Analisis Theobromine dan terkait Senyawa dengan RP-HPLC / UV

Makanan
Analisis theobromine dan kafein dalam berbagai merek produk kakao dijelaskan pada Tabel
1 (6,14, 39-41). Jumlah rata-rata senyawa ini diperoleh Caudle et al. (14) adalah 5,1 mg per 100 g;
presisi dan akurasi dibandingkan antara metode Asosiasi Resmi Kimia Analitik (AOAC International),
disetujui untuk kuantifikasi methylxanthines, dan ekstraksi air dengan menggunakan metode
penambahan standar. Metode AOAC untuk kuantifikasi dapat dilakukan dengan baik standar internal
dan eksternal. Pemulihan theobromine adalah 99,6% menggunakan metode penambahan standar,
tetapi hanya 89,3% menggunakan metode AOAC International. Meskipun metode penambahan
standar diharapkan lebih tepat dan akurat, tidak memerlukan penggunaan pelarut organik dan
kurang dikembangkan secara bertahap, sehingga isi padat methylxanthines dalam coklat tidak dapat
ditentukan dengan benar.
Ramli et al. (39) menentukan tingkat theobromine pada 32 sampel merek populer lokal
(Kuala Lumpur, Malaysia) dan cokelat impor. Dalam cokelat lokal, titer rata-rata adalah 0.72 mg / g
dalam susu cokelat dan 0.85 mg / g dalam dark chocolate. Jumlah theobromine dalam cokelat putih
adalah di bawah 0,05 mg / g. Dalam cokelat impor, tingkat rata-rata adalah 1.05 mg / g dalam dark
chocolate, 0.76 mg / g dalam susu cokelat dan 0.74 mg / g cokelat putih. Nilai rata-rata dalam lapisan
cokelat dan lapisan coklat yang dibuat dari pengganti lemak yang 0.82 dan 0.49 mg / g, masingmasing. Sementara itu, Meng et al. (40) diperoleh 8.83 dan 1.26 mg / g dalam komersial gelap dan
cokelat susu, masing-masing. Jumlah theobromine dalam cokelat putih adalah di bawah batas
deteksi.

minuman

Penentuan rutin kualitas teh baru-baru ini telah memperoleh kepentingan substansial
karena efek farmakologis dan aplikasi dalam industri makanan. Tabel 2 (19,23,24,34,42-50)
merangkum data ini.
Genarro dan Abrigo (23) dianalisis theobromine menggunakan terbalik fase ion-interaksi
HPLC / UV sebagai strategi untuk deteksi spektrofotometri. Interaksi reagen yang digunakan dalam
fase gerak adalah ortofosfat octylamine, dan tingkat deteksi untuk theobromine menggunakan
metode ini ditemukan menjadi 0,15 ppm. Selain itu, Meyer et al. (24) menggunakan RP-HPLC untuk
menganalisis minuman dengan deteksi amperometri. Batas deteksi untuk theobromine adalah 2,5
ng. Selain itu, Nakakuki et al. (42) mengubah metode sebelumnya dengan beralih jenis deteksi (UV),
fase gerak dan menambahkan pra-kolom (10 cm x 4,6 mm), dikemas dengan
polyvinylpolypyrrolidone. Metode ini memungkinkan deteksi theobromine dalam waktu kurang dari
10 menit (waktu retensi). Untuk solusi standar theobromine menggunakan metode ini, standar
deviasi relatif (RSD) adalah sekitar 0,3% untuk waktu retensi dan sekitar 2,5% untuk daerah puncak.
Selain itu, kurva kalibrasi theobromine adalah linier dari 5 sampai lebih dari 1000 ng.
Lacerda et al. (47) dievaluasi sampel komersial teh hitam, teh mate dan jenis-jenis teh
menggunakan metode ekstraksi yang berbeda: rebusan, perawatan ultrasonik dan microwave. Para
penulis menggunakan Nova-Pak C18 pra-kolom, sebuah analisis RP-18 LiChospher kolom (Alltech Inc,
Springfield, KY, USA) dan standar eksternal untuk mendapatkan koefisien korelasi yang baik untuk
theobromine (0,9998). Ekstraksi dengan bantuan gelombang mikro tampaknya lebih efisien daripada

