Vous êtes sur la page 1sur 243

Biochimie II: Biologie Moléculaire

Prof. Mohamed Chikri

Email: mchikri.fmf.ac@gmail.com 2009

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

La double hélice de Crick et Watson

Nous souhaitons suggérer une structure pour le sel de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Cette structure présente de nouvelles caractéristiques qui sont d'un intérêt biologique considérable." Francis Crick et James Watson, Nature - VOL 171, page 737, 1953 - 2 Avril 1953

Crick et Watson en 1953 devant leur modèle d'ADN
Crick et Watson en 1953 devant leur modèle d'ADN

Crick et Watson en 1953 devant leur modèle d'ADN

Ces deux chaînes ont 3 propriétés

essentielles:

Antiparallèles

Complémentaires

Hélicoïdales: configuration hélicoïdales

ont 3 propriétés essentielles: • Antiparallèles • Complémentaires • Hélicoïdales: configuration hélicoïdales

La double hélice de Crick et Watson

L'appariement est toujours:

A=T (2 ponts hydrogènes)

G=C (3 ponts hydrogènes)

Par

convention, l'écriture d'une

séquence d'ADN se fait toujours dans le sens 5' -> 3'

dénaturation de l'ADN

dénaturation = séparation des

deux brins par rupture des ponts

hydrogènes (p.ex. sous l'effet de

la chaleur).

temperature

=

température à laquelle 50% des

Tm

(température

=

melting

de

fusion)

molécules

d'ADN

sont

à

l'état

dénaturé.

Le

nucléotidique particulière dépend,

entre autres, de la richesse en A=T et G=C

d'une séquence

Tm

autres, de la richesse en A=T et G=C d'une séquence Tm • (importance pour les techniques

(importance pour les techniques

impliquant l'hybridation d'ADN:

PCR, southern blotting; cfr plus

loin)

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN
Biologie Moléculaire rappel : Structure de l’ADN

Nucléosomes

La totalité de la chromatine eucaryote est constitué de nucléosomes.

Un nucléosome contient une longueur d’ADN (200pb),

enroulée autour d’un

octamère contenant 2 copies des histones H2A, H2B, H3 et

H4.

Une seule protéine H1 est

associé e à chaque nucléosome

contenant 2 copies des histones H2A, H2B, H3 et H4 . • Une seule protéine H1

Biologie Moléculaire. Rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire. Rappel : Structure de l’ADN

ADN: notre matériel génétique

ADN: notre matériel génétique

Biologie Moléculaire. Rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire. Rappel : Structure de l’ADN

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Mécanisme de la réplication: elle est intégrée au déroulement du cycle cellulaire

: Réplication, réparation Mécanisme de la réplication: elle est intégrée au déroulement du cycle cellulaire
: Réplication, réparation Mécanisme de la réplication: elle est intégrée au déroulement du cycle cellulaire

Réplication:

Synthèse d’acide désoxyribonucléique (ADN) qui

reproduit exactement le génome d’une cellule au cours du cycle

cellulaire afin de préparer la division de cette cellule.

Cycle cellulaire et réplication

Une cellule qui ne cesse de se diviser passe

par 4 phases successives:

La phase G1 de croissance et préparation de la cellule par intensification de son métabolisme. (2n) La phase S (synthèse) durant cette phase réplication de l’ADN. (4n)

La phase G2 de croissance et de

préparation à la mitose (4n) La phase M: à ce stade se produit la division cellulaire et que se formeront donc 2 cellules filles diploïdes (2n).

On appelle G

0

l’état de repos des

cellules qui ne se divisent pas

donc 2 cellules filles diploïdes (2n). • On appelle G 0 l’état de repos des cellules

Réplication

semi-

conservatrice:

Chaque nouvelle

molécule

contient un brin ancien et un brin

nouveau.

Réplication • semi- conservatrice : • Chaque nouvelle molécule contient un brin ancien et un brin

Réplication

La

synthèse

respecte

les

règles

de

l'appariement

 

des

bases

A/T

et G/C

Réplication • La synthèse respecte les règles de l'appariement   des bases A/T et G/C

Réplication

chaque brin est

synthétisé dans

le sens 5' - > 3'

Réplication • chaque brin est synthétisé dans le sens 5' - > 3'

Modèle de la fourche de réplication

En résumé, lors de la réplication interviennent

essentiellements:

Hélicases et protéines SSB: déroulement de la double hélice Primase (RNA polymérase): qui, permet

la synthèse d’amorces de RNA

Polymérase III: qui poursuit la synthèse

de DNA sur l’amorce Polymérase I: hydrolyse les amorces les remplace par du DNA

Ligase: qui relie les fragments de DNA

DNA sur l’amorce Polymérase I : hydrolyse les amorces les remplace par du DNA Ligase :

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation
Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Xérodermie pigmentée

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation Xérodermie pigmentée

Biologie Moléculaire. Rappel : Réplication, réparation

Mécanismes de la réparation et pathologies associées

"Base excision repair":

Indépendamment de la réplication, les bases peuvent s'altérer.

Exemple de la déamination de cytosine, formant de l'uracile.

de la réplication, les bases peuvent s'altérer. Exemple de la déamination de cytosine, formant de l'uracile.
de la réplication, les bases peuvent s'altérer. Exemple de la déamination de cytosine, formant de l'uracile.
de la réplication, les bases peuvent s'altérer. Exemple de la déamination de cytosine, formant de l'uracile.

Biologie Moléculaire. Transcription et traduction

Synthèse de protéines: transcription, maturation, traduction (gène eucaryote)

Facteurs trans consensus épissage TATA ATG stop ADN ATAT TAC exon intron exon intron exon
Facteurs trans
consensus
épissage
TATA
ATG
stop
ADN
ATAT
TAC
exon
intron
exon
intron
exon
séquences cis
séquences cis
enhancer
promoteur
enhancer
cis séquences cis enhancer promoteur enhancer régions régulatrices région transcrite ARN primaire

régions régulatrices

région transcrite

ARN primaire

Transcription (ARN Pol II)régions régulatrices région transcrite ARN primaire A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG

AUG

transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF

stop

ARNm

ARNt-ac.am.

ARNr

Maturation(ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR

ORF

AUG
AUG

stop

5'UTR

II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA
II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA

AAAAAAAAAA

3'UTR
3'UTR

miRNA

Traduction

II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA

Protéine

Biologie Moléculaire. Transcription et traduction

Synthèse de protéines: régulation de la transcription

facteur généraux de la transcription: se lient sur la séquence TATA et

recrutent ARN polymerase II

Pathologie: toxicité de l'alpha-amanitine, inhibiteur de l'ARN polymérase

II

polymerase II Pathologie: toxicité de l'alpha-amanitine, inhibiteur de l'ARN polymérase II amanite phalloïde

amanite phalloïde

polymerase II Pathologie: toxicité de l'alpha-amanitine, inhibiteur de l'ARN polymérase II amanite phalloïde

Biologie Moléculaire: Transcription, Maturation ARN

Synthèse de protéines: maturation de l'ARN primaire en ARNm

addition de la coiffe (7-methyl GTP) en 5'

addition de la queue poly A en 3'

élimination des introns par épissage ("splicing"):

Pathologie: présence d'Anticorps anti snRNP dans le lupus érythémateux disséminé.

