Protocol de cercetare

Modularea rspunsului la radioterapie n cancerul de col uterin prin compui

biologici cu aciune asupra mecanismelor moleculare ale cancerogenezei
- ANGIOCOL
Proiect CNCSIS multianual de cercetare tiinific ( PN-II- IDEI-PCE-2008-2).
Cod: 1532
Perioada de derulare: 2009-2011

Director proiect: NAGY VIORICA MAGDALENA

Echipa de cercetare
BALACESCU OVIDIU
BUIGA RARES POTCOAVA
BRIE IOANA CARMEN
LELUTIU LUMINITA
TODOR NICOLAE
TUDORAN OANA

Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu

Institutul Oncologic Prof.I.Chiricu
Cluj-Napoca
2009

CUPRINS
1. INTRODUCERE
2. OBIECTIVELE STUDIULUI
3. METODOLOGIA CERCETRII
3.1. Includerea n studiu a pacientelor cu cancer de col uterin
3.2. Includerea n studiu a pacientelor cu afeciuni benigne ale colului uterin
3.3. nregistrarea n baza de date
3.4. Protocol de recoltare probe biologice
3.5. Protocol experimental de anatomie patologic
3.6. Protocol experimental de genomic funcional
3.7. Determinarea nivelului seric si din piesele tumorale de exerez chirurgicala a
EGFR, VEGFR SI COX -2
3.8. Protocolul cercetrii clinice
4. ANEXE
4.1. Consimmnt informat
4.2. Schem Angiocol

1. INTRODUCERE
Cancerul de col uterin pe plan mondial se afl pe locul doi n rndul tumorilor
maligne la femei, anual nregistrndu-se aproximativ 500 000 cazuri noi i 250 000 de
decese. 45% din femeile diagnosticate cu cancer de col uterin au vrsta ntre 40-50 ani.
Dei cancerul de col uterin este o boal prevenibil, n Romnia reprezint o problem de
sntate public, anual fiind nregistrate cca 3500 cazuri noi i 1900 decese, situndu-ne
pe primul loc n Europa n privina incidenei i mortalitii prin cancer de col uterin. Din
cazurile noi diagnosticate cca 70% sunt n stadii avansate, n care rezultatele
tratamentelor clasice (chirurgia, radioterapia, i mai nou chimioterapia) sunt modeste: n
stadiul IIB 70% supravieuire la 5 ani, n stadiul IIIA 50%, n stadiul IIIB 40-30%, iar n
stadiul IVA 10%.
Tratamentul clasic al cancerului de col uterin este chirurgia i radioterapia (RT), iar
ca rezultat al cercetrilor din ultimii zece ani standardul de aur al stadiilor avansate sau a
stadiilor incipiente dar cu risc crecut de eec a devenit radio-chimioterapia (RCT)
concomitent, care s-a dovedit superioar radioterapiei singure, ducnd la o mbuntire
semnificativ, cu 15% a supravieuirii generale. Cu toate acestea aproximativ 50% din
paciente prezint recidiv local sau metastaze la distan n primii doi ani dup
tratamentul iniial. Deoarece valorificarea factorilor de prognostic clinici i histologici
validai, precum i eficacitatea tratmentelor clasice a ajuns la un platou, se impune
intensificarea tratamentelor actuale pe baza unor noi factori de prognostic i introducerea
de noi strategii terapeutice.
Angiogeneza reprezint o treapt important n creterea tumoral, motiv pentru care
este mult studiat prin investigarea unor biomarkeri, rezultatele studiilor publicate ns
sunt contradictorii i n parte incomplete. Totusi, pe lng valoarea lor prognostic,
inhibarea acestor biomarkeri ar putea avea efect terapeutic n mai multe situaii.
Neovascularizaia este o etap important a progresiei tumorale de la leziunile in situ
la boala extins i metastatic, de aceea pe baza unor modele preclinice, intirea vaselor
sanguine tumorale pare s fie o strategie anticanceroas atractiv. n principiu tratamentul
antiangiogenic poate determina, pe lng prevenirea formrii de noi vase, sensibilizarea
celulelor endoteliale la efectul tratamentului citotoxic. Acest efect poate fi direct prin
blocarea moleculelor angiogenice care cresc supravieuirea celulelor endoteliale (ex.
factorul de cretere endotelial vascular -VEGF) sau indirect, interfernd cu recrutarea de
ctre factorii angiogenici a celulelor derivate din mduva osoas la nivelul esutului
tumoral n vederea neovascularizaiei. Astfel, dei n faz incipient de cercetare clinic,
combinarea tratamentelor intite angiogenice cu radio-chimioterapia actual pare s
reprezinte o nou modalitate de abordare fezabil i promitoare n mai multe cancere,
inclusiv n cancerul de col uterin.
Cteva din provocrile combinrii tratamentelor antiangiogenice cu radiochimioterapia sunt: monitorizarea rspunsului tumoral la substane antiangiogene,
utiliznd biomarkeri pentru identificarea pacienilor responsivi i stabilirea dozelor
optimale; estimarea eficacitii acestor noi regimuri care includ compui antiangiogenici;
prevenirea lipsei de rspuns la acest tip de tratament.

