3.

2 Deteksi
Kromatografi biasanya dipantau oleh perubahan absorbansi UV. Karena setiap senyawa memiliki
koefisien penyerapan karakteristik, absorbansi ini mungkin sangat berbeda untuk senyawa yang
berbeda, khususnya pada panjang gelombang yang lebih panjang. Untuk alasan ini, pemantauan
senyawa yang tidak diketahui dengan deteksi UV paling baik dilakukan dengan menggunakan
panjang gelombang pendek, dekat "akhir absorbansi," biasanya antara 200 dan 220 nm. Hampir
semua senyawa organik akan menunjukkan beberapa absorbansi
dalam kisaran ini; panjang gelombang lebih pendek cenderung menyebabkan absorbansi fase
pelarut mobile untuk mengganggu. Idealnya, sebuah UV dioda detektor array digunakan; ini
mengukur absorbansi atas seluruh rentang gelombang UV sehingga spektrum UV
dapat diperoleh pada setiap titik pada kromatogram. Karena setiap senyawa memiliki spektrum UV
karakteristik, ini dapat memberikan informasi yang berguna tentang senyawa dalam campuran.
Senyawa dengan tidak ada penyerapan UV relatif signifikan terhadap fase gerak dapat dipantau oleh
perubahan indeks bias atau dengan deteksi elektrokimia (jarang digunakan untuk pekerjaan
preparatif).
3.3. Prinsip Kromatografi
Pengetahuan rinci tentang teori kromatografi tidak perlu untuk melakukan pemisahan efektif, tetapi
pengetahuan tentang prinsip-prinsip yang mendasari pemisahan kromatografi sangat membantu
dalam memahami bagaimana memantau dan meningkatkan pemisahan. Seperti telah dijelaskan,
pemisahan terjadi karena dalam kesetimbangan dinamis molekul zat terlarut mentransfer antara
dua fase, molekul yang berbeda menghabiskan proporsi yang berbeda dari waktu di fase mobile dan
stasioner. Molekul zat terlarut hanya bermigrasi ketika mereka berada di fase mobile (dan semua zat
terlarut dalam fase gerak bermigrasi dengan kecepatan yang sama). Kecepatan di mana zat terlarut
bergerak melalui kolom secara langsung berkaitan dengan proporsi-mol fraksi-kelompok tertentu
dari molekul dalam fase gerak. Jika R, = fraksi mol X Pada tahap mobile.
Rx = P / P
px = ';. R,
dimana px = laju pergerakan zat terlarut band dan pm = laju pergerakan fase gerak.
Ini pada dasarnya adalah sama dengan koefisien distribusi dan proses kromatografi dasarnya terdiri
dari ribuan kesetimbangan dinamis. Namun, tidak ada waktu yang cukup untuk sampel untuk
mencapai sepenuhnya keseimbangannya distribusi antara dua fase. Sampel yang tersisa di fase
gerak dilakukan ke bagian segar dari kolom di mana ia bergerak ke stasioner fase dari fase gerak.
Sebagai konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak dari bagian pertama ini menurun, zat terlarut di
wilayah ini kolom bergerak kembali dari fase diam ke fase gerak, sesuai dengan koefisien distribusi,
dan dilakukan sampai ke bagian kedua dari kolom di mana sekali lagi keseimbangan (hampir)
tercapai. Ini tidak terjadi sebagai serangkaian langkah diskrit tapi sebagai proses dinamis yang terusmenerus (Gbr. 6).