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Manual de Prcticas para el Curso de

Toxicologa I

Rosa Mara Garca Nieto


UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Sergio Arias Negrete


UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Gustavo Cruz Jimnez


UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Manual de Prcticas para el Curso de


Toxicologa I

Nombre del Alumno:______________________________________


Equipo de Trabajo:_______________________________________
2

INDICE
Presentacin .

Prctica 1. Manejo de la esterilidad

Prctica 2. Efecto de antibiticos en Escherichia coli................

12

Prctica 3. Niveles de Flor en orina .

17

Prctica 4.Toxicidad de metales pesados en plantas. Efecto de cromo


(III) y (VI) ..
Prctica 5. Ensayo de microncleos...

23
34

Prctica 6. Prueba de movilidad (evasin) de lombrices.

39

Bibliografa..

44

PRESENTACIN
En el ltimo siglo ha habido un gran incremento en el uso de compuestos qumicos
sintticos, empleados para diferentes propsitos, como medicamentos (drogas),
conservadores de alimentos, pesticidas, qumicos de uso agrcola o casero,
agentes para limpieza y compuestos utilizados en guerras.
Solamente una parte de esos compuestos han sido suficientemente examinados
para valorar adecuadamente su impacto potencial en la salud humana. Adems
estos estudios son limitados. Por ejemplo, con frecuencia slo se evala una ruta
de aplicacin y podra ser que sta no sea la principal en la que el ser humano
pudiera estar expuesto, lo cual podra ser un factor que influenciara la toxicidad.
Adems muchas de las pruebas de toxicidad se realizan en sistemas modelo
(animales, plantas, microorganismos, etc.) y se ha visto que no es posible
extrapolar los resultados de los animales al hombre en forma concluyente. Todo
esto conduce a problemas para plantear procesos regulatorios y legislativos con
informacin experimental limitada y por otro lado el conflicto de intereses de las
industrias, grupos de consumidores y activistas ambientales. El pblico en general
no est dispuesto a perder las ventajas obtenidas con la industria qumica, pero
cada vez demanda ms ser protegidos de cualquier efecto adverso que surja por
su uso.
La toxicologa es la ciencia que estudia los txicos y las intoxicaciones. Lo cual
comprende el estudio del agente txico, su origen y propiedades, sus mecanismos
de accin, las consecuencias de sus efectos lesivos, los mtodos analticos,
cualitativos y cuantitativos para su determinacin, los modos de evitar la
contaminacin ambiental y de los lugares de trabajo, las medidas profilcticas de
la intoxicacin y el tratamiento general. Vista de este modo constituye una vasta
ciencia que aunque sigue siendo el hombre su principal objetivo, trasciende al
medio ambiente, la industria, los alimentos, los animales etc.
Es fundamental para el progreso de la toxicologa el poder realizar la
determinacin de los posibles riesgos que pudieran surgir de la exposicin a una
substancia. La evaluacin de la toxicidad busca determinar qu tan venenoso
podra ser una substancia. La evaluacin de riesgo, involucra la evaluacin
cuantitativa del efecto deletereo que podra ocurrir bajo condiciones particulares
de exposicin. El riesgo viene de la unin entre toxicidad y exposicin en un
sentido matemtico.
En este manual se plantean algunas pruebas en modelos biolgicos para la
evaluacin de la toxicidad de algunos compuestos. No son las nicas que se
pueden realizar, sin embargo se trata de introducir este tipo de pruebas como
ejemplo para el curso de Toxicologa de la carrera de Qumico Farmacutico
Bilogo.

EJERCICIO 1
REFLEXIN DE LA PELCULA ERIN BROCKVICH
Fecha de entrega: A ms tardar el jueves 21 de agosto a la hora de laboratorio.
Instrucciones: Una vez que hayas visto la pelcula redacta una reflexin que
incluya cada uno de los siguientes puntos. No incluyas la pregunta dentro del texto
y busca que la redaccin tenga coherencia e ilacin entre cada uno de los temas.
1. Cules son los eventos que desatan la trama de la pelcula?
2. Qu hace Erin Brockovich?
3. Cmo se involucra en el bufete?
4. Cmo es que se involucra en el caso de PG & E?
5. Cul es el txico por el cual se presenta el problema?
6. Qu enfermedades recurrentes encuentra en los habitantes de la zona y
qu le menciona el investigador de los efectos del txico en los humanos?
hay relacin?
7. Cul es el nivel que mencionan como nivel mximo del txico y cul haba
en el agua de acuerdo a los reportes?
8. Qu dilemas ticos se observan en la trama?
9. Qu sucede al final de la pelcula y era la nica opcin?
10. Qu relacin encuentras entre la pelcula y los temas que se ven en
clase?
11. De acuerdo a esta pelcula, cules pasos se deben hacer para identificar
el problema?
12. Si estuvieras en el lugar de Erin Brockovich, qu haras?
Letra Arial 12, mrgenes de 3cm, interlineado sencillo, MXIMO una pgina.
El trabajo deber incluir al inicio el nombre completo del alumno iniciando por los
apellidos, grupo y la fecha.

PRCTICA 1
MANEJO DE LA ESTERILIDAD
Objetivo
Que el alumno reconozca la importancia del manejo adecuado de la esterilidad y
verifique el manejo personal de ella realizando la manipulacin de medios, pipetas
y tubos estriles.
Introduccin
El control absoluto de bacterias por esterilizacin y su control por confinamiento y
desinfeccin son aspectos muy importantes del trabajo de laboratorio. El propsito
de los procedimientos de seguridad en el laboratorio es doble, por un lado es
proteger el experimento que se est realizando y por otro proteger al
experimentador.
Si se generalizara, se podra pensar que las bacterias que normalmente son
manejadas son residentes naturales en el ambiente y por lo tanto inocuas para el
hombre. Sin embargo hay un amplio espectro de grados de virulencia en relacin
a la susceptibilidad del humano. Por este motivo, la indicacin es precaucin hay
que manejar todas las bacterias como potencialmente dainas para la salud
humana.
Aunque las definiciones de esterilizacin, desinfeccin y antisepsis son aceptadas
en forma general, es muy comn que estos trminos se confundan. La distincin
exacta entre estos trminos y el conocimiento bsico de cmo realizarlos y
vigilarlos son importantes para su aplicacin efectiva.
La esterilizacin es definida como el uso de un procedimiento fsico o qumico para
destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas
bacterianas altamente resistentes, los cuales pueden estar en objetos inanimados.
Generalmente en el laboratorio microbiolgico, el vapor es usado para la
esterilizacin de medios de cultivo, equipo y material de vidrio, el calor seco es
usado para material de vidrio y equipo metlico, el gas es usado para
instrumentos, la filtracin para soluciones y la radiacin es usada con propsitos
limitados.
La desinfeccin es un proceso menos letal que la esterilizacin. Elimina
virtualmente todos los microorganismos patgenos reconocidos pero no
necesariamente todas las formas microbianas (p. ej. Endosporas bacterianas) en
objetos inanimados. Como puede verse en esta definicin, la desinfeccin no
asegura la muerte de todas las formas microbianas, y por lo tanto el proceso de
desinfeccin pierde el margen de seguridad que se obtiene mediante la
esterilizacin, por lo que es un proceso que disminuye el nivel de contaminacin
microbiana.
6