Densitatea microvascularizaiei (MVD microvessel density) este studiat i

considerat ca fiind o masur de evaluare a angiogenezei, lund n considerare posibila
influen negativ asupra supravieuirii n cancerul de col uterin.
Expresia receptorului factorului de cretere epidermal (EGFR epidermal growth
factor receptor) s-a dovedit n unele studii a fi un factor independent de prognostic
nefavorabil pentru cancerul de col uterin, n timp ce alte studii nu au confirmat acest
rezultat. Inhibarea EGFR n cursul RT pare a fi o strategie terapeutic promitoare n
unele carcinoame scuamoase. Astfel asocierea radioterapiei cu anticorpii EGFR (ex.
Cetuximab) n cancerele ORL poate duce la mbuntirea controlului loco-regional i a
supravieuirii, n comparaie cu radioterapia singur. Mecanismele care stau la baza
acestei asocieri nc nu sunt bine cunoscute, ele putnd fi multiple: moartea celulelor
stem canceroase produs direct de inhibitorii EGFR, radiosensibilizarea celular produs
de modificarea transduciei semnalului, inhibarea reparrii leziunilor ADN, reducerea
repopulrii n cursul RT, etc. Aceste ipoteze impun studiul inhibitorilor EGFR i a
eficacitii lor in combinaie cu alte tratamente, ca RT sau CT, precum i studiul efectelor
secundare la nivelul esuturilor normale.
Factorul de cretere endotelial vascular (VEGF vascular endothelial growth factor)
este o citokin cu funcie central n angiogenez. Acest factor este eliberat de celula
tumoral i induce formarea reelei capilare din jurul tumorii. Corelarea angiogenezei cu
prognosticul, respectiv rspunsul terapeutic, arat c expresia preterapeutic crescut a
VEGF tumoral, determinat imunohistochimic, pare s aib impact nefavorabil asupra
prognosticului pacientelor cu cancer de col uterin, att n ce privete supravieuirea
general, ct i supravieuirea fr semne de boal. Analiza imunohistochimic a
expresiei VEGF este o metod rapid de identificare a pacientelor cu risc crescut de
recidiv dup RCT i poate fi utilizat pentru identificarea pacientelor care pot beneficia
de alte metode terapeutice noi. VEGF a fost identificat n numeroase studii ca un factor
de prognostic independent pentru supravieuire, n timp ce n alte studii nu s-a dovedit
influena sa asupra supravieuirii. Mai muli investigatori au raportat corelarea expresiei
VEGF cu invazia tumoral sau metastazarea ganglionar. intirea VEGF ca o nou
strategie terapeutic este larg explorat n mai multe localizri tumorale.
Expresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2) s-a observat a fi corelat cu invazia ganglionar
i invazia parametrial n cancerul de col uterin. Expresia crescut a COX-2 la paciente
cu cancer de col uterin pare s fie un predictor al rspunsului slab la chimioterpia
neoadjuvant i al mortalitii ridicate. Inhibarea COX-2 poate s creasc
radiosensibilitatea tumoral fr s afecteze semnificativ rspunsul esuturilor normale la
iradiere].
Dei s-au realizat numeroase cercetri, pn la ora actual sunt doar foarte puine
studii care s investigheze concomitent mai muli biomarkeri la acelai lot de pacieni
tratai omogen. Cteva studii au descris impactul negativ al markerilor angiogenici n
cancerul de col uterin, dar cuantificarea angiogenezei este dificil. Pn la ora actual
studiile publicate au fost retrospective, cuprinznd populaii neomogene n ce privete
caracteristicile tumorale i tratamentul aplicat. Rezultatele sunt contradictorii, neexistnd

o concepie unitar asupra utilitii prognostice i terapeutice a acestor biomarkeri n nici

o localizare tumoral, ceea ce impune noi cercetri n acest domeniu.
Validarea semnificaiei prognostice a acestor biomarkeri ai angiogenezei tumorale,
corelarea acestora cu factorii de prognostici clinici (stadiu, volum tumoral, valoarea
preterapeutic a hemoglobinei, doza de iradiere), stabilirea impactului lor asupra
supravieuirii n cancerul de col uterin poate deschide noi perspective n identificarea
pacientelor cu risc crescut de recidiv i introducerea de noi strategii terapeutice intite,
cu scopul imbuntirii rezultatelor actuale.
Pentru aceasta propunem un studiu prospectiv, care s cuprind un grup omogen de
paciente, cu cancer de col uterin, stadiile IB-IIIB, incluse n dou brae terapeutice:
chirurgie primar (pentru stadiile incipiente), respectiv radio-chimioterapie concomitent
(stadiile avansate), la care s fie evaluat un set de factori angiogenetici tumorali i serici,
care vor fi analizai din punctul de vedere al valorii prognostice, a corelrii cu factorii de
prognostici clinici cunoscui i a capacitii de a identifica pacientele cu risc crescut de
deces.

