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17/09/2014

ENZYMOLOGIE
Pr Layachi CHABRAOUI

Cours1re Anne Pharmacie Rabat 2014-2015

ENZYMOLOGIE?
L'enzymologie est ltude biochimique des enzymes.
Elle consiste tudier les proprits structurales et
fonctionnelles des enzymes. Elle sintresse aussi
dcrire la vitesse des ractions catalyses par les
enzymes et les facteurs qui linfluence.

Introduction
Les organismes vivants sont le sige d'une multitude de
ractions biochimiques. Ces ractions concernent la
biosynthse ou le catabolisme dun grand nombre de
molcules biologiques. Elles constituent le mtabolisme
qui s'effectue dans des conditions physiologiques (pH:7,
temprature :37oC) grce la prsence des enzymes

Les enzymes ont donc un rle vital

17/09/2014

Les chapitres du cours

Structure et proprits des enzymes


Cintique enzymatique
Mcanisme de la raction enzymatique

Chapitre 1
Structure des enzymes
Objectifs:
Distinguer les diffrents groupes denzymes
Dcrire la structure des enzymes
Expliquer le mode daction des enzymes et des coenzymes
Distinguer les diffrents types de facteurs qui influencent
la cintique enzymatique

1- Dfinitions
1.1- Les enzymes
Protines spcialises dans la catalyse de ractions.

Catalyseurs biologiques trs puissants


Elles augmentent la vitesse des ractions
chimiques, sans en modifier lquilibre.
A + B

C +D

Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres


vivants. Cette synthse est dtermine gntiquement.
Chaque enzyme est le produit dexpression dun gne
(parfois 2 gnes)

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1.2- Un substrat (S):est la molcule qui est transforme sous


laction de lactivit de lenzyme
1.3- Un produit (P): est la molcule qui apparat au cours
dune raction catalyse par lenzyme
Site actif

S
S
Enzyme

Enzyme

Enzyme

ES

S + E

P + E
produit

substrat

1.4- Le site actif : la partie de lenzyme qui fixe le substrat


et le transforme.

2- Historique
1730: La digestion est un phnomne plus chimique que
mcanique
1850: Pasteur dmontra que la fermentation du sucre en
alcool par la levure est catalyse par une substance
qui existe dans la levure

En zyme
dans

levure

1897:

Buchner a extrait de la levure les premires enzymes

1929:

La 1re enzyme purifie et cristallise est lurase


Ure

Urase

CO2 + 2NH3
+ de 3000 E <<< nombre denzymes effectivement prsentes

3- PROPRIETS ET CARACTRISTIQUES DES ENZYMES


3.1- Agissent en trs faible quantit:
une molcule de catalase peut hydrolyser 5 millions de
molcules dH2O2 en une min dans des conditions de pH et
de temprature physiologiques
3.2- Ne sont pas consommes au cours de la raction:
comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent
intactes la fin de la raction
3.3- Sont spcifiques:
Une enzyme transforme un S donn (spcificit de substrat)
grce une raction donne (spcificit de raction)

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Spcificit lie la raction : Spcificit troite


Exemples: AA = substrat de 3 types denzymes (3 ractions)

dcarboxylation
R

CH

COOH

NH2

oxydase

oxydation
dsamination

AA

Spcificit vis vis du substrat:


Spcificit troite
Certaines E peuvent distinguer entre la forme D et L
ou entre la forme et = strospcificit
Spcificit large
Phosphatase
R+ P
R-P
alcaline
Autres exemples: HK et GK

3.4- Mode daction des enzymes


S

nergie
tat de transition
sans catalyseur
catalyseur
Energie
dactivation
enzyme
tat initial
tat final
droulement
de la raction

Les enzymes abaissent


lnergie dactivation

Illustration:
H2O2

O2 + H2O

Sans catalyseur : 18 kcal/mole dH2O2


Catalyseur chimique (le platine) : 11,7 kcal/mole dH2O2
Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole dH2O2
Les enzymes abaissent lnergie dactivation
Elles ne modifient pas lquilibre
Elles augmentent la vitesse de raction
3.5- Les enzymes sont rgulables
Lactivit catalytique de nombreuses enzymes varie
en rponse des signaux mtaboliques (inhibiteurs,
activateurs)

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4- Structure des enzymes: 2 types


ex:
Chymotrypsine

- Enzymes entirement protiques


=
holoenzyme
totalit

cofacteur

- Enzymes formes de deux parties

apoenzyme

Une partie protique: apoenzyme


Une partie non protique: cofacteur

- ion mtallique
- coenzyme, groupement
prosthtique

Apoenzyme: intervient dans la spcificit, thermolabile


Cofacteur: effectue la raction chimique, thermostable

4.1- Les enzymes holoprotiques:


Les enzymes sont des protines globulaires.
Elles peuvent tre formes:
- dune seule chane polypeptidique ex: le lysozyme
130 acides amins

- de plusieurs chanes identiques ou diffrentes


Exemples: Isoenzymes
enzymes allostriques

4.1.1- Le site actif


- Dfinition:
= enzymatique:
acides amins qui entrent en contact avec le S
4-1 La protine
site actif

- le site de fixation qui se combine au substrat


- le site catalytique qui agit sur le substrat
pour lui faire subir la raction chimique.

