Adtesoe

UNIVERSIDAD DR.
JOS MATAS DELGADO

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DEL REGLAMENTO DE GRADUACIN DE LA UNIVERSIDAD DR. JOS MATAS DELGADO
Captulo VI, Art. 46

Los documentos finales de investigacin sern propiedad de la Universidad para fines de
divulgacin
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[Escribir texto]
U N IV ER SIDA D D R . JOS M A TA S D ELGA D O

FA C U LTA D D E A GR ICU LTUR A E IN V ESTIGA C IN A GR C OLA
JU LIA HILL D E OSU LLIV A N
Investigacin referente a:
Estudio fsico-q umico y microbiolgico en el proceso de fermentacin tradicional

y no tradicional, mediante la u tilizacin de cuatro medios de cultivo para
identificar la presencia de levaduras, bacterias lcticas y acticas en las semillas de
cacao Theobroma cacao del ecotipo Trinitario, cultivado en la Hacienda San Jos
del R eal de La C arrera -U sulutn.
A sesor: D r. Rodrigo Reyes.
N ombre de los autores:

O rellana Torres, Teresa Beatriz
M olina G uzmn, Luis M iguel
Para optar al grado de:

Ingeniera A groindustrial.
ANT I GUO CUSCAT L N, LUNE S 10 DE SEPT IE M BRE DE 2012.
NDICE
Introduccin
Captulo 1
1.1
Generalidades
1.2
..
1.4
H istoria
Taxonom a del
cacao
Grupos de
cacaos
trinitarios
..
1.5
D escripcin general y longevid ad del rbol
1.6
1.6.3
D escripciones taxonm icas y m orfolgicas

..
C aractersticas
de la hoja
.
D escripciones
de la flor
.
D escripcin del
fruto
.
1.6.4
C aractersticas de la sem illa
1.7
Objetivos
1.7.1
Objetivo general
Objetivos
especficos
1.3
1.6.1
1.6.2
3
4
4
..
.. .
7
8
2.1
Captulo 2
Ferm entacin
del cacao
.
2.2
Microor ganism os en la ferm entacin del cacao
2.2.1
2.2.2
Prim era fase ..

Segunda
fase
.. .
2.2.3
Tercera fase
2.2.4
2.4.2
C uarta fase
Consecuencias
de la

ferm entacin
Medios de
cultivo
.
Agar dextrosa
sabourau d
.
Agar
Estandar
.
2.4.3
C aractersticas de agar estandar
2.4.4
Agar MRS
2.4.5
2.5
Medio de Ac etico - etanol r uherfo rd

.
Anlisis
brom atolgic o
2.6
Generalidades de la ferm entacin del cacao
2.6.1
Lavado
15
2.6.2
Secado
15
1.7.2
2
2.3
2.4
2.4.1
..
..
..
8
8
9
10
10
11
12
12
13
13
13
14
14
15
2.7
Antecedentes
20
3.6
Captulo 3
Corte y seleccin
del fruto en el
..
cam po
Peso de
m azorcas
.
Partida y
desgranad o de
..
m azorcas
Tom a de
m edidas de

granos
Ferm entacin de
las sem illas

Anlisis
Fsico
Qum icos
.
3.7
D esarrollo de tcnicas y procedim ientos de anlisis de semillas ferm entadas
23
3.7.1
pH
23
3.7.2
23
3.8
Slidos solubles, alcoh ol, acido actico

.
Metodolo ga
de anlisis
.
3.8.1
Tcnica de pre paraci n de cultivos
25
3.8.1.1
25
3.8.2
Material y equipo
.
Medio de c ultivo
Standard
..
3.8.2.1
Frm ula
3.8.2.2
3.8.3
Mtod o de p reparaci n
.
Medio de c ultivo
MRS
..
3.8.3.1
Frm ula
3.8.3.2
3.8.4

Medio de c ultivo
RAE
..
3.8.4.1
Frm ula
3.8.4.2
3.8.5
.
Medio D extr osa
Saboread
..
3.8.5.1
Frm ula
3.8.5.2
29
3.10
.
Inoculaci n de
m icroorganism os .
Materiales y
equipos
.
Procedim iento
..
Calculo y
expresin de
resultados
.
3.10.1
Anlisis
. .
31
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.9
3.9.1
3.9.2
..
..
16
20
21
21
20
22
22
25
25
26
26
26
27
27
28
28
28
28
28
30
30
30
31
cuantitativo
32
3.10.1.2
Secado de grano de cacao

.
Peso y
dim ensin de
sem illa seca

Captulo 4
33
5
6
Captulo 5
Captulo 6
51
53
Captulo 7
54
Anexos
55
3.10.1.1
NDICE IM AGENES
1
rbol de caca o trinitario .
H oja de cacao trinitario .
Flor de cacao trinitario ..
Mazorca de cacao t rinitario . .
Sem illa de cacao trinitario .
Vista en m icroscpio de Saccarom yces cerevisiae .
Vista en m icroscpio de Lact obacillus Ferm entum ..
Seleccin y corte de m azorca de cacao
20
Mazorca de cacao t rinitario parti da ..
21
10 Pie de rey ..
21
11 Sem illas de cacao trinitario pre - ferm entaci n
22
12 Poten cim etro ..
23
13 Refractm etro de alco hol ..
23
14 Refractm etro Acid o Actico .
24
15 Refractm etro slidos to tales .
24
16 Levadura S. C erniese
33
17 Oxidan Gluco no bacter .
36
18 Lactobacillus ferm entum
37
19 Lactobacillus ferm entum
38
20 Levaduras, H anseniaspora guillierm ondii y S. cereviseae
39
32
NDICE TABLAS
1
C lasificacin taxonm icas del cacao
Variantes de las caractersticas m orfolgicas en cacao trinitario
Anlisis brom atolgico del cacao
14
C recim iento de m icroo rganism os ..... ........... ...
33
34
Prom edi o de crecim ient o de m icro organism os

C am bios en la coloracin de la sem illa durante el proces o de ferm entaci n no
convencio nal
C am bios en la coloracin de la sem illa durante el proces o de ferm entaci n
convencio nal
C om portam iento de los factores alcoh ol, Brix, cido actico, pH y Tem peratura .
42
D im ensiones de la sem illa
48
10
Prom edi os y rendim ientos de la sem illa de cacao
49
40
41
NDICE GRAFICOS
1
Levaduras en Medi o Estndar .
35
Bacterias Medio Estndar ..
36
Bacterias lcticas en m edio MRS
37
Bacterias Acticas en Medio RAE .
38
Levaduras en Medi o D extrosa Saburau d
39
C om portam iento del acido actico
42
C om portam iento de Slidos Solubles Brix (en la solucin azucarada) en la Ferm entacin de
C acao
43
C om portam iento de alcoh ol .
44
C om portam iento de pH .
45
10 C om portam iento de la tem peratura en la Ferm entacin de C acao .
46
11 D im ensiones de la sem illa ..
49
12 Anlisis brom atolgico .
50
IN TR OD U CC IN
El cultivo de cacao es un a altern ativa de desa rrollo y subsistencia pa ra l os
gra nd es y pe que os ag ricultores del pas, el cac ao te na ta nta im port ancia qu e
inclusive se utilizaba c omo mo ned a de cam bio e n la p oca Pre C olom bin a.
Actualmente en El Salvad or el rea de may or refo restaci n de caca o es la
H acienda L a C arre ra ubica da en la re gi n costera e n el d ep artam ento d e
U sulutn, cant n Sa n Jos, municipi o de Ji quilisco, e n el Km 1 09, so bre l a
carret era d el Lito ral.
En la i ndustri alizacin del caca o u n proces o in dispens able es la f erm entaci n
ya qu e me diant e ste se desa rrollan las caractersticas org anol pticas q ue da n
al cacao el sabo r a chocol ate.
En la presente investigaci n se realiza ron d os mto dos de f erm entaci n: El
mtodo tradicion al qu e se realiza coloca ndo las semillas de cacao e n cajas de
made ra y un m tod o n o tra dicion al q ue co nsisti en dep ositar l as semillas e n
cajas plsticas, recu bri rlas co n una soluci n azucarada e inocul ar cep as d e
sacharo micye cervessiae.
El
principal
o bjetivo
de
sta
investig acin
fu
utilizar u n
mto do
de
ferme ntacin n o tra dicion al pa ra l as semillas de caca o q ue en u n me no r tiemp o

pro po rcione mejo res p ropi ed ad es org an olpticas al grano, sto se com prob
media nte an lisis microbiol gicos y fsico-qumicos.
El estudio microbi ol gico d e l as semillas d e caca o f e rment adas en amb os
mtodos se re aliz utilizando cuatro me dios d e cultivo: a gar MR S, D extrosa
Sabo ura ud, Ag ar estn dar y R AE, para id entificar l a p rese ncia d e leva du ras,
bacterias lcticas y acticas. Adems fu necesa rio dete rmina r cual es son los
factores qu e afecta n los ndices d e ferm entaci n d e las semillas d e caca o
especficamente e n el ecotipo tri nitari o; Se utiliz levad ura sacha romices com o
iniciado res de fe rme ntacin en el m tod o no tradicion al, con el o b jetivo d e
evalua r el efecto de stas en funcin d e acorta r el tiempo d e ferm entaci n
tradicion al
de 7 4 das, d urante el p roceso se efectu aro n a nlisis d e
tempe ratura, pH , Brix, % de alcohol y % de cido actico cada 24 ho ras ; as

como tambi n los resp ectivos anlisis microbiol gicos.
El proceso expe rime ntal fu realizad o e n las instal aciones de C EN SALU D ,

ubicad o en la U niversida d de El Salvado r. la evaluaci n bro matol gica se
realiz en el L ab orat orio de C ontrol de C ali da d de Alime ntos de la faculta d d e
agricultu ra e i nvestigacin ag r cola Juli a H ill d e O `sullivan en la U nive rsida d
D r. Jos Matas D elgad o. stos se efectuaron m edia nte las n orm as de l a
AOAC 17
TH
e dicin 2 00 3.
CAPT UL O I:
1.1
Gen eralidad es:
1.2
Histo ria
El cacao ya e ra c ultivado po r los mayas hace ms d e 2 500 a os, la p ala bra

cacao en la len gua may a significa: cac qui ere d ecir roj o (en referencia al colo r
de la cscara del f ruto ) c au q ue expresa las i de as de f uerz a y fue go.
L os
aztecas apre ndi eron d e los mayas el cultivo y el uso del cacao. Ll ama ba n
cacahu at al caca o y xocolatl la b ebid a aromtica qu e se obt ena de sus
frutos. Por aq uel ento nces el
xocolatl e ra ap recia do com o reconstituyent e
que da ba fu erza y desp erta ba el a petito sexu al. Las semill as de cac ao tam bi n
se utilizaba n como mo ned as de cambi o, costumbre q ue pe rdu r much o
despu s de la col onizaci n d e los espa oles. D e h echo H ernn C orts p ag ab a
a sus sol dad os con cacao. D ura nte t oda la ed ad mo de rna el cacao pas
bastante desa pe rcibido, a p esar de qu e ya en el siglo XVI em peza ba a se r
conocida la bebi da h echa a base d e cacao (el ch ocolate ).
1.3 T axo no m a d el cacao

El nombre del gn ero es The ob rom a qu e significa alim ento d e los D ioses , la
taxonoma del g ne ro an es cosa de estudi o; pe ro solo una, (T he ob rom a
cacao L), se cultiva com ercialm ente. (A rg uello y
col, 1 99 9, arcin egas y col,
200 5)
Tabla # 1 Clasifica cin taxonm ica del cacao
Reino
Plantae
Divisin
Spermatop hyta
Clase
Angio spe rme
Subclase
Dicotiledonae
O rden
Malvale s
Suborden
Malvinae
Fam ilia
Sterculiaceae
Tribu
Byttn erieae
G enero
Theobro ma
Especie
Theobro ma caca o L
Subespecie
Sativa, leioca rpa y pen tagona

Fuente: C as taeda, Vi aney, Bonilla, Guill er mo, Pr ez, J uan M anuel ( 2011)
En la especie The obroma caca o L. se menciona n tres

subespecies, las cuales son:
Ssp sativa
Ssp. Leiocarpa
Ssp. Pentgon a
1.4 Grupo d e cac aos trinitario s:

Los
cacaos
trinita rios
son
ve rd ad eros
Fig . 1 rb ol de cacao Trin itario
h brid os
naturales ( espo ntn eos ) de los crioll os y forasteros, como hb rid os pres enta n
las siguientes caracte rsticas:
Muestra n gran vari abilid ad

H eteroscias o vigor hb rid o (Ma nifestado en el tama o d e las mazorcas)
C recimiento vigo roso d el rbol
Altas produccio nes
R esistencia a los agentes a dversos
Mazorca
D ebido a su hete ro ge neid ad, los trinitarios constituyen u n materi al excepcion al

al procesa do r, qui n pod ra selecciona r entre la multitud de combi nacio nes,
aqu llas qu e re ne n el mayor n me ro de ca ractersticas interesant es y
pro pa gad as vegetativame nte.
Los trinita rios se cultivan b sicamente en M xico, Amrica C ent ral, Tri nida d,
C olombia, Ven ezuel a y pases don de ant erio rme nte se cultivaban cri ollos.
Tabla # 2 Variantes de las caracter sticas morfolgicas en cacao tipo trinitario:

Constitudos de poblaciones hbridas producto del cruzamiento espont neo entre criollos
y forasteros
Arboles vigorosos, producen vertcilo (Horqueta)
Las flores presentan estaminodios de color morado oscuro
Producen altos rendimientos en buenos ambientes
Producen las primeras mazorcas en menor tiempo que los genotipos criollos
Presentan c scara gruesa y dura
Son susceptibles a monilia y mazorca negra
Presentan sabor a cacao de medio a alto
Usualmente con alto sabor a frutas
Bajo sabor floral
Sabor alto a nueces
Requiere de una buena fermentacin para manifestar sus atributos.
Fuent e: C as taeda, Vi aney, Bonilla, Guill er mo, Per ez, J uan M anuel ( 2012)
1.5 D escrip cin gene ral y longe vidad del rb ol de Theobr om a ca cao :
El cacao. The obroma c acao L. es un rb ol q ue en con dicion es natu ral es, con
sombra de nsa alca nza altu ras q ue so bre pasa n los 1 0 m, pu ed en lle ga r
excepcional mente a los 1 4m; pe ro en co ndicio nes no rmal es de cultivo su altura
a los 2 aos es de 2 3 m y cuand o ha lle ga do a la eda d ad ulta (1 0 a os
aproximad ame nte), su altura prome dio es de 4
8 m.
1.6 D escrip tore s ta xonm ico s y m orfolgic os:
1.6.1 C arac ter stic as de la hoja :
C onsta de estpulas, p ecolo y limb o; El p ecolo,
es sobresalient e con una lon gitud de 7 9 cm e n
las hoj as d e ejes ortotrpicos y de 2 3 cm e n
hojas d e ramas pl agiotrpicas. Pres enta en sus
extremos a bultami entos llam ados pulvin ulos ;
las hojas qu e se encu entran e n el interi or y
recibe n men or ca ntidad de luz son much os ms
Fig . 2 H oja de cacao tipo Trinitario
gra nd es y ms del gad as q ue la de la p erife ria, las plant as jven es lleg an a
superar los 3 0cms de lo ngitud y 1 0 cm de a ncho, en ocasion es con medi das d e

hasta 45 6 0 ms, en arbol es adultos son ms p equ e os de 10 a 1 2 ms de
longitu d y 5 a 12 cm de anc ho.
El color de las h ojas n uevas o tiernas vara de acu erdo al co ntenid o d e
pigme nto antoci nicos, puede va riar d esde verde claro a diversas tonali dad es
de rojo (rosa plid o a bro nce oscuro), son su aves bla nd as y cuelga n
verticalmente de sus pecol os, a medid a ma duran tom an un colo r verde oscuro,
siendo m s oscura e n el haz q ue e n el e nvs, al envejece r pie rd en flexibilid ad y
se torna n qu ebradizas.
1.6.2 Descrip ci n de la F lo r:
El cojn floral del cacao consiste en un a base
ancha la cu al es una ramilla de ent ren ud os
muy cortos y marc ados po r brcte as p equ e as
y caedizas. D icha ramilla se divide en d os
ramas, de las cual es una te rmin a en d os
pedcelos florales y la otra no se desarrolla. La
inflore ncia se clasifica como dicasio o cima
dicasiforme y
el cojn
es un a
ramilla
de
Fig . 3 Flor de Cacao tip o Trin itario
entre nu dos muy acorta dos.

