Validación de Metodos Analíticos

VALIDACIN DE
MTODOS ANALTICOS
VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS
NDICE
Introduccin. Necesidad de la validacin.
Norma UNE EN ISO/IEC 17025.
Gua de Validacin ENAC.
Conceptos estadsticos bsicos.

Proceso de validacin.
Necesidad analtica. Mtodo.
Puesta a punto.
Eleccin de Parmetros de validacin. Fijacin de objetivos.
Diseo experimental y estadstico.
Ensayos. Tratamiento estadstico de datos.
Declaracin de mtodo validado. Registros.
Consideraciones elementales sobre la validacin de mtodos microbiolgicos
Control del mtodo. Revalidacin.

INTRODUCCIN
Cuando trabajamos con procedimientos
analticos, ms o menos complejos, en los
que participan instrumentos que tienen
carcter no estable, no podemos aplicar
estrictamente el concepto de calibracin
estable que se aplica generalmente a los
equipos de medida directa.
INTRODUCCIN II
INTRODUCCIN III
Qu mtodos deben ser validados?
Desde el punto de vista del esquema
anterior, todos los mtodos necesitan ser
conocidos por los laboratorios que los
utilizan, para establecer sus lmites de
aplicacin y los parmetros que se van a
utilizar para su control.
INTRODUCCIN IV
Las preguntas que nos debemos hacer,
ANTE UN MTODO SUPUESTAMENTE
VALIDADO,
VALIDADO son:
si el mtodo est validado, est validado
el laboratorio para llevarlo a cabo con
satisfaccin? ; y
cules son los parmetros de validacin
del mtodo que debemos controlar?.
INTRODUCCIN V
Finalmente, debemos tener claro que la
validacin es una actividad continua

que se alimenta, fundamentalmente, de los
datos que se obtienen de las actividades que
se realizan en el terreno de la calibracin y del
control de calidad.
Puede llegar el caso de que, como resultado de
esta actividad continuada, sea necesario
cambiar los lmites de aplicacin del mtodo.
La validacin en la Norma
UNE-EN ISO/IEC 17025: 2000 (i)
UNE-EN ISO/IEC 17025: 2000 (ii)
!
"
"
!
"
!
!
"
%
"
!
&
UNE-EN ISO/IEC 17025: 2000 (iii)
'()*
"
'()*
!
%
!
+
,
,
,
-
,
-
'()* .
!
&
"
/
"
"
!
10
UNE-EN ISO/IEC 17025: 2000 (iv)
.
%
0
+
"
"
"
$
$
!
1"
"
"
!
!
$
"
11
UNE-EN ISO/IEC 17025: 2000 (v)
. '()*
"
"
!
"
!
. '()*
!
"
%
&
/
!
. '()* .
%
"
2
0
"
"
!
&
+
"
%
"
"
"
!
"
12
Gua para la los laboratorios que realizan

validaciones de mtodos de anlisis qumicos
(ENAC CSQ-02, Rev.0)
)34( 5
'6*7(
4*89: )8(
13
CONCEPTOS ESTADSTICOS
BSICOS
(i)
DISTRIBUCIN NORMAL
0.25
Frecuencia
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
2
+2
Valores de x
14
BSICOS
(ii)
Porcentaje del rea total
68.27 %
90 %
95 %
95.45 %
99 %
99.73 %
99.9 %
Intervalo
15
BSICOS
(iii)
=
=
=
16
BSICOS
(iv)
COMPARACIN DE DOS VARIANZAS
Lo primero que habr que hacer es comprobar si
y
son homogneas ( es
las dos varianzas
la que presenta un valor mayor).
Se rechazar la hiptesis nula (que dice que
= ) cuando el valor del estadstico calculado a
partir de las varianzas muestrales, rebase el
valor tabulado de (con los grados de libertad
y
) para el nivel de
significacin
adoptado
(prueba
bilateral),
aceptndose, por tanto la hiptesis alternativa
( ).
17
BSICOS
(v)
COMPARACIN DE DOS MEDIAS
Una vez comprobada la homogeneidad de las
varianzas muestrales, podremos comparar las medias.
VARIANZAS IGUALES
El estadstico para comparar las medias de
dos muestras aleatorias independientes de
tamaos iguales ( =
), con
grados de libertad, lo compararemos con el
correspondiente valor de de la distribucin
de Student al nivel de significacin
).
preestablecido (normalmente
Si es menor que el valor de

tabulado podremos
afirmar que ambas medias no son diferentes al nivel de
significacin . En caso contrario deberemos decir que
son diferentes (al mencionado nivel de significacin ).
18
BSICOS
(vi)
Una vez comprobada la homogeneidad de las varianzas
muestrales, podremos comparar las medias.
VARIANZAS IGUALES
En el caso de muestras
tamaos distintos (
utilizaremos el estadstico:
con
libertad.
de
)
grados de
+
+
Si es menor que el valor de tabulado podremos afirmar

que ambas medias no son diferentes al nivel de
19
BSICOS
(vii)
Una vez comprobada la homogeneidad de las varianzas
muestrales, podremos comparar las medias.
VARIANZAS DESIGUALES
En el caso de , aunque no
existe
solucin
exacta,
el
estadstico ms adecuado para
comparar dos medias es :
con g.l. aproximadamente:
Si es menor que el valor de tabulado podremos afirmar
que ambas medias no son diferentes al nivel de
20
BSICOS
(viii)
CORRELACIN
La medida de la correlacin ms importante es el
$$!%&
(rho) entre ambas variables aleatorias.
!" ! ! #!
Dicho coeficiente se encuentra entre +1 y 1. Cuando es igual a 1 o a

