Cromatografia de lichide de inalta performanta

1.1 Aspecte generale

Cromatografia de lichide reprezinta un instrument analitic deosebit de valoros
datorita excelentelor posibilitati de determinare calitativa si cantitativa. Aceasta tehnica
poate fi aplicata unor probe foarte variate, ce constituie amestecuri extrem de
complexe, cu numeroase componente.
Dezvoltarea acestei tehnici cromatografice a condus la aparitia cromatografiei de
lichide de inalta performanta HPLC (High - Performance Liquid Chromatography)
destinata separarii si analizei cantitative a unei game largi de probe. Metodele de
analiza HP LC sunt rapide si eficiente, iar limita de detectie poate sa coboare la unele
probe pana la 200 pg.
Principiul de baza al cromatografiei de lichide il reprezinta fenomenul potrivit
caruia, in anumite conditii, fiecare component al amestecului din proba interactioneaza
cu mediul diferit de celelalte componente. Astfel, utilizarea sa ca metoda de analiza are
ca rezultat determinarea componentilor dintr-un amestec, cantitatea in care acestia se
gasesc in amestec si gradul de puritate al fiecarui component.
Separarea este necesara cand:

amestecul este prea complex pentru abordarea unei metode analitice

directe;

compusii de analizat sunt foarte asemanatori din punct de vedere structural;

este necesara obtinerea de compusi cu puritate inalta;

este necesara determinarea cantitativa exacta a unui component.

Tehnicile mai simple, cum ar fi filtrarea, cromatografia pe coloana deschisa si

cromatografia in strat subtire, sunt folosite in mod curent pentru separari relativ
simple. Metoda moderna HPLC este o tehnica ce conduce la separari precise ale
componentilor unui amestec, oferind rezolutie mare, in timp scurt.
Totusi, metoda HPLC nu este una simpla, in care se introduce proba in
instrument, se realizeaza masuratoarea si se obtine un semnal (analog sau digital)

care reprezinta cantitatea prezenta in proba. In analiza HPLC trebuie sa se

determine si sa se stabileasca numerosi parametri inainte ca proba sa fie procesata.
In figura 1.1. sunt prezentate componentele de baza ale unui sistem HPLC.
Amestecul de analizat este dizolvat intr-un solvent adecvat si este introdus in coloana

Figura 1.1. Schema unui instrument HPLC izocratic

cu ajutorul injectorului. El se deplaseaza in coloana cu ajutorul unui flux de solvent,
denumit faza mobila. Separarea are loc in coloana, care constituie faza stationara.
Componentele probei injectate reactioneaza cu faza stationara. Faza mobila este
introdusa in coloana cu ajutorul unei pompe. Selectand corect faza mobila
corespunzatoare si materialul de umplere al coloanei, unele componente ale
amestecului

vor

traversa

coloana

mai

repede

decat

altele.

Monitorizarea

componentelor la iesirea lor din coloana, se face cu ajutorul unui detector care va
transmite semnalul unui dispozitiv de inregistrare a datelor. Cromatograma este
documentul care se obtine, ea fiind o functie de timp ce indica prezenta componentilor
sub forma de pic-uri.
Procesul de separare cromatografica este prezentat schematic in figura 1.1.
Cele trei etape de baza care au loc sunt injectia, separarea si elutia. In timpul injectiei
componentele sunt adsorbite de catre faza stationara. Migrarea componentelor probei
in faza stationara este rezultatul a doua forte miscarea imprimata de faza mobila si
retentia datorata fazei stationare. Astfel, moleculele probei sunt retinute de faza

stationara si transportate de faza mobila. Aceste forte opuse determina pentru fiecare
compus o distributie echilibrata intre cele doua faze. Distributia echilibrata, diferita, a
componentelor amestecului va conduce la viteze de migrare diferite.