- Constitution: srine, cystine, histidine, tyrosine

- Mise en vidence des AA du site actif:


a- Utilisation des composs qui se fixent spcifiquement
un AA
Diisopropylfluorophosphate (DFP): Srine
Parachloromercuribenzoate: Cystine
Drivs arsenicaux: Cystine
b- Mthodes de gnie gntique

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4.1.2- Relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique


Exemple: : la trypsine: enzyme pancratique

Zymogne
Trypsinogne Nt
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

His
His

49

29

(inactif)

Ser
S

183
S

entrokinase : E intestinale
Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

Trypsine

Site actif
His His
29 49

(active)

Ser

183

S
S

Le dpart de lhexapeptide, fortement charg (-) par les 4 Asp, modifie la


conformation de la protine, en favorisant la formation dhlice .

4.1.3- forme du site actif


1890: Fischer a propos que la forme du substrat est
complmentaire de la forme du site actif de lenzyme
= modle de la cl et de la serrure

1958: Koshland a propos que lenzyme et le substrat


adaptent mutuellement leurs formes respectives
Une molcule denzyme nest pas rigide mais flexible
= modle de lajustement induit
(comme la main et le gant)

4-2 Enzymes htroprotiques: Cofacteurs


- de nature inorganique: les ions mtalliques,
- de nature organique: les

coenzymes

Lorsque le coenzyme se lie la protine enzymatique par une


liaison covalente, on parle de groupement prosthtique
Lorsque la liaison est faible on parle de

cofacteur

cosubstrat
apoenzyme

4-2-1 Ions mtalliques


Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+
Exemples: Fer: les cytochromes
Zn2+ dans lalcool dshydognase forme un pont entre
lenzyme et son substrat

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4-2-2 Coenzyme
Molcule indispensable la raction enzymatique. La raction se produit
avec le coenzyme et non avec la protine (coenzyme = site catalytique)
Lapoenzyme intervient dans la spcificit (site de fixation)
Mode daction des coenzymes

Exemple:

A-X + Co

A + Co-X

Co-X + B
A-X + B

A + B-X

B-X + Co
dshydrognase

AH2 + FAD

hydrognase

FADH2 + B

A + FADH2
BH2 + FAD

Le coenzyme nest pas spcifique: plusieurs enzymes diffrentes


peuvent avoir le mme coenzyme
certaines enzymes ont besoin dun ion mtallique et dun groupement
prosthtique: cas des cytochromes: noyau porphyrique + Fe2+

5- NOMENCLATURE ET CLASSIFICATION DES ENZYMES


Avant 1961 : les enzymes ont t dnommes selon le nom du S sur
lequel elles agissent en ajoutant le suffixe "ase ou le nom
de la raction
Exemples:

Substrat

Enzyme

amidon
ure

amylase
urase

E1 Dcarboxylase
Acide amin

E2 Aminotransfrase
E3 Oxydase

1961: lunion internationale de biochimie (UIB) : nouvelle classification


des enzymes selon le type de la raction catalyse

6 classes denzymes
On a attribu chaque enzyme un numro: EC-a-b-c-d
(EC = Enzyme Commission)

5.1- Les oxydorductases(EC-1- avec 23 sous groupes)


ncessitent un coenzyme (NAD, NADP, FAD ou FMN)

Aox + Bred
Hydroxylases:

Ared + Box

(=monooxygnases)

-CH3
-CH2-

catalysent la fixation dun


atome doxygne(EC 1-13-)

-CH2OH
-CHOH-

Dshydrognases:
lactate dshydrognase (EC 1-6-)
CH3- CHOH-COOH + NAD+
ac. lactique

CH3-CO-COOH
ac. pyruvique

+ NADH + H+

Cytochromes: ont un coenzyme hminique avec un ion, qui prsente 2


tats doxydation, ce qui en fait un transporteur
dlectrons.
Fe2+
Fe3+ + 1erduit
oxyd

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5.2- Les transfrases catalysent le transfert de groupement autre


que lhydrogne entre deux substrats
(EC-2-)
ncessitent un coenzyme

A-X + B

A + B-X

les transaminases: transfrent les radicaux amins -NH2 dun AA un


acide ctonique accepteur. Le coenzyme est le
(EC-2-6-)
phosphate de pyridoxal.
les phosphokinases ou kinases: transfrent un P sur une molcule
(EC-2-7-)
dADP. Lion Mg++ est indispensable.
ATP + glucose
Les transactylases:

ADP + glucose 6P

transfrent les radicaux actyles(-CH2COOH), le


coenzyme est CoA

Les transmthylases:

transfrent les radicaux mhyles (-CH3), dune


molcule une autre, le coenzyme est lacide
tetrahydrofolique.

