EVALUACION DE DOS DILUTORES PARA LA CRIOPRESERVACION DE SEMEN DE CABALLO PERUANO DE PASO Y SUS EFECTOS SOBRE LA MOTILIDAD ESPERMATICA E INTEGRIDAD FUNCIONAL DE MEMBRANA EVALUATION OF TWO EXTENDERS FOR THE CRYOPRESERVATION OF SEMEN PERUVIAN PASO HORSE AND ITS EFFECTS ON SPERM MOTILITY AND FUNCTIONAL INTEGRITY OF MEMBRANE Verdnica Orozco Chavez', Manuel Rosemberg Barton’, Alexei Santiani Acosta, Mirella Tomatis Kortodi, Humberto Rodriguez Landeo? RESUMEN La inseminacién artificial con semen criopreservado es una __ técnica empleada en los programas de mejoramiento genético del caballo peruano de paso. Para esto, es necesario diluir los espermatozoides ‘en medios apropiados, capaces de reducir o detener el metabolismo del espermatozoide y asi prolongar su vida fertil. La fertilidad del semen en estado congeiado es mas alta queladel semen en estado liquido después de 24 horas de almacenamiento, ya que, en este ultimo caso, se reduce de un 10% a un 35% por dia de almacenamiento (1, 2) Por tal razén, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de dos diferentes dilutores _desarrollados para criopreservar el semen equino, y de mantener la funcionalidad de espermatozoides de! caballo peruano de paso. Para ello, se colectaron seis muestras de semen proveniente de dos potros, para ser criopreservados (196 °C) ‘empleando dos dilutores comerciales: Botucrio-Botutech y EZ freezin-Animal Reproduction Systems. Se evalué la motiidad progresiva, asi como la integridad funcional de membrana plasmatica, mediante el test hipoosmético (HOS).’ Los resultados de la evaluacién de la _motilidad espermatica e integridad funcional de membrana fueron mayores (P<0.01) con el dilutor Botucrio-Botutech (65,42% y66,11%, respectivamente) en ‘comparacién con el dilutor EZ freezin - Animal Reproduction Systems (50,00% 56,96%, respectivamente). Estos fen coneluir que el resultados nos pert dilutor mas adecuado para conservar espermatozoides criopreservados de semen de caballo peruano de paso seria el dilutor Botucrio-Botutech. Palabras clave: caballo peruano de paso, _biotecnologia, © dilutor, criopreservacién, semen SUMMARY Attica insemination with cryopreserved semen is a technique used in breeding programs Peruvian Paso Horse. For this it is necessary to dilute the sperm in appropriate media, which might reduce or stop sperm metabolism and {hus to prolong their reproductive life The fertility of semen in a frozen state is higher than that of semen in liquid state after 24 hours of storage, since the latter is reduced by 10% to 35% per day of storage (1, 2). For this reason the aim of this study was to evaluate the effect of two different extender developed for equine semen cryopreservation, and maintaining sperm functionality Peruvian Paso Horse. For this purpose, 6 semen samples collected from 2 foals to be cryopreserved (-196°C) using two commercial extenders: 1.- Bolucrio- Botutech and 2.- EZ freezin - Animal Reproduction “Systems. Progressive motility was valued and_ functional integrity of plasma membrane by osmotic Hypo Test (HOS). The results of the evaluation of sperm motility and functional integnty of membrane, were higher (P_ <0.01) with diluter Botucrio-Botutech (65.42% and 66.11%) compared to the EZ diluter freezin - Animal Reproduction Systems Cientifica 8 (3), 2011 | 208ARTICULOS ORIGINALES| Verénica Orozco Chavez, Manuel Rosemberg Barrén, Alexei Santiani Acosta, Mirella Tomatis Korod, Humberto Rodriguez Landeo (50.00% and 59.96%). These results demonstrate that the extender best to conserve semen cryopreserved sperm Peruvian Paso Horse, would Botucrio- Botutech extender. Keywords: Peruvian Paso Horse, biotechnology, extenders, cryopreservation, semen INTRODUCCION Los métodos de conservacién del semen buscan reducir