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8W-5Zl-06OO

Universit de Montreal

Strat6gies de pr6vention du stress oxydatif associa au syndrome d1isch6miereperfusion cardiaque.

Par
Julie Brunet

Dpartement de Nutrition
Faculte de medecine

These ptdsente la Faculte des Btudes sup6rieures

en vue de l'obtention du grade de
Philosophiae Doctot (Ph.O.)
en Nutrition

f6vrier , 1998

Julie Brunet, 1998

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autorisation.

Universitd de Montreal
Facult des tudes supdrieures

Prdsent~bepar:

a et& 6valube par un jury composd des personnes suivantes:

Dr Sylvain Chemtob

Dr Christine Des Rosiers

Dr Jaoe Montgomery
Dr John Kingma Ir.
Dr Chanhi Lambert

Prsident du jury
Directeur de recherche
Membre du jury
Examinateur externe
Repr&sentsintedu doyen

Ce projet de doctorat s'intgrait dans un programme de recherche dont l'objectif

long terme etait une meilleure dfinition des modalits et indications de la thrapie

antioxydante pour la protection du coeur contre les dommages relis I ' i s c h h i e reperfusion. Parmi les nombreux dfis relever dans ce domaine, il nous apparaissait
pertinent de clarifier la contribution relative des espces ractives oxygnes aux

dommages observ6s. puisque ceci s'avre determinant pour le choix du ou des

antioxydants a prdconiser. Nous avons donc entrepris d'valuer la contribution du
radical hydroxyle.

L'hypothse d'une participation de ce radical aux dommages dtisch6mie-reperfusion

semblait plausible vu qu'il tait reconnu comme une esphce radicalaire trs toxique.
Afin de mettre en Bvidence une relation de cause (radical hydroxyle) effet
(dommages), notre stratgie a t d'utiliser conjointement une mthode de ddtection,
soit la formation de produits aromatiques hydroxyl6s par chromatographie gazeuse
couple A la spectromtrie de masse, et un antioxydant soluble ayant une bonne
affinit pour ce radical, soit le N-acBtylcyst6ine. R&rospectivement, le choix de cette
molcule antioxydante s'est avr dterminant quant B l'orientation de ce projet de
recherche. De fait, la mise en vidence d'un effet modulateur du N-ac6tylcystine sur
le dbit coronarien d8s la premibre srie d'expdrience a donn lieu des expriences
subsequentes, lesquelles visaient prciser le ou les mcanismes en cause.

Pour raliser cette recherche, nous avons utilise le coeur isol de rat perfus6 selon le
mode Langendorff. La sequence des Bvhements associs B l'ischmie-reperfusion
a 6t documentde par la mesure temporelle et continue tout au long des perfusions
de divers indices: (i) production de radical hydroxyle, (ii)nbcrose cellulaire (lib6ration
de la lactate dtishydrogdnase), (iii) stress oxydatif (libdration de glutathion), et (iv)
fonction mdtabolique (libdration de lactate et de pyruvate).

De plus, le dosage

d'indices tissulaires (nucl6otides adhyliques et glutathion) aprbs chaque expdrience

et la mesure de paramhtres physiologiques (debit coronarien, rythme cardiaque,

..*

III

pression systolique et diastolique, dP/dt) a u cours des perfusions, nous ont permis
d'valuer la condition des coeurs suite diffrents traitements.
Dans une premire srie d'expriences, les coeurs perfuses ont subi une ischemie
partielle de 90 minutes (ImI/min) suivie d'une reperfusion de 30 minutes. Pour la
seconde srie d'expriences, nous avons d'abord prserv les coeurs isol6s de rats
pendant 4h dans une solution cardioplgique 4C avant de les reperfuser selon le

mode Langendorff. Finalement, pour la troisidme serie d1exp6riences, nous avons fait
subir aux coeurs une ischdmie globale de 15 minutes avant de les reperfuser pendant
30 minutes.

En rsume, cette tude soulve d'une part un questionnement quant a la contribution

du radical hydroxyle aux dommages observs lors de l'ischmie-reperfusion, et par

consquent sur l'efficacit d'une thdrapie antioxydante cible sur cette espce
radicalaire. D'autre part, nos r6sultats mettent en Bvidence un effet modulateur du
N-actytcystine sur le dbit coronarien des coeurs reperfuss. Cet effet semble
attribuable B la prsence sur cette molcuie d'un groupement thiol plutt qu' son
activite de piegeur des radicaux hydroxyles. Le rn6canisrne impliqu dans cet effet
modulateur du N-acBtylcystine, lequel a t6 observ dans trois protocoles diffrents
d'ischmie-reperfusion, semble varier en fonction du temps d'addition du Nactylcyst6ine et des conditions de perfusion. Parmi ies facteurs mis en cause, tel
que sugg6r par nos r6sultats, mentionnons l'effet permissif des substrats exogdnes,

probablement le lactate, la formation d'oxyde nitrique et de ddriv6s S-nitrosothiols e t

l'activit des canaux K.,'
coronarien pourrait gtre

Cet effet modulateur du N-acBtylcyst6ine sur le debit

l'origine des effets hypotenseurs rapportes lors de son

administration chez des patients souffrant de maladies cardiovasculaires.

TABLE DES MATIERES

Page

.. .
Identification du jury ...................................................................................... i
..

Sommaire ..................................................................................................II

.
,................................................................. iv
Liste des tableaux.. ............................. , .. . . . .. ... . .. .. .. .. . ... .... . ix

Table des rnatidres.. ....... .............

Liste des figures ............................. .

.
.
,
........................................................... xi
Liste des sigles et abreviations.................................................................. xiv

Remerciements ...........................

. .. .. . . . . ....

.. .. .. .. ...... .. xvi

......................... . ..............
1 . INTRODUCTION GENERALE................................. ..
. .

Chapitre I. BEVUF DE LITTEWRE

0

2. LE SYNDROME D'ISCHMIE-REPERFUSION

CARDIAQUE

...

. ....... 2

............................ 4

..............................-............................. 4
2.1 .1 . L 'ischmie................................................................................. 5
2.1.2. La repefiusion ..................................... ................. .. .. ........ 6

2.1 . Definitions et descriptions..

2.2. Pathophysiologie.. .....................,......... .................................. ...... 7

...,.............................. .... . ......... 7

2.2.1 . Hypothse du calcium.............

2.2.2. Hypothse des espces ractives drides de 1'oxygne

et de l'azote. ............................................................................. 7

2.3.Espces idactives ddriv(Les de I'oxygbne (ROI.. ............................ ... 8

2.3.1 . D6finition........ ..........,......................................... .................... 8

2.3.2. Principales sources ................................................. ........... ...... 9

2.3.2.1 . Chaine de transport d961ectrons............. ......................1 1

2.3.2.2. Xanthine oxydase ................-...............

........... .......1 1
2.3.2.3. NADPH-oxydase et my6loperoxydase......... ............. . . .1 1
2.3.2.4. Cyclo-oxygdnase et lipoxyghase ... .....-.................... ...-.-12

Page

2.3.2.5.Catcholamines............................................................ 12
2.3.2.6. Systme des oxydases fonctions mixtes .......................13
2.3.2.7. NADH.oxydase ............................................................. 13

2.3.2.8. Autres voies .................................................................l3

2.3.3. Cibles...................................................................................... S 4
2.3.4. S y s t h e s de protection ............................................................ 6
2.3.4.1 . Les systmes enzymatiques.......................................... 18
2.3.4.2. Les systmes non-enzymatiques.................................... 21
2.3.5. M4thodes d'valuation ou de dtection des ER0 ........................2 3
2.3.5.1. EPR ............................................................................ 23

2.3.5.2. HPLC.......................................................................... 23

2.3.5.3. Chimiluminescence...........
2.3.5.4.

........................................ 24
Mesure des produits de la peroxydation des lipides..........24

2.4. Espbces rilactives dilrivdes de l'oxyde nitrique (ERN).......................9 4

2.4.1 . Historique...................... ........................................................24

2.4.2. Synthse et rgulation du -NO.................................................... 2 5

2.4.3. Catgories................................................................................ 27
2.4.4. Fonctions................................................................................. 27

2.4.4.1 RBgulation du debit coronarien.......................................28

2.5. Interactions ER0 et RN........................................................ 2

2.5.1 . Evidences exp8rimentales reliant les ERON au syndrome d'1.R .......30

3. CARDIOPROTECTION............................................................................ 36
3.1 . GRn6ralit6s.................................................................................

-36
3.1 .1 . In terventions nutritionnelles......................................................
-3
6
3.1 .1. 1. Antioxydants...............................................................

36

3.1 .2. Interventions m tabdiques ........................................................ 3 8

Page
3.1.2.1 . Acides amins............................................................. 38

................................... 39
3.1.2.3. Intermdiaires de la glycolyse ........................................40
3.1.2.4. Glucose et insuline....................................................... 41
3.1 .2. 5. Dichloroactate............................................................ 41
3.1.2.6. Adnosine .................................................................. - 4 2
3.1 .3. lntemen tions pharmacologiques................................................. -43
3.1 .3.1 . Bloqueurs bta.adrnergiques ........................................ 4 3
3.1.3.2. lnhibiteurs calciques....................................................- 4 3
3.1.2.2. Intermdiaires du cycle de Krebs

3.1 3 . 3 . Inhibiteurs de l'enzyme de conversion de

l'angiotensine (ACE).....................................................44
3.1.3.4. Nitrovasodilatateurs................................................... 45

3.1.3.5. Inhibiteurs de la synthse des prostaglandines................ 45

3.1 .4. ln terventions mcaniques ........................ ,

.............................45
3.1.4.1 . Prconditionnernent ischdmique...................................46
3.1 A.2. Modification des paramtres physico-chimiques.............. 46

3.1 5 . Interventions gniques............................................................. 48

3.2. Catdiopldgie.............................................................................. 4 8
3.2.1 . Gnralit..............................................................................4 8

3.2.2. 1a prservation du greffon cardiaque.......................................... 49

3.2.2.1. Temp4rature............................................................. 50
3.2.2.2. Modes de prtbervation ................................................ 5 1

3.2.3. Solutions cardioplgiques et de prt?se/vation................................ 51

3.2.3.1. Caract6ristiques des solutions....................................... 52

3.2.3.2. composition des solutions............................................ 5 4

3.2.3.3. Les solutions les plus utilisees....................................... 58

Chapitre II .S-I-JEI

................................................................

61

vii

Page

Chapitre III ARTICLE F l MANUSCRIT............................................................ 66

1.

Effect of N-acetylcysteine in the rat heart reperfused after

low-flow ischemia: Evidence for a direct scavenging of hydroxyl
radicals and a nitric oxideilependent increase in coronary flow ................ 67

2 . Enetgy substrates and teactive oxygen species modulate the flow

response of rat hearts reperfused with N-acetylcysteine......................... 79

Chapne IV DISCUSSION &&Al&

............................................................. 1 1 9

..................................................................................120

1 INTRODUCTION

........................

2. CONSIDERATIONS MTHODOLOGI~UES

21

2.1 . Les modeles d'btude...................................................................121

2.2. Les pararnbtres d'dvaluation de la condition des coeurs.................... 123

2.2.1 . Indice de producttn de ER0 ....................................................... 123

2.2.2. Indice du stress oxydatif............................................................. 124

2.2.3. Indice de la ngcrose cellulaire .................... .,.,............................ 2

2.2.4. Indice du statut nergtique ..................................................... 125

2.2.5. Paramtres fonctionnels.................. .

.
...................................2 5
2.3. Le NAC comme antioxydant...............
,
..................................... 2 6

2.5. La composition des tampons de perfusion....................................... 128

Page

3 CONSIDERATIONS PHYSIOLOGIQUES

...................................................129

3.1. R6les des ERO dans le syndrome d'ischhie-reperfusion......,129

3.1.1 . Production de .OH...................................................................129

3.1 .2. Rela tion -OH e t ndcrose cel/u/aire...............................................131

3.1.3. Relation .OH et fonctlbn cardiaque et debit coronarien. ................132
3.1.4. Importance des pi4geur.s de *OHdans la pdvention du
syndrome d'l-R ....................................................................... 133

3.2. Potentiel thdrapeutique du NAC................................................... 133

3.2.1 . Effe ts cardioprotec reurs du NA C...............................................133

3.2.2. Modulation par le NAC du ddbit curonarien .................................1 35

3.2.2.1 R61e des thiols et des ERON.............................,

.
....... 135

3.2.2.2.RBle des substrats bnergdtiques................................ 3

3.2.2.3. RBle des canaux,, K'

................................................ 140

...................................................................................145

4 PROJETS FUTURS

LISTE DES TABLEAUX

Cette thse est pr6sent6e sous forme de "thhse par articles". Pour viter toute
confusion, tous les tableaux et les figures sont rpertoris par chapitres avec un
numro et une page.

Chapitre I.
page

Tableau 1: Principaux systmes de defenses enzymatiques.. ........................... 1 7

Tableau 2: Principaux systmes de dfenses non-enzyrnatiques..

......................18

Tableau 3: Principaux agents antioxydants 6tudi6s ..........................................33

Tableau 4: Caract6ristiques des solutions de prservation sujets
la controverse ...........................................................................53

Tableau 5: Composition de base des solutions cardioplgiques ......................... 55

TaMeau 6: Composs ajouts aux solutions cardioplgiques.............................57

1ableau 7: Les principales solutions de prservation utilisees pour le coeur.. ......58

Chapitre II.

1.

Effects of N-acetylcysteine in the rat heart reperhured after low-ffow ischemia:

Evidence for a direct scavenging of hydroxyl radicals and a nitric oxidedependent increase in coronary flow.

Tableau 1:

Content in GSH and GSSG of hearts reperfused for 30 min

after 90 min of low-flow ischernia without or with 100 pM NAC....75

Tableau 2:

Effect of time addition of NAC on various parameters...................76

Tableau 3:

Effects of 100 PM NNLA on the coronary flow rate of

reperfused ischemic hearts treated with 100 NM
NAC........................................................................................
77

2.

Energy substrates and reactive oxygen species modulate the fiow response of

rat hearts reperfused with N-acetylcysteine.

Tableau 1:

Effect of a 4H hypothermie preservation in Celsior solution

on the myocardial glutathione and adenine nucleotide status. ......IO8

LISTE DES FIGURES

Chapitre I. Revue de_litt8rature

page

Figure 1:

Dcs relies aux maladies cardiovasculaires chez les hommes

canadiens entre 1 9 5 1.1995.. ...................................................... 3

Figure 2:

Sources de formation d ' E R 0 ....................................................... 1O

Figure 3:

Processus de lipoperoxydation................................................... 1 5

Figure 4:

CompMmentarit6 et synergisme des molcules antioxydantes.. ......19

Figure 5:

Cycle du glutathion.................................................................. .20

Figure 6:

Synthbse et rhgulation du .NO....................................................26

Figure 7:

Rdgulation du dbit coronarien par le 'NO.................................... 29

Figure 8:

Interactions E R 0 et ERN............................................................ 31
Chapitre III.

1.

et

Effects of N-acetylcysteine in the rat k a r t reperfused after low-flow ischemia:

Evidence for a direct scavenging of hydroxyl radicals and a nitnc oxidedependent increase in coronaty flow.

Page
Figure 1:

Effect of low-flow ischemia (LF) and reperfusion (RI on the

production (A) and the concentration (BI of 34DHBZ by
isolated rat hearts perfused without (white bars) or with 100

PM NAC (black bars).................................................................70

Page

Figure 2:

Effects of low-flow ischemia (LF) and reperfusion (RI on the

release of LDH (A) and GSH +GSSG (6) by isolated rat hearts
perfused without (white bars) or with 100 pM NAC (black
bars)....................................................................................... 71

Figure 3:

Effects of low-flow ischemia (LF)and repetfusion (RI on the

total (A) and ratio (B) of lactate and pytuvate released by

isolated rat hearts perfused without (white bars) or with 100 pM

.....................................-72
NAC (black bars).............................. ,
Figure 4:

Effects of low-flow ischemia (LF) and reperfusion (R) on the (Al

coronary flow rate and (Bi heart rate of isolated rat hearts

perfused without (white bars) or with 100 pM NAC (black

bars).......................................................................................73

2.

Enetgy substrates and reactive oxygen species modulate the flow tesponse

of rat heans reperfused with N-acetylcysteine.

Figure t :

Effect of sudden vs staged reperfusion of preserved hearts

on the time-profile of coronary flow (A) and LDH release ( 6 )

rates.............................. ................................................... 1
Figure 2:

14

Biochernical (A&B) and functional parameters (C) measured

in hearts reperfused under various conditions after 4 h
hypotherrnic preservation..................................................... 1

Figure 3:

15

Effect of an antioxidant and/or energetic interventions on the

coronary flow response of pteservedlreperfused hearts...............1 16

S..

XII1

Page

Figure 4:

Effects of ROS addition and DCA removal on the coronary flow

response of preserved hearts reperfused with a combined
antioxidant and energetic therapy ............................................. 1 17

Figure 5:

Effects of exogenous energy substrates in the absence (A) or

presence (BI of a K',,

channel inhibitor (glibenclamide) on the

coronary flow rate of NAC-treated hearts subjected t o 15 min

global ischemia and 30 min reperfusion ..................................... 1 18

Chapitre IV.

Page
Figure 9:

Rle potentiel d'une NADH-oxydase dans la modulation du

debit coronarien.. ................................................................. .139

Figure 10:

Rble du H,O, et des thiols dans la rdgulation

du dbit coronarien ................................................................ .142

Figure 1 1:

Principaux facteurs intervenants dans la modulation du

debit coronarien.. .................................................................. .144

xiv
LISTE DES SIGLES ET DES ABREVIATIONS

CAT: Catalase

CK: Cratine kinase

CP: Cratine phosphate

C-R: Cardioplgie-reperfusion

DCA: Dichloroac6tate

34DHBZ: 3,4-dihydroxybenzoate
EPR: Spectroscopie par rdsonance paramagnetique dectronique

ERO: Espces ractives dbrivdes de I'oxyghne

ER0N:Espces reactives derivees de I'oxyghne e t de l'oxyde nitrique

ERN: Espces rdactives derivees de I'oxyde nitrique

ESR: Spectroscopie par rbsonance d'blectrons non-apparids

sGC: Guanylate cyclase soluble
GCMS: Chromatographie gazeuse coupMe 8 la spectromtrie de masse

cGMP: Guanosine- 3', 5'-monophospate cyclique

GSH: Glutathion r6duit

GSHpx: Glutathion peroxydase

GSHrx: Glutathion rductase

GSSG: Glutathion oxyde

H,O,:

Peroxyde d'hydroghne

HPLC: Chromatographie liquide B haute performance

1-R: Ischdmie-reperfusion
LDH: Lactate dshydrog6nase

M W : Maladies cardiovasculaires
MDA: Malondialdehyde
NAC: N-actylcyst6ine
NNLA: N-a-nitro-L-arginine

.NO: Oxyde nitrique

NOS: Oxyde nitrique synthase
NO:;

Nitrite

NO,*: Nitrate

O;.: Anion superoxyde

'O,: Oxygne singulet
-OH: Radical hydroxyle

ONOO-: Peroxynitrite
PDH: Pyruvate dshydrog6nase

SUD: Superoxyde disrnutase

XO: Xanthine oxydase

Je tiens remercier vivement toutes les personnes qui, divers titres, ont contribu
la r6alisation de cette thse.

Plus particulirement, j'exprime une sincre gratitude au docteur Christine Des

Rosiers, pour avoir accept de diriger mes travaux, pour sa disponibilit, ses judicieux
conseils,

sa souplesse et son encouragement constant.

Ses nombreuses

connaissances et son dynamisme m'ont permis de mener bien mon projet de

doctorat malgr6 tes multiples revirements lis aux alas de la recherche fondamentale.
J8 tiens aussi la remercier pour m'avoir permis d'enrichir ma formation en m'offrant

I'opportunitri d'assister

et de prksenter mes rhsultats plusieurs congrs

internationaux.

Je remercie galement le docteur Christine Des Rosiers pour son soutien financier,

sans lequel il m'aurait t6 trbs difficile de compl6ter mes Btudes e t aussi le

departement de nutrition de l'universit de Montral qui m'a fourni pendant deux ans
des bourses d'tudes compl6mentaires.

Ma reconnaissance s'adresse galement Annick Laplante et Blandine Comte, avec

qui j'ai partage les joies et les frustrations de la recherche et qui sont devenues de
prcieuses amies.

Enfin, je remercie sinchrement mon conjoint, Sylvain pour son support, son soutien
moral et ses conseils, ainsi que mes parents, pour avoir cru en mes capacites, tout
au long de la rdalisation de ce projet.

Chapitre 1.5-E
R

1. INTRODUCTION GNRALE

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont encore aujourd'hui la principale cause de

c6ci3s et d'invaliditd dans la plupart des soci6tes industrialises. En 1 995, 37 % des

deces au Canada Btaient amibuables aux MCV~''. Comparativement aux statistiques
des annees 50 et 60, on note cependant une amlioration constante (Figure. I ) , due
aux progrs consid6rables accomplis dans l'identification des facteurs de risque et

dans le traitement pharmacologique et chirurgical des MCV. Malheureusement, la

morbidit et la mortalit demeurent spdcialement 6leves chez les patients ayant subi
un infarctus du myocarde. En fait, la cardiopathie ischmique tait responsable de

56% des d&&s associds aux MCV en 1995. De ce nombre, la moiti tait due un

infarctus aigu du myocarde.