Addition du ‘cap’ à l’extrémité 5’

* Addition de la coiffe à l'extrémité 5des ARNm

Immédiatement après le début de la transcription.

Liaison

pyrophosphate

5-5entre

Guanine

et

le

premier nucléotide du transcrit Primaire.

7 methyl GTP+ N (ARNm) (ARNm)

du transcrit Primaire. • 7 methyl GTP+ N (ARNm) (ARNm) 7mGTP(5 ’ -5 ’)N coiffe •

7mGTP(5-5’)N

coiffe

La coiffe est requise pour la stabilité et la traduction de l'ARNm.

Addition du ‘cap’ à l’extrémité 5’

7 methyl GTP+ N (ARNm)

5’)N (ARNm)

5’ • 7 methyl GTP+ N (ARNm) 5 ’)N (ARNm) 7mGTP(5 ’ - – Le mRNA

7mGTP(5-

Le mRNA n’aura plus un extrémité 5libre.

Cette cap protège l’ARNm de l’attaque par les enzymes.

Rôle lors de la traduction: fixation de ribosome.

Les rRNA et les tRNA n’ont pas de cap et ne sont pas

petite su du

la

traductible.

Addition de polyA à l’extrémité 3’

Polyadénylation de l'ARN:

Une fois synthétisés, les ARNm:

– 1: Clivage au niveau de la partie 3’, 20 bases en aval de la

séquence AATAAA.

2: La polyA polymérase reconnaît la séquence AAUAAA et ajoute la queue poly A (+/- 200).

La queue protège l'ARNm contre la dégradation par

les nucléases.

Enfin l’excision des introns et l’épissage des

exons

La précision du mécanisme d’excision-épissage

Excision = élimine toutes les séquences introniques du transcrit primaire.

Epissage des exons = assemblage précis des exons

• l’excision-épissage est une opération délicate et doit être parfaitement précise et fiable.

Importance de la jonction exon-intron et du

site de branchement

Séquences du mRNA impliquées dans le processus d’épissage.

Site donneur

Site de

branchement

Site accepteur

Exon 1 GU A AG Exon 2
Exon 1
GU
A
AG
Exon 2

L’épissage est un phénomène séquentiel

complexe.

Processus:

clivage de l'ARN en 5' de l'intron (site donneur ) et formation d’un lasso (site donneur GU et le site de branchement A)

Le 3’OH de l’exon libérée se trouve en face de l’exon suivant et se

produit alors soudure des 2 exons.

Grâce à une transéstérification les deux exons seront raccordés.

L’épissage aboutit à:

ARNm avec exons raccordés, intron libéré sous forme de lasso

Ces phénomènes ont lieu dans le noyau.

Excission suivi d ’épissage des ARNm eucaryotes

• figs
figs

Biologie Moléculaire: Traduction

Biologie Moléculaire: Traduction

Biologie Moléculaire: Traduction

Traduction résulte de la transformation du

message génétique constitué de triplets

nucléotidiques, ou codon, en un langage protéique utilisant les acides aminés.

Cette transformation nécessite un code

génétique.

ou codon, en un langage protéique utilisant les acides aminés. Cette transformation nécessite un code génétique.

Biologie Moléculaire: Traduction

Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine

Biologie Moléculaire: Traduction Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine 45
Biologie Moléculaire: Traduction Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine 45

Biologie Moléculaire: Traduction

Code génétique

Le « langage » nucléique s'écrit avec 4

lettres.

Le « langage » protéine s'écrit avec 20 termes correspondant aux 20 acides aminés.

Si une lettre nucléique se traduisait par un acide aminé, il ne pourrait y avoir que 4 acides aminés.

En groupant les lettres nucléiques en

« mots » de 2 lettres on pourrait avoir 16

mots, mais cela ne permettrait de coder que 16 acides aminés.

En groupant les lettres nucléiques en

« mots » de 3 lettres on peut avoir 64 mots, ce qui permet d'exprimer les 20 acides aminés.

Le code génétique est donc fondé sur des mots de trois lettres : les codons.

d'exprimer les 20 acides aminés. • Le code génétique est donc fondé sur des mots de

Biologie Moléculaire: Traduction

Les caractéristiques du code:

1. universel: le code est valable pour tous les organismes

(animaux, plantes, bactéries, virus

).

exceptions:(i) trypanosomes, levures; (ii) ADN mitochondrial: p.ex. AUA = Met dans mitochondrie, au lieu de Ile.

2. dégénéré:

(i)

un ac.

aminé peut être codé

par

plusieurs codons (cfr tableau); (ii) "wobble" : un même ARNt peut s’associer à deux codons différents mais définissant le même acide aminé. Cette flexibilité qui concerne la troisième base du codon (première de l’anticodon) est appelée wobble

3. non chevauchant: les codons sont lus sans chauvechement

Biologie Moléculaire: Traduction

Traduction de l'ARNm

Les moléculaires nécessaires

Le ribosome est le site d’accueil: il reçoit

ARNm: L'ARNm véhicule l'information génétique, du lieu de

stockage (hélice d'ADN) vers le lieu d'expression, où il sert de

matrice à la synthèse du polypeptide.

ARNt: Les ARN de transfert (ARNt) font le lien entre nucléotides et acides aminés. Ils sont chargés de collecter les acides aminés

présents dans le cytoplasme et de les transporter jusqu'au ribosome

où s'effectue la synthèse du polypeptide.

Biologie Moléculaire: Traduction

Traduction de l'ARNm

Acides aminés:

Sont les « briques » d’une chaîne peptidique.

Un groupement amine (NH 2 )

Un groupement acide (COOH)

Une portion variable d'un acide aminé à l'autre (indiqué

par la lettre R sur la molécule

ci

(COOH) • Une portion variable d'un acide aminé à l'autre (indiqué par la lettre R sur

Traduction de l'ARNm

tRNA

•L’enchaînement des aa se fait selon un ordre dicté par l’ARNm

•L’assemblage ne se fait pas directement sur l’ARNm mais nécessite un adaptateur = rôle de l’ARNt (entre le mRNA et l’aa), en effet:

le tRNA (par son extrém 3’ACC) est lié à

l’aa d’un côté et au mRNA (par son

anticodon) de l’autre côté.

