Remerciements

:
Nous tenons particulièrement à remercier Mme Murielle
BAHUT de la Plate-Forme Technologique de Biologie Moléculaire
d’Angers (Université d’Angers) qui, par des explications simples,
claires et précises nous a permis de comprendre rapidement des
phénomènes et des techniques totalement inconnus. De plus, la visite
des laboratoires nous a permis de comprendre réellement le cadre du
séquençage
et
notamment de découvrir les appareils utilisés.
Nous remercions également l'
École
ADN qui nous orienta directement vers les
personnes les plus appropriées pour répondre
à nos besoins.

Introduction
I. Comment séquence-t-on l’ADN ?
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Historique
Préparation de la séquence cible
Méthode de Sanger
Méthode de Maxam et Gilbert
Automatisation du séquençage
Pyroséquençage luminométrique en temps réel

II. À quoi sert le séquençage ?

1. Test héréditaire
2. Identification judiciaire
3. Thérapie génique

III. Quels dangers représente le séquençage ?
1. Génome humain
2. Carte d’identité génétique
3. Et demain ?

page 2

page 6

page 7

Conclusion
Index des mots-clés

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Introduction :
Le séquençage de l'
ADN, consiste à déterminer l'
ordre d'
enchaînement des
nucléotides d’un fragment d’ADN donné. Nous développerons dans ce dossier les différentes
méthodes les plus souvent utilisées, les multiples usages et les réglementations en vigueur.
Nous avons choisi ce sujet afin de comprendre les dessous d'
une technique en vogue,
souvent utilisée dans les grands enquêtes criminelles actuelles et tendant à se généraliser dans
certaines situations (test de paternité...). Du point de vue technique, les méthodes utilisées
paraissant assez complexes, nous nous sommes tournés vers une spécialiste qui réussit à nous
expliquer les choses simplement, en partant des bases que nous connaissions et nous permit
finalement de comprendre les conclusions complexes des sources d'
informations plus
conventionnelles.

