Pruebas Bioqumicas

Cepa N 6 Salmonella
Pri
Curso: 184
Viernes 29 de noviembre de 2013

TABLA DE RESULTADOS
Cepa
problema

Indol

Rojo de
Metilo

Voges
Proskauer

Citrato

N 6

Salmonella

TSI

LIA

MIO

Catalasa

Gelatina

MacConkey

+ (*)

K/K

K/K

(*) positiva a la produccin de H2S, anlisis posterior

DEBE REALIZAR UNA COMPARACION ENTRE SUS RESULTADOS
OBTENIDOS DE SU CEPA PROBLEMA Y BUSCAR INFORMACION
BIBLIOGRAFICA SOBRE LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS A SU
MICROORGANISMO X
Agar Hierro Tres Azcares (TSI)

El medio fue diseado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar

hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrgeno (H2S). El medio contiene 1
parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de
pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formacin de H2S. Si el
microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern de
color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estra
permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina
(roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH
del medio o producirn productos alcalinos y el medio TSI permanecer rojo. La
produccin de H2S se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
En el anlisis de la cepa n6, hubo produccin intensa de H 2S, lo que impide
verificar la fermentacin de glucosa, lactosa o sacarosa. Se produce cido
sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presenta un
ennegrecimiento

del

tubo.

La

produccin

de

H2S

el

consiguiente

ennegrecimiento impiden ver la fermentacin de la glucosa (fondo amarillo), pero

este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.

Fotografa cepa n6 para la prueba TSI

Agar Lisina Hierro (LIA)

La decarboxilacin de la lisina a cadaverina produce una alcalinizacin del medio y

un viraje al violeta del indicador prpura de bromocresol. Como la reaccin tiene
lugar en medio cido, es necesaria la fermentacin previa de la glucosa.
Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa
producen un viraje al amarillo en todo el medio.
La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro
producido.

Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta.

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen
un viraje al amarillo.
La formacin de H2S se indica por la aparicin de una coloracin negra.

En el caso de la cepa n6, esta descarboxila la lisina ya que haba coloracin

violeta en el tubo. Medio alcalino. Y produccin de H2S en menor cantidad que en
la prueba de TSI.

Fotografa para prueba LIA y TSI cepa Salmonella

Ensayo del Rojo de Metilo

El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un

microorganismo

fermenta

glucosa.

Todos

los

miembros

de

la

familia

Enterobacteriaceae convierten glucosa en cido pirvico por el camino de

Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan cido pirvico producen
cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el
camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El indicador del
medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. La mayora de las
Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metablico, pero raramente ambos.

Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.

Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas
ms.

En el caso de la cepa n 6 el reactivo permanece rojo, por lo que la prueba se

concluye positiva. Por lo tanto hay presencia del medio cido producido por la
bacteria.

Ensayo de Voges-Proskauer

El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido

pirvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan
el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de VogesProskauer (VP) detecta estos productos metablicos. En presencia de oxgeno e
KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del
ensayo se aumenta por el agregado de a-naftol antes del agregado de KOH.

En el caso de la cepa n 6 no se realiz directamente la prueba pero se determin

que esta era negativa debido a que la prueba para el rojo de metilo fue positiva.
La mayora de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones
opuestas entre el rojo de metilo y Voges Proskauer.

Prueba del Indol

El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con
un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para
combinarse con ciertos aldehdos para formar un compuesto coloreado. El ensayo
constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como
indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es
especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para
diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).El agregado de triptofano estimula la
produccin de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interface del reactivo y el caldo,

segundos despus de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interface.

En el caso de la cepa n 6 la prueba resulta negativa, ya que no hay cambio de

color, quedando el medio amarillo.

Prueba del citrato.

Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato

como nica fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinizacin
en el medio.
Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que
permite el paso del citrato a travs de la membrana celular.
El medio a utilizar para esta prueba es el Kocer Citrato (lquido) o Citrato de
Simons (slido e inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como nica
fuente de carbono, sales minerales, y adems un indicador de pH, el azul de
bromotimol.
El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el
citrato ocurre una alcalinizacin del medio, variando de verde a azul.
Ensayo Color azul en el medio, prueba del citrato +
Ensayo Color verde en el medio, prueba del citrato

Para la cepa n 6 la prueba es positiva debido al cambio de color del medio de

verde a azul, lo que indica citrato +.

Fotografa cepa n6 para la prueba de citrato

Catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo, la excepcin principal
el gnero Streptococcus. Cuando hay oxgeno, se produce la descomposicin
aerobia de los azcares. El perxido de hidrgeno H2O2, si se acumula es txico
para las bacterias y causa su muerte. Para evitar esto los microorganismos lo
descomponen a travs de la accin de la enzima catalasa.