Au cours des quinze dernieres annes, un grand nombre d'tudes dans le domaine de

recherche des MCV a port sur la caracterisation des "16sions de reperfusion", plus
rcemment nomme "syndrome d'ischmie-reperfusion". Ce terme rfre une serie
d18v8nements apparaissant Ci la reperfusion du coeur ischmique soit l'arythmie, la
sideration rnyocardique et endothliale et la n6crose cellulaire. De nombreuses
Bvidences expdrimentales incriminent les espdces rhactives derivees de I'oxygbne
(ERO), comme facteurs contributifs l'arythmie et

la sideration myocardique ou

endoth&liale, toutefois leur implication dans la mort cellulaire est controvers6e. Ceci
explique en partie les rdsultats plut& decevants des thdrapies antioxydantes
(lesquelles limitent l'effet toxique des ER01 lors de l'infarctus, un &at qui inclut une
composante importante de ndcrose. En outre, l'application clinique des therapies
antioxydantes semble plus prometteuse lors de la transplantation etlou de la chirurgie
cardiaque et lorsque se produisent des dpisodes r6pt6s et transitoires dlisch&niereperfusion (thrombolyse, angine). Toutefois, les modalitds de ces thdiapies
antioxydantes n'ont pas 6tB ddfinies pr6cis4rnent.

Etant donne l'abondance de litt6iature traitant des antioxydants, des espdces

r6actives d6riv6es de I'oxyg8ne et de l'oxyde nitrique, cette revue bibliographique ne

peut 0tre exhaustive, bien qu'elle tente de cerner les effets de ces d i f f h n t s facteurs

dans le syndrome d'isch8mie-reprfusion cardiaque. Aussi, les r6fhnces c i t h sont

souvent des revues de la littdrature.

Taux da mortlitb pour 100 000 hommes

700

2. LE SYNDROME D'ISCHMIE-REPERFUSION CARDIAQUE

2.1 . D6finitions et descriptions

L'ischmie suivie d'une reperfusion induit une srie de phnomnes caractristiques

nomms syndrome d'ischmie-reperfusion (1-R). Ces phnomnes sont:

la sideration

myocardique, la sidration endothliale, l'arythmie e t la ncrose cellulaire.

La sidration myocardique est une dysfonction mcanique rversible, svre et

prolonge, observee suite une isch6mie. malgr une reperfusion normale et
l'absence de ncrose ~ e l l u l a i r e ' ~ La
~ . sevritd de la sideration myocardique serait
proportionnelle la dure de l'ischmie.

La sidration endothliale ou vasculaire rfhre une alteration dans la fonction des

~ ~ .phnomdne, qui peut se
vaisseaux viables aprs l'ischmie et la r e p e r f ~ s i o n ' ~ * ' Ce
manifester par une reperfusion ralentie et une diminution dans la r6serve de
vasodilatateurs coronariens, concerne principalement 11endoth61ium,un tissu important
dans I'horn6ostasie des vaisseaux sanguins.

Le troisime phdnomne associ au syndrome d'l-R est l'arythmie. Les differents

types d'arythmies, dont la fibrillation ventriculaire, sont des manifestations du

drangement lectrophysiologique de la cellulea2qui se produisent surtout suite

A une

ischernie rgionale. En fait, la fibrillation ventriculaire serait la principale cause de

dcs chez l'homme lors d'une ischbmie myocardique aigu.

Finalement, le quatriame phthornene associe au syndrome 4'1-R est la necrose

cellulaire ou la mort d'une partie du tissu myocardique. II y a encore un debat savoir
si ce phhomene se produit la reperfusion seulement, s'il est caus par Ifisch6mie

ou s'il provient de la combinaison I-R.

2.1 .l.
L 'ischmie

L'ischmie cardiaque se caractrise par l'interruption du flux sanguin donc par une
diminution de l'apport en oxygne au niveau du myocarde. L'ischmie peut tre
globale ou rgionale, institue volontairement comme c'est le cas lors d'une chirurgie

de revascularisation ou lors de la prservation du greffon cardiaque pour une

transplantation, ou Qtre cause par une diminution du dbit sanguin suite
I'athrosclrose.

II existe deux autres conditions qui ne seront pas discutes dans cette thse mais qui

doivent tre mentionnes car elles s'apparentent I ' i s c h h i e . D'a bord l'anoxie, une

condition exprimentale qui se caractrise par une absence d'oxygne mais sans
restriction de debit, et aussi I'hypoxie, une condition o il y a une baisse de la
concentration d'oxygne sans variation de dbit, ce qui est caractristique de la vie
en haute altitude.

Concernant le degrd d ' i s c h h i e , si elle est globale. comme c'est le cas lors de la
cardioplgie avec une solution non-oxyg6ne en hypothermie, aucun substrat exoghne
n'est disponible mais I'hergie peut tre obtenue par la scission du glycoghne
endogene en lactate. Un contenu Blev6 en glycogene serait bdndfique durant des
ischmies de courte duree mais non durant celles de longue durde o le glycogdne
serait tout de mme dt5plt6 totalement et o des dommages rnyocardiques
apparatraient, exacerbes par un pH faible qui rnne l'augmentation des Bchanges
Na * l H' durant la reperfusionaO.

Lors d'une ischdmie partielle ou regionale (avec un debit r6siduel). le flux glycolytique
joue un rdle essentiel dans la gndration d'ATP. Les substrats mitochondriaux seuls

ne permettent pas une r6cupbration de la crhatine phosphate (CP),e t I'ATP gendre

seulement par la phosphorylation oxydative n'est pas suffisant pour promouvoir la
rdcupdration mdtabolique ou maintenir la fonction diastolique durant I'ischdmie
partielle r n o d & ~ e ~ ~En
@ .fait, le flux glycolytique diminue en fonction du ddbit
coronarien mme si l'extraction de glucose augmente

faible dbit, ce qui suggbre

que le dbit coronarien est I'6lment limitant lors d'ischdmie partielle.

Le dbit

coronarien rsiduel pourrait donc tre le facteur crucial qui dtermine si un

approvisionnement de glucose sera bnfique ou nfaste dans le dveloppement des
contractures is~h8rniques'~'.
Par ailleurs, l'hibernation myocardique est un tat chronique de dysfonction contractile
rgionale du ventricule gauche associ la maladie coronarienne. La diminution de la
fonction contractile rdduit la demande en oxygne du coeur dans une condition o
l'apport est faible car le debit sanguin est r6duit4".

L'hibernation myocardique est

une situation rversible avec une reperfusion normale et est parfois decrite comme
une reponse adaptative du coeur un apport d'oxygne peine suffisant pour
maintenir les fonctions biochimiques responsables de l'intgrit des cellules.

2.1.2. La repedusion
La reperfusion se dfinit par le retour d'un debit et d'une oxyghation normale au

myocarde. Lorsqu'un tissu est prive d'oxyghne, e n particulier le myocarde, le

r4tablissement du debit sanguin est un pr6-requis absolu pour la survie. Toutefois,
paradoxalement, il peut aussi entraner des ldsions du myocarde. appel6es ldsions de
r e p e r f u s i ~ n ' ~ . ~ ~C'est
. ' ~ ~ .dans les annes 70, qu'a Bt6 soulevde la possibilit6 que la
reperfusion puisse endommager les myocytes ddjd lds6es par 1 ' i ~ c h r n i e ' ~Mais
~ . ce
n'est qu'en 1983 que le concept de "16sions de reperfusion" a vu le jours2.

En effet.

la reperfusion est associbe avec une libhration d'enzymes, une augmentation

transitoire de la pression diastolique, une diminution de la contractilitd, un influx de
calcium, des alterations de la fonction rnitochondriale, des dommages aux membranes
cellulaires et marne de la ndcrose. Encore aujourd'hui, les preuves qui relient la m o n
cellulaire et les autres phdnombnes 8 la reperfusion sont faibles. Pour comprendre les
rndcanismes irnpliquds, il faudrait concentrer les efforts sur la rhalisation d'dtudes
visant uniquement une intervention au moment mme de la reperfusion.

2.2. Pathophysiologie

Le syndrome d'l-R est complexe e t multifactoriel. Les vnements biochimiques qui

ont t associs aux altrations fonctionnelles observes lors de I'l-R sont les
suivants: les mouvements de certains ions C a 2 ' , Na+, H', K + ) de part et d'autre de
la membrane cellulaire, la dgradation des substrats nerghtiques (CP, nuclotides
adnyliques), I'accurnulation de produits toxiques du m6tabolisme (ions H+, acyl-CoA)
et la production dlERO. Toutefois, ie droulement prcis de ces diffdrents
vdnements, ainsi que leur contribution respective a la pathophysiologie du syndrome
d'l-R ne sont pas encore connus avec prcision. Deux hypothses principales se

dgagent de la litterature, soient: L'accumulation massive de calcium ionise Ka2')

dans le ~ y t o s o l et
' ~la~ production
~ ~ ~ ~ d ' E ~ 0 ~ ~ , . ' Plus
~ ~ rcemment,
. ~ ~ ~ * la
~ ~ ~ . ~ ~
production d'espces ractives drives de l'oxyde nitrique ( E R N ) ~ ~a ~6t~ ~ ~ . ~
propos comme hypothse complmentaire celle des ERO.

II convient de

mentionner que les deux hypothses retenues sont toutefois interddpendantes.

2.2.1 . Hypothse du cafcium

L'homostasie du calcium intracellulaire joue un r61e significatif dans la regulation du
mtabolisme cellulaire ainsi que dans de nombreux processus physiologiques dont la
contraction. Lors d'une l'ischmie suivie d'une reperfusion, I'accurnulation de calcium
intracellulaire attribude en partie

A une augmentation des changes s6quentielles

H+/Na+ et ~ a ' l C a ~ + ' et

~ ' un mauvais fonctionnement des pompes catalysant ces
changes47t42',serait l'origine de la destruction des membranes plasmiques et

mitochondrialesl" menant Bventuellernent

la mort cellulaire1g3et ~ ' a r y t h r n i e ' ~ ~ ~ ~ ~ ~ .

Cette hypothse a et6 formule sur la base de nombreuses Btudes qui montraient le
benfice d'une rdduction de la concentration extracellulaire de calcium ii la
reperfusion' 2 6 ~89
1 etlou d'un pr6-traitement avec des antagonistes calcique^'^^*"^
avant I'ischemie, sur la sideration myocardique et l'incidence d'arythmie.

2.2.2. Hypothdse des espdces ractives ddrivdes de I'oxygdne et de /'.mie

La seconde hypothdse implique les espbces r6actives d6rivdes de l'oxygna et de
I 'azote (ERON) comme facteurs responsables des dommages cellulaires induits par

I'ischdmie et la reperfusion myocardique. Plusieurs tudes ont montr que la

dI~~~361.435.4s4
libration d l~~09.1!i.42.138,172.296.462
est un phnomne troitement li
au dbut de la reperfusion. Ainsi, une corrlation entre la production d'ER0 et la
sideration rnyocardique a 6th observe par plusieurs
modles d ' i s c h h i e de courte dure"'

auteur^^^^'^^^^^' , surtout dans des

o la ncrose est moins importante. Par

ailleurs, la relation entre les E R 0 et la ncrose n'est pas claire. Alors que la libration

d'ER0 prend une forme de cloche en fonction de la dure de l'ischmie, la ncrose

augmente de faon exp~nentielle~'~.D'autre part, le lien entre la sideration
endothliale et fa production d'RN n'a t explor6 que rcemment e t met en cause
l'atteinte du complexe recepteurs-protines G et l'activation de l'enzyme nitrique
oxyde synthase NOS)^'^. Enfin, dans un modele d'l-R, l'arythmie serait causde, du
moins en partie, par la ghration

, quoique certains auteurs rfutent

13.
cette hyp0th8se'~.~

Bien que nous reconnaissions le r6le important du calcium dans le syndrome d'l-R,
l'abondance de littrature du ddbut des ann6es 90 et la technologie

notre disposition

ont oriente nos recherches vers I'hypothse des ERON. Les prochaines sections
presenteront de faon plus d6taille la litterature pertinente

cette hypothbse

puisqu'elle est directement relie au sujet de cette thse.

2.3. Espbces i6actives derivees de I'oxygne (ERO).

2.3.1 Ddfinition

Le terme "radical libre" rdfere aux entitds chimiques possdant un ou plusieurs

Blectrons non-apparids. Le terme "espdces rdactives ddrivdes de I'oxyghne" ou E R 0
rdfdre aux entitds chimiques formees suite la rdduction monovalente de la mol4cule
dtoxyg8ne. Ainsi, la premidre Btape de cette reduction conduit a l'anion superoxyde

(O;'),

lequel peut &tre converti enzymatiquement ou chimiquement en peroxyde

d'hydrogdne (H,O,).

En pr6sence de complexes de fer, le H,O, se d6compose en

espce a tr&s fort potentiel d'oxydation, soit principalement le radical hydroxyle ('OH)

via les rdactions de Haber-Weiss (a) et de Fenton (b):

a) O;-+ H,o,-.O,+

-OH

+ OH'

b') ~ e +~ 0;'
Fe2+ + 0,
b2) ~e~~

+ H202- Fe3+ + .OH f

OH

II est noter que tous ces ERO, sauf le H,02 et I'oxygbe singulet ( ' O , ) sont aussi des
radicaux libres. Toutes ces espces chimiques ont par ailleurs une ractivit et une
toxicit trs variables e t la plupart ont une demi-vie tr&s courte. Ainsi, il est trhs
difficile de les mesurer et de les dtudier mme si leur production est permanente dans
l'organisme en raison du caractre ubiquitaire de l'O, et du fer.

Le H,O,. le O,;'

le +OH, et l''O, ont et6 impliqu6s dans le syndrome d'l-R. Plus

prcisment, la rnajorit6 des tudes in vivo et in vitro

incrimine les radicaux

hydroxyles comme facteurs contributifs b la sideration myocardique4' et le H20,

comme prcurseur du .0kflS4.D'autre part, 1'0;'serait plutt reli

il

la sideration

e n d o t h l i a ~ e,~alors
~ ~ .que
~ ~ ~quelques tudes mentionnent son implication dans les
dommages de r e p e r f u s i ~ n ~ ~ ~ * ~ ~ ~ .

2.3.2. Pn'ncipsles sources

Plusieurs sites de formation d'ER0 ont t6 dcrits, autant intracellulaires
qu'extracellulaires et varieraient selon le tissu et I'espce tudie.

Divers types

cellulaires et tissus donnent naissance A des E R 0 par des rdactions enzymatiques ou

par auto-oxydation au cours de leur mtabolisme normal et parfois en reponse & un
stimuli spcifique. Notons qu'il peut y avoir plusieurs sources differentes B l'intrieur
d'un site. Nous decritons ici les principales sources potentiellement prdsentes dans

le coeur213et nous discuterons de leur importance relative dans le syndrome d'l-R,

puisque plusieurs Bvidences montrent que des E R 0 seraient produits en grande

~ ~figure
~ * ' ~2 ' ~ ~ ~ ~ .
quantite lorsque le coeur priv6 d'oxygdne est r 6 o x y g ~ n ~ ~ ~ La
schematise les effets de quelques-unes de ces sources.

[ ~ e brane
m
basale]

Figure 2.

Sources de formation d'ERO.

Abrdviations: MPO = rny6loperoxydase, HOCI =acide hypochlorique,

Fe2+= fer ferreux.

2.3.2.1. Chaine de transport d'lectrons: En conditions physiologiques, la chane de

transport d'lectrons, situe dans les mitochondries, est la source fa plus importante
de production dtERO. Environ 2% de l'oxygne utilise par les mitochondries arobies

intactes est partiellement rdduite par des lectrons qui s'chappent des transporteurs
d'dlectrons de la chaine respiratoire, formant ainsi le

0;'12'.

Cette fuite d'8lectrons

est augmente durant l'ischmie par l'tat r6duit des transporteurs de la chane
respiratoire et davantage au dbut de la reperfusion lorsque l'oxygne est rintroduit
dans des conditions o le NADH est lev e t o il y a absence d'ADP. Bien qu'il
existe peu de preuves directes5?

il y a peu d'tudes273qui rfutent le r81e de cette

source dans la production d'ER0 lors du syndrome d ' M .

2.3.2.2. Xanthine oxydase: A M t a t normal, les tissus contiennent peu de xanthine

oxydase (XO), laquelle se retrouve principalement dans les cellules endothliales. Au
cours de I'isch6mie, l'activation d'une protine kinase cause par I'accurnulation de
calcium cytosolique ou par l'oxydation des groupements thiols, convertit la xanthine
deshydrog8nase. une enzyme qui ne produit pas de ERO. en XO. La degradation de
I'ATP cellulaire conduit l'accumulation d'hyp~xanthine~~',
qui en prdsence d'oxygdne

8 la reperfusion, est transform par la XO en xanthine. puis en acide urique. Cette

production s'accompagne de la formation d'O;'

et de ~ ~ 0 , ~Dans
' ~ .le tissu

reperfus6, la XO cytoplasmique semble tre une des principales sources de ERO, du

moins dans le coeur isole de rat4''.

II existe toutefois peu d'vidences directes290*450

du r61e de la XO dans le syndrome d'l-RI d'autant plus que la conversion entre la

xanthine dshydrogdnase et la XO serait faible et lente. De plus, la controverse

demeure dans le syndrome d'l-R cardiaque chez l'humain car quelques Btudes ont
rapport6 que le coeur possdde peu ou pas de ~

~alors~ que.d'autres
' ~ont ~

demontrd sa p r 6 s e n ~ e ' ~ ~ * ' ~ ~ .

2.3.2.3. NAOPHoxydase et mybloptoxydase:

Parmi les differents types de

leucocytes, certains granulocytes (neutrophiles et dosinophiles) e t les monocytes

(macrophages) sont des cellules phagocytaires impliqudes dans le processus
inflammatoire. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants au debut de

la reperfusion et contiennent dans leur membrane plasmique une NADPH-oxydase qui

rduit l'oxygne mol6culaire en O.';

Les neutrophiles actives sectetent aussi l'enzyme

myloperoxydase (MPO) qui catalyse la formation de l'acide hypochlorique HO CI)^^',

en plus d'induire la conversion de la xanthine d6shydrognase en XO dans les cellules
endothliales. Le rle de la NADPH-oxydase et de la MPO dans le syndrome d'l-R
cardiaque est toutefois controvers, tant donn qu'il y a tout de mme prsence de

stress oxydatif dans des prparations sans neutrophiles e t qu'il n'est toujours pas
tabli si les neutrophiles sont actives au dbut de la reperfusion ou plus tard quand
les dommages de reperfusion sont ddja B t a b l i ~ " ~ .Malgr6 cela, plusieurs chercheurs
ont propos que !es neutrophiles soient une source majeure d ' E R 0 dans le coeur
reperfusn6 principalement lors d'isch6mies prolonges ettou

2.3.2.4. Cyclo-onygdnase e t lipoxygdnase: Les perturbations du mtabolisme des

lipides, plus particulirement l'activation des phospholipases par l'accumulation de

calcium cytosolique, peut induire une liberation d'acide atachidonique qui est
rn6tabolis en prostaglandines et leucotrines durant

Cette voie implique

un transfert d'lectrons qui pourrait initier la formation de ERO, principalement 1'0;'.

par la cyclo-oxygnase et la JipoxygtSnase, bien que ce r61e dans le syndrome d'l-R

cardiaque ne soit pas bien d6fini2? II est probable que cette voie soit impliqude lors
d'ischemies svres puisque l'accumulation d'acide arachidonique dans le coeur
ischmique est un phhornhne tardif qui apparat aprds a u moins 30 minutes
d'ischmie et qui est aggrave par la r e p e r f ~ s i o n '.~ ~

2.3.2.5.

Catdcholamines:

Les cat4cholamines produites dans les membranes

cellulaires e t lib6r6es de faon importante lors de la reperfusion pourraient aussi

contribuer

une formation d'ERO. Initialement, un mecanisme d'auto-oxydation avait

6th pr0pos8~'~.mais plus rdcemment, il a Bt6 demontrd que si le phenomdne d'autooxydation se produit, il s'agit d'un processus extrmement lent'''

qui a peu de chance

d'btre implique dans le syndrome d'l-R cardiaque. L'oxydation des cat6cholamines

catalysde par une enzyme ou des metaux traces serait le mdcanisme le plus probable.

2.3.2.6. Systhme des oxydases b fonctions mixtes: Le systhme des oxydases 21

fonctions mixtes est constitu par une chaine de transport d'lectrons similaire
de la chane respiratoire rnitochondriale.

a celle

Essentiellement iocalis dans les

microsomes, ce systme comprend entre autre, des cytochrome P450 et le NADPH.

Le systme des oxydases fonctions mixtes servirait l'inactivation et l'limination
des x n o b i o t i q u e ~ ~L'Oz
~ . rnol6culaire pourrait tre activ par ce systme et tre
transform6 en substances toxiques comme l'O;'

4'9.

Bien que le rle de ce systme

ait BtB demontre dans le foie4', il ne semble pas jouer un rBle important dans le
syndrome d'l-R cardiaque,

2.3.2.7.

NADH-oxydase:

Rcemment, le rdle d'une

NADH-oxydase

non-

mitochondriale, dpendante d'une cytochrorne b558, a 8t6 mis en Bvidence dans des
microsornes de cellules endoth6liales provenant d1art8res coronaires

bovine^*^^*^'^ , de

muscles lisses vasculaires et de r n y ~ c y t e s comme

'~~
Btant une source majeure de la
production intracellulaire de O;..

Des Btudes

avaient aussi mis en

vidence une NADH-oxydase mitochondriale non-reli6e la chane de transport

d'lectrons dont 11activit6augmentait proportionnellement la gravit de I'ischdmie
dans le coeur de lapin. Selon Mohazzab-H e t collaborateur^'^^, il s'agirait de la mme
enzyme e t les vidences rapportdes laissent croire qu'elle pourrait jouer un r61e
important dans le syndrome d'l-R.