o detener el Metabolismo del espermatozoide _y asi prolongar su vida fértil Existen dos © métodos de _conservacién’ refigerado (0-15.6) y cropreservad C) La viabilidad espermatica del semen refrigerado (5°C) es capaz de mantenerse hasta por 48 horas de almacenamiento; sin embargo, para pode aplicar muchas de las ventajas de la inseminacién artificial, se requiere un largo periodo de almacenamiento, Esto se logra mediante la criopreservacion del semen (congelacién a -196 °C), por la cual se detiene el proceso metabdlico de los espermatozoides y permite un almacenamiento indefinido sin pérdida de la ferliidad (3, 4). Pese a esto, existe un alto porcentaje de potrs (26-40%) os_“espermatozoides _responden bremente a la. ctiopreservacion {5), por lo que se debs evaluar el porcentaje de motilidad espermatica de cada eyaculado después de realizar la dilucién y congelacion (6). ‘Al _respecto, _existen_numerosas Investigaciones en las que se reportan problemasde bajamotilidadespermatica poscongelacién, asi como la marcada Variabilidad que existe entre sementales (7, 8). Para realizar la criopreservaci6n de los espermatozoides, se evaluaron los dilutores “comerciales Botucrio- Botutech (BT) y EZ freezin - Animal Reproduction Systemss (ARS) (EZF). EI dilutor Botucrio-Botutech (BT) esta formulado en base a amidas especificos (tal_como_ dimetil-formamida), como crioprotectores, los cuales actuarian activando la motilidad espermatica (9) Asimismo, estas amidas mantienen la integridad’ de la membrana plasmatica, ‘como consecuencia de su bajo peso molecular, el cual posibilita una mayor penetracién de moléculas a través de la membrana plasmatica y acrosomal, lo que reduce el dafio osmético (10). Por tal motivo, este dilutor es una primera altemativa de uso, para potros cuyos indices de congelabllidad: espermatica son bajos (10, 11), en comparacién con aquellos dilutores formulados en base a glicerol (12, 13) ya que es toxico en ciertas especies (14), El dilutor EZ Freezin LE (ARS) es recomendado para los programas de congelacién de semen equino. La formula de lactosa EDTA de este diutor contiene antibidticos (tircacilin) y glicerol como crioprotector. No se especifican mas de sus compuestos. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de diferentes dilutores en|a viabilidad espermatica de caballos peruanos de paso sometidos al proceso de criopreservacién. MATERIALES Y METODOS Periodo de estudio El trabajo se realizé durante el mes de septiembre del 2009. Tuvo una duracién de cuatro semanas, en las cuales dos dias de la semana (martes y jueves, en horas de la mafiana) se destinaron a realizar las colecciones seminales de los potros seleccionados. Asimismo, corresponde a la Il etapa de criopreservacion de semen del proyecto “Evaluacién de dilutores para la criopreservacion del semen de Caballos peruanos de paso’. Lugar de estudio Se realiz6 en un criadero, ubicado en el km 40 de la antigua Panamericana Sur. Luego de haber colectado a los potros, las muestras de semen fueron transportadas al_laboratorio CIRE (Centro de Investigacion y Reproduccién Equina), ubicado en Mamacona (Lurin), pata realizar los respectivos andlisis, Potros Se seleccionaron dos potros de la raza caballos peruano de paso (CPP), los cuales tenian 8 afios (potro 1) y 10 afios (potro 2) de edad, con 280 y 290 kg de peso respectivamente, 210] Grentifica 6 (3), 2011Evaluacion de dos ciutores para Coleccién de semen Pararealizarlas coleccionesseminales, se seleccionaron potros segin su ‘comportamiento y aceptacién hacia la vagina artificial, tal como se muestra a continuacién: Para realizar las colecciones seminales, se_utlizé una vagina arffical tipo Missouri, Dado que se utilizaba una sola vagina artificial para los dos potros, previamente a su