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Chromatographie Et IR
Chromatographie Et IR
La spectromtrie.
La spectromtrie.
Rayonnement lectromagntique
Le rayonnement lectromagntique, dont la lumire est un exemple, est une forme
dnergie constitue dondes, c'est--dire de phnomnes vibratoires caractriss par :
une vitesse de propagation (en loccurrence c = 3.108 m.s-1, constante pour toutes les
ondes lectromagntiques dans le vide), une frquence (nombre de vibrations par
seconde) et une longueur donde (distance parcourue pendant une vibration). Ces 3
longueurs sont lies par la relation = c / . Bien quil y ait une continuit totale dans les
valeurs possibles de longueur donde (ou de frquence), on distingue (arbitrairement) sur
cette base des domaines particuliers du rayonnement lectromagntique, comme
indiqu sur la figure 1.1. Il est bon de rappeler galement que lnergie dun rayonnement
lectromagntique est relie sa frquence par la relation E = h.
Figure
1.1.
Domaines
particuliers
du
rayonnement
-1-
La spectromtrie.
A chacun des domaines particuliers du rayonnement lectromagntique, ou presque,
correspond un type de spectroscopie qui repose sur une interaction particulire de la matire
avec ce rayonnement. Ainsi pour le domaine :
-
des
molculaires.
orbitales
atomiques
priphriques
et/ou
des
orbitales
Les spectres continus, pour lesquels il existe un signal pour chaque longueur
donde (ou frquence). Ex. Gauche de la figure 1.2.
-2-
La spectromtrie.
spcifiques, caractristique de la matire irradiante ou irradie. Ex. Milieu de la figure
1.2.
-
Les spectres combins qui sont constitus dune superposition dun spectre continu
et dun spectre discret. Ex. Droite de la figure 1.2.
Figure 1.2. : Diffrents types de spectre : Gauche : Spectre continue. Milieu : Spectre discret, discontinue ou de raies. Droite :
Spectre combin.
mission et absorption
Il peut se produire des changes nergtiques entre la matire et un
rayonnement dans deux sens :
-
-3-
La spectromtrie.
alliages. Cest aussi en analysant la lumire reue des toiles que lon peut savoir quels
lments chimiques y sont prsents. Les frquences caractristiques de chaque lment
sont strictement invariables et on les utilise parfois comme talon pour la dfinition de
certaines units. Le mtre, par exemple, est dfini comme la longueur gale 1 650 763, 73
longueurs donde dans le vide dune raie mise par le nuclide
86
comme la dure de 9 192 631 770 vibrations pour lune des raies mises par le nuclide
133
Cs.
Aspect thorique
La thorie des quanta
La thorie des quanta a t formule pour expliquer divers phnomnes, notamment
leffet photolectrique (arrachement dlectrons un mtal sous laction dun rayonnement
de longueur donde suffisamment courte). Elle repose sur lide que lnergie ne peut pas
tre change entre la matire et le rayonnement de manire continue, par quantits
aussi petites que lon veut, la limite infiniment petites. Ces changes, quil sagisse
dabsorption ou dmission du rayonnement, ne peuvent avoir lieu que par multiples
entiers dune quantit minimale dnergie, gale un quantum. Il ne peut pas exister
dchanges dnergie entre matire et rayonnement par quantit infrieure un quantum.
Cela revient dire que lnergie, comme la matire, est discontinue. En plus de
son aspect ondulatoire, qui explique certains phnomnes, on doit aussi lui attribuer un
caractre corpusculaire, qui en explique dautres. Un rayonnement peut tre dcrit soit
comme une onde, soit comme un flux de particules, les photons, qui reprsentent
chacun un quantum dnergie.
h .
h..
Et inversement, si
un atome met un rayonnement de frquence , il perd une quantit dnergie gale h..
-4-
La spectromtrie.
est quantifie, c'est--dire quelle ne peut prendre que certaines valeurs
dtermines, appeles galement niveaux dnergie.
-
chacune des valeurs possibles pour lnergie dun lectron correspond une
trajectoire circulaire stable, sur laquelle llectron ne rayonne pas et ne perd donc
pas dnergie, et une distance noyau-lectron.
Les changements dnergie dun lectron ne peuvent seffectuer que par sauts
discontinus dun niveau un autre. On appelle ces sauts des transitions. Si la
variation dnergie associe une transition est E, la frquence du rayonnement
absorb ou mis est dfinie par la relation E = h..
Puisque les lectrons sont normalement au niveau dnergie le plus bas possible, ils
ne peuvent pas perdre dnergie. Lmission dun rayonnement ne peut donc avoir
lieu que si une excitation (apport dnergie) les porte dabord un niveau suprieur,
do ils pourront ensuite redescendre sur un niveau infrieur, en mettant un photon.
h.,
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La spectromtrie.
contient toujours, si petit soit-il, un nombre norme datomes (54 milliards de milliards
dans 1 ml, 0C et sous 1 atm) et tout moment, au sein de cet chantillon, toutes les
transitions peuvent avoir lieu.
h .
h.c
nergtiques sont caractristiques pour chaque atome, il est donc possible en les
identifiant, de dterminer la nature de latome qui les met : on dispose donc dune mthode
didentification des atomes.
On peut distinguer deux types de spectromtrie dmission atomique en fonction
de la nature de la source dexcitation et donc de la plage dnergie mise en uvre :
-
Si
lexcitation
pour
origine
un
bombardement
lectronique
ou
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La spectromtrie.
Dans le cas de la spectroscopie dmission atomique, la source de rayonnement
est constitue de lchantillon, lui-mme, sous forme datomes excits. Le but de
lexcitation est triple :
-
Exciter les atomes libres et les ions forms pour les faire mettre un spectre
lectronique caractristique.
Figure 1.4. : Schma gnral dun spectromtre dmission atomique : Une source-chantillon (ici, une
flamme), un monochromateur (ici, un prisme), un dtecteur (ici, un CCD) et un systme de traitement du
signal (ici, un ordinateur).
Un spectre continu provenant des lectrodes chaudes dans le cas dun arc ou
dune tincelle ou de la recombinaison ions-lectrons dans le cas dun
plasma.
La
spectroscopie
dmission
atomique
requiert
ensuite
la
dispersion
du
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La spectromtrie.
photographique, quasi abandonnes cause de laspect subjectif de lune et de
lincompatibilit pour lanalyse quantitative de routine de lautre, il existe diffrents types de
dtecteurs qui font appel la conversion de lnergie radiante en nergie lectrique,
ce sont les dtecteurs lectriques. Nous verrons plus en dtail le fonctionnement de
quelques uns de ces dtecteurs.
Finalement, le signal dtect doit tre trait graphiquement la main (ce qui
devient de plus en plus rare) ou via un ordinateur.
Sources dexcitation
La flamme : Il sagit dun moyen dexcitation purement thermique. La solution contenant la
substance analyser est injecte directement dans la partie centrale de la flamme sous
forme darosol. La figure 1.5 reprsente une coupe longitudinale schmatique dun brleur
de Beckman, dans lequel le comburant (ici de loxygne) assure laspiration de la solution.
Dans la flamme, la gouttelette de solution se vaporise et, de manire dpendante de la
temprature de la flamme, un certain nombre datomes sont excits lectroniquement par
voie thermique.
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La spectromtrie.
utilise. Le tableau suivant reprend quelques exemples de comburants / carburants
possibles, ainsi que la temprature de la flamme associe :
Comburant
Combustible
air
dioxygne
Gaz naturel
1850 C
2800 C
Butane
1900 C
2900 C
Hydrogne
2100 C
2780 C
Actylne
2200 C
3050 C
Cyanogne
4550 C
Actylne + NO (% divers)
2600 2800 C
Larc et ltincelle : Ces sources utilisent une dcharge disruptive de haute tension
(tincelle) ou une dcharge lectrique continue (arc) entre deux lectrodes pour
vaporiser et exciter les atomes analyser. Les lectrodes peuvent tre en mtal ou en
graphite. Si lchantillon analyser est un mtal, il peut dailleurs servir lui-mme dlectrode.
Les chantillons non-conducteurs sont placs dans llectrode de graphite infrieure en
forme de coupelle. Nous ntudierons pas plus en dtail ces mthodes dexcitation,
puisquelles ont t remplaces dans de nombreuses applications par les plasmas ou les
sources lasers et ne sont pratiquement plus utilises que dans lindustrie des mtaux.
Le Plasma Haute Frquence Couplage Inductif (Inductively Coupled Plasma, ICP) : Par
dfinition, un plasma est un mlange gazeux dans lequel une fraction importante des
espces prsentes est sous forme dions. En gnral, on utilise un plasma dargon.
Quand un chantillon est introduit dans ce milieu, latomisation se produit en raison de la
temprature leve (jusque 10 000 K). Les ions dargon, une fois forms dans le plasma,
sont capables dabsorber suffisamment dnergie dune source extrieure pour que se
maintienne la temprature requise la continuation du processus dionisation. Quatre
sources de puissance ont t utilises en spectroscopie au plasma dargon :
-9-
La spectromtrie.
-
Un laser CO2 de haute puissance (on parle alors de LIPS = Laser Induced
Plasma Spectroscopy ou de LIBS = Laser Induced Breakdown Source).
Un gnrateur de micro-ondes.
Figure
1.7.
Coupe
longitudinale
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La spectromtrie.
Linjection de lchantillon se fait sous forme darosol par un flux dargon grce un
nbuliseur pneumatique ou ultrasons. La forme torodale du plasma permet aux particules
darosol de passer en son centre, les exposant une temprature trs leve pendant une
priode relativement longue (2,5 ms). Cette forme particulire du plasma nest possible que
grce la haute frquence du gnrateur ( 5 MHz, le plasma a une forme plus sphrique).
Le cur, le plus chaud, a un aspect blanc intensment brillant et ne dpasse le tube
dinduction que de quelques millimtres, mettant un rayonnement quasi continu d des
recombinaisons ions-lectrons. A ce rayonnement se superpose le spectre atomique
(raies) de largon. Entre 10 et 30 mm au dessus de lenroulement inductif, le
rayonnement continu disparat, le plasma est optiquement transparent et est en outre
quasi exempt des raies de largon. Cest souvent cette zone de temprature quasi
uniforme, qui sert lanalyse.
LICP reprsente donc une source dexcitation particulirement intressante :
-
Monochromateurs
Les monochromateurs pour lUV, le visible et lIR sont similaires sur le plan de la
construction dans le sens quils emploient les mmes lments constitutifs :
-
Une fente dentre, s, pour donner au faisceau une forme et des dimensions bien
dfinies.
Un plan focal PF
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La spectromtrie.
Tous ces lments sont centrs sur laxe optique AO.
En outre, la plupart des monochromateurs ont des fentres dentre et de sortie
destines protger les composants contre la corrosion.
Dtecteurs
Le dtecteur, dans un spectromtre, va jouer le rle qua la rtine dans lil, c'est-dire convertir les impactes photoniques en impulsions lectriques, qui seront ensuite
traites. Il est donc logique que le premier dtecteur utilis ait t lil. Mais cette mthode,
trop subjective a rapidement laiss la place la dtection par mulsions photographiques.
Comme cest le cas pour la photographie, la rapidit et la facilit, du traitement numrique,
ont progressivement pouss les scientifiques avoir recours la dtection lectrique pour
remplacer lmulsion photographique. Les diffrents dtecteurs lectriques possdent
plusieurs paramtres caractristiques quil convient de comparer pour dterminer quel type
de dtecteur convient le mieux lutilisation que lon compte faire du spectromtre (ex. :
analyse qualitative et / ou quantitative, mesures en routine et / ou pisodiques, analyse en
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La spectromtrie.
continu et / ou ponctuelles de phnomnes rapides et / ou lents, etc). Le tableau suivant
reprend ces diffrents paramtres, ainsi que leur dfinition :
Paramtre
Dfinition
Rponse spectrale
Rsolution
Sensibilit
Efficacit quantique
Lag
blouissement
Barrettes de diodes (PDA = Photo Diode Array) : Ce dtecteur est constitu dune range de
photodiodes individuelles. Les photodiodes, habituellement constitues dune couche de
semi-conducteur entre deux lectrodes, produisent un courant lectrique fonction de la
quantit de rayonnement lumineux quelles reoivent.
Capteur transfert de charge (CCD = Charged Coupled Device) : Ce type de dtecteur est
en gnral constitu dun tableau de pixels (consistant en une photodiode de silice), qui
stockent les charges produites lorsquun photon les heurte. Au bout dun temps dtermin, la
charge accumule de chaque pixel est transfre de photodiode photodiode jusqu
un registre avant dtre amplifie et numrise (AD = Analogic to digital).
Capteur pixels actifs (APS = Active Pixel Sensor ou encore CMOS = Complementary Metal
Oxide Semi-conductor) : Concurrent direct du CCD, il est lui aussi constitu dun tableau de
pixels qui comportent chacun un lment photosensible, un amplificateur et un convertisseur
analogique numrique. Cest en quelque sorte une version sur puce des barrettes de
diodes.
Comparaison de trois dtecteurs commerciaux de types diffrents :
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La spectromtrie.
Dtecteur
TAOS 102
HAM 1024
Sony 2048
Type
PDA
CMOS
CCD
# pixels, pitch*
102, 85 m
-1
-1
1024, 25 m
-1
-1
2048, 14 m
160 V.lx-1.s-1
Sensibilit
100 V.lx .s
Signal / bruit
1000 : 1
2000 : 1
250 : 1
360 1100 nm
200 1000 nm
200 1000 nm
22 V.lx .s
Dtection dlments traces dans des mtaux tels que lor, le cobalt, le nickel ou le
palladium (de lordre du g.kg-1).
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La spectromtrie.
suite de ses expriences, Kirchoff mit la loi suivante, base de labsorption atomique : tout
corps chimique peut absorber certaines radiations quil met lui-mme.
Gnralits
Nous savons quun atome excit thermiquement ou lectriquement un tat E2 met
une radiation de frquence lorsquil revient un tat infrieur E1. Cest le phnomne
dmission que nous avons dj amplement tudi et qui est rgi par lquation de Planck
h. (de mme nergie) qui fait passer latome de ltat E1 ltat E2 (dnergie
suprieure).
homogne
qui
absorbe
cette
longueur
donde,
diminuera
/ I)
et lpaisseur
dI
= k s dx . Dans cette
I
relation, k s est une constante pour une longueur donde et un milieu donns. Lintgration de
cette quation pour un trajet allant de 0 la longueur
(aprs
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La spectromtrie.
