Cultivos

celulares

INDICE
INTRODUCCION......................................................................................................................... 3
CLASES DE CULTIVOS CELULARES.......................................................................................3
CULTIVOS PRIMARIOS.......................................................................................................... 4
LINEAS CELULARES.............................................................................................................. 4
CULTIVOS TRIDIMENSIONALES...........................................................................................4
CULTIVOS EN MONOCAPA.................................................................................................... 4
CULTIVOS EN SUSPENSION................................................................................................. 5
SUPLEMENTACION DE LOS MEDIOS CON SUERO............................................................5
CARACTERSTICAS DE LOS CULTIVOS CELULARES...........................................................6
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES.................................................................................................. 6
TIPO DE CRECIMIENTO CELULAR.................................................................................................. 6
REQUERIMIENTOS DEL CRECIMIENTO CELULAR.................................................................7
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES.............................................................................................. 7
REQUERIMIENTOS FISIOLGICOS.................................................................................................7
TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO...................................................................................................... 7
TCNICAS GENERALES DE CULTIVO CELULAR...................................................................7
EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES...................................7
MODELO DE LABORATORIO PARA CULTIVO CELULAR......................................................................7
EQUIPAMIENTO........................................................................................................................... 7
NORMAS DE BIOSEGURIDAD................................................................................................... 7
BIBLIOGRAFA........................................................................................................................... 7

INTRODUCCION
Los cultivos celulares constituyen una herramienta bsica de aplicacin fundamental en el
diagnstico viral, en el campo Mdico o en el Veterinario, en la investigacin y en la industria
farmacutica.
El desarrollo de los cultivos celulares ha sido el punto de partida para el desarrollo de la
virologa, permitiendo la replicacin y el conocimiento de este tipo de agentes y logrando el
desarrollo de medidas preventivas, a travs de la produccin de vacunas y tambin de
diferentes protenas, lo cual ha facilitado la obtencin de compuestos teraputicos. Lo anterior
ha implicado un desarrollo biotecnolgico al nivel industrial y el inters y la capacitacin de
profesionales del campo pecuario, para liderar esta importante rea del conocimiento.
El aporte que los cultivos celulares han dado a todos los campos de la biologa, es semejante a
la injerencia de los anestsicos en las prcticas quirrgicas. La investigacin en biologa
celular, biologa molecular y virologa as como los estudios en cncer, han dependido de
tcnicas de cultivo de clulas.
Con el cultivo de clulas in vitro se ha logrado el desarrollo de un determinado tipo de clula,
con una alta reproducibilidad. Igualmente el cultivo de grupos de clulas o de estructuras
celulares, ha sido importante en el establecimiento de relaciones estructurales y funcionales en
algunos organismos.
Con el advenimiento de los cultivos de clulas se logr la reproducibilidad de los agentes
virales, permitiendo de esta forma su estudio estructural y bioqumico, bsico en la elaboracin
de biolgicos que han servido para prevenir la presentacin de enfermedades, as como en el
desarrollo de tcnicas diagnsticas utilizadas en la deteccin de un agente en particular.
Los cultivos celulares han servido para la produccin de una amplia variedad de protenas
como los compuestos qumicos de la sangre, hormonas, anticuerpos monoclonales, y de
sustancias de gran significancia a nivel teraputico, como el interfern producido a partir de
cultivos continuos transformados (lneas celulares), permitiendo el surgimiento de una industria
biotecnolgica altamente competitiva. Establecer un cultivo de clulas conlleva un grado de
complejidad determinado por su adaptacin a condiciones similares a las que se tienen in vivo,
siendo fundamental para los medios utilizados su suplementacin con suero, aminocidos y
antibiticos.
Se puede afirmar que el desarrollo de los cultivos de tejidos ha sido de gran impacto en el
desarrollo de las ciencias biolgicas. Con stos se ha logrado determinar y clasificar tanto
tumores humanos como animales, as como la deteccin temprana de desrdenes genticos a
nivel embrionario.
Igualmente han sido bsicos en el diagnstico viral y en la produccin a gran escala de
antgenos para la elaboracin de vacunas. Mediante los cultivos celulares se pueden valorar los
efectos txicos de diferentes pesticidas usados en la actividad agrcola y pecuaria.
Existen investigaciones que no se podran realizar sin el soporte de los cultivos celulares, como
en el caso de animales transgnicos, donde se pretende que organismos desarrollados
expresen genes nuevos, mediante la insercin de genes extraos en clulas receptoras.
Producir clulas implica un alto grado de preparacin por parte del recurso humano
especializado, para dar el adecuado manejo a los conceptos bsicos de esterilidad, as como
destreza en la deteccin de problemas (requerimientos de un cultivo en particular, estabilidad
de algunos reactivos) y la identificacin de algunos virus a travs del tipo de efecto citoptico
que pueden generar en un determinado cultivo celular.

