Clase 2 Microbiologia Aplicada A La Mineria

FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
Pila de Biolixiviacin 16 m. a 3300 msnm. Foto. Mario Esparza 2012.
Lixiviacin Microbiana
Dr. Mario Esparza Mantilla

Laboratorio de Biominera. Departamento de Acuicultura. Facultad de
Recursos del Mar. Universidad de Antofagasta. Chile.
Mayo, 2013
mesparza@uantof.cl
Contenidos del curso terico- prctico
Unidad I:
MICROBIOLOGIA
BASICA Y APLICADA A
LA MINERA
Unidad III.
OPERACIONES DE
BIOHIDROMETALURGICA
Microbiologa
Bioinformtica
Gentica
Biologa Molecular
BIOMINERIA
Bioprocesos
Bio-Hidrometalurga
UNIDAD II. LIXIVIACION MICROBIANA

A. ferrooxidans
A. caldus
FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
I UNIDAD
Lixiviacin Microbiana
Desde las clulas microbianas a la obtencin industrial de metales
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA
Entrenar a los estudiantes en tcnicas de muestreo, aislamiento,

conteo e identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes.
CONTENIDOS:
1. Introduccin a la microbiologa. Los dominios de la vida. Bacterias,
arqueas y eucarias.
2. Cintica de crecimiento microbiano. Parmetros de anlisis.
3. Fisiologa Microbiana. Metabolismo auttrofo y hetertrofo,
nutrientes, demanda de oxgeno, carbono y sustratos energticos.
4. Muestreo y aislamiento de bacterias, recuento microbiano,
caracterizacin morfolgica y cultivos slidos y lquidos de bacterias y
arqueas biolixiviantes.
5. Identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes. Anlisis
de ADN y marcadores genticos asociados al metabolismo energtico
de metales y al metabolismo de carbono.
Laboratorio de Biominera
I UNIDAD
OBJETIVOS:
Clase 1
Introduccin a la Microbiologa
Cintica de crecimiento microbiano
Zammit y cols ( 2010).
Fisiologa Microbiana
Clase 2
Muestreo y aislamiento de bacterias
Recuento y caracterizacin microbiana
Identificacin molecular y genmica
I UNIDAD
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA
GEOMICROBIOLOGIA MINERA
I UNIDAD
Las clulas microbianas digieren minerales
M2+
Fe2+
Fe3+
SO42- + 2H+
S
Sulfuro Metlico
(MFeS2)
1.
2.
Comprender como crecen y funciona la

clulas microbiana.
Entender el rol de la clula en un
ambiente extremo: pH cido, poco
sustrato, metales pesados, etc.
M2+
Bacterias Biolixiviantes
1. Cmo realiza el proceso?
2. Qu elementos biolgicos tiene para
digerir el mineral?
3. Cmo evade la toxicidad del metal,
mecanismos?
MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
Fisiologa Microbiana: El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes
Zammit, C y cols (2009).
El cultivo en laboratorio
debe
homologar las condiciones del ambiente
natural
El cultivo debe asegurar que siempre haya suministro de fuentes energticas (Fe2+, S, etc), fuentes de
carbono ( CO2, HCO3-, Ca2CO3 ) y fuente de Nitrgeno ( sales de amonio), oxgeno (aireacin). Todo debe estar
a pH cido y en agitacin constante (180 RPM) para asegurar la homogenizacin de los nutrientes.
Fisiologa Microbiana: Medio lquido 9K para A. ferrooxidans
Ingredientes
Nitrgeno
10X ( g/L)
1X( g/L)
150
15
0,5
K2HPO4
2,5
0,25
MgSO4 . 7H20
25
2,5
Ca(NO3)2
0.72
0,072
H2SO4 10N
50 ml
FeSO4.7H2O
330
33
50
Na2S2O3.5H2O
50
(NH4)2SO4
KCI
Energa
pH: 1,6
pH: 3,5
9K+ Fe 2+
H2
pH: 3,5
Oxgeno
O2 (72%)
Aireacin
Carbono
CO2 (0,036%)
Aireacin
9K+ S
9K+ S
Almacenar a 4C.
Yates, J. R. & D. Holmes (1987). J. Bacteriol (169)5: 1861-1870.
Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.
Los ingredientes para la receta del medio salino 9K
Medio slido para A. ferrooxidans

El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para
poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener
mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas
muertas, clulas daadas y clulas viables.
Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.
Medio slido para A. ferrooxidans