+1, todos los puntos se encuentran en una recta y cuando es igual a 0,
decimos que
e ' no estn correlacionadas y por tanto son
independientes.
La estimacin de se efecta con el estadstico $:
$=
' '
' '
=
21
BSICOS
(ix)
REGRESIN
Una vez establecido que existe correlacin entre las variables
e ' , con el anlisis de regresin, se ajusta una ecuacin de
regresin a una nube de puntos (parejas de valores ( ' )
observada.
Si la ecuacin de regresin es del tipo ' (de una lnea
recta), hablamos de REGRESIN LINEAL (siendo ' la variable
aleatoria dependiente y la variable aleatoria independiente de
la que conocemos el valor).
Los parmetros y se estiman (& y )), a partir de los valores
muestrales, generalmente por el mtodo de los mnimos
cuadrados.
La ecuacin anterior queda:
22
BSICOS
(ix)
REGRESIN
La ecuacin anterior queda:
donde
' = & ' + )'
'
es la y estimada
'
)' =
'
=
y vemos que a y b muestran

unos
subndices
que
denotan que la regresin es
de y sobre x
&' =
' )'
23
BSICOS
(x)
REGRESIN
El error tipo en la estimacin de
' a partir de los valores de
(con la recta de regresin), es:
Las desviaciones estndar de
los coeficientes se calculan:
'(
&
' '
'(
24
BSICOS
(xi)
REGRESIN
Los intervalos de confianza de
los parmetros ) y & son:
donde es la de Student para

g. de libertad y el nivel de
significacin correspondiente.
&
&
REGIN DE CONFIANZA
de la regresin lineal ' & )
RECTA DE REGRESIN
PARES DE VALORES x,y
y V. DEPENDIENTE
Con ) y los lmites de & '(

podemos obtener una buena
aproximacin a la regin de
confianza de la recta (al nivel
de significacin establecido).
VARIABLE INDEPENDIENTE
25
BSICOS
(xii)
REGRESIN
Generalmente, especialmente cuando utilizamos la regresin lineal
para obtener la funcin de respuesta (recta de calibrado) de un
mtodo analtico, despus de obtenida la recta de regresin lineal
deberemos valorar el *$&# #! &+, ! de esa recta estimada a la
realidad observada (nube de puntos) para decidir si es aceptable o
no, de acuerdo con unas condiciones prefijadas.
Al trmino $ se le llama *$&# #! #! !$- &
y es un buen modo
de medir el grado de ajuste. (El significado de este trmino es que del 100% de la
dispersin, el
puede explicarse con la variacin de las
por la propia regresin lineal).
(El criterio de aceptacin para $ en rectas de calibrado debe ser

suficientemente exigente [p.e. >0.99], ya que en otro caso se aumenta
considerablemente la incertidumbre debida a la regresin)
26
BSICOS
(xiii)
ANLISIS DE LA VARIANZA
Este anlisis presupone condiciones de normalidad y homogeneidad
de las varianzas, por lo que lo primero que se debe examinar es si las
varianzas que se analizan son homogneas.
Para ello podemos utilizar la prueba de Cochran, aplicable para

examinar la homogeneidad de las varianzas de un grupo de .
muestras del mismo tamao /:
0-& =
-&
que compararemos con el valor tabulado correspondiente (tabla siguiente) para . y

/ , al nivel de significacin prefijado, para aceptar que las varianzas son
homogneas mientras que el valor obtenido no supere al tabulado.
27
BSICOS
(xiv)
ANLISIS DE LA VARIANZA
Gmax tabulado de Cochran
/1
10
0.9985
0.9750
0.9392
0.9057
0.8772
0.8534
0.8332
0.8159
0.8010
0.7880
0.9669
0.8709
0.7977
0.7457
0.7071
0.6771
0.6530
0.6333
0.6167
0.6025
0.9065
0.7679
0.6841
0.6287
0.5895
0.5598
0.5365
0.5175
0.5017
0.4884
0.8412
0.6838
0.5981
0.5441
0.5065
0.4783
0.4564
0.4387
0.4241
0.4118
0.7808
0.6161
0.5321
0.4803
0.4447
0.4184
0.3980
0.3817
0.3682
0.3568
0.7271
0.5612
0.4800
0.4307
0.3974
0.3726
0.3535
0.3384
0.3259
0.3154
0.6798
0.5157
0.4377
0.3910
0.3595
0.3362
0.3185
0.3043
0.2926
0.2829
0.6385
0.4775
0.4027
0.3584
0.3286
0.3067
0.2901
0.2768
0.2659
0.2568
10
0.6020
0.4450
0.3733
0.3311
0.3029
0.2823
0.2666
0.2541
0.2439
0.2353
28
BSICOS
(xv)
ANLISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Supnganse . grupos muestrales, de tamaos respectivos /,
todos iguales, siendo
el nmero total de elementos
muestrales ( ./ , supuesto que cada grupo muestral procede
de una poblacin normal y que todas las poblaciones normales
tienen la misma varianza (desconocida).
A cada valor muestral + se le asignan dos subndices
( -simo grupo, + -simo valor), donde . y + /.
Las observaciones se ordenan, normalmente, en forma de

tablas:
29
BSICOS
(xvi)
TABLA PARA EL ANLISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
Grupo muestral
Observaciones
/
/
Las medias de cada

grupo muestral y la
media
general
estn
definidas por:
./
+=
+=
.
30
BSICOS
(xvii)
Anlisis simple de la varianza