2. OBIECTIVELE STUDIULUI
Studiul de fa propune examinarea unui pachet de biomarkeri ai angiogenezei n
cancerul de col uterin avnd mai multe scopuri:
- Cunoaterea mai exact a mecanismelor moleculare i a istoriei naturale a bolii
- Identificarea i validarea unor noi factori de prognostic
- Validarea unor factori predictivi ai rspunsului la radiochimioterapie
- Conturarea i introducerea de noi strategii terapeutice cu potenial curativ superior
celor clasice
Dei n faz incipient de cercetare clinic, combinarea tratamentelor intite
angiogenice cu radiochimioterapia actual pare s reprezinte o nou modalitate de
abordare fezabil i promitoare n mai multe cancere, inclusiv n cancerul de col uterin.
De interes deosebit n acest sens sunt:
- Factorul de cretere al endoteliului vascular (VEGF), n prezent considerat cel mai
important factor angiogenic, a crui supraexpresie a fost observat n mai multe tipuri de
tumori. Totui valoarea prognostic a VEGF este nc controversat: unele studii au gsit
c valoarea preterapeutic crescut a VEGF este asociat cu risc crescut de eec i susin
c VEGF este cel mai puternic factor de prognostic, n timp ce altele nu confirm aceast
semnificaie prognostic.
- Receptorii factorului de cretere epidermal (EGFR) sunt supraexprimai ntr-o
varietate de tumori solide, corelndu-se cu un prognostic rezervat. Studii preclinice i
clinice au artat c supraexpresia EGFR este corelat cu control tumoral redus dup
radioterapie. Este interesant teoria c iradierea poate activa EGFR care la rndul su
poate induce radiorezisten i repopularea n cursul RT. Aceste observaii pot sta la baza
asocierii RT sau RT-CT-ei cu inhibitori ai EGFR, reprezentnd o cale promitoare de
studiu n oncologie. O modalitate optim terapeutic poate fi integrarea tratamentelor
moleculare intite n cursul radioterapiei.

- Printre factorii de prognostic nou studiai ai cancerului de col uterin se numr i

supraexpresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2), considerat factor de prognostic nefavorabil,
dar la ora actual sunt doar puine studii, i acestea preclinice.
- Densitatea microvascularizaiei (MVD) este unul din factorii prognostici
histopatologici cei mai studiai i este considerat o masur a angiogenezei tumorale i
factor prognostic semnificativ n multe tipuri tumorale, fr ns a fi unanim acceptat ca
factor de prognostic stabil.
La ora actual valoarea prognostic a acestor factori biologici i implicarea lor n
tratamentul cancerului de col uterin nu este nc confirmat, fiind chiar controverseat i
constituind obiectul unei intense activiti de cercetare.
- Reactia de PCR cantitativ (Real Time PCR) este o metod de evaluare a nivelului de
expresie a genelor implicate in aparitia si progresia cancerului de col uterin.
Obiectivele studiului constau n:
- evaluarea coninutului intratumoral i a nivelului seric al EGFR, VEGF i COX-2 la
pacientele cu cancer de col uterin st. IB-IIIB i la paciente cu afecuni benigne ale colului
uterin
- determinarea MVD n tumorile colului uterin i evaluarea semnificaiei ei prognostice,
att n sine ct i n relaie cu factorii angiogenici menionai
- corelarea factorilor angiogenetici evaluai cu factorii de prognostic clasici i cu
rezultatele terapeutice, respectiv controlul tumoral local i eecurile terapeutice
- identificarea unor eventuale corelaii ntre aceti biomarkeri
- evaluarea nivelelor de expresie genic prin qRT-PCR sau PCR array pentru genele de
interes
Obiectivul final este ca, n urma derulrii studiului s propunem strategii de
mbuntaire a rezultatelor terapeutice la pacientele cu cancer de col uterin, prin
posibilitatea individualizrii tratamentelor clasice i introducerea de noi modaliti
terapeutice (terapii intite), astfel:
o n cancerul de col uterin incipient (n care tratamentul clasic este
chirurgia), dac prin determinarea factorilor angiogenici se estimeaz un
prognostic nefavorabil, se va recomanda tratament adjuvant radiochimioterapic
o n stadiile avansate, validarea acestor biomarkeri va crea posibilitatea
asocierii la tratamentul clasic radiochimioterapic a tratamentelor
moleculare intite.
Acest studiu este deosebit de complex i totodat complet, adresndu-se tuturor
aspectelor patogenetice i investignd toate planurile relevante pentru aceast
problematic, de la cel clinic la cel histologic i pn la nivel molecular i genetic. n
cazul unor rezultate pozitive, intenionm continuarea acestui studiu pentru evaluarea
corelaiei dintre biomarkerii de angiogenez i supravieuire n cancerul colului uterin.

3. METODOLOGIA CERCETRII
Este un studiu prospectiv care va include:
- un lot de 100 paciente cu cancer de col uterin stadiile IB-IIIB care vor fi recrutate
ntr-o perioad de 2 ani: 30 n stadiile IB-IIA (operate n prim timp) i 70 n
stadiile IIB-IIIB (radio-chimioterapie primar)
- un lot mai mic (cca 20) de paciente cu afeciuni benigne ale colului uterin.
Cercetarea se va desfura pe dou planuri simultane: clinic si experimental.
3.1. Includerea n studiu a pacientelor cu cancer de col uterin
Pacientele cu carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic vor fi incluse n
dou categorii terapeutice:
- stadii incipiente (IB-IIA) care vor efectua n prim timp tratament chirurgical
- stadii avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitent
conform protocoalelor terapeutice standard n vigoare.
Diagnostic, bilan preterapeutic i stadializare
- examen clinic efectuat de ctre 2 examinatori
- biopsia tumorii pentru confirmare histopatologic
- radioscopie toracic
- computer tomografie abdomino-pelvin cu substan de contrast iv
- cistoscopie
- ex. de laborator: hemoleucogram, uree, creatinin, glicemie, transaminaze
- stadializare conform clasificrii FIGO
Criterii de includere
1. Carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic
2. Stadiile clinice FIGO IB-IIIB
3. Vrsta pacientelor: 20-70 ani
4. Indice de performan Zubrod 2.
5. Probe hematologice: Hb 9 g/l, L 3000, Tr 100.000
6. Probe renale: creatinina < 1,2 mg/l, azot < 80 mg/l
Criterii de excludere
1. Prezena unei alte tumori maligne n antecedente
2. Cancer de col uterin tratat anterior (prin chirurgie, radioterapie sau
chimioterapie)
3. Indice de performan 3 sau 4
4. Tratament ntrerupt
5. Contraindicaii cardio-vasculare sau renale pentru administrarea de
cisplatin