Biologie Moléculaire: Traduction

est lié à l’aa d’un côté et au mRNA (par son anticodon) de l’autre côté. Biologie

Lieu de la traduction

Biologie Moléculaire: Traduction

La traduction a lieu dans le cytoplasme, sur le ribosome. Le ribosome est une particule constituée de 2 sous-unités:

Sous-unité 60S :

45 protéines ARNr 5S, 5.8S et 28S 33 protéines ARNr 18S

Sous-unité 40S :

Chaque sous-unité ribosomale joue un rôle spécifique dans la

synthèse protéique et leur interaction donne une certaine

flexibilité au ribososme

Biologie Moléculaire: Traduction

Les étapes de la traduction

La synthèse protéique se divise en 3 étapes:

• L’initiation: réactions qui précédent la formation de la liaison peptidique entre les deux premiers aa. Il nécessite la fixation du ribosome à l’ARNm

• L’élongation: comprend toutes les réactions entre la synthèse de la première liaison peptidique et l’addition du dernier aa

La terminaison: englobe les réactions nécessaires pour libérer la chaîne polypeptidique complète; en même temps, le ribosome se dissocie de l’ARNm.

Biologie Moléculaire: Traduction

Inhibition de la traduction et antibiotiques
Inhibition de la traduction et antibiotiques

Biologie Moléculaire: Traduction

Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine

Conséquence de mutations:

dans un exon: effet qualitatif

- mutation silencieuse : exemple: AGT/Ser -> AGC/Ser

- non-sens : exemple : TGC/Cys -> UGA/stop

- faux-sens :

exemples: Hemoglobine S: GAA/Glu -> GTA/Val;

Biologie Moléculaire: Traduction

Anémie falciforme: Mutation dans un exon de la -globine:

GAA/Glu -> GTA/Val

Biologie Moléculaire: Traduction Anémie falciforme: Mutation dans un exon de la  -globine: GAA/Glu -> GTA/Val

Biologie Moléculaire: Traduction

Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine

Conséquence de mutations:

dans un exon:

- mutation silencieuse : exemple: AGT/Ser -> AGC/Ser

- non-sens : exemple : TGC/Cys -> UGA/stop

- faux-sens exemples: Hemoglobine S: GAA/Glu -> GTA/Val;

- saut de phase de lecture: AGG AAA ATA A -> AGA AAA TAA (délétion)

Arg

Lys

Ile

Arg

Lys stop

- expansion de triplets (ex. Huntington: expansion dans un exon CAG = Gln

en dehors d'un exon: intron

en dehors d'un exon, mais dans un site consensus d'épissage: effet qualitatif

Biologie Moléculaire: Traduction

Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine

Conséquence de mutations:

en dehors d'un exon, mais dans un site consensus d'épissage: effet qualitatif Ex: la bêta-thalassémie à hémoglobine E. Mutation G>A: création d’un site cryptique d’épissage

à hémoglobine E. Mutation G>A: création d’un site cryptique d’épissage Mutation et Hémoglobine E 59

Mutation et Hémoglobine E

Biologie Moléculaire: Traduction

Synthèse de protéines: traduction de l'ARNm en protéine

Rôles de micro-ARN (miRNA):

répression de traduction

clivage d'ARNm

Pathologie:

- mutation de site-cible de miRNA dans ARNm ou absence de production de miRNA: augmentation quantitative de la

protéine codée par le gène-cible du miRNA.

- création par mutation d'un site-cible de miRNA dans ARNm: diminution quantitative de la protéine codée par le gène ciblé par le miRNA.

Exemple : déficience en myostatine peut

résulter de mutation faux-sens ou de la création d'un site liant un miRNA.

pre- miRNA

pre- miRNA

60

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Synthèse de protéines: transcription, maturation, traduction (gène eucaryote)

Facteurs trans consensus épissage TATA ATG stop ADN ATAT TAC exon intron exon intron exon
Facteurs trans
consensus
épissage
TATA
ATG
stop
ADN
ATAT
TAC
exon
intron
exon
intron
exon
séquences cis
séquences cis
enhancer
promoteur
enhancer
cis séquences cis enhancer promoteur enhancer régions régulatrices région transcrite ARN primaire

régions régulatrices

région transcrite

ARN primaire

Transcription (ARN Pol II)régions régulatrices région transcrite ARN primaire A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG

AUG

transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF
transcrite ARN primaire Transcription (ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF

stop

ARNm

ARNt-ac.am.

ARNr

Maturation(ARN Pol II) A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR

ORF

AUG
AUG

stop

5'UTR

A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA Traduction
A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA Traduction

AAAAAAAAAA

3'UTR
3'UTR

miRNA

Traduction

A U G stop ARNm ARNt-ac.am. ARNr Maturation ORF AUG stop 5'UTR AAAAAAAAAA 3'UTR miRNA Traduction

Protéine

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Synthèse de protéines: régulation de la transcription

facteurs de transcription (facteur trans): se lient sur des séquences cis du promoteur,

des enhancers/silencers et activent ou répriment l'activité de l'ARN pol II

distribution tissulaire ubiquiste versus histo-spécifique

activité constitutive (permanente) ou inductible (dépendante des conditions métaboliques. Exemples:

- facteur CREBP (cyclicAMP response element binding protein), médiateur des effets de l'AMPc, inductible par phosphorylation.

- facteur ChREBP (carbohydrate response element binding protein), médiateur des effets du glucose.

- facteur SREBP (sterol response element binding protein), médiateur des effets du cholesterol et de l'insuline.

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Mode d’action du facteur de transcription CREBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par l’AMPc

Mode d’action du facteur de transcription CREBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par l’AMPc
Via un récepteur membranaire
Via un récepteur membranaire

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Mode d’action du facteur de transcription ChrEBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par le glucose

d’action du facteur de transcription ChrEBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par le glucose

67

Biologie Moléculaire: Régulation de l’expression des gènes

Mode d’action du facteur de transcription SREBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par l’insuline

d’action du facteur de transcription SREBP: régulation coordonnée de la transcription de gènes par l’insuline 68

Via un récepteur nucléaire

Via un récepteur nucléaire

Les différents domaines de liaison à l’ADN

Les différents domaines de liaison à l’ADN

Biologie Moléculaire: Transcription, Maturation ARN

Pathologie liée à une mutation dans le promoteur/enhancer/silencer: perte de liaison du facteur trans entaîne perte de stimulation ou de répression de la

transcription (= anomalie quantitative de l'ARNm et de la protéine

correspondante).

Exemple: mutation dans le promoteur du gène codant le facteur anticoagulant "Protéine C" entraîne une hypercoagulabilité par diminution du taux de Protéine C: thrombophilie

"Protéine C" entraîne une hypercoagulabilité par diminution du taux de Protéine C: thrombophilie 71

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

 

Les

fonctions

des

séquences

d’ADN

génomique

:

diverses

et

beaucoup

inconnues

 

Caractérisées et identifiées dans leurs fonctions

 

ADN non codant sans fonction particulière.