Descontaminacin es un trmino usado para describir un proceso o tratamiento


que proporciona un utensilio mdico, instrumento o superficie seguros para su
manejo. En el caso de instrumentos o utensilios mdicos el uso de tratamientos o
proceso de desinfeccin no necesariamente asegura que el objeto sea seguro
para reuso en pacientes. Un proceso de descontaminacin puede ir desde un
proceso de esterilizacin o desinfeccin hasta una limpieza simple con agua y
jabn.
Un antisptico es definido como un germicida que es usado en la piel o tejido vivo
con el propsito de inhibir o destruir microorganismos. Si embargo, la distincin
entre un antisptico y un desinfectante frecuentemente no se hace. Un
desinfectante es un germicida que es usado nicamente para destruir
microorganismos en objetos inanimados tales como utensilios mdicos o
superficies, mientras que un antisptico germicida es usado en tejidos vivos.
Aunque algunos germicidas contienen qumicos activos que son usados para
ambos propsitos (por ejemplo: Iodforos o alcoholes), el ser til para un propsito
no asegura utilidad para el otro. La clasificacin de los germicidas qumicos en
sus respectivas concentraciones de acuerdo al nivel de potencia microbicida es
importante pero arbitraria. Se han propuesto tres niveles de actividad, alta,
intermedia y baja, basndose en que los microorganismos pueden generalmente
ser categorizados en varios grupos generales de acuerdo a sus niveles de
resistencia inatos al espectro de agentes germicidas qumicos o fsicos. Estos
grupos son mostrados en orden descendente de resistencia en el siguiente
esquema:
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. Bovis
VIRUS PEQUEOS
Poliovirus
Coxsackievirus
Rinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.
Cryptococcus sp.
Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
VIRUS TAMAO MEDIO
Virus del herpes simple
Citomegalovirus
Virus Sincitial respiratorio
Virus de la hepatitis B
Virus de la Inmunodeficiencia humana (HIV)

Orden descendente de resistencia a germicidas qumicos

Las relaciones de estos niveles generales de resistencia microbiana a los niveles


de actividad germicida se muestran en la siguiente tabla:
Niveles de la accin desinfectante de acuerdo al tipo de microorganismo.
Efecto
Nivel
desinfectante
Alto
Intermedio
Bajo

Esporas
+
-

Bacterias
Bacilo
tuberculoso
+
+
-

Clulas
vegetativas
+
+
+

mortal
hongos

Virus
pequeos

+
+
+

medianos

+
+
+

+
+
+

En la siguiente tabla se muestran los mtodos de esterilizacin y desinfeccin ms


comunes:
Mtodos de esterilizacin o desinfeccin: niveles de actividad de germicidas lquidos selectos. a
Mtodo
Esterilizacin
Calor
Calor hmedo (vapor a presin)
Calor seco
Lquidos
Glutaraldehdo
Perxido de hidrgeno
Formaldehdo
Dixido de cloro
cido peractico
Desinfeccin
Calor
Calor hmedo (incluye
pasterizacin con agua caliente)
Lquidosg
Glutaraldehdo
Perxido de hidrgeno
Formaldehdo
Dixido de cloro
cido peractico
Compuestos cloradosh
Aloholes (etlico, isoproplico)i
Compuestos fenlicos
Compuestos iodforosj
Compuestos cuaternarios de
amonio
Antisepsisk
Alcoholes (etlico, isoproplico)
Iodforos

Concentracin o nivelb

Actividad desinfectante

121 C o 132 C por varios intervalos de


tiempo (15 min)
171 C por 1 h; 160 C por 2 h; 121 C por
16 h.
Variablec
6% 30%
6% 8%d
Variablee
Variablef
75 C 100 C

(alta)

Variable
3% 6%
1% 8%
Variable
Variable
500 5 000 mg de cloro libre o
disponible/litro
70%
0,5% 3%
30-50 mg de yodo/litro; 1%-2% de yodo
disponible
0,1% - 0,2%

Alta a intermedia
Alta a intermedia
Alta a baja
Alta
Alta
Intermedia
Intermedia
Intermedio a baja
Intermedia a baja
Baja

70%
1 mg -2 mg de yodo libre/litro; 1%-2% de
yodo disponible
Clorhexidina
0,75% -4,0%
Hexaclorofeno
1% -3%
Paraclorometaxilenol
0,5%-4,0%
a
Esta lista de germicidas qumicos, se centra en formulaciones genricas.
b
Para esterilizacin o desinfeccin se refiere a las instrucciones del fabricante para los tiempos de exposicin y condiciones
tambin como recomendaciones para enjuague y manejo subsecuente de utensilios procesados.
c
Hay varias preparaciones de glutaraldehdo en el mercado, pueden ir desde las que se pueden utilizar directamente, u
otras que debern diluirse antes de usarse.
d
Debido a la controversia sobre el papel del formaldehdo como un carcingeno ocupacional potencial, su uso est limitado
a ciertas situaciones especficas bajo condiciones controladas.