Origen de la varianza
Entre grupos
(Between)
Dentro del grupo

(Within)
Total
Grados de
libertad ( )
Sumas de diferencias
cuadrticas (SDC)
32 =
34 =
/
=
=
=
+=
=
2
+=
Diferencias cuadrticas medias

(DCM = SDC/)
35 =
.
4
.
5
31
BSICOS
(xviii)
Para aceptar los grupos estudiados como no

diferentes, obtener el valor estimado de :
y compararlo con el correspondiente valor de
y
).
tabulado (para el prefijado,
Si
podremos decir que no existen diferencias significativas
entre los distintos grupos muestrales.
<
32
34
&),%&#
En el caso, contrario, de que existan diferencias

significativas (al nivel prefijado) entre los grupos
muestrales, se deber considerar que al menos dos de las
medias de grupo son distintas entre s.
32
PROCESO DE VALIDACIN (i)

El esquema que resume un proceso de validacin es el siguiente:
1. NECESIDAD ANALTICA
(Se establece, por la autoridad del laboratorio, la

necesidad de satisfaccin de una demanda analtica).
2. MTODO (Revisin de mtodos disponibles y eleccin del ms apropiado).

3. BORRADOR DEL PROCEDIMIENTO
(Teniendo en cuenta los aspectos formales de contenido).
4. PUESTA A PUNTO
(Se ajustan y afinan las distintas variables del mtodo. En

este apartado se prueba teniendo en cuenta los diversos parmetros de validacin).
5. ELECCIN DE LOS PARMETROS DE VALIDACIN (Teniendo

en cuenta las guas aplicables y la experiencia obtenida en la puesta a punto).
6. FIJACIN DE OBJETIVOS PARA LOS PARMETROS DE VALIDACIN

(Teniendo en cuenta bibliografa aplicable y la experiencia obtenida en la puesta a punto).
33
PROCESO DE VALIDACIN (ii)

7. DISEO EXPERIMENTAL Y ESTADSTICO
(Para la obtencin de los parmetros elegidos, siguiendo el procedimiento).
8. REALIZACIN DE LOS ENSAYOS DISEADOS
(De acuerdo con el procedimiento (borrador). Evidencias registrales completas).
9. TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS DATOS OBTENIDOS

(Se obtienen los valores propios del laboratorio para los parmetros de validacin).
Cumplen objetivos predefinidos?

SI Mtodo validado, pasar a 10.
NO Analizar incumplimientos y buscar posibles causas
Se han encontrado posibles razones?

SI
Corregir y volver a 7 / 8
NO
Se pueden cambiar objetivos?
SI
Cambiar y volver a 6
NO
Volver a 4
34
PROCESO DE VALIDACIN (iii)

10.HACER DECLARACIN DE MTODO VALIDADO
11. GUARDAR REGISTROS ORDENADAMENTE, APROBAR
PROCEDIMIENTO (HASTA AHORA EN BORRADOR) Y
DIFUNDIR / DISTRIBUIR
Este procedimiento se considerar validado

mientras no se produzcan cambios que impidan
asegurar que se mantiene bajo control
(calibracin + QC).
35
MTODO (i)
An en el caso de que el mtodo elegido est publicado como
norma internacional, nacional o regional, y
con el objeto de atender los requisitos de la norma 17025 relativos
a mtodos (5.4.2. seleccin de mtodos),
es conveniente (en muchos casos preciso, cuando es necesario
complementar la norma con informacin adicional para asegurar su
correcta aplicacin) proceder a la elaboracin de un procedimiento
interno que recoja,
por un lado todos los aspectos tcnicos del mtodo y
por otro los aspectos formales y de calidad de la 17025.
Dicho procedimiento interno (borrador, mientras no sea validado)
deber realizarse teniendo en cuenta lo que se especifique en el
Sistema de la Calidad del laboratorio.
36
MTODO (ii)
El contenido mnimo de un mtodo que la 17025 especifica es:
1 3
1 /
1 5
1 4
1 *
1
"
"
%1 /
&1 5
"
/
4
(
:
1
;1 3
"
"
$
%
& !
%
37
PUESTA A PUNTO
La Puesta a punto de un mtodo es una actividad previa
a la validacin que debe realizar el laboratorio para llegar a
tener un conocimiento general del mismo. Con esta
actividad se consigue que el mtodo funcione dando
unas
respuestas
razonablemente
aceptables
y
consistentes.
Para ello, es necesario afinar el proceso del mtodo en
todos sus apartados, prestando una especial consideracin
a los diversos parmetros instrumentales de aplicacin
(p.e. longitudes de onda, paso de celda, velocidad de
aporte de muestra, temperaturas de horno, ....).
Como se ha visto antes en el esquema general de
validacin, puede ser necesario volver a esta etapa si los
resultados de la validacin no son aceptables.
38
Eleccin de parmetros de validacin.
FIJACIN DE OBJETIVOS (i)
Como se dice en la norma 17025, 5.4.5.3. NOTA 1, los

requisitos que deben cumplir los mtodos (de sus
parmetros de validacin) deben ser especificados
previamente a la validacin. Estos requisitos establecidos
a priori son los objetivos de validacin.
En algunos casos, la fijacin de estos objetivos est establecida por la

propia demanda que ha originado la necesidad analtica (p.e. la demanda
est reglamentada y tiene establecido el mtodo a utilizar y por ejemplo el
lmite de cuantificacin mximo, y las exactitud y precisin mnimas
aceptables).
En otros casos no se dispone de requisitos de obligado cumplimiento y

nos resulta ms complicado establecer objetivos de validacin. En estos
casos, la fuente de informacin debe ser, adems de las diferentes
referencias bibliogrficas, la propia experiencia adquirida en la puesta a
punto del mtodo o nuestra experiencia con mtodos similares o la
experiencia del mercado.
39
Eleccin de parmetros de validacin.
FIJACIN DE OBJETIVOS (ii)
Dejaremos registro de los parmetros elegidos y de sus objetivos.