2.3.2.8.

Autres voies: L'accumufation d'6quivalents rdducteurs pendant I'ischdmie

tels que le NADH, le NADPH, le lactate, les quinones et les flavoprotines qui peuvent
r6agir entre eux ou avec I'oxyghne, pourrait induire la formation d'ERO. La formation
de meth6moglobine partir d'oxyh6moglobine produit l'O;*

'Og

trhs lentement

a pH

physiologique, mais plus rapidement 8 pH acide comme lors d'ischmie. La lyse des
hdmaties dans les capillaires libhre des d6riv6s du fer qui favorisent la production

~ ' E R O ~L'importance
.
de ces deux dernieres voies n'est certes pas trbs grande dans
des modies de coeurs isoles et perfusds sans sang o des E R 0 sont tout de mgme
observs. Par contre, la formation de meth4rnoglobine et la lyse des hdmaties sont

certes des voies de production de E R 0 non ndgligeables dans le syndrome d'l-R

cardiaque in vivo.

Les mtabolites drives de l'oxygne s'attaquent tous les constituants cellulaires

possdant un groupement nuclophile. Ainsi. les modifications structurelles des bases
puriques et pyrimidiques entranent des altrations gdntiques. De plus l'oxydation
des groupements sulfhydryles des proteines ou des enzymes par les ERO, modifie
leurs fonctions (rndtabolisrne, transport d'ions, rdcepteurs, etc.).

Finalement. en

agissant sur les acides gras polyinsaturs par un processus de peroxydation, les E R 0
altrent les propri6ts des membranes cellulaires,
compartimentation.

dont la fluidit et la

Cela modifie l'activit des rcepteurs et par consquent la

fonction des seconds messagers, en plus d'entraner la fuite des composs

intracellulaires tels la lactate ddshydrog6nase (LDH) et la crdatine kinase ( C K ) ~' .' Une
description de la peroxydation lipidique suivra, tant donne qu'il s'agit du processus
le plus d t ~ d i ' ~ " ' ~ ~ ~ ' ~ .

Les diffgrents stades de la peroxydation lipidique ont t6 ddcrits pour la premire fois
au ddbut du 19 '-'

sicle.

II s'agit d'un enchaniement de reactions radicalaires

organisees en trois phases successives: i) une phase limitante d'initiation, ii) une
phase explosive de propagation, e t iii)une phase de terminaison (figure 3).

i) Phase d'liiitiation: La phase d'initiation consiste en la formation d'un radical d'acide

gras (Le)par soustraction d'un atome d'hydrogdne (H.) un groupement mdthylbne

(CH,) l'aide d'une espece radicalaire suffisamment reactive. Par &arrangement, le

radical d'acide gras se stabilise en formant un dine conjugu.

ii)Mase de propagation: C'est une Btape d'amplification. se ddveloppant en presence

d'O,,

dont la concentration dans les tissus et le sang est toujours largement

suprieure celle ndcessaire. 1'0, se fixe sur le radical d'acide gras pour former wi
radical peroxyle (LO;).

qui lui-m8me rdagit avec un acide gras (LH) adjacent formant

un hydroperoryde (LOOH) et un nouveau radical lipidique (L,) qui propage la rdaction.

Initiation:

Propagation:

CH

+ initiateur

L + O2

Terminaison:

--+ LOOH + L-

L O+
~ ~0,-

Loi+ L.
L+L.

Figure 3.

~ 0 ~ -

-b

LOi+W

L. + H.

----b

LOOL+ O,

LOOL

LL

Processus de lipoperoxydation
Abrviations: LH = acide gras,

L*= radical

lipidique. LO;

= radical

peroxyle, LOOH = radical hydroperoxyde. LOOL et LL = compos6s

staMes.

Les hydroperoxydes rdagissent soit avec des mtaux ou soit avec l'O;-,

pour former

des aldhydes toxiques et d'autres radicaux libres qui entretiennent la raction par un
phnomne auto-catalytique.

Les aldhydes dont

I'hydroxynonnal et le

malondiald6hyde (MDA) pour nommer les plus importants, peuvent ainsi ragir avec
les divers constituants cellulaires et propager les dommages initialement induits par
les E R O " ~ .

iii) Phase de terminaison: Cette dernire Btape consiste en la formation de cornpos6s

stables issus de l'association de deux espces radicalaires.

La probabilit de

rencontre de deux radicaux libres est beaucoup plus faible que la probabilitg d'une
interaction E R 0 et acides gras polyinsaturBs car ces derniers ont une concentration
sup6rieure. Ainsi, la phase de terminaison ne peut survenir qulapr&s un certain temps
qui, bien que bref, n'en est pas moins suffisant pour que des lsions molculaires se
soient djB produites.

2.3 -4. Systrnes de protection

Un antioxydant peut tre defini comme n'importe quelle substance qui prsente

faible concentration comparativement A un oxydant peut ralentir significativement ou

inhiber l'oxydation d'un substrat.

Les antioxydants sont donc des rnol6cules qui

peuvent prevenir la formation dtERO1 ou peuvent r6agir avec ces derniers pour les
neutraliser. Les termes "antioxydants" et "pidgeurs de radicaux libres" sont utilis8s
alternativement pour dcrire les differents systmes de protection.

Dans des conditions a&obiques, le myocarde survit

la production continuelle de E R 0

grgce I'bquilibre entre la production d'oxydants par les differents s y s t h e s

cellulaires et le maintien des d6fenses antioxydantes. Cependant, durant I'ischdmie,
le myocarde est partiellement ddpldti de ses rdserves antioxydantes e t
reperfusion,

la

cause de Itarriv6e massive d'oxygdne, la production d'ER0 est

augmente, diminuant encore plus les rserves antioxydantes endogenes du ~ o e u r ' ~ ' .
En fait, le coeur subit des dommages durant la reperfusion dont 116tendue est trbs
dependante de I'efficacitd des ddfenses antioxydantes.

Le dbalancement entre l'activit des systmes de protection ou de d6fense et la

production d'ER0 entrane un stress oxydatif qui peut dclencher une raction
inflammatoire et ainsi affecter la fonction e t le metabolisme cardiaque4. C'est ce qui
se produit lors du syndrome d'l-R ou le stress oxydatif apparat dans une situation o
Is glutathion oxyd (GSSG) s'accumule plus vite qu'il est rntabolis en glutathion
rdduit (GSH). En fait, la cellule peut tolrer un certain niveau de stress oxydatif,
cependant dans les cas les plus s6vres, elle subit des dommages importants qui
peuvent mener la mort.

Pour se dfendre des attaques radicalaires. l'organisme possde deux grands

s y s t h e s de defense. Les systmes enzymatiques iTableau 1 ) et les systrnes nonenzymatiques (Tableau 2 ) existent et fonctionnent de faon complmentaire et
synergique selon une compartimentation bien prdcise pour proteger les cellules contre
les mtabolites cytotoxiques de l'oxygne (figure 4 ) .

Tableau. 1. Principaux systames de ddfenses enzymatiques

-

Antioxydants

- -

Fonctions

Superoxyde dismutase

Dismuter l'anion superoxyde en peroxyde

(SOD)

d'hydrogne: (O;*-

Catalase (CATI

Rduire le peroxyde d'hydroghne en eau:

O,

+ H,O,).

(H202- H 2 0 O,).
Glutathion peroxydase

RBduire le peroxyde d'hydrogbne en eau: (H,O,-

(GSHpx)

H,O +GSSG) e t les hydroperoxydes en acide

hydroxyle: (LOOH-LOH

+ GSSG).

Glutathion reductase

Rdduire le glutathion oxyde en glutathion rduit

(GSHrx)

(GSSG-GSH) en prsence d'un CO-facteur, le

NADPH.

Tableau 2. Principaux s y s t h e s de dfenses non-enzymatiques

Fonctions

Antioxydants

Transferrine, cruloplasmine

Squestrer des ions mtalliques

et albumine
Histidine

Piger les radicaux hydroxyles et l'oxygne

sinaulet

Taurine

Piger l'acide hypochlorique (HOCI) et les

radicaux hydroxyles

Ubiquinone

Prvenir la peroxydation lipidique

Flavonodes

Prvenir ta peroxydation lipidique et sdquestrer

des ions mtalliques

Vitamine E (tocophdrol)

Piger les radicaux peroxyles et I'oxygne

sinaulet

Vitamine C (acide ascorbique)

Recycler le radical tocophryl en tocophdrol

Beta-carothne

Pieger l'oxygne singulet

Glutathion rdduit (GSH)

Co-enzyme du glutathion peroxydase, pidgeurs

de radicaux hydroxyles et d'oxygdne singulet

2.3.4.1. Les systmes enzymatiques: Plusieurs types de SOD sont decrits dans la
littrature: une forme mitochondriale, soit une metalIo-protine contenant du
rnanganese son site actif, une forme cytoplasmique contenant du cuivre et du zinc
et une forme extracellulaire de S O O ~ ' ~Les
. diffhrents types ayant tous comme rdfe
principal de pidger les

O;'.

Aussi, la CAT est une enzyme principalement localisde

dans le cytosol qui agit en degradant le H,O,

comme la GSHpx cytosolique, une

m6tallosnzyme contenant du sdinium. Par ailleurs, la GSHrx est trs importante, car
elle regdndre le GSH oxyde par la GSHpx en GSSG (Figure 5). 11 semble donc
qu'aucun des systbmes enzymatiques ait spcifiquement pour cible les -OH. De plus,
bien que 11activit6de la GSHpx soit relativement elevde dans le coeur, 11activit6 de la

SOD y est environ quatre fois moins Blevde que dans le foie e t celle de la CAT y est
trds faible"'.

LO , LOO

Vitamine E xamine

NADH
ascorhate
reductase

LOH, LOOH

Vitamine C

Vitamine E.

NAD

1
GSH

Ubiq~iinol

Glutathion rdductase

Ubiquinone

Figure 4.

Vitamine E

GSSG

Compldmentaritd et synergisme des molbcules antioxydantes

Abrdviations: LOS= radical alkoxyle, LOO.= radical peroxyle, LOH = acide

hydroxyle, LOOH = hydroperoxyde

LOOH

reductase

LO H

Figure 5.

Cycle du glutathion
Abrdviations: LOOH = hydroperoxyde, LOH = acide hydroxyle.

2.3.4.2. Les systdmes non-enzymatiques: D'une part, la transferrine, l'albumine et

la cruloplasmine sont des protines de poids molculaire lev prsentes en grande

quantit dans le sang o elles squestrent les mtaux (fer, cuivre) qui catalysent les
ractions d'oxydation. D'autre part, certains acides amins qui circulent aussi dans
le sang peuvent pntrer dans le milieu intracellulaire o, en plus de servir la
synthse des protines. ils peuvent exercer un effet antioxydant.

Par exemple,

l'histidine, un pr6curseut du glutamate, exerce ses proprits antioxydantes comme

pibgeur d"0, et de .OH et protkge le coeur du syndrome d'l-R via ses multiples effets
d o s e - d 6 p e n d a n t ~ ~. ' ~La. ~taurine,
~~
un produit du mtabolisme de la cystine, est
prsente en grande concentration au niveau intracellulaire bien que son rle
physiologique ne soit pas clairement tabli. Elle influence la contractilite cardiaque
en modulant les flux de Na' et ca2+le'et protge des effets des neutrophiles en
piegeant les HOCI originant de la MPO~~'.

Par ailleurs. I'ubiquinone. aussi appel coenzyme

O,,, est un constituant naturel de

la chane respiratoire mitochondriale qui a dmontre des proprits antioxydantes

d'abord in vitro sur des cellules cardiaques animales

puis plus r6cemment.

dans divers rnodles animaux d'l-R cardiaque13~247.277*458

. Chez l'humain. un traitement
I'ubiquinone avant une chirurgie cardiaque a permis de diminuer la peroxydation
lipidique et la ncrose durant et aprgs la p6riode d'ischmie".

Bien que le mecanisme

d'action de l'ubiquinone ne soit pas connu, il a 6th propose que la forme r6duite
pourrait agir en pidgeant des radicaux lipidiques ou directement des especes
radicalaires impliqu6es dans l'initiation de la peroxydation lipidiqueaa. II s'agit, en fait,
du seul antioxydant lipidique synthktis de faon endogbne.

Les flavonodes constituent une famille de composds provenant des plantes et ayant
divers effets. L ' i n t W t pour la recherche sur les flavonodes vient en partie du
paradoxe franais. En effet. il a Bt6 demontrd que le vin rouge, consomm6 en grande
quantite par les Franais exerait un effet cardioprotecteur encore plus important que
les autres types d'alcool.