El dixido de cloro se dice que es el qumico activo resultante al mezclar agua, clorito de sodio y cido lctico en diversas
proporciones, dependiendo de su uso como esterilizante o desinfectante. De forma similar al caso de los compuestos
clorados, el espectro de accin germicida es amplio, pero los efectos oxidantes en metales o superficies plsticas pueden
limitar su uso.
f
En aos recientes, se han registrado varios productos conteniendo bajas concentraciones (<0,1%) de cido peractico
(peroxiactico) combinado con bajas concentraciones (<0,1%) de perxido de hidrgeno para uso como esterilizantes o
desinfectantes. Esta combinacin de dos poderosos qumicos oxidantes a bajas concentraciones hace posible tener una
actividad germicida de amplio espectro mientras que se minimizan los efectos negativos tales como la corrosin que se
presenta a concentraciones altas del cido peractico.
g
Debido a que existen muchas formulaciones registradas como desinfectantes hospitalarios que actan sobre diferentes
tipos de bacterias, y que cada uno de ellos est compuesto de varios ingredientes activos, es difcil definir una clasificacin
genrica. Debido a esto hay que poner mucha atencin a la informacin de los productos comerciales, as como a la
literatura respecto al espectro de actividad, patrones de uso, instrucciones de uso, precauciones, etc.
h
Estos desinfectantes pueden estar disponibles en forma lquida o slida (por ejemplo: Hipoclorito de sodio o de calcio). El
blanqueador casero comn, es una excelente y barata fuente de hipoclorito de sodio. Concentraciones de entre 500 y 1
000 mg de cloro por litro son apropiadas para la gran mayora de usos que requieren un nivel intermedio de actividad
germicida. Concentraciones ms altas son extremadamente corrosivas, adems de irritantes, y slo debern usarse en
material orgnico que es difcil de limpiar (por ejemplo: Superficies porosas) o con contenidos inusualmente altos de
microorganismos (por ejemplo: Salpicaduras de material cultivado en el laboratorio).
i
La efectividad de los alcoholes como germicidas de nivel intermedio es limitada, puesto que se evaporan rpidamente,
dando como resultado tiempo de contacto muy cortos y tambin poca capacidad para penetrar residuos de material
orgnico. Hay rpida actividad tuberculocida, bactericida y fungicida pero vara en el espectro de la actividad virucida. Los
utensilios para ser desinfectados con alcoholes debern ser cuidadosamente limpiados previamente y entonces debern ser
sumergidos por un tiempo apropiado (por ejemplo: 10 min).
j
Slo debern ser usados iodforos comerciales como desinfectantes de superficies duras, y siguiendo las instrucciones
del fabricante para garantizar la efectividad y estabilidad del producto. Estos antispticos no son convenientes para la
desinfeccin de instrumentos mdicos o utensilios o para la desinfeccin de superficies en el ambiente.
k
Esta no es una lista de formulaciones completa, aunque incluye los germicidas que son ms comnmente usados en
como antispticos en hospitales.

Los factores que influencian la muerte microbiana que deben ser considerados en
la seleccin del proceso de esterilizacin incluyen los siguientes:
1. El diseo y/o composicin qumica del objeto.
2. El estado biolgico y fsico del microorganismo antes de la esterilizacin.
3. La resistencia inherente del microorganismo al proceso de esterilizacin y la
proporcin resultante de los microorganismos muertos.
4. La poblacin inicial de microorganismos asociada con el objeto que va a ser
esterilizado.
5. La intensidad del agente esterilizador.
6. La duracin de la exposicin al ambiente esterilizador.
En la siguiente tabla se muestran los mtodos convencionales de esterilizacin y
los utensilios esterilizados por cada uno.
Proceso
Calor hmedo

Calor seco

Objeto
Soluciones parenterales
Instrumentos
Equipo para procesos aspticos
Medios de cultivo
Tapones de hule
Material de vidrio
Aceites
Instrumentos
Agujas
Petrolato
Polvos
Equipo para procesos aspticos

xido de etileno

Radiacin ionizante

Filtracin

Equipo para anestesia


Catteres
Equipo para diagnstico
Utensilios prostticos implantables
Equipo de laboratorio
Equipo para terapia respiratoria
Equipo quirrgico
Suministros quirrgicos
Instrumentos telescpicos
Tubos plsticos
Materiales de empaque
Polvos
Vendajes
Tubos para coleccin de sangre
Lancetas
Cepillos y brochas
Ungentos para quemaduras
Parches para quemaduras
Tubos de centrfuga
Unidades de dilisis
Suturas quirrgicas
Aserrn para animales de laboratorio
Batas de laboratorio
Gases
Lquidos
Ungentos y aceites de baja viscosidad

Desarrollo
Material y substancias utilizadas
Tubos de 13 mm x 100 mm con tapa de rosca,
Pipetas Automticas y puntas,
Propipeta,
Papel,
Papel aluminio,
Mechero,
Gradilla,
Algodn,
Tijeras,
Botellas con tapa de rosca,
Caldo nutritivo.
Procedimiento
Prepare el caldo nutritivo y esterilice en botellas de 250 ml o 500 ml con
tapa de rosca.
Esterilice 30 tubos de 13 mm X 100 mm con tapa de rosca dejando flojas
las tapas para realizar el proceso adecuadamente. Al final del proceso
cierre las tapas.
Esterilice cajas con puntas para las pipetas automticas.
10

Realice la esterilizacin en autoclave a 120 C por 15 minutos.


En esterilidad (en campana de flujo laminar o sobre la mesa con mecheros)
Coloque 5ml de caldo nutritivo a cada uno de los tubos estriles.
Incube a 37 C los tubos y el frasco con el caldo nutritivo restante durante
24 horas.
Observe si hay crecimiento.
Observaciones

Resultados

Conclusiones

11

PRCTICA 2
EFECTO DE ANTIBITICOS EN Escherichia coli
Objetivo
Construir una curva dosis-respuesta de un antibitico en un cultivo de Escherichia
coli.
Introduccin
Las enfermedades infecciosas han causado la muerte de millones de series
humanos a lo largo de la historia de la humanidad. Con el descubrimiento de los
antibiticos, esta realidad comenz a ser modificada y en los aos ochenta del
siglo XX, poda hablarse de una victoria prcticamente total frente a las
infecciones por microorganismos. Sin embargo, este aparente triunfo fue destruido
por la propagacin de una nueva enfermedad: el sndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA).
En la actualidad, las enfermedades infecciosas muestran una tendencia
emergente, por lo que el conocimiento de los antibiticos, a quienes se prefiere
denominar en la actualidad como drogas antibacterianas, resulta de suma
importancia para los interesados en los temas de salud.
El origen de la palabra antibitico es griego: anti significa contra, y bios,
vida. Los antibacterianos son sustancias naturales, semisintticas o sintticas,
que a concentraciones bajas, inhiben el crecimiento o provocan la muerte de las
bacterias. Popularmente se les conoce a todos como antibiticos, aunque en
realidad, estos son nicamente las sustancias producidas de forma natural por
algunos microorganismos.
La accin del agente antibacteriano es lograda mediante los siguientes
mecanismos de accin:
inhibicin de la sntesis de la pared celular
inhibicin de la sntesis de protenas
inhibicin del metabolismo bacteriano
inhibicin de la actividad o sntesis del cido nucleico
alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular
Con cualquiera de estas acciones o con una combinacin de ellas, el germen
es incapaz de sobrevivir.
Un germen puede desarrollar resistencia ante un antibitico. Esto quiere
decir que ser incapaz de daar a dicho germen. La resistencia puede
desarrollarse por mutacin de los genes residentes o por adquisicin de nuevos
genes. La resistencia de los grmenes a los antibiticos es en la actualidad uno de
los grandes desafos para las autoridades de salud.
12