Por ej.:
4*89: )8(
(<= )3>(
"
40
DISEO EXPERIMENTAL Y
ESTADSTICO (i)
Es necesario resaltar que a la hora de determinar los
parmetros que se hayan seleccionado, estos no se
obtendrn, normalmente, de un modo secuencial, sino que
se obtendran como resultado final de un diseo
experimental adecuado que contemplara los objetivos que
se persigue conseguir, y en el que algunos de los
elementos
que
se
emplean
pueden
servir,
simultneamente, para la determinacin de ms de un
parmetro.
El siguiente proceso pretende ser representativo de un
mtodo analtico tpico y se compone de las fases:
41
ESTADSTICO (ii)
4
:
4
*
<
1
4
/%
3
8
?
:
8
/
8
42
ESTADSTICO (iii)
Seleccin de los tipos de muestras a ensayar.
Determinacin del nmero de submuestras por muestra a

procesar.
Procesamiento de todas las submuestras simultneamente (en
condiciones de repetibilidad) siguiendo el mtodo analtico, junto

con el blanco (es una muestra que tiene todos los componentes
de la muestra problema excepto el analito problema, y que ante
las dificultades que normalmente se tienen para conseguir una
matriz "limpia" del analito problema, suele aproximarse con un
"blanco de reactivos").
Lectura (normalmente instrumental) de una seal que produce

cada una de las submuestras y el blanco (el nmero de lecturas
que se debe obtener de cada submuestra y del blanco depende
normalmente del instrumento o sistema de medida - de su
estabilidad a corto plazo, tiempo de respuesta, ..........- y es
recomendable que sea, siempre que sea posible, mayor de una).
43
ESTADSTICO (iv)
Interpolacin, contra una "recta de calibrado" del instrumento o
sistema de medida, de la lectura obtenida para convertirla en

resultado (la recta de calibrado mencionada, que ms adelante
definiremos como funcin de respuesta instrumental, se obtiene
generalmente por la lectura de la seal que producen una serie de
"patrones de trabajo limpios" (no tienen en cuenta la matriz de la
muestra problema) que se preparan en el laboratorio a partir de
patrones trazables o productos qumicos normalizados o que se
han adquirido como tales), tras la realizacin de diversos clculos
en los que se tienen en cuenta la sustraccin de la aportacin
debida al blanco.
Clculos a partir del resultado anterior para obtener el resultado

final atribuible a la muestra y su incertidumbre asociada,
incluyendo todas las etapas del procesamiento.
44
ESTADSTICO (v)
A continuacin, se presenta, a modo de ejemplo un esquema de
diseo experimental y una serie de criterios elementales para la
determinacin de los diversos parmetros de validacin:
DISEO
EXPERIMENTAL
Obtencin de la funcin de respuesta instrumental

con seis niveles de concentracin (cinco patrones
mas blanco), por quintuplicado en cada nivel, en
condiciones de repetibilidad. Determinacin de
la exactitud (recuperacin) de materiales de referencia a tres niveles, por quintuplicado.
Repeticin del diseo anterior en cinco das distintos en condiciones de reproducibilidad.
45
ESTADSTICO (vi)
Ejemplo de esquema de diseo experimental
Patrones de trabajo limpios a cinco niveles de
concentracin
Muestras
de las que se dispone
para la validacin
Blanco
Materiales de Referencia a tres niveles de concentracin
bajo, cercano al lmite de cuantificacin
medio, prximo a los valores ms esperados
alto, cercano al mayor valor del intervalo de
trabajo
46
ESTADSTICO (vii)
Cinco de cada una, preparadas cada da en condiciones de repetibilidad, lo que supone un total de
unidades de 45 por da:
Submuestras
1 x 5 = 5 blancos
5 x 5 = 25 patrones
3 x 5 = 15 materiales de referencia
que por cinco das supondrn 225 unidades
Procesamiento
Simultneo de las 45 unidades cada da (en condiciones de repetibilidad)

Las submuestras debern seguir el mtodo completo (al menos los materiales de referencia).
47
ESTADSTICO (viii)
Lectura
Que produce cada submuestra en el sistema de

medida (por ejemplo en miliabsorbancias)
Obtenida, cada da, por regresin lineal con las
30 parejas de x: valores asignados / y: lecturas
obtenidas, de patrones y blancos.
Funcin de respuesta
Determinacin, cada da, del grado de ajuste y de

los intervalos de confianza de los coeficientes de
regresin y de la funcin de respuesta.
Determinacin de la funcin de respuesta media
de los cinco das y sus intervalos de confianza.
48
ESTADSTICO (ix)
Interpolacin
y clculos
Tratamiento
estadstico
Cada da, de las lecturas obtenidas de los materiales de referencia.