I 0
= k s .l . Cette dernire
I
I 0
k s
.l s .l . Dans cette relation, s est
absorbance , A, le rapport A log =
2,302
I
appel coefficient dabsorption la longueur donde du milieu s. Il arrive galement que
lon parle de transmission au lieu dabsorbance, pour dsigner, cette fois, le pourcentage de
lumire transmise, soit T %
I
100
100 et on a ainsi : A = log
.
T
I0
Notons que toutes ces considrations sont valables non seulement pour labsorption
atomique, mais galement pour labsorption molculaire (spectroscopie UV-Vis) que nous
allons tudier plus en dtail dans une section ultrieure. Sachant cela, nous pouvons
poursuivre notre raisonnement au cas dune solution assez dilue pour laquelle labsorbance
du solut (1) est donne par la relation :
A = 1 .C1 .l
loi de Beer-Lambert
Les units les plus courantes sont la mole par litre pour la concentration (C en mol.l-1)
le centimtre pour la longueur (l en cm) et, ds lors, le coefficient dabsorption molaire est
exprim en litre par centimtre par mole ( en l.cm-1.mol-1) puisque labsorbance na pas
dunit. Il est important de garder lesprit que des carts par rapport la loi de BeerLambert peuvent exister. Ces dviations peuvent avoir deux origines :
-
Instrumentale :
o
Si la lumire incidente nest pas suffisamment monochromatique, c'est-dire si la largeur de la bande spectrale incidente nest pas suffisamment petite
vis--vis de la largeur de la bande spectrale dabsorption, labsorbance nest
plus une fonction linaire de la concentration.
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La spectromtrie.
engendrant le mme genre de problme que la polychromaticit de la lumire
incidente.
o
Figure 1.10. : Schma gnral dun spectromtre dabsorption atomique : Une source de rayonnement
(ici, une lampe), un chantillon (ici, latomiseur est une flamme), un monochromateur (ici, un prisme), un
dtecteur (ici, une photodiode) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).
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La spectromtrie.
Figure 1.11. : Schma dun spectrophotomtre dabsorption atomique double faisceau : Un miroir
rotatif permet la fois de hacher la lumire (ce qui permet de diminuer linfluence de lmission dexcitation
de llment analys, dans la flamme) et de la faire passer alternativement dans latomiseur et dans le
faisceau de rfrence. Les deux faisceaux sont alors recombins gomtriquement par un miroir semitransparent (Mst) situ derrire latomiseur.
Sources
Les qualits essentielles dune source utilisable en spectroscopie optique sont :
une stabilit et une puissance suffisantes. La puissance lumineuse dune source varie de
manire exponentielle avec la puissance lectrique du gnrateur. La stabilit est donc
assure par la rgulation de la puissance lectrique.
Lampes cathode creuse : De tels systmes produisent des spectres de raies
caractristiques dun grand nombre dlments. La figure 1.12 en donne un schma. La
cathode est construite au moyen du mtal dont on dsire mesurer le spectre ou est
recouverte dune couche de ce mtal. Ces lampes sont donc spcifiques. On construit
cependant des lampes multi-lmentaires dans lesquelles la cathode est recouverte dun
mlange des lments analyser. Un potentiel appliqu entre les lectrodes provoque
lionisation du gaz et on obtient un courant de 5 10 mA par migration des ions aux
lectrodes. Si le potentiel est suffisant, les cations en heurtant la cathode lui arrachent des
atomes de sa surface, ce qui produit un nuage atomique (processus de pulvrisation). Une
partie de ces atomes est dans un tat excit, ils retournent vers ltat fondamental par
mission de radiations caractristiques. La conformation cylindrique de la cathode favorise la
concentration du rayonnement en une rgion limite du tube. Elle augmente aussi la
redposition, sur la cathode, des atomes de mtal plutt que sur les parois du tube.
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La spectromtrie.
Figure 1.12. : Schma dune lampe cathode creuse : La cathode creuse est fabrique au moyen du
mtal dont on dsire mesurer le spectre ou est recouverte dune couche de ce mtal ou dun mlange de
mtaux.
Atomiseurs
Le rle de latomiseur est de raliser une population datomes reprsentative de
la composition de lchantillon en solution.
Atomiseurs flamme : Nous nentrerons pas ici dans les processus qui se produisent dans le
systme nbuliseur-brleur, ni des exigences de stabilit de fonctionnement, ces deux points
ayant dj t abords lors de ltude de lmission dans la flamme. Dans le cas prsent, la
flamme doit tre suffisamment chaude pour obtenir une atomisation maximale ; elle ne peut
galement tre trop chaude car on veut viter au maximum les phnomnes dexcitation et
dionisation. Nous avons vu, cependant, que mme 3000-4000 K, la proportion datomes
excits est faible, sauf pour les lments trs bas potentiel dionisation. La population est
donc essentiellement constitue, en gnral, datomes neutres non excits. Il y a par
ailleurs moyen de pallier aux inconvnients dus lmission de flamme par hachage du
faisceau incident, mais nous nentrerons pas dans les dtails de ce procd.
Le problme de formation doxydes reprsente un autre problme technique
contourner. On le minimise soit en augmentant la temprature de la flamme, soit en utilisant
un mlange gazeux plus riche en combustible. Les flammes les plus courantes sont : Air
propane 1950 C, air actylne 2200 C et N2O actylne 2950 C.
Frquemment, on utilise des brleurs allongs dun trajet optique atteignant 10 cm,
ce qui augmente la sensibilit, et la nbulisation est produite par ultrasons, technique qui
fournit des gouttelettes de volume plus uniforme que par simple aspiration.
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La spectromtrie.
Figure
1.13.
Schma
dun
brleur
de
le
nbuliseur,
qui
assure
Atomiseurs sans flamme fours en graphite : Le systme le plus utilis est le four tubulaire
de Massmann (Figure 4.16). Le chauffage est ralis par effet Joule dans le tube graphite
lui-mme. On introduit un petit volume de solution (5 10 l) dans un tube par lorifice (a) du
tube de graphite. En gnral, on a sa disposition la slection dun programme automatique
qui assure les meilleures performances dans chaque cas particulier. Par exemple : schage
15 100 C, minralisation 60 400 C, atomisation 10 2100 C (mesure de
labsorbance), nettoyage de four 5 2600 C. La limite de dtection peut tre 1000 fois
plus basse avec le four de Massmann quavec une flamme. La cadence danalyse est
cependant plus faible quavec une flamme.
b)
Cne en graphite
c)
d)
Support
e)
Isolant
Monochromateurs
Cfr. spectromtre dmission atomique, avec une prdominance des systmes
rseau.
Dtecteurs
Cfr. spectromtre dmission atomique.
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La spectromtrie.
Spcificit spectrale
Analyse clinique : analyse de mtaux dans les fluides biologiques comme le sang et
lurine.
Mdecine lgale : Dosage de substances toxiques (ex. : arsenic) dans des tissus
(cheveux, ongles, etc.)
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La spectromtrie.
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La spectromtrie.
Molcule
Types de liaisons
1 C=C
2 C=C conjugues
(l cm-1 mol-1)
10 000
20 000
21 000
max (nm)
184
185
217
Effet hyperchromique : Alors que pour des liaisons non conjugues, la valeur du
coefficient dextinction est simplement proportionnel au nombre de liaisons doubles,
pour des liaisons conjugues, on observe une augmentation importante d.
Influence du solvant
Laugmentation de la polarit du solvant saccompagne, en gnral, dun effet
bathochromique pour les transitions * et dun effet hypsochromique (blue shift =
dplacement vers des longueurs dondes plus faibles) pour les transitions n*.
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La spectromtrie.
max (nm)
Benzne
204
7 900
Thiophnol
236
10 000
Phnol
211
Phnolate
235
Aniline
230
Ion anilinium
203
Rgles de Woodward-Fieser
Lanalyse structurale partir des spectres lectroniques est assez alatoire, dans la
mesure o leur relative simplicit a pour corollaire un faible apport dinformations. Dans les
annes 40, cependant, avant larrive des techniques plus puissantes didentification dont
nous disposons prsent, la spectromtrie UV-Vis a t utilise cette fin. Ltude des
spectres dun grand nombre de molcules a permis dtablir des corrlations entre structures
et maxima dabsorption. Les plus connues sont les rgles empiriques dues Woodward,
Fieser et Scott, qui concernent les dines et composs carbonyls insaturs. A partir de
tableaux rassemblant, sous forme dincrments, les divers facteurs et particularits de
structure prendre en compte, on peut prvoir la position de bandes dabsorption * de
ces systmes conjugus particuliers.
(Tables + exercices en classe)
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La spectromtrie.
Aspect pratique
Composition dun spectromtre dabsorption molculaire
Schma gnral
Le schma gnral dun spectromtre dabsorption molculaire (figure 1.18) reprend
globalement les mmes lments quun spectromtre dabsorption atomique, si ce nest que
la slection de la longueur donde se fait ici en amont de lchantillon.
Figure 1.18. : Schma gnral dun spectromtre
dabsorption
molculaire
Une
source
de
Sources
Pour la spectroscopie dabsorption UV-Vis, on utilise des sources fournissant un
spectre continu aussi intense que possible.
Lampes hydrogne ou deutrium : On obtient un spectre continu dans lUV par
dcharge lectrique dans le gaz basse pression. La dcharge produit une molcule
excite dnergie quantifie EH2 qui se dissocie en deux atomes anims dnergie cintique
ECH1 et ECH2. Le phnomne est accompagn de lmission dun photon h. dans lUV. On a
donc EH2 = ECH1 + ECH2 + h.. Comme la somme des nergies cintiques peut varier de 0
EH2 et ce, de manire continue, lnergie des photons varie aussi de faon continue. On
obtient ainsi, en pratique, une source continue utilisable entre 160 et 375 nm. En
consquence, les fentres du tube dcharge doivent tre constitues de quartz,
transparent dans cette zone. On peut provoquer lexcitation de diffrentes faons :
-
Soit par dcharge entre deux lectrodes daluminium entre lesquelles une
diffrence de potentiel de 2000 6000 V est applique ; un refroidissement par eau
est requis aux puissances leves.
Soit par formation dun arc entre un filament recouvert doxyde et chauff par effet
Joule, et une lectrode mtallique place un potentiel de +40 V, par exemple, par
rapport au filament.
Lampes filament de tungstne : Cest certainement la source la plus utilise dans le visible
et lIR La distribution nergtique est grosso modo, celle dun corps noir (que vous
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La spectromtrie.
avez peut-tre tudi dans votre cours de physique). Rappelons-en les caractristiques : le
maximum dmission se fait une longueur donde qui varie par linverse de la
temprature. La temprature normale dun filament de tungstne est de 2870 K. A cette
temprature, la plus grande partie de lnergie est mise dans lIR Cette source est utile pour
la zone comprise entre 320 et 2500 nm. Notons qu prsent, il nest pratiquement plus fait
usage que de lampes dites halognes . Ces dernires ncessitent une temprature
leve pour bien fonctionner, lenveloppe de ces lampes est donc constitue de quartz, ou
de verre spcial, plus rsistants. La prsence de lhalogne permet daugmenter la dure
de vie de la lampe en sadditionnant au tungstne sublim, dans la partie froide de
lampoule, pour le redposer dans la partie chaude, c'est--dire sur le filament lui-mme
(figure 1.19). Cela dit, le filament na pas pour autant une dure de vie infinie, les atomes se
redposant rarement l do ils sont partis, des zones fragilises se crent donc au cours du
temps.
Lampe arc au xnon : Lmission est produite par dcharge dans le gaz. Le spectre est
continu entre 250 et 600 nm avec un maximum 500 nm. On peut obtenir des intensits
trs leves. Dans certains cas, la dcharge est intermittente grce linterposition dune
capacit.
Monochromateurs
Cfr. spectromtre dmission atomique.
chantillons
Le plus frquemment, il sagit de substances en solution. En gnral, on utilise des
rcipients (cellules) dpaisseur fixe et calibre. En effet, pour les travaux quantitatifs, la
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La spectromtrie.
longueur de trajet travers la cellule (l) doit tre connue avec prcision (10,00 0,01 mm)
pour pouvoir dterminer des concentrations via la loi de Beer-Lambert. Des cellules de
0,5 50 mm de trajet optique sont dutilisation courante. On utilise aussi des cellules
dpaisseur variable vis micromtrique.
En tout tat de cause, comme les faces du monochromateur, les cellules doivent tre
faites dun matriau transparent la longueur donde utiliser (UV = quartz, visible =
verre ou plastic). Leurs faces doivent tre optiquement planes.
Dans le mme ordre dide, deux critres importants sont considrer lorsquon
choisi le solvant de lchantillon :
-
Dtecteurs
Photomultiplicateur : Outre les dtecteurs de type photodiode ou CCD, que nous avons
dj dcrits prcdemment, les spectromtres dabsorption molculaire utilisent parfois
des
photomultiplicateurs.
Ce
dernier
joint
lmission
lectronique
de
la
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La spectromtrie.
lanode. Un photomultiplicateur de 9 dynodes fournit une amplification suprieure 106
par rapport au courant photocathodique.
Figure 1.20. : Schma de la coupe dun photomultiplicateur : Un photon incident jecte un lectron de la
photocathode. Llectron est ensuite dirig vers la premire dynode par une lectrode collimateur. La dynode
tant un potentiel positif de 100 V, llectron est acclr et son impact produit ljection de 2 (ou plus)
lectrons. Ce processus se rptant chaque dynode, le signal sen trouve amplifi.
et en
2+
bas, une solution de Co .
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La spectromtrie.
Figure 1.21.
: Spectres UV de deux
3+
(Erbium).
o
-
Formation
dun
complexe
color
(ex. :
dosage
du
Fe2+
avec
lorthophnantroline).
o
Titrage photomtrique.
Analyse quantitative
La spectrophotomtrie prsente de nombreux avantages dans le cadre des dosages :
-
Bonne sensibilit (typiquement de 10-4 10-5 M et jusque 10-7 M dans les cas les
plus favorables).