Reaccin:

2H2O2

Catalasa

2H2O + O2 (gas)

Se siembra en una placa el microorganismo que queremos analizar. Se aade una

gota de agua oxigenada (perxido de hidrgeno) al 3% y se observa el resultado
de la reaccin.
La prueba positiva produce burbujas, producto del oxgeno liberado.

Para la cepa n 6 esta prueba resulta positiva, ya que al adicionar el agua

oxigenada sobre la muestra, esta produce burbujas inmediatas y por un perodo
de tiempo prolongado, lo que indica la presencia de esta enzima en la bacteria.

Hidrlisis de la gelatina.

Aunque el valor de la gelatina como fuente nutricional es cuestionable ( dado que

es una protena incompleta, carece del aminocido esencial triptofano), su valor
como prueba de identificacin de microorganismos se encuentra bien establecida.
La gelatina es una protena proveniente de la hidrlisis del colgeno, uno de los
componentes importantes del tejido conectivo y de los tendones en los humanos y
otros animales.

Las protenas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar
en la clula bacteriana. El catabolismo de las protenas es un proceso en dos
etapas.
Gelatinasas
Proteinas + H2O

polipptidos

Proteasas

Gelatinasas
Polipptidos + H2O

aminocidos

Proteasas

Se prepara medio agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde el medio y

luego se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121C. Una vez esterilizado,
se plaquea y deja enfriar.
Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura
adecuada durante 24-48 horas.
La lectura de esta prueba se realiza agregando a la placa el reactivo de Frazier,

La prueba positiva que indica la presencia de la exoenzima gelatinasa se ve por la

presencia de un halo claro en torno al crecimiento del microorganismo. Si no
existe este halo claro la prueba se considera negativa.

Para el caso de la cepa n6, esta prueba da negativa al no producirse el halo,

cuando se agreg el reactivo de Frazier.

Fotografa cepa n6 para prueba de la gelatina.

Fermentacin de la lactosa.

Sirve para diferenciar organismos fermentadores de la lactosa y no fermentadores

de la misma. Para esta prueba se utiliza el medio agar MacConkey, el cual es un
medio diferencial y selectivo que contiene sales biliares, rojo neutro, lactosa y
cristal violeta. La accin diferencial de este medio se basa en la fermentacin de la
lactosa. Las colonias de organismos que fermentan esta carbohidrato producen
una cada localizada del pH, lo cual seguido por la absorcin del rojo neutro,
imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que no fermentan la
lactosa permanecen incoloras y traslcidas.

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La

presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta
por el viraje del indicador debido a la produccin de cido; luego se absorbe el rojo
neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitacin de las
sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa
(S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias
incoloras y transparentes.

Este medio es ampliamente utilizado para aislar e identificar selectivamente

enterobacterias como Salmonellas, Shigellas y coliformes a partir de heces,
orinas, aguas negras y diversos alimentos.
La selectividad se debe a la presencia de cristal violeta y de sales biliares que
inhiben casi o completamente el crecimiento de organismos Gram positivos.
Urocultivo. Aislamiento sobre MacConkey. Colonias lactosa-positivas y lactosanegativas.

Aspecto de las colonias

Salmonella, Shigella incoloras, medio amarillo
Incoloras, transparentes o ambarinas: Salmonella.

Para la cepa n 6, esta prueba fue negativa, debido a que el medio permanece
incoloro, no se produce el cambio de coloracin a rojo.

Medio movilidad, Indol y Ornitina (MIO).

Es un medio diferencial que se utiliza para la identificacin de enterobacterias en

base a su movilidad, actividad de la enzima ornitina descarboxilasa y produccin
de indol.
Como se trata de un agar semislido, la movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o un crecimiento que difunde desde la lnea de
inoculacin.
La reaccin de la ornitina se indica mediante un color prpura en todo el medio,
este color puede variar en intensidad y puede blanquearse a un color plido
debido a la reduccin del indicador. La reaccin se debe a que el organismo
fermenta la dextrosa del medio, reduciendo su pH, esta condicin cida origina
que el indicador prpura de bromocresol se vuelva amarillo y proporcione las
condiciones ptimas para la descarboxilacin de la ornitina. Si ocurre esta
reaccin, el pH sube como resultado y el indicador se vuelve prpura. Los cultivos

negativos a la ornitina producen un tubo amarillo que puede ser prpura en la

parte superior.
Los microorganismos a probar en este medio se siembran por picadura, y se deja
incubar durante 24 horas a la temperatura adecuada.

ADEMAS

INVESTIGAR

TODO

LO

RELACIONADO

MICROORGANISMO IDENTIFICADO (ANIVEL DE GENERO)

CON

SU

SEGN LOS

RESULTADOS OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE

Se cree que la cepa n 6 corresponde al gnero Salmonella, de la familia

Enterobacteriaceae.