3.2. Includerea n studiu a pacientelor cu afeciuni benigne uterine

In studiu vor fi incluse i paciente cu col uterin normal, operate (histerectomie
total) pentru afeciuni benigne ale organelor genitale.
3.3. nregistrarea n baza de date
naintea includerii n studiu pacientele vor fi informate despre metodologia
studiului, probele biologice care vor fi recoltate i tratamentul indicat. Fiecare pacient va
semna consimmntul informat (Anexa 4.1.), respectndu-se condiiile de etic
medical.
Dac pacienta ndeplinete criteriile de includere n studiu, foaia de observaie se
trimite pentru nregistrarea n baza de date a studiului (Mihaela Todor, etaj IV, tel:
214) i eliberarea dosarului de studiu a pacientei. Cu aceast ocazie se va elibera i
eticheta special a studiului cu numele bolnavei i numrul de nregistrare n studiu, care
va nsoi att foaia de observaie clinic ct i probele biologice recoltate de la pacienta
respectiv. Consimmntul informat semnat de pacient este inclus n dosarul de studiu.
Dup includerea n studiu fiecare pacient va completa un chestionar de
evaluare a factorilor de risc pentru cancerul cervical (Anexa 4.2.).
3. 4. Protocol de recoltare probe biologice
Recoltarea de citologie cervico-vaginal
Recoltarea se va face preterapeutic la toate pacientele incluse n studiu de ctre
clinician cu un recoltor de tip perie (cito brush) printr-o miscare circulara insistand pe
zona de interes. Capatul periei se va detasa si se va introduce in solutia de fixare in vase
speciale etichetate. Dupa inchiderea capacului se va agita bine vasul pentru desprinderea
celulelor de pe perie, pentru buna fixare a acestora in lichid. Vasul (etichetat cu eticheta
special a studiului) se va trimite Laboratorului de Genomic (unde va fi preluat de
ctre Nui Rechit sau Oana Tudoran, tel: 144). Din solutia obtinuta se va face un
examen citologic monostrat (frotiu) si evaluare incarcatura HPV (33 subtipuri) prin
reactia PCR.
Recoltarea de snge (pentru obinere ser) (dimineaa ntre orele 8-10)
De la fiecare pacient se vor recolta n secia clinic 12 ml snge (in 2 eprubete a 6 ml
nepreparate special) pentru evaluarea n dinamic a factorilor serici:
preterapeutic: naintea interveniei chirurgicale sau biopsiei (toate cazurile
incluse n studiu)
n ultima zi a radio-chimioterapiei
la 2 luni de la ncheierea radio-chimioterapiei

Eprubetele se trimit la Laboratorul de Genomic (unde vor fi preluat de ctre Nui

Rechit sau Oana Tudoran, tel: 144). Din aceste eprubete o parte din snge va fi trimis
Laboratorului de Radiobiologie (Dr. Ioana Brie).
Recoltarea de snge (pt extracia de ARN) (dimineaa intre orele 8-10)
Pentru extractia de ARN se recolteaz preterapeutic de la toate pacientele incluse
n studiu 2,5 ml snge in eprubet special (PaxGene) care contine o solutie
stabilizatoare pentru ARN. Eprubetele sunt furnizate de Laboratorul de Genomic (Nui
Rechit sau Oana Tudoran, tel: 144).
Post recoltare eprubeta trebuie agitata prin rotire stanga-dreapta de 10 ori , conform
specificatiilor producatorului, pentru a inactiva cat mai eficinet RN-azele si a diminua
efectul de degradare al ARN-ului.
Eprubeta etichetat va fi trimisa fara conditii speciale de transport in Laboratorul de
Genomica in vederea extractiei de ARN (unde vor fi preluat de ctre Nui Rechit sau
Oana Tudoran, tel: 144).
Recoltarea de esut de col uterin - la pacientele cu radio-chimioterapie primar
(ntre orele 10-13)
Recoltarea preterapeutic si postterapeutic (la 2 luni dup terminarea RT&CT)
a fragmentelor biopsice se realizeaz in conditii metodologice identice:
Medicul clinician va recolta 2 fragmente biopsice (minim 5x5 mm) de calitate egala
(dimensiune, viabilitate) din tumora de col uterin evitand zonele necrotice ale acesteia.
- Primul fragment se va imersiona intr-un flacon etichetat continand formol
tamponat 5%
- Al doilea fragment se va introduce intr-un criotub etichetat care va fi introdus
imediat intr-un vas cu azot lichid (-1960)
Ambele flacoane se obin de la Laboratorul de Anatomie Patologic, Camera 1
(primire piese, Gabi Tanu, tel 158) si sunt trimise cu piesa recoltat la Laboratorul de
Anatomie Patologica pentru evaluare histopatologica (vor fi preluate sub semntur de
ctre asistentul de serviciu la camera 1- de primire Piese).
Recoltarea de pies operatorie (paciente operate n prim timp).
Dup semnarea consimmntului informat i includerea pacientei n baza de date
a studiului, eliberarea dosarului i etichetelor (Mihaela Todor, tel 214), Laboratorul de
Anatomie Patologica va fi notificat la inceputul programului operator. Piesa operatorie
recoltata va fi ambalata imediat intr-o punga de plastic etichetata si introdusa intr-o cutie
frigorifica pe unitati de racire i se va transporta la Laboratorul de Anatomie Patologica
(va fi preluat sub semntur de ctre asistentul de serviciu la camera 1- de primire
Piese) unde va fi examinata pentru diagnostic si includere in Biobanca.

