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TP n1 : Prparation des milieux de cultures et des colorants dobservation

microscopique des champignons


Les champignons sont des vgtaux sans chlorophylle. Le thalle, appareil vgtatif, est
souvent constitu de trs fins filaments ramifis (hyphes). L'ensemble de ces hyphes forme le
myclium. Il est parfois suffisamment dense pour se voir c'est le "blanc de champignon" en
fait du blanc au brun presque noir. Chez les Myxomyctes (les plus infrieurs) le thalle est
amibode c'est dire qu'il peut se dplacer. Du fait qu'ils n'ont pas de chlorophylle les
champignons sont obligs de se procurer le carbone dont ils ont besoin dans des substances
organiques mortes (saprophytes) ou vivantes (parasites). Seules les formes parasitaires nous
intressent ici. Il existe aussi des champignons symbiotiques qui forment des lichens avec des
algues et des mycorhizes avec des plantes suprieures.
Les maladies cryptogamiques ( champignon) sont visibles par les ractions et
transformations de la plantes mais on ne voit pas le champignon lui-mme sauf au microscope
ou s'il fructifie l'extrieur des organes atteints.
1-Les milieux de cultures :
La prparation des milieux de culture varie linfini. On peut diviser ces milieux en deux
catgories :
*Les milieux dits complexes : sans composition bien dfinie (PDA, MEA, YSA, MYEA,
SGA).
*Les milieux synthtiques de composition dtermine (CDA)
 PDA (Potatoes Dextrose Agar)
-

Pomme de terre

200 g

Eau distille

700 ml

Laver, couper en morceaux les pommes de terre, les faire cuir, ensuite filtrer et
ajouter les ingrdients suivants :
-

Succrose

20 g

Agar

15 g

Puis ajuster la quantit deau 1000 ml par leau distille. Autoclaver pendant 20
min 120C et conserver pour lemploi ultrieurement.

* PDAa (Potatoes Dextrose Agar acidifi):


Au moment densemencement on ajoute 200 ml de PDA, 1,5 ml dacide
lactique (25%) afin dinhiber la croissance des Bactries en acidifiant le milieu.
On peut remplacer lacide lactique par des antibiotiques, ou par Rose Bengal.
 AGW (Agar Water) :
-

Agar

15 g

Eau distille

1000 ml

Autoclaver pendant 20 min 120C et conserver pour lemploi ultrieurement.


 SGA (Soil Glucose Agar)
-

Sol

500 g

Eau ditille

1000 ml

Bouillir 30 mn et filtration, filtrat +


-

Glucose

10 g

Agar

15 g

Puis ajuster la quantit deau 1000 ml par leau distille. Autoclaver pendant 20 min
120C et conserver pour lemploi ultrieurement.
Nb : De prfrence utilise le sol du mme nature du sol chantillons (sol tudi).
 CDA (Czapek Dextrose Agar)
-

NaNO3

3g

MgSO4

0,5 g

KH2PO4

1,5 g

FeSO4

0,05 g

KCl

0,5 g

Succrose

30 g

Agar

15 g

Puis ajuster la quantit deau 1000 ml par leau distille. Autoclaver pendant 20 min
120C

et conserver pour lemploi ultrieurement.

2-Prparation des colorants : les colorants sont utiliss pour lobservation microscopique
des champignons. Le colorant possder obligatoirement est le bleu coton. Ce colorant, on
peut le trouver sous deux formes
* Bleu coton au lactophenol : Utilis pour les prparations conserves.

* Bleu lactique : Il permet de visualiser la structure myclienne des champignons, sans


conserver la prparation.
Composition du bleu lactique :
Bleu de mthyle (=bleu coton)