Al escoger un antibitico que se ha de utilizar en un rgimen teraputico


determinado, han de tenerse en cuenta la edad del enfermo, el cuadro clnico que
presenta, el sitio de la infeccin, su estado inmunitario, otros factores y la
prevalencia de resistencia local.
Escherichia coli
E. coli es una bacteria bacilar, gram negativa, anaerobia facultativa,
perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae. Existen cientos de cepas de
esta bacteria, la mayora son inofensivas y viven en el intestino de humanos y
animales sanos. Sin embargo, existe una cepa, la O157:H7 que produce una
poderosa toxina, la cual puede causar una infeccin severa. La mayora de las
enfermedades por esta bacteria se han asociado a comer carne molida de res mal
cocinada. Se sabe que es sensible a las cefalosporinas, las quinolonas y a la
ampicilina.
Curva Dosis-Respuesta
La curva dosis-respuesta se construye graficando en las ordenadas las
respuestas o efectos causados en el organismo expuesto a una substancia
qumica y en las abscisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la
experimentacin se hace con un solo individuo, tejido, etc., la respuesta observada
normalmente es una funcin hiperblica de la dosis de una forma similar a la
ecuacin Michaelis-Menten para expresar la velocidad inicial de una reaccin
enzimtica. La curva pasa por el origen del sistema de coordenadas cartesianas y
la pendiente mxima se presenta en el origen. La pendiente permanece
aproximadamente constante durante un rango amplio de la dosis (cintica de
primer orden), despus la pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve
cero (cintica de orden cero) y la respuesta adquiere su valor mximo. A este
valor mximo se le denomina efecto mximo (E max) y es una medida de la eficacia
del txico.
En algunas ocasiones, la relacin dosis-respuesta no es tan definida y
dentro de una poblacin se observa una distribucin de respuestas para cada
dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, sino el porcentaje de
la poblacin en este estudio que presenta una determinada respuesta para cada
dosis suministrada. Este tipo de efecto se denomina cuantal. En estos casos se
acostumbra graficar, en la ordenada el por ciento de la poblacin que presenta un
determinada valor de la respuesta y en la abscisa, el logaritmo de la dosis
suministrada. Esta curva tiene forma sigmoidal. A la regin de la curva donde los
efectos no son medibles, se le conoce como regin NOAEL (por sus siglas en
ingls (No Observed Adverse Effects Level).
Hay compuestos peligrosos que presentan dos curvas dosis-efecto, una
curva que representa efectos txicos y otra los efectos letales. Cuando se
aumenta el nivel de la dosis, se pasa de un rea de la curva en la que no se
13

observan efectos dainos a otra donde se observan efectos txicos crecientes.


Cuando se aumenta an ms la dosis, se presentan los efectos letales crecientes
que tambin se relacionan con la dosis en la misma forma que los efectos
anteriores.
Desarrollo
Material
Tubos de McFarland
Tubos de ensaye
Incubadora a 37 C
Inculo de Escherichia coli o Salmonella tiphimurium
Medio de cultivo
Bencilpenicilina Procana/Bencilpenicilina sdica 800 000 U
Estreptomicina
Procedimiento
1. Prepare una solucin de 200 000 U/mL del antibitico en estudio, y una
dilucin 1:100.
2. Realice los clculos para tener las unidades del antibitico indicadas en
cada tubo, a lo largo de 10 tubos, con el fin de obtener las concentraciones
marcadas. Agregue la cantidad de medio, inculo y antibitico necesarios.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Caldo
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
(ml)
Antibitico
(l)
Inculo
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
(l)
Se inoculan todos los tubos una vez realizada la dilucin, uno por uno, con punta diferente para
cada uno de los tubos.
Conc.
5000 2500 1250
625
312.5 156.25 78.125 39.0625 19.53 9.765
Final (U)

3. Incube a 37 C durante 24 horas y mida mediante los tubos McFarland, el


crecimiento que se presenta o determine la absorbencia a 600 nm.
4. Construya una curva dosis respuesta para el antibitico.
Clculos
C1V1=C2V2

14

Observaciones y resultados

Tubo

Concentracin (U
de antibitico)

Tubo McFarland o DO600 nm


Rplica
Rplica
Rplica
1
2
3

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Medio

Grfica

Conclusiones

15

PRACTICA 3
NIVELES DE FLOR EN ORINA
Objetivo
Determinar los niveles de flor en orina como biomarcador de exposicin por el
mtodo de ion selectivo.
Introduccin
Biomarcador de exposicin
La presencia de un txico en el ambiente implica un riesgo, no obstante, para
hablar de impregnacin hay que detectar el txico en el organismo, y para que
exista intoxicacin debe aparecer una sintomatologa o alteraciones clnicas. Por
otra parte, la relacin entre el nivel de txico presente en el organismo y la
respuesta txica es algo complejo y difcilmente predecible ya que depende de
numerosos factores (toxicocinticos, genticos, etc...). Un mtodo de cuantificar la
exposicin a xenobiticos y su posible impacto sobre la especie humana es el uso
de procedimientos de monitorizacin biolgica por medio de biomarcadores.
Biomarcador de exposicin se podra definir, en sentido amplio, como la presencia
de un xenobitico en un fluido biolgico que puede ser cuantificable.
Los biomarcadores se utilizan para:
1. Detectar la presencia de una exposicin
2. Identificar a los individuos sensibles de una poblacin
3. Fundamentar la decisin de intervenir, tanto a nivel individual como ambiental
En el diseo de una rutina de muestreo es necesario considerar lo siguiente:
1. Especificidad y sensibilidad del biomarcador
2. Dificultad de muestreo
3. Cintica de la formacin del biomarcador y estabilidad del biomarcador.
4. Fcil anlisis
Una de las limitaciones ms importantes de los biomarcadores radica en que no
pueden aplicarse a sustancias que ejercen sus efectos txicos de forma
instantnea (por ejemplo, gases y vapores irritantes primarios) o sustancias que
tienen una tasa de absorcin muy pequea.
Fundamento del mtodo
La determinacin del ion fluoruro, se basa en el uso de un electrodo de in
selectivo, el cual esta constituido de manera similar al electrodo simple de vidrio
para medir pH, excepto que funciona a base de una membrana de cristal de
16