Séquences qui contiennent l’information génétique : fabrication de toutes les protéines de l’organisme.

Chez l’homme il existe environ : 24 000 gènes

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les gènes : séquence d’ADN

Localisée de façon précise sur le chromosome

De taille variable (1 kb à des 100 kb)

Informations qualitatives et quantitatives à la synthèse d’une protéine

L’information génétique qui détermine la séquence des acides aminés de la protéine est contenus dans le gène:

Façon continue chez les procaryotes

Discontinue chez le eucaryotes.

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les séquences répétées

Dans le génome des mammifères : séquences répétées un très grand nombre de fois

Rôle : inconnu

On distingue selon la taille de la séquence répétée et

l’existence ou non de répétition en tandem au sein de cette

séquence :

Les microsatellites

Les minisatellites ou VNTR

Les séquences SINE

Les séquences LINE

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les séquences répétées

Les microsatellites

• Répétition en tandem d’une très courte séquence (1 à 5 nt).,

• répétition en tandem d’un dinucléotide CA,

• CA repeat (CACACACACACACA…ou (CA) n . ou n = de 10 à

100.

Propriété des microsatellites est leur polymorphisme : le nombre n varie d’un individu à l’autre.

Microsatellites : les études génétiques de liaisons entre maladie

et un gène.

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les séquences répétées

Les minisatellites ou VNTR (variable number of tendem repeats)

Dispersées dans le génome

Hautement répétitifs

Courtes : 10 à 100 nts

En tandem

Du fait de leur polymorphisme : même intérêt génétique

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les séquences répétées

Les séquences SINE (short interspersed elements)

Séquences disperses ; moyennement répétive ; 100 à

300 pb

• Dérivent de transcrits de l’ARN polymérase III.

Connus : séquences Alu, site de restriction AG/CT

Séquence Alu tous les 4 kb, 10 6 copies par génome haploïde

Le génome et ses modifications physiologiques

3. Les séquences génomiques caractérisées

Les séquences répétées

Les séquences LINE (long interspersed elements)

Longues séquences : 5000 à 7000 pb

Dispersées dans le génome

• Dérivent de transcrits de l’ARN polymérase II

Participation éventuelle dans les cancers

Le génome et ses modifications physiologiques

4. Cartographie et séquençage des génomes

Taille des génomes varie selon les espèces

• Aujourd’hui la taille des génomes des principales espèces

d’organisme vivants cette taille varie :

De 500 kb : mycoplasmes

160 Gb : fougères

670 Gb : amibe

homme : 3 Gb ; entre la mouche et le haricot vert

Cartographie des génomes

Les banques de données

Le génome et ses modifications physiologiques

Points clés

• Le génome correspond à l’ensemble des informations génétiques d’un être vivant, contenues, dans sa ou ses molécules d’ADN

• Il varie d’une espèce à l’autre, d’un individu à l’autre

dans une même espèce, mais pas d’une cellule à l’autre chez un même individu multicellulaire.

• L’ADN s’associe à des protéines pour former la

chromatine et les chromosomes, rassemblés dans le noyau cellulaire.

• L’unité de base de la chromatine est le nucléosome formé d’un cœur d’histone entouré d’ADN

Le génome et ses modifications physiologiques

Points clés

• La majorité de l’ADN est non codant sans caractéristique ni fonction particulière connue

Certains séquences correspondent aux gène codant les protéines, nécessaires à la réplication de l’ADN et d’autres séquence répétées dispersées dans le génome parmi lesquelles existent des éléments génétiques

mobiles.

Le génome complet de plusieurs espèces a été cartographie, séquencé et ces informations sont disponibles dans les banques de données

(www ncbi nlm nih gov)

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Hybridation d’une sonde

6.

Clonage plasmidique

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Le matériel biologique

Toute étude de biologie moléculaire implique la

disposition d’échantillons d’ADN ou/et ARN.

– Les techniques d’extractions des acides nucléiques sont relativement simples

Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1. Extraction et purification des acides nucléiques

A. ADN

Les leucocytes sanguins représentent la source majeure de DNA pour les études en médecine.

Simple prise de sang recueillis sur anticoagulant

(EDTA).

Lyse cellulaire

Précipitation des protéines

– Précipitation de l’ADN

– Suspension de l’ADN dans un tampon adéquat

Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Quantification de l’ADN purifié

Test de qualité et quantité Lecture spectrométrique:

quantité

1 DO (à 260 nm)= 50ng/ul Qualité: rapport des DO 260nm/280 =1.8

Techniques d’exploration des gènes

1. L'extraction des acides nucléiques

Précautions

la préparation d'ARN est plus délicate que celle d'ADN car les ribonucléases (RNAses) sont très répandues (par ex. sur les doigts) et sont fréquemment capables de se renaturer après de nombreux traitements (même la dénaturation par la chaleur). les contaminations sont minimisées par le port de gants, l'utilisation de vaisselle et de solutions stériles et/ou traitées au DEPC (agent inhibiteur des RNAses).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

B. Les ARN

• L’ARN total est extraite à partir de différentes préparations cellulaires ou de tissus divers.

– L’ARN total= ARNr , ARNt et les ARNm

les ARNm seront purifiés sur colonnes contenant des OligodT.

Méthodes d’exploration des acides nucléiques

2. Séparer les acides nucléiques, mesurer leur taille

Les électrophorèses

Les acides nucléiques peuvent être séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide.

Principe général de l'électrophorèse analytique

Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques uniformément chargées. De ce fait sous l'effet d'un champ électrique ils peuvent migrer sur un support solide, un gel et être séparés.

Méthodes d’exploration des acides nucléiques

2. Séparer les acides nucléiques, mesurer leur taille

Les électrophorèses

Visualisation des acides nucléiques : par coloration du gel au bromure d'éthidium (BrEt) qui est un agent s'intercalant entre les plateaux de paires de bases et émettant une fluorescence orange lorsqu'il est éclairé par des UV courts (200-300nm).

La comparaison visuelle de la fluorescence d'un échantillon avec celle d'une quantité d'ADN connue (le marqueur de taille) permet d'estimer la quantité d'acides nucléiques déposée

Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel 3 Concentration

Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel 3

Concentration d'agarose (% en M/V)

Gamme de tailles idéales (en kb)

0.3

5 60

0.6

1 20

0.7

0.8 10

0.9

0.5

7

1.2

0.4

6

1.5

0.2

3

2.0

0.1

2

Gel d’électrophorèse sous UV

Gel d’électrophorèse sous UV 1 2 3 4 Photographie du gel. Puits 1 . Echelle de

1

2

3

4

Gel d’électrophorèse sous UV 1 2 3 4 Photographie du gel. Puits 1 . Echelle de

Photographie du gel. Puits 1. Echelle de marqueur de taille moléculaire (1kbplus), Puits 2. vide, Puits 3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases, Puits 4. Fragment d'environ 4.5 kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction

détermination de la taille d'un fragment : se fait par rapport à la migration

d'un marqueur approprié contenant des fragments de tailles connues

fragment : se fait par rapport à la migration d'un marqueur approprié contenant des fragments de

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

3. Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

Les nucléases

Les ADN ligases

Les ADN polymérase

Les phosphatases et kinases

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les nucléases

Plusieurs types d'enzymes (nucléases) catalysent l'hydrolyse des acides nucléiques :

1. les endonucléases : coupent à l'intérieur de l'acide nucléique.