0.1 g

Eau distille

20 ml

Acide lactique

20ml

TP n2 : Isolement des Champignons Phytopathogne


1-Diagnostic des maladies dues aux champignons :
Le postulat de Koch : Robert Koch nona en 1881 un postulat qui prcise les tapes
successives auxquelles il doit tre satisfait pour pouvoir tablir une relation causale entre une
maladie et un microorganisme. Bien que ce postulat ait t formul pour des maladies des
vgtaux causes par des parasites cultivables in vitro. Lapplication stricte du postulat sera
rserve aux cas complexes.
Les tapes du postulat de Koch appliqu la physiopathologie snoncent comme suit :
1- Lagent doit tre prsent chez les plantes malades et absent chez les plantes saines ;
2- Lagent doit pouvoir tre isol de plantes malades et multipli en culture axnique ;
3- Lorsque lagent en culture pure est inocul une plante saine, il doit induire les
symptmes caractristiques de la maladie ;
4- On doit pouvoir risoler lagent initial partir des plantes infectes exprimentalement
2- Examen direct : Prendre un chantillon (Feuille, Tige, Fruit, Racine et Sol), vous observez
laide dune loupe binoculaire et vous notez toute changement daspect entre les
chantillons malades et sains.
3- Isolement :
a- Ensemencement :
Prendre un chantillon (Feuille, Tige, Fruit ou Racine) dune plante malade et sain, vous
les lavez frquemment avec deau distille strile deux fois, ensuite vous les dsinfectez par
de lalcool 70%, vous les laissez deux minute, puis vous les rincez avec deaux distille
strile et les schez avec papier buvard strile, ensuite vous les coupez en morceaux avec une
lame ou un couteau strile.
Vous dposer les morceaux des chantillons (Feuille, Tige et Fruit) dans des boites de
Ptri contenant trois rondelles de papier Buvard Strile et humidifi par leau distille strile.
Vous incubez ensuite les boites 22C.
Concernant les morceaux de racine vous les dposez sur milieu dAgar. Vous les incubez
28C.

Aprs trois jours dincubation vous coulez les milieux de culture (PDAac et CDA) dans
des boites de Petri ensuite, aprs solidification de ces milieux, vous transfrez les morceaux
des (Feuilles, Tiges, Fruits et Racine). Vous incubez les boites pendant 3 5 jours en 28 C.
Concernant le sol, rcuprez-le sol adhrent aux racines, Schez-le 30 C dans des
fonds de boite de Petri et Broyez le dans un mortier strile. Dispersez une quantit de terre (5
15 mg) dans des boites de Petri striles, ensuite ajoutez 1 2 gouttes deau distille strile,
par la suite vous coulez les milieux de culture (PDAac, CDA et SGA). Vous agitez les boites
de Petri doucement avant solidification et incubez-les 28 C pendant 5 Jours.

TP n3 : Purification et Identification des champignons phytopathogne


b- Purification :
Aprs incubation, vous observez le dveloppement des champignons de diffrentes
couleurs. Vous prlevez avec une anse de platine strile quelques spores ou myclium,
et vous les repiquez sur un milieu de culture (PDAac) coul en boite de Petri.
Lincubation se fait 28 C pendant 5 jours.
c- Identification :
Lidentification est une tude corrlative entre les caractres macroscopiques et
microscopiques des champignons.

Les caractres macroscopiques : Avant purification, vous notez les types de


champignons, leur nombre, texture et couleur du thalle, couleur du revers de la
boite de Petri, prsence dun pigment diffusible et odeur.

Les caractres microscopiques : Ils sont observs grce la mthode de


microculture. Vous coulez des boites de Petri avec PDAac, aprs solidification du
milieu, vous coupez le milieu en petit carr avec un couteau strile, ensuite vous
transfrez chaque carr tout seul sur une lame strile, vous ensemencez chaque
type de champignons seul sur un carr en dposant les spores sur les limites
priphriques du milieu. Ensuite vous dposez des lamelles striles sur le milieu
laide dune pince strile. Vous conditionnez lensemble dans une chambre strile
et humide puis incub 28 C pendant 3 jours.

TP n4 : Observation Microscopique
Identification microscopique :
* La microculture : Aprs incubation vous transfrez les lamelles sur dautres
lames striles contenant quelques gouttes du bleu coton. * La mthode de scotch :
vous crasez un morceau de scotch sur une colonie fongique pure et ensuite vous
le transfrez sur une lame strile contenant quelques gouttes du bleu coton
* Observation microscopique : Vous observez au microscope grossissement
10, 40 et 100. Vous comparez les observations par celles dcrites par Barnett
(1972).