Determinacin de la exactitud en cada nivel.
Anlisis de varianza simple de los resultados
obtenidos para obtencin de la precisin por niveles.
Obtencin de los lmites de deteccin y cuantificacin, del intervalo de trabajo y de la incertidumbre
asociada a cada nivel.
49
ESTADSTICO (x)
Los datos que obtendremos cada da pueden ser organizados
en tablas de acuerdo con el siguiente modelo:
Das (lecturas obtenidas - L - )
NIVEL
...
....
50
ENSAYOS
Como se ha previsto en el apartado anterior de diseo, el
procesamiento de todas las submuestras previstas cada da
se realizar en condiciones de repetibilidad y siguiendo el
mtodo completo.
Los patrones (y blancos) se prepararn cada da para recoger la
variabilidad que proviene de dicha preparacin. Si se parte de una
solucin madre, no es necesario preparar dicha solucin cada
da, siempre y cuando est controlada su deriva (e incluida en su
incertidumbre).
Los MR.s sern procesados siguiendo el mtodo completo, para poder dar
trazabilidad al resultado final (la funcin de respuesta realizada con patrones
limpios, si no han seguido el mtodo completo, puede dar trazabilidad a los
resultados de los procesados pero no al procesamiento seguido). Aunque los
patrones limpios hayan seguido el mtodo completo, el procesado de los
MR.s es necesario para la deteccin de efectos matriz.
51
SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
Normalmente, salvo en el caso de que estemos validando un
mtodo completamente desarrollado de nuevo por el laboratorio,
este parmetro de validacin se resuelve bibliogrficamente,

ya que los mtodos seleccionados, de reconocida aplicacin,
cuentan con informacin sobre su selectividad y especificidad
y las interferencias que se conocen.
Para poder asegurar la selectividad y especificidad de un
mtodo, cuando se conoce la existencia de interferencias, por
experiencia previa o por informacin bibliogrfica, habr que
disear un estudio experimental del efecto de las
mencionadas interferencias, mediante la adicin de
cantidades conocidas de componente interferente.
Los efectos matriz que puedan existir se estudian en la
funcin de respuesta.
52
FUNCIN DE RESPUESTA /
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (i)
Funcin de respuesta instrumental (del sistema de lectura) que
es la que normalmente se conoce como recta de calibrado.
Cada da se establece la funcin de respuesta [6 " 7 ] con

los treinta pares de valores formados por las cinco rplicas
del Blanco (2/) y de los 5 "patrones de trabajo limpios" (7 ( (
7 ) de valor terico conocido, que cubran el intervalo de
trabajo para el que se quiera desarrollar el mtodo analtico.
Si los datos se ajustan a una recta (respuesta lineal), la
ecuacin de la funcin ser del tipo:
6 = -7 + 6
Calculamos el coeficiente de regresin (-) de la misma y el coeficiente L0
(valor de la ordenada en el origen), por el mtodo de los mnimos cuadrados.
53
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (ii)
Debemos estimar tambin el grado de ajuste de la recta
estimada a los valores de 6 observados, calculando el grado
de determinacin, $ , que no deber superar unos valores
prefijados, (por ejemplo deber ser superior a 0.99), para considerar
que la funcin es lineal en el intervalo de concentraciones de
estudio,
adems del error tipo en la estimacin de 7 (=
6(7 8
la desviacin tipo de - ( -) y
la desviacin tipo de 6 (
),
que necesitamos para determinar los respectivos intervalos

de confianza.
54
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (iii)
6 (7
-
7
6)
6 (7
6)
6!
7
7
6!
7 (6
7
-
6 (7
son las lecturas observadas,

las estimadas con la recta de regresin 6 - 7 6 ,
el nmero de pares de valores (=30 en el ejemplo) y
los valores asignados a los patrones.
55
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (iv)
Si la funcin de respuesta no posee el grado de
linealidad definido (por ejemplo un r2 > 0.99), entonces
se aumentar el nmero de 7 para descomponer
la funcin de respuesta en tramos del intervalo de
trabajo,
o se investigar otra funcin matemtica con el fin
de establecer la curva que mejor se ajuste a los
valores obtenidos y los niveles concretos en los
que se pueden cuantificar las muestras en las
condiciones de estudio.
56
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (v)
Funcin de respuesta del mtodo: es la que se determina
cuando se calcula la recuperacin del mtodo y puede
coincidir exactamente con la instrumental cuando la
recuperacin es del 100%.
Si la funcin de respuesta del mtodo no coincide con la
instrumental (recuperacin distinta del 100%), los datos pueden
presentarse:
corregidos con el factor de recuperacin encontrado, o
sin corregir.
En ambos casos se deber tener en cuenta la contribucin a la
incertidumbre del resultado final de la opcin elegida.
57
LINEALIDAD / SENSIBILIDAD (vi)
Sensibilidad
La sensibilidad de una funcin de respuesta
es la pendiente de la curva de calibracin en
cada punto (para una funcin de respuesta
lineal la pendiente (-) de la recta).
Este parmetro va a ser ms importante a la hora de efectuar
posteriores calibraciones y realizar un seguimiento del mtodo,
que en la propia validacin del mismo.
58
LMITE DE DETECCIN
El lmite de deteccin (6 ) se calcula a partir de los resultados
obtenidos del blanco, convertidos a resultado final sobre
muestra, segn la ecuacin:
6 = 2 + 92
donde 92 es la incertidumbre expandida (k=2 o el valor necesario que asegure

una probabilidad de cobertura del 95%) asociada a la medida de 2 que es la
media general, en condiciones de reproducibilidad, de los resultados de la
submuestras de blanco convertida a resultado final sobre muestra.
[Este
clculo sustituye al ms comnmente utilizado que utiliza la