armado, se procedia a colocarle y retirarle (antes y después de cada coleccién respectivamente) un guante de palpacién en el interior de la Vagina (entre las fundas de latex). Se llenaba la vagina artificial con agua a una temperatura inicial que oscilaba entre 48 °C y 49 °C, con lo que se obtenia una_temperatura final de 41 *C.a 42°C. Enel extremo de la vagina artificial, se colocé un whire pack (bolsa de coleccién) que fue protegido por una membrana oscura y asegurados ambos on un cinta. Finalmente, se lubricé la vagina artificial en la porcién distal, ‘con gel no espermicida. Momentos previos a la coleccién, se identificé Una yegua en celo a fin que el potro se estimulara con mayor rapidez. A la yegua se le colocé una traba, a nivel de la cuartila de uno de los miembros posteriores, y se le vendo y amarré la cola en direccién ventocraneal. Con la vagina artificial armada y lista para su uso, se aproximé el potro a la yegua EI potro se estimulé y, una vez que el iene estuvo totalmente protruido, se le alejé de la yegua para poderle lavar y secar el pene. Esto permitié eliminar ‘smegma u otros detritus presentes en la superficie peneana. Finalmente, se volvi a acercar al potro a la yegua y, una vez que el pene estuvo totalmente protruido y erecto, se dejé que monte a la yegua y el pene fue desviado hacia la vagina artificial, Al término de la eyaculacién, se llevé el semen al ctiopreservacién de semen de caballo peruano de paso y sus efectos sobre ‘maiidad espermatca e integridad funcional de membrana laboratorio, Manejo, dilucién y refrigeracion de semen Una muestra del semen colectado fue diluida 1:1 (semen: dilutor) con un dilutor para transportar el semen desde el lugar de coleccién hasta el laboratorio en Mamacona (el viaje duraba 20 minutos). En el laboratorio, la muestra fue dividida en dos partes iguales, y estas se colocaron en tubos falcon de 50 mi, para_ ser centrifugadas a 2200 1pm durante 10 minutos. Tras centrifugar las muestras se obtuvo un sobrenadante y un sedimento. E| sobrenadante fue Vertido en otro’ tubo falcén para ser centrfugade nuevamente a 2400 rpm por 5 minutos; el sedimento (pele), en cambio, fue resuspendido ‘con el dilutor correspondiente (BT/EZ). Tras realizar la segunda centrifugacién, se elimind el sobrenadante y el sedimento fue resuspendido en el diluyente correspondiente (BT/EZ). Con una pipeta pasteur, se tomé una muestra on el fin de observar al microscopio la motilidad espermatica (precongelacién), con una concentracién de 100 millones de espermatozoides por millitro (15). Posteriormente, se lienaron las pajillas de 0,5mi, asi como también se retird el excedente dejando un espacio de aire, para ser selladas con alcohol polivinilico en polvo. Las pajillas fueron colocadas sobre una canastilla y_refrigeradas (4°C-6°C) durante 20 minutos ‘osteriormente, fueron suspendidas sobre el vapor del nitrégeno liquido durante 20 minutos, para ser finalmente sumergidas en nitrogeno liquido por 10 minutos y ser almacenados dentro de los globets en el tanque de nitrégeno Tiquido (a -196 °C). Paraevaluarlamotilidad poscongelacion de los dilutores, las pajilas del BT fueron ‘sometidas a bafio maria (42 °C) durante 20 segundos; en cambio, las pajilas del dilutor EZ fueron sometidas a bafio maria (37 °C) durante 30 segundos. Cientifica 8 (3), 2011 | 217ARTICULOS ORIGINALES| Verénica Orozco Chavez, Manuel Rosemberg Barrén, Alexei Santiani Acosta, Mirella Tomatis Korod, Humberto Rodriguez Landeo Para realizar el test hipoosmético (HOS) se tomo una _— muestra descongelada de una pajilla (100p!) de ambos dilutores para ser incubadas a 37 °C por 30 minutos, en una solucion preparada en base a’sacarosa diluido en agua bidestilada (18g/l) (16). Se contaron —aproximadamente 100 espermatozoides