2. les exonucléases : dégradent la molécule en détachant les nucléotides successivement à partir d'une extrémité. Ex : Exonucléase III, Nucléase Bal

31.

PS: Ne sera développé ici que le cas des endonucléases largement utilisées en biologie moléculaire

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Endonucléases de restriction : enzymes de restriction

Activité :

réalisent des coupures de l’ADN double brin, en des sites spécifiques,

déterminé par une courte séquence de 4-8 paires de nucléotides.

Sont des enzymes bactériennes Plusieurs centaines

Nomenclature : 1ère lettre=espèce bactérienne dont elle est extraite / 2-3ème

lettre=genre de l'espèce / 4ème lettre=souche bact. / chiffre romain=ordre de

découverte de l'enzyme. Ex: EcoRI

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Endonucléases de restriction : (enzymes de restriction)

Les séquences cibles sont souvent palindromiques (HindIII, SmaI…) Les bouts produites par la coupure: franches (SmaI) ou cohésives (EcoRI)

sont souvent palindromiques (HindIII, SmaI…) Les bouts produites par la coupure: franches (SmaI) ou cohésives (EcoRI)
sont souvent palindromiques (HindIII, SmaI…) Les bouts produites par la coupure: franches (SmaI) ou cohésives (EcoRI)

Mode de clivage de certains enzymes de restrictions

Mode de clivage de certains enzymes de restrictions

Mode de clivage de certains enzymes de restrictions: EcoRI

Mode de clivage de certains enzymes de restrictions: EcoRI

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Carte de restriction

Etablir la carte de restriction de chaque gène

Détecter un polymorphisme

Le profil electrophorétique: différence individuelle dans la taille des fragments de restriction:

polymorphisme de restriction (RFLP: restriction

fragment length polymorphism)

Polymorphisme Msp I du gène de l’ApoA-II

Ce polymorphisme altère le site Msp1

Sujet 4: porte un allèle fréquent et l’allèle Msp1 Hétérozygote pour ce polymorphisme

altère le site Msp1 Sujet 4: porte un allèle fréquent et l’allèle Msp1 Hétérozygote pour ce

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les autres nucléases

Désoxyribonucléase I (DNAse I)

Ribonucléase H (RNAse H)

Nucléase S1

Ribonucléases A (RNAse A) ou

endoribonucléase

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Désoxyribonucléase I (DNAse I) :

Activité : couper l'ADN simple brin ou double brin de préférence après une base pyrimidique, sur un ou les

deux brins selon l'ion divalent du tampon (Mg2+ ou

Mn2+).

Utilisation :

analyse des gènes actifs de la chromatine (in vivo).

élimination de l'ADN contaminant de préparations d'ARN ou protéiques.

marquage par translation de coupure

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Nucléase S1

Activité : dégrader spécifiquement les acides nucléiques simple brin.

des acides nucléiques • Nucléase S1 • Activité : dégrader spécifiquement les acides nucléiques simple brin.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

étude des hybrides ADN-ARN pour détecter des introns.

conversion des bouts cohésifs en bouts francs pour le clonage.

suppression des boucles dans la synthèse des ADNc

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Ribonucléases Ribonucléases A (RNAse A) ou

endoribonucléase

Activité

Très active, ubiquitaire, très thermorésistante. Clive

l'ARN simple brin après les résidus pyrimidiques.

Utilisation

Détruire l'ARN dans les hybrides ARN-ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

.Ribonucléase H (RNAse H)

Elimine l'ARN dans les préparations d'ADN ou de protéines

Détruire l'ARN dans les réactions de réverse transcription

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Ligases

Activité

Catalyser la formation d'une liaison phosphodiester entre une extrémité 3'OH et une extrémité 5'P de deux nucléotides d'un acide nucléique.

ADN ligase d'E. coli : ligation des extrémités cohésives produites par certaines enzymes de restriction.

ADN ligase du phage T4 : même activité mais peut liguer des extrémités franches.

Ligases

Ligases
Ligases

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

Introduire des fragments d'ADN dans un plasmide ou vecteur.

Ligases

des acides nucléiques • Utilisation • Introduire des fragments d'ADN dans un plasmide ou vecteur. Ligases

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les ADN polymérases

ADN polymérases ADN dépendantes

Définition, Origine

• ADN polymérase I d‘ E. coli

ADN polymérase du phage T4

Taq polymérase isolée de Thermus aquaticus

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Vent polymérase isolée de Thermococcus

litoralis Fragment de Klenow : fragment de l'ADN pol.I.

Souvent préféré à l'enzyme entière (sauf pour

les techniques de translation-coupure) car ne possède pas d'activité exonucléase 5'-3' risquant

de dégrader l'ADN néosynthétisé.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Activité

ADN pol.I et T4 : polymérase 5'-3' à partir

d'une amorce + exonucléase 5'-3' (celle de

T4 est 100 fois plus efficace).

Taq pol. :idem ci-dessus mais température

polymérisation à 72°C, stable à 95°C.

Vent pol. : idem Taq + activité de relecture.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

Séquençage de l'ADN.

Réalisation de sonde.

Amplification par PCR (Taq, Vent).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Transcriptases inverses (réverse

transcriptase)

Définition, Origine

ADN polymérase ARN/ADN dépendant

Codées par le gène Pol des rétrovirus (ex :

HIV).

Les plus utilisées sont purifiées à partir de cellules infectées par l'AMV (virus de myéloblastose aviaire) ou le MMLV (virus leucémique murin de Moloney).

Depuis peu, reverse transcriptase

thermorésistante disponible

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Activité

A partir d'une amorce et une matrice ARN, convertir l'ARN en ADN double brin (activité polymérase 5'-3').

Pas d'activité exonucléase 3'-5‘ (relecture).

+RNAase H : dégradation de l'ARN dans les

hybrides ADN-ARN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

Permet de synthétiser un ADNc à partir d’ARNm

Construction de banques d'ADNc.