Figura 1.2. Procesul de separare in cromatografia de lichide

Pe masura ce faza mobila avanseaza in coloana, componentele vor migra cu
viteze diferite in functie de distributia intre faza mobila si suprafata materialului de
impachetare din coloana, respectiv faza stationara. In final, componentele probei sunt
eluate din coloana, iar cantitatea in care acestea sunt prezente in eluat este evidentiata
de detector si este proportionala cu inaltimea pic-ului inregistrata in cromatograma.

1.2 Selectivitate metodelor lichid cromatografice

Pentru a dezvolta si a realiza o separare corecta este necesara analiza a
numeroase variabile experimentale care au influenta mare asupra distributiei in cele
doua faze, respectiv compozitia fazei mobile, natura fazei stationare si temperatura.
Fortele responsabile de interactia intre cele doua faze sunt cele care explica si
solubilitatea: forte electrostatice, interactii dipol - dipol si forte Van der Waals. Pentru
obtinerea unei separari bune, fazele mobile si stationare se aleg, de obicei, cu polaritati
contrastante. In cromatografia de lichide cu faza normala, faza stationara este polara,
in timp ce faza mobila este constituita de solventi nepolari. In cromatografia de lichide
cu faza inversa, faza mobila este mai polara decat faza stationara. In acest tip de
cromatografie, compusii polari sunt mai mult atrasi de faza mobila decat de cea
stationara, si astfel, sunt eluati mai repede din coloana. Compusii mai putin polari
interactioneaza mai mult cu faza stationara si sunt retinuti mai mult in coloana.

Uneori nu este posibil sa se realizeze o separare buna folosind o singura faza

mobila. In aceste cazuri este necesara realizarea unui gradient de elutie. Gradientul de
elutie reprezinta utilizarea a doi sau mai multi solventi, ce formeaza faza mobila, si al
caror raport de concentratie variaza in timp. Gradientul de elutie este oportun atunci
cand componentele amestecului de analizat au polaritati foarte diferite, separarea cu o
singura faza mobila nefiind eficienta.

1.3 Aplicaii ale cromatografiei de lichide de nalt performan

Cromatografia de lichide de inalta performanta este una din cele mai utilizate
tehnici analitice, deoarece are o gama larga de aplicatii. Daca in anii `60 nu existau
referinte la metodele HPLC, in perioada anilor `70 acestea au cunoscut o perioada
exploziva, iar in prezent ele sunt folosite in cele mai diverse domenii.
Cercetare in domeniul chimiei si biochimiei:

analiza amestecurilor complexe;

purificarea compusilor chimici;

dezvoltarea de procese pentru sinteza compusilor chimici;

izolarea compusilor naturali bioactivi;

analiza unor proprietati fizice.

Controlul calitatii produselor:

o asigurarea puritatii materiei prime;
o testarea pe flux;
o analiza cantitativa a produselor finite in vederea asigurarii conformitatii cu
specificatiile;
o evaluarea stabilitatii in timp si monitorizarea degradarii.
Controlul calitatii mediului:

analiza poluantilor aerului si ai apei;

monitorizarea materialelor care pot prezenta pericol pentru sanatate si
mediu;

monitorizarea nivelului pesticidelor din mediu.

Agentii teritoriale:

supravegherea produselor alimentare si

o
farmaceutice;

identificarea narcoticelor;

respectarea etichetarii.

1.4 Elaborarea unei metode bazat pe cromatografia de lichide de

nalt performan
n practica cromatografica, elaborarea metodei de analiza HPLC este faza cea
mai importanta, dar si cea mai laborioasa.
Reprezentarea schematica a etapelor elaborarii unei metode HPLC este
prezentat n figura 1.3.
1. Informatii despre proba,
definirea scopului separarii
2. Necesitatea unei metode speciale
HPLC, pretratamentul probei, etc.

