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EL CICLO DE LA UREA

Objetivos
Comprobar diferentes aspectos del ciclo de la urea
Calcular la concentracin de urea en diferentes muestras problema
Introduccin
La urea, CO(NH2)2, es el compuesto mediante el cual los mamferos excretan la mayora del ion amonio
producido por el catabolismo de los aminocidos. En la sntesis de la urea, que tiene lugar en el hgado, las
fuentes inmediata de los tomos de nitrgeno son el carbamil fosfato y el acido asprtico. El carbamil
fosfato se sintetiza a partir de anhdrido carbnico y amoniaco en una reaccin que requiere ATP. El acido
asprtico se forma por una transaminacion en la que el acido oxalacetico es el receptor de un grupo amino.
Para cuantificar el efecto de los cambios experimentales sobre la actividad del ciclo, se utilizar un mtodo
de medida de la cantidad de urea basado en la reaccin coloreada de la urea en presencia de ortoftalaldehido
en medio acido. La mezcla incubada durante 15 min a 37 C da una coloraron roja con un mximo de
absorcin a una longitud de onda de 510 nm.
Material
7 tubos de ensayo
2 pipetas de 1 mL
Bao de hielo
Colormetro a 510 nm
Reactivos
Homogenizado de hgado
Tris-ClH 0,1 M pH 7,4 conteniendo 0,01 M MgCl2
Ornitina 0,05 M
Carbamil fosfato
Aspartato 0,002 M
ATP 0,05 M (preparar en el momento)
Arginina 0,05 M
Solucin patrn Urea 10 mM
Reactivo 1 (ortoftaldehido 4,8 mM)
Reactivo 2 (solucin borato 87 mM)
Procedimiento
Preparacin del bemolizado
Pesar 2 g de hgado, centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos. Guardar el sobrenadante. Congelar a -20 C
Efecto de la presencia de diferentes sustratos sobre la formacin de urea
Preparar 3 tubos del siguiente modo (el extracto de hgado debe ser el ultimo que se aade)

Incubar los tubos durante 10 minutos a 37 C para que tenga lugar la sntesis de urea.
Curva de calibrado de la urea
Disponer 4 tubos como sigue

Desarrollo de la reaccin coloreada


1.
2.
3.
4.

Adicionar 0,5 ml de reactivo 1 y 0,5 ml de reactivo 2 a


cada tubo
Incubar durante 15 minutos a 37 C para que tenga lugar la
reaccin coloreada
Enfriar los tubos para parar la reaccin (5 minutos en
hielo)
Medir la absorbancia a 510 nm