I. Comment séquence-t-on l’ADN ?
1. Historique :

Les premières techniques de séquençage ont été développées en parallèle au milieu des
années 1970. Les méthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes
deux été récompensées d'
un prix Nobel de chimie en 1980.
Le premier organisme a été séquencé en 1977. Il s'
agissait du virus bactériophage
X174, possédant un ADN simple brin ne nécessitant donc pas l'
étape de dénaturation utilisé
dans les méthodes de Sanger et Maxam et Gilbert.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Depuis une trentaine d'
année, l'
amélioration de la technique de production des
amorces, de l'
amplification des brins et la généralisation des traceurs fluorescents ont permis
d'
améliorer considérablement les techniques de séquençage. L'
apparition des séquenceurs
automatiques a notamment permis l'
automatisation de ces technologies et ont contribué à la
finalisation du génotypage humain en 2003.
2. Préparation de la séquence cible :
Ces trois méthodes utilisent des bases communes : le brin d’ADN à séquencer est
extrait, amplifié, puis dénaturé (on sépare le double brin d’ADN en deux), et on utilise la
polymérase, une enzyme dont le rôle est de dupliquer un élément.
L'
amplification, c'
est à dire la réplication de la séquence, est réalisée à partir d'
un
technique appelée PCR ou "Polymerase chain reaction" (réaction de polymérisation en
chaîne). Cela permet de dupliquer à plusieurs millions d'
exemplaires un fragment d'
ADN
grâce à l'
ADN polymérase. Cette technique utilise des cycles de trois phases au cours des
quelles chaque double brin est dénaturé (cf. infra) et séparé de sa polymérase (qui est
maintenu par des protéines). Une variation spécifique de la température permet aux
nombreuses amorces présentes en suspension dans la solution de s'
hybrider aux simples brins
sans que ceux-ci ne s'
hybrident entre eux (ce qui rendrait impossible l'
accrochage de
l'
amorce). Enfin, la polymérase assimile progressivement les nucléotides néoformés libres
ajoutés également dans la solution jusqu'
à l'
obtention de doubles brins complets ; c’est
l’élongation. Le cycle, d'
une durée maximum de quatre minutes, est répété en boucles de
nombreuses fois (entre 35 et 45 par PCR) et double le nombre de brins à chaque fois (suite
logique de
puissance
2).
La dénaturation (ou déshybridation), c'
est à dire la séparation des deux brins
composant la molécule d'
ADN, est obtenue par élévation de température ce qui a pour effet de
fragiliser les liaisons hydrogènes reliant les bases azotées.
3. Méthode de Sanger :
Dans quatre tubes à essais distincts, on
introduit en parallèle des brins d’ADN cibles dénaturés
en grand nombre, des amorces (sur laquelle se fixe la
polymérase), la polymérase elle-même et des
nucléotides normaux (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
On ajoute ensuite un nucléotide modifié ou didéshydro-nucléotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP)
de type différent dans chaque tube. Ceux-ci sont
identiques aux nucléo bases classiques à la différence
qu'
il leur manque un groupepement-HO nécessaire à
l'
assimilation du nucléotide suivant par la polymérase
(liaison phospho-diester).
La quantité de nucléotides modifiés incorporés dans chaque tube est bien inférieure au
nombre de nucléotides classiques afin de ne pas stopper l'
assimilation trop tôt. Il faut qu’il y
ait moins de ddNTP que de dNTP pour que dans le tube, on ait toutes les molécules possibles
qui soient synthétisées.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Ainsi,
lors
de
l'
assimilation d'
un de ces
nucléotides par la polymérase,
la réplication du brin est
stoppée. La quantité de
nucléotides
modifiés
incorporés dans chaque tube
étant inférieure au nombre de
nucléotides
classiques,
statistiquement.
Une fois les réactions
terminées, on obtient dans
chacun des quatre tubes des
doubles brins d’ADN de tailles
variables, en fonction de leur
arrêt par les nucléotides
modifiés.
Les
"réactions
de
séquence" (avec ddNTP) sont rapides (moins de 15 minutes). Le point long du protocole est