Los cojines so n p or lo ge ne ral i nfluencias m s complej as qu e se fo rma n d e
nume rosas ramificaciones junt as.
1.6.3 Descrip ci n del fru to

El fruto se llam a com nm ente Mazo rca, es
polispe rma, sosteni da al rb ol p or un fuert e
ped ncul o
leoso,
o rigin ad o
po r
el
eng rosami ento d el pe dcelo de la flo r.

La base para ag ru par las p oblacio nes ha sid o
su forma y est determin ad a por la relaci n
Fig . 4 Mazorcas de cacao t ip o
Trinitario
4
entre l a lon gitud y la anch ura, la form a de l os extrem os pue de se r: extrem o

apical o p unta ms o me nos acumin ad o y otras punt as chatas.
Algun os termin an con un estran gula miento en fo rma de b otella, las form as
varan d esde las casi esfricas hasta forma alarga da y puntia gu da .
En la sup erficie de l a mazo rca se e ncue ntra n cinco p romin encias lo ngitu dinal es
qu en alg unos tip os se p rese ntan co mo aristas ma rcad as y salientes, e n
algu nos casos hay cinco promi ne ncias secunda rias qu e alterna n con las
prime ras, a veces tiene n el mismo d esarrollo, e n ste caso se presenta n 1 0
surcos reg ulares, se prese ntan e n cacao criollos.
Los colores varan cua ndo m adu ra n de ve rde a R oj o Violeta
Su tama o qu ed a d etermi na do po r la lo ngitu d sta p ued e va ria r e ntre 1 0 3 0
ms y un ancho entre los 7 a 10 cms. El peso d e la mazo rca p ue de ser de 200 g.
hasta los 10 00 g. Los cacaos trinita rios pu ed en p rese ntar una su pe rfic ie muy
verru gosa, hasta lleg ar a ser lisas, el corte transversal mu estra qu e el espeso r
es muy varia ble se gn se a el ori gen ge ntico d el rbol. U n fruto jove n present a
5 comp artimie ntos e n ca da de los cual es estn los gra nos
reg ula rment e, al madurar d esap arec en las pared es de sta
re partid os
cmara. U na
mazorca p or lo gen eral contie ne e ntre 3 0 4 0

semillas.
1.6.4 Caractersticas de la sem illa
Semilla en fo rma d e ha ba
Sin albm en
D e 2 3 cm de longitu d
R ecubierta por una pulp a mucilagi nosa
Al eliminar el muclago o pul pa, ap arece un a

envoltura d elga da p ero resistente, colo r rosa da,
con
ne rvios
pro mine ntes
gru esos,
dicha
Fig . 5 Sem illa de Cacao Trin itario
envoltura proviene d e l os teg ume ntos d el vulo y constituye l a tsta
de la
semilla, la cul provie ne d e los tegum entos d el ovulo.
La testa es gruesa y corice a, con cutcula du ra, d eb ajo d e la cul h ay un a

capa de pa r nquim a y otra de esclern quim a, de baj o d e l a cul h ay un estrat o
delg ado que rep rese nta el inte gum ento .
Para d escribir las semillas del caca o se usan:
Sus dimension es
Form a de los gran os
C olor de los cotiled on es
Lon gitud
Anchura
Espesor
Peso
1.8 Ob jetivo s
1.8.1 Gene ral:
Estudiar fsico-qumica y microbi ol gicame nte
el proceso d e ferm entaci n
tradicion al y no tradicio nal, me diante l a utilizacin de cu atro m edios d e cultivo

para id entificar l a p rese ncia de l evad uras, b acterias l cticas y acticas en l as
semillas de cacao The ob rom a cacao del ecotip o Trinita rio, cultivado e n la
H acienda Sa n Jos del R eal d e La C a rre ra -U sul utn
1.8.2 Objeti vos Esp ecfic os:
1- C aracte rizacin mo rfol gica de los g ra nos de cacao T rinita rio

2- C rea r l as con diciones ad ecua das pa ra re alizar u na f erm entaci n tradicion al ;
y una no tradicio nal utiliza ndo l evad ura Saccaromyces cerevisiae a com o
iniciado r y acelera do r del p roceso.
3- Ide ntificar medi ante cuat ro me dios d e cultivo las levadu ras, bacteri as lcticas
y acticas, que se desarrollan en el p roceso d e ferm entaci n del cacao.
4- R e alizar u n a nlisis fisicoqumico a l as semillas fe rme ntad as p ara co noce r
sus caractersticas bromatol gicas.
C A PTU LO 2 R EVISION D E LITER A TU R A

2.1 Ferm en ta cin del ca cao
Es el proceso po r medio d el cual se d la calid ad propi a del cacao p ara hace r
chocolate; se li mpia n las se millas, se mat a el emb ri n y se da bu en a
prese ntacin a las alme ndras. Para ll o se precisa d lu ga res acon dicion ados y
bien ventila dos. C un do las alme nd ras no ferm enta n ste proceso se re aliza
mal o e n fo rma d eficiente, se prod uce el llam ad o caca o co rri ente. D u ra nte el
proceso, l a accin com bina da y bal ance ad a d e tem peratura, alco hol es, cidos,
pH y hum ed ad m atan el emb rin, disminuye el s abo r ama rgo po r l a p rdida d e
theob romi na y se prod ucen las re acciones bio qumicas que fo rma n el
chocolate.
2.2 Microorg anism os d e la ferm entacin del ca cao
2.2.1 Prim era fase

La p ulpa es rica e n carb ohi dratos y tiene u n pH baj o.
En sas condiciones se
favorece el desa rrollo de
levadu ras.
En la prim era fase ap arecen entre 5 y 6 esp ecies
difere ntes d e l evad uras, qu e l ueg o desa parecen
deja ndo su lug ar a H anse niasp ora g uillie rmon dii,
que es la lev adu ra pred omina nte durante l as
Fig . 6 V ista en m icroscp io

de Saccarom yces cerevisiae
prime ras 24 ho ras. A H anse naspo ra slo se le encu entra oc asionalm ente e n
las fases posteriores. La leva du ra C ndi da zempli nin a es una nu eva especi e
que sl o se pu do d etectar h asta qu e ap areciero n las tcnicas mod ernas de l a
biolo ga molecul ar q ue detectan la pres enc ia d e microo rg anismos p or sus
gen es, ms no cultivn dol os. C ndid a silvae, C an dida ze mplini na y C n did a
diversa so n leva du ras q ue s e e ncue ntran com nme nte e n las fe rme ntacin es
en cha rol as, posiblem ente por l a mayo r conce ntraci n de oxgen o e n ese tip o
de ferme ntacin. Se re po rta qu e a las 36-3 8 ho ras domi na n Saccaromyces
cerevisiae y Pichia memb ran aefacie ns, que se encu entra al final de l a
ferme ntacin;
C ndi da
krusei
H anseniasp ora
guilli erm ondii,
en
las
ferme ntacin es en charolas, y pre domin a tambi n Saccha romyces cerevisia e

(N ielsen et al., 200 7).
En las ferment acines p or pil as que se llev an a cab o en Gha na, u no d e los
princip ales pases prod uctores d e cacao, Pichia kudri avzevii, Sa ccharomyces
cerevisiae y H a nsenasp ora o pu ntiae s on l os comp one ntes p rincip ales d e l a
comunid ad
de leva du ras. H . opuntia e se desa rrolla al p rincipi o de l a
ferme ntacin, d ebi do a su t olerancia a val ores baj os d e pH y a sus

caractersticas metablicas (D ani el et al., 2009 ).
En la ferm entaci n d el cacao pa rticipan un gra n n me ro de es pecies d e
microorga nismos, algu nos de los cual es no se ha n re po rtad o en otros
ambie ntes o fue ron aisla dos inicial ment e d el caca o. ste es el caso de nu evas
levadu ras como C ndi da halmi ae, Ge otrich um g han ense, C n did a aw u aii
(N ielsen et al., 2 01 0). Las l evadu ras ll evan a cabo el proceso de ferm entaci n,
transform an do los azca res sencillos del m uclago
o pul pa e n etan ol,
deg ra dan do l a p ectina, lo qu e mo difica la t extura del gran o y elimin a el cid o

ctrico, lo que trae como co ns ecue ncia un a disminuci n de la acid ez.
Por otro l ad o, el conso rcio d e l evadu ras co nsume el ox ge no, crean do u n
ambie nte a na erbio qu e favo rece el d esarroll o d e
bacterias lcticas.
2.2.2 Segund a fa se
En la segun da fase del p roceso d e ferme ntacin d el
cacao, se favorec e el
d esarroll o de bacte rias
lcticas, que ferm enta n los carbo hidratos residu ales

y continan el co nsumo d el cido ctrico. En la
ferme ntacion es de pilas se han aislad o so bre tod o
bacterias del tip o L actob acillus (L b. colloni des,
Lb. ferme ntum, Lb. mali y Lb. pl anta rum ), aun qu e
tambin
se
ha n
i dentificad o
pseud omese nteroid es,
Leucon ostoc
bacteri as
Fig . 7 V ista en m icroscp io de

Lactobacillus Ferm entum
como
pseud oficulne um,
L euco nostoc
y
Pediococcus
acidilactici.
Por otro la do, L b ferm entum y L b pl anta rum so n ind gen as de
sta
ferme ntacin. U na ce pa d e W eissella, un a bacte ria lctica aislad a d e

ferme ntacion es de cacao en Gh an a, se report como una es pecie nu eva,
W eissella fabari a (D e Bruyn e et al., 2010 ).
Las levad uras contien en e nzimas del tip o pectinoltico, lo q ue les p ermit e
hidrolizar las pectin as, ocasionan do u na dismin ucin d e la viscosidad de l a
pulp a de m uclago y favorecien do la entrada de ai re. C on steambi ente a erobi o
y menos cido -de bido al consumo de cid o ctrico- se favorece el desa rrollo d e
bacterias acticas.
2.2.3 Ter cer a fa se
En la terce ra fas e del proceso d e ferm entaci n ocu rre u n cambi o imp orta nte e n
trminos d e los p rod uctos de la fe rme ntacin, ya q ue i ntervie nen bacteri as
acticas que lleva n a cabo l a transfo rmaci n del eta nol q ue p ro duje ro n las
levadu ras en cid o actico, tal como ocurre e n la ind ustria producto ra d e
vinagre. D ado q ue la transform acin de eta nol e n cido actico es una reacci n
exotrmica, se prod uce calor. El etan ol y el cido actico se difu nde n hacia el
interio r de l os g ran os y, ju nto co n la temp eratura alta, mata n al em b ri n. L as
ms import antes bacte rias acticas qu e se ha n aislad o d e la ferm entaci n d el
cacao, son: Glucon obacte r oxydans.
2.2.4 C uarta fa se
En la cuarta y ltima fase d e la ferm entaci n, que se d esarroll a entre las 48 y
las 60 h oras, se d etectan b acterias d el g ne ro B acillus. Al voltear la pil a d e
gra nos, se favorece la presencia, en las pa rtes extern as, de B. liche niformis, B.
megate rium, B. pu milus y un grup o peq ue o de B. subtilis, B. me gate rium y B.
pumilus.
La temp erat ura alta favo rece el d esarrollo de bacte rias del g ne ro Bacillus,
conocido p or la p ro duccin d e num erosas enzimas, que catalizan reaccion es
cuyos prod uctos da n al cacao s abo res y olo res d esag rad abl es, como las
prote olticas, que deg ra dan las p roten as y las lipolticas, que actan sobre la s
grasas; pero po dra n co ntribui r en el s abo r co n l a p ro duccin d e cid os
org nicos y saboriza ntes, como 2,3-buta nodi ol (Ardh ana y Fleet, 20 03 ).
10
C uand o G arca-A rmisen et al. (20 10 ) usa ro n mto dos m ode rn os basa dos en l a
biolo ga mol ecula r d e los microorga nismos pa ra estudia r la ferm entaci n d el
cacao, detectaron b acterias Tat umella, Pa ntoe a y Erw inia, que no se h aba n
rep orta do n unca a ntes en la fermentaci n del caca o. Se sabe q ue p ued en se r
fitopatg enas (es decir, qu e caus an da o a l a pl anta ), p ero stos a utores
piensa n tambi n qu e po dra n contrib uir e n el consum o de citrato.
2.3 C onsec uen cias de la Fe rm entacin
Se sabe qu e en el sab or a choc olate p articipa n por lo m enos 5 00 comp uestos
difere ntes y qu e stesab or dep en de de m uchos factores, como el tip o de g ran o
de cacao, la p oca en la cual se cosech, la ferm entaci n (la accin d e
microorga nismos), la accin d e e nzimas e nd g enas (e nzimas d el caca o), el
rostizado y el secado. Es por lo mismo m uy difcil definir de cul d e tod as sta s
etapas dep en de l a prod uccin d e a rom as. Las e nzimas en d gen as, po r
ejempl o, pu ede n actua r sob re los carbohi dratos, prote nas y polifen oles d el
gra no d e cacao, g en erand o a romas. L o qu e es u n hech o es q ue el sa bo r
caracterstico del chocolat e no se des arrolla si no h ay ferment aci n.
D urante la fe rme ntacin los micro orga nismos jue ga n p apel es muy im po rtantes:
las levaduras elimina n la pul pa q ue rode a a los gra nos de caca o frescos, des polime rizan do o rompi en do l a p ectina y e n l as condicio nes ana erbicas (si n
oxgeno ) q ue im pe ra n en el a mbie nte, llevan do a cab o la f erme ntacin de l os
azcares p ara p ro ducir eta nol. Las bacteri as lcticas fermentan los azcares y
pro duce n
cido
lctico,
cido
actico
manitol.
Ambos
tipos
de
microorga nismos consum en el cido ctrico. Las b acteri as lcticas convierten el

etanol en cido actico y esa re accin p rod uce cal or, p or l o q ue l a temp eratura
aume nta h asta 50 C . El etanol y el cido actico p rod ucidos p en etra n en l os
gra nos, hacien do q ue su pH interno dismin uya de 6.5 a 4. 8 y junto con el
increme nto d e la t emp eratu ra a 5 0 C , da a nd o la estructura i nterna del caca o.
sto debe ocurrir p ara qu e se formen precurso res d el sabo r, qu e e n etap as
posterio res se conve rtir n en comp uestos de sa bor. T ambi n ocu rre l a
deg ra dacin d e pi gme ntos p or las enzimas en dg en as. Tal vez el pa pel m s
importa nte de los mic roo rg anismos es el d esarrollo d e precu rsores d el sa bo r a
chocolate, porqu e, como h emos se al ado, sin la ferm entaci n no se o btien e el
11
sabor compl eto d el ch ocolate. Pe ro po r otra pa rte, los microorga nismos