-29-
La spectromtrie.
Bases de lanalyse quantitative
Lanalyse quantitative par spectrophotomtrie UV-vis repose sur le respect de la loi
de Beer-Lambert. Il est ds lors important de se rendre compte que cette loi nest valable
que sous certaines conditions :
-
Cm : la concentration en dessous de
laquelle
la
substance
ne
peut
tre
objectivement dtecte.
-
une
ne
quantification
peut
tre
de
la
prcisment
ralise.
-
rponse
nest
plus
directement
proportionnelle la concentration.
De la temprature.
Du pH (ex. : phnol-phnolate)
De substances interfrentes.
La plupart de ces observations rsultent du fait que le coefficient dextinction est
fonction de :
-
Le solvant
-30-
La spectromtrie.
-
La
loi
de
Beer-Lambert
indique
que :
A C
A X lCX
CX = X S
=
A S lCS
AS
Mthode de ltalon interne (ou mthode de lajout dos) : Le principe consiste mesurer
labsorbance AX de la solution de concentration CX inconnue et de volume VX. Dans un
second temps, on ajoute un volume v (faible par rapport VX) dune solution standard de
concentration
CX =
CS.
Labsorbance
AXS
est
alors
mesure.
On
alors
que
A XCS v
. Cette mthode prsente lavantage de tenir compte des effets de
A XS (VX +v)-A X VX
matrice. Par contre, elle est relativement lente, puisquelle ncessite un ajout par chantillon.
A noter que cette mthode, comme celle de ltalon externe, supposent que la loi de BeerLambert est bien respecte, ce qui nest pas toujours le cas (notamment pour les solutions
concentres.
-31-
La spectromtrie.
la
droite
absorbances
de
dtalonnage
solutions
Les
talon
de
ensuite
reporte
sur
la
droite
-32-
La spectromtrie.
2me tape : Mesure de A M +N aux deux longueurs donde de sorte que lon obtient
un systme de deux quations deux inconnues (CM et CN dans la solution
inconnue).
fonc :
spectre
dune
substance
une
Titrage photomtrique
Le principe du titrage photomtrique est identique celui dun titrage avec indicateur
pH (qui leut cru ?), si ce nest que la dtection des modifications de couleur nest plus
visuelle, mais instrumentale. On obtient alors des courbes de type absorbance en fonction
du volume de titrant (A=f(VT)). Le point de fin de titrage correspond alors lintersection des
droites obtenues par extrapolation des deux parties linaires. Prenons lexemple suivant :
S (substrat) + T (titrant) P (produit)
Cas 1. S et P nabsorbent pas (S = P = 0) et T absorbe (T > 0)
-33-
La spectromtrie.
Cas 2. S et T nabsorbent pas (S = T = 0) et P absorbe (P > 0)
-34-
La spectromtrie.
diagonales grises qui sparent ces niveaux, indiquent que lchelle nest pas
respecte et quils sont en fait beaucoup plus loigns en nergie que ce qui
est illustr. Pour chaque niveau lectronique (UV-Vis) on voit quil existe
plusieurs niveaux dnergie vibrationnelle (IR). Quelques transitions possibles
sont reprsentes par des flches et le spectre correspondant est illustr
dans le dessous de la figure. En outre, il existe des niveaux dnergie
rotationnelle pour chaque niveau dnergie vibrationnelle, mais ils ne sont pas
reprsents pour des raisons de clart. Par contre, deux exemples de
structures fines sont illustrs dans le spectre.
Aspect thorique
Dsexcitation
Une fois la molcule porte dans un tat excit par labsorption dun photon, plusieurs
voies de dsexcitation sont possibles :
-
R-mission. Si labsorption a lieu comme illustr dans la figure 4.57, alors la rmission est exactement linverse de celle-ci. La radiation mise, qui peut tre
mesure et reprsente comme un spectre dmission, est identique en
frquence avec celui dabsorption.
-35-
La spectromtrie.
-
Fluorescence. Si, comme cela est reprsent dans la figure 1.27, la molcule se
retrouve dans un tat de vibration lev aprs une excitation lectronique et lexcs
dnergie vibrationnelle peut tre perdu par des collisions intermolculaires.
Lnergie vibrationnelle est convertie en nergie cintique et apparat sous forme de
chaleur dans lchantillon ; un tel transfert entre les niveaux dnergie est dit non
radiatif et on parle dans ce cas de conversion interne (CI). Ce phnomne est
reprsent par des flches ondules sur la figure 1 .27. Lorsque la molcule excite
a atteint un niveau vibrationnel plus bas (ex :
-36-
La spectromtrie.
CI : Conversion interne.
SX : tat singulet.
TX : tat triplet.
Les niveaux dnergie lectronique sont reprsents par des traits horizontaux gras, les niveaux dnergie
vibrationnelle par des traits horizontaux fins, les transitions radiatives (avec absorption ou mission de lumire) par
des flches verticales droites et les transitions non radiatives (sans mission de lumire) par des flches ondules.
Fluorescence
Les principales caractristiques de lmission de fluorescence dune molcule
organique sont :
-
-37-
La spectromtrie.
fluorescente sera capable de capter de photons, plus elle sera susceptible den
rmettre.
La fluorescence a connu un trs fort dveloppement dans de nombreux domaines
(physique, biologie, mdecine, environnement, industries pharmaceutiques, etc.) en
particulier du fait de la trs grande dpendance de la lumire mise par une molcule son
environnement (polarit, pH, temprature, pression, viscosit, liaisons hydrognes, etc.)
Aspect pratique
Composition dun spectromtre de fluorescence UV
Schma gnral
Figure 1.28. : Schma gnral dun fluorimtre UV
: Une source de rayonnement (ici, une lampe), un
monochromateur (ici, un prisme), un chantillon (ici,
une solution dans une cuvette), un dtecteur (ici, une
photodiode) dans laxe optique et 90 et un systme
de traitement du signal (ici, un ordinateur).
Comme on peut le voir la figure 1.28, le schma gnral dun fluorimtre est en tout
point comparable au schma gnral dun spectromtre UV, si ce nest que cette fois, on
dtecte le signale, non seulement dans laxe optique (mesure du spectre dabsorbance),
mais galement 90 de cet axe, pour dtecter les missions de fluorescence.
Applications de la fluorescence UV
Afin de bien montrer ltendue des applications de la fluorescence, nous ne nous
limiterons pas la spectroscopie par fluorescence UV exclusivement.
-
-38-
La spectromtrie.
Figure 1.29. : Photo de 4 puits dune plaque de test : Les Puits
1 et 2 ne contiennent pas un des ractifs de la raction. Le puits 3
contient les deux ractifs, sans catalyseur ; on y observe une
faible fluorescence aprs plusieurs minutes, trahissant lapparition
dun produit fluorescent. Dans le puits 4, en prsence dun
catalyseur, la florescence est plus importante.
Marquage : Certains composs fluorescents ont t crs pour avoir en plus une
certaine affinit pour lune ou lautre organelle cellulaire, ce qui permet de les colorer
spcifiquement, comme lillustre la figure 1.30.
-39-
La spectromtrie.
Aspect thorique
Principe de la spectromtrie de masse
L'analyse par spectromtrie de masse repose sur l'ionisation, gnralement dans une
enceinte o rgne un vide pouss (10-4 Pa), d'une trs petite quantit d'chantillon, afin de
crer des ions ; ces espces charges sont alors soumises l'action de champs
lectriques et/ou magntiques, suivant les appareils. L'tude des trajectoires suivies
permet de dterminer le rapport masse/charge des ions, donc ventuellement leur
nature. La reprsentation sous forme graphique de l'abondance des ions sur la base de leur
rapport masse/charge constitue le spectre de masse (figure 1.31). Celui-ci traduit la
fragmentation, l'chelle statistique, du trs grand nombre d'espces individuelles qui
composent tout produit soumis cette analyse. La mthode, d'une extrme sensibilit,
dtruit l'chantillon.
Ionisation : les molcules prsentes dans l'chantillon passent l'tat gazeux, par
effet du vide, et sont ioniss par un des procds existants. Il en rsulte un mlange
d'ions issus de la fragmentation des molcules de dpart.
Acclration : sitt forms, les ions sont dirigs vers le dispositif de sparation, par
effet d'un champ lectrique qui accrot leur nergie cintique.
Sparation : les ions sont alors tris suivant leur rapport masse/charge (m/e).
Plusieurs procds peuvent tre employs cette fin.
Dtection : aprs sparation, les ions sont recueillis par un dtecteur sensible aux
charges lectriques transportes.
-40-
La spectromtrie.
plus ou moins de prcision. Les meilleurs appareils peuvent dterminer les masses avec une
extrme prcision : la marge d'erreur ne dpasse pas 10-5 uma. Tous les appareils, quelles
que soient leur performances, conduisent une prsentation standardise des rsultats
sous forme de spectre de fragmentation qui correspond une rpartition des ions, regroups
aux valeurs nominales entires (qui n'existe que de nom et non de fait) les plus proches de
leur masse relles, et dont les intensits sont exprime en % du pic le plus intense,
appel pic de base.
Ce "spectre-btons", qui correspond la distribution des masses rparties en classes
dont les hauteurs sont proportionnelles leurs abondances, n'est autre qu'une sorte
d'histogramme. Nanmoins cette reprsentation a pour inconvnient qu' une mme masse
nominale il peut correspondre plusieurs ions, par ailleurs totalement diffrents, qui se
confondent dans ce type de reprsentation. C'est pourquoi les spectromtres de masse
permettent galement une autre prsentation des rsultats, sous forme d'un trac continu
des masses balayes. Les signaux prennent alors l'aspect de pics gaussiens, plus ou moins
larges selon l'appareil. La position de chaque maximum correspond un rapport
masse/charge prcis.
Pour identifier un compos molculaire par spectromtrie de masse, on dispose
de deux approches : soit en faisant appel une spectrothque o est rpertori un grand
nombre de spectres, parmi lesquels on retrouvera celui du compos tudi s'il existe dans la
collection, soit en essayant de reconstituer la structure du compos de dpart la
manire d'un puzzle. La seconde mthode est un exercice d'une grande difficult, les
fragmentations tant souvent assez difficilement prvisibles. Il faut alors disposer de
plusieurs spectres, enregistrs dans des conditions diffrentes.
La spectromtrie de masse est devenue progressivement un moyen d'investigation
irremplaable des composs structurs. Elle s'applique galement l'analyse de la
composition lmentaire des milieux inorganiques (technique ICP/MS) et peut tre tendue
l'tude des mlanges molculaires, condition de placer en amont du spectromtre de
masse un chromatographe (liquide ou gazeux) ou une lectrophorse capillaire pour sparer
les composs.
-41-
La spectromtrie.
E=
V
d
=qE
F
a le mme sens que E
, et inversement. Cette force est indpendante de
Si q > 0, F
la vitesse de l'ion. En spectromtrie de masse, on remplace souvent q par e ou z pour
dsigner la charge, bien que les ions portent quelquefois plus d'une seule charge
lmentaire.
F=qvB
-42-
La spectromtrie.
, parcouru par un
qui exprime la force laquelle est soumise un conducteur de longueur dl
.
courant I, dans un champ d'induction magntique B
F=ldl
B
Le champ magntique ne modifie pas la vitesse des ions, donc leur nergie cintique.
Par application de la relation fondamentale de dynamique, qui s'crit, dans le repre du
=ma
, on en dduit, si = /2 :
laboratoire, F
=
a
B
v
m
m RB
mv
=
ou R =
e
v
eB
La spectromtrie de masse ne permet d'accder qu'au rapport masse/charge des
ions, port en abscisse du spectre (c'est pourquoi on crit par convention m/q ou m/e). Si
tous les ions portent la mme charge, l'chelle de masse est la mme, un facteur prs.
C'est pourquoi l'chelle des spectres est indique en uma (ou Da). Par contre, si un mme
fragment m est porteur de charges diffrentes, il apparatra plusieurs positions, l'appareil
ne pouvant diffrencier, par exemple, m/2e et (m/2)/e.
Aspect pratique
Introduction et ionisation de l'chantillon
Modes d'introduction directe des chantillons
Le mode d'introduction dans le spectromtre de masse varie suivant l'tat physique
de l'chantillon et la technique choisie. Dans le cas d'un gaz ou d'un compos l'tat de
vapeur, on introduit un peu de l'chantillon dans un rservoir qui communique avec la
-43-
La spectromtrie.
chambre d'ionisation par une fuite rglable. Pour un liquide, on utilise une microseringue. Le
liquide se trouve vaporis par effet du vide rgnant dans la chambre d'ionisation.
Les solides peuvent tre introduits en les dposant l'extrmit d'une canne
mtallique chauffante, pour assurer la sublimation du compos, ou par vaporation partir
d'une solution dans un solvant volatil.
-44-
La spectromtrie.
Thermospray : Volatilisation rapide par passage de lluant, dont le dbit se situe entre 1 et
2 ml/min, dans un capillaire chauff en prsence dun lectrolyte comme lactate
dammonium. Un systme de pompage situ en face du capillaire produit un jet
supersonique de vapeur contenant de trs fines gouttelettes. La taille de ces dernires
diminue mesure quelles se dplacent (vaporisation) et, un certain moment, les ions sen
dtachent et entrent dans le spectromtre de masse.
ICPA (Ionisation Chimique Pression Atmosphrique) : Cest un procd assez comparable
au thermospray, mais avec une ionisation pression atmosphrique.
Figure
1.33.
Ionisation
pression atmosphrique.
-45-
La spectromtrie.
d'accrotre, sur le spectre, l'intensit relative du pic molculaire M , il est possible de choisir
une nergie d'ionisation plus faible, 15 eV par exemple.
Figure 1.35. : Schma du processus
dionisation par impact lectronique :
1.
Bombardement lectronique.
2.
3.
Ionisation.
4.
Fragmentation.
Dsorption / ionisation
L'chantillon est ionis par impact d'atomes lourds (Xe ou Ar), ou avec des ions (Cs+
ou Na+), anims d'une grande vitesse. Ainsi dans la mthode de bombardement par des
atomes rapides (FAB), on ionise un gaz atomique avec des lectrons, puis on acclre les
ions forms afin de les faire entrer en collision avec des atomes du gaz rests l'tat neutre.