metode ekstraksi lainnya. Sayangnya, waktu retensi dan batas deteksi yang tidak terdaftar. Hor`i} et
al. (48) membandingkan isi theobromine dalam teh dan infus herbal (Camellia sinensis L.) serta
pengaruh kondisi ekstraksi yang berbeda (suhu air dan jumlah ekstraksi). Menurut hasil, isi
theobromine meningkat dengan suhu air (60 <80 <100 C) dan menurun dengan jumlah ekstraksi
berulang (ekstraksi 1> ekstraksi 2> ekstraksi 3).
Analisis ini menunjukkan rata-rata 3,8 kali lipat perbedaan antara 1 dan ekstrak 3 dari semua
teh, sedangkan ekstrak berikutnya infus herbal menunjukkan isi yang hampir dapat diabaikan
theobromine. Selain itu, Hu et al. (49) teh juga diperiksa C. sinensis tetapi sampel siap melalui infus
dalam dua cara: larutan 50% asetonitril (metode A) dan mendidih dalam air suling (metode B).
Konsentrasi theobromine lebih tinggi pada infus teh dibuat dengan metode A.
Bispo et al. (43) menentukan konsentrasi senyawa-theobromine terkait minuman dalam
berjalan hanya 6 menit. Dalam penelitian ini, kurva kalibrasi untuk theobromine memiliki linearitas
yang baik (0,9996) dan standar deviasi relatif 0,64%. Konsentrasi mereka berkisar dari 0,1 pg / mL 32
mg / mL. Metode ini terbukti tepat dan tidak membutuhkan derivatisasi sampel.
Mizukami et al. (50), menggunakan katekol sebagai standar internal, menganalisis senyawatheobromine terkait, catechin, asam galat dan strictinin dalam teh komersial. Menurut penulis, ini
adalah alternatif terbaik karena lebih murah, terutama ketika ada beberapa senyawa yang akan
dianalisa dalam sampel tunggal. Metode yang ditawarkan pengulangan yang baik, reproduktifitas,
tingkat pemulihan dan resolusi komponen. Penambahan asam askorbat diawetkan stabilitas standar
acuan catechin mahal dalam larutan stok untuk 1 tahun bila disimpan pada -30 C. Hanya jejak
theobromine diidentifikasi dalam sampel. Batas deteksi, koefisien korelasi dan batas kuantifikasi
untuk kurva kalibrasi masing-masing adalah 0.44, 0.998 dan 1.35 Ig / mL,. Kisaran adalah dari ND
(tidak terdeteksi) sampai 10 IG / mL dengan rata-rata 9 Ig / mL, dan 7-19 IG / mL dengan rata-rata 13
Ig / mL dalam teh botol dan diseduh, masing-masing.
Alves dan Bragagnolo (34) dioptimalkan metodologi untuk analisis teh, menciptakan metode
untuk penentuan kafein dalam kopi menggunakan HPLC. Metode menunjukkan nilai koefisien
korelasi yang baik untuk kurva kalibrasi, pemulihan yang baik dan batas deteksi yang baik untuk
theobromine (0,99991, 95% dan 0.0003 g per 100 g, masing-masing). Proses ini terbukti sederhana,
ekonomis dan tepat.
De Arago et al. (19) menggunakan analisis multivariat faktorial penuh dalam tiga tingkatan
untuk optimalisasi pemisahan kromatografi senyawa-theobromine terkait. Fase gerak dipelajari
dalam hal polaritas, fluks, selektivitas dan keasaman. Metode yang dihasilkan memiliki resolusi tinggi
untuk semua methylxanthines dalam waktu kurang dari 6 menit, dan batas deteksi yang dilaporkan
untuk theobromine adalah 0.07 g / L. Optimasi ini cepat, dan ekstraksi atau derivatisasi sampel tidak
diperlukan.
Dalam karya oleh Sharma et al. (44), efek dari metode elusi, fase gerak, panjang gelombang
dan suhu kolom dalam pemisahan theobromine- senyawa terkait dipelajari. The optimum metode
yang dikembangkan memiliki linearitas yang baik, dengan koefisien korelasi berkisar 0,954-0,990,
baik reproduktifitas dan akurasi. Selain itu, menunjukkan hasil yang memuaskan dan dapat
diterapkan untuk semua jenis teh untuk analisis rutin.
Da Costa Silva dan Augusto (45) pertama kali digunakan ekstraksi fase padat untuk
menganalisis air alami. Silika organik diubah (ORMOSIL) yang molekuler dicantumkan kemudian
disiapkan melalui prosedur sol-gel yang sederhana dan dievaluasi sebagai penyerap khusus untuk
ekstraksi fase padat (SPE) dari methylxanthines dari sampel air.