tambin so n esenci ales pa ra p re parar el gra no, ya q ue sin llos n o se
elimina ra el muclag o, n o se elimin ara l a acid ez d el g ra no, caus ada po r l a
prese ncia del citrato, y sin la produccin d el cido actico, el etanol y la
tempe ratura alta, el grano de cacao n o se da ara, da nd o luga r a la accin d e
sus enzimas. N o se con oce co n d etalle cul es son los com puestos qu e
determina n el sa bo r a ch ocolate; sin emb argo, N ielsen et al.(200 8) enco ntra ro n
que exista una co rrelaci n e ntre el a rom a d e un lote de caca o y el co njunt o d e
microorga nismos qu e lo ferme ntan, id entificados a trav s de tcnicas mod ern as
como la Electroforesis en Gel con Gra die nte D esnaturalizante (D G GE), qu e
consiste en id entificar microo rga nismos de ntro de po blacio nes compl ejas e n u n
medio am biente d etermi nad o m edi ante l a se paracin de los g en es de sus
ribosom as. stos anlisis se realiza n po r sep arad o pa ra analiza r b acterias y
levadu ras de fo rma sep arada.
2.4 Med io s d e Cu ltivo
2.4.1 A gar D extros a Sabour aud
El Agar D extrosa Sabo uraud es un m edio utilizad o pa ra el cultivo de ho ng o s y

levadu ras. E l Agar de D extrosa S abo uraud es un a modificaci n a la f rmul a
origi nal d el Aga r de D extrosa d esarroll ado por R aym and Sa bo uraud. ste
medio es utilizad o pa ra el cultivo de h on gos pa t ge nos, particula rme nte d e
aqu llos asocia dos con inf ecciones d e piel. L a alta co ncentracin d e d extrosa y
la acidez del pH hace n a ste un m edio selectivo pa ra h on gos. C on la adici n
de cicloheximi da, estre ptomicin a y pe nicilina, se obtien e u n excel ente m edi o
para el aislami ento p rima rio de d erm atofitos. ste medi o es tambi n utilizad o
para la d eterminaci n micro biol gica e n cosmticos y para eval uar l a p resenci a
de ho ngos en alim entos. En ste medio las pept onas provee n la fuente d e
carbo no y nitr ge no p ara el crecim ie nto de l os microo rga nismos, la dextros a
acta como fue nte de e ne rga y el ag ar es ag re gad o como a ge nte solidificante.
12
2.4.2 A gar Estnda r
El Agar Estn da r es u n me dio utilizado pa ra el rec uento de bacte rias a er bicas

a pa rtir d e ag ua, a guas residu ales, alime ntos y pro ductos lcteos. ste medi o
tambin es con ocido como A ga r C ue nta Estn dar. l A ga r Mto dos Estn da r
fu d esarrolla do po r Buch bin de r Ba ris an d G oldstein e n 1 95 3 como u n
req ue rimient o de la America n Public H ealth Association. stemedio se formul a
con los ing re dient es ori ginal es. El extracto de l evad ura y la p epto na d e casen a
han sido utilizad os en me dios dise ados pa ra estudi ar la presencia d e
microorga nismos termoflicos en p rod uctos lcteos desd e 192 8. L a pepto na d e
gelatin a y el extracto d e leva dura p ro porci ona n la f uente de carb on o y
nitrg en o. La dextrosa es el ca rb ohid rato fe rme ntabl e y el aga r es a dicion ad o
como ag ente solidificante.
2.4.3 C arac ter stic as de la s colonias e n agar estnd ar
Las colo nias son ge neralme nte peq ue as, bla nco -grisce o, lisas o rug osas. Se
observa el crecimie nto de microo rga nismos de Lactob acillus ferme ntum
933 8 y Lactob acillus gasseri
ATC C
A TC C 3332 3 . Las lev ad u ras lleva n a ca bo el
proceso de ferm entaci n, transform an do los azcares sencillos del muclago o

pulp a en etan ol, de grada nd o la p ectina, lo q ue m odifica la textu ra d el g ran o y
elimina el cid o ctrico, lo qu e trae com o consecu encia un a dismin ucin de l a
acidez. Por otro lad o, el conso rcio de l evad uras consume el oxgen o, crea nd o
un ambi ente ana erbio que favo rece el d esarroll o de b acterias lcticas.
2.4.4 A gar MR S
A men udo a brevi ado como MR S, ste tipo d e me dio de crecimie nto bacteri an o
se llama as po r sus inve ntores: Man, R o gosa y S ha rpe. D esa rrollad o en 196 0,
ste medio fue dis ea do p ara favorece r el crecimie nto exub erante d e
lactobacilos p ara el estudio de l ab orato rio. C o ntien e acetato de sodio, qu e
suprime el crecimie nto d e muchas b acterias com petid oras (au nq ue al gun os
Lactobacillal es otros, como L euco nostoc y Pedi ococcus, pue den crece r). ste
medio tien e un colo r marrn claro. La levad ura y extractos de carne y pepton a
13
pro po rciona n fue ntes de carb on o, nitr gen o y vitaminas para el crecimient o
bacteria no en ge neral. El extracto de lev adu ra co ntien e tam bin vitami nas y
amino cidos especficamente req ue ridas po r l actobacilos. polisorbato 8 0 es u n
tensioactivo q ue contri buye a la abso rcin d e n utrie ntes p or lactob acilos. El
sulfato de ma gnesio y sulfato d e m ang an eso p ro po rciona n catio nes utilizad os
en el meta bolismo.
2.4.5 Medio de cido ac tico -e tanol R uthe rfor d
ste medio de cultivo, contie ne los comp one ntes neces arios p ara el obse rvar el
crecimiento de bacteri as acticas. Junto con l os ele mentos de Pe pton a,
Glucosa, Fosfato S dico, Aga r y cido C trico evitan el crecimi ento de otros
microorga nismos, lo que lo co nvierte e n un me dio selectivo muy pa rticular.
2.5 A N LISIS BR OMA TOLGIC O

En el sig uie nte C u adro se muestran l os ndices de H ume dad, Grasa, pH y el
sabor d el gran o de caca o previ o a su tostado.
Tabla # 3 A nlisis brom a tolgico d el cac ao

Porcentaj e de H um eda d
6 - 6.5
Porcentaj e de g rasa
52 55
pH
5.0 5.5
Sabo r
A m argo
Fuente: www.fedec ac ao.c om.c o
14
2.6 Gen eralidad es de la F erm en tacin d el cac ao

La fe rment acin es el p roceso po r me dio del cu al se d la cali dad propi a d el
cacao pa ra h acer choc olate; se limpia n las semi llas, se mata el emb ri n y se d
bue na presentaci n a las alme nd ras. Pa ra llo se precisa de lu gares
acondicio na dos y bien ventila dos. C u and o l as alm en dras no fermenta n ste
proceso se re aliza mal o en form a deficiente, se pro duce el llam ado caca o
corrie nte.
D urante el proceso, la accin com bin ada y bal ance ad a d e tem peratura,
alcohol es, cidos, pH y humed ad m atan el emb rin, dismin uye el sa bor ama rg o
por la prdid a d e th eob romi na y se p ro ducen las reaccion es bi oqumicas qu e
forma n el chocolate.
La du raci n del sistema d e ferme ntacin no d ebe se r mayo r de tres das p ara
los cacaos criollos o de cotile d n bla nco y de och o pa ra los cacaos fo rasteros o
de cotiled n m orad o o prpu ra. Existen vari os mtod os pa ra re alizar l a
ferme ntacin, sie ndo los m s empl ea dos la ferm entaci n e n m onto nes, e n
sacos, en cajas, el mtodo R oha n y el emple o de te ndal es.
2.6.1 Lav ado
Los gra nos se lavan al final d e la ferm entaci n en ciertos pases pa ra elimi na r
las partculas de p ulp a. Los tipos ms burdos ge ne ralm ente n o necesita n
lavado, p uesto qu e la ferm entaci n prolo nga da h a desint egrad o completa ment e
la pulp a. Los criollos nunc a son lavad os. Existe cierta influencia d el lavad o
sobre el aroma de l as varied ad es foraste ras. La te nde ncia actual es la d e
suprimir ste proceso y transferi r los granos di rectam ente d e los tanq ues d e
ferme ntacin a las secad oras.
2.6.2 Sec ado
El secado del caca o es el p roceso du ra nte el cu l las semill as termi na n d e

perde r el exceso d e hum eda d que contie ne n y estn listas pa ra se r ve ndid as y
en el caso d el caca o fermenta do compl etan ste p roceso. Se consig ue pasa r
15
de alm end ras con un 5 5 % de hum ed ad h asta semillas con u n 6 - 8 % . D urant e

ste tiempo las semillas d e cacao te rmin an los cam bios pa ra obte ner el sab or y
arom a a choc olate. Tam bi n se produc en cambi os en el color, a pa recien do el
color tpico marrn del cacao ferment ado y secado co rrectamente.
2.7 A N TEC ED EN TES:

N ugma L, defi ne que la c osec ha se i de ntifica: Gui ndos e p or el colo r de l a
vaina y po r el so nid o q ue h ace su int erio r al se r lig era mente gol pe ado, el
recolecto r sabe cu and o ha ll ega do el m ome nto de la cosec ha. Estar
absoluta mente s egu ro del mom ento en que l a vain a est ma dura requi ere a os
de prctica.
Las vainas se a rra ncan del rb ol cortn dol as por el tallo, las qu e estn al
alcance de la ma no con un a hoz, y las de las ramas ms altas con un cuchillo
curvo ata do al extremo de un palo largo. El co rte d e la vaina de be hace rse co n
cuidad o p ara n o estro pe ar l a coliflo r, ya qu e a h se rep ro d ucir n d e n uevo l as
flores y ms tarde los frutos. La recol eccin del cacao se lleva a cab o du rant e
todo el a o.
Partida y desgran ada d e las m azorcas: Al partir las mazorcas se debe evita r
causar d a os mecnic os a las alm end ras, p ues q ued arn pre dispu estas al
ataqu e d e h on gos e i nsectos, y los gra nos q ue ll egu en al final del proceso,
prese ntarn u n aspecto d efectuoso q ue alte ra r la calid ad d el pro ducto.
Ferm entaci n: es el proceso q ue com pre nd e la elimi naci n de l a ba ba o
muclago d el cacao y la formaci n, dentro de l a alme ndra, de las sustancias
precu rsoras del sab or y arom a del ch ocolate. C uan do las alm end ras n o
ferme ntan, steproceso se realiza mal o e n fo rma deficie nte, se prod uce el
llamad o
cacao
corriente.
D urante
el
p roceso,
la
accin
com bina da
bala ncea da de t emp erat ura, alcoh oles, cid os, pH y h ume dad mata n el
embri n (es indisp ensa ble), dismin uye el sab or a margo por l a pe rdid a d e
theob romi na y
se prod ucen las re acciones bio qumicas que fo rma n el
C hocolate. L a d uracin del sistema de fe rme ntacin no de be se r m ayor de tres
16
(3) das p ara los cacaos "C riollos" o de cotiled n bla nco, y de ocho para los
cacaos "Forasteros" o de cotiled n mo rad o o p rp ura
Secado: el secad o d el cacao es el p roces o du ra nte el cul las alme ndras
termina n d e pe rde r el exceso d e hum ed ad q ue contie ne n y estn listas para se r
vendid as (y en el caso del cacao fe rme ntad o completa n ste proceso).
C lasificacin: Existen normas que se aplica n a los gran os d e caca o o
almen dras una vez termi nad o el proceso d el Beneficio p ara tipificarlos seg n su
calidad, p ara sto se toma u na m uestra de cacao al aza r y se cortan los g ran os
longitu din alment e:
Extra Fino: se co rres pon de a los tipos de caca os "C riollos" sometidos al
proceso de la ferm entaci n.
Fino de Prim era (F1 ): H ace refere ncia a los tipos de cacaos hbrid os y
Foraste ros qu e son sometid os a la ferme ntacin.
Fino d e Se gun da (F2 ): Tod as aq uell as alme nd ras qu e n o se som eten al
proceso de ferm entaci n. U sualmente se les de nomi na cacao co rri ente.
Almend ras Moh osas: Son las alme ndras qu e presenta n en su inte rio r
contamin acin por ho ng os y adq uie re n colo racin bla nca, verdosa, g ris
motead o o am arille nto, ge ne ralme nte es ocasion ad o po r Aspergillus sp. ste
defecto se consid era como muy g rave y com o el m s indes eabl e p or l a
industria.
D aad os po r insectos: Se obse rva e n el inte rio r d e la alm en dra excretas d e
insectos o restos de cutculas que se mant ie ne n como contami na ntes.
Almend ras
pa rtidas:
C orrespo nde
las
almen dras
partid as,
como
consecue ncia del ma nipul eo.

Almend ras Pizarrosas: Al h acer el corte se o bserva l a sup erficie del cotile d n
liso, usualmente d e un col or oscuro.
Igualme nte existen otras que q ue dan d entro d e l a sig uient e clasificacin:
Almend ras
ge rmin ad as.
Almend ras
insuficientem ente
fe rme ntad as
no
ferme ntadas. Almen dras mltiples. Impu reza visible. D omin ar eficiente ment e
17
cada un a de stas operacion es, gara ntizar l os ben eficios ec onmicos qu e se

esperen alca nzar e n un a prod uccin cacaote ra a decua da
Los investiga do res F ari as L, B erto relli L, Alvarez N , Le al A defini ero n que , l as
Mazorcas de cacao tipo trinit ario cosech adas, de ben d e ser desg ra nad as 5
das
des pus
de
la
recol eccin,
fe rment adas
en
cajas
cu ad rad as
rectang ula res d e ma dera, con el fin de com pa ra r el efecto de los dos dise os
sobre las ca ractersticas fsicas y qumicas del grano. La du raci n d e l a
ferme ntacin fue d e 5 d, volten dose los g ra nos a las 24 y 48 h d e inic iado el
proceso.
La temp eratura se mide di ari ame nte y el ndice d e ferme ntacin (F) a l os 0, 2,4
y 5 d, durante los cual es tambin fu ero n dete rmin ad os los contenidos d e
hume da d, tanin os, acidez tot al y el pH de la pulp a + testa y del cotile d n d el
gra no e n ferme ntacin.
Los result ados i ndica n q ue el diseo d el ferm enta do r influy sob re l as
caractersticas fsicas y qumicas, siendo mayo r la tem pe ratu ra alcanza da po r
la masa de cacao al f erme ntar con la caj a cu adrad a, con la cu al los val ores d e
taninos fu ero n ms altos y los de pH ms baj os, tanto e n la pul pa + testa com o
en el cotiled n.
As mismo, con los dos fe rme ntad ores se obtuvi ero n tem peraturas e F qu e
revela ro n una b ue na ferm entaci n, sin embargo, los valores de estas dos
variabl es fueron su pe riores al usa r la caj a cuad ra da, p or lo qu e p odr a
considerarse como el dise o m s eficiente pa ra el proceso fe rme ntativo d el
cacao.
Portillo E se refiere qu e, para establ ecer las con diciones d e ferm entaci n
adecu ad as es necesari o con ocer los factores que inf l uyen sob re sta, e n tal
sentido es d e suma imp orta ncia defini r los pa rm etros fsicos que revel en co n
mayor p recisin las p articula rid ades asocia das a la cali da d del caca o
Porcela na.
Por lo qu e se evalu aron los siguie ntes factores post -cosech a qu e influy en so bre
la ferme ntacin
del cacao cri ollo p orcel ana: tipo
de ferment ado r (TF ),
frecuenci a de re mocin (FR ), agu ante de l a maz orca (AM) y el tiemp o d e
18
ferme ntacin (TPF ). La meto dolo ga consisti en un dise o d e bloq ues al aza r
con un a rre glo factori al do nde se estu diaron cuat ro factores (T F, FR , AM, TPF).
Las varia bles estudi ad as fuero n: temp erat ura de la m asa d e cacao y el ndic e
de fermentaci n. L os resulta dos mostraro n dife re ncias altame nte significativas
(P<0,01 ) pa ra tod os los factores de estudi os y para las d os variabl es
analiza das, en relacio n a las inte raccion es, stas reflejan que l os mximos
valores de temp eratura (45, 4C ) se o btuvieron en el caj n cu adrad o y ag uant e
cero. L os trata mientos de re mocin c ad a 2 4 h oras tambi n re gistraron l as
mayores l ecturas a l as 72 horas de f erme ntacin (4 6,5C ) y (46 C ) e n amb os
casos.
El mayor ndice d e ferme ntacin se obtuvo e n ferm enta dores cuad rad os
(65,4% ) y para la interaccin (AMxFR ) la mej or com binaci n res ulto ag uant e
cinco con remocio nes ca da 24 h oras a l as 96 ho ras d e inicia do el p roceso. L os
resultad os pe rmiten c oncluir qu e am bas vari abl es obtie nen sus m ximos
valores e n fe rment ado res cu adrad os, agu ante ce ro, remoci ones ca da 2 4 y 7 2
horas de fe rme ntacin pa ra la te mpe ratu ra y 9 6 h oras p ara el n dice d e
ferme ntacin.
19
CAPT UL O 3: MET ODOL OGIA DE L A IN VE ST IGACIO N:
La m etod ologa a utilizar en el p roceso de investigaci n se describ e a