en fait la lecture du résultat.
On place alors le contenu des tubes dans quatre puits distincts (correspondant aux
quatre nucléotides possibles) de gel d’électrophorèse. L’ADN étant chargée négativement,
plus la taille de la séquence est important et plus la molécule migre vers le pole positif du gel
d’électrophorèse. Après leurs migrations, dans ce gel on peut aisément retrouver l’ordre des
nucléotides de la séquence concernée. Une simple lecture horizontale de ce gel (une fois
révélé) permet de connaître l'
ordre des bases de la séquence.
Afin de voir les fragments d'
ADN sur le gel d'
électrophorèse, on utilise la plupart du
temps des marqueurs fluorescents. On peut aussi marquer radioactivement les nucléotides
puis les exposer à un film photographique: des bandes sombres apparaissent là où se trouvait
de l'
ADN sur le chromatogramme ; c’est l’autoradiographie.
4. Méthode de Maxam et Gilbert :
Contrairement à la méthode précédente, celle-ci n'
utilise quant à elle aucune base
modifiée mais une réaction chimique permettant de couper le brin suite à un type de base.
Étant donnée le nombre important de copies présentes dans le tube, on obtient statistiquement
chaque possibilité. La méthode de l'
électrophorèse suit ensuite celle de Sanger.
Moins facile à robotiser que la méthode de Sanger, cette technique est aujourd'
hui
très peu utilisée dans les milieux industriels.
5. Automatisation du séquençage :
Aujourd'
hui, la plupart des séquençages sont réalisés par des séquenceurs industriels
entièrement automatisés. Ceux-ci utilisent la technique de Sanger mais avec des méthodes de
révélation différentes.
Les fragments d'
ADN sont marqués par des marqueurs fluorescents; leur taille est
ensuite déterminée par chromatographie ou électrophorèse assistée par ordinateur.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Avec ces techniques, on peut séquencer jusqu'
à 1000 bases avec les meilleurs
séquenceurs contre 200 à 300 via une méthode manuelle comme celles exposées ci-dessus. En
effet, lors de l’électrophorèse manuelle, le nombre de bases est limité afin de ne pas rendre le
chromatogramme illisible par la surcharge des bandes et ainsi ne plus permettre une lecture
horizontale.
C’est notamment grâce à la rapidité de ces appareils que le séquençage du génome
humain fut réalisé en un temps record par rapport aux prévisions effectuées lors du démarrage
du projet.
6. Pyroséquençage luminométrique en temps réel :
Contrairement
aux
méthodes
traditionnelles,
le
pyroséquençage ne peut séquencer
que des brins d’une centaine de
bases azotées. Par conséquent,
cette méthode n’est pas très
courante.
Elle
est
utilisée
principalement pour détecter des
mutations sur des séquences
ciblées par comparaisons de brins.
Encore une fois, on utilise
un brin dénaturé, une amorce, les
quatre types de nucléotides
normaux. On ajoute également
quatre enzymes : la polymérase, la
sulfurylase, la luciférase, et
l’apyrase. Les nucléotides, les
enzymes et leurs substrats sont
introduits dans une cartouche
adaptée, et le brin d’ADN dans
une micro cuvette. Le tout est mis
dans un pyroséquenceur, appareil
entièrement informatisé.
Le pyroséquenceur propose alors tour à tour un type de base. Si la base correspond,
elle est alors incorporée par la polymérase au brin.
Celui-ci rejette alors un phosphate inorganique (PPi) transformé en ATP par la
sulfurylase puis en lumière par la luciférase. Cette émission lumineuse est alors captée par un
détecteur photosensible qui transmet un signal à l’ordinateur.
Dans le cas ou deux bases identiques se suivent, celles-ci sont incorporées dans le
même temps ; l’énergie lumineuse à donc une intensité double se qui se traduit
graphiquement sur l’écran.
Dans le cas où la base n’est pas incorporée, celle-ci est alors dégradée par l’apyrase.
Un autre type de nucléotide est alors proposé.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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II. À quoi sert le séquençage ?
1. Test héréditaire :