RT-PCR.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les phosphatases et kinases

Les phosphatases

Origine

Phosphatase alcaline extraite de l'intestin de

veau

Phosphatase alcaline bactérienne

Activité

Eliminer le groupement phosphate en 5' (déphosphoryler)

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

LES PHOSPHATASES

(ou déphosphorylases)

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques LES PHOSPHATASES (ou déphosphorylases)

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

Lors du clonage,

empêcher la ligation du vecteur

sur lui-même et

favoriser ainsi la ligation avec un insert

• Lors du clonage, empêcher la ligation du vecteur sur lui-même et favoriser ainsi la ligation

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques kinases

T4 polynucléotides kinase

Activité Transférer le groupement phosphate d'un nucléotide tri-P sur le OH en 5' d'un polynucléotide.

Utilisation

Marquage radioactif d'oligonucléotides de synthèse

Phosphorylation des fragments de PCR pour le clonage

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

T4 polynucléotides kinase

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques T4 polynucléotides kinase

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Utilisation

Marquage radioactif d'oligonucléotides de

synthèse

Phosphorylation des fragments de PCR pour le clonage

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Clonage plasmidique

6.

Hybridation d’une sonde

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

4. L’ADN recombinant

La manipulation de l’ADN peut être réalisée in vitro afin de produire des

molécules qui n’existent pas dans la nature.

La technologie de l’ADN recombinant a pour objectifs de cloner ou d’exprimer un fragment d’ADN en dehors de son contexte

naturel (Système permettant le transfert, l'expression et la réplication d'un ADN étranger dans les cellules hôtes) .

Elle repose sur l’utilisation de vecteurs.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

4. L’ADN recombinant

vecteurs.

Les vecteurs sont de petites molécules d’ADN dans

lesquels on insère le fragment d’ADN à étudier.

Plasmides, des virus bactériens (bactériophages),

cosmides, BAC, YAC

Signaux nécessaires à leur

réplication (vecteurs de clonage, pUC) expression (vecteurs d’expression, pGEM)

Récapitulatif des vecteurs

Récapitulatif des vecteurs

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

vecteurs.

Les plasmides

Molécules d’ADN

circulaires double brin

d’origine bactérienne

De petites tailles (2-5 kb)

Extra chromosomiques

Cènes de résistances aux antibiotiques

Plasmides de la dernière génération (pBR, pUC, pSP et pGEM)

Fragment d’operon lac,

un polylinker (choix de sites de restriction uniques)

un gène de résistance à l’ampicilline (sélection)

Vecteur plasmidique de la famille pUC

Vecteur plasmidique de la famille pUC
MCS=polylinker=sites multiples de clonage

MCS=polylinker=sites multiples de clonage

MCS=polylinker=sites multiples de clonage

Vecteur d’expression pGEM

Vecteur d’expression pGEM

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Clonage plasmidique

6.

Hybridation d’une sonde

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

5. Clonage plasmidique

Principe de l'utilisation des plasmides

1. vecteur de clonage

Le clonage consiste à synthétiser de nombreuses copies identiques d’un fragment d’ADN (ou d’ADNc).

Bactéries ou levures (transformation avec un plasmide).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

5. Clonage plasmidique

Principe de l'utilisation des plasmides

1. vecteur de clonage

Principe de clonage:

1. Insérer le fragment d’ADN (ou d’ADNc) dans vecteur (plasmide)

2. Obtention d’un plasmide chimérique (recombinant)

3. Transformation des bactéries par ces plasmides

4. Obtention des clones bactériens qui contiennent le plasmide recombinant

5. Amplification de ces bactéries par multiplication.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

5. Clonage plasmidique

Principe de l'utilisation des plasmides 2. vecteur d’expression

ADN cloné dans un plasmide

Exprimer les gènes qu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli.

Transcription de ce fragment et la traduction du

messager.

On peut ainsi faire fabriquer à Escherichia coli des protéines étrangères (par exemple, l'insuline

humaine, l'hormone de croissance humaine).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Autres catégories de vecteurs

Transfert de gènes thérapeutiques (thérapie génie)

vecteurs rétroviraux

vecteurs adénoviraux

Adeno-associated-virus (AAV)

vecteur du virus de l'Herpès

Avantages et inconvénients des vecteurs viraux utilisé pour la thérapie génique

Avantages et inconvénients des vecteurs viraux utilisé pour la thérapie génique

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les organismes modèles

L'importante complexité du génome humain a incité les chercheurs à se pencher préalablement sur des organismes modèles.

Aussi, ces espèces ont été retenues car elles partagent plusieurs caractéristiques : faible taille des génomes ; cycle de vie court ;

facilité de culture ; descendance nombreuse

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Les organismes modèles

Escherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans

Arabidopsis thaliana (l'arabette de

elegans • Arabidopsis thaliana (l'arabette de Thalien) • Drosophila melanogaster • Mus musculus

Thalien)

Drosophila melanogaster

Mus musculus

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Clonage plasmidique

6.

Hybridation d’une sonde

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Hybridation moléculaire sur support solide

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques Hybridation moléculaire sur support solide

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

6. Hybridation d’une sonde

Les techniques d’hybridations des acides nucléiques utilisent la propriété fondamentale de l’ADN (ou ARN) simple brin à s’hybrider par complémentarité avec un brin antisens pour former une molécule double brin. Sonde: pour détecter de façon spécifique une séquence d’ADN ou ARN, séquence cible, dans une population complexe de molécules d’ADN d’une cellule ou d’un extrait biologique

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

6. Hybridation d’une sonde

Marquage de la sonde: marquée par un atome radioactif (P 32 ).

• Marquage de l’extrémité 5’ par une T4 kinase (ATP-g radioactif)

Marquage interne (par random priming=amorçage alétaoire):

• ADN double brin dénaturé, mélange d’hexanucléotides (4 4 =4096) hybridation, synthèse de brin complémentaire grâce à l’enzyme de Klenow en présense d’un a-P 32 ) dNTP+3dNTP non radioactifs.

• En final: sonde radioactive spécifique de la cible qu’on veut

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

6. Hybridation d’une sonde

Premier exemple: Le Southern Blot

Objectif : visualiser et cartographier un fragment du génome (ADN) dont on possède une sonde. Préparation de l'ADN à étudier

digestion par une enzyme de restriction adéquate

séparation des fragments par électrophorèse dénaturation de l'ADN par incubation du gel d'électrophorèse dans une solution de soude transfert de l'ADN sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon par un flux de

liquide entraînant l'ADN

fixation covalente de l'ADN sur la membrane par cuisson (nitrocellulose) ou

exposition aux U.V courts(nylon).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Le Southern Blot

Hybridation

Ajouter la sonde dénaturée à la solution d'hybridation. La température d'hybridation étant définie par la Température de la sonde soit ~65°C pour une sonde de + de 100 bases.

Lavages

Autoradiographie Les particules émises par le P vont impressionner le film photographique, qui révélera la position des bandes d’ADN .