(donde es la desviacin tpica de la serie de resultados del blanco).]
ecuacin
La determinacin del lmite de deteccin con la expresin anterior debe

guardar coherencia con el que se deriva del valor superior de la regin de
confianza de la funcin de respuesta validada (para x = 0 ). En caso
contrario, podran llegar a producirse situaciones en las que el LD
calculado tendra poco que ver con la realidad.
59
LMITE DE CUANTIFICACIN
Es el valor, superior al 6 , a partir del cual los
resultados que se obtienen cumplen unos
condicionantes de precisin y de exactitud predeterminados por exigencias de norma, cliente, ...
(p.e. determinaciones con un nivel de incertidumbre
que asegure una probabilidad de cobertura del 95%) inferior
(U con k=2 o el valor necesario
al 3% del resultado).
Para un condicionante de %U = 100, el LC coincide

con el LD.
[Que sustituye al utilizado por algunos de la ecuacin
60
PRECISIN:
(i)
(Repetibilidad / Reproducibilidad)
La precisin de reproducibilidad que mide la siguiente sR es la
del mtodo en el laboratorio (es por tanto una medida de
precisin intermedia segn el esquema de la norma ISO 5725,
que define la sR como desviacin estndar de reproducibilidad
del mtodo en el mercado, incluyendo la variabilidad que
proviene de los distintos laboratorios de un ensayo
interlaboratorios adecuado).
El estudio de la precisin se puede realizar

calculando, a travs del anlisis simple de varianza
(ANOVA de dos factores totalmente anidados
homogneos), las desviaciones estndar de
repetibilidad (sr ) y de reproducibilidad (sR) para
cada uno de los niveles de ensayo.
61
PRECISIN:
(ii)
TABLA PARA EL ANLISIS SIMPLE DE LA VARIANZA
CADA NIVEL
Da
Observaciones
Las medias de cada

da son:
6 =
+=
6+
La media general es:

6=
+=
6+
6
=
6
=
62
PRECISIN:
(iii)
Anlisis simple de la varianza
Origen
de la varianza
Grados de
libertad ( )
Entre grupos
(Between)
Sumas de diferencias
cuadrticas (SDC)
Total
34
=
2
6 6
=
Dentro del grupo

(Within)
Diferencias cuadrticas medias

(DCM = SDC/ )
+=
+=
6+ 6
6+ 6
32 =
34 =
35 =
32
34
63
PRECISIN:
(iv)
6
32
34
donde el denominador (5) es igual al nmero de observaciones

que se realizan cada da (en cada nivel) [cuando es el caso de un
diseo experimental homogneo de dos factores (totalmente
anidados) (como el que se ha planteado)].
Si, por efectos aleatorios, sL2 < 0, debe asumirse

sL2 = 0 (normalmente debera cumplirse que
DCMB > DCMW y en caso contrario deberan
existir razones que lo justificaran).
64
PRECISIN:
(v)
Las sr y sR del mtodo estarn comprendidas entre el valor
menor y el valor mayor de todas las desviaciones tpicas
calculadas (todos los niveles) (o CV.s si se quiere presentar
en trminos relativos, que es ms comparable).
Si el intervalo de trabajo del mtodo es muy

amplio, es razonable esperar que las (tanto
de repetibilidad como de reproducibilidad)
sean
significativamente diferentes para cada
punto de la funcin de respuesta del mtodo
(p.e. siguiendo una ecuacin como la de Horwitz), lo que
nos obligara a tomar decisiones relativas a
la definicin de su uso por tramos.
65
PRECISIN:
(vi)
sR(P ) (%RS D)
R elacin P / sR (P ) (% R S D )
va lor de P
66
PRECISIN:
(vii)
ECUACIN DE HORWITZ
(INTERLABORATORIOS)
C.V.(%) = 2(1 - 0,5 logC)
C = conc. expresada como potencia de 10
ECUACIN DE HORWITZ
100
ECUACIN DE HORWITZ
100
90
80
60
C.V.(%)
C.V.(%)
70
50
40
10
30
20
10
REPETIBILIDAD ( M AX.)
REPRODUCIBILIDAD
10
%
1%
pp
m
pp
m
10
00
pp
m
10
pp
m
1
pp
b
REPETIBILIDAD (M IN.)
10
0
CONCENTRACIN
10
0
pp
b
10
pp
b
1
pp
t
10
0
10
pp
t
1
10
%
1%
pp
m
pp
m
10
00
pp
m
REPETIBILIDAD ( M IN.)
10
0
10
pp
m
1
pp
b
10
0
pp
b
10
pp
b
1
pp
t
10
0
pp
t
10
pp
t
1
REPRODUCIBILIDAD
pp
t
CONCENTRACIN
REPETIBILIDAD (M AX.)
67
EXACTITUD (i)
La exactitud del mtodo puede establecerse por la
comparacin de los resultados, obtenidos en el diseo
experimental, de los Materiales de Referencia (MRi) con los
valores tericos de los mismos, observando el grado de
concordia entre el valor obtenido y el valor esperado.
La recuperacin en cada punto se calcula mediante la
siguiente expresin:
! ,/!$&
Donde:
:
)! #
:! /!$&#
= : )! #
: ! /!$&#
es el resultado obtenido del anlisis del material de