Se aplic protocol identic si pentru piesele de histerectomie utilizate pentru

recoltarea de tesut normal in vederea stabilirii lotului control (martor).
Cnd probele ajung n Biobanc fiecare pies va primi un cod specific biobncii i
tipului de prob biologic recoltat.
3.5. Protocol experimental de anatomie patologic
Va consta n determinri de laborator la toate persoanele incluse n studiu:
- evaluarea seric i intratumoral a unor biomarkeri de angiogenez (EGFR,
VEGF, COX-2),
- cuantificarea microdensitii neovascularizaiei (MVD)
- evaluarea nivelului de expresie a genelor implicate in apariia i progresia
cancerului de col uterin prin tehnica de PCR cantitativ (real-time PCR)
Pe msura includerii n studiu a cazurilor se va efectua:
- evaluarea iniial a materialului tisular disponibil (re-evaluarea diagnosticului de
trimitere de ctre doi anatomopatologi)
- evaluarea existenei de material histologic suficient i de bun calitate n blocurile
de parafin corespunztoare, din care se vor executa seciuni la 5 microni ce se
vor etala pe lame silanate
- se va crea o banc de materiale biologice congelate (biobanc) care va fi utilizat
n realizarea studiilor de biologie molecula care au ca finalitate stabilirea de
semnturi moleculare la nivelul eantioanelor analizate. Pe de alta parte, biobanca
va permite deschiderea de oportuniti de cercetare translaonal att la nivel
naonal ct i internaional.
Determinarea expresiei EGFR, VEGF si COX-2 n esutul tumoral
Se va face prin tehnici specifice de imunohistochimie, utiliznd anticorpi primari antiR-EGFR, anti-R-VEGF i respectiv anti-COX-2. Dup deparafinare, seciunile
histologice se vor trata termic timp de 20 de minute n tampon citrat pentru demascarea
antigenic a seciunilor. Seciunile histologice se vor incuba cu anticorpul primar folosind
timpii de incubare i respectiv diluiile cele mai potrivite, conform specificaiilor tehnice
ale productorului. Coloraiile se vor aprecia cantitativ pentru compartimentul epitelial al
tumorii utiliznd grila Weibel de 42 puncte montat n piesa ocular a microscopului.
Aceasta va permite evaluarea procentului de celule epiteliale pozitive pe 10 cmpuri
microscopice de mrire mare (x 400) pentru fiecare lam. Folosind valoarea median a
expresiei EGFR n componenta epitelial, tumorile vor fi clasificate n tumori cu expresie
ridicat a EGFR i n tumori cu expresie sczut a EGFR. In mod similar se va proceda
i n cazul VEGF i COX-2.
Determinarea densitii microvascularizaiei tumorale (MVD)
Se va face prin marcarea endoteliului vascular cu anticorpul monoclonal CD34 (clona
QBEnd 10) i ncubare 30 minute la o dilutie de 1:200. Densitatea microvascularizaiei
tumorale se va aprecia prin tehnica hot spot, ce const n scanarea ariei tumorale

10

pentru identificarea zonelor celor mai dens vascularizate, la nivelul crora se numra i se
insumeaz elementele (profilele) vasculare identificate dup criteriile general acceptate
ale lui Weidner. Folosind valoarea median a DMV ca valoare prag, cazuistica se va
diviza n tumori slab vascularizate, respectiv tumori intens vascularizate. In rarele cazuri
care exprim difuz CD34 la nivelul stromei, impiedicnd astfel numrarea corect a
profilelor vasculare, se va utiliza CD31 ca metod alternativ de colorare.
Rezultatele obinute vor fi introduse n baza de date a studiului i n dosarul de studiu
a pacientei.
3.6. Protocol experimental de genomic funcional
Reacia de PCR cantitativ (Real Time PCR) se va utiliza pentru evaluarea nivelului
de expresie al genelor implicate n apariia i progresia cancerului de col uterin. Aceasta
se va realiza cu ajutorul aparatului Light Cycler 2 (Hoffman la Roche) cu ajutorul
sondelor taqman specifice fiecarei gene. Cuantificarea transcriptiei genice se va face prin
reacia PCR care folosete activitatea 5-3' exonucleazic a enzimei taq-polimeraz,
pentru a ndeprta o sond fluorescent care se hibridizeaz specific pe produsul de
transcripie. Pentru normalizarea nivelelor de expresie a genelor de interes vor fi utilizate
gene de referin precum: RPLPO (Large Ribosomal Protein PO), -globin, GAPDH
(Glyceraldehide-3phosphate dehydrogenase). Genele de referin au o expresie
cvasiconstant la nivel celular fiind denumite i gene housekeeping. Designul primerilor
i sondelor UPL (Universal Probe Library) se va face prin studii in silico. Aparatul
utilizat pentru determinarile de expresie cantitativa va fi Light Cycler 480 (Hofmann la
Roche).
Rezultatele obinute vor fi introduse n baza de date a studiului i n dosarul de studiu
a pacientei.

