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Reaccin en Cadena de la Polimerasa

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa, conocida como P.C.R por sus siglas en


ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular
desarrollada en 1983 por Kary Mullis que permite la sntesis in Vitro de
secuencias especficas de cido desoxirribonucleico (ADN).
Fundamento e importancia
Esta una tcnica que se fundamenta en la propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas
y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas
entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de
ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena
de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus
Corporation en California, en la dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al
realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas
en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases
de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda
protena,
se
emplean
ADN
polimerasas
termoestables,
extradas
de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la
mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas,
son: Thermus aquaticus (polimerasTaq),Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas
de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de
errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado
mediante un aparato llamado termociclador, que
permite calentar y enfriar los tubos de reaccin
para controlar la temperatura necesaria para cada
etapa de la reaccin. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que
permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los
tubos usados para PCR tienen una pared muy
fina, lo que favorece una buena conductividad
trmica, permitiendo que se alcance rpidamente
el equilibrio trmico.

Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en


laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin,
la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de
trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en
tcnicasforenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas.
Componentes de la PCR
Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi -nucletidos que
sirve de sustrato para la sntesis de nuevo ADN.
Iniciadores (primers). Dos oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a
una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30
nucletidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin.
Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del ADN), para delimitar el fragmento
a amplificar).
ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, un ADN
polimerasa extrada de la bacteria termfila Thermus aquaticus que habita medios
de muy alta temperatura (50-80 C), elimin los grandes inconvenientes del
mtodo de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas,
permaneciendo activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN.
ADN molde. Molcula que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Etapas de la PCR
La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados
ciclos. Por lo general el nmero de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres
cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo, dependen de algunos parmetros en los que se incluye, la enzima usada
para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y dNTPs en la
reaccin as como la temperatura de unin de los iniciadores.

1. Desnaturalizacin del ADN


En la primera etapa, la reaccin es llevada a una temperatura de 94-96C y se
mantiene entre 30 segundos y un minuto. A estas temperaturas el ADN se
desnaturaliza (se separan las dos hebras que lo constituyen). La temperatura a la
cual se decide llevar a cabo esta etapa va a depender de la proporcin de

Guanina-Citocina (G-C) que tenga la hebra, as como tambin del largo de la


misma.

2. Alineamiento/Unin del iniciador a la secuencia complementaria


En la segunda etapa tambin conocida como hibridacin, los iniciadores se unen a
las regiones 3`complementarias que flanquean el fragmento que se quiere
amplificar. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65C durante 20-40
segundos, permitiendo as el alineamiento. La polimerasa se une entonces al
hibrido formado por la cadena molde y el iniciador y empieza la sntesis del ADN.
Los iniciadores actan como lmite de la regin de la molcula que va a ser
amplificada.

3. Extensin/Elongacin de la cadena
En la tercera etapa, la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementario a la hebra molde, aadiendo los dNTPs complementarios en
direccin 5` 3` uniendo el grupo 5`-fosfato de los dNTPs con el grupo 3`-hidroxilo
del final de la hebra de ADN creciente. La temperatura en esta etapa depende de
la ADN polimerasa que se utilice. Para la Taq polimerasa, la temperatura de
mxima actividad est entre 74-80C, aunque por lo general se usa 74C. El
tiempo de elongacin va a depender del tipo de polimerasa empleado, as como
tambin del tamao del fragmento de ADN que se requiere amplificar
4. Elongacin final
En la cuarta etapa, la temperatura es regulada de 70-74C durante 5-15 minutos
tras el ltimo ciclo de PCR, con el objeto de asegurar que cualquier ADN de
cadena simple restante sea totalmente amplificado.
Por ltimo, el producto amplificado es mantenido a una temperatura de 4C por un
periodo indefinido lo cual permite conservar el producto de la reaccin
Para comprobar que la PCR ha generado el fragmento de ADN esperado, se
emplean tcnicas como la electroforesis, que permite separar los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su tamao. Por lo general se emplea la
electroforesis en gel de agarosa para fragmentos grandes, en acrilamida para
fragmentos ms pequeos y asociada a marcaje fluorescente as como la
electroforesis capilar
5. Contaminacin en la PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa PCR es una tcnica altamente sensible y


especfica, por lo que es muy importante evitar contaminaciones que puedan dar
origen a la amplificacin de ADN no deseado.
La contaminacin con ADN extrao puede solucionarse con protocolos y
procedimientos que separen las reacciones pre-PCR (mezcla de todos los
componentes de la reaccin), del ADN molde.
Esto normalmente implica la separacin espacial de las reas de realizacin de la
PCR de los de anlisis o purificacin de los productos, as como la limpieza
exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de un PCR y el siguiente.

M. Somma, M. Querci. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) [en linea]


European Commission. [Fecha de consulta: 23 Febrero 2014] Disponible en:
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%
B3n6.pdf
Rodrguez D. y Barrios M, A. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR) y otras tcnicas moleculares en el estudio de afecciones dermatolgicas.
[En lnea] Laboratorio de Ingeniera Gentica, Instituto de Biomedicina,
Universidad Central de Venezuela. [Fecha de consulta: 23 Febrero 2014] Disponible en:
Ahttp://antoniorondonlugo.com/blog/wp-content/uploads/2010/05/85
Reacci%C3%B3n-en-cadena-de-la-polimerasa.pdf