schard, une plante aromatique et mdicinale de la flore du Sahara algrien, vis--vis de quelques champignons pathognes de
contamination du bl tendre stock.
Ltude de la qualit du bl tendre local et import a montr que le taux de contamination de la varit importe est trs lev. Le genre Aspergillus
reprsent par des espces diffrentes a t retrouv dans les deux varits analyses avec une frquence et une abondance allant de 41 plus de 86% de la flore
totale identifie sur milieu CDA et PDA. Les genres Penicillium et Alternaria sont peu frquents. Enfin, Les genres Cladosporium, Ulocladium et Fusarium sont
les moins abondants dans les deux varits de bl tendre analyses. Parmi ces moisissures au moins deux espces du genre Aspergillus sont potentiellement
toxinognes.
Lanalyse phytochimique des extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis a rvl la prsence de quelques groupes chimiques
(polyphnols totaux, strodes et alcalodes) susceptibles dexprimer les activits antifongiques recherches. Lactivit antifongique des extraits est teste par la
mthode de micro-dilution en milieu solide afin de calculer lindice antifongique. Les rsultats suggrent que lextrait mthanolique a empch totalement la
croissance myclienne dA. fumigatus et A. niger avec une CMF de 2.5% (25mg/ml) et A. ochraceus avec une CMF de 0.5% (5 mg/ml) enregistrant un indice
antifongique de 100%. A la mme concentration 2.5% (25mg/ml) lextrait aqueux a inhib la croissance dA. ochraceus. Les deux extraits possdent un bon
pouvoir antimycotoxinogne. La synthse dAFB1 et dOTA produites par A. flavus et A. ochraceus est bloque en prsence des extraits dans le milieu YES. Les
rsultats montrent que les extraits mthanolique et aqueux des graines de Citrullus colocynthis utiliss faible concentration pourraient avoir un potentiel
important pour le contrle biologique des champignons dans les denres alimentaires.
Mots cls : Bl tendre, Citrullus colocynthis, extrait aqueux, extrait mthanolique, analyse phytochimique, indice antifongique, pouvoir antimycotoxinogne.

Abstract
Contribution to study of the antifungal and antimycotoxigenic activity of methanol and aqueous extract of seeds of Citrullus
colocynthis against some fungi isolated from wheat stored.
Plant extracts and their constituents have a long history as antifungal agents. However, their use to preserve wheat has rarely been reported.
This work is based on in vitro study of the antifungal and antimycotoxinognic activity of methanol and aqueous extracts of the seeds of Citrullus
colocynthis (L.) Schard, an aromatic and medicinal plant of the flora of the Algerian Sahara, against some pathogenic fungi contaminated the stored
wheat.
The study of the quality of local and imported wheat has shown that the rate of contamination of the imported variety is very high. The genus
Aspergillus represented by different species was found in two varieties which had been analyzed with a frequency and an abundance ranging from 41 to
more than 86% of the total flora in CDA and PDA. Whereas Penicillium and Alternaria are uncommon. Finally, the genus Cladosporium, Fusarium and
Ulocladium are less abundant in the wheat varieties analyzed. Among these molds at least two species of the genus Aspergillus are potentially toxigenic.
The phytochemical analysis of methanol and aqueous extracts of the seeds of Citrullus colocynthis revealed the presence of some chemical
groups (total polyphenols, steroids and alkaloids) that can express the desired antifungal activities. To calculate the index antifungal, the antifungal
activity of extracts was tested by the method of micro-dilution in a solid medium. The results suggest that the methanol extract has completely inhibited
mycelial growth of A. fumigatus and A. Niger with MFC = 2.5% (25mg/ml) and A. ochraceus with MFC = 0.5% (5 mg / ml), the index antifungal is
100%. At the same concentration of 2.5% (25mg/ml) the aqueous extract inhibited mycelial growth of A. ochraceus. Both extracts have good power
antimycotoxinognic. The synthesis of AFB1 and OTA is blocked in the presence of extracts in the mid YES. The results show that the methanol and
aqueous extracts of the seeds of Citrullus colocynthis used at low concentrations can have great potential for biological control of fungi in food.
Key words: wheat, Citrullus colocynthis, aqueous extract, methanol extract, phytochemical analysis, index antifungal, antimycotoxinognic power.






Aspergillus % 41 % 86 CDA PDA Penicillium Alternaria
Cladosporium Ulocladium Fusarium
Aspergillus

A.fumigatus
A.niger 2.5 % ) 25 ( A.oc hraceus 0.5 % ) 5 ( 2.5 % ) 25 (
A.ochraceus OTA 1 AFB
A.ochraceus A.flavus YES .


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