3. Alegerea detectorului,
setarea detectorului

4. Alegerea metodei cromatografice.

Analize preliminare.
5. Optimizarea conditiilor de separare
6. Verificarea problemelor aparute sau
necesitatea aplicarii unei metode

speciale
7a. Evaluarea regasirii
substantei pure

7b. Realizarea curbei

de calibrare

7c. Metoda calitativa

(identitate, puritate)

8. Validarea metodei

Figura 1.3 Etapele elaborarii unei metode HPLC

1. Informatii despre proba, definirea scopului separarii

In aceasta prima etapa se analizeaza o serie de informatii legate de tipul probei

pe care o analizam. Legat de natura probei de analizat, trebuie sa se cunoasca:

numarul de componenti prezenti in proba;

structura chimica a compusilor;

masa moleculara;

valorile pKa;

spectrele UV;

domeniul de concentratii;

solubilitatea.
Solubilitatea compusului de analizat reprezinta cheia procesului de separare. In

functie de aceasta, se alege si solventul ce constituie faza mobila, dar si tipul de

cromatografie de lichide cel mai adecvat pentru realizarea separarii.
Pentru definirea scopului separarii trebuie sa se stie daca:
se doreste analiza cantitativa a unui compus, caracterizarea componentilor
probei, sau izolarea unor componenti puri?
intereseaza toti componentii din proba?
daca este o analiza cantitativa, care este nivelul de exactitate si precizie
necesara?
In afara de cele enumerate anterior, este necesar sa se cunoasca estimativ
numarul de probe care vor fi analizate conform metodei in curs de elaborare.
Nu in ultimul rand trebuie sa se analizeze echipamentul HPLC existent,
respectiv configuratia acestuia.
2. Necesitate a unei metode speciale HPLC, pretratament al probei
Probele supuse analizei pot sa fie sub forma de solutie, caz in care se practica
injectarea directa. Unele solutii necesita insa pretratamente anterioare injectiei, cum ar
fi: diluarea, tamponarea, adaugarea unui standard intern sau alte manipulari
volumetrice.
Probele solide se prelucreaza in scopul solubilizarii lor. Ele necesita fie
dizolvare, fie o extractie prealabila a substantelor de interes.
Exista si o alta categorie de probe, si anume acelea care necesita pretratamente
pentru inlaturarea interferentilor sau a impuritatilor, in vederea protejarii coloanei sau a
echipamentului HPLC.

3. Alegere si setare a detectorului

O cromatograma corecta implica un detector adecvat, care sa determine
prezenta compusului in proba.
Detectia se poate face cu :

detector UV cu mai multe lungimi de unda (10-8 g/ml);

detector de fluorescenta (10-12 g/ml);

detector electrochimic (10-10 g/ml);

detector al indicelui de refractie (10-6 g/ml);

detector conductometric (10-7 g/ml).

Cel mai utilizat detector este cel UV. Daca compusul de separat nu absoarbe in

domeniul UV, cea mai utilizata alternativa este detectorul de indice de refractie. Atunci
cand compusul prezinta fluorescenta sau se poate obtine in urma unei derivatizari
adecvate, detectorul de fluorescenta conduce la atingerea unor limite de detectie foarte
scazute pana la 10-12 g/ml.
Parametrii care caracterizeaza detectia sunt: sensibilitatea, selectivitatea si
zgomotul de fond.
4. Alegere a metodei cromatografice. Analize preliminarii. Estimare a conditiilor
optime de separare.
Analiza HPLC are la baza cromatografia de adsorbtie, putand sa fie de doua
tipuri:
-

HPLC clasic in care faza stationara este polara, iar cea mobila este
nepolara.
* Compusii polari (hidrosolubili, hidrofilici) sunt eluati mai tarziu decat
compusii nepolari.

RP - HPLC in care faza stationara este nepolara (C 8, C 18), iar faza

mobila este polara.
* Compusii nepolari (liposolubili, lipofilici) sunt eluati mai tarziu decat
compusii polari.
*

Fazele mobile, tipice pentru acest gen de cromatografie, sunt

amestecurile de apa sau tampoane apoase cu metanol, acetonitril sau

tetrahidrofuran.