Ceux-ci sont projets grande vitesse sur l'chantillon dpos, l'tat de film, sur un
support mtallique. Cette technique vite de chauffer les composs et permet de faire des
tudes de plus longue dure.
Gillet Steve, D.Sc.
-46-
La spectromtrie.
Figure 1.36.
: Schma du processus de
dsorption/ionisation :
1.
Bombardement lectronique du Xe et
+
formation dun cation Xe .
2.
CH4+ CH3+ + 2H
CH4+ + CH4 CH5+ + CH3
CH3+ + CH4 C2H5+ + H2
Collisions :
(ion M+1)
CH5+ + M MCH4+ + H
(ion M+16)
C2H5+
(ion M+29)
+M
MC2H5+
-47-
La spectromtrie.
CH5+ + M [M-H]+ + CH4 + H2
NH4+ se comporte comme CH5+. Quant l'isobutane, il donne avec facilit l'ion
(CH3)3C+ stable, qui conduit l'ion (M+1), en se transformant en isobutne :
(CH3)3C+ + M MH+ + CH2=C(CH3)2
1.37.
processus
Schma
par
plasma
du
:
spectromtrie
dmission
de
masse
proprement dit.
Dtecteurs ions
La dtection repose sur les mesures lectriques des charges transportes pour
lesquelles on retrouve des principes qui sont communs avec la dtection des photons.
Ces dtecteurs fixes imposent que l'on explore le domaine m/e par un balayage en
fonction du temps. Certains modles ont une telle sensibilit qu'ils peuvent reprer l'impact
d'un seul ion. Ordinairement le nombre d'ions d'une mme espce est grand, de sorte que le
signal est de type analogique. On distingue :
-
-48-
La spectromtrie.
d'lectrons n'est pas provoqu par l'impact d'un photon, mais par l'impact d'un ion.
Malheureusement, ces dtecteurs vieillissent assez mal, mais il est possible de les
remplacer par des photomultiplicateurs, en ajoutant un systme de conversion ion
photon, ce qui conduit un montage appel dynolite.
-
Figure 1.38.
dtecteurs
Multiplicateur
: Schmas des
a/
dlectrons
ions
(multplicateur
Sensibilit
-49-
La spectromtrie.
La sensibilit d'un appareil se mesure en masse d'chantillon consomm par
seconde (de l'ordre du pg), pour obtenir un signal d'intensit normalise.
Pouvoir de rsolution
Les pics des spectres de masses des appareillent prsentent l'aspect de courbes
gaussiennes plus ou moins larges par la suite d'imperfections diverses. Le pouvoir de
rsolution est un paramtre qui permet de juger de l'efficacit des appareils sparer des
ions de masses voisines. Il est dfinit par R = M/M, calcul sur un enregistrement rel,
aprs que l'appareil ait t rgl au mieux de ses performances. La masse M est mesure
au milieu du pic choisi. Quant M, il correspond :
-
soit l'cart minimum entre deux masses voisines, de mme intensit, tel que la
valle, entre les pics, ne dpasse pas 10 % de leur hauteur.
Le pouvoir de rsolution est sans dimension. Avec des appareils secteur
magntique, M varie avec M et il faut donc prciser la masse ayant servi au calcul. Avec
des appareils filtres quadrupolaires, M est constant.
Figure 1.39. : Calcul de la rsolution dun
SM : A gauche, M correspond lcart
minimum entre deux masses voisines, de
mme intensit, tel que la valle, entre les pics,
ne dpasse pas 10 % de leur hauteur. A droite,
M correspond la largeur du pic mi-hauteur.
Figure
1.40.
Elments
Dans certains montages, l'ordre des deux secteurs est invers (le secteur
lectrostatique est plac avant le secteur magntique). Etant donn la quantit
Gillet Steve, D.Sc.
-50-
La spectromtrie.
d'informations produites au cours d'une seule analyse, le traitement des donnes par
l'ordinateur s'avre indispensable pour la correction, la manipulation, la conservation et la
visualisation des donnes, sans oublier l'impression des rsultats et le diagnostic des
pannes de l'appareil.
Acclrateur d'ions
Environ 5 % des ions forms amorcent le parcours qui va les mener jusqu'au
dtecteur. Les ions (supposs ici positifs) sont acclrs au moyen de plusieurs plaques
portes des potentiels ngatifs croissants, la diffrence de potentiel totale pouvant
atteindre 10 000 V. Le vide doit tre excellent pour viter la formation d'arcs lectriques.
Les ions acquirent tous une mme nergie cintique Ec = eU. La vitesse acquise
aprs acclration est donc inversement proportionnelle la racine carre de leur masse :
vi =
2eU
mi
Cependant leur nergie cintique E0 avant acclration, bien que trs petite devant
celle qu'ils ont acquise, est la cause d'une faible dispersion de leur nergie cintique
totale.
Etotale = E0 + Ec
Secteur lectrostatique
L'inhomognit nergtique prcite est neutralise en faisant passer les ions
travers un secteur constitu de deux lectrodes cylindriques concentriques qui slectionnent
les ions ayant la mme nergie, quelle que soit leur masse. Ce systme champ radial,
galement focalisateur en direction, redresse les trajectoires quelque peu divergentes,
l'entre du secteur.
qui s'exerce sur les ions est perpendiculaire la trajectoire centrale de
=eE
La force F
rayon R et ne modifie donc pas leur nergie. En grandeur, elle est gale F = mv2/R. En
remplaant le produit mv2 par son quivalent en fonction de tension acclratrice (mv2 =
2eU), on aboutit la relation fixant les conditions de passage des ions dans le secteur radial
:
-51-
La spectromtrie.
E=
2U
R
Lorsque E et U sont relis par cette expression, seuls les ions ayant exactement
l'nergie acquise au cours de l'acclration passeront par la fente de sortie. En reliant
U la diffrence de potentiel V entre les plaques du secteur distantes de d (V = Ed),
l'expression devient :
V=
2d
U
R
spectromtre
secteur magntique et
double focalisation.
Secteur magntique
A la suite du secteur lectrostatique, se trouve le secteur magntique. Les appareils
se partagent entre le montage Nier-Johnson pour lequel la courbure impose par le champ
magntique est de mme sens que la courbure due au secteur lectrostatique et le montage
de type Mattauch-Herzog o ces deux courbures sont opposes.
Figure
1.42.
fonctionnement
magntique
secteur
dun
Schma
du
de
secteur
spectromtre
magntique
et
double
montages
possibles :
Nier-
-52-
La spectromtrie.
m R2B2
=
e
2U
Seuls les ions ayant suivi la trajectoire de rayon R, impos par la construction,
pourront tre dtects. Par consquent, pour reprer les masses prsentes on fait varier
B (mode normal d'utilisation) ou U, de manire progressive, pour que les ions suivent
successivement l'unique parcours qui permet leur dtection.
Comme le secteur lectrostatique, le secteur magntique encore appel prisme
magntique est focalisateur en direction : un faisceau d'ions identiques abordant le
secteur magntique sous un petit angle de divergence , est focalis en F2, fente image de
F1. A chaque instant une seule masse peut suivre la trajectoire de rayon R.
Le qualificatif de double focalisation donn ces appareils, vient de ce que les
montages en tandem des deux secteurs permettent de corriger la fois les aberrations
angulaires et en nergie des ions (focalisation en direction par le secteur magntique et en
vitesse par le secteur lectrostatique).
m=
2eU 2
t
L2
Figure
1.43.
Schma
de
-53-
La spectromtrie.
Figure
1.44.
Schma
de
illustration
des
barres
champ
transversale.
dans
En
une
bas :
coupe
trajectoires
-54-
La spectromtrie.
lion
se
trouve
sur
maximum de potentiel.
-55-
un
La spectromtrie.
-
composante de vitesse nulle suivant Oy : la trajectoire reste dans le plan xOz. Les
parois devenant alternativement positives et ngatives, les ions lourds auront une
inertie trop grande pour suivre ces variations d'orientation du champ lectrique : ils
resteront peu perturbs. Par contre, les ions lgers se mettront osciller et ne
pourront pas, en gnral, trouver le trou de sortie du filtre. On a ralis ce qu'on
appelle un filtre passe-haut.
passer qu'un petit intervalle en masses, en particulier si V0/VRF < 0,2. En faisant varier
cette bande passante, on slectionne les ions de masses croissantes et on comprend qu'il
soit ainsi possible d'obtenir un spectre de masse.
Figure 1.46.
: Schma dun
complexe
-56-
La spectromtrie.
Une approche qualitative du fonctionnement peut se rsumer comme suit. Le
compos introduit dans cette cavit est ionis par un bombardement d'lectrons, de trs
courte dure dfinie par une lectrode de contrle. Une radiofrquence fixe, applique
l'lectrode annulaire, confine les ions forms dans l'espace central o ils dcrivent des
trajectoires complexes, amorties par effet d'une faible pression d'hlium, de l'ordre de
0,01 Pa. L'analyse des ions se fait en les extrayant dans l'ordre des masses croissantes
par augmentation de l'amplitude du champ de radiofrquence : l'amplitude d'oscillation
des ions crot dans la direction axiale et va jusqu' conduire leur jection vers les
lectrodes d'entre ou de sortie. Ceux qui traversent l'lectrode de sortie, perce en son
centre, atteignent le dtecteur (channeltron). Par introduction conjointe de l'chantillon et
d'un gaz ractant dans le pige on obtient, sans autres modification, une ionisation chimique.
-57-
La spectromtrie.
refltent les abondances isotopiques naturelles des lments prsents. Les amas
isotopiques forment des combinaisons uniques pour chaque formule brute. L'utilisation de
cette mthode pour dterminer la formule brute suppose que l'on dispose d'une table de
valeurs calcules ou bien d'un ordinateur pour rechercher la formule brute dont l'amas
isotopique s'approche le plus des valeurs exprimentales.
Pour les composs ne comportant que les lments C, H, N, O, F, P, les intensits
des pics M+1 et M+2 sont donnes par les formules simplifies suivantes :
(M+1)% = 1,1 nC + 0,36 nN
(M+2)% = nC(nC -1).1,12/200 + 0,2 nO
Le pic M+1 sera d'autant plus important que le nombre d'atomes de 13C, de 15N ou de
35
S sera plus grand. Par contre, le pic M+2 dpend de 18O, 34S, 37Cl, etc.
Ces formules permettent aussi de dduire le nombre maximum de C dans un
-58-
La spectromtrie.
-
Rgles de fragmentation
L'identification des composs avec l'aide d'une spectrothque constitue une aide
efficace, mais cette approche peut conduire des erreurs. C'est pourquoi l'interprtation de
la nature et l'origine des pics de fragmentation en masse reste toujours d'un grand
intrt. Des ouvrages spcialiss y sont consacrs. Elle ncessite une grande exprience.
Le chimiste organicien y est gnralement bien prpar, car il retrouve les mmes types
d'ions dans les mcanismes ractionnels en phases condenses, la diffrence cependant
que les ions se dplacent ici dans le vide et sans entrer en collision. Les temps de parcours
tant trs brefs, on peut envisager des espces trs instables. Toutes les liaisons n'ont
pas la mme prdisposition se couper. En ionisation lectronique, l'action commence par
l'arrachement d'un lectron de la molcule, appartenant une liaison ou un doublet libre. A
ce stade, la molcule est ionise, mais non fragmente. Dans un second temps, l'ion
molculaire va pouvoir voluer. Ainsi l'ionisation de l'isobutane peut conduire la perte d'un
radical mthyle, le cation isopropyle sera favoris car il est thermodynamiquement plus
stable que le cation mthyle.
Pour les composs qui comportent des htroatomes, l'ionisation se porte de
prfrence sur l'un d'eux. Les modes de dcomposition sont plus nombreux. La
fragmentation de la butanone fait ainsi apparatre l'ion actyle 43, l'ion 57 tant 10 fois moins
intense.
A ct de ces exemples lmentaires de fragmentation, il existe bien d'autres
transformations possibles dans lesquelles les ions se rarrangent, quelquefois suivant des
voies trs complexes. Toutes ces transformations font l'objet de rgles semi-empiriques qui
sont utilises dans l'tude des composs inconnus et qui servent aussi, plus simplement,
-59-
La spectromtrie.
contrler les rsultats auxquels conduisent les recherches automatises avec les
spectrothques.
1.6. Spectroscopie IR
Tout dabord, notons quen spectroscopie IR on fera plus souvent rfrence au
nombre donde dun rayonnement qu sa frquence ou sa longueur donde. Il faut ds lors
savoir que le nombre donde ( ) reprsente le nombre doscillations de londe par unit
de longueur et est ainsi dfini comme : = 1 / avec la longueur donde dans le vide
exprime en cm. Lunit du nombre donde est donc le cm-1.
Rappelons prsent que la rgion IR du spectre comprend la rgion de longueur
donde comprise entre environ 0,78 et 1000 m (ou de nombre donde de 12 800 10 cm-1).
Il est utile, tant sur le plan des applications que sur le plan de linstrumentation, de diviser
cette zone du spectre en trois rgions :
-
ses
possibilits
remarquables
comme
outil
danalyse
qualitative,
la
spectroscopie IR offre des utilisations intressantes sur le plan quantitatif : son atout majeur
est la slectivit qui rend possible une dtermination dune substance inconnue dans un
mlange complexe sans sparation pralable. Ces applications sont cependant limites,
pour divers motifs que nous expliciterons ultrieurement. Les plus importantes dentre elles
se rapportent la mesure de polluants atmosphriques provenant de processus industriels
(autant dire que vous risquez peu dy tre confronts).
-60-
La spectromtrie.
et
labscisse
est
linaire
en
-1
La figure 1.47 nous servira de base pour faire quelques remarques sur le mode de
prsentation des spectres IR. Lordonne est gnralement donne en transmission,
bien que certains enregistrements soient reprsents en absorbance. Dautre part,
labscisse est linaire en nombre donde et, bien que cette terminologie ne soit pas
correcte, les spectroscopistes utilisent frquemment le terme frquence en lieu et place de
nombre donde.