Lorsqu'
une simple vérification des groupes sanguins et des gènes récessifs ne suffit
pas à déterminer la parenté, on utilise alors indirectement le séquençage génétique.
Chez chaque individu, des séquences de nucléotides non codantes (aussi appelées
ADN répétitif ou encore « ADN poubelle ») se répètent un certain nombre de fois, différent
selon les individus. Ces séquences répétées sont appelées minisatellites; leur taille, qui
correspond au nombre de répétitions varie généralement de 5 à 50.
Etant donné que l'
on possède tous les chromosomes, excepté les sexuels, par paire, on
a deux tailles différentes de minisatellites, transmises par chaque parent. La comparaison de
ceux-ci avec les géniteurs potentiels conduit à la découverte du père biologique.
Afin d'
augmenter les probabilités du lien de parenté recherché, ces mesures de
minisatellites sont étendues à plusieurs chromosomes; cela permet actuellement aux
laboratoires d'
analyse d'
assurer une fiabilité supérieure à 99%.
2. Identification judiciaire :
La médecine légale utilise les même minisatellites afin de constituer une empreinte
génétique spécifique à chaque individu Celle-ci est ensuite comparé aux preuves biologiques
de l'
enquête comme par exemple du sang, du sperme, des cheveux ou de la salive.
Cette méthode permet d'
inculper ou de relaxer un suspect avec une quasi-certitude
écartant tout risque d'
erreur judiciaire (sous réserve que les éléments cibles soient les bons
bien entendu).
3. Thérapie génique :
Certaines maladies sont dues à la mutation d’un gène. Le séquençage génétique
permet de comparer l’ADN de deux personnes afin de détecter une mutation. Ainsi, on peut
savoir sur quel gène et donc à quel endroit du génome s’est produite la mutation.
Les techniques de thérapies géniques, encore à l’état de test, essaient de remplacer la
séquence mutée par une séquence saine. Cependant, il s’avère beaucoup plus difficile
d’introduire la séquence modifiée au bon endroit d’un génome humain que d’un génome de
souris.
Ces nouvelles pistes de recherche, même si elles sont encore balbutiantes, ouvrent de
nouveaux horizons et autorisent les malades à espérer. En effet, il y a quelques années encore,
des maladies telles que la mucoviscidose, l'
hémophilie, la myopathie de Duchenne et la
drépanocytose étaient incurables. Aujourd’hui, les chercheurs savent où chercher et les
perspectives de guérison grandissent chaque année.
Cependant leur l’élaboration, les tests qu’ils nécessitent prennent su temps et surtout
de l’argent ; Il est donc nécessaire que des manifestations contre le Téléthon perdurent pour
sensibiliser et informer le grand public à propos de l’importance de leurs dons.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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III. Quels dangers représente le séquençage ?
Actuellement, les réglementations au sujet du séquençage ne sont pas très claires.
1. Génome humain :
Au début des années 1990, la communauté internationale a décidé d’organiser un
projet public de séquençage dont le but était d’obtenir, en l’an 2000, la totalité des séquences
du génome humain en caractères. En raison de l’ampleur de ce travail, 20 institutions ont
convenu de partager la tâche. Chaque centre de séquençage s’était alors engagé à déposer les
séquences dans des bases de données publiques dès l’acquisition, pour éviter un accès payant
à ces informations.
Dans le même temps, une société privée, Celera Genomics, s’était engagée à donner
accès à ses clients plus rapidement à une séquence plus complète que celle du consortium.
Cependant, la société n’a pas réussi à obtenir une ébauche suffisamment complète pour
pouvoir concurrencer le consortium.
Sur ce point, le projet public de séquençage a atteint son objectif d’obtenir la séquence
complète au début du troisième millénaire (2003).
La seule loi en vigueur a été énoncée par l’UNESCO, en 1997 : « Le génome humain
est un patrimoine de l'
humanité. Un patrimoine de l'
humanité ne peut pas être la propriété de
quelqu'
un. »
2. Carte d’identité génétique :
Il est, depuis 2003, formellement interdit de dresser la carte d’identité génétique d’un
être humain : cela est considéré comme une forme de racisme et de discrimination.
Cependant, un Fichier Automatisé des Empreintes Génétiques national de lutte contre
la criminalité se et progressivement en place dans certains pays tels que les Etats-Unis, le
Royaume Uni, l'
Autriche, l'
Allemagne et les Pays Bas. L’ADN répertorié correspond aux
minisatellites non codant permettant l’identification judiciaire.
En France, ce système regroupe exclusivement les délinquant sexuels potentiellement
récidivistes.
3. Et demain ?
On pourrait par exemple envisager que l’empreinte génétique soit implantée
directement dans nos papiers d’identité. Cependant le fichage systématique des individus pose
des problèmes sous-jacents inévitables. Qu’est-ce qui empêcherait un terroriste de fabriquer
des armes génétiquement ciblées pour un individus ou un groupe de personnes ? De plus,
pourquoi ne pas imaginer un monde à l’image du film Bienvenue à Gattaca dans lequel le sort
de chacun est décidé avant même sa naissance ?
Les dérives criminelles de la génétique sont aussi nombreuses et diversifiées que leurs
perspectives bénéfiques...La science et le savoir en eux-mêmes ne sont ni bons ni mauvais ;
tout dépend de ce que l’homme en fait. Depuis la nuit des temps la recherche progresse et l’on
ne peu pas la stopper, c’est dans la nature humaine. Il est cependant nécessaire de l’encadrer !