1. Séparation sur gel d’agarose

Autres étapes

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

La sonde spécifique d’allèle

Représente une des applications de l’hybridation au diagnostic de maladie génétique. Drépanocytose = anémie falciforme

Maladie autosomique récessive du gène de la Globine : Sub A/T, Glu6/Val •Analyse par 2 sondes: spécifique de l’allèle normale •Oligonucléotide spécifique d’allèle (ASO, allele specific oligonucleotide) Sondes: 20nts, conditions d’hybridations stringentes.

Sonde oligonucléotidique spécifique d’allèle

1.

Sujet homozygote pour le gène normal

2.

Sujet malade

3.

Sujet hétérozygote

spécifique d’allèle 1. Sujet homozygote pour le gène normal 2. Sujet malade 3. Sujet hétérozygote

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

Deuxième exemple: Le Northern Blot

Le principe est le même que pour le Southern Blot mais ici ce sont les ARN qui sont

étudiés. Plus besoin de digérer par enzyme de restriction. La visualisation d'un ARN par une sonde permet de :

apprécier sa distribution dans les tissus, étudier son abondance relative

Déterminer sa taille détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage de l'ARN.

Exemple: Étude d’expression du Gène PCA3 par Northern blot

Étude d’expression du Gène PCA3 par Northern blot Expression spécifique du gène PCA3 dans les cellules

Expression spécifique du gène PCA3 dans les cellules cancéreuses de la

prostate.

Tissues étudiés : T=tumeur, B= hyperplasie prostatique bénigne, N=normale,

N/T=normale +10% cellules tumorales, and M=métastases.

Reproduite à partir de M.J. Bussemakers, et al, Cancer Res. 59: 5975, 1999.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

3: Le Dot Blot

Dot = tache en anglais. Technique très simple. L’échantillon est déposé sur un filtre de nylon

Dénaturation, hybridation, lavage et autoradiogramme.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Clonage plasmidique

6.

Hybridation d’une sonde

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro.

échantillon complexe et peu abondant

d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie (millions de copies en quelques heures ).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

Le principe

Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel dès 1993)

succession de réactions de réplication

matrice double brin d'ADN

deux amorces oligonucléotidiques « aller/retour » et une ADN Polymérase

L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices

L'amplification obtenue est exponentielle

vers 1988: commercialisation d'une ADN polymérase

La PCR: simple et efficace

La PCR: simple et efficace

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

La réaction de PCR se déroule dans un tube et

nécessite:

Matrice double brin (ADN cible)

Deux Amorces (20-30 bases)

ADN Polymérase, 4 types de nucléotides (dNTP) , MgCl 2

Chaque cycle comporte 3 étapes:

Étape 1: dénaturation de l’ADN (91-96°C)

Étape 2. Hybridation des amorces (50-65°C

Étape 3. Extension (72°C) Le nombres de cycles: 35 34 milliards de copies.

Thermocyler: machine de PCR

amorces (50-65°C Étape 3. Extension (72°C) Le nombres de cycles: 35 34 milliards de copies. Thermocyler:
Étape 1: dénaturation de l’ADN (91 -96°C) Étape 2. Hybridation des amorces (50-65°

Étape 1: dénaturation de l’ADN (91-96°C)

Étape 1: dénaturation de l’ADN (91 -96°C) Étape 2. Hybridation des amorces (50-65°

Étape 2. Hybridation des amorces (50-65°

Étape 3. Extension (72°C) Présentation extraite de http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

Étape 3. Extension (72°C)

Présentation

extraite

de

http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

Étape 3. Extension (72°C) Présentation extraite de http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

Les principales applications

Nombreuses:

diagnostic des maladies génétiques (analyse des mutations)

Typage génétique des individus

– Détection d’un ADN étranger (virus, bactérie, etc.) dans un liquide biologique.

Il existe des variantes de la PCR:

La RT-PCR: ajoute une étape supplémentaire (ADNc)

La PCR quantitative: amplification et quantification en temps réel des molécules d’ADN cible amplifiées.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

Il existe des variantes de la PCR:

La RT-PCR: ajoute une étape supplémentaire (ADNc)

L'acronyme RT-PCR signifie Reverse Transcriptase PCR, soit une PCR après transcription inverse d'un acide ribonucléique

(ARN) en ADN complémentaire (ADNc).

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

PCR en temps réel

Amplification et détection simultanée des produits amplifiés.

– Principe: la détection et la mesure d’un signal fluorescent.

Principe mathématique: N = N 0 .2 n .

– L’intensité du signal du fluorophore est proportionnelle à la quantité de produits amplifiés pendant la PCR.

Thermocycler adapté

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

Il existe des variantes de la PCR:

La PCR quantitative: amplification et quantification en temps réel des molécules d’ADN cible amplifiées. PCR en temps réel

Plusieurs systèmes pour détecter et quantifier le signal fluorescent en temps réel:

– Agents intercalent l’ADN = SYBR Green

– Sondes d’hybridations: Système FRET (fluorescence resonance nergt transfert)

Principe de la PCR en temps réel utilisant le SYBR Green

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

PCR en temps réel

– Sondes d’hybridations: Système FRET (fluorescence resonance nergt transfert)

• Marquage de l’extrémité des sondes par des fluorophores.

Les deux fluorophores des sondes ne sont espacées que de qq bases (1-

5bases).

cette proximité:

• Transfert d’énergie de fluorescence = émission du signal

Extinction du signal si le fluophore= « Quencher » absorbe l’énergie de fluorescence.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

PCR en temps réel

– Sondes d’hybridations: Système FRET (fluorescence resonance nergt transfert)

Type de thermocycler PCR

LightCycler: émission du signal qui est détecté.

• L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié pendant la PCR.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

7. Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

PCR en temps réel

Quelques applications:

Microbiologie clinique: agents pathogènes bactériens et fongiques

Virologie, SIDA, hépatites

Oncologie clinique: cancer du sein, diagnostic

cancer de la prostate (PCA3, phase de

validation)

Recherche scientifique: expression des gènes, niveau d’expression, etc.

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

1.

Extraction et purification des acides nucléiques

2.

Séparation par électrophores

3.

Les enzymes utilisées pour l’étude des acides nucléiques

4.

L’ADN recombinant

5.

Clonage plasmidique

6.

Hybridation d’une sonde

7.

Amplification d’une séquence d’ADN par PCR

8.