fluoruro de lantano. A travs de la membrana cristalina se lleva a cabo una


diferencia de potencial entre la solucin problema y la solucin interna de
referencia (NaF 0.1M y KCl 0.1M) del electrodo, la cual se compara contra un
potencial externo de referencia mediante alambre de Ag-AgCl conectado a un
potencimetro.
La actividad de los iones fluoruro, es dependiente de la fuerza inica total de la
solucin del pH y de la presencia de especies acomplejantes en la misma. Para
eliminar todas las posibles interferencias que pudieran alterar los resultados
obtenidos, se adiciona un buffer de alta resistencia inica (TISAB= Total ionic
strength activity buffer). Los propsitos de este buffer son: a) proporcionar una alta
fuerza inica a la muestra, b) ajustar el pH (entre 5.0 y 5.5) para evitar la
interferencia producida por lo iones hidroxilo, los cuales son los nicos que tienen
una interferencia significativa debido a la similitud entre la carga inica y radio
inico con los del flor y c) la liberacin de los iones fluoruro que estn unidos a
metales (tales como Al+3 o el Fe+3) mediante la inclusin de un fuerte agente
acomplejante como lo es el EDTA.
Desarrollo
Equipo
Potenciometro
Electrodo de in selectivo
Material
Matraces Volumetricos
Vasos de precipitado de plstico
Micropipetas
Agitador magntico
Reactivos
Fluoruro de Sodio (reactivo grado analtico secado a 120C)
NaOH
Acido actico glacial
Cloruro de Sodio
Citrato de sodio
EDTA
Agua desionizada
Soluciones
Solucin stock de Fluoruros 100 ppm
Soluciones estndar de Fluoruros (10, 8, 5, 4 y 2 ppm)
Solucin de NaOH 6N
Solucin Buffer TISAB

17

Anote los clculos necesarios para preparar la solucin de fluoruros 100 ppm.

Anote los clculos necesarios para preparar la solucin de NaOH 6N

Preparacin del amortiguador TISAB


Utilizando agitacin magntica, aadir aproximadamente 500 ml de agua
desionizada 57 ml de cido actico glacial, enseguida poco a poco 58 g de NaCl
hasta disolucin. Posteriormente 0.3 de citrato de sodio. Se agregan NaOH hasta
que el pH se encuentre entre 5.3 y 5.5. Transferir a un matraz volumtrico de 1
litro y aforar con agua desionizada.
Nota: Todo el material se resguarda en envases de polietileno.
Muestra problema
Primera orina de la maana.
Procedimiento
1. Pretratamiento de la muestra de orina
Por cada 100 ml de muestra de orina aada 0.3 gr de EDTA. Deje al menos
reposar 1 hora. Evalu la densidad de la muestra.
2. Tratamiento de las muestras.
En vasos de precipitado de plstico de 50 ml se colocan 10 ml de la muestra y 10
ml de cada estndar respectivo, se aaden a cada uno 10 ml de TISAB y se
mezclan. La muestra y los estndares se pueden quedar a temperatura ambiente
hasta su anlisis.
3. Curva de calibracin y lectura de muestra.

18

Para establecer un punto de referencia en el aparato, se designa un estndar de


concentracin intermedia como el punto cero. Esto se hace con la finalidad de que
la lectura del potencimetro tenga una mayor estabilidad. Una vez agitada
perfectamente la solucin de ajuste cero, se sumerge el electrodo procurando
evitar la formacin de burbujas. Se toma la lectura del estndar (aprox 3 min)
cuando se estabiliza se toma la lectura se ajusta a cero el aparato. Se procede
entonces a tomar la lectura de los dems estndares. Se procede entonces a
tomar la lectura de las muestras.
Nota: El agitador magntico debe apagarse cada que se introduce o extrae el
electrodo de la solucin, este debe enjuagarse con agua desionizada en cada
cambio de muestra o estndar. Cada una de las muestras o los estndares se
analizan por duplicado.
Clculos experimentales
La actividad de un in es dependiente de la proporcin de la fuerza inica en la
solucin. Dado que el volumen de TISAB adicionado en las muestras y estndares
es el mismo, es posible hacer uso del electrodo directamente para determinar la
concentracin de fluoruros, pues la fuerza inica es la misma para ambos tipos de
soluciones lo que permite asumir que la actividad es igual a la concentracin. En
base a esto se realiza una curva estndar de calibracin en escala
semilogartmica, en donde el potencial medido en milivolts se lee en la escala
aritmtica y la concentracin de fluoruros en la escala logartmica. Usando el
sistema de regresin lineal es posible interpolar los resultados obtenidos de las
muestras y conocer las concentraciones de flor.
Resultados
Anote los datos necesarios para la realizacin de la grfica y concentracin del
problema. Sealando la procedencia de la muestra.

19

Haga una grafica de mV contra log concentracin de flor (ppm).

Mediante regresin lineal determine la concentracin de las muestras problema.

Realice un diagrama de la toxico cintica del Flor.

20

Mencione por que Flor en orina es el mejor biomarcador para este txico y a que
tipo de exposicin refiere.

Investigue como se encuentra la problemtica del Flor en Mxico y en nuestro


estado (Guanajuato).

Bibliografa

21

PRACTICA 4
TOXICIDAD DE METALES PESADOS EN PLANTAS.
EFECTO DE CROMO (III) Y (VI)
Objetivo
El alumno identificar los diferentes sntomas de toxicidad causados por metales
(cromo) en plantas.
Introduccin
Los metales son elementos distribuidos en el ambiente. Algunos de ellos pueden
ser dainos para el hombre. Los metales difieren de otros txicos ya que estos no
pueden ser destruidos ni creados por el hombre. Su influencia en el hombre
depende de su transporte a travs del medio ambiente (agua, aire, suelo y
comida), o por alteracin de la especiacin bioqumica del elemento.
Los metales se redistribuyen de manera natural en el medio ambiente mediante
los ciclos biolgicos y geolgicos. El agua de lluvia disuelve las rocas y las menas
y transporta los materiales a los ros, arroyos y luego los sedimenta. Los ciclos
biolgicos incluyen la bioconcentracin por las plantas y los animales y los
incorporan a sus ciclos alimenticios. Por otro lado las actividades antropognicas
modifican (aumentan) el contenido del metal en una regin.
Hay factores que influencian la toxicidad de los metales:
-Interaccin con metales esenciales. Por ejemplo por metabolismo similar entre un
metal esencial y el txico.
-Formacin de complejos metal-protena. Como las metalotionenas que se
acomplejan con Cd, Zn, o Cu.
-Edad y estadio de desarrollo. En el caso de nios y jvenes, ingieren ms
caloras por Kg de peso que los adultos, por lo que si hay algn metal
contaminante, mayor ser la ingesta. Adems por ejemplo el Pb se absorbe ms
por va GI en los nios que en los adultos. Por otro lado, el crecimiento rpido y la
divisin celular, da oportunidad para efectos genotxicos.
-Factores por estilo de vida. Por ejemplo, el tabaquismo aumenta la exposicin al
Cd y la ingestin de alcohol predispone a la prdida de metales esenciales.
-Forma qumica o especiacin. La forma qumica de un metal repercute en la
biodistribucin en el organismo. El tetraetilo de Pb y el metilmercurio son solubles
en lpidos y son ms solubles en mielina que las sales inorgnicas de stos.
22

