Microscopa y Preparacin de

Muestras
Microscopa es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del
ojo normal.
Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del
mismo se requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto
de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas son,
tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas de salida,
procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc.
Exceptuando tcnicas especiales como las utilizadas en microscopio de fuerza
atmica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto tnel, la
microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de algn
tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio. El objetivo de la preparacin
de muestras para microscopa ptica es permitir que las estructuras de los
materiales se revelen con suficiente contraste de modo que las caractersticas
de inters sean descritas, grabadas y caracterizadas en detalles visibles a una
escala menor que la agudeza visual del ojo humano.La escala ltima de
observacin estar limitada por a resolucin del sistema de imagen del
microscopio.
1. Lentes y desviacin de la luz
El trmino lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plstico u otro
material transparente, generalmente de dimetro circular, que posee dos
superficies pulidas y diseadas de una manera especfica para producir la
convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. La
accin de una lente depende de los principios de refraccin y reflexin, los
cuales pueden entenderse mediante unas sencillas reglas de geometra que
rigen el paso y trayecto de la luz a travs de la lente. Estos conceptos son
materia de estudio de la ptica Geomtrica y permiten comprender el proceso
de magnificacin, las propiedades de las imgenes real y virtual, as como
tambin los defectos (aberraciones) de las lentes.
La palabra lente proviene del latn "lentis" que significa "lenteja" por lo que a
las lentes pticas se les llama as por su semejanza con la forma de la
legumbre.
Las lentes son instrumentos pticos que concentran o dispersan los rayos de
luz. Sus dos superficies pueden ser curvas (biconvexas, bicncavas o cncavoconvexas) o una de ellas puede ser plana (plano-convexas, plano-cncavas).
Las lentes de superficies convexas se denominan positivas, convergentes,
recolectoras o de aumento. Las lentes de superficies cncavas son conocidas
como negativas, divergentes, de dispersin y producen una imagen reducida.

Diversos tipos de lentes

La luz se propaga con una trayectoria rectilnea y con una velocidad constante
en cada medio. Cuando incide en un objeto, el rayo luminoso se comporta de
diversas maneras, producindose: Refraccin, Reflexin, Difraccin, AbsorcinTransmisin, Interferencia y Polarizacin. Describiremos someramente la
refraccin.
1.1 Refraccin de la luz:
Las propiedades de las lentes se deben gracias a los fenmenos de refraccin
que experimentan los rayos luminosos que las atraviesan. Cuando una
radiacin electromagntica en la forma de rayo luminoso, denominado
incidente, viaja de un medio o una superficie y atraviesa otro medio, las ondas
luminosas sufren el fenmeno conocido como refraccin, el cual se manifiesta
mediante una desviacin en la direccin de la luz. Si el rayo incidente llega de
manera perpendicular a la superficie de una lmina de vidrio, de superficies
paralelas, no es desviado de su trayecto rectilneo, pasando del aire al vidrio y
de este ltimo al aire nuevamente. Por el contrario, si el rayo incide de manera
oblicua sobre la superficie de la lmina de vidrio, es desviado de su direccin
rectilnea, en principio al entrar al vidrio, pues pasa de un medio menos denso
(aire) a otro medio de mayor densidad (vidrio) y es desviado nuevamente al
salir del vidrio hacia el aire.
Cuando la luz pasa de un medio a otro, la velocidad de la onda disminuye. La
nueva direccin que toma el rayo refractado depende de la densidad del medio
que atraviesa. Los efectos de la refraccin son responsables de algunos
fenmenos que nos son familiares, por ejemplo, la aparente deformidad de un
objeto parcialmente sumergido en un vaso de agua. La refraccin de la luz
visible en las lentes es de vital importancia, pues les permite concentrar un haz
de rayos luminosos en un punto especfico.
Si dividimos la velocidad de la luz en el vaco entre la que tiene en un medio
transparente, obtenemos un valor que llamamos ndice de refraccin de ese
medio y es el cociente entre velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la
luz en el medio que se estudia:
n: ndice de refraccin
c: velocidad de la luz en el vaco
v: velocidad de la luz en el medio material transparente

1.2 ndice de refraccin

El ndice de refraccin de un medio es una medida para saber cunto se reduce
la velocidad de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el ndice de
refraccin del agua es n= 1,33, quiere decir que la luz es 1,33 veces ms
rpida en el vaco que en el agua y es un valor que tiene que ver con las
propiedades de las lentes.

