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Module Biochimie / Biologie Molculaire

ENZYMOLOGIE
Semestre 4
Filire Fondamentale de la Licence
Sciences de la Vie
Pr Mohammed BEKKALI
Coordonnateur

www.uh2c.ac.ma/moodle

Enzymologie 2098/2010

Pr Mohammed Bekkali
Universit Hassan II Casablanca

Enzymes
ENZYMES

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INTRODUCTION
Quand en 1883, Payen dcouvrit la diastase
et en 1849 Claude Bernard La lipase pancratique ;

Nul ne pouvait imaginer quil sagissait dj de


lbauche dune famille de biocatalyseurs qui
va rvolutionner la technologie 150 ans plus
tard.

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Cest en effet la matrise scientifique


de fermentation qui a dmontr
lintrt dutiliser non plus le
microorganisme entier mais
seulement son principe actif pour
une ventuelle transformation
dune substance biochimique.

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En raison de leurs proprits catalytiques ,


les enzymes participent :
Synthses de molcules biologiques
L acides amins; exhausteurs de got etc.
Technologie alimentaire (viande; lait; fromage,
boissons etc.)
Elaboration de nouvelles techniques analytiques
(lectrodes et capteurs enzymatiques) pour dtection
et dosage immdiat et donc de contrle en temps rel
dun produit donn

Lavenir des enzymes sera plus prometteur Ds


que la protine sera :
plus efficace,
plus stable , et
dune dure de vie plus longue
ce qui nous conduit parler de:

superenzyme

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A+B

A-B

C+D

Raction en milieu aqueux, donc les molcules de

A et

B sont entoures deau, se dplacent dans tous les


sens cause de lagitation thermique avant de se

transformer en produits C + D. le complexe A-B dit de


collision doit passer par un tat de transition pour la
formation duquel une nergie dactivation est
ncessaire. Et comme un nombre faible de molcules
du complexe A-B atteint cette barrire, la vitesse de
raction est faible et do la ncessit de lenzyme.
Lnergie dactivation est ncessaire pour liminer les
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molcules deau.

Raction simple
Ce qui empche la conversion d'une substance chimique en une autre,
c'est la barrire nergtique qui les spare:
Entre les deux substances, il faut passer par un tat de transition particulirement dfavorable.

La vitesse de la raction de A B dpend de l'nergie d'activation (DEa1) ncessaire pour arriver


l'tat de transition (E.T.).
La vitesse de la raction de B A dpend de l'nergie d'activation (DEa2) ncessaire pour arriver l'tat de transition
L'nergie d'activation est fournie par l'agitation thermique. On peut donc acclrer une raction en chauffant.
L'quilibre de la raction de A B dpend de la diffrence d'nergie libre standard (DG0'),
mais pas de la hauteur de la barrire.

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Modle: deux lacs de niveaux diffrents spars par une digue.

Le passage d'eau de gauche droite est dtermin par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac
de gauche, mais aussi par la frquence de vagues dpassant cette hauteur.
Le passage d'eau de droite gauche est dtermin par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac
de droite, mais aussi par la frquence de vagues dpassant cette hauteur.
Des vagues plus hautes dues une agitation plus forte augmenteront le passage d'eau dans les deux sens et
aboutiront plus vite galiser le niveau des deux lacs.

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HISTORIQUE
1823-BERZHELIUS formula le concept de catalyse et met en vidence son
rle dans la fermentation et dans la digestion.
1833 - (Payen & Persoz):Premire prparation enzymatique (extrait aqueux
d'orge germ). Par prcipitation alcoolique,le principe actif est concentr
dont une faible quantit suffit la conversion dune masse importante
damidon en sucre. Cette prparation est sensible la chaleur et porta le
nom de DIASTASE.
1878-kHNE proposa le nom denzyme (Du Grec, zyme:dans la levure),qui
en1940 devient universel.

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1913 MICHAELIS donne la cintique


enzymatique sa forme mathmatique.

