Laboratorul de Nanotehnologii

TEHNICI DE SPECTROSCOPIE

Mihaela Miu (mihaela.miu@imt.ro)

Definitie generala:
Spectroscopia presupune analiza efectului interactiei radiatiei
electromagnetice cu proba

Proprietatile radiatiei
electromagnetice

energia;
viteza;
Lungine de unda

Amplitudin
e

amplitudinea;

Modificarea a cel putin una din

frecventa;

proprietati are loc la interactia

unghiul de faza;
polarizarea;
directia de
propagare.

radiatiei electromagnetice cu
proba

UV Vis:
raze X:
excitatia
electronilor adanci

excitatia

IR:

electronilor de

vibratii

valenta

moleculare

unde Radio :
starile de spin nuclear
(in camp magnetic)

4 tipuri de tranzitii posibile:

Excitarea electronica a electronilor intre orbitalii moleculari

Orbitalii legaturilor simple

* de antilegatura

(neocupati)
Orbitalii legaturilor duble

* de antilegatura

Nivele energetice libere

(posibile stari excitate >
Ee)

(neocupati)

radiatie

* necesita cea mai mare energie

(<150nm UV indepartat) ;

n * sunt caracteristice sistemelor cu

heteroatomi (N, O etc.) care contin electroni

neparticipanti ( 180 - 370 nm);

Orbitalii legaturilor duble

Nivele energetice

de legatura (ocupati)

ocupate (stari

Orbitalii legaturilor simple

fundamentale > Ef)

* i n * sunt caracteristice in

cazul moleculelor cu legturi duble ( 200

- 700 nm).

de legatura (ocupati)
E = Ee Ef = hc/
Nivelele vibrationale si rotationale superimpuse peste nivelele
electronice
Nivele
rotationale
Nivele
vibrationale
Stari electronice
excitate
Nivele
rotationale
Nivele
vibrationale
Stari
electronice
fundamentale

Metoda

Fenomenul ce sta la baza

spectroscopica

Tipul de

Domeniul de

Domeniul de

Numar de

radiatie

lungimi de

frecventa

unda

electromagneti

unda

ca
Spectroscopie UV Vis

Spectroscopie de

schimbare
a starii
electronilo
r exteriori

fluorescenta
Spectroscopia IR

Spectroscopie Raman

schimbare
a starii de
oscilatie

masoara
absorbtiaexteriori
pentru a
Electronii
determina comportarea
avea tranzitii din starea
chimica
fundamentala
Lumina vizibila
in starea excitata
1000 nm 100
31014Hz - 31016Hz
nm
Radiatie UV
masoara tranzitiile din starea
excitata in starea
fundamentala
Inregistreaza aparitia unor
miscari vibrationale ale
moleculelor

100 m 1m

31012Hz - 31014Hz

100 - 104 cm-1

10 nm -100
pm

31016Hz - 31018Hz

106 108 cm-1

Rntgen

schimbarea starii de spin a electronului

sau a starii hiperfine

microunde

1 m 1 cm

300 MHz 30
GHz

0,01 1 cm-1

schimbarea starii de spin a nucleului

unde radio

100 m 1 m

3 MHz - 300 MHz

10-4 0.01

Inregistreaza aparitia unor

miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului

radiatia

Spectroscopie de
electroni (ESCA)

radiatie IR

104 106 cm-1

schimbarea starii electronilor adanci

Spectroscopia de
rezonanta de spin
(ESR)
Spectroscopia de
rezonanta magnetica

-1

Metoda

Fenomenul ce sta la baza

spectroscopica

Tipul de

Domeniul de

Domeniul de

Numar de

radiatie

lungimi de

frecventa

unda

electromagneti

unda

ca
Spectroscopie UV
Vis

Spectroscopie de
fluorescenta

schimbare
a starii
electronilo
r exteriori

masoara absorbtia pentru a

avea tranzitii din starea
fundamentala
in starea excitata
masoara tranzitiile din starea
excitata in starea
fundamentala