CLASES DE CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares son el producto de la coleccin de clulas animales de diferentes
rganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicacin,
manteniendo para esto todas sus funciones metablicas de una manera semejante a las que
tena en el husped.
Los cultivos de clulas animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje
(adherencia), y as han sido aisladas recientemente de un rgano determinado o si provienen
de clulas que han sufrido modificacin.

De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer

formando monocapa o en suspensin respectivamente, lo que est muy asociado con el tipo de
clula de la cual derivan: por lo general las clulas provenientes de rganos, crecen en
monocapa; igualmente existen clulas que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa
como en suspensin, ejemplo son las clulas HeLa que son clulas transformadas derivadas
de cultivos en monocapa.
Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido original tomado de
un rgano de un animal recin sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario; cuando ste
cultivo primario es sometido a procesos de transformacin que le confiere capacidad ilimitada
de multiplicacion, reciben el nombre de Lneas Celulares.

CULTIVOS PRIMARIOS
Los cultivos primarios tienen caractersticas especiales que los diferencian de las lneas
celulares: conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, sus
cromosomas tienen un nmero diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin
por contacto.
El estar ms cercanas a las clulas que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y
funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas
virales stas tienen mayor sensibilidad que una Lnea Celular ya establecida. Igualmente para
la produccin de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja
probabilidad de que se transformen en malignos.
Dentro de las desventajas est la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o
latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnologa para el control de calidad.

LINEAS CELULARES
Las Lneas Celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y
morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se
derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario mediante
transfeccin con oncogenes o con tratamiento con carcinogenticos, lo que les confiere un
nuevo fenotipo.
Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de ser aneuploides, de no tener inhibicin por
contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a lnea se denomina
transformacin.
Una transformacin puede inducirse fisiolgicamente (interaccin celular, polaridad) a travs de
hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiolgicos como el DMS.

CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido in vivo. Los
sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin y morfologa epitelial y su
interaccin con otras clulas como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede
evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.

CULTIVOS EN MONOCAPA
Las clulas exhiben una variedad de "comportamientos sociales", lo que hace que su
multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s, permitiendo la formacin de
una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento. Las clulas
provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta condicin, dada su
estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal.
Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri, frascos para el
cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de material de plstico o de vidrio
previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan
con agentes proteolticos como la tripsina.
Cuando se requiere la produccin de ste tipo de cultivo en una escala mayor, se debe
incrementar el rea de la superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas en rotacin
(roller). Mediante ste sistema, las clulas pueden crecer en toda la parte interna de la pared

de la botella, usando un aparato que permite la rotacin del roller a una baja velocidad; de esta
forma un roller de 1 litro que requiere 100 ml de medio, confiere una superficie de crecimiento
de 500 cm2.
Otra forma de aumentar el nmero de clulas adherentes por volumen de frasco, es utilizando
microperlas (microportadores), que son compuestos en base a dextranos o a vidrio, las que
flotan cuando se emplean en cultivos con agitacin, lo que le da una mayor disponibilidad de
superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio de cultivo, se logra una superficie
de 0.24 m2. La relacin superficie-volumen para los rollers es de 0.2-0.7, mientras que para los
microportadores es de 122-153.
Existen otras consideraciones que influyen en la utilizacin de sistemas en monocapa a pesar
de las ventajas que tienen los cultivos en suspensin, entre las que estn la flexibilidad para
desarrollar cultivos primarios o de lneas heteroplodes, la facilidad para la remocin del medio
gastado antes de infectar las clulas y la alta concentracin que se obtiene del producto.

CULTIVOS EN SUSPENSION
Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a
superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus de
un perodo de adaptacin.
Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensin tambin requieren de matrices
que son macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular; stas
macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de
cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de stas matrices est el
Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensin.
Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboracin de productos
extracelulares, el cultivo en suspensin es deseable cuando los productos son intracelulares o
cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de clula.
El proceso de cultivo continuo ofrece factores econmicos decisivos (utilizacin de mejores
equipos, reducida manipulacin) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de
operacin.