3.7. Protocol de determinare a nivelului seric si din piesele tumorale de exerez

chirurgicala a EGFR, VEGFR SI COX -2 (Laboratorul de Radiobiologie)
Concentratiile serice i intratumorale ale receptorilor solubili ai VEGF si EGF si
ale COX-2 vor fi cuantificate prin kituri ELISA (enzyme-linked immunoassay) cu
ajutorul unui cititor ELISA de microplaci Tecan Sunrise
Prelucrarea probelor
Probele de sange:
Sange periferic recoltat se las 3- minute la temperatura camerei, timp in care are
loc coagularea, dup care se centrifugheaz 15 min la 1000 x g. Serul colectat se
portioneaza n trei microtuburi care se pstreaz la - 200 C in Biobanca.
Inainte de analiza, serurile vor fi decongelate lent si aduse la temperatura camerei.

11

Probele de ser cu precipitate vizibile vor fi clarificate inainte de analiza, iar

probele intens hemolizate sau lipemice vor fi excluse
Lizatele tisulare din piesele de histerectomie (tumor i esut cervical normal)
Celule aderente
Pentru determinari este necesar un numar mediu de 107 celule aderente cultivate pe placi
Petri de 90 mm diametru.
Supernatantul este aruncat si se adauga 1 ml de de solutie de extractie a receptorului.
Celulele sunt apoi desprinse cu ajutorul unui scrapper si transferate intr-un tub de
microcentrifuga de 1,5 ml, si se centrifugheaza la 10000 x g. timp de 5 minute la
temperatura de 40C. Supernatantul se colecteaza, se portioneaza si se pastreaza la -800C.
Celule neaderente
Celulele neaderente se transfera in tuburi de microcentrifuga si se centrifugheaza la 300 x
g. Dupa ce supernatantul este indepartat se va adauga 1 ml de de solutie de extractie a
receptorului in care se vor resuspenda bland celulele. Suspensia celulara este apoi
centrifugata la 10000 x g. timp de 5 min la temperatura de 40C. Stocarea se va face prin
inghetare la, -800C.
Probele de lizate tumorale vor fi diluate de 10-50 ori, probele de ser vor fi analizate
nediluate sau diluate de 2 ori.
Principiul metodei
Probele si standardele se pipeteaza in godeurile placii. Moleculele solubile de
VEGF-R, EGF-R si COX-2, prezente in serul de analizat i/sau n lizatele tumorale vor
fi legate de anticorpii ce tapeteaza godeul.
Substantele ramase nelegate in godeuri vor fi indepartate prin spalare, dupa care
se adauga anticorpii policlonali specifici pentru VEGFR sau EGFR sau COX, legati la
sistemul enzimatic.
Dupa o noua spalare pentru indepartarea reactivului anticorp-enzima nelegat, se
adauga substratul enzymatic. Virarea culorii este stopata si apoi se va masura intensitatea
culorii la cititorul de microplaci, absorbtia la o lungime de unda indicata de producatorul
kitului. Fiecare proba va fi analizata in duplicat.
Cu ajutorul programului Magellan se creeaza o curba standard si se va calcula
valoarea medie pentru fiecare standard, control sau proba a pacientului.
Tehnica de lucru
Va fi folosita cea din manualul tehnic al fiecarui kit folosit, conform indicatiilor
producatorului.
Indiferent de kitul folosit, principalele etape sunt urmatoarele:
1. Prepararea reactivilor, solutiilor standard si solutiilor de lucru
2. Se adauga 100 l din solutia standard/control/solutia de lucru in fiecare godeu
si se incubeaza 2 ore la 37C
3. Se indeparteaza lichidul din fiecare godeu, prin aspirare cu pipeta
4. Se adauga 100 l din reactivul A de detectare in fiecare godeu si se incubeaza
1 ora la 37C.