Lumina
vizibila
Radiatie UV

1000 nm 100
nm

31014Hz - 31016Hz

104 106 cm-1

SPECTROSCOPIE UV - VIZ
Spectrul
vizibil

Frecvente
mari

Frecvente
mici

Lungimi de unda
(nm)

Violet: 400 - 420 nm

Indigo: 420 - 440 nm

Blue: 440 - 490 nm
Green: 490 - 570 nm

> Cand lumina traverseaza sau este reflectata de o

Yellow: 570 - 585 nm

substanta colorata, o parte caracteristica a lungimilor de

Orange: 585 - 620 nm

unda este absorbita.

Red: 620 - 780 nm

>

Lumina

ramasa

din

spectru

se

presupune

complementara in culoare cu lungimile de unda absorbite.

fi
Absorbtia luminii in domeniul 420-430
nm face ca substanta sa fie galbena, iar
Absorbtia luminii in domeniul 500-520
nm face ca substanta sa fie rosie.

Absorbtia luminii din spectru este datorata tranzitiilor electronice

Schema de detectie in spectroscopia UV-Vis

Spectrometru cu monofascicul

Spectrometru cu retea de
diode

(pentru fiecare lungime de unda este detectata

(tot spectrul este obtinut

odata)

cantitatea de lumina transmisa / reflectata)

Spectrometru
dublufascicul

1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

Transmitanta: T = I / I0
Absorbanta: A=log10 I0 /I= log101/T = - log T
coeficient de absorbtie;

= c

c concentratia speciilor
absorbante;
absorbtivitatea molara sau
coeficient
de extincie molara.

A = cl

lumina incidenta

lumina transmisa

lumina incidenta

lumina transmisa

Legea Lambert
Beer

lumina
incidenta

Absorbanta este direct proportionala cu concentratia solutiei > dublarea concentratiei dubleaza absorbtia

Absorbanta este direct proportionala cu distanta parcursa in solutie > dublarea distantei dubleaza absorbtia

lumina
transmisa

1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

A = cl

Legea Lambert
Beer

Exemplu de
curbe de
absorbie la
diferite

curba de etalonare a

concentraii de

absorbantei la maximul de

analit

absorbie la max

Deviatii de la legea Beer descrie corect solutiile diluate

La concentratii mari (> 10-2 M) apar interactii intre particulele

absorbante.
In plus, se modifica indicele de refractie al solutiei

Evolutia spectrului de absorbtie pentru

2. Se poate calcula dimensiunea

nanocristale cu diametre de la 1,7 nm pana la

cristalitelor

12 nm
(CdSe/ZnS
core/shell700
QD)
450 nm
nm

Lungimi de unda mai mici / energii mai mari

Apare deplasarea spre albastru blue shift odata cu scaderea

dimensiunilor

Eg (CdSebulk) = 1.75 eV bulk = 710

nm

260 nm

Eg (CdSeOD) = 2.75 eV QD = 450

nm

scaderea dimensiunilor unui

cristal pana la valori nanometrice

determina aparitia fenomelor de
confinare cuantica

Ex: largirea BI Eg = 1eV corespunde unei deplasari

262 nm
Apare fenomenul de largire a benzii interzise
(BI)

SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENTA
detectie complementara spectroscopiei UV-Vis
> daca in spectroscopia UV-Viz se masoara energia absorbita de o molecula pentru
a trece dintr-o stare fundamentala in stare excitata,
> in spectroscopia de fluorescenta se masoara energia emisa de o molecula pentru
a trece din starea excitata in starea fundamentala.