En fait, le vin rouge est riche en compos6s phdnoliques

comme le trans-resveratrol qui fait partie de la famille des f l a v ~ n o d e s ~ ~Ce

~~~'.

compos, ainsi que la quercetine aussi prsente dans le sang mais en moins grande
quantite, ont des effets sur l'agrgation plaquettaire, la synthse de thromboxanes et
d'autres drives nfastes des leucotrines. Des tudes in vitro chez l'animal ont
dmontr des effets cardioprotecteurs de certains flavonodes, possiblement via leurs
proprits a n t i o x y d a n t e ~ ~ ~ ' ~ ~ ~ ~ .

Les vitamines qui proviennent de l'alimentation se retrouvent dans le sang, mais aussi

liees aux membranes dans le compartiment intracellulaire.

Alors que l'acide

ascorbique est hydrosoluble, le tocoph6rol ainsi que le bta-carotne sont liposolubles

e t se dplacent lies diff8rentes formes de transporteurs. Plusieurs dtudes, autant

in vivo, qu'in vitro ont dmontr les effets antioxydants du tocophero1'4~18~54~111*'90~340,

et dans une moindre mesure, de I'acide ascorbiqueJ4' et du b t a - ~ a r o t n e " ~ . ~ ~Ils
'.
agiraient tous les trois en interrompant des rdactions en chane impliqu6es dans la
peroxydation des lipides.

Prlsent dans le coeur, le tocoph6rol agit de faon

synergique avec la vitamine C qui rdagit avec le radical tocophdryl pour regendrer le
tocoph6rol. L'administration d'acide a s c o r b i q ~ eou
~ ~du~ b* &
~ a~- ~c a r ~ t & n elors
~ ~ de
~
la squence 1-R pourrait par contre avoir des effets nfastes dans certaines
conditions.

E n outre, toutes les cellules de l'organisme, incluant les cellules cardiaques

contiennent des niveaux Blevds (0.5-10 mM) de GSH, un tripeptide qui joue un rdle
important comme antioxydant endogene et dans le maintien de I'lquilibre d'oxydordduction. En fait. le GSH participe 1'4limination du H,02et des LOOH, en servant
de CO-substratB l'enzyme G s ~ p x " ' . Le GSSG forme par cette premiere reaction est

de nouveau r6duit en GSH par la GSHrx, une enzyme qui utilise le NADPH comme
cofacteur. Un statut 6levd en GSH du myocarde est associd une diminution de
l'tendue de l'infarctus et une rdcup&ation precoce des fonctions contractiles du
myocarde isch6mique3".

Enfin, le GSH peut inhiber la peroxydation des lipides et

seav8reefficace comme piegeur direct de certains ERO, tels les -OH e t

'o,~'~'~?

Bien que le GSH soit synthdtis6 dans le cytosol, on en retrouve une grande quantite

dans la mitochondrie.

La libration de GSH des organes isolbs et perfuss origine

largement du compartiment cytosolique et peu de la mitochondrie. En fait, le rle du

GSH cytosolique est bien dfini puisqu'il agit dans le transport, la catalyse et la

protection contre des composs toxiques endognes et exog8nesZS3alors que le GSH

mitochondrial, moins bien dfini, semble agir presqu'exclusivement contre le stress
o~ydatif~~'.

2 -3.5. Mdthades d'dvaluation ou de ddtection des ER0

La

spectroscopie

par

rsonance

paramagnetique

lectronique

(EPR),

la

chromatographie fiquids haute performance (HPLC) et la chimiluminescence sont des

techniques utilises pour la detection directe des ERO, alors que la mesure des
produits de la peroxydation des lipides est une mthode d'6valuation indirecte de la
production de ERO.

2.3.5.1. PR: A l'origine. la technique de EPR qui fournit des spectres de rsonance,
etait appliqude sur des homogdnats de coeurs prdalablernent congels2491462.
Cette
methode a t critiquee du fait que certains spectres de resonance ne seraient pas
dus 8 des ERO, mais plutt Ci la conglation et
tissu4".

la manipulation mcanique du

Aussi, cette methode ne permet qu'une mesure par coeur.

A un temps

prdd~termin6"~.Depuis quelques ann6es. la technique EPA est sunout appliqube sur

1
coronarien9.'5.34.42.1
36.250.353.41 3
OU SUI des cellules en
, auxquels
un agent qui sert B pidger les dlectrons non-apparies (ESR:"electron spin resonance

spectroscopy") est ajout& stabilisant les ER0 et rendant la methode plus spcifique.
L'utilisation de 5,5-dimdthyl-pyrroline-N-oxyde (DMPO) permet en effet de piger les
*OH, mais cet agent pourrait simultandment rduire la vulndrabilite des coeurs

l'arythmie4?

Aussi, les Bchantillons doivent tout de mdme Btre purifies et/ou

congelhs et une production an6factuelle de E R 0 a BtB rapp0rt6e~'~.de mme que la

toxicit6 in vivo des agents pidgeurs B concentrations 6 1 e v ~ e s ~ ~ . ~ ' ~ .

2.3.5.2. HPLC: Aprds une purification (extraction ou filtration) des produits de

I'hydroxylation de substances aromatiques dont le salicylate, servant d'index de la

production de .OH (2,3-dihydroxybenzoate. 2.5-dihydroxybenzoate). sont mesurs par

~p~c27.200.317.397.398.411

L'acide salicylique (2-hydroxybenzoate) est ajout au tampon

de reperfusion et sert piger les .OH. Ceae technique serait beaucoup plus sensible

que I'EPR dans la dtection d'-~+i'~~~~''.

2.3.5.3. Chimiluminescence: La chimiluminescence est une technique sensible, non

invasive qui peut servir a Bvaluer la gdndration de E R 0 en c o n t i n ~ e " ~ . Pour la
chimiluminescence a faible niveau, la lumiere est gdnrde par 1'8mission d"0, et via
des intermdiaires de la peroxydation des lipides. Pour la chimiluminescence niveau
leve, une substance fluorescente (le luminole ou la lucignine) mettant de la
lumihre lorsqu'elle est oxyd6e. est ajout6e la preparation pour amplifier le signal8.
Cette technique n'est toutefois pas spcifique

une esphce radicalaire bien que la

lucigdnine soit trs sensible B l'O;*.

2.3.5.4. Mesure des produits de la peroxydation des lipides: Les mthodes utilisees
pour la mesure des produits de la peroxydation des lipides dosent soit les dienes
conjugus, les hydroperoxydes lipidiques, les alcanes de l'air expir ou les alddhydes.
La methode la plus populaire, bien que non specifique, demeure le test d l'acide
thiobarbiturique (TBA ou TBARS) qui sert quantifier le MDA, un des alddhydes
produit lors de la peroxydation lipidiqueleg. Cette methode utilise soit la technique de
spectrophotom&rie qui est non specifique et peu sensible ou soit la technique de

HPLC qui amdliore la spcificit et la sensibilit. Plus rdcernment, des rn6thodes plus
specifiques de dosages de divers aldehydes issus de la lipoperoxydation utilisent la
chromatographie gazeuse coupMe

la spectrom6trie de masse (GCMS)~'.

2.4. E s p h t s rdactives ddiivdes de l'oxyde nitrique (RN)

2.4.1 Historique
Bien que l'oxyde nitreux (N,O) ait BtB introduit dans la pratique clinique en anesthdsie

il y a plus de cent ans, ce n'est que vers la fin des annees 80 et surtout au ddbut des
annees 90 que l'intrt s'est accru pour l'oxyde nitrique (.NO). Les effets sur le coeur

de cette molcule hydrosoluble ont Bt rapports pour la premire fois par Furchgott

et Zawadzki en 1 9 8 0 ' ~ ' .qui l'avait nomm EDRF ("endothelium derived relaxing
factor"). Depuis, certains auteurs ont dmontr qu'il s'agissait du NO^^^^^^^, mais
d'autres recherches proposent qu'il s'agit plutt d'un ~ - n i t r o s o t h i o l ~ ~Dans
~'~~.
l'ensemble, les recherches ont progress rapidement puisqu'i! a t dmontr que le
.NO est synthtis dans plusieurs types cellulaires et qu'il contrle et influence de

nombreux processus physiologiques critiques5'.

2.4.2. Synthse et r4gufation du .NO

Le *NO rsulte de la conversion du L-arginine en L-citrulline une raction catalyse par

l'oxyde nitrique synthase (NOS), une enzyme du cytochrome P45O qui agit l'aide
de cofacteurs tels le NADPH, l'O,,

le ~a~*/calmoduline,
le ttrahydrobioptrine (H,B),

la flavine adhine dinucldotide (FAD) et la flavine mononucl6otide (FMN)~"'(Figure 6).

II existe trois types d'isoenzymes de la NOS, soit la forme neuronale (nNOS; type I),

la forme inductible (iNOS; type Il) et la forme endothliale (eNOS; type III). Ces trois
isoenzymes diffhrent par plusieurs traits caract6ristiques incluant leur expression
(constitutive ou inductible), leur distribution subcellulaire et leur dependance au
calcium et la calmoduline.

La synthdse du .NO apparat dans differents types cellulaires et tissus, incluant

I'endoth6lium vasculaire, les plaquettes, les macrophages et les cellules neuronalesz30.
En outre, un coeur normal synthtise le -NO via la NOS prdsente dans l'endoth6lium
coronarien et dans les rnyocytes.

Plusieurs agents peuvent augmenter la

concentration intracellulaire de calcium, laquelle induit l'activation de la NOS. De

plus, I'endothdline-1 (ET4 ), un peptide produit par I'endoth8lium, induit la Iiberation
de facteurs de relaxation comme le -NO et les prostacyclines partir des cellules
endoth6liales.

En conditions pathologiques, l'ET-1 endogne agit comme un

vasoconstricteur car il semble que le mecanisme regdateur de production e t de

libdration de -NO et de ET-1 puisse avoir et6 d6truit si I'endothdliurn est
end0mmag6~'~. II existerait un mecanisme de r6troaction r6ciproque de synthdse
entre les vasoconstricteurs et les v a s o d i ~ a t a t e u r s ~Selon
~ ~ . plusieurs auteurs, la

Actylcholine

ATP
Norpinephrine

Icellule endothliale
Ca 2'lCalrnoduline

cibles

Figure 6.

Synthse et rdgulation du 'NO

Abrdviations: NOS =oxyde nitrique synthase, H,B =t6tra hydrobiopterine

libration de .NO par l'endothlium des coronaires serait rduite dans quelques
~ ' que
- ~ ~ ~
conditions pathologiques incluant I'athrosclerose e t le syndrome d ' l - ~ ~, bien
d'autres aient mesur une augmentation de la libration de .NO dans les premires
secondes de r e p e r f u ~ i o n. ~II~semble
~ . ~ ~ que
~ lors d'ischdmies de courtes dures la
formation de .NO provienne de la NOS, alors que si Itisch6mie est longue et progresse
vers la ndcrose, la formation de N O viendrait de la dcomposition du nitrite
tissulaire435. D'autre part, l'expression de la NOS inductible nomd6pendante du
calcium ionique, apparatrait dans les myocytes de coeurs humains dfaillants e t
pourrait tre implique dans certaines pathophysiol~gies'"*~~~.
Ainsi, differents types
de stress pourraient tre responsables de l'expression de la iNOS qui est indtectable
dans le myocarde non-dfaillant.

En plus du .NO, les recherches ont mis

jours au moins trois formes rdactives

derivees de l'oxyde nitrique soit le peroxynitrite (ON003, le dioxyde nitrique ou nitrite

(NO,') et le nitrate (NO,').

un pH de 7.4, le ONOO' serait tr&s instable et rgagirait

rapidement avec des residus tyrosines sur les proteines pour former le nitrotyrosineUg
ou serait proton6 en acide peroxynitreux qui se rearrange en NO3' ou se dcompose
en NO,' et OH^^'.
2.4.4. Fonctions

L'effet protecteur ou dldtre du .NO n'est pas clairement tabli dans le coeur.
Beaucoup d'btudes utilisent des methodes indirectes, avec le ~ - a r g i n i n e ~ ~ ~ * ~ ~
ou des inhibiteurs de la

NOS^^^.^^^^^^*^^^ pour demontrer l'effet du 'NO. Selon les

modeles (coeur ischdmique ou normal) &udids, certains auteurs lui confrent un effet
plutt protecteur209.Z20.282.362+436.~2.~6, a(Ors que d*gUtreS21.97.J61.454 le croit nocif.
Aussi, durant le phhomene d'l-R du myocarde, les cellules souffriraient, selon
certains auteurs, d'une Iibdration dficiente de

NO^^^*^^^*^^ , alors que d'autres

rappcrtent une augmentation marqude de -NO A la r e p e r f ~ s i o n ~ ~ ~ .

Le principal mecanisme d'action du -NO est une reaction avec des ptotdines e t des

enzymes contenant du fer etlou un groupement thiol ( ~ e - s ) ~ ' 'Par

. ce m6canisme. le
.NO exerce diverses fonctions au niveau du systme cardiovasculaire tels que la

rgulation du dbit coronarien, du tonus vasculaire et de la contractilit myocardique,

le maintien de l'intgrit de I'endothlium vasculaire, l'inhibition de l'agrgation et de
l'adhrence des plaquettes et des neutrophiles. De plus, le -NO semble exercer une
modulation mtabolique via, par exemple, l'inhibition de I'aconitase, une enzyme
importante du cycle de Krebset avoir un effet antioxydant ou pro-oxydant selon les
circonstances 230.275 . La fonction de rgulation du dbit coronarien sera labore
davantage puisqu'elle est directement implique dans ce projet de recherche.

2.4.4.1. RBgulstion du ddbit coronarien: II est gnralement accepte que le .NO

rgule le debit coronarien par la stimulation directe de la guanylate cyclase soluble
(sec), une protine contenant du fer hmique, qui catalyse la formation de guanosine3',5'-monophosphate cyclique (cGMP), un second messager action vasorelaxante
dans plusieurs systmes b i o l o g i q ~ e s ~ ~ ~ ( ~7).
i g uCette
r e fonction du +NOa Bt6 valu
dans diffrents mod8les. principalement in vitro en utilisant des donneurs de .

ou des inhibiteurs d e . ~ 0 " * ~Cependant,

~~.
le r61e du .NO dans la regdation basale du
dbit coronarien a t6 rcemment remis en question par une tude dans le coeur isol
de chien perfusd avec une solution sanguineJ5'. II semble que cette disparit puisse
provenir d'un effet de pression relie au type de solution et/ou de l'espce animale
utilise.

Par ailleurs, plusieurs Btudes ont montr que le

.NO provenant de

l'endothlium est un des facteurs impliqus dans le mcanisme dlhyper&nie reactive

rnyocardiale qui suit une interruption transitoire du debit sanguin coronaire40~235~4'8~460.

2.5. Interactions ER0 et ERN

Les interactions multiples et complexes entre les ERO. et le -NO seraient
~ ' ~ 8).
~ ~Lors
~ ~de~la' reperfusion,
* ~ ~ ~
determinantes dans le syndrome d ' l - ~ " ~ ~ figure
en presence d'O;-,

le .NO pourrait tre transform en ONOO- qui se d6compose

NOS

VASODILATATION

AGGRGATION

Dbit coronarien

Figure 7.

Rdgulation du ddbit coronarien par k NO

Abrdviations: NOS = oxyde nitrique synthase, sGC =guanylate cyclase
soluble, cGMP = guanosine-3' ,5'-monophosphate cyclique.

ultrieurement en - 0 ~ ~Les
~ vidences
' .
exprimentales ce sujet sont de plus en
plus nombreuses bien que souvent indirectes et controverses2'~278~320~328~429.
Rcemment, dans diffrents modles in vitro de coeurs isols, la formation de ONOO'
a t mise en v i d e n ~ e ,~bien
~ ~que
* ~celle-ci
~ ~ * n'ait
~ ~ pas
~ encore t dmontre de
faon directe in vivo. Aussi, il a 6th propos que la NOS pourrait elle-mme produire

10
' ;- en plus du -NO en condition o le L-arginine est faibleas. De plus, il est connu
que des cellules endommages librent du fer qui est disponible lors de la priode de
reperfusion pour convertir les 0;-et les H202en -OH. Ce dernier peut exacerber les
dommages e n d o t h 6 l i a ~ x 'et
~ ~modifier la production de N O .

Puisque le ONOO'

oxyderait les composs sulfhydryles cent fois plus vite que le H,O,, il est propos que
cette raction soit un mcanisme important de la toxicit des E R N ~ ~ ' ,OU un
mecanisme par lequel le .NO est mis en rserve sous forme de S-nitrosothiols et
relgch sur une priode prolongeu8.

En outre, lorsque le -NO rdagit avec des thiols rdduits, il y a production de radicaux
intermdiaires, puis de S-nitrosothiols capables comme le N O , de produire une
vasodilatation. Cependant, il existe une controverse

savoir si la raction entre

le

-NO et les mol6cules contenant des groupements sulfhydryles produit vraiment des
nitrosothiols dans des conditions anarobiques,

pH

II semble que la

'~
prsence d'oxyghe et de mol6cules accepteuses d'lectrons soit n 6 ~ e s s a i r e pour
que la raction se produise. Par ailleurs, certaines Btudes ont propose que te .NO
pourrait servir de pi6geur d'02--116*350
. Enfin, l'effet nBfaste du NO,' qui oxyderait le

GSH tissulaire par un mdcanisme temps-dpendant a Bti5 dmontre par certaines

c tu des'^" Finalement, d'autres ont montrd que la nitrosation du GSH ou d'autres

compos6s possddant un groupement thiol par le NO, causerait plut& une relaxation
par un mcanisme impliquant la production de .NO et la stimulation de SGC'".

2.5.1 Evdences exphimentates reliant les ERON au syndrome d'/-U

Dans les annees 70, Hearse et ses

ont demontrd que la

rintroduction de I'oxygdne A un coeur hypoxique etait accompagnde d'une alteration

rapide e t profonde du tissu, Bvalude par la libdration d'enzymes cytosoliques et des

-Pyrogallol

Inactivation

SOD

ONOO

ONOOH

NO;

-Lipoxyghase
-Cytochrome PldO

-Catalase
4SHpx

-xo

-Rx Haer-Weiss/Fenton 9 M S O
-6radykinine
-Mannitol
-dferoxarnine

SOD

Figure 8.

Interactions ER0 et RN

Voies: connues +, proposdes -B

AbrBviation: TxA, = thromboxane A,, ONOOH = acide peroxynitreux,
OMS0 =dirn6thylsulfoxide

changements ultrastructuraux. Au debut des anndes 80, des chercheurs ont note
qu'il existait plusieurs voies de production des E R 0 dans diffdrents tissus (voir section

2.3.2.)'incluant le coeur347. Comme la plupart de ces sources radicalaires pouvaient

Btre activdes durant la reperfusion aprds une p6riode d'ischdrnie. il fut propose que
les E R 0 puissent contribuer

la mort ceilulaire observde dans le syndrome d ' M .

Cette hypothhse implique que ce n'est pas I'isch6mie en soit qui entrane la mort
cellulaire, mais plutt la rintroduction de Itoxyg8ne la reperfusion.

Ainsi, plusieurs Bvidences exprimentales supportant le rle des E R 0 dans I'infarctus

du myocarde sont basdes sur la capacitd de molcules prsurnment antioxydantes
rdduire les dommages dans des modeles d'l-R myocardique. Plusieurs antioxydants
ont t6 utilisds, autant durant Itisch8mie que la reperfusion, pour tenter de prvenir
ou corriger les dommages d ' M . Le Tableau 3 &urne

quelques-unes de ces Btudes.

L'action de certains agents antioxydants sera davantage documentde dans la section

3.1.1.1

.. Malgr6 le grand nombre d'dtudes in vitro rdpertorides sur le sujet avant le

debut de ce projet de doctorat'a~3*257~25e~20'~3a~~W1

, le rdle de la thdrapie antioxydante
dans la sequeme isch6mielreperfusion in vivo avait Btd peu 6 t ~ ~ d i B " * ~ ~Chez
'.
l'humain, avant 1992. il n'existait que des Btudes Bpid6rniologiquas sur la
consommation de vitamines antioxydantes, principalement la vitamine E et le risque
de MCV"'.

Plusieurs raisons peuvent expliquer les rdsultats divergents obtenus dans ces Btudes
et le succs mitigd de la thdrapie antioxydante dans la prdvention du syndrome d'l-R:

1)

Les modles d'dtudes (organelles cellulaires, myocytes isoles, coeurs isols),

les esphces animales (rat, chien, cochon, lapin, etc.I3" et les paramdtres
mesures sont trds variables et parfois difficilement comparables.

A titre

d'exemple, mentionnons la taille de l'infarctus qui est mesurde aprhs une

durde lirnitde de reperfusion, quoiqu'elle varie grandement dans les 24h suivant

ta reperf~sion"~;

rdants &tu
-

Esphce
dtudide

----

---

M o m e n t de l'intervention
-

Lapin

Hypoxielrepertusion

Reperfusion

Augmente la libdration de CK

Juste avant reperfusion

Ne diminue pas la taille de

SOO et CAT
(Convertissent les O, en H,O, et en

Chien

Al!opurinol
(Inhibiteur de la XO1

Chien

18h avant
l'occlusion +bolus 6 min
avant I'occlueion

Diminue la taille de l'infarctus

Rat

Avant e t aprds I ' i s c h h i s

A m d i o r e la fonction
cardiaque et diminue le COH

Lapin

Juste avant reperiusion

Maintien la CP et l a fonction
myocardique

Rat

Prdservationfreperfusion

A m d i o r e la rdcupdrstion
fonctioniielle

I'inferctus

Rat

Prtiservationl
reperfusion

Pr~aervationlreperfusion
-

Chien

fonctioniielle

Diffdrents moments

AmBliore l a r d c u p h t i o n
fonctionelle si donne avant
l'occlusion o u juste avant
reperfusion et pendant
reperfusion. Diminue .OH si
administre juste avant la
reperfusian.
N8em6liorepas l a fonction
cardiaque

Rat

Prdservationlreperfusion

Pendant Vintusion de
solution cardiopltigique
pour I'arrbl du coeur

Humain

angioplastiereperfusion

Avant l'angioplastie et
aprhs pour plusieurs
mois

2)

La th6rapie antioxydante semble efficace seulement contre les dommages

rversibles. Toutefois, l'infarctus qui est la situation clinique la plus courante

a une composante irrversible importante;

3)

11 semble crucial que t'intervention ait lieu immdiatement au moment de la

reperfusion334~460,
puisque c'est ce moment qu'il y a le plus d'8vidences
d'une production augmenthe d a ~ 0 4 ' ;

4)

S'il est relativement simple d'accrotre le potentiel antioxydant extracellulaire,

le renforcement des antioxydants intracellulaires pose des problmes puisque
la plupart des molcules ont un poids molculaire trop 4 e v pour traverser la

membrane et s'attaquer aux sites de production intracellulaires des ERO*'~.

En combinant la SOD ou la CAT avec le polythylne glycol ou en les
encapsulant dans des liposomes, ii est possible d'amliorer l'accs
intracellulaire. Cependant, bien que ce genre de traitement s'effectue sur
l'animal, il reste Stre valu chez l'humain;

5)

Mme avec des molcules antioxydantes qui pntrent facilement la

membrane plasmatique tel que le N-actylcystdine (NACI, I'efficacite du
traitement est incertain, etant donn la ractivite extrame des E R 0 tel le 'OH;

6)

Dans plusieurs dtudes, l'effet bndfique de substances prdsum6ment

antioxydantes sur la fonction rnyocardique est rapport6 sans que soit Btablie
une relation de cause effet. II y aurait eu lieu de documenter simultanment
la diminution de la production des E R 0 et les bndfices pour la fonction dans
une mgme dtude. Par exemple, des effets bdn6fiques de I'allopurinol ont dt6
maintes fois rapportes, bien qu'il ne soit pas prouvd hors de tous doutes que
la XO ait un r8le dans la pathophysiotogie des dommages de reperfusion
myocardique. Certains chercheurs remettent mame en question la ptdsence
de cette enzyme dans le myocarde humain92.106.146.t

7)

Certaines techniques utilisees pour valuer la production d ' E R 0 ou leurs effets,

dont le test TBA, donnent des rsultats artfactuels et sont controverss' 50v'89.

Finalement, le syndrome d'l-R est un phnomne multifactoriel dont la prvention ou

le traitement

n6cessite vraisemblablement plus qu'une

simple

intervention

antioxydante. Puisqu'il est difficile d'identifier quels types d'ERON sont impliqus, il
est aussi trs difficile de choisir le type d'antioxydant adquat pour protger le coeur.
De plus, il est bien connu que l'ischmie diminue le statut nergtique du coeur, ainsi
une thrapie combine (antioxydant et substrats dnerg6tiques) aurait avantage tre
propose.

3.1 Gnralits

La therapie antioxydante ne s'avre qu'une des nombreuses approches envisagees

pour la protection du myocarde ischmique et reperfus. Au cours des dernires

annes, l'amlioration des techniques chirurgicales a grandement contribu rduire
les statistiques de mortaiit et de morbidit relies aux accidents cardiaques. De plus,

plusieurs autres interventions sont propos6es pour proteger le coeur des dommages
ischrniques et/ou amliorer la rdcupration fonctionnelle des coeurs ayant subi une
priode d1isch6mie. Ces interventions peuvent tre utilises autant pour les patients
devant subir une intervention chirurgicale que pour ceux souffrant de maladies
cardiaques de type ischdmique, telle l'angine.

Dans le cas d'ischmie prdcedant ou reliee

une chirurgie, ces interventions sont

effectues soit au moment ou se produit la priode d'ischmie (lors de la prservation

du coeur dans les cas de transplantation, ou durant l'arrt cardiaque associ toutes

chirurgies}, et/ou lors de la reperfusion du myocarde.

3.1 .1. htewentions nutntionne/les

Les interventions nutritionnelles se rapportent

l'administration de substances

retrouves normalement dans l'organisme ou leurs prcurseurs.

La strategie

nutritionnelle vise maximiser les rserves antioxydantes du coeur et arndiorer le

mtabolisme nergtique de la cellule myocardique.
3.1.1 .l.
Les arrtiorydants: Tel que mentionne prc6demment. les antioxydants sont

necessaires pour prdvenir la formation et s'opposer l'action des ERON, lesquels

causent des dommages

l'ADN, aux lipides, aux protines et

A d'autres

biomol6culestS3. Une des stratdgies nutritionnelles consiste fournir au coeur des

substances antioxydantes naturelles ou leurs pr6curseurs des le debut de la
reperfusion et si possible, avant l'ischmie, pour augmenter les rdserves en vue de
pidger les E R 0 ou interrompre les rdactions en chabe.

Parmi les antioxydants

naturels, mentionnons les vitamines E et C, les carotnodes, I'ubiquinone e t les

flavonodes. Puisqu'il a dj t question de ces antioxydants (section 2.3.4.), les
paragraphes suivants porteront sur le GSH e t un de ses prcurseurs, soit le NAC qui
ont t utiliss lors du pr6sent projet de recherche.

GSW

Tel que mentionn pr&&dernment, le GSH joue un rle important dans le

maintien de Wquilibre d'oxydo-rdduction des cellules.

Le GSH exogne ne peut

facilement dtre capt par la cellule. Par contre, il peut tre synthtis dans la cellule

partir de la L-cystbine, de la glycine et du glutamate. Pour augmenter les rserves

tissulaires de GSH, la stratgie est de fournir soit des prcurseurs qui s'avrent
limitant pour sa synthhse comme la cysteine, ou des donneurs de GSH comme le GSH
monoethyl esterla7. Toutefois, la cyst6ine ne peut Btre administre tel quel puisqu'elle
est rapidement oxyd6e en cystine et de fortes concentrations extracellulaires de
cyst6ine sont toxiques chez l'animal7 et pour les cellules en culture"'.

NAC:

Le NAC est un compose de faible poids mol6culaire prdcurseur de cyst6ine

Puisque sa dsactylation est lente, il est faiblement toxique toutes les

concentrations testdes. D'ailleurs, en clinique, le NAC est utilise depuis une
quarantaine dfann6es pour diffrents traitements dont les maladies obstructives et
congestives des poumons355et l'intoxication au paracdtarnol qui produit une d6pldtion
en GSH dans les h6patocytes12'.

Son utilisation comme agent cardioprotecteur

demeure assez rcente. Ainsi, plusieurs 6tudes ont montr que le NAC attdnue les
ph6nomdnes
vjm62.1

associs

21.127.283.323.376.401

au

syndrome

d'l-R

dans

diffrents

modeles

in

et in vivo chez des patients subissant un pontage'" ou suite

I' i n f a r ~ t u s ' ~ ~ ~ ' ' .

En fait, il semble que le NAC puisse exercer un effet antioxydant en agissant via
plusieurs rn6canisrnes. Ainsi, il a 6th rapporte que l'infusion de NAC des coeurs
lapins subissant une ischdmie puis une reperfusion, augmente la concentration
intracellulaire de GSH?

D'autres dtudes ont montre que le NAC n'augmentait pasw7

ou peu75*206
la synthdse de GSH, mais augmentait plutt le rapport GSH/GSSG~'~.II

a aussi t rapport que s'il est administr avant l'ischmie, le NAC stimule la
production de GSH dans divers modles

montre des effets protecteurs

au niveau de la fonction cardiaquee2*' 27~256.323.40'

et du dbit coronarien2581401mais
"a'

que si il est administr qu' la reperfusion, dans la majorit6 des cas, il perd ses

bnfices. D'autre part, in vitro, le NAC agit surtout comme antioxydant directe
contre le OH", puisqu'il s'agit d'un compos comportant un groupement sulfhydryle.
Toutefois, notre connaissance, cet effet antioxydant direct n'a pas et document
dans des systhmes celiulaires intacts ou de perfusion d'organes.

3.1 .2. Intementions rndtaboliques

Plusieurs substrats dnergdtiques dont certains acides amins intermdiaires du cycle

de Krebs et de la glycolyse, le glucose, ainsi que l'adnosine ont t etudis pour leurs
effets cardioprotecteurs. Ces substrats peuvent aussi tre combins une hormone
telle que l'insuline W o u d'autres agents comme le dichloroac6tate (DCA), reconnus
pour leurs effets mtaboliques. Un r6sum des connaissances actuelles sera prdsent
pour chaque type de substrats nergtiques ou agents ci-haut mentionnes.

3.1 2.1. Acides amins: En conditions adrobiques, les acides amines contribuent peu
(<

5 % 1 la production d'nergie du coeur. Le myocarde oxyde prf4rentiellement

les glucides (glucose), le lactate et les lipides (acides gras) pour former I'ATP
ncessaire aux contractions, au maintien des diverses pompes ioniques et 2i la
rparation des structures subcellulaire^^^? Cependant, la contribution des acides
amines (principalement le glutamate et les acides amines

A chanes branches)

En effet, plusieurs
augmente lorsque l'apport en oxygne est insuffisant.
~tUdeS3Z.44,S8v70.71.
1 39.37 0.31 1.343,366,3O7.375
montrent que les acides amines peuvent
protdger contre les dommages d'ischdrnie, m&mesi quelques

une^^'*'^"'^*' 94*332 n'ont

pas dmontre d'effet bndfique. La reperfusion avec un ou des acides amines a

permis dans differents modles d'l-R d'obtenir une meilleure r6cup6ration de la
fonctioncontractile32.a.56*70*
139.1 51.267.386.367
de la fonction end0th6liale~'~~
du
m &a bolisme 6nerg&iqueS6*'09*Y33387*391.-

ou une diminution de la taille de

I ' i n f a r c t u ~ ' ~In

~ .vivo, l'effet du glutamate a Bt6 etudid chez l'humain en condition d'l-

R et semble stimuler la scrtion d'insuline et modifier la disponibilit et l'utilisation

des substrats vers le glucose et le glutamate plutt que vers les acides gras4''.

Les

rsultats divergents obtenus concernant la recherche sur les acides amines

s'expliquent par les diffrences dans les modeles d'l-R, I'espce animale, les acides
amins utilises, leurs concentrations, la priode d'administration, le niveau de travail
cardiaque etlou la concentration de substrats exoghnes employ6sJ0'.

Les mcanismes proposs pour expliquer les effets des acides amins sont nombreux
e t sujets h la controverse. Pour le glutamate, I'aspartate et les acides amins
chanes branches, leur mtabolisme respectif en intermdiaire du cycle de Krebs
semble implique. Ainsi, suite leur transamination respective en a-cthoglutarate et

A une voie anarobique pour la regheration

en o ~ a l o a c B t a t e ~ ~ils
~ "contribueraient
,
des phosphates riches en nergie. De plus, le glutamate amliore la clairance du
lactate et de I'excbs de NH, en acc6lerant la transamination du pyruvate en alanine392.

Par ailleurs, I'intdrt rcent pour le L-arginine provient de son rle de prcurseur de
NO.

II semble que l'ischmie suivie de la reperfusion endommage les cellules

endoth6liales. ce qui pourrait bloquer le recyclage de L-citrulline en ~ - a r g i n i n e ' ~ La

~.
suppl4mentation en L-arginine ne fait pas I1unanimit8 car certains chercheurs400ont
ddmontr une augmentation des dommages lies la sequence d ' M .

Aussi, le L-

arginine pourrait avoir des effets sur les cellules indpendamment de son rble de
prdcurseur de -NO car il s'agit d'un acide amine basique dont le transport est assure
par des transporteurs voltages-sensibles'97.

3.1.2.2. Intemdiaires du cycle de Krebs: Plusieurs substrats intermddiaires du cycle

de Krebs, dont le fumarate, le malate, l'a-cdtoglutarate et le succinate seraient

cardioprotecteurs dans des modeles in vitro et in situ d'l-R3?

Ils amdioreraient ia

production d'ATP lors de I'iscMmie mais cet avantage serait perdu d8s le debut de
la reperfusion?

Par contre, lors de la cardiopldgie hypothermique, le fumarate

semble ameliorer la rdcup6ration fonctionnelle ainsi que le niveau de Cp303. Le

mdcanisme d'action propos6 est similaire B celui du glutamate et de I'aspanate, soit

Itam61iorationde la production d'ATP lors de I'isch6mie. Ainsi. l'a-ctoglutarate a 6th

ajout aux solutions cardiopl6giques lors de chirurgie cardiaque chez l'humainzo5et
comme substrat dans une solution de perfusion pr-ischemique pour un coeur
Selon ces tudes, l'a-ctoglutarate agirait en augmentant la capacit oxydative du
myocarde.

3.1.2.3.

Interm4diaires de la glycolyse: Plusieurs auteurs ont rapport6 un effet

. Son utilisation mene une augmentation

cardioprotecteur du pyruvate'~53~57"'~889113g3
des dquivalents rdduits pour la chane mitochondriales de transport d'dlectrons et
un potentiel de phosphorylation cytosolique supdrieur au glucose359. in vitro, dans des
moddes de coeurs isols perfuss, le pyruvate diminue la perte de GSH des
mitochondries"'.

~~.
le pompage
diminue les phosphates i n t r a c e l ~ u l a i r e s ~amliore

d'ions du r6ticulum sarcoplasmique dont le Ca2+ 53, diminue la libdration de L D H " ~ ~ ~ ,

augmente Itactivit6 de l'enzyme G S H ~ X "et augmente ou preserve les phosphates
riches en ~ n e r g i e ~ ~ .De
' ~ .plus. en pr6sence de glucose, le pyruvate pr6vient la perte
de CF la reperfusion, dans un modele d'ischdmie partielle35g,alors que le pyruvate
seul a le mme effet s'il est administre avant I'ischkmie globale" ou r6gionale5' en
plus d'ameliorer la performance fonctionnelle.

En conditions anarobiques, ce

substrat a un effet important sur la r6cup6ration de la pression ddveloppde aprhs

l'ischmie, bien que la pression demeure substantiellement plus faible que les valeurs
p r 6 - i s c h 8 m i q ~ e s ~Le~ pyruvate
~~.
doit Btre administre avant la reperfusion pour avoir
ces effets et miime, une meilleure protection est offerte quand le coeur est perfus
avec le pyruvate avant le debut de 11isch6mie.

L'effet protecteur du pyruvate serait donc multifactoriel et diffdrents modes d'action

semblent intervenirM. En g6n6ral. deux explications ressortent; un effet m6tabolique
et un effet antioxydant. D'abord, cet intermediaire de la glycolyse est directement
transport6 dans la mitochondrie par un mecanisme de transporteur medie, 6liminant
plusieurs Btapes lirnitantes de la glycolyse.

Les diffrentes voies mdtaboliques

impliqu6es sont: une carboxylation qui fournit I'oxaloac&ate, une deshydrogdnation

qui forme I'acetyl-CoA, outrepassant la glycolyse et la formation de lactate par la LDH

qui rduit le ratio NADH/NAD+. De plus, en combinaison avec le glucose, le pyruvate

augmente I'activit6 de la pyruvate dshydrognase (PDH) durant l'anoxie ou I'ischmie
et la reperfusionag. Finalement, le pyruvate exerce un effet antioxydant en ragissant
et consquemment en rduisant la production de .OH".

avec le H,O,

3.1.2.4. Glucose et insuline: Lors de I'ischmie, le coeur a une capacit rduite de

produire de I'dnergie partir de I'oxydation des glucides. L'utilisation du glucose e t

de I'insuline lors de l'ischmie partielle a pour but d'viter la perte des rserves de
glycogkne pour la reperf~sion*~'.L'administration d 'une quantit supra physiologique
de glucose accompagnde d'insuline un coeur ischbmique, permet de maintenir la
glycolyse et d'bviter les contractures i s c h 6 m i q u e ~ ~ ~ 'L'utilisation
.
d'un mlange
glucose-insuline-potassium
gauche suite

en clinique a permis d'amdliorer la fonction ventriculaire

une chirurgie cardiaque necessitant une priode d ' i ~ c h 6 r n i e ~ ~ ' .

Cependant, l'insuline pourrait avoir d'autres effets que la captation de glucose, tels
que la diminution des acides gras libres circulants, la promotion de la synthdse

myocardique de glycogdne et possiblement la stimulation de 11activit6 de la P D H ~ ~ ' .

Ces effets favoriseraient l'oxydation des glucides au depend des acides gras.

3.1.2.5. Dichloroacetate: Quoique le DCA ne soit pas un substrat naturel, son

mcanisme d'action est essentiellement metabolique. C'est un puissant activateur du
complexe de la PDH qui augmente l'incorporation de pyruvate dans le cycle de Krebs,
augmentant t'oxydation du glucose et du lactate quand les niveaux d'oxygdne sont
suffisants.

Chez certains patients souffrants de maladies stables des andres

coronaires ou d'insuffisance cardiaque svre sans acidose, le DCA augmente la

fraction d'djection et diminue les dommages ischdmiques en arneliorant l'oxydation
via la PDH~? Dans un modele de pr6servationkeperfusion. l'administration de DCA

8 la reperfusion amdiore la rdcupration fonctionnelle, le statut BnergBtique e t diminue

la concentration de lactate dans le perf~sat'~'. De marne. le DCA ameliore la
performance rndcanique d'un coeur ayant subi une ischemie suivie d'une reperf usion,
en rdduisant le lactate via l'augmentation de Itactivit6 de la PDH~'?

Ainsi, plusieurs vidences suggrent que le DCA exerce un effet inotropique directe
(contraction) sur le coeur, prsumment en facilitant le mtabolisme oxydatif des
glucides au dpend des lipides dans des conditions o la disponibilit des phosphates
riches en nergie etlou l'oxygne peut tre limitante pour la fonction cardiaque3".

Bien que la consommation d'oxygne et le dbit coronarien ne soient pas affects par
le DCA,

la diminution des besoins en oxygne pour oxyder le glucose

comparativement aux acides gras et I'ATP gnr par l'oxydation arobique du

glucose, suggre des mcanismes par lesquels cette drogue peut amliorer l'efficacit
du coeur.

3.1 2 . 6 . Adhosine: L'adnosine est un nucltioside endogne qu'on retrouve dans

toutes les cellules de l'organisme.

Les nucl6osides sont des substances dont

l'hydrolyse libre un pentose et une base purique ou pyrimidique. Catabolite de

l'adnine nucldotide, 11ad6nosine est un puissant vasodilatateur qui a des effets
directs sur les muscles vasculaires lissesMet qui exerce aussi un effet chronotropique
(rythme) n6gatif et dromotropique (conduction) ndgatif sur les noeuds sinusoauriculaire et auriculo-ventriculaire'01. L'adnosine a aussi plusieurs autres actions
cardiovasculaires dont la stimulation des flux glycolytiques, l'inhibition de la lipolyse,
un effet anti-adrenergique qui r6duit la libration de nor6pindphrine des terminaisons
nerveuses sympathiques et une habilet
gbnration de O;' par les neutrophilesl".

A inhiber l'agrgation plaquettaire et la

De plus I'adhosine attenuerait la sideration

myocardique et microvasculaire, initierait et modulerait le prconditionnement et

finalement, reduirait l'tendue de I ' i n f a r c t ~ s ~ ~ ~ .

Bien qu'il y ait des Bvidences que I'ad6nosine puisse proteger contre les dommages
induits par Itisch+5mieet la reperfusion, il y a peu d'enthousiasme pour son utilisation
lors de la cardiop16gieN et en clinique. Les Bl6ments mis en cause sont: sa trhs courte
demie-vie, son r61e de prkurseur d'hypoxanthine (le substrat de la XO), sa captation
rapide par I'endoth6lium et les globules rouges et ses multiples effets secondaires

rapport6slY.

3.1.3. Interventions pharmacologiques

Plusieurs classes de produits pharmacologiques ont t utilises dans un but de

cardioprotection. Parmi celles-ci mentionnons les plus tudies:
3.1.3.1. Bloqueurs bta-adrhergiques (bdta-bloquants): Depuis les annes 50, les

bta-bloquants sont utiliss dans le traitement de I'angine de poitrine et de l'arythmie

Les bta-bloquants
et depuis environ une dcennie, dans celui de I'hyperten~ion~'~.

seraient particulirement efficaces pour reduire les pisodes d'ischhie lors d'angine
instable. Aujourd'hui, ces mdicaments sont aussi utiliss dans la prvention de
l'infarctus du myocarde ou lors de la priode de reperfusion suivant un infarctus. Ils
agissent par compdtition avec les neurotransmetteurs du systhme nerveux
sympathiques pour occuper les sites des recepteurs bdta-adrenergiques. Dans le
coeur, on retrouve les sites des rcepteurs bta,-adrhergiques, alors que dans les
vaisseaux et les muscles lisses on retrouve les b0ta,-adr6nergique~"~. L'efficacit
de ces mdicaments dans le traitement de l'angine est attribuable une diminution
de la consommation d'oxygbne par le myocarde au repos et l'exercice, d un effet
chronotropique ndgatif, un effet inotropique n6gatif et une rdduction dans la pression
art6riel sanguine durant l'exercice.

L'intdrt accru pour ces mdicaments au cours des dernires annes vient de leurs
effets sur le mtabolisme des lipides e t les ractions mdies par les E R 0 et sur la
cascade de l'acide arachidonique. II a 6tB ddmontrd que les b&a-bloquants diminuent
I'agrdgation plaquettaire et la prolif6ration de neutrophilesY5. De plus, certains btabloquants (carvedilol, propanolol) am6liorent les paramettes hhodynamiques postisch6miques, diminuent la libdration de LDH, la formation d'hydroperoxydes et la
peroxydation ~ipidique"~.

3.1.3.2. Inhibiteurs calciques: Utilise dans le traitement de I'angine, du spasme

coronarien puis de l'hypertension, les inhibiteurs calciques agissent en inhibant
Itentr6e de calcium dans les cellules des muscles lisses vasculaires et du myocarde
et en entranant la dilatation des art4res coronaires. l'utilisation des inhibiteurs

calciques dans differents modles in vitro et in vivo, dmontre l'importance attribue

au paradoxe du calcium, un phnomne qui se produit lorsque le coeur est perfus6

quelques minutes avec une solution contenant tr6s peu ou pas de calcium suivi d'une
perfusion avec une concentration physiologique de calcium.
pompes calciques rdsulte en une accumulation de Ca2'

Le drglement des
intracellulaire, qui

s'accompagne d'une perte de constituants intracellulaires e t de problmes de

~ o n t r a c t i l i t ' ~ Le
~ . paradoxe du calcium est d'autant plus dommageable lorsqu'il
apparat lors du syndrome d'l-R o le coeur est dj affaibli.

Comme les autres antagonistes du calcium, la nifdipine dmontre un effet

inotropique n6gatif qui permet une meilleure r4cupdration fonctionnelle dans un
modle exp6rimental d M m '

A condition d'tre administre avant la pdriode

d'isch6mie3l4. Par ailleurs, le 2.3-butanedione monoxime est un agent inotropique

ndgatif vasodilatateur, qui diminue de faon rdversible la sensibilit6 des proteines
contractiles au ca2+. En fait, il s'agit d'un inhibiteur rbversible du couplage actinemyosine qui a un rle d'inhibiteur calcique. Cette drogue influencerait plusieurs
mcanismes, incluant la contraction musculaire, les courants ioniques et la

transmission ~ y n a p t i q u e ~Elle
~ . est utilisee de faon expdrirnentale dans les solutions
de r e p e r f u ~ i o n ~ ' . ~ ~et* ~
de" .priservation
~~~
cardiaque22s03a7~30a.