5.3- Les hydrolases (EC-3- avec 13 sous groupes)


Catalysent la rupture dune liaison avec fixation des lments
dune molcule deau.
A-B + H2O

A-H +

B-OH

Les estrases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool

(EC-3-1-)
RCOO-CH2-R + H2O

RCOOH + RCH2OH

Les lipases : hydrolysent les glycrides en glycrol et en acides gras


Les osidases: hydrolysent les osides
glucosidase, galactosidase
Les enzymes protolytiques: hydrolysent les liaisons peptidiques
R-CO-NH-R + H2O

RCOOH + NH2-R

5.4- Les lyases (EC-4- avec 7 sous groupes)


catalysent la rupture des liaisons C-C, C-N, C-O, C-S
- dcarboxylase dacide ctonique: le coenzyme est la thiamine
pyrophosphate (TPP)
R-CO-COOH

- dcarboxylase dacides amins:

CH

COOH

R-CHO + CO2

le coenzyme est le phosphate de


pyridoxal

R-CH2-NH2 + CO2

NH2

Cas de la pyruvate dshydrognase: 5 coenzymes


TPP, NAD+, FAD, Coenzyme A et Lipoate

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5.5- Les isomrases (EC-5- avec 6 sous groupes)


catalysent le dplacement de groupes lintrieur dune molcule
sans que la formule brute varie
Epimrases:

provoquent des interconversions doses


galactose

Mutases:

glucose

catalysent le transfert dun radical dune partie dune


molcule une autre
H

CH3

CH2

CH2

COOH

CO

CO

CoA

CoA

Methyl malonyl CoA

COOH

Succinyl CoA

5.6- Les ligases (EC-6- avec 6 sous groupes)


catalysent la condensation de 2 molcules.
A+B

A-B
ATP

AMP + P-O-P

6- PRINCIPAUX COENZYMES
Origine des coenzymes
(ATP, S adnosyl mthionine)

1- mtabolisme
2- Vitamine

(= amine vitale)

Un certain nombre de coenzymes drivent de vitamines, notamment


de vitamines hyrosolubles et en particulier les vitamines du groupe B

- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction


(4 coenzymes)
- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement
(6 coenzymes)

6.1- Coenzymes intervenant dans les ractions doxydorduction

6.1.1-Coenzymes nicotiniques = Nicotinamide adnine dinuclotide


(NAD+) et NADP+
NAD+

Structure

CO- NH2

nuclotide

O
HO

O
H
H

H
H
OH

OH

NH2
N

nuclotide

N
HO

P
O

Nicotinamide
(Vit B3ou Vit PP)

N+

Adnine
N

O
H
H

OH

H
H
OH

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centre actif
CO- NH2
O
HO

N+
O

O
H
H

H
H
OH

OH

O
N

N
HO

P
O

NAD+

NH2

NADP+
O

O
H

OH

HO

OH

Mcanisme ractionnel
AH2 +
Substrat
rduit

NAD+
(ou NADP+)

A + NADH + H+
(ou NADPH)
Substrat
oxyd
H

AH2 +

CO- NH2

+ H+

N+

CO- NH2

NADH + H+
(ou NADPH)

BH2 + NAD+ +
(ou NADP )

Substrat
oxyd

Substrat
rduit

Ce sont des coenzymes de


type Cosubstrats

Spectre dabsorption
Mesure de la densit optique en
fonction de
NAD+
(forme oxyde)

DO

NADH
(forme rduite)

260

350

Longueur donde
(nm)

dosage des enzymes NAD+ ou NADP+


Exemple: LDH

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Spcificit
NAD+

Localisation mitochondriale
Coenzyme doxydation
Localisation cytoplasmique

NADP+

Coenzyme dhydrognation, de biosynthse

[NAD+]

>

[NADP+]

La plupart des enzymes sont spcifiques soit du NAD+ soit du


NADP+ sauf qq exceptions comme la glutamate dshydrognase
Origine
Le NAD+ et le NADP+ sapparentent la vitamine B3 ou PP
(pellagre preventive)
Lavitaminose PP entrane une maladie appele pellagre