SUPLEMENTACION DE LOS MEDIOS CON SUERO

El papel de suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de lneas
y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de
suero, el crecimiento celular requiere, la suplementacin con hormonas y otros factores de
crecimiento que estn involucradas en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de
energa celular, control de sntesis de macromolculas y factores que estimulan la formacin
del producto deseado. Muchos de los factores suplementados son purificados del mismo suero,
lo cual hace que cultivos a gran escala con medio libre de suero no sean rentables.
Uno de los inconvenientes que presentan los laboratorios de investigacin y diagnstico es el
del alto porcentaje de cultivos contaminados por el virus de la DVB. Como consecuencia de la
infeccin intrauterina de los bovinos donantes del suero, las lneas celulares y los cultivos
primarios se pueden contaminar con el virus cuando son suplementados con el suero
contaminado. El porcentaje de contaminacin del suero fetal comercial oscila entre el 10y el
70%.
Las clulas afectadas, alteran su eficiencia en la replicacin, y en la produccin de metabolitos
especficos. Como una alternativa para prevenir este probloma se ha optado por la radiacin de
los lotes de suero; se han evaluado otros mtodos de inactivacin, a travs del uso de
sustancias tales como el BEI (etilenimina binaria), la cual ofrece ventajas comparativas, pero
demanda estudios adicionales para determinar el efecto en el tiempo, sobre la calidad de las
clulas como substrato biolgico en pruebas diagnsticas y especialmente en el aislamiento de
agentes virales.
Sin embargo, adems de buscar soluciones para el producto final, se han desarrollado tambin
mtodos y tcnicas para la deteccin de animales inmunotolerantes persistentemente
infectados con el virus de la DVB, usando cultivo de clulas polimorfonucleares y tcnicas de
inmunoperoxidasa indirecta.

Caractersticas de los cultivos celulares

Tipos de cultivos celulares
Tejido u rgano

Disgregacin: mecnica, enzimtica o por tamices

Cultivo primario: primer cultivo in vitro

Conserva cariotipo diploide caracterstico del organismo que le dio origen

Subcultivo: lnea celular

Primeros pasajes conserva clulas y cariotipo del organismo de origen

Lnea celular continua

Lnea celular comn establecida

1 tipo celular, diploide

=50 generaciones

1 tipo celular, aneuploide

tericamente infinitas generaciones

Tiempo generacional: tiempo que tardan las clulas de un cultivo en duplicarse.

Tipo de crecimiento celular

Monocapa: capa de clulas crecidas sobre superficie
Hay clulas que para crecer necesitan una superficie de
adhesin.
Morfologa de fibroblasto o epitelial

Cultivos en masa: obtienen clulas a gran escala.

Botellas roller, microcarriers, tanques fermentadores, reactores de fibra hueca, etc.

Clulas
Suspensin: crecen en medio lquido
Hematopoyticas, transformadas o de tumores malignos.
Morfologa redondeada.

Requerimientos del crecimiento celular

Requerimientos nutricionales
1. Medios de cultivo: composicin de nutrientes esenciales balanceados cuantitativamente.
Aminocidos: sntesis de protenas y cidos nucleicos
Hidratos de carbono: fuente de energa
Iones inorgnicos
Vitaminas, etc
2. Suero: composicin no cuantitativa de diferentes componentes con actividad promotora del
crecimiento celular.

Requerimientos fisiolgicos

Temperatura (gral. 37 C)
pH ptimo (gral. 7.2-7.4)
CO2 (gral. 5%)
Presin osmtica
Humedad cercana a saturacin

Tipos de medio de cultivo

Definidos (sin suero): compuesto por elementos cuya composicin qumica y concentracin
estn perfectamente determinados. Medio solo o con agregados de formulaciones especiales.
Ejemplos:
MEM: medio esencial mnimo, 27 factores esenciales para el crecimiento celular.
DMEM: medio esencial mnimo modificado.
HamF12: MEM + albmina, transferrina, insulina y piruvato de sodio.
No definidos (con suero o hidrolizados proteicos): tienen componentes cuya composicin
qumica y concentracin no estn determinados.
Ejemplos:
Medios de mantenimiento: clulas con metabolismo basal (MEM + 2% de suero)
Medios de crecimiento: activacin del ciclo celular (MEM + 10% de suero)

Tcnicas generales de cultivo celular

Cambios peridicos del medio (bajo pH y
agotamiento de nutrientes, por crecimiento celular
Mantenimiento de los cultivos

Volumen del medio

Subcultivos

Contar en cmara de conteo

o hemocitmetro
cmara de Newbauer
error del 10%

Viabilidad celular

Contadorelectrnico o Coulter

Objetivo: conservar clulas por largos perodos, disminuir riesgos de contaminacin y

Preservacin celular

Congelacin

probabilidad de prdida de caracteres deseados por los sucesivos pasajes.