3.1.3.3. Inhibiteurs de l'enzyme de conversion de I'angiotensine (AC]: Diffdrents

inhibiteurs de I'ACE ont t administrs de faon expbrimentale dans des modles d'l-

R 203.z43+244a259.402
et chez des patients

souffrant de

MCV122.

Ces agents

pharmacologiques, dont le premier commercialis etait le captopril, ont pour effet

d'inhiber la conversion de l'angiotensine I qui est relativement inactive en angiotensine
II active. Les inhibiteurs de ACE agiraient en augmentant la r6cup6ration contractile

la reperfusion via la prdvention de la degradation de la bradykinineM2qui stimule la

biosynthdse des prostaglandines et la production de .NO dans I'endothdlium

v a s c u ~ a i r e ~ Par
~ ~ ailleurs,
* ~ ~ ~ . certains inhibiteurs de ACE demontreraient des effets
bdnefiques en partie cause de leur groupement thio12".

3.1.3.4. Nitrovasodilatateurs (donneurs de *NO): La nitroglycrine est utilise depuis

f o n longtemps pour la prvention et le traitement des crises d'angine de poitrine.

Cette drogue sert aussi dans le traitement d'infarctus aigu du myocarde en

augmentant le dbit coronarien par la dilatation des artres coronaires et par
I'am6lioration de l'irrigation des territoires i ~ c h 6 r n i s ~ Les
~ ~ . nitrates Bgalement
utilis6s contre l'angine de poitrine agissent aussi en liberant le .NO, lequel relaxe les
muscles vasculaires lisses incluant ceux des artres et des veines. De plus, ils
semblent redistribuer le dbit coronarien dans le coeur quand la circulation coronaire
est partiellement bloqueu8. Bien que le mecanisme responsable de ces effets ne soit
pas parfaitement clair, il est connu que ces produits sont efficaces court terme mais
non 5i long terme car une tolrance possiblement associe une dpltion en thiols
se dveloppe avec le temps2. Plus rcemment, les donneurs de groupements SH

comme le NAC ont Bt6 employds pour renverser cette tolrance aux

alors

que les nitrosothiols eux-marnes, ont t utiiiss au niveau exprimental comme

donneurs de . ~ 0 ~ ' ~ . ~ ~ ~ .

3.1.3.5. Inhibiteurs de la synthse des prostaglandines:

non-stroidiens sont depuis longtemps utiliss suite

Les anti-inflammatoires

l'infarctus ou chez les patients

souffrant de maladies thrombolytiques comme analgsiques et anti-inflammatoires.

Ces drogues telles l'aspirine, I'indornthacine ou I'ibuprophene, inhibent la synthhse
de prostaglandines en agissant sur la cyclo-oxygdnase, diminuant ainsi I'agrdgation
plaquettaire2". RIcemment, des drogues plus spdcifiques ont Bt Bvalu6es dans des
rnoddles animaux in vivo et in vitro, dmontrant l'implication des ieucotridnes et des
thromboxanes dans les dommages de reperfusionm5. Chez l'humain, l'utilisation d'un
inhibiteur sphcifique de l'enzyme thromboxane synthase a permis de prserver la
production de la prostacycline PGI,, qui demontre des effets protecteurs e t aussi
d'am6liorer le debit coronarien suite

a un pontagea7.

3.1 -4. interventions rnt#caniques

Les interventions m6caniques incluent le prdconditionnement, la modification des

paramtres physico-chimiques du coeur et la cardiopldgie. Cette dernier0 strategie

sera discute en dtail la section 3.2. tant donn qu'elle fait partie des
interventions utilises dans ce projet de rscherche.

Pr6conditionnement ischmique: L'exposition du coeur des i s c h h i e s

3.1.4.1

transitoires semble induire des changements adaptatifs qui amliorent la capacit du

coeur

subir

une

ischbmie

plus

importante.

Ce

phnomne,

appel

prconditionnement i s ~ h 6 r n i q u e permettrait
~~~.
en autre d'augmenter l'efficacit des
systdmes de protection e n d o g ~ n e s ~ ~ *Parmi
' ~ ~ . les mcanismes propos&
expliquer

ce

phnomne, mentionnons

pour

les recepteurs alpha-adrnergiques,

l'adnosine, les canaux potassiques sensibles I'ATP et/ou la protine kinase C. Bien
que ces mecanismes soient encore dbattus, ce phnomne a des implications
cliniques et exprimentales intressantes. Par exemple, il est possible que l'ischmie
produite lors d'angine de poitrine puisse tre suffisante pour induite un
prbconditionnement ischdmique chez les patients.

3.1.4.2. Modification des paramdtres physico-chimiques: Les paramtres physico-

chimiques des solutions utilisees pour I'arret, la preservation ou la reperfusion du

coeur dans des modeles d'organes isolds peuvent influencer la rcuperation
fonctionnelle du coeur.

Parmi ces paramtres, mentionnons la temprature, la

pression, le pH e t la composition ionique, particulirernent la concentration de

calcium, de magndsium et de potassium. Dans cette section, seuls les facteurs se
rapportant aux interventions de reperfusion seront discuts, les autres paramtres
plus pertinents la cardioplgie seront abordes

a la section suivante.

Pression et temprature: La pression et la temperature au cours des premires

minutes de reperfusion semblent affecter la restauration de la fonction cardiaque

. *La
de reperfusion jouerait un r61e
aprs une p6riode d ' i s ~ h 6 r n i e ~
' ~ pression
~~~
majeur au niveau de la ndcrose cellulaire3sg, de la demande 6nerg6tique312, de la
fonction contractiie35e~3gsA52
et de l'apparition d'0ed8me'~~. Dans les modhles
animaux, une restauration progressive plut& qu'abrupte du flot coronaire, rdduirait la
surcharge en calcium20aet le stress rn6canigue sur la paroi vasculaire, diminuant le

paradoxe de l'oxygne, responsable des dommages associs aux E R 0 dans les

myocytes et la v a s c u l a t ~ r e ~Chez
~ ~ ~l'humain,
~ ~ ~ . la reperfusion directement B la
pression normale suite une ischmie globale, est associe avec de I'oedhme
prolong, des niveaux d'ATP infrieurs e t une rcupration plus lente de la fonction
contractile comparativement

une reperfusion avec une augmentation graduelle de

la pression3g3. Dans certaines Btudes, I'effet de la temprature de reperfusion n'est

il a t rapport qu'une
pas dissoci de I'effet de la p r e s ~ i o n ' ~ ~ . *Cependant,
'~.
reperfusion hypothermique pouvait affecter la rcup6ration de la fonction
hemodynamique, en retardant la production ~ ' A T P ~ ~ " ' .

pH e t calcium: Pour les trois premires minutes de reperfusion suite une ischmie,

la rcup6ration des coeurs est influence par le PH"'.