6.1.2- Coenzymes flaviniques = Flavine mononuclotides (FMN) et


Flavine adnine dinuclotide (FAD)
Structure
FMN

Flavine mononuclotides:

ribitol
O
(CHOH)3

CH2

CH2

OH

OH
CH3

CH3

NH
O

Noyau isoalloxazine = flavine


= vit B2

Flavine Adnine Dinuclotide: FAD


FMN
(CHOH)3

CH2
CH3

CH3

NH

CH 2

OH

OH

O
O

NH2
N

Ac
adenylique

CH2
O
H

OH

H
OH

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Mcanisme ractionnel

AH2 +

N
H

FAD ou

FADH2 ou

FMN

FMNH2

jaunes

incolores

Les FMN et FAD sont appels ferments jaunes


FMN et FAD sont lis lenzyme: groupements prosthtiques

Exemples de dshydrognases FAD:


NADH Dshydrognase
NAD+

NADH + H+
FAD

FADH2
COOH

COOH

Succinate dshydrognase
CH2

CH

CH2

CH

FADH2

FAD

COOH

COOH

succinate

Fumarate

Origine
Le FAD et le FMN drivent de la flavine ou vitamine B2

6.1.3- Les ferroporphyrines: Coenzymes associs aux cytochromes


grpt prosthtique + Fe

Structure
CH3

CH2-CH 2

CH3

CH3

N Fe N
N

Cyt C

CH2-CH2

CH2
CH2

CH2
COOH

CH2

CH 3

CH2
COOH

Rle
Jouent un rle important dans le transfert dlectrons
Fe2+
Fe3+ + 1erduit
oxyd

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6.1.4- Acide lipoque


Structure
Ce coenzyme a la structure dun AG satur 8 C avec un pont
disulfure entre C6-C8.
7
CH2

COOH

CH2

CH2

CH2

CH2

CH

CH2

Rle:

+ 2H

SH

SH

Transporteur dH2

Lacide lipoque est attach par covalence lApoenzyme par son


carboxyle un reste lysine de lenzyme : groupement prosthtique

6.2- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement

6.2.1- Thiamine pyrophosphate (TPP)


Structure:

drive de la vitamine B1 ou thiamine


H

NH2

centre actif
S

C
N

CH2

N+

CH3

CH2

CH3

Cycle pyrimidique

OH

OH
CH2

OH

Cycle thiazole

Thiamine = vitamine B1
Rle: Transporteur dactaldhyde dans les ractions de
dcarboxylation
COOH
CO2 + CH3

C=O
CH3

C
H

Actaldhyde

Ac. pyruvique
La carence en vitamine B1 entrane une maladie : le Bri-bri

NH2

Structure
O

CH2
H
H
O

O
P
OH

P
O
O

OH

OH

N
N

H
H
OH
OH

N
N

6.2.2- Coenzyme A (CoA) = Coenzyme


dAcylation
Drive dune Vit du groupe B:
ac pantothnique
Rle
Transporteur dactyle et
dacide gras

O
CH2
CH3

OH
C
O
C
NH

CH3

Acide
pantothnique
CoA-SH + CH3COOH

CH2

CH3CO-SCoA
actyle CoA

CH2
C

CoA-SH + R-COOH

RCOO-SCoA

NH

acyl CoA
CH2
CH2

Thiothylamine ou
mercaptoethylamine

SH

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6.2.3- Acide tetrahydrofolique

(FH4)

Structure: drive dune vit: ac folique (vit B9)


OH
N

N 4

Acide folique

5 6
8 7

10

CH

CH2 CH2 COOH

COOH

Glu

Ac. Para amino


benzoque

N. pteridine
H

OH

FH4

CO NH

CH2 NH

NH2

N
H
H
N

N
NH2

CH2

NH

CO NH

CH2 CH2 COOH

CH
COOH

Rle

: transporteur dunits un C (CH3)


CH2
Sur N5
Sur N10
N
CH2
5
entre N5 et N10

10

6.2.4- S adnosyl mthionine (SAM)


COOH

Structure:

NH 2

CH
NH2
CH2

Met

CH2
N
+

CH3

CH3

adnosine

OH

H
OH

Rle: transporteur de radicaux mthyles


Transmthylase
Substrat mthyl

Substrat

(Adrnaline)

(Noradrnaline)
SAM

SAH

6.2.5- Adnosine 5 triphosphate


NH2

Structure:

O
HO

P
OH

O
O

P
OOH

N
O

adnine

OH
H

OH

H
OH

AMP
ADP
ATP
Rle: transfert de groupements
ATP

ADP

+ P

ATP

AMP

+ P-P

ATP

adnosyl

+ P + P-P

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6.2.6- Phosphate de pyridoxal


Structure:

drive de la vit B6

= vit B6
CHO

CH2OH

CH2-NH2

CH2OH

CH2OH

CH2OH

OH

OH

OH

CH3

CH3

CH3

pyridoxine
Rle:

pyridoxal

pyridoxamine

Transport de groupement amin: NH2


Pyridoxal = vit B6

HO

CH2-NH2

CHO

- NH2

CH3

CH3
OH

OH

OH

OH

HO

CH3

CH3

Phosphate de pyridoxamine

Phosphate de pyridoxal

Mcanisme des ractions de


Dcarboxylation et de Transamination
1re tape
-Enzyme

Acide
amin

PLP

Enzyme-PLP

Amino-acid-PLP

Raction de dcarboxylation

CO2
Quininod intermdiaire

Amino-acid-PLP
PLP

Amine

H2

H2 O

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Raction de transamination
Raction globale