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Conclusion
Cette étude approfondie des techniques de génie-génétique nous a permis de
comprendre les dessous du thème d'
actualité que représente le séquençage génétique.
Nous avons préféré approfondir les techniques de séquençage et leurs utilités aux
réglementations en vigueurs et aux conséquences qu'
il en découle afin de ne pas trop tomber
dans une réflexion polémique pour le moment insoluble. En effet, ce dernier point nous paraît
très important du point de vu éthique cependant, il nous semblé plus intéressant de
comprendre le « pourquoi du comment » biologique.
Nous espérons vous avoir transmis, de la manière la plus simple et complète possible
l’essentiel de tout ce que nous avons pu apprendre lors de la préparation de ce thème au choix.
Excusez cependant notre maladresse dans la rédaction rendant parfois nos explications moins
compréhensibles que nous l’aurions souhaité.
Cette étude ne détaille que succinctement de nombreux fonctionnement (notamment
ceux des enzymes utilisées), ceci dans le but de ne pas surcharger le lecteur et facilité la
compréhension. Ainsi si le minimum présenté ici ne répond pas à vos attentes, nous vous
invitons à consulter en profondeur les sites web utilisés dans la préparation de ce dossier.

Index des mots-clé
Amorce (ou oligonucléotide): Série de quelques dizaines de nucléotides
complémentaires au début du brin à séquencer. Support sur lequel se fixe la polymérase.
Apyrase : enzyme utilisée dans la technique de pyroséquençage. Dégrade les
nucléotides non assimilée par la polymérase.
Dénaturation ou déshybridation : séparation des deux brins de la double hélice
d’ADN.
dNTP: nucléotide (ou nucléobase) "classique". Sigle signifiant désoxyNucléotide
TriPhosphate. Correspondant aux quatre bases Adénine (dATP), Thymine (dTTP), Cytosine
(dCTP)
et
Guanine
(dGTP).
ddNTP: type de nucléotide modifié, ne permettant pas la poursuite de l'
assimilation
par la polymérase à cause du manque d'
un groupement hydroxyde HO nécessaire aux liaisons
phosphodiesters. Utilisé dans la méthode de Sanger.
Electrophorèse : technique utilisant la propriété es ions à se déplacer selon un champ
électrique. Elle est utilisée pour connaître et classer par longueur les séquences d’Adn dans
certaines techniques de séquençage génétique.
Luciférase : enzyme utilisé dans la méthode de pyroséquençage. Transforme l’ATP
en lumière.
Minisatellites : séquence de nucléotides non codantes répétées un nombre spécifique
de fois chez chaque individus et utilisé pour les empreintes génétiques.
(ADN) polymérase: complexe enzymatique permettant, à partir d'
une amorce,
d'
assimiler les nucléobases (néoformés libres) afin de répliquer un brin d'
ADN fils ; sorte de
"tricoteuse" ou "assembleuse de fermeture éclair".
PPi : phosphate inorganique. Rejeté lors de l’assimilation d’un nucléotide par l’Adn
polymérase.
Sulfurylase : enzyme utilisé dans la méthode de pyroséquençage. Transforme le PPi
dégagé en en ATP.

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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Sources :
Pour préparer ce dossier, nous avons utilisé
plusieurs types de documentations. Mme BAHUT de la
PFT nous a premièrement fourni de nombreuses
explications ainsi que quelques documents papier. De plus,
nous avons également bénéficié de cours de l’université
d’Angers prêtés par notre professeur de S.V.T.
La plupart des photographies proviennent de la
visite des laboratoires de l’école ADN et de la PFT. Les
illustrations et compléments d’informations sont quand à
eux principalement extraits des sites web suivants :
• www.wikipedia.org
• www.snv.jussieu.fr
• www.genoscope.cns.fr

– Aurélien DUMAINE & Vincent COLIN

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