-Estatus inmune del husped. Algunos metales producen reacciones de


hipersensibilidad: Hg, Au, Pt, Be, Cr y Ni (hipersensibilidad tipo I). El Au puede
actuar como hapteno (hipersensibilidad tipo II). Hipersensibilidad tipo IV se
presenta con el Ni o Cr. Se pueden presentar granulomas con berilio o zirconio.
Qumicamente los metales pesados reaccionan con ligandos que contengan
Oxgeno (hidroxilo, carboxilato, fosfato, cetona), azufre (sulfhidrilos o disulfuros),
nitrgeno (NH2 y NH), o pueden formar enlaces de coordinacin (agentes
quelantes).
Desarrollo
Material
Semillas de trigo, lenteja o maz,
Vasos de precipitados de diferentes volmenes,
Agitadores magnticos,
Mechero,
Probetas,
Matraces volumtricos de diferentes volmenes,
Pipetas automticas y puntas,
Ca(NO3)2.4H2O,
CaCl2.2 H2O,
KH2PO4,
KNO3,
Mg(ClO4)2,
FeCl3,
H3BO3,
MnCl2. 4H2O,
MoO3,
Zn(NO3)2.6H2O,
CuSO4.5H2O,
Cloro comercial,
CrCl3,
Na2CrO4,
NaOH,
HCl,
HNO3,
H2O2 al 30%,
Agua destilada,
Soluciones
Preparacin de la solucin nutritiva de Hoagland
Prepare las soluciones stock de las siguientes sales:
23

Sal

g/lt

Ca(NO3)2.4H2O
CaCl2.2 H2O
KH2PO4
KNO3
Mg(ClO4)2
FeCl3
H3BO3
MnCl2. 4H2O
MoO3
Zn(NO3)2.6H2O
CuSO4.5H2O

8,431
31,421
13,183
2,585
23,323
0,726
0,143
0,077
0,001
0,011
0,011

Tome 10 ml de cada una de las soluciones anteriores, agregue 800 ml de agua


destilada, ajuste a pH 5,8 y afore a l lt.
Solucin de hipoclorito de sodio para eliminar microorganismos de las
semillas
Tome 4 ml de cualquier blanqueador comercial y afore a 100 ml. Prepare la
solucin un poco antes de su utilizacin.
Para desinfectar material, utilice 8 ml de blanqueador comercial y afore a 100 ml.
Sumerja el material a desinfectar en la solucin durante 30 minutos.
Solucin stock de Cr(III) y Cr(VI)
Prepare una solucin stock de 1 000 ppm de CrCl 3 y otra de Na2CrO4 en agua
destilada. Calcule la cantidad necesaria para las concentraciones requeridas y
agregue a la mezcla de las soluciones nutritivas de Hogland antes de aforar.
Procedimiento
1. Coloque 100 g de semillas en 500 ml de solucin de hipoclorito de sodio en
un vaso de precipitados de 1 000 ml. Deje 30 minutos con agitacin.
2. Elimine el agua con hipoclorito de las semillas y enjugue 3 veces con agua
destilada estril.
3. En un refractario o recipiente grande, extienda toallas de papel y
humedzcalas con la solucin nutritiva.
4. Coloque varias semillas a 1 cm de la orilla del papel como se muestra en la
figura. Doble el papel a lo largo (doblez 1) para que las semillas queden
entre el papel, y luego doble a lo ancho varias veces, como si se estuviera
haciendo un rollo de papel (doblez 2). Haga el procedimiento en una
campana de flujo laminar o en un rea previamente desinfectada con
24

solucin de hipoclorito de sodio comercial al 50% v/v y trabaje entre dos


mecheros, como si se hiciera un sembrado microbiolgico.
Doblez 2
Doblez 1

5. Los rollos con las semillas se colocan en recipientes de plstico


desechables desinfectados con solucin de hipoclorito de sodio. En el
recipiente se deber colocar una cantidad de solucin nutritiva y los rollos
debern estar mojados por la solucin, sin que las semillas estn
sumergidas y tapar con una bolsa de plstico. Monte el experimento por
duplicado y por lo tanto deber haber dos recipientes para control (solucin
nutritiva sin cromo), dos con solucin nutritiva con 10 ppm, dos con 100
ppm y dos con 1 000 ppm de cromo. El maestro asignar qu tipo de sal de
cromo usar cada equipo.
6. Coloque los recipientes en un lugar limpio e iluminado. Deje 1 semana para
dejar crecer las plntulas. Remplace el agua que se evapore a lo largo de la
semana, con agua destilada.
7. A los siete das, saque las plntulas con cuidado. Registre si todas las
semillas germinaron. En las que germinaron, mida con una regla la longitud
de la raz primaria, longitud del tallo, longitud de las hojas y registre la
presencia o ausencia de races secundarias y de hojas.
8. Compare los resultados tanto del control, como de las diferentes
concentraciones de cromo.

Resultados

25

Control:

10 ppm:

26

100 ppm:

1 000 ppm:

27

Conclusiones

Cuestionario
1. Compare sus resultados con los de sus compaeros. En general, Cul es
ms txico en los organismos el Cr(III) o el Cr(VI)? Por qu?

2. Qu efectos de toxicidad se presentaron en las plantas utilizadas?

28

3. Cmo se podra determinar la concentracin de cromo en cada parte de la


planta?