Aspect thorique
Nous avons vu que pour obtenir des transitions lectroniques, il est ncessaire de
recourir des nergies dans le visible et lUV. Labsorption IR est pour sa part confine
principalement des transitions molculaire de type vibrationnel et rotationnel. Pour quune
molcule puisse absorber une radiation IR, elle doit subir une modification de son
moment dipolaire, lors de son mouvement vibrationnel ou rotationnel. Ce nest que
sous cette condition que le champ alternatif du rayonnement interagira avec la molcule et
provoquera un changement damplitude du mouvement considr. Par exemple, la
distribution de charge dune molcule telle que HCl nest pas symtrique, le moment
dipolaire tant dtermin par limportance de la diffrence de charge et la distance entre les
deux centres de charge. Si la molcule HCl vibre longitudinalement, on observe une
fluctuation rgulire de son moment dipolaire. Si la frquence du rayonnement correspond
celle de la frquence naturelle de vibration de la molcule, un transfert dnergie se produit :
le rsultat en est une augmentation de lamplitude de vibration. De la mme manire, la
rotation asymtrique autour de leur centre de masse a pour rsultat une variation dipolaire
asymtrique : de nouveau, une interaction avec le rayonnement incident de frquence ad
hoc est possible.
Notons que les molcules homopolaires telles que O2, N2, Cl2, etc. ne subissent
pas de variation de moment dipolaire lors de leur vibration ou de leur rotation : elles
ne peuvent pas absorber dans lIR.
-61-
La spectromtrie.
Transition de rotation
Lnergie requise pour induire un mouvement de rotation est trs faible : elle
correspond au rayonnement de 100 m ou plus ( 100 cm-1). Comme les niveaux de
rotation sont quantifis (ce que je vous demande de croire sur parole, moins que vous
ne dsiriez vraiment la dmonstration), labsorption par les gaz dans cette zone de lIR
lointain est caractrise par des raies discrtes bien dfinies pour autant que
lappareillage puisse dtecter lIR lointain et que sa rsolution soit suffisante (< 1 cm-1). Dans
les liquides et les solides, les collisions entre les molcules font disparatre cette
structure fine et on observe des bandes vibro-rotationnelles plus larges.
Transition de vibration-rotation
Les niveaux vibrationnels dnergie sont aussi quantifis (comme nous allons le
voir ultrieurement) et les diffrences nergtiques entre niveaux correspondent aux
rgions aisment accessibles du spectre IR : environ 0,75 15 m (1300 675 cm-1). Le
spectre IR dun gaz consiste, en gnral, en des sries de raies rapproches, parce quil y a
plusieurs niveaux rotationnels dnergie par tat vibrationnel. Par contre, la rotation est
inhibe dans les liquides et les solides : dans de tels chantillons, les raies discrtes
vibro-rotationnelles disparaissent, le rsultat tant des pics vibrationnels quelque peu
largis. Nos proccupations se limitent principalement aux spectres de solides, liquides et
solutions dans lesquelles les effets rotationnels son minimaux.
-62-
La spectromtrie.
La figure 1.48 reprsente les divers types de vibration dun groupe de formule
gnrale XY2. Tous ces types de vibration sont possibles dans une molcule contenant plus
de deux atomes.
Figure 1.48.
symtrique
(gauche)
et
bas
reprsentent
les
vibrations
de
Aspect pratique
Composition dun spectromtre dabsorption IR (non FTIR)
Schma gnral
Sur le plan des principes, linstrumentation utilise en absorption IR est identique
celle utilise en UV-Vis (figure 1.49). Seuls diffrent la nature de la source, des matriaux
optiques (sur le plan de la transparence, dispersion, rsolution, etc.) et des dtecteurs. En
outre, cette fois, la slection de la longueur donde, se fait plutt en aval de lchantillon. Il
est noter que les appareils transforme de Fourier, dont nous parlerons un peu plus
ultrieurement, remplacent galement de plus en plus les monochromateurs optiques.
Figure 1.49. : Schma gnral dun spectromtre dabsorption IR : Une source de rayonnement (ici, une
lampe), un chantillon (ici, une pastille KBr), un monochromateur (ici, un rseau), un dtecteur (ici, un
dtecteur pyrolectrique) et un systme de traitement du signal (ici, un ordinateur).
-63-
La spectromtrie.
Sources
Filament de Nernst (Nernst Glower) : Il sagit dun cylindre (l = 20 mm, = 1 2 mm)
doxydes de terres rares auquel sont relis des fils de platine servant de conducteurs
lectriques. La rsistance du systme prsente un coefficient de temprature ngatif
(c'est--dire que la rsistance diminue si la temprature augmente) : il doit en pratique tre
chauff au rouge sombre par une source externe pour que le courant puisse passer avec
une intensit suffisante. En raison de ce coefficient de temprature ngatif, le circuit doit
ncessairement limiter le courant de manire viter une auto-destruction du systme.
Globar : Il sagit toujours dun cylindre (l = 50 mm, = 5 mm), mais cette fois de SiC chauff
lectriquement qui prsente sur le systme prcdent lavantage dun coefficient de
rsistance positif. Les connexions requirent cependant un refroidissement par eau. Les
domaines spectraux du filament de Nernst et du Globar sont comparables, sauf dans la
rgion < 5000 nm (> 2000 cm-1) o le Globar fournit un rayonnement dintensit plus forte.
Fils incandescents : Un fil de nichrome ou de rhodium enroul en spirale et chauff
lectriquement fournit une source de vie plus longue quun Globar ou un filament de
Nernst, mais aussi dnergie radiante plus faible.
chantillons
Nature et techniques de prparation : Comme nous lavons vu, les spectres IR sont obtenus
le plus souvent partir de solutions dilues, la valeur optimale de labsorbance tant
obtenue par ajustement de la concentration ou de la longueur de la cellule.
Malheureusement, en raison de lorigine mme des spectres IR, il nexiste aucun solvant
qui soit transparent dans tout le domaine IR. En consquence, dans lIR, on doit souvent
utiliser des techniques qui rendent la mesure prcise et exacte du coefficient dabsorption
molaire difficile voire impossible. Nous discuterons ci-dessous quelques techniques propres
labsorption IR.
chantillons gazeux : Le spectre dun liquide bas point dbullition, ou dun gaz, peut tre
obtenu en introduisant lchantillon dans une cellule pralablement mise sous vide. On
dispose ainsi de cellules dont les trajets lumineux peuvent atteindre plusieurs mtres
(cellules compactes avec rflexions internes).
-64-
La spectromtrie.
Solutions : La figure 1.50 donne la liste des solvants les plus courants utiliss pour ltude du
spectre IR de substances organiques. Cette figure montre clairement quaucun solvant ne
peut couvrir ne ft-ce que la zone IR moyen. CS2 et CCl4 sont assez complmentaires :
toutefois CS2 ne dissout que peu de substances.
Leau et les alcools sont rarement utiliss, non seulement parce quils absorbent
fortement, mais parce quils attaquent les halognures alcalins qui constituent les
matriaux les plus courants des fentres des cellules. Pour ces raisons aussi, les divers
solvants utiliss doivent tre desschs avant usage. Notons que pour des solutions
contenant un peu deau, on peut utiliser des matriaux de fentre plus rsistants : AgCl ;
Irtran-1 (MgF2), Irtran-2 (ZnS) ; Irtran-4 (ZnSe). En particulier, lIrtran-2 se travaille bien pour
obtenir un poli optique.
Figure 1.50. : Tableau des solvants les plus courants utiliss en spectroscopie dabsorption IR : Les rgions
ouvertes sont celles pour lesquelles le solvant transmet plus de 25 % de la lumire incidente pour 1 mm dpaisseur.
En raison de labsorption lumineuse par les solvants, les cellules IR ont, en gnral,
un trajet lumineux court (quelques centimes de mm 1 mm). Ces cellules sont le plus
souvent dmontables (figure 1.51) et sont constitues de deux lames parallles de matriau
transparent, spares par une mince feuille de plomb, cuivre, tflon munie dun orifice
permettant le remplissage. Lpaisseur de cette feuille, ou spacer , fixe la longueur du
trajet optique. Pour des travaux quantitatifs, lpaisseur des cellules doit tre contrle : elles
I 0'
sutilisent par paires lorsquon emploie la technique classique de mesure de . Notons
I
quexistent galement des cellules dpaisseur rglable avec prcision.
-65-
La spectromtrie.
Liquides purs : Quand la quantit dchantillon est faible ou quun solvant adquat nexiste
pas, il est courant denregistrer le spectre sur le liquide pur. La technique la plus utilise
(figure 1.52) consiste presser une goutte de liquide entre deux lames de matriau
transparent (NaCl ou KBr sont souvent utiliss). On obtient ainsi une paisseur assez mal
dfinie de 0,01 mm ou moins. Une telle technique donne de bons rsultats en analyse
qualitative.
Solides : Pour les chantillons solides qui ne peuvent tre dissous dans un solvant adquat,
plusieurs techniques peuvent tre envisages :
-
-66-
La spectromtrie.
deux lames transparentes. On peut aussi utiliser la technique des pastilles qui
consiste broyer 1 quelques mg dchantillon avec 200 mg de KBr sec et presser
le mlange 1 plusieurs tonnes par cm2 pendant quelques minutes de manire
obtenir une pastille homogne. De meilleurs rsultats sont obtenus si lair occlus est
limin par pressage sous vide. Le disque est utilis tel quel dans le faisceau
lumineux. En dpit des prcautions, lhumidit absorbe conduit lapparition de
bandes 3400 et 1600 cm-1.
Monochromateurs
Cfr. Spectromtre dmission atomique. En gnral, cest un monochromateur
rseau qui est utilis dans les spectromtres dabsorption IR.
Exemples de Dtecteurs
Thermocouple : Ce type de dtecteur est largement utilis dans lIR. Sous sa forme la plus
simple, le thermocouple est ralis par jonction de deux pices dun mtal donn avec les
extrmits dune pice dun autre mtal ou alliage. Une diffrence de potentiel se
dveloppe entre les deux jonctions lorsquelles se trouvent des tempratures
diffrentes. Contrairement aux dtecteurs prcdents, les thermocouples ont une rponse
non slective en . En pratique, les jonctions utilises pour la dtection dans lIR sont
formes de trs fins fils de mtal tels que Bi-Ag, Pt-Sb, etc. Pour augmenter la sensibilit, on
ralise de telles soudures en srie (piles thermolectriques) avec alternance de soudures
chaudes (celles recevant le rayonnement) et froides (rfrence). Les soudures chaudes sont
noircies pour mieux absorber les radiations mesurer. Elles sont scelles sous vide dans
une enceinte munie dune fentre transparente aux radiations mesurer.
Dtecteur de Golay : Il sagit essentiellement dun thermomtre gaz sensible : une enceinte
tanche de forme cylindrique contient du xnon et une membrane noircie destine
absorber le rayonnement incident qui pntre par une fentre transparente lIR. Lautre
face du cylindre est faite dun diaphragme flexible dont le ct extrieur est argent. Un
faisceau lumineux est rflchi sur cette face vers la cathode dun photo-tube. Lorsque le
rayonnement incident pntre le tube, la membrane noircie schauffe et chauffe son tour
le xnon qui, en se dilatant, dforme le diaphragme : la fraction de lumire rflchie qui
frappe la photocathode est modifie, ce qui produit une variation du courant qui dpend de
lnergie dissipe dans le gaz par le rayonnement IR (figure 1.53). Le dtecteur de Golay est
-67-
La spectromtrie.
plus coteux que les autres dtecteurs de type thermique, mais nest pas plus sensible
dans lIR proche ou moyen. Il est par contre suprieur dans le domaine de lIR lointain. Le
dtecteur de Golay a une rponse plus rapide que le thermocouple.
Figure 1.53. : Schma de la coupe transversale dune cellule de Golay : Des radiations incidentes IR
traversent la fentre de la cellule et son absorbes par la membrane noire. Cette dernire schauffe et
chauffe le xnon emprisonn dans la cellule. La dilatation de ce dernier modifie la gomtrie du diaphragme
argent qui se situe lextrmit de la cellule et sur lequel se rflchit une lumire incidente visible. Ce
phnomne entrane une modification du signal reu par la photocathode et donc de lintensit lectrique
mesure. Cette diffrence dintensit lectrique sera donc fonction de la quantit de radiations IR incidentes.
-68-
La spectromtrie.
Ici, M = 1 et S/N (T)1/2. Lavantage thorique entre les deux types de disperseurs
est donc de (M)1/2.
2) Un autre avantage est dnomm lavantage de Jacquinot. Puisquil ny a pas de
fente dans spectromtre TF, Jacquinot a montr quil est thoriquement possible de
laisser entrer plus de lumire dans un spectromtre TF que dans un
monochromateur classique. En pratique, toutefois, cet avantage est compens par
dautres inconvnients :
-
Il est ncessaire dutiliser des collimateurs (qui rduisent dons la luminosit) pour
rendre la lumire aussi parallle que possible.
3) En pratique, ce type dappareil sera utilis avec profit surtout pour les applications
demandant une grande sensibilit (spectroscopie IR par mission, analyse dans
lIR lointain, analyse de gaz, de microchantillons ou analyses ultra-rapides). Le gain
en sensibilit est au moins dun facteur 10 et un spectre IR peut tre enregistr en
moins dune seconde avec une rsolution moyenne.
-69-
La spectromtrie.
nombreuses tables de corrlation qui peut servir de point de dpart dans le processus
didentification dune molcule.
Figure 1.54. : Table de corrlation simplifie : Les plages dabsorption correspondant des vibrations
dlongation sont indiques en haut et les plages dabsorption correspondant des vibrations de dformation
sont indiques dans le bas.
Des pics dans la zone 3700 3100 cm-1 sont souvent dus aux vibrations de valence
O-H et N-H, les premires apparaissent souvent pour des plus levs. Les bandes
OH sont souvent plus larges que les bandes NH et apparaissent seulement dans
les solvants non polaires en milieu dilu. En effet, les liaisons par ponts hydrogne
largissent les pics et les dplacent vers des plus faibles.