continuaci n:
En prim er l uga r se efectu aron visitas de camp o, con el obj etivo de dete rmin ar e
identificar el caca o Trinit ario, d esde la base a gro morf olgica tom an do com o
parmetros de me dicin los indica dos p or C astane da, Bonill a y Prez, 201 2.
Los cuales ser n descritos en l a discusin de resulta dos
Para ef ectuar sta i nvestigacin, se realizaron diferentes eta pas, comenza nd o
con la eta pa A gro mo rfolgica pa ra co noce r mas ace rca d el cacao t rinitari o,
que se describi r en la fase de resultad os, la part e ex peri mental q ue es l a
ferme ntacin ta nto M tod o co nvencio nal com o M tod o N o C o nvencio nal, y
anlisis micro biol gicos, y fsico qumicos p ara d etermi nar la c alida d d e l a
ferme ntacin tanto co nvencio nal como n o conve ncional.
3.1 C orte y s elec cin del fru to en el cam p o:
sta etapa se realizo sel ecciona nd o los frutos
del tipo trinita rio, s e tomo e n cuenta
el
moment o d e ma du raci n d e los frutos, cuyo

estado se rec onoci por l a coloracin d e los
mismos.
Es
necesario
ase gu rarse
de
la
madu rez a decua da de los frutos a ntes de la

cosecha, para evitar la mezcla de gran os con
distintos niveles de d esarroll o y la p rdid a de
calidad
en
la
fe rme ntacin.
Los
frutos
seleccionad os posteri orm ente se trasla da ron

Fig . 8 Selecci n y c orte de
Mazorcas de Cacao,
Hacienda la Carrera
al labo rato rio d e C EN SALU D , de la U niversidad

N acional.
20
3.2 Peso de m azor ca s

Se peso 75 m azorcas en u na b ala nza C OBOS PR ESIC ION C B - JU N IOR
MAX/D 60070.01 g. H aciendo u n peso total en mazo rcas de 51.2 5 lb, cuyo
prom edi o en mazo rca fue d e 0.86l b.
3.3 Partida y desg ran ada de la s Mazorc as

Los frutos se clasificaron de acue rdo a
la
calida d
qu e
presenta ro n,
sta
seleccin se hizo en el la bo rato rio con

el obj etivo de unifo rmizar las mu estras
que fu eron ev alua das. sto se realizo
partie nd o la mazo rca co n u n cuchillo
tratan do de n o da ar las semillas,
Fig . 9 Mazorca de cacao Trin itario
Partida
lueg o de p artid o la mazo rca se sepa ro

las
semillas
de
su
place nta
se
clasificaron de acue rd o al mt odo d e fe rme ntacin seg n el expe riment o

made ra o pl stico.
3.4 Tom a de m edida s a los gra nos
El peso total de l a semill a extrad a co n muclag o fu e 2 0.45lb y su
prom edi o fue de 0.27lb po r mazo rca. L ueg o se realiza ro n
medicion es a 1 0 semill as d e la masa o bteni da (2 0.45l b); cuy o
prom edi o en semillas fue: largo 2 5.07, anch o 16.5, g rues o 10.7 2
datos dete rmin antes pa ra o bten er ren dimient os de ferm entaci n.
Fig . 10 Me dicin de sem illa

utilizan do un pie de rey
21
3.5 Ferm en ta cin de las s em illas

D e la masa obte nid a de l as semillas
frescas
se
dividiero n
en
tres
rep eticiones con p eso de 3.4l b pa ra

MN T en las cual es se inocul aro n con
levadu ra S. cereviceae al 0.05% ; L as
semillas
inocul ad as
recubi ertas
con
pre pa rad a
con
un a
azc ar
(sacaros a) al 2 1% de
Fig . 11 Sem illas de Cacao Trinitario
Frescas, pre a la ferm entacin
(21
Brix ).
Se
fueron
solucin
de
ca a
concentracin
hom og eniza ron
las
muestras e n tres repeticio nes. El pH de
las muestras fue de 4 y la temp eratura inicial 22C .

En la mu estra M T las semillas se coloca ro n e n caj as d e m ad era d e C e dro co n
dimensio nes d e: (30cm x 1 5cm x 12cm ) En ste expe rime nto l as semillas
fuero n cu bie rtas con h ojas de hu erta tal como se realiza e n l a hacien da Sa n
Jos del re al La carre ra. Se efectua ro n las medicion es de tem peratura con u n
termm etro d e mercu rio con un a escala de 0 -1 00C ste proc eso se efectu
cada 2 4 ho ras , du ra nte cuatro das q ue dur la fe rme ntacin.
Se efectu cad a
24 ho ras movimie nto (volte o) de las masas con el obj etivo de favorecer l a
aire acin y asi mej ora r las co ndicio nes d e fe rme ntacin. sta ope raci n fu
realiza da e n un la ps o de cu atro das tiemp o qu e du r la ferment acin.
3.6 A nlisis Fsico y Qum ico
D urante el proceso de ferm entaci n y fin alizad o el p roceso d e fe rment acin s e
realiza ro n control es de los siguie ntes parmetros:
Slidos Solu bles Totales (Gra dos Brix)
% cido Actico
% de Alcohol
D eteccin de micro org anismo de leva duras y bacterias

PH
Temp eratu ra
22
3.7 D ESA RR OLLO D E LA S TC N IC A S Y PR OC ED IMIEN TO D E A N LISIS

D E LA SEMILLA S FER MEN TA DA S
3.7.1 Pro cedim iento pa ra la
D eterm inacin del
Potenci al de H idrogeno (pH ) o con cen tra cin de

hidrogeno.
Se calibr el potenci metro

Se
estand ariz
los
el ectrod os
con
sol ucin
amortig ua do ra (buffer) de 4 y 7
Se limpian los el ectrod os con agu a destila da
Fig . 12 potenc im etro
Se tom un a m uestra d e 0.3 ml del j ug o d e

muclago
Se reviso la lectu ra d e la mu estra int rod ucien do los el ectrod os en 3
difere ntes pu ntos para lue go o bten er la me dia
3.7.2 Procedim ien to par a la determ in acin de % de cido ac tic o, slidos

solubles y niv el de alcohol.
Para l a dete rminaci n de cido actico, alco hol y l a ca ntida d d e slid os

solubles tot ales (B rix) pres entes, e n las muestras se u tilizo el mtod o po r
refractom etra. El dato se m uestra e n la p antall a y ste bsicame nte facilita el
proce dimie nto de m edicin.
A ) D eterm inacin d e alcohol :
Se calibr a 0%
Se le agre g 0. 3 ml de ag ua d estilada e n la p risma
Se presio n start, obse rvan do qu e ma rqu e 0
Se obtuvo 0.3 ml de m uclago l os cuales se col ocan en
el prisma
Se presio n start
Se observa n el resultad o en p orce ntaje
Fig . 13 Refractm etro para
la determ inacin de
porcentaje de alco ho l
23
B ) D eterm inacin d e cido ac tico :
Se calibr a 0%
Se agreg 0.3 ml de a gua destilad a en el p rima
Se presio n 0
Se tomaro n 0.3 ml de mucla go qu e se colocan e n el
prisma
Fig .14 Refractm etro para

la determ inacin de
porcentaje de cid o actico
Se presio n start y se observ el resultad o

Si el resultad o pasa del 2 0 % se realiza u na dil ucin d e 0.1 e n 1 ml d e
agu a destilad a.
C ) D eterm inacin d e Slidos Solubles to tale s (B rix)
Se calibr a 0% colocand o ag ua d estilada

Se tomaron 0.3 ml de m uclago
Se observa n los resulta dos exp resad os en po rcentaj e
Fig .15 Refractm etro

para la determ inacin de
slidos so lu bles t otales.
24
3.8 Meto d o lo g a de anlisis

3.8.1 T cn ica en la p reparacin d e med ios d e cu ltivo
Para la i nocul acin, crecimiento e ide ntificacin d e stos micro org anismos s e
hace uso d e los siguient es medios de cultivo qu e se describ en a co ntinuaci n:
3.8.1.1 Material y Equipo
Autoclave
Erlenm eyer
H ot Plate
Pipetas gra du ad as estriles de 1 0ml
C ajas de Petri estriles
Portao bjetos
3.8.2 Medio de cul tivo Stan dard
El Agar Mtod os Estnda r es un medi o utilizado p ara el recu ento d e bacteri as

aerbicas a parti r de ag ua, ag uas residu ales, alime ntos y pro ductos lcteos.
ste medio tambi n es conocid o como Aga r c ue nta estnd ar.
El Agar Mtod os Estnda r fu
desarroll ado por Buch bin de r Baris an d
Goldstein e n 19 53 como u n re qu erimie nto de la Ame rican Pu blic H ealth

Association. ste medio se formul a con los ing re dientes o rigi nales. El extracto
de leva dura y la pe pton a d e casena han sid o utilizad os en me dios dise ad os
para estudi ar l a presencia de mic roo rg anismos termoflicos en p ro ductos
lcteos desde 1 928. L a pept ona d e gel atina y el extracto de levad ura
pro po rciona n la fu nte d e carbon o y nitr gen o. La dextrosa es el carb ohi drat o
ferme ntable y el ag ar es a diciona do com o ag ente solidificante.
25
3.8.2.1 Frm ula :
Pepton a de C asen a 5.0
D extro sa 1.0
Extra cto d e levad ura 2.5
A gar bac teriolgico 1 5.0
pH 7.0 0.2
3.8.2.2 Mto do d e p reparacin :
1. Pesar 11.1 g del m edio en u na bal anza SAR TOR IU S BL60.

2. Agre gar 300 ml de a gua destilada en Erle nmeye r de 5 00ml.
3. Aadi r el medi o ya pesad o al Erle nmeye r.
4. C olocar el
Erle nmeye r e n u n H ot Plate A GITAD OR MAGN TIC O
AN ALGIC O (AGIMATIC -N ), cale ntar a 100 C y mezclarl o p or medi o

del imn a 800 r.p.m.
5. Se coloc el Erlenm eyer con la diluci n en u n auto clave pa ra su
esterilizacin a 1 20C d urante u na h ora y medi a.
3.8.3 Medio de cultiv o MR S
El Agar M.R .S. fu d esarrolla do po r Ma n, R og osa y Sh arpe pa ra prov eer u n

medio q ue pu die ra evide nciar u n bu en crecimie nto de lactob acilos y otras
bacterias cid o lcticas . El medio de cultivo pe rmite u n ab un dant e desa rrollo d e
todas las especies de lactob acilos . La pe pton a y glucosa constituyen la fuent e
de nitrge no, carbon o y de otros eleme ntos necesa rios p ara el crecimient o
bacteria no. El mo nol eato d e sorbitn, m agn esio, man ga neso y acetat o, ap orta n
cofactores y pu ede n in hibir el d esarrollo de alg unos microo rga nismos. El citrato
de amoni o acta com o a ge nte in hibito rio del crecimiento d e b acterias Gra m
neg ativas.
26
3.8.3.1 Frm ula :
Proteosa p epto na N 3 10.0

Extracto de carn e 8.0
Extracto de levadu ra 4. 0
Glucosa 20. 0
Monol eato d e sorbit n 1 ml

Fosfato dipot s ico 2.0
Acetato de sodio 5. 0
C itrato de amo nio 2. 0
Sulfato de ma gn esio 0.2
Sulfato de ma ng aneso 0.05

Agar 1 3.0
3.8.3.2 Mtodo de pr epar acin
Pesar 15.6 6g d el medi o en una b ala nza SAR TOR IU S BL60.

Agre gar 300 ml de a gua destilada en Erle nmeye r de 5 00ml.
Aadi r el medi o ya pesad o al Erle nmeye r.
C olocar el
Erlenm eyer en u n H ot Plate AGITAD OR MAGN TIC O
AN ALGIC O (AGIMATIC -N ), calentar a 1 00C y mezclarlo
po r medi o

Se coloc el Erlen meye r con la diluci n en u n auto clave p ara su
Esterilizacin a 12 0C du rant e una hora y media.
27
3.8.4 Medio de cultiv o R A E

Medio de cultivo q ue contie ne l os compo nent es necesa rios pa ra desa rroll ar el
crecimiento de b acterias acticas. Junto co n l os ele ment os pe pton a, gl ucosa,
fosfato
sdico,
agar
cido
ctrico,
evitan
el
crecimie nto
de
otros
microorga nismos, lo que lo h ace u n medi o de cultivo muy selectivo particula r.
3.8.4.1 C om ponen tes :
Glucosa 40 g
Extracto levadura 10 g
Pepton a 10 g
Fosfato sdico 3,38 g

cido ctrico 1,5 g
Etanol 20 ml
cido actico 10 ml
Agar 1 0 g
Agua 1 Litro
3.8.4.2
Modo de prep ara cin
1. Agre gar 500 ml de a gua destilada en Erle nmeye r de 1 00 0ml.