Bibliografa

29

PRCTICA 5
ENSAYO DE MICRONCLEOS
Objetivo
Determinar la presencia de microncleos como medida de inestabilidad gentica
inducida por agentes genotxicos.
Introduccin
La integridad gentica de la poblacin humana se ve afectada por la actividad
industrial, por lo que es importante utilizar mtodos para determinar el grado de
dao gentico en una poblacin (ensayos de genotoxicidad). Los microncleos
son cuerpos citoplsmicos de naturaleza nuclear que corresponden a material
gentico no incorporado correctamente a las clulas hijas durante la divisin
celular. Estos reflejan aberraciones cromosmicas y son originados por roturas en
el material gentico o por errores durante la replicacin y posterior divisin del
DNA y/o por exposicin a agentes genotxicos. Hay factores que pueden influir o
modificar el nmero de microncleos que pueden estar presentes en una clula,
como edad, gnero, tratamientos mdicos, la exposicin diaria a agentes
genotxicos etc.
Los microncleos (MN) son masas de cromatina que tienen forma de pequeos
ncleos, que aparecen cerca del ncleo principal en las clulas interfsicas. Los
MN se pueden generar en forma espontnea o como respuesta a determinados
agentes (clastognicos y/o aneugnicos) como resultado de la prdida de
fragmentos cromosmicos y/o cromosomas enteros durante la divisin celular. Las
roturas cromosmicas darn lugar a fragmentos cromosomales acntricos que al
no disponer de centrmero no se incluirn en los ncleos hijos durante la divisin
celular, al no poderse unir al huso mittico en la anafase. Estos fragmentos se
rodean de membrana nuclear y aparecen como pequeos ncleos. Si el dao
genotxico ha afectado a las protenas del cinetocoro al centrmero o al huso
mittico lo ms probable es que haya un retraso mittico y un desequilibrio en la
distribucin de cromosomas provocando que los cromosomas rezagados se
pierdan durante la anafase y se rodeen de envoltura nuclear.
Del 10 al 25% de los linfocitos de sangre perifrica son de vida larga (hasta ms
de 5 aos) y generalmente estn en estado no proliferativo (fase G 0), al estar en
este estado, requieren un estmulo durante el cultivo que se realiza con PHA. Sin
embargo como los MN son inestables tienden a desaparecer a lo largo de las
divisiones celulares, por lo cual es importante saber si una clula se ha dividido y
cuntas veces lo ha hecho, para ello se utiliza citocalasina B que detiene la
citocinesis al impedir la polimerizacin de la actina. De esta forma las clulas que
hayan llevado a cabo una divisin celular aparecern como binucleadas y las que
30

realicen ms de una divisin aparecern como multinucleadas. La frecuencia


basal de MN en sangre perifrica oscila entre 0 y 2.5%.
Los tejidos epiteliales proliferan muy rpido y estn en contacto continuo con el
ambiente. El epitelio est formado por varias capas de clulas, las cuales van
exfoliando a medida que alcanzan la superficie, por cual el dao que puede
observarse es el que ha ocurrido en las clulas basales que es el lugar en el que
las clulas se dividen para formar el tejido. La renovacin rpida del tejido hace
que los MN aparezcan entre 1 y 3 semanas despus de la exposicin al agente
txico, ya que es el tiempo que tardan estas clulas en llegar a la superficie del
tejido. La frecuencia de MN en clulas de exfoliacin epitelial de la mucosa tiende
a ser inferior a la que se observa en clulas sanguneas (0.03 a 0.47%).
En la tabla 1 se presentan las diferencias entre clulas binucleadas y microncleos
y en la figura 1 se presentan fotografas de clulas con microncleos.
Tabla 1. Criterios definidos por el HUMN-project para la seleccin de clulas binucleadas y de
microncleos en cultivos de clulas humanas.
Criterios para clulas binucleadas
El citoplasma debe distinguirse claramente
Membranas citoplasmtica y nuclear intactas
Ncleos con similar grado de condensacin de
la cromatina
Igual tamao, forma (ovalados) y patrn de
tincin
Pueden estar unidos por puentes
nucleoplasmticos
Pueden tocarse pero no solaparse

Criterios para microncleos


El dimetro oscila entre 1/16-1/3 de la media
del dimetro del ncleo principal
No refractarios
Intensidad de tincin similar a los ncleos
principales o superior
Forma similar a los ncleos de la clula
binucleadas
No conectados con ninguno de los ncleos de
la clula binucleadas
Pueden tocar los ncleos de la clula
binucleadas pero no solaparse con ellos

Ninguno de los ncleos debe encontrarse en


etapas de apoptosis

Figura 1 (a) (b) y (c) clulas binucleadas portadoras de microncleos; tanto las clulas como los
microncleos cumplen los criterios de seleccin definidos por el comit internacional de
microncleos humanos; (d) (e) y (f) distintos estadios de clulas en vas de apoptosis; (g) (h)
e (i) clulas con distintos ndices de divisin nuclear; (g) clulas mononucleadas; (h) clula
trinucleada portadora de microncleos: (i) clula tetranucleada portadora de microncleos,
(j) clula mononucleada con microncleos

31

Reactivos
Amortiguador
EDTA 0.1 M
Tris HCl 0.01M
NaCl 0.02 M
pH 7.0
Giemsa al 10%
En una caja Koplin colocar 5 ml de solucin madre de Giemsa y agregar 45 ml de
agua destilada.
Solucin madre de Giemsa
Giemsa 1 g
Glicerina 67 ml
Metanol absoluto 133 ml
Calentar en estufa o en bao mara la glicerina a 60C, agregar el colorante y
mantener 30 min a la misma temperatura. Agregar el metanol y agitar durante 4 h.
Filtrar y guardar en frasco mbar en el refrigerador.
Desarrollo
Procedimiento
MN en clulas de epitelio bucal
Realizar un raspado de la parte interna de las mejillas con un cepillo dental sin
tocar lengua ni dientes. Sumergir el cepillo en 10 ml de amortiguador (EDTA 0.1 M,
Tris HCl 0.01 M, NaCl 0.02 M, pH 7.0), agitar por 1 minuto y centrifugar a 1500
rpm durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y lavar 3 veces con el
amortiguador a las mismas condiciones. Al final la pastilla se resuspende en 1.5 ml
de amortiguador. Dejar caer desde una distancia de 20 cm dos gotas de la
suspensin de linfocitos en un portaobjetos humedecido con etanol. Dejar secar la
laminilla a 37C durante 10 minutos. Sumergir la laminilla en el colorante Giemsa
al 10% durante 5 a 10 minutos. Realizar la observacin y el conteo en el
microscopio mediante inmersin.
Resultados
Se cuentan 1000 clulas en interfase y se indicar el nmero de clulas con MN.
Observacin en el microscopio

32

Conclusiones

Cuestionario
1.Describa mediante un esquema cmo se producen los microncleos en una
clula.

33

2. Mencione qu es un agente clastognico.

3. Mencione varios xenobiticos clastognicos.

4.Defina lo que es un biomarcador de efecto temprano.

5. Investigue si hay valores de referencia para este biomarcador en poblacin


humana.