Les vibrations C-H aliphatiques se trouvent dans la rgion 3000 2850 cm-1. La
plupart des composs aliphatiques ont suffisamment de liaison C-H pour quon
observe un pic important dans cette zone. Toute variation structurale affectant la
force de liaison C-H sera la cause dun dplacement du maximum du pic : par
-70-
La spectromtrie.
exemple, la bande C-H dans un groupe Cl-C-H se trouve juste au-dessus de 3000
cm-1 comme les C-H des olfines et des aromatiques. Par contre, la C-H actylnique
se trouve 3300 cm-1. Lhydrogne dun aldhyde CHO produit un pic distinct dans
la zone 2745 2710 cm-1. Le remplacement de H par le deutrium provoque un
dplacement vers des plus faibles par un facteur , ainsi que permet de le prvoir
la thorie. Cet effet est utilis pour lidentification des pics de valence C-H.
Rgion des liaisons triples : 2700 1850 cm-1 : Un nombre limit de groupes absorbe dans
cette rgion, leur prsence est donc aisment visible. On peut citer les zones suivantes :
-
Rgion des liaisons doubles : 1950 1550 cm-1 : La vibration de valence C=O absorbe dans
cette zone. Ctones, aldhydes, acides, amides et carbonates ont tous des pics dabsorption
aux environs de 1700 cm-1. Les esters, les chlorures dacide et les anhydrides organiques
absorbent vers 1770 1725 cm-1. Le processus de conjugaison tend abaisser le pic
dabsorption denviron 20 cm-1. Au vu de ce grand nombre de possibilits, on ralise quil est
frquemment impossible de dterminer la nature dun groupe C=O uniquement sur la
base de labsorption dans cette zone ; cependant, lexamen dautres rgions spectrales
permet parfois de lever le doute : cest ainsi que les esters ont une forte bande de valence
C-O-R 1200 cm-1 tandis que les aldhydes, comme nous lavons dj vu, prsentent une
bande C-H juste au dessus de 2700 cm-1. Les pics dabsorption des vibrations de valence
C=C et C=N sont situs dans la zone 1690 1600 cm-1. Des informations prcieuses
relatives la structure des olfines peuvent tre dduites de la position exacte de tels pics.
La zone 1650 1450 cm-1 est importante en ce qui concerne les drivs aromatiques.
Les composs aromatiques prsentant peu de substituants possdent 4 pics aux environs
de 1600, 1580, 1500 et 1460 cm-1. Le nombre et la dispersion de ces substituants produisent
des modifications spectrales prvisibles, mais indpendantes de la nature des substituants.
Rgion de 400 1650 cm-1 : Dans cette rgion sont situes les bandes de vibration de
valence des liaisons simples C-C et C-X (X = O, N, S, halognes) ainsi que les bandes des
modes de dformation de nombreuses liaisons simples. La position de ces bandes est trs
sensible aux changements de structure, si bien que leur ensemble peut tre considr
comme caractristique dune substance bien dfinie. En particulier, le domaine spectral
Gillet Steve, D.Sc.
-71-
La spectromtrie.
compris entre 650 et 1350 cm-1, appele rgion des empreintes, prsente un spectre
complexe qui rsulte dinteractions entre liaisons voisines : il dpend donc de la structure
mme du squelette de la molcule. Linterprtation complte du spectre dans cette zone est
rarement possible en raison de sa complexit. Cependant, cette complexit mme conduit
un spectre caractristique de chaque substance, ce qui est extrmement utile pour
lidentification de la substance par comparaison. Quelques groupements fonctionnels
importants ont, en outre, des vibrations caractristiques dans cette zone, notamment :
-
Vibration de valence de C-O-C des esters et des thers vers 1200 cm-1.
Des groupements organiques tels que SO42-, PO43-, NO3-, CO32- absorbent galement
en dessous de 1200 cm-1.
En analyse fonctionnelle, c'est--dire pour identifier des groupements, les tables et
-72-
La spectromtrie.
lchantillon dans la cellule de mesure avec la substance pure dans la cellule de rfrence,
seules les bandes des impurets apparaissent. En gnral, on peut dire que la limite de
dtection atteinte est loin dtre aussi basse quen absorption UV. En moyenne, on ne
dpasse gure le dixime de pourcent en poids pour une paisseur de cuve de 1 cm. Il
existe cependant des cas favorables, comme la recherche dune impuret fortement
absorbante prsente dans un solvant qui lest peu.
Analyse quantitative
En principe, lanalyse quantitative par absorption IR repose, comme dans le cas de
labsorption atomique et de labsorption UV-Vis., sur la loi de Beer-Lambert. En pratique,
toutefois, la loi de Beer-Lambert est, le plus souvent dans le cas prsent, sujette des
carts pour les raisons suivantes :
La condition de monochromaticit : difficile respecter parce que
-
les bandes dabsorption IR sont nettement plus fines que les bandes dabsorption
UV-Vis.
-73-
La chromatographie et
l'lectrophorse.
La chromatographie et l'lectrophorse.
2.1. Introduction
Dfinition
La
chromatographie,
mthode
danalyse
physico-chimique,
spare
les
constituants dun mlange (les soluts) par entranement au moyen dune phase mobile
(liquide ou gaz) le long dune phase stationnaire (solide ou liquide fix), grce la
rpartition slective des soluts entre ces deux phases. Chaque solut est donc soumis
une force de rtention (exerce par la phase stationnaire) et une force de mobilit (due
la phase mobile).
-74-
La chromatographie et l'lectrophorse.
En rsum
Les diffrents principes de chromatographie rsultent du fait que lon a privilgi un
des facteurs suivants, afin de sparer des composs constituant un mlange :
Facteur
Technique chromatographique
Chromatographie de partage
Taille et forme
Chromatographie dexclusion
Polarit
Charge lectrique
Groupement datomes formant des sites
particuliers
Chromatographie dadsorption et
dadsorption en phase inverse
Chromatographie par change dions
Chromatographie daffinit
-75-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Il est important de noter quil est possible de dterminer les volumes en fonction
du dbit et du temps, en effet, V = d.t, avec d = dbit (ex. : Ve = d.tr). Ds lors dans la suite
de notre discussion, on parlera indiffremment, par exemple, de temps de rtention et
de volume dlution, puisqu dbit donn, lun est directement proportionnel lautre.
Le temps de rtention tr (le volume dlution Ve) est le temps (le volume) que
met la substance, de linjection jusqu la sortie de la colonne. Ce paramtre dpend
beaucoup de lluant, autrement dit de la phase mobile. Ainsi, un constituant peut tre
beaucoup moins retenu par lajout dun luant dune plus grande force. De plus, la rtention
dune substance dpend du choix de la phase stationnaire.
-76-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Les molcules du solut ne passent pas tout le temps tr dans la phase stationnaire.
Elles consacrent le temps tm parcourir les vides et interstices de la colonne. En pratique,
cette dure comporte galement le temps de balayage des volumes de linjecteur, du
dtecteur et des tuyaux de raccordement, volumes quil convient de rduire au maximum,
mais qui ne peuvent tre compltement limins. Ce temps tm, qui est en quelque sorte le
temps de rtention dun compos non retenu, est appel temps mort.
En soustrayant ce temps mort du temps de rtention, on obtient le temps de rtention
relatif tr, appel aussi temps de rtention rduit. Ce temps de rtention rduit tr mesure le
temps pass par la substance sur la phase stationnaire, et il est donc li au phnomne
de rtention. De mme, il est bien entendu possible de dterminer un volume dlution rduit
Ve en soustrayant au volume dlution Ve le volume mort Vm.
Ve = Ve Vm et tr = tr tm
Coefficientdedistribution
-77-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Il est possible de dmontrer (mais nous le ferons pas) que Wb (), la largeur du pic
la base (figure 5.9), est gal
4.t R
N
plus le pic est fin, par contre, plus le temps de rtention est grand, plus la pic est large
(ce qui correspond bien ce que nous venons de discuter ci-dessus).
-78-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Surfacedespics
La surface des pics, c'est--dire lintgrale de laire sous la courbe dun pic dlution,
permet de mesurer la concentration dune substance, pour autant que la rponse du
systme soit proportionnelle la concentration de lchantillon.
Sparationdespics
-79-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Plaque
Une plaque, sur laquelle est fix le support solide, sous forme dune mince pellicule,
est trempe dans un bain de phase mobile, dans une cuve ferme, permettant la saturation
de lair par la phase mobile. Cette dernire remonte le long de la plaque par capillarit.
Figure 2.3.
mobile)
que
sont
dposs
les
Rapportfrontal
On appelle rapport frontal, RF (ou rfrence front , coefficient de migration ), le
rapport Distance parcourue par le solut / Distance parcourue par le solvant. Le
schma de la figure 2.4 montre comment calculer le RF dans le cas dune chromatographie
liquide ascendante.
Figure 2.4. : Schma montrant comment
dterminer
le
rapport
frontal
dune
y parcourue
x / y
Un solut trs soluble dans la phase fixe aura un RF faible, alors quun solut
trs soluble dans la phase mobile aura un RF lev et proche de 1.
Chromatographiebidimensionnelle
Dans le cas o le mlange contient des soluts de mobilits voisines, on peut
augmenter le pouvoir sparateur en ralisant une chromatographie bidimensionnelle : sur
le mme support, on ralise une premire chromatographie laide dun systme de
solvants, puis une deuxime laide dun second systme de solvants, dans une direction
perpendiculaire la premire (figure 2.5).
-80-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Figure
2.5.
liquide-liquide
Chromatographie
bidimensionnelle
classique
avec
un
certain
Thorie de la partition
La distribution dun solut A entre deux solvants non-miscibles, lun aqueux (Saq),
lautre organique (Sorg), relve de lquilibre AS aq ' ASorg . La constante dquilibre, qui est
appele coefficient de partage ou coefficient de distribution , est gale
[ AS org ]
[ AS aq ]
. Cest lquation de Nernst pour le partage dune substance entre deux phases
-81-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Solvants
Les deux solvants sont caractriss par leur diffrence de polarit et leur non
miscibilit. Gnralement, le solvant fixe est polaire et trs souvent, ce sera leau. Le
solvant mobile sera quant lui non polaire et constitu dun mlange choisi selon les
ncessits de la sparation.
Technologie
Comme nous lavons dj indiqu, cest une technique essentiellement qualitative.
-
Sur colonne : La colonne est remplie dun support inerte imprgn du solvant fixe, le
tout constituant la phase stationnaire. Or, les supports sont rarement totalement
inertes, il est donc difficile de dterminer ce qui relve du partage et de ladsorption
(dont nous parlerons ultrieurement). Autrement dit, les soluts vont tre spars
selon deux mcanismes : le partage et ladsorption.
Sur couche mince : le support inerte du liquide qui constituera la phase fixe est coul
sur une plaque de verre. Les solvants migreront par capillarit.
long
et
elles
sont
lues
plus
rapidement.
-82-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Types de gels
-
Gels hydrats (les plus utiliss) : le SphadexTM (G10 G200) qui sont des
polyosides bactriens de type dextran et le SpharoseTM (agarose). Le gain deau
correspond au nombre de grammes deau fixs par gramme de substance sche.
molcules,
totalement
exclues
sont
Les grosses molcules (dont le diamtre est suprieur celui des pores) sont
exclues et sont donc toutes lues les premires, au niveau du volume mort (Vm). Les petites
et moyennes molcules sont lues plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration
est gne. Une molcule totalement incluse sera lue avec un volume V* = Vm + Vi, o Vi
est le volume deau interne aux granules de gel. Les soluts sont donc lus dans lordre
inverse des masses molculaires.
-83-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Si 0 < K < 1, le solut est partiellement inclus. Le taux dinclusion augmente avec K.
Si K > 1, le solut est non seulement inclus, mais aussi adsorb par le gel.
Adsorption vs absorption
Ladsorption est un phnomne de surface par lequel des molcules se fixent sur
la surface dun adsorbant, selon divers processus plus ou moins intenses. Le phnomne
inverse, par lequel les molcules adsorbes sur une surface sen dtachent se nomme la
dsorption. Il existe diffrents types dadsorption :
-
-84-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Les adsorbants
Ce sont des solides trs diviss (ladsorption est un phnomne de surface), ainsi,
1 g dalumine pour chromatographie peur reprsenter une surface de lordre de 100 m2.
On peut distinguer :
-
ou lalumine, alors que dautres, comme le charbon actif ou les phases inverses (dont nous
parlerons plus en dtail ultrieurement) ont une faible polarit.
Les solvants
Pour un systme chromatographique donn (caractris par une phase stationnaire,
une temprature, une pression et un solut), le pouvoir luant dpend de la polarit du
solvant. Prenons, par exemple, une phase stationnaire constitue dun adsorbant polaire (le
gel de silice), dun solut polaire adsorb et dun solvant polaire (la propanone). Le solvant
polaire possde un pouvoir luant lev, fortement adsorb, il dplace le solut. En
revanche, un solvant apolaire comme lther de ptrole possdera un mauvais pouvoir
luant, mais entranera un solut apolaire. Le tableau suivant reprend quelques solvants
classs dans lordre croissant de polarit (srie luotropique).
ther de ptrole
Dichloromthane
Propan-1-ol
Cyclohexane
ther dithylique
thanol
Ttrachloromthane
Trichloromthane
Mthanol
Trichlorothne
thanoate dthyle
Eau
Tolune
Pyridine
Acide thanoque
Benzne
Propanone
Technologie
La chromatographie dadsorption est applique selon diffrentes techniques :
-
Sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coul sur une plaque
(verre, aluminium, plastique), mlang un liant (pltre).
-85-
La chromatographie et l'lectrophorse.
CH3
O
OH
Si
O
Si
O
(CH2)17
CH3
Si
(CH2)17
CH3
CH3
Figure 2.8. : Phase normale et phase inverse : De gauche droite sont reprsentes : Une silice non
greffe (phase normale), une silice greffe organosilane de type C18 (phase inverse) et finalement, une
silice greffe par une chane aliphatique de type C18 galement (phase inverse).
Technologie
Dans
la
pratique,
cette
chromatographie
ne
sapplique
quen
CLHP
(Chromatographie Liquide Haute Performance ou Pression) que lon dsigne souvent sous
son sigle anglais HPLC (pour High Pressure Liquid Chromatography). Cette technique
sapplique bien la sparation de petites molcules peu polaires : lipides, acides amins,
peptides.
-86-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Rsine cationique
Cest une rsine qui change rversiblement des cations, elle est donc charge
ngativement. Le groupement ngatif, habituellement la base conjugue dun acide
(carboxylique ou sulfonique), est li la rsine (souvent un polymre organique) de faon
covalente et est en gnral sous forme protonne avant utilisation (cest donc le cation H+
qui est alors chang).