Schema procesului de aparitie a fluorescentei

excitare
Fluorescenta
dezexcitar
e

Schema de detectie a unui spectrometru de

fluorescenta cu o geometrie la 90 utilizand o
sursa de Xe

Detaliu drum optic

Schema de detectie a fluorescentei in Microarray

technology

Diagrama Jablonski
Conversie interna > tranzitii
neradiative

Vi stari energetice de
vibratie

S0 stare fundamentala;
S1 prima stare de tranzitie electronica
excitata

Time resolve
fluorescence

Se obtine timpul de viata al

Proba este supusa unei iluminari in

unei specii moleculare

pulsuri (durata pulsurilor trebuie sa

excitate

fie mai scurta ca timpul de viata) >

nanoFlash Lamp

ns

fluorescenta

fosforescent
a

Steady state fluorescence

(de fapt este o mediere a

resolve)

Proba este supusa unei iluminari

fenomenelor time
continue

Se obtine spectrul de
emisie

Investigarea constantei de legatura a bioconjugatelor

BSA-Nanoparticule de aur
prin spectroscopia de fluorescenta
M. Iosin, F. Toderas, and S. Astilean,
Institutul de Cercetari Experimentale Interdisciplinare, Laborator de Nanobiofotonica, Universitatea Babes Bolyai,
Cluj-Napoca

Fenomen de stingere a

Sf
er

Au
NP

fluorescentei

as
on
st
Ba
e
P
N
Au

II

Metoda

Fenomenul ce sta la baza

spectroscopica

Tipul de

Domeniul de

Domeniul de

Numar de

radiatie

lungimi de

frecventa

unda

electromagneti

unda

ca
Spectroscopia IR

Spectroscopie
Raman

schimbare
a starii de
oscilatie

Inregistreaza aparitia unor

miscari vibrationale ale
moleculelor
Inregistreaza aparitia unor
miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului

radiatie IR

100 m 1m

31012Hz - 31014Hz

100 - 104 cm-1

SPECTROSCOPIE IR si Raman

Fiecare atom are 3 grade de libertate > o molecula cu n atomi are 3n grade de
libertate
3 grade de libertate
descriu translatia
moleculei

Pentru o molecula liniara, rotatia in jurul

3n-6

3 grade de libertate
descriu rotatia moleculei

grade de libertate descriu vibratiile fundamentale

axei nu conteaza (nu afecteaza energia

moleculei)
3n 5 grade de liberate descriu vibratiile
fundamentale

Exemple:

Cele care produc o modificare neta

in momentul dipolului

in polarizare pot da

pot da o activitate IR

o activitate Raman

Sunt vibratii active atat IR cat si Raman

H2O molecula neliniara cu 3 atomi

3n 6 = 3 stari vibrationale

CO2 molecula liniara cu 3 atomi

3n 5 = 4 stari vibrationale

C6H6 (benzen) molecula foarte mica, dar cu 30 de benzi de vibratie in IR si Raman

molecula polimer polistiren contine 1000 de unitati monomere (16000 atomi) aproximativ 50.000 de vibratii diferi
Este imposibili identificarea tuturor starilor vibrationale simplificam luand in considerare numai gruparile chimice repetitive (ex: benzile nucleului aromatic,
vibratiile C-H, C-C sau C=C

Teoria spectroscopiei de absorbtie in

infrarosu
Pentru ca o molecula sa absoarba radiatia IR, vibratiile sau rotatiile in
interiorul ei trebuie sa determine o schimbare neta in momentul de dipol

Campul electric oscilant al radiatiei electromagnetice

interactioneaza cu fluctuatiile momentului de dipol al
moleculei
Daca frecventa radiatiei se potriveste cu frecventa
vibrationala a moleculei, atunci radiatia va fi absorbita

Va aparea o modificare in amplitudinea vibratiei moleculare.