3. C olocar el

esterilizacin a 1 20C d urante u na h ora y medi a.
28
3.8.5 Medio D extr osa Sa borau d
El Agar D extrosa Sabo uraud es un m edio utilizad o pa ra el cultivo de ho ng os y

levadu ras. El Ag ar de dextrosa s a bou ra ud es u na m odificacin a l a f rmul a
origi nal d el Aga r de D extrosa d esarroll ado por R aym and Sa bo uraud. ste
medio es utilizad o pa ra el cultivo de h on gos pat ge nos, particula rme nte d e
aqu ellos asocia dos con inf ecciones d e piel. L a alta co ncentracin d e d extrosa y
la acidez del pH hace n a ste un m edio selectivo pa ra h on gos. C on la adici n
de cicloheximi da, estre ptomicin a y pe nicilina, se obtien e u n excel ente m edi o
para el aislamie nto pri mari o de d erm atofitos.
ste medio es tambi n utilizado p ara la dete rmin acin micro biol gica e n
cosmticos y para evalua r la presencia de hon gos e n alim entos. En ste m edi o
las pepto nas p rove en la fu ente de ca rb ono y nit rg en o pa ra el crecimie nto d e
los microorganism os, la dextrosa acta com o fuente d e en erga y el aga r es
agreg ado com o ag ente solidificant e.
3.8.5.1 Frm ula :
D extro sa 4 0.0
Pepton a de C asen a 5.0
D igerido Pancre tico d e Tejido A nim al 5.0
A gar B acte riolgico 15.0
pH 5.6 0.2
3.8.5.2 Mto do d e p reparacin

1. Pesar 32.5 g del m edio en u na bal anza SAR TOR IU S BL60.
2. Agre gar 500 ml de a gua destilada en Erle nmeye r de 1 00 0ml.
4. C olocar el

esterilizacin a 1 20C d urante u na h ora y medi
29
3.9 In o cu lacin d e m icroo rgan ismo s

3.9.1 Materiale s y equipo
C ajas de Petri estriles
Incubad ora con term stato qu e pu eda se r mant enid o a 25 1C y

35C .
Portao bjetos
Microscpio ptico
Asa bacteriol gica.
R ecipiente d e an aerbi o AN AER OC U LT A
C ontado r de col onias d e campo oscuro, con luz ad ecua da, plac a
de cristal cuadricul ad a y lente amplificad or.
U tensilios estriles para la mani pulaci n de m uestras: jeri nga.

3.9.2 Proce dim iento:
1) Se mide 0.1 ml de mu estra con u na jeri ng a estril, lueg o pasa rla a u n

tubo bacteri olgic o con 10 ml d e agu a pepto na da. H om og eneiza r l a
muestra con la sol ucin (dilucin prim aria )
2) D e la dilucin p rimari a, tomar 1. 0 ml y colocarlo en otro tub o

bacteriol gico co n
10 ml de agu a pe pton ad a; agita r y repeti r sta
ope raci n 3 vec es. (se utilizaron diferentes aguj as esteril es en cad a
disolucin )
3) Se coloca po r duplica do e n cajas Petri estril es, 1.0 ml de cada u na d e

las diluciones d e la muestra, utilizando u na je rin ga estril.
4) El medi o a nteri orm ente p rep arado y este rilizado se enfri a y se ma ntien e
a 45 C .
30
5) En cada caja d e Petri con in culo, se vierte d e 15.0 a 20.0 ml d e los

medios a 4 5C . El tiempo transcurrido e ntre la p re pa racin d e las
dilucion es y el mom ento en q ue es vertido el me dio de cultivo n o d eb e
de exced er d e 20.0 min.
6) Se mezcla cuida dosam ente el medi o con seis movimie ntos de d erecha a
izquierda, seis en el sentid o de l as man ecillas del reloj, seis e n sentid o
contra rio y seis d e atrs h acia adel ante, so bre u na s upe rficie lisa,
tenien do c uida do de n o h ume dece r con el medi o la tap a d e l a caja d e
Petri. Permitir qu e la mezcla en l as cajas Pet ri solidifiq ue, d ej ndol as
rep osar sob re u na sup erficie h orizont al fra.
7) Se coloca en la incu ba dora a 2 51 C y 351C
8) Se cue ntan las colo nias de c ada pl aca d espu s d e 2, 3 y 5 das d e

incubaci n (ste ltimo para el Me dio dextrosa s abu ro ad.)
9) Se realiza un a tincin con colo rant e cristal viol eta y lu gol y safra nin a
(tincin d e gram)
10) Se detall an l as uni dad es form ad oras de col onias por gramo o mililitro
(U FC /g o ml) de micro org anismo (cada uno en form a ind ep endi ente ).
11) Se
describ e
las
caractersticas
macroscpicas
microscpicas
observa das, de l os microo rg anismos d esarrolla dos a p artir de la m uestra

analiza da
31
3.10 C lculo y Expr esin de los R e sultad os
3.10.1 A nlisis C uanti tati vo
Se hace un re po rte d e la pa rte cu antitativa d e ste anlisis, se cue ntan l as

colonias p rese ntes y calcular el n me ro de lev adu ras y b acterias p or se pa rad o.
D e sta manera se pu ede calcul ar las uni da des form ado ras de col onias.
sto se logra m ultiplicand o el nm ero de U FC enc ontradas e n u na caj a
rep rese ntativa, por el inve rso d e la diluci n correspo ndie nte a esa caja.
Al no e ncontrar col oni as caractersticas de l evad uras y b acterias, el resulta do a
rep orta do es: men os de 10 U FC /ml (sensibilid ad d el m tod o).
Para cu alqui era de l os casos citados se rep orta el tiem po de incu baci n en el
que se realiz la cua ntificacin.
Para cu alqui era d e los casos citados se rep orta por s epa ra do el resulta do de l a
cuantificacin de b acterias y levad uras.
3.10.2 Se cado de Grano d e C acao

C on el o bjetivo d e re ducir l a hum eda d de la se milla fe rme ntad a, se expusie ro n
las semillas al ai re li bre e n el sol du rante p er o dos de tres h oras matutin as y
tres ho ras vesp ertin as d urante t res das. P ara ser crtica la evalu acin de l as
caractersticas fsico-qumica.
32
3.10.3 Pe so y dim ensin de la s em illa sec a

C on un a muestra de 3 0 semillas se realiz u na me dicin p ara det ermin ar el
prom edi o d e las di mensio nes de la rg o, anc ho y es pesor. El peso de los g ran os
de caca o se re aliz co n el o bjetivo de
con ocer la disminuci n del ag ua. L os
clculos se realizaron me dia nte la siguie nte frm ula:
CV= Vi -
D ON D E:
V i = Volum en inicial (cm )
V f = Volumen final (cm )
Pp=
x 100
D ON D E:
Mpi= Peso inicial de la mu estra

Mpf= Peso final de la mu estra
33
C A PTU LO 4: A N LISIS D E R ESU LTAD OS

Descripcin del crecim ie nto de m icro organ ism os
En la sigui ente t abla se mu estra el prome dio de crecimient o de colo nias d e

microorga nismos en los cuatro m edios de cultivo. Adems se dem uestra la
desviacin est nda r y el p rom edio de acuerdo a los d os mtod os utilizados,
mtodo tradicio nal y mtod o no tra dicion al
Tabla # 3 cr ecim iento de Microo rganism o s
M TO DO CO N VEN CIO N AL
M icroorganismos /Tiemp o
24 Horas 48 Horas
M TO DO N O CO N VEN CIO N AL
72 Horas 96 Horas
24 Horas 48 Horas 72 Horas
96 Horas
MUESTRA/CAJ A 1
ESTN DAR
Levaduras
124
110
100
88
284
28
41
39
B acterias
248
235
220
150
185
325
420
120
55
62
79
34
150
231
168
256
MRS
B acterias Lacticas
172
157
168
R AE
B acterias Aceticas
65
60
DEX TR O SA SAB U RO AD
Levaduras
425
503
416
61
24 Horas 48 Horas
72 Horas 96 Horas
96 Horas
ESTN DAR
Levaduras
MUESTRA/CAJ A 2
B acterias
300
400
250
48
176
158
40
50
21
23
18
66
11
70
40
32
28
24
11
68
436
120
72
52
MRS
B acterias Lacticas
172
284
224
R AE
B acterias Aceticas
20
Levaduras
163
548
434
562
24 Horas 48 Horas
72 Horas 96 Horas
96 Horas
MUESTRA/CAJ A 3
ESTN DAR
Levaduras
58
52
27
20
128
101
45
17
B acterias
440
256
452
211
160
50
83
35
15
11
21
16
14
40
32
0
658
253
250
180
46
26
MRS
B acterias Lcticas
8
R AE
B acterias Acticas
Levaduras
18
325
20
34
Tabla # 4 Prom edio d e cre cim iento de Mic roorg anism os
MED IO D E
C ULTIVO
MED IO ESTND AR
MED IO MRS
MED IO RAE
MED IO D EXTROSA
SABUROAD
Descripcin
MTOD O C ONVENC IONAL
MTOD O NO
C ONVENC IONAL
24
Hora
s
48
Hora
s
72
Hora
s
96
Hora
s
24
Hora
s
48
Hora
s
72
Hora
s
96
Hora
s
Levaduras
160.
67
187.
33
125.
67
52.0
0
196.
00
95.6
7
42.0
0
35.3
3
Bacterias
229.
33
126.
33
27.6
7
304.
33
166.
33
152.
00
26.6
7
350.
33
226.
33
133.
33
6.67
122.
00
65.6
7
10.6
7
292.
00
3.67
122.
00
44.3
3
21.3
3
177.
00
132.
67
39.3
3
18.0
0
95.3
3
173.
67
32.6
7
34.3
3
111.
33
Bacterias
Lcticas
Bacterias
Acticas
Levaduras
502.
67
12.0
0
11.6
7
278.
67
35
Grfi co # 1 Le vadu ras e n m edio es tnd ar
Levaduras en Medio Estndar

METODO CONVE NCIO NA L
METODO NO CONVE NCIO NA L
250
200
196
150
160.67
187.33
125.67
100
95.67
50
42
52
35.33
0 Horas
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
D escripcin:
En el grfico se mu estra el co nteo de las colo nias d e levad ura d esarrolla das e n
medio d e cultivo estnd ar en el m tod o co nvencio nal (MC F1 ) y el mto do n o
convencion al (MN C F). Se pu ed e o bserva r q ue de 0 a 24 ho ras e n el MC F 1
la
canti dad de U FC es d e 1 60.6 7X10 6, p or su p arte en el MN C F2 s e
desarroll aro n ms
las U FC con 196X10 6; sto se deb e a qu e en MN C F se
inocula ro n leva duras al 0.05% y e n MC F1 no f ue a greg ada po r lo tanto en ste

mtodo s e desa rrollan desd e cero. Pasad as las 48 h oras ocurri un alza en el
MC F1 con u na c antida d de 1 87.33X 10 6 de U FC , caso totalme nte co ntra rio d el
MN C F1 en el cul existi un a baj a consid era ble a 9 5.67X 10 6 de U FC . A las
72 h oras se o btuvo b aja co nside rabl e e n MC F1 con una ca ntida d d e
125.6 7X1 06 d e U FC , al igual q ue MN C F con un a
baja consid erabl e de 4 2X10 6 de U FC . Pasadas
las
96
ho ras
ferme ntacin
ya
l as
termin ado
levad uras
el
tiempo
en
de
MC F1
descendi eron a u n 52.0 0x10 6 y de igu al man era el

MN C F a 35.33x1 06. Al obs ervar en el microscpi o
N iko YS100
se identificaron e n el m edio
estnda r las presencias d e levad uras tales
Fig. 16 vista en microscpio de

Levaduras S. cereviseae.
como H anseni aspo ra g uillierm on dii y S. cereviseae.
36
Grfi co # 2 B ac teria s en Medio Es tnd ar
Bacterias en Medio Estndar

250
229.33
226.33
200
173.67
166.33
150
122
132.67
122
100
50
0
0
0 Horas
3.67
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
D escripcin:
En el grfico anterior se muestra el conteo del comportamiento de las colonias de
bacterias desarrolladas en medio de cultivo estndar mediante el mtodo convencional
y el mtodo no convencional. Se observa que de cero a las 24 horas en el MCF1 nos
d una cantidad de 229.33X106 de UFC, todo lo contrario con el MNCF con una
cantidad de 3.67 X106 de UFC; siendo un nivel muy bajo comparado con MCF1 . A las
48 horas hubo una disminucin apreciable en el MCF1 con una cantidad de
166.33X106 de UFC, caso con trario del MNCF en el cual existi un aumento muy
considerable 122.00 X106 de UFC. A las 72 horas se obtuvo alza en MCF1 con una
cantidad de 226.33 X106 de UFC, diferente al MNCF con un aumento mnimo a
132.67X106 de UFC; finalmente terminada la fermentacin el MC F1 disminuy
considerablemente a 122.00x106; caso contrario con el MNC F que aumenta su
nmero de bacterias a 173.67x106. Se observa en MNCF que el crecimiento siempre
fu en ascenso sto se debe a que las condiciones de temperatura, pH y humedad
eran ms favorables e n MNCF para el crecimiento de las
bacterias.
Al observar en el microscpio Niko YS100 se identificaron
en el medio estndar las presencias de bacterias acticas
tales como O xydans G luconobacter y pocas bacterias
lcticas como la Lactobacillus Fermentum.
Fig. 17 Oxydans G luconobacter
37
G rfico # 3 Bacterias Lcticas en Med io MRS
Bacterias Lacticas en Medio MRS

200
152
150
133.33
126.33
100
50
0
44.33
12
0
0 Horas
39.33
24 Horas
48 Horas
72 Horas
65.67
32.67
96 Horas
Descripcin :
levadura desarrolladas en medio de cultivo M.R.S . mediante el mtodo convencional y
el mtodo no convencional. Se observa que a las 24 horas en el MCF1 nos da una
cantidad de 126.33 X106 de UFC, todo lo contrario con el MNCF con una cantidad de
12.00X106 de UFC; siendo un nivel muy bajo comparado al MCF1 . A las 48 horas
hubo aumento en el MCF1 con una cantidad de 152.00 X106 de UFC, a l igual el MNCF
en el cual existi un aumento mnimo 44.3 3X106 de UFC. A las 72 horas se obtuvo
una baja en mtodo tradicional con una cantidad de 133.33 X106 de UFC, al igual que
el mtodo no tradicio nal con una baja mnima de a 39,33 X106 de UFC. Terminada la
fermentacin los do s bajaron muy considerablemente el MCF1 a 65.67x106 y el MNC F
a 32.67x106. Haciendo una comparacin de comportamiento
de las bacterias lcticas en el medio M.R.S. el mtodo
tradicional fu en aumento considerable ya que y el mtodo
no tradicional fu en aumento mnimo y despus disminuy,
se puede decir que fu estable. En el mtodo convencional
las bacterias acticas se desarrollaron mejor ya que al
observar en el microscpio Niko YS100 se identificaron en el
medio M.R.S bacterias lcticas que son los Lactobacillus
fermentum en grandes cantidades.
Fig. 18 Lactobacillus ferm entum
38
G rfico # 4 Bacterias Aceticas en Medio RAE
Bacterias Aceticas en Medio RAE

40
34.33
30
27.67
20
18
11.67
10
0
26.67
21.33
10.67
6.67
0
0 Horas
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
Descripcin :
levadura desarrolladas en medio de cultivo R.A.E . mediante el mtodo convencional y
el mtodo no convencional. Se observa qu a las 24 horas en el MC F1 nos d una
cantidad de 27.67 X106 de UFC, con el MNC F vemos un comportamiento casi similar
con una cantidad de 11.67X106 de UFC. A las 48 horas hu bo una baja muy mnima en
el MCF con una cantidad de 26.67 X106 de UFC, en cambio el MNC F sufri un alza a
21.33X106 de UFC. A las 72 horas se obtuvo ba ja considerable en el MC F1 con una
cantidad de 6.67 X106 de UFC, al igual que el MNCF con un baja mnima a 18X106 de
UFC. Terminada la fermentacin el MCF1 hizo un alza a 10.67x106 UFC mientras el
MNC subi considerablemente hasta 34.33x106. Haciendo una comparacin de
comportamiento de las bacterias acticas en el me dio R.A.E; ambos mtodos sufrieron
comportamiento inestable de bajas y alzas en la cantidad de
UFC.
Al observar en el microscpio Niko YS100 se identificaron en
el medio estndar las presencias de bacterias acticas como
O xydans G luconobacter que es la predomina en la tercera fase
de fermentacin y se encuentran en pocas cantidades .
Fig. 19 Oxydans G luconobacter
39
G rfico # 5 Levaduras en Med io Dextrosa Saborau d
Levaduras en Medio Dextrosa Saburoad

600
500
502.67
400
350.33
304.33
278.67
300
292
200
177
100
95.33
111.33
0
0 Horas
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
Descripcin :
levadura desarrolladas en medio de cultivo Dextrosa Saborau d mediante el mtodo
convencional y el mtodo no convencional . Se observa que a las 24 horas en el MCF1
nos d una cantidad de 304.33 X106 UFC, y el MNC F una cantidad de 278.67 X106
UFC. A las 48 horas hubo aumen to considerable en el MCF1 con una cantidad de
350.33X106 UFC, caso con trario del MNC F que obtuvo un baja apreciable a
177.00X106 UFC. A las 72 horas se obtuvo otra alza considerable en MCF1 con una
cantidad de 502.67 X106 UFC, diferente al mtodo no tradicional con una baja mnima
de 95.33X106 UFC. Terminada la fermentacin el MC F1 sufri una baja final a
292.00x106, por su parte el MNC F una alza insignificante a 111.33x106 UFC.
Haciendo una comparacin de comportamiento de las
levaduras en el medio Dextrosa Saboraud; el mtodo
tradicional fu
en aumento considerable y obtuvo una
baja moderada y el mtodo no tradicional fu
en baja
mnimo y despus se puede decir que fu estable.