Rsine-G- / X+ + cation+ ' Rsine-G- / cation+ + X+
Le tableau suivant reprend les caractristiques des deux types de rsines cationiques
les plus utilises.
Rsine
Groupement
Fortement acide
-SO3H
Faiblement acide
-CO2H
Rgnrateur
pH dutilisation
HCl ou H2SO4
1-13
en excs (3 q.)
HCl ou H2SO4
4-13
(1 q.)
Cations changs
Mtaux lourds
(ex. : Na+, Cu2+)
Cations valences
multiples
Rsine anionique
Cest une rsine qui change rversiblement des anions, elle est donc charge
positivement. Le groupement positif, habituellement une amine ou un ammonium est li la
rsine (souvent un polymre organique) de faon covalente.
Rsine-G+ / Y- + anion- ' Rsine-G+ / anion- + Y-
Le tableau suivant reprend les caractristiques des deux types de rsines anioniques
les plus utilises.
Rsine
Groupement
Fortement basique
-N+(CH3)3
Faiblement
basique
-N(CH3)2
Rgnrateur
NaOH en excs
(3 q.)
HCl ou H2SO4
(1,5 q.)
pH dutilisation
1-12
1-4
Anions changs
Anions acides
faibles et forts
Anions dacides
forts
Technologie
La chromatographie par change dions se pratique le plus souvent sur colonne,
mais la mthode peut tre transpose sur couche mince. Du papier changeur dions est
-87-
La chromatographie et l'lectrophorse.
galement commercialis. Enfin, lchange dions peut tre ralis en batch : la rsine
est mise en suspension dans la solution et agite mcaniquement.
Echangeurs anioniques :
Echangeurs cationiques :
-88-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Etape de purification
En continuant faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molcules
contaminantes sont limines et lues.
Etape dlution
La molcule est finalement dcroche de la colonne et recueillie dans lluat.
par
chromatographie
Phase stationnaire
Le gel daffinit est constitu dun effecteur fix par covalence un support
(carboxymthylcellulose, SephadexTM, gel de polyacrylamide) par lintermdiaire dun bras de
fixation ( spacer en anglais), le plus souvent constitu dune chane carbone de
longueur variable, choisie de manire limiter les contraintes striques. Les effecteurs
peuvent tre de diffrents types :
-
-89-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Elution
Elle peut tre ralise de diffrentes faons :
-
Instrumentation
Dans tous les appareils CLHP, on retrouve un ensemble de modules relis entre eux
par des tubes de faible diamtre. Une, ou plusieurs pompes assurent le dbit du solvant
dlution. En aval de linjecteur se trouvent la ou les colonnes o seffectuera la sparation,
-90-
La chromatographie et l'lectrophorse.
puis au bout de la chane se trouve le dtecteur (figure 2.10). Par la suite, nous allons
aborder un peu plus en dtail chacun des composants essentiels dune CLHP.
Figure 2.10. : Schma gnral dun systme
CLHP : Les modules principaux sont :
a)
b)
c)
d)
Pompes
Nous avons vu que la CLHP fonctionnait dbit constant, hors, une simple pompe
ne permet que davoir un dbit puls, puisquil y a une phase daspiration du solvant, puis
une phase dexpulsion du solvant. Ds lors que le dbit de la pompe est puls, la ligne de
base ne sera pas continue, ce qui ne nous intresse pas. En pratique, donc, on travaille avec
des systmes de pompage plus complexe, tel que celui reprsent dans la figure 2.11. La
came de forme cardiode fait fonctionner les deux pistons, en quelque sorte, en
opposition de phase, de sorte que le dbit total, constitu de la somme des dbits de
chaque piston est continu.
le
dbit
total.
On
remarque
que
le
-91-
La chromatographie et l'lectrophorse.
des bulles lintrieur du systme, ce qui peut provoquer lapparition de pics fantmes,
le dsamorage de la pompe, etc Il convient donc dliminer au maximum lazote et
loxygne qui peuvent tre prsents dans les solvants. Pour cela, il existe plusieurs
techniques :
-
Filtration sous vide : cette technique permet en outre de se dbarrasser des petites
impurets qui pourraient se trouver dans le solvant. Il convient toutefois dviter de
filtrer des mlanges de solvants dans lesquels un des composant serait fortement
volatil, puisquil risquerait, alors, dy avoir un changement important de la composition
du mlange.
Tube poreux : cette technique consiste faire passer la phase mobile dans un tube
poreux au travers dune enceinte sous vide. Le tube poreux tant conu pour ne
laisser passer que les gaz, lluant est progressivement dgaz.
Injecteur
Il est constitu dune vanne haute pression (manuelle ou non) plusieurs voies dont
le fonctionnement se droule en deux tapes :
-92-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Colonne
La colonne est gnralement un tube en acier de 5 30 cm de longueur et de
diamtre de lordre de 5 mm. La phase stationnaire est constitue de grains
sphriques calibrs de diamtre allant de 5 10 m. La nature de la phase est fonction
du type de chromatographie liquide que lon souhaite raliser (exclusion, adsorption, ).
Dtecteurs
Typesdedtection
Principauxparamtres
Bruit : Qui se dfinit comme la variation du signal de sortie dun dtecteur non attribuable au
passage du solut dans la cellule.
a) bruit court terme : zigzags sur la ligne de base
b) bruit long terme : pics et valles
c) drives : dviation constante de la ligne de base vers le haut et le bas de lchelle.
Sensibilit :
a) absolue : mesure par un dplacement sur tout lchelle de lenregistreur lorsque
la sensibilit du dtecteur est maximale sans interfrence de bruit de fond.
b) relative : concentration minimale de solut dtectable pour un signal au moins
gal deux fois la hauteur du bruit de fond.
La sensibilit peut changer avec la nature du bruit de fond (type de dtecteur), avec
le dbit (polarographie) et la temprature ambiante. En outre, le volume mort, llargissement
des pics dans la cellule et les raccords peuvent augmenter la quantit minimale dtectable
dun chantillon.
Linarit : Rgion o il y a une proportion linaire entre le signal de sortie et la concentration
du solut.
-93-
La chromatographie et l'lectrophorse.
SpectroscopiedanslUVetleVis.
Figure 2.12. : Schma dune cuvette de dtecteur UV-Vis. : On voit que la forme en Z du conduit dans
lequel circule lluant permet de suivre labsorbance de ce dernier en continu avec un trajet optique
relativement important (ce qui ne serait pas le cas dune simple lecture sur la tranche du tube). A noter que
les fentres de la cellule sont en quartz.
-94-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Fluorimtrie
Mesure lnergie de fluorescence dun solut excit par une radiation ultraviolette.
Lmission de lumires est mesure angle droit du faisceau dexcitation. Ce procd sert
pour les composs fluorescents ou les drivs fluorescents de certains composs.
Avantages :
- Encore plus sensible que le dtecteur UV-Vis.
- Trs spcifique.
- Peu sensible aux variations de dbit et de temprature.
- Peut tre utilis en mode gradient dlution.
Inconvnients :
- Les substances doivent tre fluorescentes.
- Sensibilit loxygne dissous dans la phase mobile (quench = dsactivation)
Spectromtriedemasse
Cfr. 3me BBM.
-95-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Dans les deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui vhicule les soluts ; la phase mobile
est constitue du gaz vecteur et des soluts gazeux.
Instrumentation
Un appareil de chromatographie en phase gazeuse comporte trois parties :
injecteur, colonne et dtecteur (figure 2.13) travers lesquels un gaz vecteur entrane les
substances dun mlange sparer. Le gaz vecteur le plus utilis est lhlium, les autres
sont lhydrogne, lazote ou largon. Il doit tre trs pur et surtout ne contenir ni oxygne, ni
eau. Le dbit du gaz est ajust par un rgulateur.
Figure
2.13.
Schma
dun
appareil
chantillons
Les limites de sensibilit sont, selon les appareils, de lordre du nanogramme et
mme du picogramme. Le traitement de lchantillon varie selon les substances analyses :
-
Injecteur
Il sert lintroduction du mlange analyser dans la colonne. Cette opration est
faite :
-
-96-
La chromatographie et l'lectrophorse.
idale est celle qui est 20 plus leve que le point dbullition de la substance la moins
volatile.
Le choix de linjecteur est dict par le type de colonne utilise (remplie ou
capillaire) et par la nature des produits sparer (leur rsistance la dcomposition
lorsquils sont soumis de hautes tempratures).
Il y a essentiellement deux techniques dinjection, si on ne tient pas compte de la
vanne boucles : la vaporisation directe dans la colonne et lintroduction dans la
colonne dune fraction de ce qui est inject (split / splitless). Cette dernire technique
est utilise avec les colonnes capillaires.
Pour viter les dcompositions catalytiques causes par les mtaux qui composent le
corps de linjecteur, on y place un tube de verre dans lequel est introduit le mlange
analyser.
Injectionchaudavecvaporisationdirectedanslecorpsdelinjecteur
Injectionchauddanslacolonneavecvaporisationdirecte
Injecteursplit/splitless
Les injections sur colonnes capillaires ou mgabores doivent obir trois critres
importants :
-
-97-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Mnager la colonne.
du volume inject. Cette fraction est ajustable et peut atteindre 1 / 200. Il est aussi quip
dune purge de septum qui joue deux rles :
-
Injectionfroidsuiviedunebrusquemontedelatemprature
Cette mthode est utilise lors de la sparation de substances trs fragiles. Cette
technique permet la condensation lentre de la colonne de produits qui ne supportent pas
les hautes tempratures des injecteurs conventionnels. Une fois linjection faite, la
temprature de linjecteur est trs rapidement leve de faon ne chauffer les substances
injectes que sur un temps beaucoup plus court que celui pass dans linjecteur chaud.
La temprature
On adopte gnralement une temprature lgrement suprieure au point de
vaporisation du constituant le moins volatil. Dun point de vue technique, la colonne est
maintenue dans un four bain dair thermostat.
Les colonnes
Elles peuvent tre mtalliques, en plastique pour des sparations basse
temprature, en verre et joints Tflon. Diverses formes ont t utilises : rectilignes, en U,
en spirales (la plus rpandue).
Il existe deux grands types de colonnes avec des variantes (figure 2.16) :
-
-98-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Vous
remarquerez
que
les
Tube : acier inoxydable (assez inerte et bon conducteur de chaleur) ou verre (inerte
mais mauvais conducteur de chaleur).
Longueur : de 15 100 m.
-99-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Choixdesphasesstationnaires
Exemples
Phases stationnaires
SPB-octyl
Non polaires
Poly(mthylsiloxane), SE-30
SPB-5, PTE-5, SE-54
Polaires
Poly(mthylphnylsiloxane)
Poly(cyanopropylmthylsiloxane)
ctones
Polarisables
Alcnes aromatiques
Poly(cyanopropylphnylsiloxane)
TCEP
Les dtecteurs
Dtecteurionisationdeflamme(FIDpourFlameIonizationDetector)
Trs sensible.
-100-
La chromatographie et l'lectrophorse.
-101-
La chromatographie et l'lectrophorse.
-102-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Donc, la mobilit lectrophortique et les effets de tamisage vont tous deux rendre le
dplacement de cette protine anormalement lent et donc lui donner une masse molculaire
apparente plus leve.
On peut galement imaginer le problme que va poser l'analyse de deux protines
globulaires de diffrentes tailles, mais avec des diffrences de charges qui
compensent, de sorte que les deux protines vont migrer la mme vitesse dans le gel.
Une technique permettant d'viter ces problmes consiste raliser l'lectrophorse
dans des conditions dnaturantes, ce dont nous allons parler ultrieurement.
En rsum, la technique d'lectrophorse permet, entre autre, de :
De sparer des protines pour les rvler par la technique de Western blot
(raction avec un ou plusieurs anticorps) par exemple.
De sparer des protines sur des gels bi-dimensionnels, selon 2 paramtres : point
isolectrique (isofocalisation), puis masse molaire
De squencer l'ADN
De sparer des acides nucliques pour les analyser par la technique de Northern
blot (ARN) ou de Southern blot (ADN)
D'un dtergent anionique fort (agent dnaturant) : le sodium dodcyl sulfate (SDS).
Ce dtergent se lie et dnature la plupart des protines, avec environ 1,4 g de SDS
li par gramme de protine (soit environ 1 SDS / 2 acides amins). Comme il y a une
charge ngative par molcule de SDS, sa liaison masque toutes les charges de la
protine, et lui confre une charge globale ngative leve. En outre, les complexes
protine/SDS ont gnralement une forme allonge cylindrique. Comme la quantit
de SDS li par unit de masse de la protine est constante, la densit de charge
globale de toutes les protines est similaire, donc la mobilit lectrophortique est
-103-
La chromatographie et l'lectrophorse.
seulement dtermine par les effets de tamisage. Le SDS limine galement les
diffrences dues la forme des protines au niveau des effets de tamisage, puisque
toutes les protines ont la mme forme gnrale cylindrique. La mobilit devient
seulement une fonction de la masse molculaire de la protine, et non de sa
forme.
Figure 2.18. : Sodium dodcylsulfate (SDS) : Dtergent anionique possdant une tte hydrophile
de type sulfate et une queue lipophile carbone.
D'un agent rducteur : le -mercaptothanol qui rduit les ponts disulfures, ce qui
permet une dnaturation complte des protines et leur permet d'adopter la forme
cylindrique dont nous venons de parler. Des masses molculaires apparentes
peuvent tre obtenues sous des conditions non rductrices, mais elles ne doivent
tre considres que comme des estimations. L'analyse de protine la fois en
prsence et en absence d'agent rducteur peut fournir des informations importantes
sur la structure des sous-units d'une protine. Une protine multimrique dont les
sous-units sont maintenues ensembles par des ponts disulfures peut tre rsolue en
ses diffrents composants individuels lorsque l'agent rducteur est ajout. Si les
sous-units sont maintenues ensemble par des attractions intermolculaires non
covalentes, les protines vont luer de la mme faon dans des conditions
dnaturantes (ce qui va liminer les interactions des sous units), en prsence ou en
absence d'agent rducteur. Pour dterminer la composition en sous units d'une
protine, lorsqu'elles sont maintenues ensembles par des interactions non
covalentes, l'lectrophorse doit tre ralise en absence d'agent dnaturant.