El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para
poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener
mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas
muertas, clulas daadas y clulas viables.
Yong-Quan Li y cols (2011). J Curr Microbiol (2010) 60:1724.
Inhibidores del crecimiento en A. ferooxidans
Compuesto
Concentracin
% Inhibicin
As (III)
200 ppm
70
As(V)
500 ppm
70
Fluoruro
4.7 ppm
100
Cianuro
6.2 ppm
99
Molibdato
1 mM
85
Nitrato
5.8g/l
100
Cloruro de sodio
5g/l
50
Cloruro de sodio
10g/l
90
Luz: la luz visible y la no filtrada tienen un efecto inhibitorio sobre algunas especies del genero Acidithiobacillus,
pero el frrico ofrece alguna proteccin a los rayos visibles.
Presencia de Inhibidores: en los procesos de molienda o por accin propia del agente lixiviante se liberan algunos
iones que en ciertas concentraciones resultan txicas para las bacterias ferroxidantes afectando el desarrollo bacterial.
La literatura seala que los niveles de tolerancia de las bacterias para ciertos metales es Zn+2= 15 72 g/l; Ni+2 =12
50 g/l; Cu+2 =15g/l; Ag+ =1ppb; UO2+2 = 200 500 mg/l, entre otros.
Jo, M (2008).
MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA
Tcnicas microbiolgicas y
herramientas para aislamiento y
cultivo de bacterias
Muestreo y aislamiento de bacterias biolixiviantes

Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas
Aislamientos de A. ferrooxidans
Recuento microscpico en cmara de Petroff-Hausser

Determinacin del nmero ms probable
Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables (azul de metileno)
Recuento bacteriano basado en tcnicas moleculares (PCR y qPCR)
Discusin: viable/no viable; efecto del medio cultivo

MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.
Escobar, B y cols (2007). Hydrocooper.
Determinacin del nmero ms probable en placas de ELISA
Recuento por siembra por extensin
Escobar, B y cols (2007). Hydrocooper.
Recuento por filtracin en membrana

Recuento en placa por siembra por incorporacin o extensin (solo crecen los
microorganismos cultivables).

Migracin celular por preferencia del oxgeno

Recuento en placa mediante diluciones seriadas

Caracterizacin microbiana por tincin de Gram
Las bacterias biolixiviantes preferentemente son Gram negativas Por qu?

Caracterizacin microbiana
Tcnica de hibridacin fluorescente in situ (FISH): es una tcnica de tincion de

cromosomas en la que se provoca que los cromosomas especificos brillen bajo el
microscopio.
Microcolonias en DEFT: tcnica de epifluorescencia directa en filtro. En esta tcnica las

bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con
un agente fluorescente (como la naranja de acridina que tie especificamente los acidos
nuclecos). La deteccion de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopia de
fluorescencia o por cualquier otro metodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos,
las membranas se incuban para producir colonias que son mas facilmente detectables.
Recuento de microcolonias al microscopio: se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a

un portaobjeto y se incuba para seguir la formacion de microcolonias al microscopio.
Gotitas de agar: se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de

10 ml en una placa petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias
en las gotitas tras la incubacin.
Jo, M (2008).

Las bacterias Lixiviantes son o no sensibles a los antimicrobianos?

Preparacin de inculos
de A. ferrooxidans
ETAPAS
UFC
(bact/ml)
108
104
Tiempo(h)
Preparacin de
inculo
Propagacin de
inculo
500 ml
50 ml
(cultivo de
trabajo)
(volumen total)
104
UFC= 106 bact/ml
Proliferacin de
inculo
bact/ml
5 ml
(inculo)
106 bact/ml
Fe2+
Fe3+
Potencial Redox
Velocidad de
crecimiento ()
Anlisis Qumico y
Biolgico
Los experimentos deben

hacerse por triplicado
Todos los matraces deben

contener al inicio del
experimento 104 bact/ml
Preparacin de inculos de A. ferrooxidans
5000 ml
(volumen total)
500 ml
(volumen de
48 h
trabajo)
104 bact/ml
Lavar 2 Veces
en 9K
108 bact/ml
10 000 rpm x10 min 4C
Resuspender Pellet Celular

1,0ml de Glicerol (50%)+ 9K
Repartir 0,5 ml en dos nuevos

tubos y aforar a 1.0ml con Glicerol
(50%) + 9K
Cosechar Pellet Celular
Alicuotar 40 tubos eppendorf de

1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10
10 bact/ml) y almacenar a -20C
hasta su uso.
Proliferacin de clulas
de A. ferrooxidans
ETAPAS
Alicuotar 40 tubos eppendorf de