El gnero Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia

Enterobacteriaceae. Los miembros del gnero Salmonella son bacilos gramnegativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5m, generalmente mviles por flagelos pertricos
(excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados, algunos mviles
y no fermentan la lactosa. S. typhi es la nica serovariedad que no produce gas en
la fermentacin de los azcares.
El gnero Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a travs de los
aos, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonoma. Sin embargo, todava
siguen vigentes las ideas desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la
dcada del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del gnero
Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Estudios del DNA mediante tcnicas de hibridacin mostraron que el gnero
Salmonella est constitudo por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella
bongori. Salmonella entrica est compuesta por 6 subespecies: Salmonella
enterica

subespecie

Salmonella

enterica

enterica,
subespecie

Salmonella
arizonae,

enterica

subespecie

Salmonella

entrica

salamae,
subespcie

diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica

subespecie indica. A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie

Salmonella bongori se dividen en ms de 2400 serovariedades, que estn
definidas en funcin de diferentes asociaciones de factores antignicos somticos
O y flagelares H.
La mayora de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de
sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un
nombre por lo general relacionado con el lugar geogrfico donde se la aisl por
primera vez.
Como las serovariedades no tienen nivel taxonmico de especie, sus nombres no
siguen las reglas del International Code of Nomenclature of Bacteria, de manera
que sus nombres se deben escribir en letras romanas (no itlicas) y con
mayscula.
Los miembros del gnero Salmonella estn ampliamente distribuidos en la
naturaleza, se los encuentra como comensales y como patgenos en el tracto
gastrointestinal de mamferos domsticos y salvajes, reptiles, aves e insectos,
causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales.
Los miembros del gnero se pueden clasificar en tres grupos:
a) Los que no tienen preferencia por algn husped en especial, por lo que
infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la
mayora de las serovariedades responsables de las salmonelosis.
b) Los que infectan slo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella Paratyphi C.
c) Los que estn adaptados a un husped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S.
Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves

Los criterios para la identificacin bioqumica de Salmonella estn ampliamente

descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresin fenotpica de las
caractersticas analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios
de cultivo y en las condiciones de incubacin.
El sistema de serotipificacin de Salmonella spp. es probablemente el mejor
sistema de tipificacin fenotpica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y

provee informacin con significado epidemiolgico, desde el punto de vista de la

vigilancia basada en laboratorio.
.
Los microorganismos del gnero Salmonellae son bacilos Gram negativos no
fermentadores de lactosa. Fermentan glucosa con produccin de cido y gas
(excepto S. Typhi). Tambin fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol,
Dmanosa,L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Son oxidasa
negativo,catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y
citrato de Simmons positivo, urea negativo y producen H2S.
El hbitat de esta bacteria es en organismos obicuos, intestino de homeotermos y
poiquilotermos. El poder patgeno es a travs de transmisin fecal/oral, en formas
entricas, septicmicas y abortignicas. Poseen genes cromosmicos y
plasmdicos.

Microbiologa

La Salmonella crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3

milmetros. En laboratorios de microbiologa clnica se asla con medios selectivos,
Selenito, Hektoen, SS o XLD para inhibir el crecimiento de otras bacterias
patgenas y de la flora intestinal saprfita. Tienen los siguientes antgenos:
1)

Somtico O, del lipopolisacrido en la pared celular.

2)

Flagelar H, de la protena flagelina.

3)

Envoltura Vi, termolbil, responsable de la virulencia de varias especies

patognicas.

Virulencia
Salmonella, al igual que otras bacteria Gram negativas, usa un sistema
secretor especializado (denominado tipo III) para inyectar dentro de
clulas eucariotas ciertas protenas efectoras que manipulan las vas de
sealizacin celular y de la bacteria. Se ha observado la entrega de la
protena SipA a clulas que debilitan la maquinaria intracelular del husped y
promueven la virulencia en mamferos en aproximadamente 10 minutos,
dejando

la

bacteria

virtualmente

deprovista

de SipA,

efectivamente

estableciendo un nicho para la multiplicacin intracelular de la bacteria.

Bibliografa

Difco, Manual de Difco: Medios de cultivo deshidratados y reactivos para

microbiologa, Edit. Difco, edicin 10, pginas 115-120 y tabla 1.
Morfologa y caractersticas de crecimiento.

Prctico n 5 pruebas bioqumicas, Laboratorio de microbiologa, segundo

semestre 2013, elaborado profesora Mara Elisa Escobar.

Pginas de internet:

http://apps.who.int/medicinedocs/index/assoc/s16330s/s16330s.pdf pginas
111-128

http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella

http://www.ispch.cl/lab_amb/serv_lab/salmonella.html