Al
observar
en
el
microsc pio
Niko
YS100
se
identificaron en el medio saburoad se encontraron las

Hanseniaspora guilliermondii en pocas cantidades y la
S. cereviseae se en cuentran en grandes cantidades
Fig. 20 Levaduras, Hans eniaspora

guillierm ondii y S. cer evisea e.
40
Tabla # 5 Cam bios en la coloraci n de la sem illa durante el proceso de

ferm entacin no tradicional
Dia
Sem illa
Fresca
D ia 1
D ia 2
D ia 3
D ia 4
Imagen de Semilla
Descripcin
La sem illa Fresca de C acao Trinitario

es de color m ora do plid o.
D espus de 24 horas de ferm en tacin

se observa una coloraci n m ora da m as
Intensa.
.
A las 48 horas de ferm entacin la sem illa

com ienza tornar a u na coloraci n caf que
corresp on de a la parte ferm entada .
72 horas desp us de el inicio del

proces o la sem illa.
Al cuarto da (96 horas) la sem illa se torna

casi totalm ente caf, alcanza su porcentaje
m xim o de ferm entacin, des pus de m edir
los factores corresp on dientes se suspen di el
proces o y se dispuso a secar la sem illa
41
Tabla # 6 C am bios en la color acin de la s em illa duran te el proc eso de

ferm en ta cin tradicion al
Dia
Semilla
Descripcin
Semilla Fresca
Sem illa fresca de cacao

trinitario, col or violeta
plido.
Dia 1
Pasadas 24 horas se
torna violeta intenso
debid o a los cam bios
que la ferm entacin
est generando.
Dia2
48 horas desp us se
van tornand o cafes las
partes que estn siend o
ferm entadas.
Dia 3
Dia 4
72 horas desp us la
ferm entacin avanza
colorean do de colo r
caf m ayor parte de la
sem illa.
96 horas desp us del
inicio de la
ferm entacin, la sem illa
no ha alcanzado su 10 0
% de ferm ento.
42
Tabla # 7 C om portam iento de lo s fac tore s al cohol, B rix, cido a cti co, pH
y Tem per atur a
En la tabla se observa la variacin de los factores alcohol, grados Brix, cido actico
pH y temperatura , comparando los dos mtodos utilizados.
Descripcin
Alcohol
Grados Brix
PH
Temperatura
13
cido
Actico
0
Inicial
25
M CF1
32
M NCF1
30
15
14.7
28
M CF2
35
M NCD2
26
13
13.3
28
M CD3
4.3
37
M NCD3
26
14
14.3
25
M CD4
3.5
39
M NCD4
23
12
12.3
25
43
Grfi co # 6 com po rtam ie nto del cido ac tico
Comportamiento del cido actico en la

Fermentacion de Cacao
20
15
14.7
13.3
14.3
4.3
24 Horas
48 Horas
10
5
0
12.3
3.5
0 Horas
72 Horas
96 Horas
Descripcin :
D espus de 24 ho ras iniciad a la fe rme ntacin se obse rva e n la g rfica q ue el

MN C F (en el qu e se adicio n la soluci n d e azca r) se ge ne r m ayor grad o d e
acides q ue en el mto do co nvencio nal debi do a q ue no existe azcar qu e se l e
est aplican do.
D espus de
48
ho ras, el MN C F mostr
una l eve dismin ucin
en l a
concentracin del cid o actico, mie ntras que en el MC F1se m antuvo establ e
en el tiemp o.
Al llegar a l as 72 h oras am bos mto dos mu estran u n leve increme nto en sie nd o
el mtod o no conve ncion al el qu e mostr u n cambio m s significativo.
Pasadas 9 6 h oras, am bos mt odos sufri eron u na baja en l a conce ntraci n d e
cido acetico, siend o ms significativo la b aja q ue tuvo el mtod o n o
convencion al.
44
Grfi co # 7 com po rtam ie nto de Slidos s olubles
Comportamiento de slidos soluble s

Brix (en la solucin azucarada) en la
Fermentacin de Cacao
30
20
22
10
13
0
0 Horas
15
13
14
24 Horas
48 Horas
72 Horas
12
4
96 Horas
D escripcin :
Seg n se represent a en la grafica el inicio en amb os mtodos fu el mismo a
las 24 horas hubo u n cambio radical sien do mayo r la cantidad d e azcar e n el
MN C F como en el MC F1
El MC F1 no mostr un cam bio, se mantuvo a 4 Brix durante las ltimas 7 2
horas, mientras qu e se present u na
leve b aja en el MN C F1 de 2 Brix,
respecto a los valo res de los das ant erio res.

Pasadas las 96 ho ras el MN C F termin con 12 Brix y el MC F1 en 4 Brix
Suele se r satisfactoria un a conce ntraci n de azcar del 1 0 al 1 8% , el valor m s
corrie nte es del 12% . C u an do se tra baja con conce ntracio nes d e az car m uy
altas, del orde n de 25% , se o bserva u na deficie ncia respiratori a en la l evad ura
y un descenso d e la velocida d de ferment acin
45
Grfi co # 8 com po rtam ie nto de alcohol
Comportamiento del Alcohol en la

Fermentacion de Cacao
40
30
30
26
26
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
20
10
0
23
0
0 Horas
Descripcin:
D espus d e 2 4 h oras iniciad a la f erme ntacin como s e o bserva en l a g rfica el

MN C F(en el que se adicio n la sol ucin d e azcar) se ge ne r mayo r gra do d e
alcohol q ue en el MC F1 de bid o a que h ay mayor adicio n de azuca res qu e
ayuda n al proceso d e alcoh olizacin
Las siguient es de 72 h oras, el MN C F mostr una leve disminuci n en l a
concentracin del alco hol, al igu al que e n el MC D F1, mostrando u n po rcentaj e
del 6% al final e n el mtod o conve ncional.
La lev adu ra es afecta da en alto gra do po r la conce ntraci n d e alc ohol, un a
concentracin
alcoh lica
del
3%
ya
influye s obre
el crecimiento;
un a
concentracin de un 5% i nfluye ta nto so bre el crecimie nto cm o e n l a

ferme ntacin. C ua nd o la co ncentracin es del 10% , el crecimiento s ufre l a
paralizacin total.
46
Grfi co # 9 com po rtam ie nto de pH
Comportamiento del PH en la
fermentacin de Cacao
5
4
2
1
0
0 Horas
24 Horas
48 Horas
72 Horas
96 Horas
Descripcin:
D espus de 24 ho ras iniciad a la fe rme ntacin se obse rva e n la g rafica q ue el

MN C F (en el que se a dicion la soluci n d e azcar) el PH se ma ntuvo du rant e
las 96 H oras de fe rme ntacin, debi do a qu e las con dicion es del MN C F e ran l as
apropia das p ara qu e el PH se mantuvie ra a escala n orm al . En el MC F1 m tod o
convencion al h ubo un a baj a de PH d ebid o a que sta no est en m tod o
controla do di rigie nd o u na b aja de PH du ra nte l as p rime ras 2 4 H o ras. L as
siguientes 7 2 ho ras se mantuv o un ren dimient o de PH = 4 debi do a q ue h ub o
un am bie nte controlad o, pa ra l a ferm entaci n del c acao. ste es un facto r
importa nte e n la fermentaci n, de bid o a su imp orta ncia en el control de l a
contamin acin bacteri al com o tam bi n al efecto en el crecimie nto de l as
levadu ras, en la vel ocida d de fe rme ntacin y en l a form acin d e alcoh ol.
D urante la ferm entaci n la leva du ra to ma el nit rg en o d e l os ami nocid os
org nicos, p erdien do s u carcter anfte ro y pasa nd o a cidos, lo c ual ori gin a
una disminuci n d el pH d el me dio. C u nto ms b ajo el pH d el me dio, tant o
meno r el p elig ro d e infec cin, p ero si se trab aja con pH muy baj os la
ferme ntacin es muy lenta, ya qu e la l evadu ra no se desa rrolla de la f orm a
convenie nte. Seg n estudios se hall qu e el pH ms favorable pa ra el
crecimiento d e la saccharomyces cerevisiae se e ncue ntra e ntre 4.4 5.0, con
un pH de 4.5 p ara su crecimiento ptimo.
47
Grfi co # 10 c om portam iento de Tem pe ra tura
Comportamiento de la temperatura en la
Fermentacin de Cacao
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
28
24 Horas
48 Horas
39
37
35
32
28
25
0 Horas
25
25
72 Horas
96 Horas
Descripcin :
D espus de 24 ho ras iniciad a la fe rme ntacin se obse rva e n la g rafica q ue el

MN C F (en el q ue se adicion la sol ucin d e azca r) se gen er u n leve ascens o
de 3C en l a tem pe ratu ra comp ara da con el MC F1 qu e a ume nto 7C . El calo r
es prod ucido po r la respiracin de las semillas qu e e n sta fase se e ncue ntra n
latentes, se le conoce como calo r de respiraci n. D espus de 4 8 ho ras, el
MC F1 no mostr u n cambi o de temp eratura se mantuvo a 28C , mientras qu e
se prese nt u n alza l eve e n el mt odo no co nvencio nal d e 3 C , respecto a l os
valores d el da a nteri or. En sta tem pe ratu ra se p ro duce la m ue rte del emb ri n
y a partir de ah se dese ncad ena n las re acciones bio qumicas pa ra la fo rmaci n
de los precu rsores de aroma y sa bo r. Pasad as 72 ho ras, el MN C F sufri un a
baja de tem pe ratu ra de 3C , mientras qu e el MC F1 subi o 2 C . lueg o d e 9 6
horas el MC F1 fi naliz co n un a tem pe ratu ra de 3 9C , y el MN C F no sufri
cambios y se mantuvo a 25 C .
Las semillas de amb os mto dos al ge nerarl es un volte o se gen era ai reaci n,
sto contrib uye al crecimie nto d e microo rg anismos lo gra nd o qu e stos se
distribuyan
unifo rmem ente
en
la
masa
de
semillas
as
logra r un a
ferme ntacin h omo gn ea y 90% compl eta.
48
Se deb e tene r en cuent a que p ara cada leva dura existe una temp eratura
ptima de d esarrollo, en la cual se m uestra activa. Ad ems, se tiene u na zon a
inde pen die nte d e la tem pe ratu ra ptima e n la cu al la l evadu ra a n present a
actividad; a medi da q ue se al eja d e la temp erat ura ptima su activida d
disminuye nota blem ente. P or de baj o d e l a tem peratura se al ada como mnim a
y por e ncima d e la m xima, las levad uras contin an vivien do e n estad o late nte,
sin emba rg o, al expo ne r cual quie r leva dura a una te mpe rat u ra demasi ado po r
un tiemp o de 5 min utos se pro duce su m ue rte. En el caso d e la saccha romyces
cerevisae se tiene un d esarrollo ptimo e ntre 2 835 C , recome nd able 30 C .
49
Tabla # 8 Dimensiones de las semillas

Esquematizacin de los valores en largo, ancho y grueso de las semillas de cacao
Seco No Tradicional
1
PROMEDIO
Largo
1
20
2
22.7
3
24.9
4
20
5
23.2
6
23.5
7
20.7
8
26.8
9
22.1
10
18
1
27
2
25.8
3
27.3
4
21.4
5
20.8
6
22
7
20.9
8
25.7
9
22
10
20.6
1
24
2
23.5
3
21.8
4
22.7
5
23.9
6
20.7
7
23
8
23.2
9
24.6
10
24.6
22.92**
Ancho
Grosor
8.5
13
12.2
5
13
8
11.8
8.2
11.2
5.3
12.4
6.1
12.1
6.7
13
6.5
11.5
7.4
12.4
9.7
13.2
11.4
10.6
9
15
7.3
13.7
11.1
12.2
10.3
10.9
5.1
11.4
7
13.5
7.3
12
7
11.6
5.8
12.3
6.1
11.9
7.5
15.6
4.8
11.8
7.6
12.2
7.1
11.8
8.2
12.6
6
12.8
5.8
14
6.1
13.7
6
12.36**
7.41**
2.10 *
Seco Tradicional
1
Largo
25.7
Ancho
Grosor
13.4
10
1
5
24.5
23
23.1
23.8
13
7.7
12.1
6.7
12.7
8.1
12
9.4
2
6
10
23.3
21
20.7
11.5
6.6
12.7
7.2
14.1
7.3
10
22.1
25
23.1
22.7
15.4
6
11.3
8
12.6
7.7
13.4
7
20.7
22
23.2
21.7
20.5
21.7
21.6
21.4
27.2
11.7
8.1
11.6
7.4
12.3
7
12
6.6
14
6
11.7
7.7
12.6
6.3
11.6
7.1
12
5.8
22
27
22.5
12.3
8
12.7
7.1
10.1
7
3
5
10
25.2
21.7
22.6
22.2
21
20.5
22.76**
13
6
12
7.2
11.4
6.8
11.1
8
12
7.2
11.7
8.7
12.33**
7.32**
2.05 *
Fresco
4
5
10
10
10
Largo
22.5
26.9
26
22.1
28
24.8
24
24.9
23.7
26.2
23.6
22.2
26
26.5
23.8
23.1
23
24
28
26
25
27.2
28.2
23.3
24.1
27.9
24.8
25.7
27.8
23
25.07**
Ancho
Grosor
16.2
9.6
15
12.2
15.7
8.4
14.1
12.7
15
8.1
14.3
12.8
16.4
13
15.1
12
15.8
10.1
15.9
13
16.6
13
15.8
11.8
16.2
8.5
14.7
13.7
15.7
9
14.3
9.7
13.2
8.8
16
8
14.8
13.4
15.7
9.8
15.9
10.1
15.7
12
14.6
12.7
15.4
8
14.7
7.8
14.2
12
14.9
9.1
15
8
13.1
11.7
15.3
12.6
16.5**
4.43 *
Nomenclatura:
**: mm
*: cm
50
Tabla # 9 prom edio s y rendim ien tos de la s em illa de cac ao