S
V Vmax .
Km S
1926

(Sumner) Cristallisation de l'urase.

Dtermination de la nature protique des


enzymes

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1930 Environ 80 enzymes sont isoles


1947 Dbut des techniques de filtration
sur gel de Sephadex et lectrophorse.
Et donc plus de 200 enzymes isoles.
1968 Plus de 1300 enzymes isoles.
1980 Grce la Chromatographie
d'affinit, plus de 2000 enzymes
purifies.
De nos jours , environ 3500 enzymes
purifies.
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Dfinition
Enzyme Nom suggr en 1878
par le physiologiste allemand
KHNE.

Lenzyme est une Substance


protique, qui agit comme catalyseur
biologique dans la rgulation de la
vitesse de nombreuses ractions
thermodynamiquement possibles (sans
modifier leur tat dquilibre) .
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STRUCTURE
Exemple de la glutamine transfrase

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Pourquoi des enzymes?


A. Acclration
Un(e) enzyme est un catalyseur biologique, donc elle acclre une raction qui serait
beaucoup trop lente sans elle (sans lenzyme).
Trois proprits importantes des enzymes:

Acclration de la raction dans les deux sens


Equilibre inchang
Saturation
1- Acclration mais quilibre inchang:
Concentrations de A et B en fonction du temps, en commenant avec

[A]o =10 et [B]o = 0

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Keq = 2.4 , [A]eq =2.94 et [B]eq =7.06


traits fins: sans enzyme,

traits pais: avec enzyme (acclration 10x)


(En fait, une enzyme acclre souvent une raction plus de 1'000'000'000 x !)

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Acclration de la raction inverse et quilibre inchang:


mmes constantes mais en commenant avec [A]o =0 et [B]o = 10

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. Canalisation

Parmi plusieurs ractions possibles, cest la raction catalyse qui aura lieu.

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Cintique

Pour une raction simple, la vitesse de formation de B (ou de disparition de


A)
est proportionnelle la concentration de A:

Vitesse de raction:
d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A]
(K1 = constante de vitesse)

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Comme la raction inverse a aussi lieu,


le changement de [B] dpend de la diffrence
des deux vitesses de raction:

d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] - k-1[B]


Equilibre: d[B]/dt = - d[A]/dt = 0
Donc, l'quilibre: k1[A]eq = k-1[B]eq
[B]eq / [A]eq = k1/ k-1 = Keq (constante d'quilibre)

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vitesse initiale
Concentrations de A et B en fonction du temps,
en commenant avec [A]o =10 et [B]o =0
k1 =0.3, k-1 =0.125, Keq = 2.4

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Les deux concentrations s'approchent de


leurs valeurs d'quilibre,
[A]eq =2.94 et [B]eq =7.06

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La vitesse de raction est difficile mesurer en prsence de A et B, surtout lquilibre !


On mesure donc en dsquilibre total, cest--dire la vitesse initiale:
[B] = 0 ; d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] , ou
[A] = 0 ; d[A]/dt = - d[B]/dt = k-1[B]
Graphiquement, la vitesse initiale est la pente de l'asymptote de la courbe pour t=0:

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la catalyse enzymatique passe par la formation d'un site


actif "cl-serrure", grace a la struc tertiaire. le site actif est
une rgion qui interagit avec les substrats qui seront
transforms en produits.le site actif est constitu d'acides
amins dont les groupements fonctionnels qui sont peu
nombreux interviennent dans la transformation des
substrats.