Certains auteurs obtiennent

une meilleure rbcupration avec un pH acide3'*'60.'79~246.'9",

bien que de plus vieilles
tudes mentionnaient avoir de meilleurs rsultats avec pH basique pour contrer
1 'aCidoSe33,126.255. Le mcanisme expliquant I'effet protecteur d'un pH initial de
reperfusion acide n'est pas simple et le rn6canisme de base par lequel le pH affecte
la contractilit du muscle cardiaque et te mtabolisme myocardique n'est pas
compltement compris. Un pH acide retarderait la rcupration du pH physiologique,
prdviendrait la libration d'H', la surcharge de calcium et la liaison du calcium avec
la troponine. Aussi, en reduisant la contractiiitd, un pH acide diminue la demande
nergdtique et rdduit l'utilisation dlATP. Mais le pH a un effet biphasique et si la
reperfusion acide se prolonge plus de trois minutes, cela devient n6fastezg4. Par
ailleurs, il semble que la temprature de la solution de reperfusion influence I'effet du
PH
D'autre part, dans la cellule myocardique intacte le systdrne d'bchange ~ a + / ~ est
a ~ *
sensible au pH. Le taux initial de captation de Ca2' via 1'6change Na'/Ca2+
est r6duit de 50% par rapport B sa valeur 9 pH 7.4?

a pH 6.7

Donc si les dommages induits

par la reperfusion sont provoqu6s par l'entre de Ca2+, l'acidification de la solution de

reperfusion initiale protdge la cellule. De plus, une acidose intracellulaire transitoire
pourrait pdvenir la sidration myacardique' 79*246, probablement par une rduction des

influx de Ca2+ dans la cellule etlou par la comptition des ions H' pour les sites de
charge
liaison du calcium intracellulaire au dbut de la r e p e r f u s i ~ n. ~La
~~
. ~ ~ ~de Na'
associe la rduction de l'acidose intracellulaire via l'change Na'/Hf ou par
l'inhibition de la pompe au Na' peut aussi contribuer la surcharge en ca2' en
inhibant les efflux de calcium par les changes IVa+lCa2' 14'.

La rduction de Ca2+

dans la solution de reperfusion et l'ajout d'un agent anti-calcique font partie des
stratgies de cardioprotection87~1?

3.1.5. lnterventions gdniques

La thrapie gnique est une nouvelle intervention de cardioprotection, dveloppe in
vitro et in vivo dans des modles animaux. Elle consiste introduire du nouveau

matriel gndtique l'intrieur des cellules somatiques pour permettre de synthtiser

des protines dficientes ou manquantesJ4'. II existe trois principales approches de
transfert de gnes, soit les rtrovirus recombinants, les adnovirus recombinants et
la livraison directe ~ ' A D N ~ ~La
' . thdrapie gdnique dans le traitement des MCV pourra
ventuellement permettre de diminuer les facteurs de risque d'athroscldirose, de
prdvenir les maladies thrombolytiques vasculaires,

de fournir

un systme

d'administration des mddicaments et de prdvenir l'infarctus du myocardeua.

La

recherche progresse trs rapidement au niveau du pMnom8ne de restenose qui se

produit suite une angioplastie 110.1 17.129.157.278

Le but ultime tant d'interferer avec

la prolifration de cellules musculaires lisses etfou avec la sdcrtion de diverses

composantes de la matrice extracellulaire qui accompagne la lsion de restenose dans
la lumihre des artres2".

A ce jour, l'injection directe d'ADN donne une expression

gnique trhs faible, alors que l'utilisation de vecteurs adhoviraux donne une

*'.

expression gnique beaucoup plus efficace1

3.2.Cardiopldgie

3.2.1 GdndnIitB
Lors de la chirurgie cardiaque ou de la prdservation en vue d'une transplantation, le
coeur doit invitablement subir une pttriode d'isch6mie2'.

Dans ces conditions, les

dommages sont minimiss par la cardioplgie. La cardioplgie rfre A un arrt

cardiaque contrl, visant ralentir t'apparition de lsions ischmiques irrversibles.
Les solutions cardioplgiques induisent un arrt rapide et complet du coeur en
diastole, minimisant ainsi ses besoins dnergtiques.

Depuis son introduction au dbut des annes 70, la cardioplegie cristallode froide est
devenue la mthode de protection rnyocardique de choix de plusieurs quipes
chirugicales. Associe aux progrs de I'anesthesie e t des techniques chirurgicales,
elle a permis de rduire de faon sensible la morbidit e t la mortalit suite aux
chirurgies cardiaques.

Initialement,

les solutions

cardioplgiques visaient

principalement t'arrt rapide et complet du coeur en diastoie afin de minimiser les

besoins dnergtiques.

De nos jours, les solutions cardioplgiques de types

intracellulaire (riche en potassium) ou extracellulaire (riche en sodium), cristallodes

ou sanguines, enrichies de diverses substances pour leurs effets anti-ischdrniques,
sont utilisees de routine pour arrter et prot6ger le myocarde durant les chirurgies 9
coeur ouvert.

3.2.2.Prdservation du greffon cardieque

Que ce soit pour une transplantation ou pour toutes autres chirurgies ncessitant un
arrt relativement prolong de la circulation sanguine, la prservation du greffon
cardiaque est invitable et entrane une periode d'ischdmie transitoire qui doit 6tre
contrlh.

Plus particulihrement lors de transplantation, la protection cardiaque pose des

problemes sp6cifiques, puisque les conditions de prMwernent et de transport du
greffon cardiaque imposent une privation d'oxyghe de plusieurs heures23. En fait,
le coeur subit cinq phases, soit:

I'arrbt ou cardiopldgie, le prdldvement, la

pr6servationI la rhplantation et la reperfusion. En d6pit de recherches actives, lors

de transplantations,

les coeurs des donneurs sont souvent pr4servds par des

techniques simples d'entreposage au froid qui permettent une prdservation sdcuritaire

. Pourtant, des efforts considdrables ont BtB d6ploy6s pour amdliorer

de 4 5 h206*443

la qualit et augmenter la dure de la prservatior;, afin de surmonter la pnurie de

coeurs greffer. Malheureusement, il existe encore trop de controverses concernant
la prservation de longue dure pour que son usage devienne rpandu.

La prservation myocardique est un processus dynamique affect par la durde et la

s6vrit de l'ischmie.

Contrairement au foie et au rein, le coeur est un organe

contractile qui contient de grandes quantits d'actine et de rnyosine. Il est donc

susceptible

Zi des dommages de contraction relis une privation d18nergie, d'autant

plus que le rtablissement rapide de sa fonction est vitala7'.

Plusieurs types de

prservation ont t tests autant sur des modles exprimentaux animaux que chez
l'humain. Diffrentes tempratures et modes de prservation ont t utiliss.

3.2.2.1. Temptature: Que la temperature de prservation soit physiologique (37C)

ou froide ( < 2 0 C ) , chaque mthode a ses avantages et ses inconvnients et la
temprature myocardique iddate reste ddterminer. La prservation hypothermique
ralentit l'activit des enzymes intracellulaires ainsi que la mort cellulaire sans toutefois
arr6ter totalement le rn6tab0lisme~~.Selon certains. la cardioplgie tibde (37C).
continue, ne serait pas suprieure a la cardiopldgie froide et aucune n'offrirait une
protection

D'autres auteurs, ont observ une meilleure protection

avec la cardioplgie t i ~ d e " ~laquelle

,
permettrait d'6viter le stress oxydatif, alors que
la froide l'augmenterait.

En outre, l'utilisation de cardiopldgie sanguine froide

prserverait 11endoth41iummieux que la solution cristallo~de'~'.

Les contractures seraient la principale cause de dommages myocardiques lors de la

prservation hypotherrnique, un phdnomne acc616r par la prdsence de calcium
i o n i s ~ ~ ~ ' Pourtant,
.
des t e m p h t u r e s entre 0C e t 1O0C

permettraient la

rdcupdration complte de la fonction ventriculaire, alors qu'entre 12 et 20C la

r6cupration serait plus lente239~245+45.
L'oeddrne tissulaire, une complication majeure
de la prhservation d'organe Ibasse tempdrature. apparat

ti

cause de l'hypothermie

et de l'absence d'oxygme combinds, qui inhibent les pompes sodium-potassium du

sarcolemme. En consdquence, les ions Na+ e t CI- entrent dans la cellule contre un

gradient de concentration, avec un dplacement d'eau concomitant.

3.2.2.2.Modes de prdsenration: II n'y a pas de consensus savoir si le coeur devrait

tre prserve d'une faon statique ou s'il devrait 6tre perfus. O n reproche toutefois

a la perfusion d'acc616rer le processus d'oxydation donc d'exposer le coeur aux E R 0

et d'inhiber les systtmes de protection e m y m a t i q u e ~ ~Par
~ ~contre,
.
en hy potherrnie.
les coeurs ont un meilleurs dbit aortique et librent moins de CK lorsqu'infuse 10
ou 20 c r n ~ , ~ " . Des pressions plus ou moins dleves seraient n6fastes. II semble
que la r6cupration de la fonction contractile lors de prdservation long terme soit
La microperfusion permettrait donc
reliee au dbit d'infusion durant la pr6~ervation'~~.

d'amliorer la fonction cardiaque pour des prdservations de longue dure ( 1 2-24h)

malgr un fort oedbme. Pour des prservations de 6h ou moins la microperfusion
n'aurait pas d'avantage sur prservation hypotherrnique statique sauf pour les niveaux
d'ATP, d'ADP et ~ ' A M P ' * ~ .

Les chercheurs sont aussi trds partags quant au mode de perfusion le plus ad6quat
car il semble dependre de la temperature. Ainsi, il ne semble pas plus avantageux
d'utiliser la perfusion continue avec le sang en normothermie que la solution
cristallode froide administrde de faon intermittente324. Par ailleurs, il existe un lien
complexe entre la pression d'infusion, la durde d'infusion et la concentration d'ions
potassiques dans la solutionw. Ainsi, la microperfusion avec une solution froide sans
oxygne serait plus efficace qu'une solution oxygdnde perfusde

pression plus

levde. La presence d'une substance collodale dans ce cas est cependant ncessaire
pour obtenir de bons r6sultats long termedu.

3.2.3. Solutions cadiop/dgique et de prdsewation

En pratique, plusieurs Bqvipes utilisent une solution d'arr8t (cardiopl6gique) mais
prdservent encore le coeur dans un salin physiologique froidu3.

Heureusement, la

tendance va vers l'utilisation de solutions de prdservation plus sophistiquees qui

servent parfois du mQme coup de solution diarr&.

Les nombreuses recherches des

dernieres annees en vue de determiner la composition de la solution iddale ont permis

de mieux comprendre les complications lies la preservation du coeur et d'identifier

les facteurs responsables. Malheureusement, la varit de solutions utilise donne

lieu beaucoup de controverse dans ce domaine.

3.2.3.1. Caractdristiques des solutions: Plusieurs caractristiques des solutions de

prservation influencent le devenir du coeur.

Le Tableau 4 rsume ces

caractristiques, tout en souievant les controverses.

pH: II est bien tabli que pour maintenir les ractions enzymatiques, l'quilibre acido-

basique doit tre respect. Cependant, une autre thorie veut qu'en utilisant une
solution I g h r n e n t alcaline (pH 7.4-7.6) cela puisse compenser pour l'acidose
mtabolique qui accompagne I'ischdmie m y o ~ a r d i q u e ' ~Pour
~ . une preservation de
longue durde, de meilleurs rsultats sont obtenus B pH physio~ogique'~~.

Oxygdnation: Le besoin d'oxyghation semble troitement relie la temperature de

prservation. La dependance

I'oxyghne des coeurs de rats arr&ts 3 20C est

dmontree par la quantitd substantielle

d'O, consomm6e sur une p6riode de 5hs9.

L'oxygBnation diminuerait les pertes dlATP, de CP" et aurait aussi u n effet sur le

p ~ ~ " .

Osmolarir:

Tant les solutions hypo-osmolaires (260-270 mOsm), que hyper-

osmolaires (310-350 m0sm). si elles sont hypothermiques, causent des probldmes

ZI la fonction cardiaquetg. L'osmolaritB optimale se situerait entre 280 et 290 m0sm.

La prdvention de I'oeddme avec une solution hyper-osmolaire n'est pas efficace
puisqu'8 la reperfusion. ces coeurs deviennent oedhmiques.

Par ailleurs,

l'augmentation de Ifosmolarit6 stimulait le taux de consommation myocardiale

dfoxyg8ne de faon do~e-d6pendante'~~.

Type de solution: Comparativement la cardiopldgie cristallode, la cardiopldgie au

' ~ ' une

sang permettait une meilleure rdcupdration de la fonction ~ a r d i a ~ u e ~ ' * et

meilleure prservation des phosphates riches en &~ergie~~',

bien que certains auteurs

Tableau 4. Caract&nstiquesdes solutions de pr6servation sujets 8 la controverse

Avantager et inconvhients

Csract~ristiques

pH:
, Acidose

durant preservation:

surcharge en c a l ' ,

libration de lactate;

. L g h alcalose pendant la prhservation: compense pour acidose metabolique;

. Acidose ou alcalose: 1 fonction ventriculaire et l liberation de CK;
. Lleghre alcalose pendant prtlservation:

I rhcupbration fonctionnelle.

Oxygdnation :

vs

. Onyghation:

perte d' ATP et de CP,

liberation de lactate;

. Oxy~dnatlon:i production d'ERO;

. OxygBnation: 1 ou I r6cupbration des parambtres hdmodynamiques.

1 >D m O s m )

Osmolerit4:

. tiyperosmolaire: prBvient I'oedbme durant prdservation mais pas lors de la reperfusion;

. Isoosmolaire: 1 r6cupration de la fonction contractile,
e vs

Type de

solutions:

Cristalloide

. Sanguine: i rbcup6ration de la fonction cardiaque;

. Sanguine: 1 prbservation des phosphates riches en Bnergie;

. Cristalloide: 1 viscosit6 ii basse temperature;

. Cristalloide:

absence de leucocytes qui produisent des ERO.

e vs
- 1

. Intracellulaire (hyperkalidmique): endommage endothdiurn coronarien lors de l'arrt;

, Intracellulaire: permet de maintenir la fonction cardiaque B la reperfusion;

. Extra- et Intracellulaire: niveau d'oedme et rdserves de substrats riches en nergie similaires.

n'aient pas observe de bnfices la solution sanguine" ou aient not des avantages
avec les deux types de solution'? L'inconvdnient majeur de la solution cristallode est
sa faibfe capacit de transport de l'oxygne alors que la solution sanguine basse
temprature a une viscosit levbe, ce qui peut causer t'clatement des globules
rouges avec une obstruction des capillaires. Les conclusions sont cependant difficiles
tirer des tudes comparant les solutions sanguines et cristallodes parce que la

temprature varie et le sang est souvent dilue dans un ratio 4:1 dans une solution
cristallode.
E n ce qui concerne les types de solutions intra e t extraceilulaires, il n'y a pas de

consensus 8 savoir si l'un est prbferable l'autre. Les solutions de type intracellulaire
imitent la composition du liquide intracellulaire avec une concentration 6lev en
potassium, alors que les solutions dites extracellulaires ont un contenu lev8 en
sodium.
Finalement, aucune technique (froid, chaud, intermittent, continue, etc.] de
cardiopldgie n'a encore permis de prvenir totalement les consquences de lfisch6mie
myocardique chez des patients subissant un pontage455.En fait, il existe un lien
complexe entre les caractdristiques qui forment I'dquilibre d'une solution et c'est
pourquoi il n'existe pas de consensus pour ce qui est des caractristiques idales que
devraient posseder une solution de prdservation.

II semble que plusieurs

corn binaisons soient acceptables.

3.2.3.2.Composition des solutions cardiopl6giques: Outre les caracteristiques des

solutions cardiopl6giques mentionn6es a la section prcdente, la composition de ces
solutions a aussi fait l'objet de nombreuses 6tudes.

Depuis les vingt dernieres

anndes. plusieurs agents ont BtB ajoutes aux solutions cardiopl4giques afin d'en
arndliorer 11efficacit6. Nous ddcrivons dans un premier temps la composition de base

des solutions cardiopl6giques (Tableau 51, puis nous discuterons brivement des
principaux composds ajoutes A ces solutions ( Tableau 6) .

Tableau 5.

Composition de base des solutions cardioplgiques

Additifs

Principales fonctions

Concentrations utilisees

Potassium

Arrt du coeur en diastole

4-145 mM

Calcium

Maintien de I'intgrit6 des

0.05-2.5 m M

mernbranes cellulaires

mitochondriales
Sodium

Equilibre ionique

10-184 mM

Magnsium

Diminution des influx de calcium et

0.4-34 mM

efflux de potassium durant ischmie

Chlore

Equilibre ionique

20-276 m M

Bicarbonate

Pouvoir tampon

4.5-30 mM

de sodium

Du Tableau 5, nous devons souligner les points suivant:

Malgr6 que la nature des ions ajoutes aux solutions varie peu, leur

concentration est trs variable.

Des concentrations levdes de potassium durant l'arrt et la prservation

pourraient Btre responsables, du moins en partie, de la d6gdnrescence de
Ifendothlium observ6e B la r e p e r f u ~ i o n ' ~ * ~ ~ ?

La presence de calcium dans la solution cardiopldgique ne semble pas

essentielle, d'autant plus que son absence cause ltarr8t cardiaquee7.
Cependant, les problmes apparaissent lors de la reperfusion d'un coeur
preservd sans calcium, avec une solution contenant du calcium, causant le
paradoxe du calcium.
Le magndsium a plusieurs utilit4s; entre autres il prvient la perte cellufaire de

potassium, prserve le magnsium endogne pour son rle de cofacteur

enzymatique, joue un r6le anti-calcique et diminue l'incidence des troubles du
rythme h la reperfusionl".

5)

Les concentrations optimales de sodium et de chlore n'ont pas t d6terrnindes

car trs peu d'tudes se sont attardes l'effet direct de ces ions4?

II en est

de mme pour le bicarbonate de sodium, qui a de plus un pouvoir tampon

discutable si la solution n'est pas oxygne.

Le Tableau 6 rsume les principales classes d'agents retrouvs dans les solutions

cardiopldgiques.

Les effets anti-ischemiques cardioprotecteurs des substrats

nergetiques e t des inhibiteurs calciques ont dja t discutes respectivement aux

sections 3.1.2. et 3.1.3.2.. Bien que le rle des antioxydants a galement fait l'objet
de cette revue prcddemment (sections 2.3.4. et 3.1.1.1 .), ajoutons tout de mme
que l'utilisation d'antioxydants des la priode de prservation est justifide par des
~ ~ . des effets Wnefiques
Bvidences de la production de E R 0 durant I ' i s ~ h h i e ~Aussi,
de l'addition de GSH ont bt6 rappones sur le coeur reperfus6, bien que son utilisation
puisse causer un problrne pratique reli

A son instabiiit chimique. La substitution

par le NAC dans ces conditions n'a pas donn d'aussi bons rsultats282et rdcemment
le S-adnosyl-L-mdthionine a dt propos comme alternative114.

En outre, concernant les autres classes d'agents, elles seront brivement introduites:

Agents osmotiques et oncotiques:

Au marne titre que les ERO, I'oedbme

intracellulaire du myocarde pourrait contribuer 4 la mauvaise performance du coeur

aprhs l ' i ~ c h 6 r n i e ~ ~Les
~ . agents osmotiques aident donc 9 conserver I'int6gritb
morphologique des cellules alors que les agents oncotiques visent plus spdcifiquement

limiter I'oedhme interstitiel.

Agents vasodilatateurs et anesthsiques: L'utilisation d'agents vasodilatateurs est

TaMeau 6.

Compos&s ajouts aux solutions cardioplgiques

.

Exemoles

-.

Rfrences

Glutamate
Aspartate
Glucose
Pvruvate
Fumarate
GSH

NAC
Mannitol

Allopurinol

Dfro xamine
SOD
CAT

Lactobionate
Mannitol

Dextran
Vetapamil
Diltiatem
2,3-Butanedione

monoxime
Nitroglycrine
Procane

moins tepandue mais semble amdliorer la fonction cardiaque.

L'efficacitd de la

nino@ycrineserait dosed6pendante. Par ailleurs, les anesth6siques sont utilises en

cardiopldgie pour induire 11arr8t cardiaque, diminuer la demande d'oxygbne durant

l'ischmie et rduire l'arythmie A la r e p e r f u s i ~ n ' ~ ~ .

3.2.3.3.

Les solutions les plus utilises:

Dans la littrature, plusieurs solutions

utilises pour I'arrst et/ou la prservation cardiaque sont dnombres. Par contre,
seulement deux solutions ont t conues spcifiquement pour le coeur. Les autres
ont t dveloppes pour la prservation d'organes abdominaux dont la sensibilit
la prservation diffre grandement du coeur en raison de son contenu en actine et
myosine qui le rend susceptible des dommages de contraction relis une privation
d'dnergie. Le Tableau 7 identifie les principales solutions utilises dans la prdservation
cardiaque, ainsi que leurs caractristiques dominantes,

Tableau 7. Les principales solutions de prservation utilises pour le coeur

Y

SOLUTIONS

CARACTERISTIQUES

RFCRENCES

University of Wisconsin (UWI

St-Thomas Hospital N0.2 ou
Pleaisol (STH No.2)
Celsior

Ailopurinol, adnosine, GSH

104,191

Ions principaux et bicarbonate

de sodium

2 19,395

GSH, glutamate, histidine,

mannitol

264
-

Osmolarit dleve

384

Histidine dlev6e

178,333

Collins

Glucose 6lev

207,414,415

Columbia University (CU)

CAMP, nitroglycrine

Stanford University

1 Bretschneider HTK

300

Dans les prochains paragraphes, suivra une brhve description de chacune des
solutions num6r6es dans le Tableau 7:

La solution UW est certes la plus connue. Elle a 6td mise au point pour la
transplantation de pancreas, avant d'Btre utilisbe pour le rein, le foie puis le coeur.
Comme solution cardiopldgique elle connat du succbs dans diffdrents modeles pour
des durdes e t conditions de prdservation trs varides. Par contre, puisqu'elle ne

contient pas de calcium, la solution UW peut causer un dysfonctionnement cellulaire

si la reperfusion a lieu avec une solution contenant du calcium, via un influx massif
de ce dernier. Aussi, sa viscosit levde peut augmenter le stress et la rsistance

vasculaire si elle est perfuse contribuant ainsi aux dommages e n d o t h ~ i a u xd6j

~~
prsents cause de la concentration leve de potassium. Enfin, il semble que la
solution Wisconsin cause des dysfonctions endothliales proportionnelles
l'augmentation de t e m p r a t ~ r e ' ~ ~ et
. " ~qu'elle serait plus efficace 4C.