En rsum :
Les protines sont dnatures : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
Les protines n'ont plus de ponts disulfures : elles sont sous une forme monomrique
Les protines de l'chantillon sont ensuite spares par une lectrophorse sur gel
-104-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Figure
2.19.
Diffrentes
molcules
Acrylamide : monomre
Une protine globulaire (assimilable une sphre) migre d'autant moins que sa
masse molaire est leve.
Pourcentage d'acrylamide
7,5
45 400
10
22 300
12
13 200
15
2,5 - 100
Le gel est coul, en deux tapes, entre des plaques de verre fixes sur un support.
La partie infrieure du gel, appel "gel de migration" (running gel) est celui au niveau
duquel la sparation va avoir lieu. Son pH se situe habituellement vers 8,7 et sa
concentration en acrylamide (entre 7 et 15 %, en gnral) dpend de la taille des
-105-
La chromatographie et l'lectrophorse.
protines que l'on dsire analyser. La partie suprieure du gel, dans lequel un peigne est
enchss pour former des puits, est appel "gel de concentration" (stacking gel). Son pH
se situe vers 6,5 et sa concentration en acrylamide est de l'ordre de 2 4 % seulement.
L'utilit d'un gel divis en deux parties rside dans le fait que les protines vont se
dplacer rapidement dans le gel de concentration et s'accumuler l'interface avec le gel de
migration avant de pntrer ce dernier. Cela accrot la concentration des protines avant
qu'elles n'entrent dans le gel de migration, ce qui augmente la rsolution. Comment cela
marche-t-il ?
Lorsque les lectrodes sont branches, les ions glycine, de la partie suprieure du
rservoir pH environ 8,7 (cf. composition du tampon d'lectrophorse ci-dessous), qui ont,
ce pH, une charge partielle moyenne ngative, entrent dans le gel de concentration. Les
ions du tampon du gel de concentration continuent de se dplacer dans le gel de
concentration, mais les ions glycines, eux, lorsqu'ils se trouvent pH 6,5, deviennent des
zwitterions avec une charge nette de zro et donc cessent de se dplacer. La rsistance
lectrique dans le gel de concentration augmente alors, puisque le nombre d'ions se
dplaant travers le gel de concentration diminue. Pour maintenir le courant constant dans
le circuit, il va y avoir une augmentation locale du potentiel dans le gel de concentration
(puisque suivant la loi de Ohm, V = iR). Cela va provoquer une migration rapide des
protines et leur accumulation dans une tranche trs troite juste derrire les ions Cl- dans le
gel de concentration (lesquels sont en front de migration, puisqu'ils possdent la plus grande
densit de charge et mobilit lectrophortique de tous les ions se trouvant dans le gel de
concentration). Les protines ne vont pas dpasser les ions Cl- puisque sils le faisaient, ils
seraient immdiatement ralentis, ne se trouvant plus dans une zone appauvrie en porteurs
de charges et donc de haut potentiel.
A l'interface gel de concentration / gel de migration, les protines ne peuvent
toutes se dplacer la mme vitesse cause de l'effet de tamisage du gel plus
concentr et donc elles se sparent dans le gel de migration. La glycine finit par entrer dans
le gel de migration, si on suppose qu'elle est totalement charge pH 8,7, dpasse les
protines et comble la dficience de charge qui tait apparue dans le gel de concentration.
Aprs polymrisation du gel, le peigne est retir formant ainsi des puits. La taille et le
nombre de dents des peignes sont variables, ce qui permet de dposer des volumes allant
de 20 l 200 l d'chantillon de protines sparer. Les plaques de verre contenant le gel
polymris sont places dans une cuve d'lectrophorse.
Du tampon d'lectrophorse conducteur (lectrolytes) est mis dans la cuve et la
migration s'effectue sous l'action d'un champ lectrique :
-106-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Les chantillons de protines dnatures sont dposs dans les puits. La plupart des
protines n'absorbent pas la lumire dans les longueurs d'onde visibles, elles ne seront donc
pas visibles durant la migration. Pour s'assurer que les protines ne soient pas lues dans
le rservoir infrieur (analyse trop longue) un colorant anionique de faible masse
molculaire, le bleu de bromophnol, est ajout aux protines avant qu'elles ne soient
places sur le gel. L'lectrophorse est arrte lorsque le colorant approche de l'extrmit
infrieure du gel de migration.
-107-
La chromatographie et l'lectrophorse.
-108-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Electrophorse 2D
Cette
technique
consiste
typiquement
soumettre
les
protines
une
35
Western blot :
Aprs une lectrophorse standard sur plaque, le gel est recouvert d'une membrane
de nitrocellulose. Le sandwich de gel et de membrane est replac dans une chambre
d'lectrophorse, de sorte que les protines migrent du gel vers la nitrocellulose, o elles se
lient irrversiblement. La membrane peut alors tre te et trempe dans une solution
contenant un anticorps de la protine d'intrt. Ce complexe protine-anticorps, form sur la
membrane peut alors tre dtect par ajout d'un anticorps marqu et qui se lie sur le premier
anticorps utilis (celui qui est prsent li la protine d'intrt).
Figure 2.24. : Schmatisation du principe de
fonctionnement du western blot :
-
Un
anticorps
primaire
(anti-protine
-109-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Outre l'utilisation d'un gel d'agarose la place d'un gel de polyacrylamide, l'autre
diffrence notable entre la sparation de protines et la sparation d'ADN par lectrophorse
rside dans la gomtrie de la cuve lectrophorse, qui est, en gnral, horizontale dans
le cas de l'ADN.
-110-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Applications et avantages
Estimation de la taille d'un fragment d'ADN aprs une digestion par des enzymes
de restriction.
Sparation de fragments ADN digrs avant Southern blot ou d'ARN dans le cas du
Northern Blot
-111-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Rvlation de l'ADN
La mthode la plus utilise est la rvlation au bromure d'thidium (BET), qui est un
agent d'intercalation fluorescent couramment utilis comme marqueur d'acides nucliques
en laboratoire de biologie molculaire. Lorsqu'il est expos des rayonnements UV, il prend
une coloration rouge-orange, 20 fois plus intense lorsqu'il est li l'ADN. Cet effet est du
l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement.
-112-
La chromatographie et l'lectrophorse.
Gnralits
Dans cette technique, le gel classique est remplac par un tube capillaire ouvert
ses extrmits, en verre de silice (quartz fondu, verre extrmement pur appel parfois Silice
UV) de trs faible diamtre (30 100 m) d'une longueur variant de 0,3 1 m et rempli d'une
solution tampon. Les extrmits plongent dans deux rservoirs d'lectrolyte, auxquels on
applique une diffrence de potentiel pouvant atteindre 30 kV pendant le temps ncessaire.
Figure
2.29.
Schma
gnral
dune
L'intensit du courant, dans ces conditions, ne dpasse pas 100 A, soit une
puissance dissipe d'un maximum de 3 W, ce qui limite l'chauffement du capillaire qui doit
nanmoins tre plac dans une enceinte thermostatise. L'lectrolyte est un mlange
soigneusement filtr et dgaz contenant divers additifs.
Un dtecteur est plac un peu avant l'extrmit du capillaire. En mode de dtection
UV, le capillaire sert directement de cellule de mesure de l'absorbance. On vite ainsi tout
volume mort et le mlange des composs spars. Le trajet optique tant extrmement
faible, on peut l'augmenter en utilisant un capillaire avec bulbe ou en faisant la dtection
l'intrieur d'un Z, mais ces deux procds diminuent bien entendu la rsolution de la
mthode. On peut galement raliser une dtection lectrochimique, des lectrodes tant
alors insres dans le capillaire. Finalement, la dtection peut se faire par spectromtrie de
masse.
-113-
La chromatographie et l'lectrophorse.
nature du milieu et en particulier de son pH. Cette charge provient de la fixation, leur
surface, d'ions contenus dans le milieu tampon. Pour des ions de tailles comparables, les
vitesses de migration sont plus grandes s'ils sont porteurs de charges plus importantes. Pour
chaque ion, la vitesse de migration rsulte de l'quilibre entre la force lectrique FE qui
s'exerce dans le champ E sur la particule de charge Q (F = QE), et les forces de frottement
qui dpendent de la viscosit du milieu. Pour les ions minraux, les temps de migration
dpendent de leur conductivit limite quivalente.
En lectrophorse capillaire, on observe que les constituants d'un mlange se
sparent dans le temps par effet de deux facteurs principaux appels mobilit
lectrophortique et flux lectro-osmotique, qui sont dfinissables pour les ions, les
molcules, les particules ou les micelles.
Mobilit lectrophortique
La mobilit (ou migration) lectrophortique Ue correspond au dplacement des
molcules charges, dans un lectrolyte suppos immobile, vers les lectrodes de
signe oppos. Ue correspond au quotient de la vitesse de migration de l'ion, ve, par la valeur
du champ lectrique, E. Ue = ve/E = ve.L/V, o L reprsente la longueur du capillaire et V la
diffrence de potentiel applique ses extrmits. U (cm2.V-1.s-1) s'obtient partir d'une
mesure exprimentale faite au dpart d'un lectrophorgramme. On affecte la mobilit Ue
le signe (+) ou (-) selon la nature de la charge porte; elle est nulle pour une espce sans
charge nette.
Flux lectro-osmotique
Le second paramtre qui contrle le mouvement des soluts est appel flux lectroosmotique Uos. Il est d l'coulement de l'lectrolyte par effet de la paroi interne du
capillaire, qui est tapisse de groupements silanols qui se dprotonnent si le pH est
suprieur 2 pour former une couche polyanionique fixe. Les cations du milieu tampon,
qui viennent recouvrir la paroi, se mettent en mouvement ds qu'un champ lectrique est
appliqu au capillaire. Les ions du tampon et les ions H+ (sous forme d'ions H3O+)
entranent les molcules lectrolytiques de l'chantillon. Ainsi, mme un anion peut se
dplacer vers l'lectrode ngative. Ce dplacement de l'lectrolyte, produit par la charge
des ions et le potentiel appliqu, peut tre contrl en modifiant la tension, le pH ou en
introduisant des additifs.
On dfinit Uos par une relation calque sur la prcdente, vos reprsentant la vitesse
lectro-osmotique des molcules neutres de la phase mobile : Uos = vos/E = vos.L/V.
-114-
La chromatographie et l'lectrophorse.
cration
du
flux
lectro-
osmotique.
Pour calculer Uos on doit dterminer vos. Celle-ci est obtenue partir du temps de
parcours que met un marqueur neutre pour traverser le capillaire. On choisit une molcule
organique, non polaire au pH de l'lectrolyte utilis et facilement dtectable par absorption
dans le proche UV, par exemple.
Dans les appareils d'lectrophorse capillaire, on met profit le flux lectroosmotique pour imposer l'ensemble des espces charges de l'chantillon une mme
direction de migration dont le sens va de l'anode (+) vers la cathode (-). L'accroissement
de vitesse du flux lectro-osmotique vos diminue l'cart entre les temps d'arrive des ions,
allant dans le mme sens, au niveau du dtecteur.
L'emploi de tubes capillaires en silice fondue, partiellement dsactivs par un
revtement interne, permet de moduler le flux lectro-osmotique. Ainsi, avec une paroi
rendue hydrophobe, comme en CLHP, par un traitement avec un alkylsilyle, les protines
deviennent sparables, alors qu'elles ont tendance rester accroches la paroi lorsque
celle-ci n'est pas traite. A la limite, on peut ne rcuprer qu'une seule catgorie d'ions, en
fonction de la direction du champ appliqu.
Mobilit apparente
Le flux lectro-osmotique, responsable d'une circulation de la phase mobile vers la
cathode (-), est donc prendre en compte pour valuer la vitesse relle de migration des
molcules charges. On observe que chaque ion a une vitesse apparente vapp facilement
mesurable partir de laquelle on dfinit une mobilit lectrophortique apparente Uapp
telle que : Uapp = Uos + Ue. En dsignant par L, la longueur du capillaire, et par V la tension
applique, le temps de migration t est donn par :
-115-
La chromatographie et l'lectrophorse.
t=
L2
Uapp V
Expression que l'on retrouve facilement partir de Uapp = vapp.L/V et vapp = L/t.
Pour simplifier la comprhension de ce phnomne, on pourrait assimiler la migration
des molcules dans le capillaire une course de natation dans une rivire dont le courant
serait la transposition du flux lectro-osmotique. Si les nageurs vont leurs vitesses propres
d'un point amont un point aval, ils arriveront moins spars dans le temps que sils
remontent le courant de l'aval vers l'amont. Si le courant est moins rapide que la vitesse des
nageurs, ils effectueront le mme parcours, mais en mettant plus de temps. Enfin deux
troncs d'arbres (transposition de molcules neutres) partis au mme instant arriveront sans
que soit modifie la distance les sparant.
Instrumentation
Pour introduire l'chantillon dans le capillaire, deux procds d'injection sont utiliss :
-
-116-
La chromatographie et l'lectrophorse.
-117-
La chromatographie et l'lectrophorse.
N=
Uapp V
L2
ou N =
2
s
2D
L'efficacit peut atteindre 400 000 plateaux par mtre. La relation ci-dessus montre
qu'elle crot avec la diffrence de potentiel applique et que les macromolcules, dont les
facteurs de diffusion sont normalement plus petits que pour les petites molcules, conduisent
de meilleures sparations.
La mise au point d'une sparation revient trouver un milieu tampon adapt au
problme rsoudre. L'lectrophorse capillaire est comparable la chromatographie
liquide quant aux performances. Elle complte utilement cette dernire pour les sparations
de protines, d'enzymes, de sucres et d'oligonuclotides. La sensibilit est trs grande : on
connat des exemples de dtection de quelques milliers de molcules vraies. La quantit
requise d'chantillon est trs faible et la consommation de ractifs ou de solvants est
ngligeable.
Enfin, il est possible de runir lectrophorse capillaire et spectromtrie de
masse en ligne, ce qui a donn un intrt accru cette mthode pour l'analyse des
composs biologiques. L'effluent du capillaire est mlang un lectrolyte d'appoint avant
d'tre nbulis, ionis et enfin introduit dans le spectromtre de masse.
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