Transaminase
PLP
Acide amin

ctoglutarate

Acide
ctonique

Glutamate

Transamination: tape 1
Iminoacide

Fonction
amine

Acide
ctonique
Pyridoxamine P
(PMP)

Transamination: tape 2

(PMP)

ctoglutarate

Enzyme-PLP

Glutamate

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6.2.7-Raction de carboxylation: Carboxylases Biotine

Centre actif

Biotine

Exemple: ActylCoA Carboxylase


HCO3ATP

CH3-CO
SCoA

Pi
ADP

HOOC-CH2-CO
SCoA

Biotine

Chapitre 2:

La cintique enzymatique

Objectifs:
Reconnatre la cintique dune enzyme
Reconnatre les facteurs qui influencent la cintique dune enzyme
Dfinir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM)
Reprsenter graphiquement la cintique dune enzyme en fonction
des diffrentes variables

1- LORDRE DUNE REACTION


S

A- raction dordre 0
[S]

V
V=

-d[S]

=k

dt

[S]

B- raction dordre 1
[S]

V=

-d[S]
dt

= k[S]

[S]

17

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Calcul de la vitesse dune raction


K1

V = V de disparition de S (dapparition de P):

K1
K2

V =

d [ S ] d[ P]
= K1 [ S ]
=
dt
dt

V de lalle = V de disparition de S (apparition de P):V =

d [ S ] d[P] = K [ S ]
=
1
dt
dt

d[P ] d [ S ]
= K 2 [P ]
V de retour = V dapparition de S (disparition de P): V =
=
dt
dt

quilibre

Keq =

K1[S] = K2[P]

K1 [ P ]
=
K 2 [S ]

K1
A+B

K2

V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B]


V de retour= V dapparition de A et B (disparition de P): V = K2[P]
quilibre K1[A][B] = K2[P]

Keq=

K1
[P ]
=
K 2 [ A ][B]

K1
A +B

C+ D

K2

V de lalle= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B]


V de retour= V dapparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D]
K1[A][B] = K2[C][D]

Keq=

K1 [C][D]
=
K 2 [ A ][B ]

2- CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES


Ce qui est fondamental dans les ractions enzymatiques, cest la
combinaison E-S.
Aprs formation du complexe, le substrat est transform en produit et
lenzyme retrouve sa structure initiale.

S +E

K1
K2

ES

K3
K4

P +E

La V de la raction enzymatique est influence par:


[S], [E], temprature, pH, effecteurs.

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2.1- V de la raction en fonction de [S]


Ltude de la cintique enzymatique a t ralise essentiellement par
Michaelis et Menten en 1913.

2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten


[E] fixe et faible
V

V=Vmax [E] =[ES]


Saturation de lenzyme
Ordre 0

Vmax

Courbe de Michaelis-Menten

Ordre 1
S

S
S

S S S
S

[S]

S
S

Interprtation de la courbe de MM

- Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la raction est


proportionnelle la concentration du substrat (raction dordre 1)

- Lorsque la conc de S augmente, la vitesse ne saccrot plus dans les


mmes proportions (raction dordre mixte)

- Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indpendante de


cette concentration (raction dordre 0): lenzyme est sature par son
substrat. Ce phnomne est particulier la cintique enzymatique.

1.1.2- Dtermination de lquation de Michaelis-Menten


K1

S+ E

K2

S +E
ES

K3

K1
K2

ES

K3
K4

P +E

ES (rapide)

V= f([S]) ?

Conditions initiales
[E] = concentration totale de lenzyme
[ES] = concentration du complexe Enz-Sub
[E]L = concentration de lenzyme libre

P + E (lente)

[E] = [E]L+ [ES]

[E]L= [E] - [ES]

V= K3[ES]
Vitesse de formation de [ES] =
Vitesse de disparition de [ES] =

d[ES]
= K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S]
dt
- d[ES]
= K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3)
dt

Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES]


K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)

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K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)


([E]-[ES])[S]
[ES]

(K2+K3)
= KM
K1

[E][S] - [ES][S] = [ES] KM

[E] [S]
[ES] =

[ES](KM+[S]) = [E][S]
Or, V = K3[ES]

KM+[S]
[E] [S]

= K3

V=Vmax

[E]=[ES]

KM+[S]

Vmax = K3 [E]

V=

Vmax [S]
KM+[S]

V=

Equation de M-M

Vmax [S]
KM+[S]

Cas particulier
Si V=

Vmax
2
Vmax = Vmax [S]
2
KM+[S]