Kafein digunakan sebagai template untuk perbandingan molekuler dicetak ORMOSIL dengan
non-tercetak silika (NIS) dan kartrid SPE C18. Teknik pencetakan molekul ditemukan mampu
menghasilkan bahan dengan selektivitas tinggi untuk senyawa tertentu. Silika Dicetak dibuat dengan
metode sol-gel diproduksi oleh penggabungan rantai template silika organik diubah (ORMOSIL).
Karena sifat khusus dari interaksi antara bahan tercetak molekuler dan molekul dipilih, mereka telah
bekerja di beberapa teknik analisis, termasuk kromatografi cair (51,52). Misalnya, da Costa Silva dan
Augusto (45) melaporkan bahwa molekuler dicantumkan silika diperoleh satu puncak yang
diidentifikasi sebagai (waktu retensi 5,05 menit) theobromine. Puncak dalam kromatogram
menggunakan non-tercetak silika yang terasa kecil, mengkonfirmasikan keuntungan dari pencetakan
molekuler. Oleh karena itu, molekuler dicetak ORMOSIL adalah sangat spesifik, menunjukkan
selektivitas yang baik dengan batas deteksi 0,09 mg / L dan batas kuantifikasi 0.29 mg / L untuk
theobromine.
Penerapan sempit bore kolom monolitik baru untuk penentuan simultan methylxanthines
dalam berbagai sampel nyata seperti minuman ringan, teh dan kopi juga diselidiki (46). Pemisahan
dioptimalkan dan divalidasi. Metode yang diusulkan menawarkan waktu analisis yang lebih pendek
dan penurunan drastis dalam konsumsi fase gerak dan pelarut organik.
cairan biologis
Kondisi kromatografi untuk analisis senyawa-theobromine terkait dalam cairan biologis
dijelaskan dalam Tabel 3 (25,26,29,30,43,53). Prez-Martnez et al. (26) menggunakan kromatografi
cair kinerja tinggi fase balik dengan detektor UV (RP-HPLC / UV) untuk penentuan methylxanthines
dalam urin dengan menggunakan fase gerak misel. Satu keuntungan adalah bahwa metode ini tidak
memerlukan dimasukkannya prosedur untuk membersihkan sebelum sampel (28). RP-HPLC
kemudian memisahkan molekul-molekul dalam cairan biologis atas dasar perbedaan hidrofobik
mereka. Lebih khusus, komponen aliran campuran analit lebih dari partikel stasioner fase bantalan
pori cukup besar bagi mereka untuk masuk, di mana interaksi dengan permukaan hidrofobik
menghapus mereka dari mengalir sungai ponsel-fase. Kekuatan dan sifat interaksi antara partikel
sampel dan fase diam tergantung pada kedua interaksi hidrofobik dan polar. Para penulis juga
menggunakan kolom penjaga (35 4,6 mm) yang memiliki karakteristik serupa dengan kolom
analitik dan laju alir 1 mL / menit. Komposisi fase yang tepat mobile (pH, konsentrasi SDS, sifat dan
konsentrasi pelarut organik) untuk pemisahan juga diselidiki. Batas deteksi dengan UV untuk
theobromine adalah 0,4 mg / mL, dan prosedur memungkinkan penentuan tiga senyawa dalam
sampel dalam waktu kurang dari 10 menit (26).
Zambonin et al. (29) menggunakan RP-HPLC untuk menganalisis theobromine dalam sampel
urin manusia dengan array dioda de-tector (DAD) dan pra-kolom (20 x 2.1 mm, 5 mm) dengan laju
alir 0,2 mL / menit. Pemulihan, batas deteksi dan kuantifikasi untuk theobromine adalah (99,3
6,3)%, 0,3 dan 1,2 mg / mL, masing-masing. Selain itu, Aresta et al. (30) dianalisis theobromine
dalam susu manusia, tetapi mengubah komposisi buffer, ukuran kolom / pra-kolom dan aliran (1 mL
/ menit). Sebuah pemulihan 60.2 kemudian diamati untuk theobromine.
Sebuah detektor array dioda terdiri dari satu sirkuit terpadu yang memiliki sensor radiasi,
kapasitas muatan menyimpan dan unit membaca. Kinerja keseluruhan dari perangkat dengan DAD
ditentukan sebagian besar pada karakteristik detektor, seperti rentang spektral respon, akurasi dan
presisi dalam pengukuran panjang gelombang dan intensitas cahaya, resolusi, sensitivitas, dan
karena itu sinyal / kebisingan dan dinamika Band. Hal ini mampu menghasilkan jumlah yang relatif
besar titik data dalam waktu yang sangat singkat dengan memindai rentang panjang gelombang (54).

