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Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas
circunstancias metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario
sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresin, denominados
promotores fuertes, que tambin pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de
crecimiento.
Figura 4.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la
transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1 ori,
origen de replicacin f1 y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado
en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lac I. Los vectores usualmente presentan ms de un
origen de replicacin, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori es el origen
de replicacin usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla.
Transformacin
Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son
la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector, o
mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformacin de plantas). En el caso
de la transformacin de bacterias, generalmente se introduce el DNA ajeno por
microelectroporacin o por choque trmico.
Durante el choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con
agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre stos se
encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga elctrica de la
membrana al recubrir las cabezas polares de lpidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que
disminuye la repulsin de cargas elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la
membrana y adems facilita la entrada del plsmido al interior celular. Las clulas que han
recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introduccin de material gentico se
denominan clulas competentes.
Una vez que se introduce el material gentico a las clulas competentes, se disminuye la
temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al
colocar a las clulas en condiciones ptimas de crecimiento se obtienen las clulas
transformantes.
En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.4, que
contiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la
tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que
las clulas son transformantes.
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Figura 4.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 4.3) fue utilizado para la
construccin del vector pET-TEM-1. Se insert el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin
mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa.
Para insertarlo se adicion el sitio de restriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen la secuencia
que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias,
en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia
seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector
pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a kanamicina ya que el plsmido contiene
un gene que confiere la resistencia a ese antibitico.
Material biolgico
1 tubo de microcentrfuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo,
mantenerlas congeladas hasta su uso.
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo,
mantenerlas congeladas hasta su uso.
Plsmido PET-TEM-1.
Materiales y equipo
2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL)
Tubos de microfuga de 1.5 mL
Varilla de vidrio en forma de L
Recipiente para hielo
Mechero Bunsen
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 10-100 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Material por grupo
Bao de incubacin a 42C
Incubadora con agitacin a 37C
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http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm
eficiencia de la transformacin)
(determinacin
de
Inocular
Clulas transformantes
Referencias
Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences &
2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin,
WH Freeman.
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EcoRI
HindIII
HaeIII
Figura 4.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde
se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.
3.
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Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y
negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que
las muestras migren hacia el lado positivo de la cmara.
Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la
observacin de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado
sobre una lmpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin
ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrlico
entre el observador y la fuente de luz UV.
Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si es que
estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.
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Cuestionario
1. Qu parte de la molcula de DNA le confiere la carga negativa?
2. Cul es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los
dos colorantes que contiene?
3. Por qu el bromuro de etidio es un reactivo mutagnico?
4. A que se le denomina topoismeros?
5. En la prctica se pudieron observar topoismeros?
6. Qu peso molecular tienen los topoismeros?
7. Qu tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la prctica, romos o
cohesivos?
8. Cuntos fragmentos de DNA o restriccin se obtuvieron al utilizar las dos enzimas
NdeI y BamH1?
9. Cuntos fragmentos se obtuvieron al utilizar slo una de las enzimas de restriccin?
Por qu?
10. Cul fue el peso molecular del DNA liberado y del plsmido o vector?
11. Cules son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restriccin?
Referencias
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Introduccin
La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas
y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
protenas. Los sistemas bacterianos han sido los ms utilizados para este fin, debido a que son
fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos y
se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas
inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatizacin en proyectos de produccin a gran
escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas.
A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las protenas de eucariontes o
las protenas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico
del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (protenas que se unen a las protenas recin
sintetizadas), as como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son
muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias
no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin, como los sistemas de clulas de mamfero,
de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las protenas eucariontes de manera correcta
y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo de estos sistemas
es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms complicada. Adicionalmente,
la produccin de grandes cantidades de protenas, como algunos productos teraputicos, se puede
lograr tanto en plantas como en sistemas animales.
Muchas compaas ofrecen una serie de vectores con capacidades de expresin muy variadas, con o
sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin de la protena
deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.
Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de protenas
heterlogas en E. coli. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de
expresin fuerte del promotor del bacteriofago T7, que controla la alta expresin de la RNA
polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la
RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms
detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se
exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de la protena de inters, se
tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el isopropil-D tiogalactosido
(IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del opern de la
lactosa (Fig. 4.9). El IPTG se une a la protena represora, ocasionndole a la protena un cambio
conformacional que le impide su funcin biolgica de unirse al DNA. La actividad biolgica de la
protena represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo, en el caso
del vector pET, la transcripcin del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripcin del
transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represin del gen es denominado induccin, por lo que
el IPTG es llamado inductor. El gen que codifica a la protena represora se encuentra incluido en el
vector, LacI, y su transcripcin ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9).
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Figura 4.9. Mecanismo de accin del IPTG en la expresin de protena mediada por el vector pET.
Como se mencion anteriormente, la produccin de la protena recombinante en un organismo no
relacionado puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las
modificaciones post-traduccionales necesarias o bien porque no se pleg adecuadamente,
provocando su aglomeracin. Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo
pueden solubilizarse a travs del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de
inclusin. En este caso, aumentan los costos de produccin y/o recuperacin de la protena.
En la prctica se llevar a cabo el monitoreo de la induccin de la -lactamasa en clulas completas
de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 4.4), vector que fue
producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostr en la Figura 4.3.
Material biolgico por grupo
1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo lquido saturado de clulas transformadas de E. coli (crecidas
por 12 a 16 horas con agitacin vigorosa).
Material y equipo
1 mechero
1 recipiente para hielo
Tubos para microfuga de 0.5 mL
2 vasos de precipitados 25 mL
1 pipeta Pasteur con bulbo
Recipiente de plstico para la tincin.
Micropipeta de 2 a 10 L
Micropipeta de 20 a 200 L
Micropipeta de 200 a 1000 L
1 caja de puntas de 10 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
Placas de vidrio
Peine
18
19
20
1.5 ml
Medio LB-kanamicina
Leer a 600 m
hasta obtener 0.6-0.8 Abs.
Agregar__________L 100mM IPTG
(concentracin final 0.5 mM)
1 mL
t=0
Incubar a 37 0C / agitacin.
Tomar una alcuota cada 30 min
t=0
1 mL
t = 30 min
1 mL
t = 60 min
1 mL
t = 90 min
1 mL
t = 120 min
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