D'autre part, la solution STH No.2 a t conue en 1981 partir de la solution StThomas No. 12'9. Les modifications apportees Mg&e diminution du sodium et du
potassium et diminution de 50% du contenu en calcium, retrait de la procane, ajout

de bicarbonate et ajustement du pH 7.8) ont amdlior les performances de cette

solution dont Ifefficacit6 est rapportde entre 1 et 10C avec une solution oxygn6eeg.

Conue en 1994, la solution Celsior a t mise au point spcifiquement pour le

coeurz6".

La formulation de cette solution visait trois grands principes, soit la

prevention de Ifoed8me intracellulaire, la pr6vention des dommages causes par les

E R 0 et la pr6vention des contractures par I'am6lioration de la production d'nergie et

la limitation de la surcharge en calcium. Cette solution contient des composds
antioxydants, un substrat nergtique, des agents osmotiques, des agents tampons
et les lectrolytes de base.

Par ailleurs, il existe peu de litt6rature concernant les solutions Stanford,

Bretschneider HTK, Collins et Columbia. A long terme, les patients dont le coeur a
8t trait avec la solution Stanford lors de transplantation, ont ddrnontr moins de
vasculopathie que ceux traites avec la solution UW'*'. La solution Stanford University
est quelques fois utilisde simplement pour la priode d'arrgt.

DBveloppde en 1961, la solution Bretschneider serait la plus utilisee en Europe. Au

cours des annees, elle a Btd rnodifide et la version HTK conue pour la pr6servation

de coeurs, est maintenant la plus utilisde, offrant de bons r6sultats en hypothermie,

sans tre oxygne313.

De son ct, la solution Collins avait t conue au dpart pour la pr6servation de

reins.

Elle endommage le coeur h l'arrt

A cause de sa grande concentration de

potassium e t sa faible concentration de sodium, mais serait efficace pour la

prservation414, surtout basse temprature.

Finalement, la solution CU, 6labor6e dans le but de reconstituer le cGMP, le *NO e t

VAMP inter et intra-cellulaire, contient une grande diversit de produits e t serait

efficace pour les prservations de longue dure300.

Enfin, il existe une confusion majeure dans la littrature concernant les solutions
cardioplgiques. Certains chercheurs utilisent les formulations initiales, d'autres les
modifient. De plus, le mode, la dure et la temperature de prservation, de mme que
I'esphce dtudie varient constamment rendant les comparaisons sur l'efficacit des
solutions trs hasardeuses.

Chapitre II.

sTRAfaGlEDE PROJET

Chapitre II.

Ce projet de doctorat s'intdgrait dans un programme de recherche dont le l'objectif

B long terme &ait une meilleure definition des modalitds et indications de la therapie
antioxydante pour la protection du coeur contre les dommages relis I'ischemiereperfusion.

Dans le contexte du debut des annes 90. plusieurs tudes portant sur le sujet avaient
et6 publies, bien que la controverse rgnait quant au rle de la thrapie antioxydante
due en partie, au manque de rigueur de plusieurs tudes. A cet gard, I'objectif
g h r a l de ce projet &ait d'claircir la contribution de chacune des espces
radicalaires aux dommages observ&, puisque ceci s'avdre dterminant pour le choix
du ou des antioxydants h prconiser. L'hypothse principale &ait que l'investigation
systdmatique de la sequence des vhements pendant I'isch6rnie e t la reperfusion
avec les outils mthodologiques appropries, nous permettrait de clarifier la relation de

cause effet entre les espces rhactives oxyg&n&es et les dommages associ6s 8
l'ischmie-reperf usion.

Nous avons donc choisi d'tudier le rle des -OH puisque d'une part, il semble qu'ils
soient les plus toxiques et d'autre part, nous disposions d'une mthode spcifique de
chromatographie gazeuse couple h la spectrorndtrie de masse pour Bvaluer leur
formation. Aussi, nous voulions travailler avec un seul antioxydant dont I'efficacitd
avait td dmontre in vitro contre le -OH. C'est ainsi que le NAC a et6 slectionn,
d'autant plus qu'il s'agissait d'une molcule non-toxique possedant plusieurs
propriets intressantes dont certaines furent dmontr6es in vivo chez des sujets
souffrant de maladies cardiaques.

Pour notre h d e , nous avons choisi d'utiliser un modele d1isch6mie-reperfusion sur

des coeurs isolds de rats perfuss selon le mode Langendorff. Ce modele permet un
bon contrdle des conditions exprimentales et ta caractgrisation de la squence des

vnements par diffrentes mesures faites sur le perfusat effluent.

Puisque la

premire srie d'expriences avait un aspect exploratoire, nous avons document

diffrents paramtres dans des coeurs isols de rats perfuss en conditions
arobiques, soumis une ischmie partielle de 90 minutes (1 ml/min) puis une
reperfusion de 30 minutes soient: la production de .OH ainsi que divers paramtres
refldtant soit le stress oxydatif (GSH), la ncrose cellulaire (LDH}, l'tat rdox
cytosolique (lactate/pyruvate) et la fonction cardiaque (dbit coronarien et rythme
cardiaque). De plus, le NAC a t infus6 a diffrents moments durant l'exprience
afin de dterminer si: 1 ) cette molcule avait un effet antioxydant direct sur les .OH
dans un organe isol et dans l'affirmative, 2 ) si cet effet tait associ des effets
bhnfiques sur les paramtres biochimiques et physiologiques du coeur. Des rsultats
de cette premire partie de I'dtude, nous avons tir8 les conclusions suivantes: 1 ) le
NAC a un effet antioxydant direct contre les .OH quoique cette action ne soit pas

associde aucun effet bndfique sur les paramdtres biochimiques et physiologiques

du coeur et 2)le NAC induit une hypermie soutenue dans les coeurs reperfuss aprs
une ischmie partielle. II semble que plus d'un mcanisme soit impliqu dont la
production de .NO, et que ce mcanisme dpende du temps d'addition du NAC.

Suite cette premire srie d'expriences, nous avons examin, suivant le mme
protocole, les effets de deux drivs du NAC, des molcules non commercialises trs
prometteuses, soit le thiopyruvate thyi ester et te N-actylcystine-fumarate dithyl
ester.

L'hypothse tait que ces molcules devaient permettre d'observer des

bdnfices supplmentaires la rdduction des .OH tant donne les propridts des
conjugus. Les r6sultats preliminaires dcevants nous ont fait changer de voie.

Par ailleurs, quelques articles parus dans la litterature soulevaient la possibilitb d'un
plus grand bnfice d'une therapie antioxydante dans un moddle o la ncrose serait
moins importante, comme dans les cas de chirurgie pour un pontage ou lors d'une
prbervation en vue d'une transplantation. C'est alors que nous avons decide
d'appliquer la thrapie antioxydante la mise au point d'une solution de prdservation
e t d'une solution de reperfusion.

La solution cardioplegique devait permettre

d'augmenter la dure securitaire de la priode de prservation alors que la solution de

reperfusion devait limiter les dommages associs l'ischmie-reperfusion.

Aprs

plusieurs essais et aprs avoir ralis l'ampleur de la littrature, la complexit de ce

domaine de recherche et les controverses qui y rgnent, nous nous sommes fixs des
objectifs plus prcis.

Nous avons dcid d'utiliser une solution de prservation

conue spcifiquement pour le coeur afin de pouvoir concentrer nos efforts sur
diverses interventions lors de la priode de reperfusion.

Nous avons donc utilis un deuxime protocole bas sur un modle de cardiopidgiereperfusion (C-R). L'hypothse de travail tait que dans un modle de C-R o il y a
peu de ncrose, nous devrions observer d'une faon plus marque les effets
bn6fiques d'un traitement antioxydant. Puisque dans la littrature il tait suggdr
qu'une reperfusion graduelle pourrait permettre de diminuer les dommages de
reperfusion associs au stress oxydatif, nous avions comme premier objectif de
documenter I'effet de la technique de reperfusion. En tenant compte du rksultat, le
deuxihme objectif tait dt8valuer l'effet d'une therapie antioxydante couple ou non
avec une thrapie nergdtique.

Dans les deux cas, les coeurs de rats taient

pr6servs 4 h B 4" C dans la solution Celsior, puis reperfuss 60 minutes sur un

montage Langendorff. En plus des techniques utilisees lors de la premire serie
d'exprience, nous avons mis au point le dosage d'ATP, d'ADP et d'AMP tissulaire
par spectrophotomtrie, nous avons plac de petites lectrodes sur le coeur fi la
reperfusion afin d'valuer l'incidence d'arythmie et nous avons insr6 un ballonnet
dans le ventricule gauche du coeur pendant la reperfusion afin d'obtenir des
paramettes de la fonction contractile. Des r6sultats de ce deuxihme protocole, nous
avons tir les conclusions suivantes: 1) le NAC combine aux substrats Bnergdtiques
augmentent le debit coronarien 3 la reperfusion et 2) l'augmentation du debit
coronarien n'est associde aucun effet bdnfique sur les paramimes biochimiques e t
physiologiques du coeur isold.

Pour tenter d'expliquer les facteurs impliques dans la modulation du debit coronarien,
nous avons utilise un troisidme protocole d'ischemie-reperfusion, soit l'ischmie

globale de 15 minutes suivie d'une reperfusion de 30 minutes.

Ce protocole

permettait le traitement des coeurs avec des inhibiteurs varis avant la priode
d'ischmie. L'hypothbse de travail tant qu'en bloquant alternativement differentes

voies connues dans la littrature pour tre impliques dans la modulation du ddbit
coronarien, nous pourrions identifier la ou les voies responsables de l'lvation du
dbit coronarien observe pour les coeurs reperfuss avec le NAC et les substrats

nergtiques.

Les rsultats obtenus au cours de ce projet font l'objet d'un article publi (Free
Radicals Biology & Medicine) et d'un manuscrit soumis (American Journal of
Physiology). Dans l'ensemble, ces rsultats soulvent un questionnement quant

la

contribution des .OH et par consquent, quant la pertinence d'une thtirapie

antioxydante ciblde sur ces espdces reactives oxygdn6es dans le syndrome
d'ischmie-reperfusion sur un coeur isol. En outre, les rsultats mettent aussi en
vidence un effet modulateur du NAC sur le dbit corofiarien.

Cet effet est

indpendant de son activit de pigeur de .OH et pourrait bien expliquer les effets
hypotenseurs rapportes prdcddemment dans la litterature lors de son administration
chez des patients cardiaques.

Chapitre III. A ~ ~ ~ L E ~ U S C R ~ T

EFFECTS OF N-ACETYLCYSTEINE IN THE RAT HEART REPERFUSED

AFTER LOW-FLOW ISCHEMIA: EVIDENCE FOR A DIRECT
SCAVENGING OF HYDROXYL W
C AND A NITRIC
OXIDE-DEPENDENT INCREASE IN CORONARY FLOW
JULIE

BRUNET,MARIE-JoseBOILY,S n v a CORDEAU,
uid CHRISTINE
DES ROSIERS
Depurment of Nuuiuon, University of Manuthi. Monail. Q u t k , Canada

(Recrived 12 Iunuoty 1995; Reviscd d occrpted 26 April 1995)

Abstract-The u p r i t y of N-uctylcylrcine to d-ly

scavcnge hydroxyl d i a l pduccd by n t hem rcprfrued aficr 90
min of low-flow ischcmh w u ases& by the hydroxylation of 4 h y d r o x y ~ u
into 3,edihydroxybentorte using a gas
chmtognphy-mur spcmrneaic u u y . Rcptrfutcd heuu h w e d a massive rtlcuc of 3.4dihydroxyknzorir, Iicute
dthydrogenut, ud i d gluuihioric, conuiacd leu d u c c d and oxidiztd glutllhionc. but iruintained sponunaus buting and
comnary flow n w close io pischcmic dues. Cornpurd to unueased hutu: rcpcrfwed heuu crcaltd wirh N-acecylcystcine
h m rhe surt of isckmia (il nlurcd four cimes l a s 3 . 4 d i h y d r o x y ~ ~
but
. similu amounls of lactate dchydrogcmsc or
gluialionc. (ii) showed 8 nimc oxidc-t
incrruc in c o m ~ u yflow nit. and (iii) conuined lus oxidited gluuthione,
bus s i m i t u mouna of d u c c d glutathionc. RcpdUStd heurs mziving N-rcctylcystcinc sina ihe l u t 5 min of ischtmia had
dso a four-cimes louer 3,6dihybxybeaurric releue, but theu c o r o n q flow nie rcspoiuc w u simijar io ihrt of unacrred
hunr. Thclc r c s u l ~indiare
~
thit N - i ~ c t y l c p e kun direclly rrvenge hydroxyl r a d i a i s produce. by ~ p r h u e dirchemic
kms. dthough lhio cffcct u not utociued with my pnncctive efecu u indiutcd by thc lacure dehyrogenuc and gluuthione
relusc and cuinot u p i n the nitic oxidcatpndcni rrprfwion hypcremia

Repcrfision of blood flow to the ischcmic myocardium

is an absolute prtrquisitc for survival. Howcver, paradoxicaily. it rnay also promote further mydcardiai injury by what has k n d e d "repcrfusion injury."
Rcpcrfusion injury is a compiex multifaccted phcnomcnon that includes atrtiythmias, rcversiblc myocardial
and endothdial dysfunction (myocatdid and microvascular stunning), and the conversion of tevcrsibly to
imvcrsibly injurcd myocytes (myocytc death; sec for
rcview Opie,' Yellon and lennings.' and Hune et ai?).
Increasing evidcncc indimes that urhythmias and
stunning are f i ndical-mediated phenomena4-' but
contruvcrsy pcnists rcgarding whethcr oxygen radicals
contribute to cxtmding al1 duth? "
N-Acctylcysieine (NAC) is one among rnany agents
-

Add-

p
+
Julie Bruna. iabraoy of InwmwdiCO:

uy MaPboliun. Lauis-Chdc% S i d Rwrrch Ccnm NotreOomc H a s p h l . 1560 Shrrbrodrc SL Euc. Ma-1.

da H Z I M I .

Qtdk.Ca-

administcrcd in an anempt to ncutralizt the deletenous

effects of k-radicais and thus to improve hcart rtcovery upon npcrfision. NAC is a low molccular wcighi
compound that raises the inaacclluiar concentration of
cysteine. and hence of reduccd glutathione (GSH).12
an important endogtnous antioxidant, It also has direct
scavenging pmpertics in vitra against the hydroxyl radi d COH). and hypachlomus acid.'""
NAC was
show by many auth~rs,~"'~-"
but not dl,17''?0 be
effective in improving htart mechanicd function without nducing myayte dead~.l~*'~
niese bemficiai effccts arc obscrvcd when NAC matment is starteci before'% during ischemia." but not at reperfusion.""
and arc arsociared in some studic~.'~"but noi ail."
with an incrcase in the GSH content of the hem. The
failure of NAC to bc beneficial whcn addcd at repcrfusion is takcn as evidcncc against its direct scavenging
action." Howcver, the latter cannot bt excludd, btcause the improved caniiac function is not dways Ssocisited with an incrtriscd h m GSH ~ontcnt.'~
7hc pirpare of ch* sudy was CO &ccnninc whe*
NAC can d i r d y savenge 'OH dYiI in an in v i n

mdrrl of crirdiric ischcmia and rcpctiusion. 'OH production h a i bccn ~sscssedby ruornatic hydroxylaiion.-T'
mcasuring the formationof3.4-dihydroxybenzoare
(34DHBZ) from 4-hydroxybenzoote(SHBZ) using a gas
chmmatognphy mass spectrometry (GCMS) assay.-"
Pm of this work was prcsented in absmct forni."'
MATERIAU AND METHODS

Chernicals

N-acetyf-~cysteine, (2)-norrpincphnne hydrrxhb

ride. 5$'ditfii*bis-(2-ni~benmic acid). 2-vinylpyridine. (2.2.3.3-'H&uccinic acid and [ 1.1 -'H:jphenylacctic acid were obtained h m Aldrich Chernical Co.
milwaukee, WT). 4Hydroxybenzoale. 3,Mhydroxybenmate. 2,5dihydroxybellzoa~,sodium octamate, Nw-nitrrst-arginine (NNLA), U +)-lactic acid, reduced
glutathione (GSH). and glutathione ductase werie
bought from Sigma (Sr huis, MO), oxidized glutathione
(GSSG), NAD, NADPH, and TRIS fiom Bhringer
Mannheim Canada (Lavai, Que'btc). merhanolamine
from Fiber Scicntific(Montrial, Qubec), and sulfosalicylic acid from Anachernia (Montral, Qu&).
Cardie
ml (iactatc dchydrogenasc (LDH) h m human serurn)
was obtained h m Hoffmann-La Roche Ltd (Brampton,
Ontario), N-Methyl-N-(t-butyIdimethy1silyl)-trif
acctamide was supplid by Rcgis Chernid Co. (Morton
Grme, IL). Sodium borodeutcride R(aB2H,) w u bought
h m Cambridge Isotope hbratories (Andover, MA).
The internai standard [3.4,4,42H.,]la*atc was synthcsucd as previously dtscribtd." Ail ochcr raigents wac
analyticai grade. Al1 aqueous solutions wcm made with
watcr puifid by a "Miili-Q" systcrn (Miiiiporr, StLaurent, Qubec).
Rat heurt pefisions

Maic Spraguc -Dawley rats wcighing bctween 250

and 350 g were sactificcd by cervical dislocation. The
hearts were rapidly txciscd and pcrfused according to
the Langendorff technique at a constant pressure of 80
mm Hg with a nonrtcirculating modificd KrebsRingcr bicarbonate buffer containing 119 rnM NaCl,
4.8 m M KCI. 1.3 m M CaClt.ZH,P, 1.2 m M KH2P4,
1.2 m M MgS04 7H20.25 rnM NaHCO,, I 1 rnM glucose. 0.2 mM octanoatc, and 1 mM 4HBZ.The perfusatc was equilibrated at 37'C with 5% CO2 and 95%
O=(pH 7.4). The hem was encloscd in a temperaturecontrollcd. water-jac kctcd, chamber. Coronary flow
rate was mcasurcd with an clcctromagnctic flow probe
(Mode1 FM501. Cmlina Medical Electronics Inc.,
King, NC) installed above the riortic cannuia. Hem
rate was measuccd using a pressure tr;uisduccr connected to the perfusion Iine via a T junction above the

riortic crinnula ( Blood Pressurc Analyzer. Micro-Med

Inc.. Louisville. KN).and the hem temperature using
a thermocouple (Yrllow Springs instrument Co.. Inc.
OH) attached on the surface of the hem. All three
ins~rumentswere linked to o microcornputer IHewlett
Packard Vectra ES) for continuous recording of data.
The hems weft allowed to beat spontaneously
throughout the expcrimtnrs. Hearts that didn't fulfill
the foIlowing criteria were discarded: spontaneous
hem rate above 200 beatsfmin and incrcase of coronary flow on relerise of a 20-25 second period of
inflow occlusion (reactive hyperemia).
PeSusion prorocols
After an quilibration period at normal flow (normally about 20-30 min), hearts were perfuscd aerobically at reduced flow (1 mllmin) for 90 min low-flow
ischcmia, and then reperfused for 30 min. Hcam were
freeze-clampcd ( wi th Wollenbtrger tongs) and stored
in liquid nitrogcn.
For al1 perfusions, norcpinephrinc (NE) was infused
at a final concenuation of 1 pM from the beginning
of the low-flow ischemic period untii the end of the
perfusion to sirnulate the excessive systemic and/or
local adrenergic discharge, which are known cornplications of rnyocardial i~chemia'~
When indicated, NAC
was infused at a final concentration of 100
either
from (i) the beginning of the low-flow ischemic period.
or (ii) 5 min prior to the reperfusion period, until the
end of the perfusion. To determine the tffect of a nitric
oxide (NO) synthctase inhibitor, N-w-nitro-L-argininc
(NNLA)was added to the perfusion buffcr at a final
concentration of 100
Perfusate NE and NAC
concentrations wcrt kcpt constant dcspitc variations in
coronary flow using a cornputer program2'' developed
for fccdback convol of a syringe pump (Harvard instniments, Southnatick, MA). Stock solutions of NE
( 100 PM)and NAC ( IO rnM) wcrc prcpared frcsh with
dcionized nimgen-quilibrated water just prior to the
experimcnt. and wcre proicctcd from light. The 5 m M
NNLA stock solution was made in 0.9% NaCl solution.