referencia utilizado, y
es el valor terico del mismo.
68
EXACTITUD (ii)
La recuperacin global del mtodo se calcula a
partir de la media de las individuales en cada
punto (indicaremos el intervalo de recuperaciones
obtenidas), cuando las recuperaciones en los
diversos niveles son similares.
Si la recuperacin no es similar en las distintas
concentraciones del intervalo de trabajo y se observa
que existe una posible relacin entre la
concentracin y la recuperacin (positiva o negativa),
deberamos recurrir al mtodo de adiciones,
adiciones para la
cuantificacin de las muestras reales.
69
EXACTITUD (iii)
MTODO DE ADICIONES
conc. (C)
Lectura (L)
(mg / l)
(absorbancias)
0,004
REGRESIN / CORRELACIN
P1
0,041
L = m C + L0
P2
0,167
P3
10
0,329
0,030
0,020
P4
20
0,614
0,012
0,260
M (M + B)
M+0
0,250
r2
0,9989
0,9963
M + P1
M+1
0,276
M + P2
M+5
0,368
M + P3
M + 10
0,467
M + P4
M + 20
0,645
SIN ADICIONES
CON ADICIONES
70
EXACTITUD (iv)
Absorbancias
FUNCIN RES P UES TA

0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0 .2 50 0,200
0,100
0,000
-15
-10
-5
10
7.8 2
-13 .22
SIN ADICIONES
Regres in SIN
CON ADICIONES
Regres in CON
15
20
mg / l
71
EXACTITUD (v)
La presentacin de los resultados finales sobre muestra
(incluye su incertidumbre asociada) siempre debern tener
en cuenta el factor de recuperacin.
recuperacin Este factor puede o no
aplicarse. Si se aplica, la incertidumbre del resultado final
deber tener en cuenta la contribucin de dicho factor. Si
no se aplica, la incertidumbre del resultado final deber
tener en cuenta la contribucin de no corregir.
Otras formas con las puede determinarse la exactitud de un
mtodo, son:
por comparacin con resultados obtenidos por otro mtodo ya
validado
mediante estudios de intercomparacin.
72
INCERTIDUMBRES
Se calcularn de acuerdo con el procedimiento
correspondiente, teniendo en cuenta lo que se
dice en el documento ENAC aplicable.
73
INTERVALO DE TRABAJO
VALIDADO
El intervalo de trabajo validado puede coincidir con el que
utilizamos al principio, en el estudio de la funcin de
respuesta, como intervalo de trabajo deseable, pero puede
haber disminuido como resultado del proceso de
validacin.
Normalmente estar comprendido entre el Lmite de
Cuantificacin y el valor asignado al mayor patrn utilizado.
La expresin de los intervalos de trabajo validados en los
alcances de acreditacin de ENAC se expresan en las unidades
de resultado final sobre muestra (intervalo de trabajo de mtodo
completo), para lo cual habr que tener bajo control el efecto
que producen las diluciones aplicables a las muestras para
conseguir que produzcan lecturas comprendidas en el intervalo
de trabajo validado de la funcin de respuesta instrumental.
74
DECLARACIN DE MTODO
VALIDADO
Si los objetivos predefinidos se han
cumplido, podemos proceder a declarar
formalmente el mtodo validado.
validado
Dicha declaracin, en la que se recogen las
caractersticas del mtodo (parmetros de
validacin), se puede realizar en un formato
ad hoc.
75
REGISTROS
Deberemos guardar todos los registros que justifican el
proceso seguido de acuerdo con el sistema de la calidad
instaurado. A saber:
Origen de la necesidad analtica.
Borrador del mtodo con todos sus documentos anexos y
relacionados.
Parmetros de
preestablecidos.
validacin
seleccionados
objetivos
Diseo experimental y estadstico realizado.

Registros de ensayos realizados.
Tratamiento de los datos obtenidos.
Declaracin de mtodo validado.
76
Algunas consideraciones sobre la

validacin de mtodos microbiolgicos (i)
Las caractersticas del anlisis microbiolgico,
cuyo objetivo es determinar la presencia o
ausencia de un determinado microorganismo
(cualitativos) o contar el nmero de unidades
(formadoras de colonias) presentes una muestra
(cuantitativos), son suficientemente particulares
como para precisar de un tratamiento
especializado frente al que se realiza en los
procedimientos fsico qumicos, y que no se
puede incluir en la estructura de este curso.
77

validacin de mtodos microbiolgicos (ii)
La principal caracterstica distintiva del anlisis microbiolgico

radica en el tipo funcin de distribucin que siguen las
observaciones que se obtienen de muestras replicadas tanto en
condiciones de repetibilidad como de reproducibilidad. Esta
funcin de distribucin, que depende fundamentalmente de la
naturaleza del objetivo del ensayo (organismo vivo), del pequeo
nmero de organismos presentes y de su irregular distribucin en
la muestra, es ms cercana a una distribucin binomial o a una
distribucin de Poisson, para las que existen estadsticas no
normales.
El diseo estadstico basado en la distribucin normal que se

aplica en los mtodos qumicos sera aplicable en los mtodos
microbiolgicos si realizamos una transformacin de variable que
normaliza la distribucin de las observaciones. La
transformacin generalmente utilizada por los microbilogos es la
logartmica ( ; % * ).
78