funcionales (cola enrollada) y afuncionales (cola rigida) por cada muestra, Dilutores Se evaluaron dos dilutores: el Botucrio-Bolutech (BT) y EZ Freezin PAnimal Repreducion Systems (E2), los cuales estan formulados en base a_crioprotectores tales como amidas (BT) y glicerol (EZ). Con ambos dilutores, se analizo la _motilidad progresiva e integridad de membrana plasmatica (HOS) en las etapas de pre y poscongelacién de semen de caballlo peruano de paso. EVALUACIO DE MEN Motilidad espermatica Se _utiliz el método _ subjetivo para determinar el porcentaje de espermatozoides_motiles. Con una pipeta Pasteur se tomé una pequefia muestra de semen y se la colocé en una lémina portaobjetos_temperada en una platina a una temperatura aprox. de 37 °C. Sobre esta muestra se colocé una lamina cubre objetos (también temperada) y se observé al microscopio a 100X. Los resultados fueron expresados " en porcentaje de espermatozoides motiles _ con respecto al total de espermatozoides observados en diversos campos. Integridad funcional de membrana Para evaluar la integridad funcional de membrana se realiz6 el test hipoosmotico (HOS). prepard un medio de sacarosa_diluido en agua bidestilada (18 gM) (14), En un tubo Eppendor, se colocé 1 mide la solucién preparada y 100 4 de semen, para ser incubados en una_estufa durante 30 minutos a 37 °C, Posteriormente, se contaron en promedio 100 espermatozoides, los cuales fueron clasificados como HOS+ (membrana citoplasmatica funcional, observandose la cola espermatica hinchada y/o doblada) 0 como HOS- (membrana _citoplasmatica,_ daftada, observandose la cola espermatica recta), Los resultados se expresan en porcentaje de espermatozoides HOS+, es decir, con la membrana espermatica funcional RESULTADOS Y DISCUSION El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de dos tipos de dilutores sobre la_calidad seminal luego de ser sometidas las muestras a un proceso de criopreservacion. Los parametros evaluados fueron la motilidad espermatica y la integridad funcional de la membrana celular realizada mediante el test hipoosmético. Tras la colegcién seminal de los potros, se evaluéla calidad seminal momentos antes de realizar las primeras diluciones. Los principales parametros evaluados fueron la motiidad espermatica, la concentracién espermatica y el volumen seminal libre de gel on donde, se obluvieron valores del 2%, 130 x 10° espermatozoidesim| mi respectivamente. Estas caracteristicas sonsimilares alas desoritas anteriormente para muestras seminales de caballo Peruano de paso obtenidas por otros studios (17, 48, 19,20) “Train 1. PoRCENTAJE DE MOTLIDAD ESPERMATICA PRE Y POSCONGELACION CON DOS OIFERENTES OILUTORES Dilutor Pre Pos Prom dilut, | X+D.S. Botuerio | 75,42(a) | 65,42(a) [70.42 7.07 75,42(a)_|_50,00(b) 62,71 17.97 75,42_ [57.71 6657 |_ 12.52 * En as comparaciones vertcales, letras diferentes incican diferencias significavas (P < 0.05), 22 Cientifica 8 (3), 2071Evaluacién de dos ciutores paral eriopreservacién de semen de caballo peruano de paso y sus efectos sobre la ‘maiidad espermatca e integridad funcional de membrana “Tne 2, EVALUACION DE LA NTEGREDAD FUNCIONAL O€ LA MEMRANA PLASHATICA PRE Y FOSCONGELACION (26) Dilutor Pre Pos Promdilut. | X2D.S. | Botucrio 69.21@) | 66,11(@) 67.95 219 | EZFreezin [_ 69,78) | 56,96(b) 637 907 | Prom.trs. | 69,78 63,38 65.66 453_| “En las comparaciones vertcales, letras diferentes indican diferencias signficativas (P < 0.05), En el cuadro anterior, se observa que los dilutores BT y EZ se comportan de manera similar durante la Brecongelacion, con promedios, del 5,42% de motilidad espermatica. En poscongelacién, se _observan diferencias significativas (P<0.05) entre dilutores, con promedios del 85,42% y el 50,00% para los dilutores BT y E: respectivamente. Cabe destacar que el éxito de la criopreservacion depende de muchos factores, tales como la interaccién entre el _crioprotector- dilutor, la tasa_de enfriamiento, asi como’ la variacién individual | que aparentemente es muy significatva en el equino (21, 22, 23). Aun bajo condiciones ideals, es inevitable que algunos dafios puedan ocurtir a los espermatozoides durante el proceso de congelacién. Esto es consecuencia de ia formacién interna de cristales de hielo (la cual altera la estructura espermatica) y el incremento de la concentracion de solutos, posiblemente a niveles téxicos, mientras el agua se retira para formar hielo tanto extra como intercelularmente (24). El uso de crioprotectores como son las amidas ylo glicerol, previenen algunos de estos dafios. La superioridad del dilutor BT en poscongelacién podria deberse a la presencia de amidas, a diferencia del glicerol presente en el dilutor EZ Las amidas permiten que exista una mayor permeabilidad y menor estrés ‘osmético, lo que permite mantener mejor _a la membrana plasmatica (25). El glicerol, en cambio, causa danos principalmente a nivel de la membrana mitocondrial, _plasmatica y acrosomal, por la desnaturalizacion de las proteinas (12, 26). Asimismo, el glicerol resulta ser un producto txico para los espermatozoides si ne una concentracién excesiva (27); por tal motivo, se debe disminuir la concentracion de glicerol, asi como el tiempo de contacto con el espermatozoide antes del congelamiento, a fin de maximizar los efectos benéficos del glicerol_ como crioprotector y, a la vez, minimizar los efectos toxicos (28) En relacién con la evaluacién de. la motilidad espermatica poscongelacién de semen de caballo peruano de paso, Vasquez (2005) (19) encontré similares resultados con un 70,6% y un 50.6% de motilidad poscongelacion en diferentes dilutores. Niveles inferiores de motilidad poscongelacién fueron encontrados por Borgesa (2004) (18), con promedios que oscilaron entre un 0,50% y un 27.60% de motiidad El otro pardmetro evaluado fue la integridad de membrana mediante el test hipoosmético. Esta prueba es un buen indicador de la eficiencia de los dilutores, por lo que se espera obtener buenos indices de fertilidad al inseminar artificialmente yeguas. Tras realizar el test hipoosmotico (HOS), los “espermatozoides que posean una membrana plasmatica funcional seran aquellos que tengan ta, cola engrosada y enrollada (HOS+). Estos espermatozoides atin mantienen la capacidad de incorporar agua para equilibrar el medio en el que estan presentes, sin que suceda una lisis celular, De los resultados obtenidos del HOS, se concluye que existe una diferencia significativa (P<0.05) poscongelacion entre dilutores, con promedios del 66,11% y el 56,96 para el BT y EZ, respectivamente. Por tal motivo, se esperarian mejores indices de fertiidad con el dilutor BT en comparacién con el Cientifica 8 (3), 2011 | 213ARTICULOS ORIGINALES| Verénica Orozco Chavez, Manuel Rosemberg Barrén, Alexei Santiani Acosta, Mirella Tomatis Korod, Humberto Rodriguez Landeo EZ, contrariamentelomaniestadoper (CONGYTEC) sean expodiente N° Demick et al. (1976) (28), Wolfe y col. 256-2008-CONCYTEC-OAJ. (1998) (30) y Miller y'col. (1999) (31), quienes indican que existen dilutores AGRADECIMIENTO gua. causan ig ciomnucion ela erilidad, probablemente por los dafios, produedos a nivel de la membrana a Sonsole: Riscones ie Gena y plasmatica de’ los espermatozoides (46) , debido a la toxicidad del gliceral jeenologia, (CONCYTEC) ya, los (12, 26) del Sur, sin cuyo apoyo no hubiera sido FINANCIAMIENTO posible ejecutar y culminar el presente Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia 1. Salomon S, Maxwell WMC. Storage of ram semen. 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