Bispo et al. (43) dianalisis kafein, theobromine dan teofilin dalam urin mengikuti kondisi
yang sama seperti di atas (29) pada konsentrasi mulai dari 0,1 pg / mL menjadi 13,2 Ig / mL.
Analisis dalam urin dilakukan dalam kondisi optimal yang disebutkan di atas oleh de Arago
et al. (19) dan da Costa Silva dan Augusto (45); penulis kedua menyimpulkan bahwa efisiensi
ekstraksi theobromine menggunakan dicantumkan silika rendah, kira-kira. 68%. Angka-angka ini
bahkan lebih kecil untuk methylxanthines sebelum konsumsi susu cokelat. Kromatogram ekstrak dari
ekstraksi C18 menunjukkan beberapa puncak terdeteksi di kromatogram molekuler tercetak
ORMOSIL. Juga, puncak theobromine dalam kromatogram C18 adalah cacat. Menurut penulis,
penelitian ini merupakan hasil dari analit co-dipertahankan tidak hadir dalam ekstrak molekuler
tercetak ORMOSIL.
Akhirnya, Hieda et al. (25) dianalisis senyawa-theobromine terkait dalam urin dan plasma
manusia dengan HPLC dengan pemboman atom tipe 'frit-cepat' (RP-HPLC - frit-FAB-MS). Para penulis
menggunakan pre-kolom (ODS- -HG-15/30 35 0,3 mm, 5 im) dan dua fase mobile. Theobromine
diamati sebagai pseudo-molekul ion [M + H] + pada m / z = 181, tetapi sedikit fragmentasi jelas. Dari
Tabel 3, dapat dilihat bahwa semua tes dilakukan dalam kondisi isokratik.
Ptolemy et al. (53) menggabungkan ultracentrifugation- tunggal sampel berbasis
pretreatment dan kromatografi-spektrometri massa tandem cair untuk mengukur theobromine dan
kafein dalam air liur, plasma dan urin sampel. Pengujian adalah linear pada rentang konsentrasi 160
kali lipat 2,5-40 umol / L untuk kedua theobromine (rata-rata R2 = 0,9968) dan kafein (rata-rata R2 =
0,9997).

tanaman
Reginatto et al. (16) dianalisis senyawa-theobromine terkait dalam spesies dari genus Ilex.
Sebuah pra-kolom RP-C18 (39 3.0 mm, 5 nm) dan laju alir 0,5 mL / menit yang digunakan.
Menariknya, senyawa ini hanya ditemukan dalam dua varietas pasangan (Ilex paraguariensis).
Namun, prosedur yang digunakan memiliki keuntungan menjadi sederhana, tepat dan akurat (Tabel
4; 15,16,32,55-63).
Sebuah analisis oleh Gnoatto et al. (55) juga bertujuan untuk membandingkan tujuh metode
ekstraktif di Ilex paraguariensis dan menentukan pengaruh kondisi ekstraksi (dalam ekstraktor
Soxhlet dan dengan rebusan) dari methylxanthine hasil. Batas deteksi dan kuantifikasi theobromine
adalah 0.09 dan 0.30 g / mL, masing-masing, dinilai dalam linearitas untuk metode (0,32-4,85 g /
mL). Ekstraksi theobromine oleh rebusan dengan larutan asam menunjukkan efisiensi yang lebih
tinggi. Oleh karena itu, untuk secara bersamaan theobromine dan kafein kuantifikasi rebusan
dengan larutan berair asam direkomendasikan.
Lopes et al. (56) ditentukan theobromine dan kafein dalam daun tanaman muda dan tua.
Tingkat theobromine dan koefisien variasi yang ditemukan dalam daun muda dan tua adalah 0,05
dan 0,08%, dan 3,61 dan 1,16%, masing-masing. Metodologi yang digunakan terbukti cocok untuk
studi kontrol kualitas dan / atau pemalsuan. Kandungan methylxanthines di 16 progeni pasangan
dari 4 wilayah di Brasil dievaluasi oleh Cardozo Jr et al. (58). Puncak dalam kromatogram
diidentifikasi dibandingkan dengan waktu retensi standar. Perbedaan signifikan yang diamati dalam
isi theobromine di 16 progeni, membagi mereka menjadi 3 kelompok (0.086,? 0.091 dan 0.237%),
dan di antara 4 daerah asal. Tidak ada perbedaan yang ditemukan antara tiga daerah di mana
progeni ditanam.