2[S] = KM +[S]

KM = [S]

Vmax

Vmax
2

KM

[S]

1.1.3- Signification de Vmax et de KM


Vmax est atteinte lorsque toute lenzyme est sature par le substrat
KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la raction est Vmax/2
KM est une grandeur exprimentale qui peut varier avec la structure du
S, le pH, la temprature. Chaque enzyme a un KM caractristique pour un S
KM indique laffinit de lenzyme pour le S

KM

affinit

20

17/09/2014

1.1.4- Reprsentation de Linweaver et Burk


KM +[S]

KM

[S]

1 =
=
+
V
Vmax [S]
Vmax [S]
Vmax [S]

V=

Vmax [S]
KM+[S]

1
KM
1 + 1
=
V
Vmax [S] Vmax
Y =
a
x + b

1
V

KM/Vmax

1/Vmax
1
[S]

-1/KM

Cette reprsentation offre lavantage de permettre la dtermination plus


prcise de KM et Vmax. De plus, tant une droite, elle ncessite moins de
points exprimentaux.

1.2- Influence de la concentration en enzyme

V
V

E3
E2
E1

[S]

[E]

La vitesse dune raction est


proportionnelle la quantit
denzyme

1.3- Influence de la temprature

to optimale
Mouvement
des molcules

Dnaturation
de la protine

temprature
20

30

40

50

60

21

17/09/2014

1.4- Influence du pH

cholinestrase

pepsine

La plupart des
enzymes

Le pH agit:

10

12

pH

Conformation de la protine
Association E-S
Action catalytique de lenzyme

1.5- Effet des effecteurs


Rle des effecteurs:
Physiologique: Rgulation du mtabolisme cellulaire
Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode daction des
enzymes
comptitive
rversibles
inhibiteurs

irrversibles

non comptitive
incomptitive

activateurs
effecteurs allostriques

1.5.1- Inhibiteurs
1.5.1.1- Inhibition rversible
1.5.1.1.1- Inhibition comptitive
Exerce par un compos dont la structure ressemble celle du S
E + S
E + I
KI =

K1
K2

ES

E + P

EI (Inactif)

[E] [I]
[EI]

[EI] =

[E] [I]
KI

[E] = [E]L + [ES] + [EI]


Vmax [S]
V =
KM(1+[I]/KI) + [S]

KM= KM(1+[I]/KI)

KM

22

17/09/2014

Vmax [S]
V =
KM(1+[I]/KI) + [S]

[I]
KM
1 + 1
(1+
)
[S]
Vmax
KI
Vmax

V
1/ V

Sans I
[I]

Vmax

[I]

Vmax/2
1/Vmax

-1/KM -1/KM -1/KM

[S]

KM KM KM

KM

1/[S]

affinit

Quand [S] augmente , leffet de linhibiteur disparat:


Linhibition comptitive est leve par un excs de substrat
Vmax nest pas modifie

Exemples:
La succinate dshydrognase
COOH

COOH

Succinate dshydrognase
CH2

CH

CH2

CH

FADH2

FAD

COOH

COOH

succinate

Fumarate
COOH

COOH

CH2

Inhibiteurs comptitifs de la
succinate dshydrognase

CH2

CO
COOH

COOH

malonate

oxaloactate

Inhibition par le produit de la raction


Glucose 6 phosphatase
Glucose 6P

+ H2O

glucose + H3PO4

Les amines quaternaires


sont des inhibiteurs comptitifs de la cholinestrase

CH3
CH3

N+

CH2

CH2

CO

CH3

actylcholinestrase
Choline + ac. actique

CH3

actylcholine
R1
R2

N+

R4

Amines quaternaires

R3

23

17/09/2014

Antimtaboliques
En sintroduisant dans lorganisme, ils donnent naissance des
composs anormaux et ralentissent certains mtabolismes.
fluorouracile
2-amino adnine

Action anti-cancreuse

La sulfamide

NH2

NH2

bactrie
N-ptridine +Ac. para
amino-benzoque + Glu

E
COOH

Ac. para aminobenzoque

Ac. folique

SO2-NH2

sulfamide
Action antibactrienne

X des bactries

1.5.1.1.2- Inhibition non comptitive


E + S
E + I
ES + I

ES
EI
ESI

+ P

inactifs

i
Cu2+, Ag2+

[E]= [E]L+ [ES] + [EI] + [ESI]


Vmax
V=

V
Vmax
Vmax a
Vmax b

Vmax
[S]
1+ [I]/KI

KM + [S]

KM
Vmax

(1+[I]/KI)

1
1
+
(1+[I]/KI)
[S]
Vmax

1/V

[i]

sans i

1/Vmax
1/Vmax
1/Vmax

[S]

1/[S]
-1/KM

Ce type dinhibition nest pas lev par un excs de substrat


KM est inchang, laffinit de E pour S nest pas affecte
Vmax est diminue par linhibiteur
Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des ractifs
capables de se combiner rversiblement avec les groupement SH des
radicaux Cys indispensables lactivit enzymatique comme les mtaux
lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+..)
Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+,
cet ion peut tre chlat par EDTA (thylne diamine ttra actique).