Factori care afecteaza pozitia vibratiilor moleculelor in spectrul absorbtiilor

I // Cazul unor molecule
liniare
(i) Tipul de vibratii

(ii) Taria legaturii

Exemplu

Exemplu
Legatura C - H stretch in alkene
absoarbe la 2600 2800 cm

Energie mai
mare

-1

Legatura C N absoarbe la

1050 1650 cm-1

2200 cm-1

Energie mai
mare

In cazul unor legaturi similare, diferenta in

Legatura C - H bend in alkene

absoarbe la 1365 1485 cm

Legatura C - N absoarbe la

Energie mai
mica

Exemplu

Exemplu

-1

energia de absorbtie este data de masa

atomilor constituenti

Energie mai
mica

Atomul cu masa mai

Atomul cu masa mai mare

mica va vibra mai

va vibra mai putin

puternic

Legatura C Cl

Legatura C Br

absoarbe la 600 800

absoarbe la 500 600

cm-1

cm-1

Atomul de Cl e mai usor >

energie mai mare de
vibratie

Atomul de Br e mai greu >

energie mai mica de

I I // Cazul unor molecule

neliniare
Exemplu: apa (H2O) molecula neliniara cu 3 atomi
3n 6 = 3 stari vibrationale

3 benzi de absorbtie in IR si Raman

n 1 = 2 vibratii

2n 5 = 1 vibratii

streching

bending

pentru legaturile H - O

pentru structura H O - H

Felul in care radiatia este utilizata difera in spectroscopia Raman fata de spectroscopia IR :

in FTIR energia care acopera un interval de frecvente este directionata catre

proba;
>

absorbtia are loc cand frecventa radiatiei incidente se identifica cu cea la

care molecula trece intr-o stare excitata vibrationala

in Raman se utilizeaza o singura frecventa a radiatiei pentru iradierea probei

>

radiatia este imprastiata de molecula, detectandu-se unitatile de energie

vibrationale diferite de
cele incidente
(luminaexprimata
care interactioneaza
moleculele
distorsioneaza

Imprasierea
Raman trebuie
ca o deplasare cu
in energie
fata de
radiatia de
excitatie
Pentru
legaturi cu
unnorul
moment
puternic de dipol (care sunt active IR) mobilitatea electronilor sau polarizabilitatea este de obicei scazuta.
polarizeaza
electronic)
Pentru legaturi cu un moment slab de dipol (care sunt inactive IR) polarizabilitatea este de obicei mare si starile vibrationale ale legaturilor
sint active Raman.

Spectru IR
Acid benzoic

Spectru
Raman

Spectroscopie Raman

Nu implica nici absorbtia, nici emisia, ci

radiatiei

imprastierea

Radiatia IR incidenta determina miscarea electronilor in legaturi si poate fi:

Este sensibila la
mobilitatea electronilor in

absorbita;

legaturi

difuzata fara a i se modifica lungimea de unda > difuzie Rayleigh;

(polarizabilitatea
legaturilor)
Masoara
cit de usor este
sa misti un

electron
si implicit
-4 polarizezi o
- intensitatea Rayleigh depinde puternic de lungimea
de unda
I ~ sa
legatura

imprastiata Raman-Stokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mare dect cea a radiatiei
incidente);
imprastiata Raman-antiStokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mica dect cea a
radiatiei incidente);

Spectroscopie IR

Energia asociata radiatiilor IR este suficienta sa stimuleze vibratiile moleculare (ale

legaturilor chimice)
Conditii pentru ca o molecula sa absoarba radiatia n domeniul IR:
sa aiba o structura de dipol sau sa poata dobandi o astfel de structura prin
excitatie
perioada de vibratie trebuie sa fie in faza cu perioada de oscilatie a radiatiei
incidente
cantitatea de energie a radiaiei IR trebuie sa fie permisa de restrictiile
Spectrul IR rezultat reprezinta absorbtia si transmisia
cuantice
moleculara, fiind amprenta moleculara a probei

Spectrele utilizate curent sunt de fapt spectre asupra carora s-a aplicat
transformata Fourier
Spectroscopia FTIR - o metoda de masura a tuturor frecventelor IR simultan utilizand
interferometria