P eso Total de M azorca
51.25
P eso P romedio por M azorca
0.63
P eso Total de Semillas con M uclago
20.45
P romedio de semillas con muclago
0.27
P eso Fresco Total Muestra T
13.01
P eso Seco Total Muestra T
4.09
P eso Fresco Total Muestra NT
6.97
P eso Seco Total Muestra NT
2.32
Rendimiento de Muestra T
31.44
Rendimiento de Muestra NT
33.29
El ren dimie nto d e la mu estra de m tod o tradicion al tie ne un 31.4 4% d el

ren dimie nto resp ecto al peso fresco y seco de las semillas, mientras que e n el
mtodo no tradicio nal m uestra un 3 3.29% , p rese ntan do u n mayo r ren dimient o
la muestra n o tradicio nal.
Grfi co # 11 dim en sione s de la sem illa:
Dimensiones de la semilla
80
70
68.56 66.71
53.62
60
52.49
50
40
31.44
33.29
Metodo convencional
30
Metodo no convenciona l
20
10
0
Perdida de
peso
Rendimie nto
Cambio de
volumen
51
Grfi co #1 2
C om paracin de re sultad os de an lisis brom a tolgicos d e
Mtodo conv encion al y m todo no con ven cional.
Analisis Bromatologicos de MCF1 y MNCF

30
25
20
15
METODO NO
CONVENCIO NA L
10
3.82
3.88
25.75
24.98
20.82
21.27
4.53
6.019
12.54
13.5
Los resulta dos de los an lisis bromatol gicos con respecto a grasa, prot enas,
hume da d y ceniza p resent mayo res valo res en el mto do no conv encion al,
sto nos i ndica qu e es una bu en a p ro pu esta al mejo rami ento de la cali dad d el
cacao p ara el abo ra r ch ocolate.
L os resultad os fue ron
estadsticament e
distintos, pero p rximos ent re s.
52
C A PTU LO 5: C ON C LU SION ES
1.
La semilla de cac ao tri nitario presenta n las sig uientes ca ractersticas
segn l os descripto res a gro -mo rfol gicos utilizados, el p rom edio del p eso d e
semilla con m uclago res ult d e 0.2 7 g ram os, con u n la rg o d e 2 5.07mm, anch o
16.5mm y
g ru eso 10.7 2mm. Po r su pa rte el cotile d n d el gra no d e C aca o
Trinitari o es color mo rad o intenso, el cul a me did a avanza la ferm entaci n se

torna caf.
2.
El mtodo no tradicion al pe rmite obte ne r un a ferme ntacin e n men or
tiempo 4 d as, comp ara do con el mt odo d e fermentaci n tradicio nal qu e d ura
un tiemp o ap roxima do de siete d as.
3.
Al
realiza r
los
an lisis
Microbiol gicos
en
amb os
mtod os
de
ferme ntacin, se obtie ne en l os res ult ados qu e MN T se desa rrollaron m s

levadu ras q ue b acterias, sto se d eb e a q ue l a temp erat ura en MN T e ra n baj as
y no favorecan el crecimient o de stos microo rg anismos, p or lo t anto l a
ferme ntacin e n MN T no lleg o a la fase actica.
4.
Los gra nos d e cacao ferm enta dos en MN T tiene n mayor conte nid o de
grasa (2 1.27/1 00g r) y p roten as (13. 5/10 0gr), sto d m ejo res caractersticas
org an olpticas, las cu ales son imp orta ntes e n la i nd ustria del caca o para l a
elab oraci n de ch ocolate d e calida d.
53
C A PTU LO 6: R EC OMEND AC ION ES:
1) R ealizar n uevos estudi os aplican do u na sol ucin azuc ara da al 25 % d e

concentracin, y levadura S. C ervesiae e n un 0.1 0% con el obje tivo d e
observa r los cam bios e n tiemp o d e ferm entaci n d e semilla, comp arad o
con los del mt odo tradicio nal (7 dias), y los resulta dos o bteni dos en l a
prese nte investigaci n (4 di as).
2) Se
recomie nd a
brom atol gicos
realiza r
(Protein a,
en
G rasa,
futu ras
investigacion es
anlisis
H ume dad )
a nalisis
C e niza,
microbiol gicos pa ra d etermina r la p resencia de b acterias lcticas y

acticas por l os siguient es medio de cultivo: Aga r d extrosa Sa bo rau d,
cido
Acticos
etan ol
R uthe rford,
aga r est nda r,
ag ar MR S,
comparan do sus com po rtamie nto tanto en el m todo N o tra dicion al

como tradicio nal.
3) Es importante controlar parmetros como pH
Brix, alcohol, cid o
actico y Temp eratura de las semillas d e caca o e n el proces o d e

ferme ntacin, p ara evitar su d eteri oro po r crecimiento de m oh os en l as
semillas.
54
C A PTU LO 7: FU EN TES A N TES C ON SU LTA D A S
Vianey C asta eda Abreg o, Guill erm o Bo nilla, Jua n M anu el Pe rez (20 11 )
Manu al
de
aplic acin
de
d escriptores
agromo rfolo gicos
para
la
identificacin y registro de cultivares salvadore os
Smilja Lam be rt, Mars, Inc (20 10) Fe rme ntacin del cac ao aspectos
gen erales, disponi ble e n:
http://w ww .canacacao.org/ uplo ads/smartsection/1 9_F erm entaci n_d el_
C acao.pdf
Fede racio n n acion al d e cacaote ros ( 2 010 ), G en erali da des d el cultivo

del cacao, dispo nibl e en:
http://w ww .fedecacao.com.co/cw /ca/eventos/2011monilia/com/fed ecacao -g en erali da des -cultivo-caca o.pdf
Mara
d el
C arme n
W ache r
R oda rte
(2 01 1),
Micro org anismos
chocolate, dispo nibl e en:

http://w ww .revista.unam.mx/vol.12/num4/a rt42/a rt42.p df
Adria na M erce des Ma rro qui n R od rigu ez (2 01 1), Ecotipos de caca o e n El

Salvado r, disponi ble e n:
http://w ebque ry.ujmd.ed u.sv/siab/bvirtual/BIBLIOTEC A% 20VIR TU AL/TE
SIS/04/IAL/AD TESME000125 7.pdf
55
ANEXO S
MTOD OS D E D ETER MIN ACIN BR OMATOL GIC A

PR OC ED IMIEN TO
PAR A
D ETER MIN AR
MATERIA
GR ASA -MTOD O
SOXH LET
1.- OBJETIVO
D etermin ar la conce ntraci n de la m ateri a grasa crud a o extracto et reo li bre.
2.- C AMPO D E APLIC AC IN
El mtodo es a plicabl e en m uestras d e alime ntos en g en eral y e n alime ntos
que no h an
sid o sometid os a trat amient o trmico.(c arn es, cere ales, sopas,
gra nos de semill as, etc)
3.- FU N D AMEN TO
U na cantida d previame nte hom og eneiza da y seca, medid a o pesa da d el
alimento se somete a u na extraccin co n te r d e p etrl eo o te r etlico, libre d e
perxidos o mezcla de am bos. Posteri orm ente, se realiza l a extraccin total d e
la materi a grasa libre po r soxhlet.
4.- R EFER EN CIAS
4.1.-Official Metho ds of Analysis A.O.A.C . 15th Edition, U .S.A.(1990)
5.- TER MIN OLOGIA
N /A
6.- MATER IAL Y EQU IPO
6.1.- Sistema extractor Soxhl et
6.2.- Balanz a an altica
6.3.- Pap el filtro o ded al de cel ulosa
56
6.4.- Ba o termo rregul ad o

6.5.- Estufa de aire 10 3 + 2C
6.6.-Tamiz d e malla d e 1 mm
6.7.- Manto cal efactor o rota vapo r
6.8.- Materi al usual de lab oratori o
7.- R EAC TIVOS
7.1.- ter etlico P.E. 40-60C
7.3.- ter de petrl eo P.E. 40-60C
8.- PR OC ED IMIEN TO
8.1.- Pre paracin d e la mu estra:
En muestras con m ucha h ume dad hom oge neiza r y secar a 10 3+ C en estufa
de aire conside ra nd o el tipo de m uestra.
8.1.1.- Mole r y pasar p or tamiz de m alla de 1 mm
8.1.2.- Pesar e n du plicado 2 5 gra mos de mu estra prep arada e n el de dal d e
extraccin o pap el filtro p reviam ente pesa do y tapa do co n al god n desgrasad o.
R egistrar m
8.1.3.- Secar el m atraz de extraccin po r 30 mi n a 10 3+ 2C .
8.1.4.- pesa r el matraz de extraccin registrar m1
8.1.5.- po ne r el matraz de extraccin e n el sistema soxhlet el de dal e n el tub o
de extraccin y adicio na r el solvente al matraz.
8.1.6.- Extrae r la m uestra con el solvente po r 6 a 8 horas a u na vel ocida d d e
conde nsacin d e 3-6 gotas/seg.
8.1.7.- U na vez termin ad a la extraccin elimin ar el solvente po r eva po raci n e n
R ota vapor o b a o Mar a bajo cam pa na. H asta que n o se detecte olo r a te r.
57
8.1.8.-Seca r el m atraz con l a g rasa en estufa a 1 03+ 2 C po r 1 0 min, e nfria r e n

desecad os y pesar. R egistrar m 2.
9.- C LC U LO Y EXPR ESIN D E R ESU LTAD OS
% grasa cru da =
x 100
D onde: m peso de la mu estra

1 tara del mat raz solo
2 peso matraz con g rasa.

100% g rasa cru da en b ase seca = % grasa cru da x ------------------------ 10 0 -%
hume da d
D onde: m peso de la mu estra
1 tara d el matraz solo
2 peso matraz con g rasa.

Los resulta dos se inform an e n % de mate ria grasa e n base seca o h me da.
Prome dia r los valores o btenid os y expresar el resulta do con 2 decimal es.
R epetibilid ad: la diferencia d e los 2 resultad os no de be ser sup erio r al 2 % del
prom edi o.
58
3.11.2.
PR OC ED IMIEN TO
PAR A
D ETER MIN AC IN
DE
PR OTEIN AS -
MTOD O KJELD AH L
1.- OBJETIVO
D etermin ar la conc entracin d e nitr ge no p rese nte en l a muestra pa ra lu eg o
ser transformad o a travs de un factor e n protena.
2.- ALC AN C E Y C AMPO D E APLIC AC IN

El mtodo es aplica ble a alim entos e n ge neral.
3.-FU N D AMEN TO
El mtod o se basa en la destrucci n d e la m ate ria org nica con cid o sulfric o
concentrado, form nd ose sulf ato d e amo nio qu e e n exceso d e hidrxido d e
sodio libe ra am onaco, el q ue se d estila recibi nd olo en:
a) cid o sulfric o d nd e se form a sulfato de am oni o y el exceso de cido es
valora do con hi drxido d e sodio e n presencia de roj o de m etilo, o
b) cid o b rico f orm nd ose borato de amo nio el que se val ora con cid o
clorhdric o.
4.- R EFER EN CIAS
4.1. - A.O.A.C . Official Methods of Analysis 13 th Edition, 1984.
4.2. - FAO Foo d an d N utrition Pap er 1 4/7 R oma, 19 86
5. - MATER IAL Y EQU IPO
5.1.- Balanz a an altica, sensibilidad 0.1 m g.
5.2.- Equip o Kjeld ahl
5.3.- Manto cal efactor
5.4.- pH metro
59
5.5.- Materi al usual de lab oratori o.

6.- R EAC TIVOS
6.1.- cido sulfrico conce ntra do, p.a.
6.2.- Sulfato de potasio o sulfato d e sodio, p.a.
6.3.- Sulfato cp rico, p.a.
6.4.- Sol ucin de hid rxid o d e so dio al 1 5 % . D isolver 150 g de N aOH y
completa r a 1 litro.
6.5.- Sol ucin de ci do sulf rico 0.1 N . Toma r 2.7 ml de 2
2
3 completa r
a 1 litro, lue go estan da rizar con
conc. y
anhi dro p.a.
6.6.- Sol ucin de hid rxid o d e so dio al 3 0 % . D isolver 300 g de N aOH y

completa r a 1 litro.
6.7.- Soluci n indica do ra d e roj o de m etilo al 1 % e n etan ol. D isolver 1 g de roj o
de metilo e n 10 0 ml de eta nol (95 % ).
6.8.- Soluci n de hi drxid o de so dio 0.1 N . Toma r 4 g de N aOH y enrasar a 1

litro con ag ua recientem ente h ervid a y enfria da. Valo rar co n cido succnico.
6.9.- cido b rico al 3 % . D isolver 30 g de cid o b rico y completar a 1 litro.
6.10.- I ndicad or d e Tas hiro: roj o d e m etilo al 0. 1 % y azul d e m etilen o al 0.1 %
en rel acin d e 2:1, en alco hol etlico.
6.11.- Sol ucin d e cido clo rhd rico 0.1 N . Tomar 8.3 ml de H C l conc. Y enrasa r
a 1 litro.
Valorar con
anhid ro.
60
7.- PR OC ED IMIEN TO
7.1.- R ealizar la m uestra e n du plicad o.
7.2.- Efectua r un ensayo en bl anco usan do un a susta ncia o rg nica si n
nitrg en o (saca rosa ) q ue sea ca paz d e p rovoca r la re duccin de los d erivad os
ntricos y nitrosos eventualme nte p resent es en los reactivos.
7.3.- Pesar al 0.1 mg. alrede do r de 1 g de mu estra h omo gen eizad a (m) en u n
matraz de di gestin Kjel da hl.
7.4.- Agreg ar 3 perl as de vidri o, 10 g de sulfato de p otasio o sulfato de sodi o,
0.5 g de sulfato cp rico y 20 ml de cido sulf rico conc.
7.5.- C onectar el matraz a la trampa d e abso rcin qu e contien e 25 0 ml de
hidrxido d e sodio al 15 % . El disco poroso p rod uce la divisin de los h umos e n
finas bu rb ujas con el fin de facilitar l a a bsorci n y p ara q ue te ng a u na du ra ci n
prol ong ad a de be ser limpi ado co n reg ula rida d antes d el uso. Los dep sitos de
sulfito sdico se eliminan co n cido
clorh drico. C uan do la sol ucin d e
hidrxido d e sodi o al 15 % a dicion ada de fe nolftalen a conte nida en la tramp a

de abso rcin p erm an ece incolo ra d eb e ser cambia da (ap rox. 3 an lisis).
7.6.- C ale ntar en m anta cal efactora y un a vez qu e la sol ucin
est
transpa re nte, dej ar e n eb ullicin 15 a 20 min. Ms, si la muestra tien de a fo rma r

espuma ag re ga r cid o este rico o gotas de silicon a anti espu m ante y com enza r
el calentami ento le ntame nte.
7.7.- Enfria r y agre ga r 20 0 ml de a gua.
7.8.- C on ectar el m atraz al ap arat o de destilacin, agreg ar l entam ente 100 ml
de N aOH al 30 o p or el embu do, y cerra r la llave.
7.9.- D estilar no m en os de 1 50 ml e n un m atraz q ue lleve sum ergido el extrem o
del ref rige ra nte o tubo col ector en:
a) 5 0 ml de un a soluci n d e cid o sulf rico 0.1 N , 4 5 g otas de roj o d e metil o
y 50 ml de agua destilad a. Asegura r un exceso de 2
para qu e se pueda
realiza r la retro titulacin. Titul ar el exceso d e cid o con N aOH 0.1 N h asta
color am arillo.
61
b) 5 0 ml de cido bric o al 3 % . Titula r con cido clorhdrico 0.1 N hasta pH 4. 6

media nte u n medi do r de pH calibra do co n solucion es tamp n pH 4 y pH 7, o e n
prese ncia del in dicad or d e Tas hiro hasta pH 4.6.
C ada cierto ti emp o es nec esario v erificar l a he rmeticida d d el eq uip o d e
destilacin usa nd o 1 0 ml de un a soluci n de sulf ato de amo nio 0.1 N (6.6 07 7
g/L), 10 0 ml d e ag ua destilad a y 1 a 2 g otas de hid rxid o de so dio al 30 % p ara
liberar el am onaco, as como tambi n verificar l a recu peracin d estruye ndo l a
materia org nica d e 0.2 5 g de l (-)-Tirosin a. El conte nid o te rico e n nitrg en o
de ste prod ucto es de 7.73 % . D ebe recup erarse u n 99.7 % .
7.-C ALC U LO Y EXPR ESIN D E R ESU LTAD O
7.1.- % N =
100
14
1000
7.2.- % Protena =
D onde:
V: 50 ml 2
14
1 0 0
100
0.1 N - gasto N aOH 0.1 N o gasto de H C l 0.1 N
m: masa de la muestra, en gramos