12

5. Se aspira si se spala de 3 ori fiecare godeu. Spalarea se face prin umplerea

fiecarui godeu cu tampon de spalare (350 l). Indepartarea completa a
lichidului in fiecare din aceste trepte este esentiala pentru corectitudinea
rezultatelor. Dupa ultima spalare, se indeparteaza orice urma de tampon de
spalare restant, prin aspirare sau decantare. Se inverseaza placa cu godeuri pe
un tampon absorbant.
6. Se adauga 100 l de reactiv B de detectare in fiecare godeu. Se acopera si se
incubeaza 1 ora la 37C.
7. Se repeta aspirarea/spalarea ca in treapta 5.
8. Se adauga 90 l de solutie-substrat in fiecare godeu. Se incubeaza 30 de
minute la temperatura camerei, protejat de lumina.
9. Se adauga 50 l de solutie de stopare in fiecare godeu.
10. Se determina densitatea optica a fiecarui godeu, cu ajutorul unui cititor de
microplaci, la 450nm lungime de unda, in maximum 30 de minute.
Citirile se vor face in duplicat, pentru solutia standard, control si cea de lucru. Se face
media citirilor duplicatelor si se construieste o curba standard.
3.8. Protocolul cercetrii clinice
Pacientele vor fi selectate, nrolate i incluse (pe baza criteriilor de includere) n
dou categorii terapeutice:
- stadiile incipiente (IB-IIA), care vor efectua n prim timp tratament chirurgical
- stadiile avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitent
conform protocoalelor terapeutice standard n vigoare.
Protocol terapeutic
Stadiul IB1
1. Histerectomie radical cu limfadenectomie pelvin fr iradiere preoperatorie.
Iradiere pelvin postoperatorie (DT=50 Gy) asociat cu chimioterapie bazat pe cisplatin
n caz de ganglioni pelvini pozitivi, margini chirurgicale pozitive, parametre invadate.
2. Radioterapie: iradiere extern pe pelvis asociat cu 2 sau mai multe aplicaii de
brahiterapie intracavitar.
3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy) - dac la intervenia
chirurgical se evideniaz ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) i tumora
pelvin este controlabil. Postoperator se indic radioterapie"extended-field" (iradiere
pelvin i paraaortic) asociat cu chimioterapie bazat pe cisplatin.
Stadiul IB2
1. Radioterapie: iradiere extern pe pelvis asociat cu 2 sau mai multe aplicaii de
brahiterapie intracavitar, cu reevaluare la doza de 46+10 Gy, n vederea deciderii
conduitei n continuare: radioterapie exclusiv sau intervenie chirurgical. (HRLP).
2. Chirurgie: histerectomie radicala cu limfadenectomie pelvin.

13

3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy), dac la intervenia

chirurgical se evideniaz ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) i tumora
pelvin este controlabil.
Stadiul II A
Tumori cervicale de dimensiuni < 4 cm
1. Chirurgie: histerectomie radical cu limfadenectomie pelvin.
2. Radioterapie: radioterapie extern postoperatorie (DT=50 Gy/pelvis, tehnica
box) brahiterapie intracavitar, asociat cu chimioterapie bazat pe cisplatin, dac
examenul histologic al piesei operatorii evideniaz ganglioni pelvini pozitivi, margini de
rezecie pozitive sau parametre pozitive.
Tumori cervicale de dimensiuni 4 cm
1. Radioterapie extern pelvin asociat cu cisplatin i supraimpresiune pe colul
tumoral prin brahiterapie utero-vaginal, urmat la interval de 4-6 sptmni de chirurgie
(histero-colpectomie lrgit cu limfadenectomie pelvin).
2. Radioterapie exclusiv (extern + brahiterapie intracavitar) + chimioterapie
concomitent cu cisplatin.
3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT=44-46 Gy) - dac la intervenia chirurgical
se evideniaz ganglioni paraaortici inextirpabili i tumora pelvin este controlabil.
Postoperator se indic radioterapie"extended-field" (iradiere pelvin i paraaortic)
asociat cu chimioterapie bazat pe cisplatin.
4. Radioterapie"extended-field" (iradiere pelvin i paraaortic) asociat cu
chimioterapie bazat pe cisplatin - dac bilanul preterapeutic evideniaz ganglioni
paraaortici mrii de volum.
Stadiul II B
Conduita standard in stadiul IIB este radioterapia. Chirurgia (HRLP) va fi utilizat
numai n cazuri bine selecionate, evaluate dup radioterapie.
Radioterapie: extern: DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box" + supraimpresiune pe
volumul tumoral central prin brahiterapie intracavitar (pn la DT=85 Gy n punctul A)
sau prin iradiere extern tehnica "pendular" (DT=10-14 Gy) asociat cu chimioterapie
concomitent (cu cisplatin)
Stadiul III
Standard
Radioterapie: extern (DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box") + supraimpresiune pe
volumul tumoral central (brahiterapie intracavitar pn la DT=85 Gy n punctul A sau
prin iradiere extern tehnica "pendular" (DT=10-14 Gy).+ Chimioterapie concomitent
(bazat pe cisplatin)
Opiuni
1. Reevaluare la doza de iradiere de 44-46 Gy/ pelvis + supraimpresiune pe
tumora central (10-14 Gy): n cazul rspunsului favorabil la nivelul parametrelor (=
operabilitate) dar cu relicvat tumoral central care nu poate fi controlat cu radioterapie
exclusiv- intervenie chirurgical cu intenie de radicalitate (HCL cu biopsie ganglionar