Schema de detectie

Fasciculul IR incident este

divizat in 2 fascicule optice

Un fascicul se reflecta pe

Al 2-lea fascicul se reflecta pe o

o oglinda plata fixa

oglinda plata care se deplaseaza

pe distante scurte (inainte
inapoi)

Se recombina cind se reintilnesc in splitter

Pentru ca au parcurcurs drumuri optice diferite, semnalul

rezultat este un semnal de interferenta

Fiecare punct contine o

informatie despre fiecare
frecventa IR care vine de la
sursa

Spectrul FTIR pentru o solutie de etanol

O-H

C-H

C-0

Observatii:
- o molecula contine legaturi care dau mai multe vibratii posibile > in spectrul IR trebuie sa se
regaseasca mai multe absorbtii care sa defineasca o molecula (nu numai o legatura chimica);
- se pot identifica legaturile specifice ale unei molecule (gruparile functionale) pentru a
determina structura;

III

PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT

SCATTERING)

III

PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT

SCATTERING)

tehnica utilizata pentru determinarea dimensiunilor

nanoparticulelor
Se obtin in plus informatii despre

procesul de clusterizare a particulelor in

suspensie
procesul de adsorbtie a anticorpilor pe
particule

Principiul de detectie:
proba cu particule in suspensie este iluminata

particulele vor imprastia lumina in toate

directiile
pe un ecran situat in
vecinatate vor aparea spoturi
luminoase

daca particulele ar fi fixe > imaginea de pe ecran ar fi

stationara;
fiind in miscare browniana > imaginea nu este stationara
proba
Particule
in
suspensie
Intensitatea
luminoasa va fluctua
in timp

Din punct de vedere fizic

- Atunci cand un fascicul de lumina traverseaza o solutie cu particule sferice aflate in miscare
Browniana, interactiile cu particulele determina o deplasare Doppler, modificand lungimea de unda
initiala
Depinde de marimea
particulelor

Este posibila obtinerea distributia de dimensiuni ale

sferelor si sa ai implicit o descriere a miscarii
particulelor in mediul respectiv masurand coeficientul
de difuzie al particulelor si utilizand functia de
autocorelatie.
O functie caracteristica de autocorelatie a

Particulele sau macromoleculele suspendate intr-un mediu lichid,

luminii imprastiate - determinate

aflate in miscare Browniana determina fluctuatiii ale concentratiei

experimental

locale a particulelor apar neomogenitati locale ale indicelui de

refractie

Rezulta fluctuatii ale intensitatii luminii imprastiate

Semi-largimea emisiei la semi-inaltime (HWHM) este

proportionala cu coeficientul de difuzie al
particulelor D:

= Dk2

unghiul de imprastiere

unde

lungimea de unda a LASER-ului

IV

SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

IV

SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

In curent continuu

Sistem analizat

E=IxR

In curent alternativ

E0 + E sin(t)

Sistem analizat

I0 + I sin(t +)

I, E

E=IxZ

deplasare de faza

timp

Prezentarea rezultatelor masuratorilor de

impedanta
Z (ii) = E (ii) / I (ii)
numar complex

Prezentare in coordonate Carteziene:

Prezentare in coordonate Polare :

Z (ii) = = Z eji

Z (ii) = Rei + iImi

indicele

= 1, 2 ,.n frecventele din

Z = (Rei2 + iImi2)1/2 - modul ;

interval

-Im

f i = arc tan Imi/Rei - faza.