1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10
10 bact/ml) y almacenar a -20C
hasta su uso.
Resuspender o llevar al
vortex por 1 min
Aforar hasta 1 ml con 9K y

traspasar a matraz con 49
ml de medio a usar (9K+Fe)
Incubar
por 48h a
30C
A 180 RPM
Produccin de cultivosETAPAS
tipo de A. ferrooxidans
Medio de cultivo 9K
Tiempo
+
A.ferrooxidans
Fe 2+
A. ferrooxidans
Aislamiento y cultivo de bacterias

Aislamiento de
ADN
secuenciacin
Caractersticas de colonia,
forma y tamao
Crecimiento en
placa
Respaldo y produccin de cultivos

tipo
Identificacin molecular y genmica
Anlisis mediante microarreglos (ADN chip) en bacterias lixiviantes
L. ferrooxidans
Moreno-Paz , M. & V. Parro(2006) .Environmental Microbiology 8 (6), 10641073
A. ferrooxidans
Li y cols. (2011). Folia Microbiol 56:439451

Perspectivas de la Microbiologa Minera
Qu hacer para que las bacterias Biolixiviantes crezcan mas rpido
a nivel industrial?
Ustedes deben responder y

Tarea N1

La realidad biolixiviante
Los Microorganismos biolixiviantes crecen muy lento. Por qu?
Muchos de estos microorganismo son de inters biotecnolgico en:
BIOMINERIA ( quimiolitoautotrofos oxidantes del hierro o azufre)
La mayoria son bacterias entre ellas destacan
Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus thiooxidans
Thiobacillus Thiooxidans
Aplicacin Biotecnolgica
Acelerar el crecimiento
Produccin de Biomasa

Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes
En la industria de alimentos, la agricultura, la salud, entre otras usan organismos
genticamente modificados (Transgnicos) para potenciar la productividad de sus
procesos y tener sistemas biolgicos con capacidades mejoradas pero en la
Industria de la Minera eso no ha ocurrido ni mucho menos se hace procesos
biolixiviantes con microorganismos transgnicos
El Desafo
Realizar manipulacin gentica y producir microorganismos transgnicos con
capacidades genticas mejoradas que permitan realizar los procesos
biolixiviantes en menores tiempos que los microorganismos nativos.
Los Obstculos
Poca investigacin, escasa reproducibilidad experimental, no hay vectores
eficientes de transferencia de material gentica, escaso crecimiento de
bacterias mineras en medio solido en presencia de antibiticos o
marcadores de seleccin y

Los Virus son excelentes vectores para hacer

manipulacin gentica bacteriana

Estrategias para producir bacterias transgnicas Biolixiviantes
Bacteria
Tcnica
Acidiphilium sp.
electropermeabilizacin
conjugacin
Acidithiobacillus
thiooxidans
conjugacin
Acidithiobacillus
ferrooxidans
electropermeabilizacin
Acidithiobacillus
ferrooxidans
conjugacin
Kusano y cols., (1992). J Bacteriol. 174: 6617-6623.

Los vectores conocidos de organismos acidfilos son:
Cardenas y Cols (2010). Appl Microbiol Biotechnol 88:605620.

Las bacteria lixiviante A. ferrooxidans presentan sistema inmune
Horvath.P, y cols (2010).Science. - Josiane E. & Garneau, Marie-ve Dupuis (2010) Nature.

Biologa sinttica en Biominera
Construccin de la bacteria ideal para la Minera (La bacteria Top1)
Alta resistencia a
los metales
pesados
Alta
recuperacin de
metales
Alta produccin de
biomasa
Microbiologa Aplicada a la Minera
Anlisis y discusin de
papers
Anlisis y discusin de papers
Paper 1

Paper 2
Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.
Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453
Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.
Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.
Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.
Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.
Preguntas

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Pila de Biolixiviacin 16 m. a 3300 msnm. Foto. Mario Esparza 2012.

Dr. Mario Esparza Mantilla

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Zammit y cols ( 2010).

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Recuento y caracterizacin microbiana

Identificacin molecular y genmica

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Las clulas microbianas digieren minerales

Zammit y cols ( 2010).

Comprender como crecen y funciona la

Dr. Mario Esparza Mantilla

Zammit, C y cols (2009).

Dr. Mario Esparza Mantilla

Yates, J. R. & D. Holmes (1987). J. Bacteriol (169)5: 1861-1870.

Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.

Dr. Mario Esparza Mantilla

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Zammit, C y cols (2009).

Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas

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Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas

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Recuento por siembra por extensin

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Escobar, B y cols (2007). Hydrocooper.

Recuento por filtracin en membrana

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