24

17/09/2014

1.5.1.1.3- Inhibition incomptitive

l'inhibiteur ne se lie que sur ES


S

ES
+
I

E + S

+P

Vmax
[S]
1+[I]/KI
V=
KM
+ [S]
1+[I]/KI

ESI
[E]= [E]L+ [ES] + [ESI]

1
1
1 = KM
(1+[I]/KI)
+
V
Vmax [S] Vmax

Vmax

sans I

Vmax

1/V

1/V max
1/Vmax

[S]

1/[S]

-1/KM -1/KM

Cet inhibiteur dplace leq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloque
sous forme ESI, donc Vmax est diminue

Tableau rcapitulatif des inhibitions rversibles

KM

Vmax

Pente

Comptitive
Non comptitive
Incomptitive

1.5.1.2- Inhibition irrversible:

inactivation totale de lenzyme

1er exemple:
E-S-CH2-CONH2 + HI

E-SH + ICH2CONH2
E Cys liodoactamide

Complexe inactif

raction irrversible
2me

exemple: Diisopropyl fluorophosphate (DFP) : arme biologique


E - CH2
F
CH3

E-CH2OH +
E Ser

CH
CH3

DFP

CH

CH3

CH3

CH3

CH3

O
CH

CH

CH3

+ HF

CH3
O

raction irrversible
Complexe inactif

Ex. enzyme srine: actylcholinestrase


3me exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire
Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes
respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition

25

17/09/2014

1.5.2- Activateurs
1.5.2.1- Activation par protection de lenzyme
Des composs qui protgent les enzymes contre les oxydations
dans les enzymes Cys se comportent comme des activateurs
E-SH + SH-G
E Cys

E-S ------ SG + H2

Glutathion

1.5.2.2- Activation par les ions


Concerne les enzymes qui ncessitent des ions pour leur activit
Mg2+ est un activateur des kinases

Exemple:

1.5.2.3- Activation par action sur les subunits enzymatiques


Protine kinase
protine +

Protine-P +

ATP

ADP

Les protines kinases sont actives par lAMPc

Site actif Site de fixation de lactivateur

E inactive

AMPc

AMPc

Subunit
catalytique active

3- ENZYMES ET EFFECTEURS ALLOSTERIQUES


3.1- Cintique des E allostriques

3.1.1- V en fonction de [S]


Interprtation de la courbe des E allostriques
V

E michaelienne

- Les petites quantits de substrat


sont transformes lentement
- La vitesse augmente partir dun seuil

E allostrique
- Effet coopratif

[S]
Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostriques
nexercent leur action qu des concentrations en substrat leves

26

17/09/2014

ont une structure quaternaire, formes dun nombre pair de sous units.

S
i

1er

La fixation de S au
site entrane un changement
A
de conformation des autres sites, ce qui modifie
laffinit pour le S. On dit quil y a un effet coopratif.

En plus du site actif o se fixe le substrat, lenzyme possde un ou


plusieurs sites allostriques o peuvent se fixer des effecteurs
allostriques (activateurs ou inhibiteurs).
Ces effecteurs nont aucune analogie structurale avec le substrat.

2.2- Action des effecteurs allostriques


Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en
modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change
laffinit pour le substrat
Activateurs allostriques
Augmentent laffinit de lenzyme pour le substrat, lui permettant
dagir de faible concentration en substrat
inhibiteurs allostriques

Activateur

Comme les inhibiteurs non comptitifs


diminuent laffinit de lenzyme pour le
substrat
Inhibiteur

Vmax
2

KM(a)KM KM(I)

2.3- Model des E allostriques


S
S

[S]

Model de Monod Wyman et


Changeux (MWC)
1- possdent 2 sites: site actif et
des sites rgulateurs (activateur
et inhibiteur)

i
A

2- formes de plusieurs sous


units identiques (= protomres)
3- existent sous 2 tats en
quilibre: tat catalytique R et
tat inhib T

A ou S

i
Relch
Tendu
(actif)
(inactif)
transition allostrique

Allostrie
Autre forme

4- effet coopratif: du la prsence de plusieurs sous units (protomres)


la fixation dune molcule de S sur un protomre
dplace lquilibre vers la forme active

27

17/09/2014

2.4- Importance des enzymes allostriques


Ont un rle de rgulation trs important dans la cellule:
Permettent ladaptation du mtabolisme au besoin de la cellule
En gnral lenzyme allostrique catalyse la 1re raction, limitante
dune voie mtabolique
Son activit peut tre contrle par des activateurs ou inhibiteurs
appartenant cette voie mtabolique