Ejemplos del ndice de

refraccin
en
algunos
medios transparentes. (*)
En condiciones normales
de presin y temperatura,

1.3Punto Focal
El punto focal es el punto en donde confluyen los rayos luminosos refractados,
despus de atravesar la lente. Se puede apreciar, por ejemplo, cuando al
recibir los rayos solares sobre una lupa planoconvexa o biconvexa, se forma un
punto muy luminoso y muy caliente. Los rayos calorferos siguen el mismo
trayecto que los luminosos.
1.4

Distancia Focal

La distancia focal de una lente es la distancia entre el centro ptico de la lente

y el foco (o punto focal). El foco es el punto donde se concentran los rayos de
luz. Es la relacin existente entre la longitud del tubo del microscopio
empleado y la amplificacin usada en un momento dado.
2 Unidades de longitud para describir microorganismos
A nosotros nos interesan los submltiplos del metro porque los elementos
conque trabajan las ciencias biolgicas experimentales tienen dimensiones por
debajo del metro. Para darnos una idea veamos en forma comparativa el
tamao de las clulas, las bacterias, los virus y las molculas. De todos los
submltiplos del metro los ms usados son: el milmetro (10-3 metros), el
micrmetro (10-6 metros), el nanmetro (10-9 metros) y el rmstrong (1010 metros).
El nanmetro (nm) es mil millones de veces inferior al metro. Una unidad an
ms pequea es el ngstrom (), que es diez mil millones de veces menor que
el metro; esta ltima unidad no forma parte oficialmente del sistema mtrico
decimal, aunque tambin se emplea.
Las clulas de las bacterias, los hongos, las algas y los protozoos se miden en
micrmetros. Los virus y las estructuras subcelulares, tales como los ribosomas
y las membranas, en nanmetros. Y los tomos y molculas se miden en
angstroms.

3 Microscopio ptico
Se usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cual
permite observar los detalles estructurales de los microorganismos. El
microscopio ptico normal que se usa para observar bacterias y otros
organismos celulares es un microscopio compuesto, el cual est provisto de una
fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto a
observar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificacin de la imagen.
A travs de la refraccin o reflexin de los rayos luminosos mediante el sistema
de lentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es ms grande
que el objeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.
3.1 Microscopio Simple
Los primeros microscopios, construidos por Leeuwenhoek alrededor de 1675,
eran simples, es decir, contenan slo una lente o lupa. Estas eran lentes
convexas (ms gruesas en el centro que en la periferia). La muestra u objeto
podran entonces ser enfocados por el uso de la lupa colocada entre el objeto y
el ojo. Estos "microscopios simples" podran difundir la imagen en la retina por
ampliacin mediante el aumento del ngulo visual en la retina.
El objeto a observar se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que
determina la formacin de una imagen virtual, derecha y
mayor cuanto mayor sea el poder diptrico de la lente y
cuanto ms alejado est el punto prximo de la visin
ntida del sujeto.
El aumento obtenido con estos microscopios es reducido,
debido a que la longitud de onda de la luz visible le
impone limitaciones.
El microscopio que se observa en la imagen fue construido
hacia 1668 y mide 10 cm de longitud; esos microscopios
simples de una sola lente producan una ampliacin de
hasta 275 veces (275x) y tenan un poder de resolucin de
1,4 m.; no padecan las aberraciones que limitaban la eficacia de los primeros
microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke. Con ellos
Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez protistas
microscpicos de vida libre y parastica, clulas espermticas, clulas
sanguneas, nematodos microscpicos, rotferos y hasta bacterias.
3.2 Microscopio compuesto
Tiene varias lentes combinadas, capaces de producir gran aumento. Existen
varios aditamentos que utilizados en el microscopio ptico ordinario, aumentan
mucho su rendimiento como instrumento de observacin, p. ej. Microscopio en
Campo Oscuro (Ultramicroscopio), Microscopio de Contraste de Fases,
Microscopio de Fluorescencia, Microscopio de Luz Ultravioleta, Microscopio de

Interferencia,
Nomarski.

Microscopio

de

Contraste

de

Interferencia

Diferencial

de

Existe adems el Microscopio electrnico, que debido a sus posibilidades para

obtener imgenes claras de los objetos ms diminutos, ha hecho
contribuciones de la mayor importancia, sobre todo en el estudio de la
constitucin y ciclos vitales de los virus filtrables.

De campo luminoso

El material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se

aprecian detalles que estn naturalmente coloreados. Para formar una
imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra
debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan
atravesarla. Tambin se usan mtodos de tincin, segn las necesidades,
con el fin de aumentar los detalles en la imagen.El campo del microscopio
est intensamente iluminado, mientras que los objetos observados
aparecen ms oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar
los 1000 aumentos, pudindose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y
3000 aumentos.El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50
micras de dimetro ni consigue resolver dos lneas separadas por menos de
100 micras (es decir, las ve como una sola lnea)
De campo oscuro
El microscopio de campo oscuro es un microscopio que utiliza un haz
enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre
el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible
contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por
ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras
que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y
dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el
espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se
utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar,
invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras
metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta
reflectancia.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del
espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado
con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte
indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra
como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas
brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz
emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz
reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las
hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms
pequeas que el poder separador del sistema ptico usado por
transparencia.