ENZYME
SUBSTRAT

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MODELE DE FISHER

Modle de la cl dans la serrure

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PROPRIETES
De tous les catalyseurs, les enzymes sont:
Les plus efficaces:
De trs petites quantits dE (micromoles) sont
capables dacclrer la raction un million de fois

Les plus spcifiques


chaque type de substrat correspond un enzyme.
Les enzymes possdent la capacit de rgulation.
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Ils interviennent dans tous les processus


biologiques

Un quelconque dficit enzymatique peut


tre fatal pour la cellule vivante.
Les enzymes sont utilises en:

agroalimentaire, pharmacie,
mdecine, environnement, en
biotechnologie etc
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E ne figure pas parmi les produits de


la raction et nest donc pas consomm
E ne modifie pas la nature de la
raction ni son quilibre (la raction
est possible sans E).

E modifie la vitesse de raction (10


fois)

11

Il ne faut surtout pas penser que la


matire vivante fonctionnerait sans les
E mais avec une vitesse lente.
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CYCLE CATALYTIQUE
1.Diffusion des molcules dans le milieu

2.Reconnaissance spcifique enzyme


substrat
3.Mcanisme catalytique
4.Expulsion des produits.
-9

Un tel cycle est de lordre de 10 - 10 seconde


-8

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EVOLUTION DUNE CINETIQUE ENZYMATIQUE

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S = cte et E = variable;

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E = cte et S

variable

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REACTION ENZYMATIQUE

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Du fait que la vitesse est dtermine juste aprs le dbut de raction, cd


vo vitesse initiale, la probabilit de formation de ES partir de P et de E
est ngligeable parce que la concent de P est trs petite.
1. Ltat dquilibre est atteint trs rapidement pour lintermdiaire ES
(Briggs et Haldane), cd vf de ES = vd ES, autrement dit ES est
constant dans le temps.

vf .ES vd.ES ES const


vf .ES K 1E
. S
vd.ES K 2.ES K 3ES
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V formation de ES

v disparition de ES

K 1E S K 3ES K 2ES 1
La concentration totale de lenzyme est:

ET EL ES 2
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Si lon considre que vf de P partir de ES sexprime comme suit:

K
3
ES
E P

vf .P vo K 3.ES 3

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Vmaximale est atteinte quand ES est maximale, cd tout E fait partie


de ES (Elibre=0), E satur par S.

ES max ET V max K 3.ES max


doncV max K 3ET 4

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A ltat stationnaire,cd quand vf et vd de ES est la mme, on


obtient:

K 1E S K 3ES K 2ES 1

dES/dt = 0

Tout lenzyme est libre ,

K 1EL S K 2 K 3.ES 0maisEL ET ES


K 1ET ES S K 2 K 3.ES 0

ET
. S
ES
5
S K 2 K 3 K 1
On remplace le rapport (K2+K3/K1) par Km

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(la constante de michaelis)

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On multiplie le tout par K3

K 3.ET
. S
K 3.ES
S Km
maisK 3.ET V max etK 3.ES vo

V max .S
vo
S Km
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d ' aprs 3

V max .S
vo
S Km

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Raction catalyse par une enzyme

Il y a au moins trois ractions simples:


1.Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)
2.Transformation du substrat li (ES) en produit li (EP)
3.Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)

Pour chaque raction il y a une diffrence d'nergie libre


et une barrire d'activation franchir.

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A chaque constante de vitesse correspond une nergie d'activation


(plus DEa est grande, plus k est petite):

La diffrence d'nergie libre (DG) entre substrat et produit ne dpend pas


de l'enzyme.
L'quilibre n'est donc pas modifi par l'enzyme!

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Ici aussi, la vitesse de raction est difficile


mesurer en prsence de S et P,
surtout lquilibre!
On mesure donc de prfrence en dsquilibre total,
cest--dire la vitesse initiale vo:
En dbut de raction, il n'y a pas de P,

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et on prsume que le complexe EP se dissocie plus vite qu'il ne se forme partir de ES,
c'est--dire que k3 > k2, k-2 . La raction qui limite la vitesse de formation de P est la
raction k2. Dans ces conditions, le schma se simplifie:

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Leonor Michaelis et Maud Menten ont dduit de ce modle


en 1913 une quation qui prdit la vitesse initiale (de formation de P )
en fonction de la concentration du substrat:
Vitesse initiale de la raction: vo = d[P]/dt = k2[ ES ]
La vitesse de raction dpend de la concentration
du complexe enzyme-substrat ES.
V = f([ES])
Il faut donc calculer la concentration de ES:

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ES se forme partir de E + S
et se dcompose
soit en E + S ,
soit en E + P .
Vitesse de formation de ES: vf = k1[ E ][ S ]
Vitesse de dgradation de ES: vd = (k-1+ k2)[ ES ]
[ ES ] atteint rapidement une valeur constante
(condition dite de "steady state"),
donc vd = vf

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vf ES = k1[ E ][ S ]
vd ES = (k-1+ k2)[ ES ]

donc vd = vf
(k-1+ k2)[ ES ] = k1[ E ][ S ]
[ ES ] = [ E ][ S ] k1/ (k-1+ k2) =
= [ E ][ S ] / Km
Km = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis -Menten)

Il faut maintenant connatre


la concentration de l'enzyme libre [ E ].

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[ E ]libre = [ E ]T - [ ES ]
o [ E ]T est la concentration totale d'enzyme.
On a donc: [ES]= [ E ][ S ] / Km
[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])[ S ] / Km =
= [ E ]T[ S ] / Km - [ ES ][ S ] / Km
[ ES ] + [ ES ][ S ] / Km = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ]( 1 + [ S ] / Km) = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ](Km + [ S ]) / Km = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ](Km + [ S ]) = [ E ]T[ S ]
[ ES ] = [ E ]T[ S ] / (Km + [ S ])

On multiplie par K2

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On peut introduire ce terme dans l'quation pour la vitesse initiale:


vo = k2[ ES ] = k2[ E ]T[ S ] / (Km + [ S ]) =
=Vmax[ S ] / (Km+ [ S ])

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Cas spciaux ou extrmes

vo = vmax[ S ] / [ S ]
[ S ] >> Km

vo = vmax

vo indpendante de
[ S ],
saturation,
asymptote
dpendance
linaire de [ S ],
substrat limitant,
asymptote

[ S ] << Km

vo = vmax[ S ] / Km

[ S ] = Km

vo = vmax Km / 2 Km demi-saturation de
v = v / 2 l'enzyme

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max

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Courbe de Michaelis-Menten:
vo en fonction de [ S ]

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Vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la raction


lorsque l'enzyme est sature de substrat,
c'est--dire lorsque [ E ]T = [ ES ].
Km est la concentration de substrat qui sature l'enzyme moiti et pour
laquelle vo = Vmax/2.
Vmax = K2 . [E]T
k2 (= Vmax/ [ E ]T) est souvent appele constante catalytique kcat,

Cest une vitesse et reprsente le nombre de


cycles catalytiques par seconde (nombre de rotations)
dont est capable l'enzyme.

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Le rapport kcat/Km est souvent aussi donn comme mesure de


l'efficacit catalytique, car il correspond une constante
de vitesse pour de basses concentrations de substrat
( [ S ] << Km, donc [ E ] = [ E ]T)
vo = Vmax[ S ] / Km = kcat[ E ] [ S ] / Km =

vo=[ E ] [ S ] kcat/Km

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Linarisation de l'quation de Michaelis-Menten


Il est difficile de placer correctement la main
une hyperbole dans un graphe.
On se trompe trs facilement sur la hauteur de Vmax
. Pour simplifier l'valuation des rsultats, on utilise une transformation
de l'hyperbole en droite.
La plus connue est la transformation en double-rciproque
de Lineweaver et Burck ou

les inverses:

1 / vo = 1 / Vmax + (Km / Vmax ) 1 / [ S ]


Cette quation reprsente une droite qui a pour pente
pente = Km / Vmax

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Reprsentation de Linweaver Burck

L'intersection sur l'axe vertical est = 1 / Vmax

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et sur l'axe horizontal = 1 / Km.

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