Factor: 6.25: pa ra carne, p escado, hu evo, leg uminos as y protenas en gen eral
5.7: para cere ales y deriva dos de soya
6.38: leche
5.55: gel atina
5.95: arroz
R epetibilid ad
del
mto do:
La
diferencia
e ntre
l os
resultad os
de
d os
determinacio nes ef ectuad as un a d espu s de otra, po r el mism o a nalista, n o

deb e excede r 0.06 % d e N itrge no o 0.3 8 % de p roten a.
62
En la pl anill a d e resultad os se indica r mto do utilizado, id entificacin de l a

muestra, peso de mu estra, gastos d e titulaci n, factor utilizad o y resultad os
obteni dos de la m uestras e n du plicado co n 2 decimal es.
3.11.3. PR OC ED IMIEN TO PAR A D ETER MIN AR FIBR A CR U D A -MTOD O
GR AVIMTR IC O
1.0. OBJETIVO
D eterminar fibra crud a en dive rsos tipos de alime ntos.
2.0. C AMPO D E APLIC AC ION
El mtodo es aplica ble a granos, pl atos prepa ra dos, ha rinas, alim entos p ara
animal es, material es qu e contien en fib ra d e los cuales la grasa ha sido extrad a
para dej ar u n resid uo a decua do.
3.0. FU N D AMEN TO
Fibra cru da es l a p r dida d e m asa que corresp on de a l a i ncineracin d el
residu o o rg nico qu e q ue da desp us d e l a di gestin c on sol ucion es de cid o
sulfrico e hid rxid o de sodi o en con dicion es especificas.
4.0. R EFER ENC IAS
4.1.- Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition. U .S.A. (1990).
4.2.- Ma nu als of foo d q uality control. FAO F ood N utrition P ap er 14/7. R om a
(19 86 ).
5.0. TER MIN OLOGA
5.1. N .A.
6.0. MATER IALES, IN SU MOS Y EQU IPOS
6.1. Material es y Equipos
6.1.1. Aparato de cale ntami ento a reflujo.
6.1.2. Balanza a naltica, sensibilida d 0,1 mg.
63
6.1.3. C risoles de po rcela na o d e slica.

6.1.4. D esecado r con deshi dratante a decu ad o (silicagel con in dicad or u ot ro).
6.1.5. D ispositivo de succin al vaco.
6.1.6. Embud o Bch ner de p olip ropil en o tipo C alifornia u otra alt ern ativa
equival ente.
6.1.7. Estufa a 103 2 C .
6.1.8. Tamiz de malla 1 mm.
6.1.9. Placa calefactora capaz d e llevar 200 ml de a gua a 25 C . H asta
ebullici n en 1 5 + 2 min.
6.1.10. Mate rial usu al de la boratori o.
6.2. R eactivos
6.2.1. Solucin de cid o sulfrico 0.25 5 N (1.25 g de 2
/ 100 ml). La
concentracin d ebe se r cheq ue ada p or titulaci n.
6.2.2. Solucin d e hidrxido d e sodio 0.3 13 N (1,25 g de N aOH / 100 de a gu a

libre d e
3 ).
La conce ntraci n de be ser ch eq uea da p or titulacin.
6.2.3. Fibra ce rmica: C erafiber, 8 lb/cu ft. C olocar 60 g e n un a jug uera,

agreg ar 80 0 ml de ag ua y mezclar po r un minut o a baja velocid ad. D etermi na r
el bla nco trat and o a proximad ame nte 2 g (peso seco ) d e la fib ra c ermic a
pre pa rad a co n cid o y lcalis como en la dete rmin acin (6.2 ) C o rre gir l os
resultad os d e fib ra cru da po r el blanco, el cu al de be s er i nsignificant e
(ap roxima dam ente 2 m g).
6.2.4. Silicona Antiespum ante.
6.2.5. Etanol al 9 5% ..
6.2.6. ter de p etrl eo, P.E. 40 60 C .
7.0. D ESAR R OLLO D EL PR OC ESO
7.1. Prep araci n de la m uestra
64
7.1.1. H omog en eizar, seca r 1 03 + 2 C e n estufa d e ai re o a 70 C al vaco, d e

acuerdo a las tc nicas indica das en l a referencia, co nsideran do el tipo d e
muestra. Mole r la mu estra.
7.1.2. Pasar po r un tamiz d e malla d e 1 mm..
7.1.3. Extraer con t er de petrleo s el conteni do d e grasa es supe rior al 1.
7.2.- D etermin acin
7.2.1. R ealizar el a nlisis en du plicad o.
7.2.2. Pesa r a 0.1 mg alred edo r de 2 g d e m uestra p rep arad a y transferi r e n al
matraz de a pa rato d e calenta mient o a refluj o. R egistrar s
7.2.3. Agre ga r 1.5 a 2.0 g d e fibra ce rmica p re parad a.
7.2.4. Agreg ar 200 ml d e 2
0.255 N , hi rviente, gotas d e a ntiespu mant e y
perl as de vidrio.
7.2.5. C onecta r el ap arat o d e cale ntamie nto a refluj o y h ervir exactament e

durante 3 0 minut os, rotand o el matraz p eri dicame nte.
7.2.6. D esmonta r el eq uip o y filtrar a trav s del emb ud o Bch ner tipo C alifo rni a
o sus alternativas.
7.2.7. Lava r con 50 a 75 ml de ag ua hi rviente, rep etir el l avad o con 3 p orcion es
de 50 ml d e ag ua o h asta que cese la reacci n cida.
7.2.8. R etorn ar el residu o al ap arat o de cale ntamie nt o a reflujo y hervi r
exactamente d urante 3 0 minut os, rotand o el matraz peri dicam ente.
7.2.9. Lava r con 2 5 ml de 2
0.255 N , hirvie nte, con 3 porci ones d e 50 ml
de ag ua hi rviente y con 25 ml d e etan ol al 95% .

7.2.10. R emove r el resid uo y transferi r al crisol.
7.3.10. Secar e n estufa a 1 30 + 2 C por 2 h oras, enfria r en d esecad or y pesa r.
7.3.11. Incine rar 3 0 min utos a 600 + 15 C , enfri ar e n desec ado r y pesar.
7.3.12. D etermi nar un bla nco e n las mismas condiciones q ue la mu estra.
65
8.0 EXPR ESIN D E R ESU LTAD OS

% Fibra cruda e n muestra moli da = C = (Prdid a de p eso en la incine raci n
prdida d e peso d el bla nco de fib ra cermica) x 10 0/ peso de l a muestra.
% Fibra cru da (base h me da ) = C x 100 - % H umedad mu estra o rigin al.
Prome dia r los valores o btenid os y expresar el resulta do con d os decimal es.
R epetibilid ad: L a difere ncia de l os res ultados no de be r se r sup eri or al 5 % d el
prom edi o.
Informa r el % d e fibra al 0,1 % , sobre la base d e la m uestra ori gin al
consideran do q ue h a sido d esgrasada en el caso d e c onte ner m s de 1 % d e
grasa.
3.11.4. PR OC ED IMIEN TO PAR A D ETER MIN AC ION D E H U MEDAD
MATER IAL
Papel o cha rolitas d e alumi nio (p ro po rciona do p or el alumn o)

1 esptul a
Frascos de vidri o con tapa de ra (propo rcion ad os por el al umn o)
1 bala nza an altica
1 paq uete chico d e ha rina de trig o.
1 tamz
PR OC ED IMIEN TO
1. Prepa re u na cha rolita d e pa pel alu minio
2. Pese la charola vaca y anote el peso
3. Tamice l a mu estra de hari na y, e n la ch arola de alumi nio, p ese 3 - 4 g de l a
muestra e n la bal anza a naltica. R egistre hasta centsimas.
4. Ponga a seca r las muestras en el horno a 130 C durante 1 h ora
5. Saqu e la m uestra del ho rn o y p ngal a a enfri ar en un d esecad or du ra nte 1 0
minutos.
66
6. Pese l as muestras secas si es p osible hasta peso co nstante, reg res ndol as
10 minut os al horno y enfri and o nu evame nte.
7.
C alcule el conteni do d e hum ed ad com o el peso pe rdid o de l a muestra
durante el seca do seg n la sigui ente f rmula:
Pi - Pf X 100 = % de humeda d
En don de:
Pi = Peso inicial
Pf = Peso final
Otra ma nera de realiza r los clculos es la siguiente:
Peso de la cha rola + mu estra hm ed a - Peso d e la charola vaca
Peso de la mu estra h med a
Peso de la cha rola + mu estra hm ed a
Peso de la cha rola + mu estra seca
Peso del ag ua eva po ra da
% de hum ed ad d e la muestra = Peso de ag ua eva pora d a
Peso de la mu estra h med a
% de materi a seca = 100 - % de h ume dad.
8. R egistre el conteni do d e hum ed ad y escriba sus dat os en el piza rrn. U tilice

los datos de to do el gru po pa ra c alcular la m edi a y la desviacin estn da r p ara
el conteni do de hum eda d de la m uestra d e ha rin a.
3.11.5. PR OC ED IMIEN TO PAR A D ETER MIN AC ION D E H U MEDAD

MATER IAL
C risoles o cpsulas de p orcel ana

1 deseca dor
1 pinzas largas
67
1 par de gu antes d e asbesto

1 mufla
1 bala nza an altica
1 esptul a
Muestra d e ha rina seca
1 meche ro d e Bunsen
C erillos
1 tela de al amb re
soporte co n anill o
MTOD O
1. Pon ga a peso co nstante un c risol o cpsula d e p orcel ana po r ca da m uestra
que se va a an alizar, lo cual significa deja rlo d urante 1 5 minutos en la mufl a a
una tem peratura de 550 a 60 0C .
2. D eje enfri ar el crisol en un d esecad or du rant e 1 5 a 20 min utos. Proc ure n o
cerra r el d esecad or totalme nte, ya qu e el cal or de los crisol es p ued e p rovoca r
que la ta pa se proyecte y se rompa.
3. Pese el crisol en bala nza a naltica e id entifqu elo co n el n me ro qu e tien e
marcad o e n la part e infe rior (N O LE VAYA A PON ER MASKIN G TAPE). Anote
el peso.
4. Pese en el crisol 1-2 g ramos d e la m uestra (sob re to do si va a d etermi na r
C a y P) de la muestra s eca. R egistre el peso ex acto.
5. Preincine re la mu estra exp oni nd ola a la flam a del mech ero de Bu nsen
6. Incinere la mu estra e n la mufla precale ntad a entre 55 0 y 60 0C durante 2
horas.
7. Pese el crisol co n ce nizas (ya no de be n estar n egras, si lo est n incin ere
otra me dia h ora ) en la misma bala nza qu e utiliz inicialme nte. Anote el peso.
68
Peso del crisol con mu estra

Peso del crisol vaco
Peso de la mu estra
Peso del crisol con cenizas
Peso del crisol vaco
Peso de las cenizas
% de cenizas en base seca = Peso de ce nizas X 100
Peso de la mu estra
% de cenizas e n base hm eda = % d e cenizas b ase seca x % materi a
seca
100% d e materi a org nica = 100 - % cenizas base seca
69

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UNIVERSIDAD DR.

JOS MATAS DELGADO

DEL REGLAMENTO DE GRADUACIN DE LA UNIVERSIDAD DR. JOS MATAS DELGADO

Captulo VI, Art. 46

PUBLICADO BAJO LA LICENCIA CREATIVE COMMONS

No se permite un uso comercial de la obra original ni la generacin de obras derivadas.

Para cualquier otro uso se debe solicitar el permiso a la Universidad

U N IV ER SIDA D D R . JOS M A TA S D ELGA D O

Estudio fsico-q umico y microbiolgico en el proceso de fermentacin tradicional

A sesor: D r. Rodrigo Reyes.

N ombre de los autores:

Para optar al grado de:

ANT I GUO CUSCAT L N, LUNE S 10 DE SEPT IE M BRE DE 2012.

D escripcin general y longevid ad del rbol

D escripciones taxonm icas y m orfolgicas

C aractersticas de la sem illa

Microor ganism os en la ferm entacin del cacao

Prim era fase ..

C aractersticas de agar estandar

Medio de Ac etico - etanol r uherfo rd

Generalidades de la ferm entacin del cacao

D esarrollo de tcnicas y procedim ientos de anlisis de semillas ferm entadas

Slidos solubles, alcoh ol, acido actico

Tcnica de pre paraci n de cultivos

Secado de grano de cacao

rbol de caca o trinitario .

H oja de cacao trinitario .

Flor de cacao trinitario ..

Mazorca de cacao t rinitario . .

Sem illa de cacao trinitario .

Vista en m icroscpio de Saccarom yces cerevisiae .

Vista en m icroscpio de Lact obacillus Ferm entum ..

Seleccin y corte de m azorca de cacao

Mazorca de cacao t rinitario parti da ..

11 Sem illas de cacao trinitario pre - ferm entaci n

12 Poten cim etro ..

13 Refractm etro de alco hol ..

14 Refractm etro Acid o Actico .

15 Refractm etro slidos to tales .

17 Oxidan Gluco no bacter .

18 Lactobacillus ferm entum

19 Lactobacillus ferm entum

20 Levaduras, H anseniaspora guillierm ondii y S. cereviseae

C lasificacin taxonm icas del cacao

Variantes de las caractersticas m orfolgicas en cacao trinitario

Anlisis brom atolgico del cacao

C recim iento de m icroo rganism os ..... ........... ...

Prom edi o de crecim ient o de m icro organism os

D im ensiones de la sem illa

Prom edi os y rendim ientos de la sem illa de cacao

Levaduras en Medi o Estndar .

Bacterias Medio Estndar ..

Bacterias lcticas en m edio MRS

Bacterias Acticas en Medio RAE .

Levaduras en Medi o D extrosa Saburau d

C om portam iento del acido actico

C om portam iento de alcoh ol .

10 C om portam iento de la tem peratura en la Ferm entacin de C acao .

11 D im ensiones de la sem illa ..

12 Anlisis brom atolgico .

ferme ntacin n o tra dicion al pa ra l as semillas de caca o q ue en u n me no r tiemp o

de 7 4 das, d urante el p roceso se efectu aro n a nlisis d e

tempe ratura, pH , Brix, % de alcohol y % de cido actico cada 24 ho ras ; as