Los condensadores que se emplean en microscopa de campo oscuro son

de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del
tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es
indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en
el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con
una apertura numrica mayor al del objetivo.
De campo de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia... es una variacin del microscopio de luz
ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una
determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la
radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la
excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para
dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros
apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para
detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias
marcadas con fluorocromos.
El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un electrn de un tomo
absorbe toda la energa de una determinada longitud de onda de la luz,
saltando a otros orbitales. Es una situacin inestable durante la cual se
emite la mayor parte de la energa que se ha absorbido (con mayor longitud
de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.
Aprovechando este fenmeno, se han creado los flurocromos. Para
utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible.
Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitacin que seleccione
la longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los ms comunes son el
DAPI que tie el ncleo de las clulas y el GFP.
4 Partes del Microscopio
Un microscopio compuesto tiene ms de una lente objetiva. Los microscopios
compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o
cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar
o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El
microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para
sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.
El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos,
dispuestos de tal manera que producen las ranuras de luz.
El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un
aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros
llamados "de antigel subsecuente".

4.1 El sistema mecnico

Parte mecnica del microscopio

Esquema de un microscopio ptico.

La parte mecnica del microscopio
comprende el pie, el tubo, el revlver,
el asa, la platina, el carro y el tornillo
micromtrico.
Estos
elementos
sostienen la parte ptica y de
iluminacin; adems, permiten los
desplazamientos necesarios para el
enfoque del objeto.

El pie y soporte: contiene la base

sobre
la
que
se
apoya
el
microscopio y tiene por lo general
forma de Y o bien es rectangular.
La columna o brazo: llamada tambin asa, es una pieza en forma de C,
unida a la base por su parte inferior mediante unabisagra, permitiendo la
inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan
los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo
inferior se adapta al pie.
El can tiene forma cilndrica. El can se encuentra en la parte
superior de la columna, enfoca el objeto mediante un sistema de
cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los
tornillos.
El tornillo macromtrico o macroscpico: girando este tornillo,
asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizndose en sentido
vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos
largos permiten el enfoque rpido de la preparacin.
El tornillo micromtrico o microscpico: mediante el ajuste fino con
movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la
platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva
acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm, que se utiliza
para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.
La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca el objeto
que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que
permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina
puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede
ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o
producir movimientos circulares.
Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar el objeto.
Se encuentran en la platina.
El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se
enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje
del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido
de un pin que lo fija.

4.2 Sistema ptico

Es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto

de lentes que lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El
objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego ampla.

El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre

se debe a la cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como
funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son
intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X.
Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que
poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de
medir el tamao del objeto observado.
Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver
y producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y,
por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los
objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y
objetivos de inmersin.
Los objetivos secos: se utilizan sin necesidad de colocar sustancia
alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie
de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y
otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan
40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su
aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de
tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio
y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms
frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.
El objetivo de inmersin: Est compuesto por un complicado sistema
de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar
una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de
manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro.
Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos
crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

4.3 Sistema de iluminacin

Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera
que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de
la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:

Fuente de iluminacin: Se trata clsicamente de una lmpara

incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas
con leds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente
convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite
controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada,
para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces
parsitas.
El espejo: Necesario si la fuente de iluminacin no est construida
dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele

ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una

cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La
cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la
plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen
espejos sino una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo.
Condensador: Est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es
concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin,
formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del
objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior
es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en
contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura
(los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que
piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la
preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al
menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar
todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente
sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su
uso con objetivos de poca potencia.
Diafragma: El condensador est provisto de un diafragma-iris, que
regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de
manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo
ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema
ptico.

BIBLIOGRAFA
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http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo2_
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- MICROSCOPIO SIMPLE
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_simple
- MICROSCOPIO
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio
- EL MICROSCOPIO
http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p01.pdf
-MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fluorescencia
- MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_campo_oscuro
- MICROSCOPIO COMPUESTO
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto
- CURSO DE INTRODUCCIN AL CONOCIMIENTO CIENTFICO EXPERIMENTAL
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo5.htm
-BARRERA, H Y CRDENAS, R. 1997. EL MICROSCOPIO PTICO. EDITORIAL PLAZA
Y VALDES, MXICO. PG 29-30, 34-36, 63-68.
-INSTITUTO TCNICO PROFESIONAL MARTIMO DE VALPARASO. [EN
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DE LOS MICROORGANISMOS: EL MICROSCOPIO: PREPARACIN Y EXAMEN DE
MUESTRAS.
DR. PEDRO F. MATEOS DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA Y GENTICA.
FACULTAD
DE FARMACIA. UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

<http://www.institutomaritimo.cl/espec/elab/microbio/micro2.html> [Consulta:
31 Jul. 02]
-MONOGRAFIAS.COM. MICROSCOPIA. [EN LINEA]. MONOGRAFIAS.COM
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-ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD 1983. MANUAL DE TCNICAS BSICAS
PARA UN LABORATORIO DE SALUD. EDITORIAL OMS. C. DE MXICO, MXICO.
PG. 13-23.