Séquençage de l’ADN

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

8. Séquençage de l’ADN

Principe: méthode de Sanger ADN= matrice simple brin Amorce spécifique

ADN Polymérase: T4 poly, Klenow, Taq Poly

dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP ddNTP: en faibles concentrations

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

8. Séquençage de l’ADN

Principe: méthode de Sanger pour détérminer la séquence:

1. 4 ddNTP, 4 tubes différents

Marquage radioactif: amorce/ 1 des dNTP

2. Même réaction: 4 types de ddNTP

ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA, ddTTP-ROX

5’ - GAGTAAAGTTG….TTTTC - 3’
5’ - GAGTAAAGTTG….TTTTC - 3’

5’-GAGTAAAGTTG….TTTTC-3’

V. Méthodes d’exploration des acides nucléiques

8. Séquençage de l’ADN

Principe: méthode de Sanger pour détérminer la séquence:

2. Même réaction: 4 types de ddNTP

ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA, ddTTP-ROX JOE: verte, FAM: blue; TAMRA: Gris; ROX: rouge

ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA, ddTTP-ROX JOE: verte , FAM: blue ; TAMRA: Gris; ROX: rouge

ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA, ddTTP-ROX JOE: verte, FAM: blue; TAMRA: Gris; ROX: rouge

Voir surtout cours de génétique

VI. Pathologies du génome

Différents types de mutations

Les principales modifications du génome en

pathologie humaine

Principaux types de mutations

Principaux types de mutations

Exemples de déphasage du cadre de lecture par délétion ou insertion

Exemples de déphasage du cadre de lecture par délétion ou insertion

Maladies héréditaires monogéniques

Maladies héréditaires monogéniques

Les maladies polygéniques

VI. Pathologies du génome

Diabète II, obésité, hypertension artérielle,

asthme etc plusieurs gènes

Cancer: oncogéniques, gènes suppresseurs

de tumeurs

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

Traitement

Analyse du génome humain

Laboratoire de recherche

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

• L’analyse moléculaire des gènes:

diagnostic des maladies génétiques

Une amélioration des conditions de vie

Thérapeutique adaptée

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

Plus de 3000 maladies génétiques humaines

• Des mutations d’un seul gène

Drépanocytose, hypercholestérolémies familiales, la maladie de Duchenne, mucoviscidose

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

Deux exemples de diagnostic direct de

maladies monogéniques: drépanocytose et mucoviscidose

1: 2 copies N du gène 3: 1 copie N et 1 copie M 2:
1: 2 copies N du gène
3: 1 copie N et 1 copie M
2: 2 copies M

Exemple de la drépanocytose: Southern Blot

Exemple de la drépanocytose: PCR

Exemple de la drépanocytose: PCR

Exemple de la mucoviscidose: PCR

Exemple de la mucoviscidose: PCR

Test diagnostique de détection de la mucoviscidose

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

Traitement

Analyse du génome humain

Laboratoire de recherche

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Traitement

Double application de la biologie

moléculaire:

Produire des protéines recombinantes

Intérêt économique et valeur ajoutée

Système: E. Coli/ Saccharomyces cerevisae

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Traitement

Produire des protéines recombinantes Système: E. Coli/ Saccharomyces cerevisae

Exemples: Insuline, Hormone de croissance

humaine, Facteur VIII de la coagulation, vaccin

contre l’hépatite B….

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic

Traitement

Analyse du génome humain

Laboratoire de recherche

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Analyse du génome humain Laboratoire de recherche

Au-delà des applications médicales, les

techniques de BM:

– Investigations d’ordre juridiques

Développement industrielle novateurs

Avancer les connaissances scientifiques

Mise en évidence par RFLP d’un minisatellite avec une sonde uniloculaire

Mise en évidence par RFLP d’un minisatellite avec une sonde uniloculaire
Empreintes génétiques par RFLP avec une sonde uniloculaire dans un cas de crime

Empreintes génétiques par RFLP avec une sonde uniloculaire dans un cas de crime

Recherche de paternité par RFLP

Recherche de paternité par RFLP

Alignement des séquences et banques de données

Alignement des séquences et banques de données

Biologie Moléculaire: Médecine, Science et Industrie

Diagnostic Traitement Analyse du génome humain Laboratoire de recherche

Dr. Mario Capecci (Prix Nobel)

Dr. Mario Capecci (Prix Nobel)

Invalidation des gènes (knock-out)

comment on procède pour créer ces souris

knock-out ?

également appelées mutants nuls

Grâce à la recombinaison homologue

Invalidation des gènes (knock-out)

on introduit un allèle inactivé dans des cellules souches embryonnaires (ES) en culture,

On sélectionne les cellules ES qui ont intégré la mutation au bon

endroit.

Puis on les implante dans un jeune embryon de souris (au stade blastocyste), que l'on transfère à une mère porteuse.

Les souriceaux sont des chimères, ou mosaïques : leurs tissus sont dérivés des cellules de l'embryon et des cellules ES transplantées.

Reste à repérer si la mutation est présente dans leurs cellules sexuelles, ce que l'on fait en croisant les souris mosaïques avec une lignée pure (dite sauvage) que l'on sait robuste.

La première génération est constituée d'animaux hétérozygotes*

(F1) dont certains possèdent l'allèle inactivé.

Enfin, dernière étape, on croise entre eux chacun des hétérozygotes mutants, jusqu'à ce qu'on obtienne des souris homozygotes* (F2) pour le gène invalidé.

ARN INTERFERENCE

Le phénomène d'ARN interférence (RNAi, RNA interference)

mécanisme de défense naturel. un nouveau moyen d'inactivation des gènes

C'est un processus post-transcriptionnel qui est déclenché

par l'introduction d'ARN double-brin (ARNdb) dans la cellule et qui mène à l'inactivation d'un gène d'une manière

séquence-spécifique.

.

ARN INTERFERENCE

Principe

Phénomène d'ARN interférence est un

mécanisme en deux temps qui se déroule dans le cytoplasme :

ARN INTERFERENCE

on peut résumer le mécanisme de l'interférence à RNA ainsi

- Si un ARN double-brin (DsRNA) apparaît dans la cellule (qu'il soit introduit, ou issu du génome), il est coupé par l'enzyme Dicer à une longueur précise de 21-23bases (cela devient un siRNA)

- Un complexe enzymatique RISC le prend en charge, sépare les deux brins du siRNA et lorsque le brin siRNA trouve à s'apparier sur une ARN messager, une partie de RISC (slicer ou argonaute) coupe cet ARNm.

-L'ARNm ainsi exposé est rapidement dégradé par d'autres enzymes.

En effet les nouvelles extrémités produites n'ont pas de 5' cap

ni de terminaison polyAAAAAA qui protègent normalement ces extrémités contre les ribonucléases.

ARN INTERFERENCE

-

La possibilité de désactiver (ou au moins fortement limiter l'expression :

Fin de la traduction de cet ARNm.

on réduit de 80-90%) les gènes à un endroit et à un moment donné sans devoir créer un organisme génétiquement modifié.

Applications

D'innombrables applications en recherche et bientôt en médecine ( désactiver des gènes pour lutter contre les virus, le cancer, ou comme thérapie génique paraît très prometteur).

Mécanisme générale de l’ARN intérférence