Bibliografa

34

PRCTICA 6
PRUEBA DE MOVILIDAD (EVASIN) DE LOMBRICES
Este ensayo es una prueba aguda (se desarrolla en 48 h) que se puede aplicar
como una alternativa a pruebas de mortalidad. Se basa en la evaluacin de
efectos subletales caracterizados por el comportamiento de evasin de las
lombrices, para la cual se mide el nmero de lombrices que se desplazan desde
un suelo contaminado y que, por tanto, evaden la exposicin. Dicho
comportamiento se calcula a travs de la concentracin efectiva media (CE50),
que indica la concentracin a la que el comportamiento de evasin es el 50 % de
los organismos expuestos, comparado con el control. Esta prueba se usa para
evaluar si el hbitat es funcional para la lombriz (Feisthauer, 2003; Hund et al.,
2003).
Material y equipo
Contenedor de prueba
Guantes
Balanza analtica
Papel aluminio
Micropipeta de 100 a 1000 L
Papel filtro
Potencimetro
Pinzas
Pipetas volumtricas de 1 a100 mL
Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L
Tela sinttica (organza)
Contenedor de Prueba
El contenedor de prueba es un recipiente redondo de acero inoxidable o PVC con
un dimetro de 21 cm, altura de 5 cm y espesor de 3 mm; tiene seis cmaras
unidas en forma radial con paredes (placas) de 6 cm de ancho, 5 cm de altura y un
espesor de 2 mm, y una cmara central con un dimetro de 8 cm y paredes de espesor de 2 mm. Las paredes y la cmara central estn intercomunicadas con cinco
arcos y dos arcos, respectivamente, los cuales tienen una dimensin de 0.5 cm de
altura y 1 cm de ancho.

35

Organismos de prueba
Se emplean lombrices adultas cliteladas (Eisenia fetida), con un peso de 0.250 a
0.500 g cada una.
Suelo
El suelo problema (4 kg) se tamiza a travs de una malla de 4 mm. Se determina
su pH y porcentaje de Humedad. En funcin de los resultados de estas
determinaciones se realiza el ajuste a un pH de 6.5 a 7.0 y un contenido de
humedad del 70%. Las concentraciones de muestra provienen de diferentes
suelos contaminados y sitios de referencia (tambin se puede trabajar con fases
de procesos de biorremediacin), por lo que se obtienen suelos o muestras con
concentraciones diversas.
Procedimiento
Preparacin de los organismos
Previamente a la prueba, las lombrices se depositan en cajas de Petri con papel
filtro humedecido con agua desionizada, para que vacen sus intestinos durante 5
h. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas.
Desarrollo de la prueba
Se pesan 100 g del suelo problema y del suelo control, y se colocan en el
contenedor de seis cmaras, alternando el suelo control y el suelo contaminado en
diferentes concentraciones.
Nota:
Para controlar variables como % de materia orgnica y % de humedad todas las
muestras sern mezcladas con suelo control en una relacin 1:3 y medidos en
volumen de 350 ml.
Posteriormente se depositan 10 lombrices en la cmara central. La migracin de la
lombriz es lenta, por lo que, si despus de 10 min no se observa migracin, se
acerca una lmpara para disminuir el tiempo de espera y acelerar el movimiento
36

hacia los compartimentos, cuidando de no daar a la lombriz. Cada contenedor


tendr cuando menos cuatro rplicas.
Para evitar que las lombrices escapen, los contenedores deben ser cubiertos con
tela de organza y papel aluminio perforado con pequeos orificios, lo cual facilitar
la circulacin de oxgeno dentro del contenedor y evitar la prdida excesiva de
humedad. Los contenedores deben ser colocados en un lugar donde la luz sea
mnima y la temperatura no exceda los 25 C (Hund y Wiechering, 2001).

Al trmino de 48 h, las paredes de las cmaras son tapadas con una placa
divisoria con dimensiones de 12 cm de altura, 8.3 cm de ancho y espesor de 0.5
mm (figura 2.7) para evitar el movimiento de la lombriz hacia las cmaras vecinas.
El suelo y los organismos de cada cmara debern ser sacados para registrar el
nmero de lombrices en cada una de ellas, as como para evaluar su movimiento
ante los estmulos de tacto y registrar su peso al final de la prueba.
Clculos
Si es una prueba de concentraciones mltiples, que tienen cuatro o ms
concentraciones y un contenedor por cada concentracin (alternando suelo limpio
y contaminado), la evasin se determina aplicando la siguiente frmula a cada
rplica (ISO, 2008; De Silva y Van Gesten, 2009):
E= C - P / L x 100
Donde E = evasin (%)
C = nmero de lombrices en el control
P = nmero de lombrices en el suelo problema
L = nmero total de lombrices expuestas
Para evaluar si el suelo analizado es un hbitat adecuado para las lombrices, se
evalan los siguientes criterios:
Si el 50 % de los organismos se encuentran en el suelo contaminado o tratado, se
considera que no muestran preferencia por ningn tipo de suelo y que dicho suelo
es un hbitat adecuado.
Por su parte, si el porcentaje de lombrices en el suelo contaminado es del 20%, se
considera que el suelo tiene efecto sobre los organismos y, por lo tanto, que es
37

txico o de baja calidad (Hund et al., 2003; Hund et al., 2005; Ricardo et al., 2010).
Preparen una presentacin (15 minutos por equipo) en la que muestren los
resultados del experimento, recalcando si los suelos utilizados presentaban
toxicidad para los organismos usados.
Preparen un reporte de la prctica por equipo.
Cuestionario.
1. Menciona las caractersticas de los ensayos para toxicidad aguda, subcrnica y
crnica.

2. Qu es un bioensayo?

3. Menciona algunas aplicaciones de los bioensayos.


38

Bibliografa

39

BIBLIOGRAFA GENERAL
Curtis D. Klaassen , John B. Watkins. Casarett & Doull's Essentials of Toxicology
(Casarett and Doull's Essentials of Toxicology) McGraw-Hill Professional; First
edition 2003.
Barbara B Mishell, Sanley M Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology,
W.H. Freeman and Company, New York, 1980.
Albert Balows, William J. Hausler, Jr., Kenneth L. Herrmann, Henry D. Isenberg, H.
Jean Shadomy, Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition, American Society for
Microbiology, Washington, 1991.
B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson, Molecular Biology
of the Cell. Garland Publishing Inc., Third Edition, New York, 1994.
Noel R. Rose, Herman Fierman, John L. Fahey (Eds.) Manual of Clinical
Immunology, Third Edition, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
1986.
M.J. Lynch, S.S. Raphael, L.D. Mellor, P.D. Spare, M.J.H. Inwood, Mtodos de
Laboratorio, Ed. Interamericana, Mxico, 1972.
J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Sheback and W. Strober,
Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, U.S.A. 1992.

40

Manual de Prcticas para el Curso de


Toxicologa I
Primera edicin 2009
Universidad de Guanajuato
Lascurain de Retana No. 5
C.P. 36000
Guanajuato, Gto., Mxico
Impreso en Mxico
ISBN
Revisin Tcnica
Q. Fernando de Jess Amzquita Lpez
Facultad de Qumica, Universidad de Guanajuato

41

Manual de Prcticas para el Curso de


Toxicologa I
de: Rosa Mara Garca Nieto
Se termin de imprimir en el mes
Impreso en:

42