* Faza stationara tipica este silicea cu hidrocarburi alifatice, care au rol de

liganzi.
Cu sistemele HPLC se poate practica si cromatografie de schimb ionic, la
care separarea compusilor este posibila prin fixarea acestora de catre faza stationara
care este incarcata ionic. Distributia sarcinilor poate sa fie de suprafata (in cazul
schimbatorilor de ioni pe baza de silice) sau in intreaga matrice a materialului (in cazul
schimbatorilor de ioni pe baza de polimeri).
In functie de caracteristicile compusului de analizat se opteaza pentru una dintre
aceste tipuri de analize HPLC.
De asemenea, se stabileste tipul de coloana care se va utiliza, alegand pentru
aceasta o anumita dimensiune a porilor (intre 60 si 300 ) si a particulelor (intre 2,5 si
20 m). Configuratia coloanelor folosite (C 8 sau C 18) variaza in functie de lungime,
diametru interior si material (L, id).
Tot in aceasta etapa se selecteaza faza mobila, indicand pentru aceasta
utilizarea in sistem izocratic sau gradient.
Metoda de separare se completeaza cu indicarea debitului de eluent (de obicei
intre 0,5 si 2 ml/min) si a temperaturii, avand grija sa se evite temperaturile prea
ridicate care scurteaza durata de functionare a coloanei.
In final, se stabileste marimea probei, alegand volumul de injectie (este de
preferat sa fie mai mic de 25 l) si cantitatea de substanta, evitandu-se incarcarea
excesiva.
5. Optimizare a conditiilor de separare
Scopul acestei etape este de a imbunatatii urmatorii parametri:
Rezolutie indica separarea a doua picuri consecutive.
O analiza precisa si robusta presupune ca rezolutia (Rs) sa fie mai mare
de 1,5, astfel incat cele doua picuri consecutive sa fie clar separate
pentru o identificare si cuantificare corecta.
La probele cu mai putin de 5 componenti se obtin usor rezolutii mai mari
de 1,5. In schimb, la probele cu 10 sau mai multi componenti, rezolutia
are valori intre 1 si 1,5.

 Timp de analiza pentru determinarile de rutina, acesta trebuie sa fie de maxim

10 minute. In cazul unor analize speciale acesta poate sa depaseasca 10
minute, numeroase aplicatii durand 30 de minute.
Determinare cantitativa trebuie sa aiba o valoare RSD mai mica de 2 % in
cazul dozarilor.
Pentru alte tipuri de determinari aceasta valoare poate sa fie mai mica de
5 %, iar pentru analiza urmelor in cazul controlului puritatii, cat si in cazul
dozarilor din medii biologice, RSD trebuie sa fie mai mic de 15 %.
Presiune optim trebuie sa fie mai mica de 150 bar.
Trebuie avut in vedere faptul ca presiunea mare conduce la uzarea
valvelor si a pompelor.
Inaltime a picului in urma optimizarii trebuie sa se obtina picuri inalte, pentru
care raportul semnal/zgomot sa fie cat mai mare.
Consum de solvent optim esta ca acesta sa fie minim per analiza, deoarece se
folosesc solventi de puritate speciala HPLC, iar un consum ridicat majoreaza
costul analizei.
6. Verificare a problemelor aparute sau a necesitatii unei metode speciale
In aceasta etapa se realizeaza:
o Evaluarea regasirii substantei pure;
o Realizarea curbei de calibrare (cu standard intern sau cu standard extern);
o Aplicarea unor metode calitative (determinare de densitate, puritate).
7. Validare a metodei
Ultima etapa este destinata corectarii erorilor cauzate de proba si nu a celor
cauzate de metoda folosita si urmareste stabilirea de:

Specificitate;

Linearitate;

Exactitate;

Precizie (repetabilitate, reproductibilitate);

Limita de cuantificare (LOQ);

Limita de detectie (LOD);

Robustete (modul in care analiza este influentata de o serie de factori

pH, aditivi, etc).