validacin de mtodos microbiolgicos (iii)
Adicionalmente, la dificultad general, mayor que en el
entorno de los ensayos fsico qumicos, de disponer de
materiales de referencia con valor asignado, lleva a la
necesidad de, en muchas ocasiones, asignar valor a partir
de diluciones decimales realizadas a partir de cepas de
trabajo que provengan de cepas patrn reconocidas.
No debemos dejar de mencionar la importancia del control
de elementos fundamentales en cualquier mtodo
microbiolgico, que naturalmente deben ser tenidos en
cuenta a la hora de la validacin de los mismos, como los
medios de cultivo,
cultivo y las condiciones de siembra e
incubacin.
incubacin
79

validacin de mtodos microbiolgicos (iv)
TABLA DE RESULTADOS PAREADOS (ASIGNADOS/ OBTENIDOS)
PARA VALIDACIN DE UN MTODO CUALITATIVO
(Adaptado de prEN ISO 16140:2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods)
RESULTADO
ASIGNADO
RESULTADO OBTENIDO
NEGATIVO
POSITIVO
NEGATIVO
AN
29
Acuerdo negativo (-/-)
(Resultado correcto)
DN
2
Desviacin negativa (+/-)
(Falso negativo)
TNO = AN + DN
31
Total Negativos Obtenidos
POSITIVO
DP
1
Desviacin positiva (-/+)
(Falso positivo)
AP
28
Acuerdo positivo
(Resultado correcto)
TPO = DP + AP
29
Total Positivos Obtenidos
Nota: el Positivo Asignado debe estar aproximadamente en el Lmite de Deteccin
> 7> ? ? ? =
=
>< ?2?6? =
>:= 5?59
=<
5<=
=7
57=
5=
<
TNA = AN + DP
30
Total Negativos Asignados
TPA = DN + AP
30
Total Positivos Asignados
TA = AN + AP
57
Total de Acuerdos
N = AN + DP + DN + AP
60
Total de Resultados
96,67
93,33
95,00
(En algunos textos, la exactitud antes definida, se puede encontrar denominada como EFICIENCIA)
80
CONTROL DEL MTODO.

REVALIDACIN
Como ya se ha dicho, todo procedimiento declarado como
validado se considerar validado mientras no se produzcan
cambios que impidan asegurar que se mantiene bajo
control.
Debemos tener claro que la validacin es una actividad
continua que se alimenta, fundamentalmente, de los datos
que se obtienen de las actividades que se realizan en el
terreno de la calibracin y del control de calidad.
Puede llegar el caso de que, como resultado de esta
actividad continuada, sea necesario cambiar los lmites de
aplicacin del mtodo. Si se produce esta situacin,
deberemos proceder a una nueva declaracin de
validacin, apoyada en todos los registros que la soportan.
81
EJEMPLO NUMRICO
NOTA MUY IMPORTANTE: LOS DATOS QUE SE PRESENTAN EN ESTAS HOJAS DEBEN SER
ENTENDIDOS COMO EJEMPLOS QUE EN NINGN CASO SE ENTIENDEN COMO ESPECIFICACIONES

OBLIGATORIAS. CADA LABORATORIO DEBER ESTABLECER SUS OBJETIVOS Y DISEOS EN
FUNCIN DE SUS NECESIDADES ESPECIFICADAS DESDE AUTORIDADES, NORMAS O CLIENTES.
MTODO CUANTITATIVO
(Preparacin de muestra, Lectura instrumental, Clculos sobre muestra)
4*89: )8(
0@ = : 4 (A1
(<= )3>(
/
/
8%
6
CDD
%
B
!
DE
C %$
C %$ 0E F
!
"
E " GD
E1
8 E />"
HCE E 8
CE"
FE 0 GD
E 1
C %$
C %$
E"
82

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VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Conceptos estadsticos bsicos.

Control del mtodo. Revalidacin.

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validacin es una actividad continua

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Gua para la los laboratorios que realizan

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VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Si es menor que el valor de

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Si es menor que el valor de tabulado podremos afirmar

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Dicho coeficiente se encuentra entre +1 y 1. Cuando es igual a 1 o a

La estimacin de se efecta con el estadstico $:

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

' = & ' + )'

y vemos que a y b muestran

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

donde es la de Student para

PARES DE VALORES x,y

Con ) y los lmites de & '(

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

puede explicarse con la variacin de las

por la propia regresin lineal).

(El criterio de aceptacin para $ en rectas de calibrado debe ser

Para ello podemos utilizar la prueba de Cochran, aplicable para

que compararemos con el valor tabulado correspondiente (tabla siguiente) para . y

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Las observaciones se ordenan, normalmente, en forma de

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Las medias de cada

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Anlisis simple de la varianza

Dentro del grupo

Diferencias cuadrticas medias

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Para aceptar los grupos estudiados como no

En el caso, contrario, de que existan diferencias

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

PROCESO DE VALIDACIN (i)

(Se establece, por la autoridad del laboratorio, la

2. MTODO (Revisin de mtodos disponibles y eleccin del ms apropiado).

(Teniendo en cuenta los aspectos formales de contenido).

(Se ajustan y afinan las distintas variables del mtodo. En

5. ELECCIN DE LOS PARMETROS DE VALIDACIN (Teniendo

6. FIJACIN DE OBJETIVOS PARA LOS PARMETROS DE VALIDACIN

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

PROCESO DE VALIDACIN (ii)

(Para la obtencin de los parmetros elegidos, siguiendo el procedimiento).

8. REALIZACIN DE LOS ENSAYOS DISEADOS

(De acuerdo con el procedimiento (borrador). Evidencias registrales completas).