14

para-aortic) dup un interval de 4-6 sptmni. Dac se confirm histologic invazia

ganglionilor para-aortici: postoperator iradierea ganglionilor para-aortici + chimioterapie.
2. Iradierea ganglionilor paraaortici (44 - 50 Gy) mrii (> 1 cm) la examenul
computer tomografic: tehnica "extended-field" asociat cu chimioterapie bazat pe
cisplatin - dac exist ansa obinerii controlului tumorii primare prin radio-chimioterapie
Evaluarea rspunsurilor terapeutice
Evaluarea rspunsului terapeutic pentru cazurile neoperate
La 2 luni i la 5 luni dup terminarea radio-chimioterapiei exclusive:
- remisie complet (RC): dispariia complet a tumorii la nivelul colului i a
extinderilor sale (vagin, parametre)
- remisie parial (RP): diminuarea cu 50% sau mai mult a leziunilor cunoscute
- staionar (ST): o scdere cu 50% a leziunilor nu a putut fi documentat, dar
nici o cretere a lor cu 25%
- evoluie (EV): creterea cu 25% sau mai mult a tumorii de la nivelul colului
sau a extinderilor loco-regionale
Evaluarea rspunsului terapeutic la cazurile operate
Pe baza rezultatului histologic al piesei operatorii:
- RC: piesa steril
- RP: relicvat tumoral numai la nivelul colului uterin
- ST: parametru (e) i/sau ganglion (i) histologic pozitivi
In ultima etap a studiului se va realiza:
- analiza i interpretarea datelor clinice i experimentale
- corelarea datelor experimentale obinute cu factorii de prognostic clasici i cu
rezultatele terapeutice (controlul tumoral local i eecurile terapeutice).
ntreaga activitate desfurat n cadrul acestui proiect se va face respectnd normele
elaborate de Comisia de Etic a Universitii de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu
Cluj-Napoca i n concordan cu normele internaionale din domeniu. Cercetarea clinic
se va desfura cu respectarea Declaraiei de la Helsinki referitoare la studiile pe subieci
umani. De la fiecare pacient se va obine n prealabil consimmnntul informat, sub
semnatur. n ce privete partea experimental, toate activitile depuse pentru realizarea
prezentului studiu se vor desfura n acord cu Regulile de bun practic n laborator.
Echipa implicat n desfurarea studiului este una multidisciplinar, cuprinznd
clinician radioterapeut, chirurg, tolog, specialist n biologie molecular, radiobiolog,
activitatea lor necesitnd o colaborare perfect n vederea parcurgerii n lan a tuturor
etapelor cercetrii.

15

INSTITUTUL ONCOLOGIC PROF. DR. I. CHIRICU CLUJ NAPOCA

STR. REPUBLICII NR. 34-36, 400015 CLUJ-NAPOCA, ROMNIA
TEL: +40-264-598 361/62, 63, 64; 591281/82; 450672;
Fax: +40-264-597673/597692;
e-mail: office@iocn.ro

web: www.iocn.ro
Consimmnt informat
Semntura dat mai jos confirm urmtoarele:
Subsemnata, prin prezenta consimt s particip la studiul n domeniul colului uterin n care voi fi
inclus.
Am fost informat c pentru aceasta mi se va recolta snge din ven i un fragment de tumor de
la nivelul colului uterin.
Mi s-a explicat c acceptarea sau refuzarea includerii n studiile de cercetare n domeniul colului
uterin nu mi va modifica conduita trerapeutic stabilit i relaia cu doctorul curant.
Accept ca orice date provenite din probele biologice care rezult din acest studiu de cercetare s
poat fi incluse i n alte studii de cercetare. Participarea mea este complet voluntar.
Am fost informat c datele (personale, clinice

i ale materialelor biologice) colectate pot fi

folosite pentru cercetarea tiinific in domeniul patologiei colului uterin i c imi va fi asigurat
confidenialitatea.
Am neles c toate datele (personale, clinice i ale materialelor biologice) colectate vor fi tratate
n conformitate cu Directiva Uniunii Europene (Dir /95/46/EC) asupra proteciei indivizilor cu
privire la procesarea datelor personale i cu aplicarea legilor naionale.
Sunt de acord ca viitoarele studii de cercetare s poat fi realizate pe materialele biologice
rmase, incluse in biobanc, i c orice dat rezultat din aceste studii s poat fi legat n viitor
de alte date provenite din studii de cercetare.
Nume Pacient________________________________
Semnatura Pacient______________________________
Data:________________

Subsemnata/ul, investigator clinic, confirm c am informat n prealabil pacienta cu privire

la realizarea studiilor de cercetare i c nu am exercitat nici o presiune asupra pacientei de a lua
parte la aceste studii.
Nume Investigator________________________________
Semnatur Investigator:______________________________

16

ANGIO - CERVIX
St. I B IIA
(CH primara)

Includere

Recoltare probe biologice

Preterapeutic
- citologie cervico-vaginala (perie)
- snge periferic - 2 eprub. x 6 ml )
- 1 eprub PaxGene
2,5 ml
- piesa operatorie -> cutie frigorifica

Recoltare probe biologice

Nr. paciente:

- CH primara: 30
- RT&CT primara: 70
- Col normal: 20

Prelucrare
Lab.Genomica;
Lab.Genomica:tel.144

Anat. Patol.
Radiobiologie

Anat. Patolog. tel.158

Prelucrare

Consimtamntul informat
baza date + dosar + eticheta
(Mihaela Todor, tel.214)

Preterapeutic
-citologie cervico-vaginala (perie)
-snge periferic - 2 eprub. x 6 ml )
- 1 eprub PaxGene
2,5 ml
- biopsie tumora 2 fragm. x 5 mm

Biobanca

Lab.Genomica; tel.144
Lab.Genomica

Anat. Patologica: tel.158

1. n flacon cu formol tamponat 5%

2. n criotub -> azot lichid

St. IIB IIIB

(RT& CT primara)

Postterapeutic ultima zi de RTE

- sange periferic (3 eprubete)

Lab.Genomica:tel.144

Postterapeutic la 2 luni dupa RTE

- sange periferic (3 eprubete)
- biopsie col uterin ( 2 fragmente)
1. n flacon cu formol tamponat 5%
2. n criotub -> azot lichid

Lab.Genomica
Anat. Patologica, tel: 158

17

18