Cultivo celular

Congelacin
Lento y gradual para evitar
formacin de cristales
intracelulares.
Agregar agentes (DMSO) que se
unen al agua: baja formacin de
cristales y por consecuencia la
concentracin de electrolitos que
aparecen son perjudiciales para
la clula.

Descongelacin
Lo ms rpido
posible

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO

DE CULTIVOS CELULARES
Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura bsica en la cual se
disponga de reas independientes para llevar a cabo la preparacin y esterilizacin de medios
y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de material y un
rea propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares.
Dentro de la infraestructura fsica bsica se debe contar con sistemas de refrigeracin y
congelacin, incubadoras, centrfugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.
Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plstico y de vidrio y con
sistemas de esterilizacin apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados.
Esterilizacin: proceso por el cual se eliminan totalmente los microorganismos de un objeto o
sustancia.
Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los siguientes:
Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de
121oC, por lo menos por 20 minutos a una presin de 1.2 atm.
Utilizados para la esterilizacin de soluciones cuyos componentes no se degradan por ste
mtodo, material plstico y de vidrio y equipos de filtracin.
Calor Seco: lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200 oC por espacio de 3 horas.
Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio particularmente.
Filtracin: a travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa
con poro de 0.22 0.1 micrometros de dimetro, mediante la aplicacin de presin positiva o
negativa.

Por ste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solucin de
antibitico-antimictico y suplementos.
Desinfeccin: proceso por el cual se detiene el desarrollo celular de los microorganismos,
elimina la mayor parte de stos pero no sus esporas.

Modelo de laboratorio para cultivo celular

Objetivo: proteger al operador y al producto.
Tener en cuenta:
Diseo
Ubicacin
Equipamiento
Entrenamiento del personal encargado
Areas de un laboratorio
1. Area estril o de cultivo: tener cmaras de flujo laminar o cerradas con UV.
Requerimiento:
Sin corrientes de aire
Filtros de aire
Desinfecciones peridicas
Luz UV en perodos de descanso
Area, equipos y materiales usados slo para cultivo celular
2. Incubacin: estufas humidificadas a 37C, gaseadas con CO2 o cuartos termostticamente
controlados.
3.

Preparacin
Los medios se filtran en cmaras de flujo laminar
pHmetros y agitador magntico
guantes, barbijo y guardapolvo

4. Almacenamiento: tanques de N2 para los cultivos celulares

5. Lavado y esterilizacin: preparacin del material lejos del rea de cultivo

Equipamiento

Cabina de flujo laminar

Centrfugas refrigeradas
Microscopio o lupa invertida
Equipos de esterilizacin
Tanques de almacenamientos de clulas
Heladera y freezer
Estufas con y sin CO2
Fuentes de agua: destilador, desionizador, etc
Baos termoestabilizados
Balanzas, pHmetro, agitador magntico, pipeta automtica, etc
Materiales: probetas, pipetas, botellas, frascos de cultivo, cmara de Newbauer, etc

Funcin de la cmara de flujo laminar

Proteger de contaminacin al operador, producto y medio ambiente.

Caractersticas principales: aire filtrado estril (HEPA) y regimen de aire laminar.
Los filtros HEPA retienen un 99% de eficiencia las partculas de hasta 0.3 micrones.
Se pueden clasificar en 3 segn su nivel de bioseguridad que ofrezcan. La eleccin del nivel de
bioseguridad depende de la peligrosidad del material de experimentacin.
Clase 1: cmara de extraccin de aire que pasa por un filtro
Protege al medio ambiente y al operador
No protege al producto
Variante: flujo laminar de circulacin horizontal
Protege al producto
No protege al medio ambiente ni al operador
Clase 2: flujo laminar de circulacin vertical, doble sistema de filtracin
Protege al medio ambiente, al operador y al producto
Clase 3: sistemas totalmente cerrados de alta seguridad, el operador solo accede al producto
mediante guantes.

Normas de bioseguridad

No comer, beber, etc

No pipetear con la boca
No al ingreso de personas no autorizadas
Lavarse las manos antes y despus del trabajo
Usar guantes slo cuando sea necesario
El material se descarta en lugar especial
Usar guantes desinfectantes
Desinfectar mesadas antes y despus de usarla

Bibliografa

www.encolombia.com/acovez24_evolucion14.htm
www.ub.es/biocel/wbc/recursos/coleccionphc.htm

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