Se realizeaza o scanare descrescatoare

Grafic
in plan
complex
(Nyquist)
de
la frecvente
mari
la frecvente
mici
Set de date 3D

R
e
1 R
2R

b)
D3 [ i, Z i, f i ]

lg |Z|

D3 [ Rei, Imi, i]

Grafice Bode

lg

Avantaje si dezavantaje ale EIS

Pe de o parte functia impedanta contine toate informatiile pentru un sistem investigat

(daca ipotezele de lucru sunt alese corespunzator).
Pe de alta parte aceasta informatie trebuie extrasa din datele experimentale,
(identificarea procedurii de analiza a datelor)

Utilizarea spectroscopiei de impedanta (i)

caracterizarea materialelor si proceselor tehnologice
structura cristalina
- evaluare rapida pentru un material cu o structura
policristalina a contributiei individuale la conductia electrica
sau la polarizare
(efectele regiunilor de contact intergranulare sau a
volumului)
caracterizarea
electrozilor
-potentialul de flat-band, densitatea de sarcina (masuratori Mott-

caracterizarea densitatii de impachetare si

distributia de defecte in straturile autoasamblate
transferul electronilor prin stratul autoasamblat de alkanethiol si implicit prin
straturile corespunzatoare de
recunoastere moleculara

Schottky);
- proprietatile catalitice ale nanoparticulelor metalice
transferul electric in materiale nanocompozite
- contributia starilor electronice de suprafatala transportul
electronilor

caracterizarea dinamica pentru extragerea parametrilor celulelor solare

- concentratia de dopare a junctiunii,
- timpul de viata efectiv;
- efectul straturilor tampon asupra timpului de viata a purtatorilor
minoritari;

Utilizarea spectroscopiei de impedanta electrochimica (ii)

caracterizarea sistemelor electrochimice / fenomenelor fizico-chimice care apar la interfetele electrochi

- transportul de masa, transferul de sarcina prin interfata sau efectele

1.

adsorbtiei;
- parametrii de reactie (relatia intre geometria electrozilor si cinetica la
electrod, monitorizarea incarcarii surprafetei electrozilor datorita speciilor
intermediare adsorbite;
- efectele
straturilor
de interfata in cazul structurilor poroase.
mecanismele
ne-faradaice

2.

(pierderile ohmice, conductivitatea ionica in membranele cu schimb protonic);

- investigarea integritatii oxidului / straturilor de acoperire;
- ratele de corodare (proprietatile straturilor organice de acoperire in contact cu solutiile
corozive

caracterizarea sistemelor bio-electrochimice

- instrument de detectie in care marcarea nu este necesara (label-free) a
modificarii proprietatilor de interfata prin legarea unor biomolecule incarcate
pe suprafata
- analiza hibridizarii AND-ului pe electrozi

dezvoltare
a de
senzori

Electrical / Impedance detection

Binding of DNA inside the PSi matrix induces a change in capacitance and conductance.
Mott-Schottky plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The capacitance of the Electrolyte/PS/Si

has been measured as function of DC
potential and the data recorded for different
concentration of DNA in electrolyte solution
are presented. The figure illustrate that the
test structure capacitance plots suffer
modifications by adding different
concentrations of DNA in electrolyte
solution: the flat band potential is shifted
to lower values as DNA immobilization
starts from 0.31V to 0.24V and 0.21V
respectively.

Experimental data
Phosphate buffered saline- PBS) is a buffer solution commonly used in biological research. It is a salty solution
containing sodium chloride, sodium phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate.
The buffer helps to maintain a constant pH.
DNA 1 1 M /50 ml PBS solution
DNA 2 2 M/50ml PBS solution

Bode (a, b) and Nyquist (c) plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The Bode phase angle plots (a) reveal that phase angle attained a maximum at the value of -30 at higher
frequency region, which tends to -20 as the concentration of DNA is increased; opposing, in lower
frequencies domain, the maximum is initially around -70 and its value increases to -80 going
concomitantly with a gradual shift to lower frequencies, proving that the interface phenomena became
dominant. The corresponding impedance module plots fig. (b) show a similar behavior, with a more
evident decrease of values in low frequencies domain. The Nyquist graphs presented in fig. (c) indicate that
the data are not well separated above 200 Hz and clear distinct below, with a dominant interface
capacitance.