E1

E2

E3

X
X= inhibiteur
allostrique

E allostrique
Inhibition feed back
ou retroinhibition

Les effecteurs allostriques ont une action spcifique sur les


enzymes allostrique, en se fixant sur leur sites allostriques

MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE


1- Chymotrypsine:
hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe
R-CO-NH-R + H2O

RCOOH

+ NH2-R

Le site actif :
His 57,

Asp 102

et Ser 195

1re tape: acylation


peptide
H

O
C

R'

R'

O(His 57)

CH2

O
N

(Asp102)
(His 57)

(Ser 195)

Enzyme

O- H

(Asp102)

CH2
(Ser 195)

Enzyme

acylchymotrypsine

28

17/09/2014

2me tape: dsacylation

O
C

H
N

H
O-

(Asp102)

CH2

(His 57)

(Asp102)

OH

O
-

CH2

(His 57)

(Ser 195)

(Ser 195)

Enzyme

Enzyme

acylchymotrypsine

2- Actylcholinestrase
enzyme

Site anionique His

NH Site estrasique

CH2

CH3

actylcholine

N+

CH3

CH2

CH2

OH CH2

CH3

Ser

CH3

un dplacement dlectron va
fragiliser la liaison ester et
provoquer sa rupture

HO

Tyr

H2O

CH3
CH3

N+

CH2

CH2

OH

CH3

HO

C
CH3

Ac. actique

choline

3- Transaminases
Permettent le transfert rversible du groupement
amine dun AA un acide ctonique.

Le coenzyme des transaminases est le phosphate de


pyridoxal
O H

C H

C HO
C H
O
P

29

17/09/2014

Site actif dune transaminase


OH CH3

OH CH3

HOOC

HOOC
N

CH NH2C HO
R

CH

H2O

CH2
O
P

CH2
O
P

Base de schiff
COOH

OH CH3

+ H2O

HOOC
C

C
O

OH CH3

NH2

CH2
O
P

CH2
O
P

Ac. ctonique

Phosphate de pyridoxamine

DOSAGE DES ENZYMES


La quantit denzyme peut tre mesure par son activit enzymatique
E
A + B
C
Pour dterminer lactivit enzymatique, il faut connatre:
1- la stchiomtrie de la raction
2- les besoins de lenzyme en cofacteurs
3- KM
4- le pH optimum de lenzyme
5- la gamme de temprature olenzyme est stable
6- une mthode analytique permettant la dtermination de la
concentration du substrat qui disparat ou du produit obtenu
1- Unit de lactivit enzymatique
Unit internationale (UI) = la quantit denzyme qui produit la transformation
dune micromole ( mole) de S par min 25oC
Le katal (kat) = la quantit denzyme transformant une mole de substrat
par sec
Activit spcifique = le nombre dUI par mg de la protine enzymatique

DO = [C] l

NAD+
(forme oxyde)

DO

NADH
(forme rduite)

260

AH2

+ NAD+

350

Longueur donde
(nm)

A + NADH + H+

30

17/09/2014

2- Intrt de dosage des enzymes


Le fonctionnement normal de lorganisme est le rsultat de laction
harmonieuse de tous les systmes enzymatiques
Dosage des enzymes dans les liquides biologiques et les tissus
rvle des variations pathologiques:
Phosphatase acide dans le srum
Transaminases dans le srum

Cancer de la prostate
Cytolyse hpatique (hpatite)

La prsence de certaines enzymes dans le srum est le signe dune


ncrose tissulaire
Mais dans certains cas la mme activit enzymatique peut tre due
des enzymes diffrentes selon leur origine tissulaire.
Cest le cas des isoenzymes
Llectrophorse des isoenzymes permet de localiser lorigine de la
ncrose

3- Les isoenzymes
Ce sont des enzymes qui ont la mme proprit catalytique mais qui
diffrent par leur proprits physicochimique. Les isoenzymes peuvent
diffrer dun tissu un autre.
LDH
Ac. pyruvique
Ex.: Lactate dshydrognase (LDH): Ac. lactique
LDH: 4 sous units de 2 types, H et M
Sparation par lectrophorse des 5 isoenzymes de la LDH

+
1
dpts Cur

Forme H (Cur)

5
Muscle
et foie

Forme M (muscle et foie)

4- Les enzymopathies hrditaires:


Il sagit des dficits enzymatiques hrditaires
Dans certains cas le diagnostic peut se faire par ltude de
lactivit enzymatique sur leucocytes (qui est diminue)
Cest le cas des maladies de surcharge lysosomale
Pour dautres maladies on mesure le substrat qui est
accumul
Exs:

maladie

Albinisme:

Enzyme altre
Tyrosine hydroxylase

phnylctonurie: Phnylalanine hydroxylase


homocystinurie: Cystathionine synthtase

31