Tema:

EXTRACCIN E IDENTIFICACIN DE GLUTATIN

INTRODUCCIN
La fase oxidativa de la va de las pentosas fosfato permite la oxidacin de la glucosa 6 fosfato a
pentosas fosfato y la generacin de NADPH utilizado por las clulas para la biosntesis reductiva, la
reduccin de la forma oxidada del glutatin (GSSG) a la forma reducida correspondiente (GSH) o
para contrarrestar los efectos nocivos de los radicales libres del oxgeno en los eritrocitos y las
clulas del cristalino y de la crnea que estn directamente expuestos al oxgeno y a los radicales
libres y perxidos. Al mantener una atmsfera reductora mediante una alta relacin de NADPH a
NADP y de glutatin reducido a glutatin oxidado se puede evitar o atenuar el dao a protenas,
lpidos, ADN y otras molculas sensibles.
El glutatin (GSH) es un tripptido formado por residuos de cido glutmico (Glu), cistena (Cys) y
glicina (Gly). Se encuentra fundamentalmente en los rganos celulares y en los glbulos rojos. En
los tejidos y clulas del organismo animal, el glutatin se encuentra en forma reducida (GSH) y en
forma oxidada como hexapptido GSSG. Entre las numerosas funciones biolgicas en las que est
implicado, podemos destacar la eliminacin de radicales libres y la formacin de conjugados para la
excrecin de txicos celulares.
Los grupos tiol (SH) son agentes reductores. El GSH reduce los enlaces disulfuro formados en las
protenas citoplasmticas a Cys. En el proceso el GSH es convertido a su forma oxidada el disulfuro
de glutatin (GSSG). El GSH se encuentra casi exclusivamente en su forma reducida, puesto que la
enzima que lo revierte, la glutatin reductasa, es constitutivamente activa e inducible cuando existe
estrs oxidativo. El glutatin es indudablemente el ms importante de los antioxidantes, al punto que
sin l los seres humanos, animales y plantas moriran. El rol principal de este pptido pequeo es el
de proteger a los millones de clulas de los seres vivos.
Para la determinacin cualitativa del GSH, se realiza la reduccin del GSSG mediante la reaccin
con el sulfuro sdico que se desprende en medio alcalino y que al combinarse con nitroprusiato
sdico forma un compuesto de color carmes. Debido a la no disponibilidad de nitroprusiato la
identificacin del GSH se realizar mediante una tcnica de identificacin de S en muestras
orgnicas.

OBJETIVO
Determinar la presencia de glutatin mediante tcnicas de identificacin de S como sulfuro en
muestras orgnicas.
MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivos y materia prima

Sangre (5 muestras en EDTA).

Materiales

Mortero con pistilo

1

Sulfato de amonio
Acetato de plomo al 10%
Hidrxido de sodio al 10%
Cistena
Cistina
EDTA
Fosfato dicido de sodio
Fosfato dibsico de sodio

Polvo de vidrio o arena lavada y seca

Tubos de ensayo
Tubos de centrfuga
Soporte para tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Pipeta automtica de 100 a 1000 l
Sistema de calentamiento
Jeringuilla de 5 ml
Tubos para muestras de sangre con
EDTA

PROCEDIMIENTO
Extraccin de GSH a partir de sangre
Separacin de eritrocitos: colectar 5 ml de sangre en un tubo con EDTA (disponible en locales de
venta de materiales para laboratorios clnicos). Centrifugar las muestras a 5000 g por 5 min.
Remover cuidadosamente el sobrenadante, extraer una alcuota de 100 l de los eritrocitos
empacados y aadir a 9,9 ml de tampn fosfato 0,01M de pH 7,5 que contiene 0,005 M de EDTA
para producir un hemolizado. Comprobar la presencia del GSH a travs de la deteccin de S.
Identificacin del glutatin en forma de sulfuro:
En un tubo de ensayo coloque 2 ml del sobrenadante de la extraccin de GSH (solucin de
eritrocitos hemolizados), agregue 2 ml de la solucin de NaOH al 10% y caliente, a continuacin
aada 0.5 ml de solucin de acetato de plomo al 10% y vuelva a calentar. La aparicin de un
precipitado oscuro indica la presencia de azufre en forma de ion sulfuro.
Realice el ensayo descrito con las muestras de cistena y cistina al 0,1% para comparar las
coloraciones que presentan estos aminocidos con los de las muestras ensayadas.

RESULTADOS
Reportar el resultado de la reaccin que se produjo con cada muestra e incluir las fotografas
correspondientes.

DISCUSIN
Comparar la coloracin obtenida a partir de las muestras de sangre y compararcon la coloracin
producida con cistena y cistina. Explicar las diferencias.
2

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

Consulte la base cientfica de la determinacin del GSH con nitroprusiato.

Proponer un mtodo enzimtico para determinar la presencia de GSH y GSH total.
Qu propsito cumple el empleo de sodio metlico en la determinacin de S?.
El glutatin contiene un enlace peptdico inusual, seale como se forma.
Qu significa que la glutatin reductasa, sea constitutivamente activa?.
Describa las reacciones qumicas que se producen entre un compuesto azufrado y el acetato de
plomo en medio alcalino.
Qu funcin cumple el EDTA aadido al tampn fosfato?.

BIBLIOGRAFA

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Vsconez, C. (1993). Manual de Prcticas de laboratorio de Qumica de Alimentos.
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http://www.amazing-glutathione.com/#ixzz1LKIK4cCQ
http://organica1.org/1345/1345pdf11.pdf
http://www.geocities.ws/todolostrabajossallo/orgaI_12.pdf
http://www.teknokroma.es/es/Productos/cultivo-celular-biociencias/12/diagnostico-clinico-porhplc-chromsystems/151/1142/glutation-en-sangre-total.aspx.
Iqbal, M.P., Ishaq, M. and Mehboobali, N. 2004. Increased Levels of Erythrocyte Glutathione in
Acute Myocardial Infarction: an Antioxidant Defence. J. of Pakistan Medical Asociation, 54(5):
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