Sampling prorocols
Samples of effluent perfusate were collcctcd on icc
at the indicated timcs and proccssed irnmcdiatcly as
foIlows: (il 34DHBZ: 2 ml perfusate without any M t ment. (ii) GSH + GSSG: 500 pL pcrfusate was tmtcd
with 10 pl of saturatcd sulfosa~icylicacid (SSA) for
pmtein prrcipitation. followed by 16 pl of triethanolamine for ncutralization: (iii) LDH: 500 pl perfusatc
w u dilutcd with 500 pl 245 mM TRIS buffer pH
7.0. and (iv) I;rtate, pynivate and succiniie: 500 pl

perfusriie was ircritd for 30 min with 200 pl I M

N~B'H,to stabilize pyruvte by reduciion inio ['HIlciatr." Gluirithion was assayed within 2 io 4 h'- after
smple collection. and LDH within 10 min as prcliminary experimenis indicated a rapid dccrease in LDH
activity with time. Smplcs for the assay of 3SDHBZ.
lactate, pymvare. and succinate were frozen.
A nalyrical procedures

Enzymatic assays: LDH.GSH, and GSSG were assayed on a Roche COBAS FARA. For LDH.the procedure of the insvument operator's manual, which is that
of Gay et al.." was foilowed. A standard solution of
LDH (Cadiotrol) was always assayed in parallel with
Lhe samples. The procedure to assay GSH and GSSG
was that of ~ n d e r s o nFor
. ~ tissue content of GSH and
GSSG, h e m were pulverizcd in a mortar cooled at
the temperature of liquid nitrogcn, and the frozen powdercd tissue (80 mg) was homogenized using an ultrasonic disinregrator (Vibra Ccll, Sonics & Materials
inc., Danbury, CN) in 1 ml of an ice-cold nimgenquiiibrated 5% SSA solution. The homogenatcs werc
then cennifuged at 3000 g for 20 min. For the assay
of GSH, 100 pl supernatant was diiutcd in 0.4 ml
nitrogen-equilibratcd 5% SSA solution and neutralizcd
with 16pl criethanolamine. For the assay of GSSG, 400
pl supernatant is trcated with 8 pl of 2-vinylpyridine to
prevent interference by GSH, and neutraiizcd with 6
pl triethanolamine. Standard curves of GSH and GSSG
wcre always performcd in parallet. Analyses were performed in triplicate. and each sarnple was assayed thrte
times.
Gas ch romatography -mus spectrornetry (GCMS)
ussuy. (i) 34DHBZ: Pcrfusate sarnplcs (2 ml) werc
spiked with 1 nmol of each of the following c x m a l
standards, ['Hr]phcnylacetic acid ([*H~PAC)
and 2.5dihydmxyknzoate (25DHBZ)." (ii) Lactate, pynivate
(reduced to ['~Iactatc)." and succinate: Pedusatc
sarnplcs (0.5 ml) werc spiked with 250 nmol ['hllactate and 5 nmol ['&]succinate. Al1 sarnplrr werc
acidificd, saturatcd with NaCl, and extractcd with diethyl ether. The combincd ether phases were dried with

anhydrous sodium sulphate and gently evaporatcd under a nitrogcn sutam. The dry rcsidues wcrr convertcd
to r-butyldimethylsilyl (TBDMS)derivatives by the
addition of 50 or 75 pl of N-Mcthyl-N-(t-butyldirncthylsily1)-tnfluomcetamide.
AI1 samples wcre analyzcd on a Hcwlctt Packiud
5988A GCMS opemicd in the clcctron impact mode
(70 eV) using sclcctivc ion monitoring analysis (SIM).
GC conditions werc: 25 m x 0.2 mm HP-5capillq
column; heiium flow, 0.6-0.8 mumin; split niio 1 :IO:

column hcad prcssurc. ?O k P x injection port and transfer linr. 380C.The GC temperature prognrns used
were ihe followmg: ( i l 31DHBZ: 110" for 2 min and
6"Imin to 280". Eluiion times for the TBDMS derivativcs of [?H,JPAC. 25DHB2.and 34DHBZ were 12.2.
28.0. and 29.3 min. respectively. Ions monitored at
these times wcre ai rnfz 195. 439, and 439, respcctively. Those ions are formed rhrough the loss of the
r-butyl group [M-57]+from the TBDMS radical. (ii)
Lactate, lactate (pynivate reduced with N~B%,,],
succinate: 140" for 5 min and S0/min to 305" and 50/
min to 250" for 2 min. The TBDMS derivatives of
lactate and succinate eIute at 9.3 and 12.7 min, respectively. Ions monitored are at m/z 261, 262, and 265
for lactate. ['H]lactate and ['H,]lactate. respectively,
and at d z 289 and 293 for succinate and ['H,]succinate, rcspectively.
Peak areas, detcdned by computer integration,
werc correctcd for naturally occurring heavy isotopes
and for light isotopic impurities."-" Conccnvations
of lactate, pynivate, and succinate in sarnples (Q,)
werr calculated using the correctcd arca (CA) of the
ion corresponding to the compound of interest (CA,)
and to the interna1 standard (CA,s). and the quantity
of the intemal standard (QIS)added to each sarnple
analyzcd.

For 34DHBZ quantitation was achitved using a

rcsponse factor in the numerator of the above equation." This factor is detcrmined expcrimendly for
each extemal standard with a standard curve performcd
in parallel with the sarnpks to be analyzed. The limit
of dctcction of OUT assay is in the pmolc range.
34DHBZ data arc expresscd in thrce diffrent formats:
(i) concentration (nmol 34DHBZ per ml of effluent
pcrfusatc), (ii) rate of production or formation in nmol
pcr min (nmol 34DHBZ pcr rd of effluent perfusate
x flow rate in mUmin), and (iii) accumulatcd amount
of 34DHBZ formed during the first 10 min of rcpcrfusion (nmol 34DHiWIO min), which was calculatcd as
follows:
f: ([Rate of formation of 34DHBZ (nmoUrnin] at,t,J

wherc il-i, is the time interval bctween two sarnple

collections.
In vicw of possible artefacts associated with mcasuremenu of 'OH radicals production by ammatic hydroxy Intion in various ~ystcrns.~-"-' out 34DHBZ
date wcre comctcd for background noise. The latter

was drtennined for each perfusion experiment by

analysis of the influent petfusrite. collected at
rhe beginning and the end of the experirneni. 1; averaged 6.2 2 1.6 nmoM, representing 7 1 %. 22%. and
16% of basal. ischemic. and postischernic 340HBZ
concentration, ~spcctively.Sirnilarly, in two separate
expiments wticrc WC simulated a perfusion without
hanging a heart, the anefactual conccntraiion of
34DHBZ in the perfusate amountcd io 2.8 -t 1.0

GCMS

nmo14.
Starisrical analysis

Dam arc expresscd as means 2 SE of n hem perfusions. A one-way nonpatametric anaiysis of variance
(Kruskai-Wallis test) wcrt uscd COassess scparattly in
conml or NAC-trcatcd hcarts the efftct of intervention
(low-flow ischemia, or repcrfusion, versus basal or preischcmic condilions) on the various measurcd paramct a s . Cornparisons bctwecn control and NAC-treated
hearts (effect of marnent) wetc pcrformed using either
an analysis of covariance for rcpeatcd mcasurts (perfusate), a one-way anaiysis of variance followed by a

Dunnrtt multiple cornparison test (perfusate), or an

unpaircd r-test (tissue). Linear trend betwcen two parrirneters was tested with the Pearson comtation cocfficient. A probribility ofp < 0.05 was considered statistically significant.

The formation of 'OH radicals by the isolatcd perfused rat fieart was assessed by che hydroxylation of
3HBZ into 34DHBZ using GCMS.This approach is
similar to that measunng the formation of 2.3-dihydroxybenzoate fmm the chernical reaction of salicylic
acid wirfi 'OH. Similarly, the chernicd reaction of
4HBZ with 'OH yields 34DHBZ2' Quantitation of
34DHBZ in the hart influent and efffucnt perfusate
was achievcd using two different extemal standards,
[2H,]phenylacetic acid. and 2.5-dihydroxybenzoate.
Because similar results werc obtaincd with the two
extcmal standards (not shown), only thosc calculated
with ['H2]phenylacetic acid are rcponed in rhis micle.
In prcliminary experirnents (not shown), the addition of 1 mM 4HBZ to Ihe pcrfusate of hearts subjccted

Fit. 1. Effect of low-ilow ischrmh (LF)a

d rcpcrfusim (RIon ihc pmductioci (A) ud the concentration ( 6 )of 34DHBZ by
isolucd ru hcrRs prfwe wiihait (whiic bur) or wich 100 phi NAC ( b k k ban). Two p u p s of htrru, paf&
m'th r
mmrrcirculuing M - R i n p r kiffcf ccmuining I I mM g l u m e 0.2 m M acrrnouc. d 1 m M 4HBZ wre subjcr<cd to 90
min of LF ud 30 min of repdwin. Swing at ihc m n n i n g of tht LF pnod onc gmup of hunt rcceivcd an infuion of I
pM N E rlon (n = 6, amaril), w h r r r u rhc othcr p u p rueivtd an infushm of I phtl NE + 100 phi NAC (n S. NAC).
Sunpks fran ihc efllucnt p d w e wcre colkctcd during 1-2 min stmin# rt tht timc indicarrd ud rnrlylcd by GCMS to
detrmiint the quaniity of 34DHBZ fmcd f m 4HBZ m indcx of 'OH diui prodimion. Vdws ut mcuis 2 SE o f the bvc
or six hun pfusions. AnilyW of covuimce ( e k t of tmtnni): p < 0.05 f ~ boih
r
34DH62 production uid coaccaVUi011
rt LF ancl R, Aauiysis of v u i u m (dktor intemeniion): (a) WDHBZ poduction. LF:NS (contml. NAC). Rr p < 0.05 (con*.
NAC); (b) MDHBZ niricciiuoiiori. LF p < 0.05 (mml. NAC). R: p < 0.05 (caciiml) ud NS (NAC). B: basal OT pchhrmic
conicioru.

Time period
Fig. 2. Efiecl of low-flow iwhcmia (LF)and npcrfusion (R) on ihc ~ l u r co f LDH (A) and GSH + GSSG (B)by isolaicd n t
hcuu prfuscd wiihoul (white brn) or wi(h 100 ph4 NAC (blwk ban). Othcr data h m ihc h m perfusion expcriments descrikd
in Figure 1 . Samplcr from ihe effluent prfurru wcrc collectcd during 1-2 min rt the tirne indicrted and assaycd imrncdiately.
Values uc m u s iSE of five or six hcur perfusions. Adysis of covariuicc kffect of miment): NS in ail cases. Analysis
of vatianct (effcct of inicmnrion): (a) LOH. LF and R: p < 0.05 (conuol. NAC}; (b) GSH. W.
NS (conmrl, NAC). R: p <
0.05 (conmi. NAC). B: basai or prtischcmic condiiions.

to 60 min of low-flow ischemia and 15 min of npcrfusion did not significantly influence the coronary flow
rate or hart rate, nor the magnitude of LDH and GSH
release. under basai or ischcmic conditions or upon
rcpcrfision. Also, the formation of 34DHBZ by h m
perfsed during 75 min under acrobic conditions was
found to be close to the iimit of dctcction of our assay.
Low-jow ischemia and repe@tsion

Hcam pcrfuscd undcr normal acrobic conditions

rtleased smail amounts of 34DHBZ LDH,GSH, and
lactate + pynivate in a ratio within the physiologicai
range (Figs. 1-3, open bars). Undcr these conditions,
the concentration of 34DHBZ in the effluent perfusatc
was close to thc Iirnit of dctcction of our assay. Reducing the coronary flow to 1 r n M n for 90 min rrsulicd
in (i) similar formation. but incmsa perfusatc concentration, of 34DHBZ (Eg.1). (ii) lower hlcase of
LDH (Fig. 2A), and (iii) a p u r and tirne-dependent
rrlcase of lactate + pymvaic (Fig. 3) and succinate
(not shown). Because the ischemic hart rckased proponionally mon lactate. but lcss pynivate. han the
acmbic hem (not shownl. ihc Iiu%ic/pynivatc ratios
aftcr 75 min of low-flow ischcmia wcte as much as
600-fold p a t e r than the prcischcmic value (Fig. 38).
Shonly a k r npcrfusion. the ischemic hauts rctcascd

(Figs. 1-3 and Tabic 2) 34DHBZ LDH,and GSH in

massive amounts.but lactate + pynivate, and succinate
(not shown) at a rate similar to that obscrvcd aftcr 75
min of Iow-flow ischemia. One minute aftcr npcrfusion, the lactatdpynivate ratio was alrcady 2-fold
lower than that observcd at the end of low-flow ischernic pend. As rcpcrfusion continueci, dl these mctabolic parameters rctunied progressively to pnischemic
values. After rcpcrfusion, hearts had coronary flow
rates (Fig 4A) and maintained spontancous bcating
(Fig. 48) close to prcischornic values.

When cornparcd to untrcatcd hearts, hcarts rtcciving 100 pM NAC fmm the beginning of the low-flow
ischemic pcriod showcd a signiticantly lower production and pcrfusate concentration of 34DHBZ during
the low-flow ischcmic pcriod and at reperfusion (Fig.
1, dark bars). The mlwc of d l other measud parametcrs. LDH. GSH. lactate + pynivate and lactatdpyrUV*
ratio (Figs. 2 and 3, black bars) was not significntly affectcd by the ucaiment, although values
tendcd to be lower (LDH, p = 0.07 using the analysis
of covari;icc) and to show lcss varability (as indiutcd
by the smaller standard enors). With respect to the
physiologicd parameters. tmtment with NAC resultd

Fig. 3. Effccc o f low-dow ischcmia (tF)and rrprfusion (RI on ihe t o d (A) and the ratio (6)of lactate and pyruvarc rcleased
by isolaicd ni hcarts perfuxd wiihout (white bars) or with 100 @
NAC
i (black bus). m e r &u fmrn ihc h c v t perfusion
cxprimenrs descrikd in Figure 1. Samplcs of effluent prfusaie w m collecrcd dunng 1-2 min siuung at ihe lime indicattd,
md anaiyzed by GCMS for I ~ i (LAC)
e
and pynivatc (PYR)concenation wiih an interna1 stvldanj of [2tC]lactlte.Results
art s h o w as (A) tocal lactate + pynivau relcase and as (B) the ntio lacutdpynrvare. which is an index of Ihc cyosolic ndox
suic (NADWNAD). Values uc means i SE of four or fivc hurt perfusions. A d y s i s of covariance (effect of mtmcnt): NS
in d l u ~ sAnaiysis
.
of variance (cffect of intervention):(a) iAC + PYR. LF:p < 0.05 (conml. NAC). R: p < 0.05 (conmi.
NAC); (b) LACIPYR, LF: p C 0.05 (conuol, NAC). R: NS (contrul, NAC). B: basai or prcischcrnic conditions.

in coronary flow rates at rcperfusion about 65% grcatcr

than preischcmic values (Fig. 4A and Table 2. p <
0.05). although it did not influence the hem rate responsc (Fige 4B). Finally, rcperfuscd ischemic hearts
mateci with NAC containcd l a s GSSG, but similar
GSH, than untmted hcarts (Table 1). Consqucntly,
the GSWGSSG ratio aiso tended to bc hghcr.
The addition of NAC 5 min prior to npcrfusion
(Table 2) rcsultcd in a rclease of 34DHBZ at nperfusion comparable to that observe. for hearts ueaied
with NAC frorn the bcginning of the low-flow ischernic
pcnod. The rclease of dl othcr metaboiic and physiological parameters, including the coronary Row rate,
masurcd at rcpcrfusion was similar to untrcated
hcarts.

Relation between the r e l e ~ ~ofe34DHBZ LDH, a d

GSH

The relation bctwccn 34DHBZ LDH,and GSH was

evaluatcd by (i) tcsting for a linw trend ktwecn the
magnitude of thcir release during the first 10 min of
hpcrfusion with the the Pearson correlation coefficient
and by (ii) comparing the avcnge time of k i r p k
rclew. Taking inIo account d l perfusion exprimenu

( n = 151, without and with NAC, a significrit correlation was found between the total nlease of LDH and

GSH ( r = 0.89; p < 0.0001), but not betwecn that of

34DHBZ and eithcr LDH (r = 0.3;p = 0.3). or GSH (r
= 0.1 ;p = 0.7). However, 34DHBZ and GSH rckase
peaked at a similar timc, 1.14 i 0.14 and 1.29 3:
0.19 minute. rcspcctively (NS), which was carlier than
LDH,2.69 t 0.43 min @ < 0.05). Note that the given
timcs arc the average of all perfusion experiments,
bccause ttiey did not diffcr for h e m perfused without
or with NAC.
Bccausc rcsults obtained in the two first series of
perfusions (without and with NAC added at ischtmia)
alrcady indicatcd similar timcs for the peak rcltase of
34DHBZ and GSH, the sampling pmtocol of our last
scnes of perfusions ( h e m trcated with NAC 5 min
prior to rcperfusion) was slightly modified in hoping
to clarify a possible cause to cffcct nlationship. Thus.
the pcrfusatc coming out of the hcart immediatcly at
the cime of r#stablishment of flow was also collc~tcd
and analyzcd for 34DHBZ LDH. and GSH. Out of
fivc hwrts. four showed a greatet rclcasc for 34DHBZ
(0.74 I
0.26 nmollmin: n = 5) ai this cariicr time
compmd to ihat obscrved betwecn I and 3 min of
rtpcrfusion (RI = 0.35 2 0.07 nmoVmin; n = S),
cornparcd to only one for GSH and none for LDH.

Time pcriod
Fig. 4. Effcct of low-flow isckmia (LF)and mperfusion (R) on the (A) coronary flow nie and (BI h e m rate of isolated nt
huns perfuscd without (white bus) or wiih 100 pM NAC (black bus). C h k r dala fmm the h m perfusion experimenls dcscnbcd
in Figure 1. Corovry flow nie (Cm)
and hem rate (HR) were continuously monitorcd throughout the perfusion expnmenu
and avengcd for rhe following time priod: (i) the l u t 10 min prrcccding LF, (ii) the eniirt LF and (iii) for ihc Ymc rntewd
bcrwn t h t indicated during repcrfusion. V d u a uie means r SE of six or scven hun perfusions. Aruiysis of covariance
(effect of trcatment): (a) CFR at R p < 0.05. W y r i s of variance (cffcct of intervention): (a) CFR. R: NS (control) and p <
0.05 (NAC); (b) HR,LF:p

< 0.05 (conaol) and NS (NAC),R: NS (conuol. NAC). 8: basal or preixhernic conditions.

These rcsults do not, howevcr, change any of the above

conclusions.
EBct of
repef i i o n

on the coronary flaw rate al

Perfusion of acrobic hcarts for 20 min with 0.1 m M

NNLA,a NO synthasc inhibitor, resultcd in more than
a two-fold dccrcasc in the coronary flow rate (42% 2
5% of basal value, n = 9, not shown). This decreasc
was observcd in the absence or prescnce of 100 PM
NAC z 1 PM NE. NAC donc, with or without NE,
had no effect on the coronary flow rate (not shown).
The effcct of NNLA on the coronary flow rate of rcperf'ustd ischcrnic hearts treated with NAC varicd dcpcnding upon the timc of addition of NAC (Table 3).
NNLA was without any effcct when NAC was added
pror io NNLA and to the low-flow ischernic perid,
that is, thcrr was still a 75% incrcasc in the coronary
flow raie at rcpcrfision. Hawevcr. this risc was abolished by the addition of NNLA prior to ischemia and
of NAC ai ihc bcginning of the low-flow ischemic
pcriod.

This article demanstrates thai NAC trcatmcnt decrrases the production of 'OH ndicals by the isolated

rat heart repcrfused aftcf 90 min of low-flowischcmia

It aiso documents a NO-dependent increase in coronary
fiow at rcperfusion of heam a a t e d with NAC since
the beginning of the low-fiow ischemic period.
Production of 'OH radicals during ischemia and
repe@sion
Incrcascd production of oxygendcnved fret radicals (ODFR)early upon mflow of ischemic or hypoxic
Table 1. Content in GSH and GSSG of Hcuu
Rcprfuscd for 30 min Afttt 90 min of LowRow lschemia Wiihout or Wiih 100 phi NAC
Perfusion Conditions
Pammctcn

Contml

GSH
GSSG
GSWGSSG

555 2 62
1 3 . 0 ~ 1.3
45

100 pM NAC

531
32
9 3 z 0.S8
58 r: 6'

OIhcr dail fmm the htrn prfusion cxpmimenu

dcscrikd in Fipm 1. At ihr md of the pitusion, dl
hem w m f~t~uclunptd
ai the tempniurc of liquid N: . Hem tissue was pulvcritcd dhomopnizd
kforc derminarion of GSH and GSSG cocictnaaticin. Vdues :s exxprrssc in nmoUt wct wcight and
arc rncm :
SE of tivc heui prfusions. For cornparim. values for i h nonprfuwd karts WCYC: GSH
= 1017 r 93 nmoUg: GSSG = 24 f 2 nmoVg; GSH/
GSSG = 45 z 7 nmolig: p < 0.05 and 'p < 0.1,
NAC vcrsus conirol using an u n p i d t-wL

Timc tif NAC Addiiirin

Pannieters Mc;uurcd
Upon Rcperfusion
34DHBZ inmoVIO min)
LDH (unitdl0 min)
GSH inmou 10 min)
CFR ( 8 PI valire)

Nonc

Low-Flow Iichcmis

Repcrlusion

C LF)

(Ri

1.3 r 0 4 '
15 r 2
141 r 13
162
9'

3.7 3 0.7
16
8
159 r 41
107
10

=
=

1.6 z 0.2'
31 r 8
180
38
91
8'

=
=

O t k r data [rom the hem pdusion expcnmenis descnkd in Figure 1 in which 100 HM
NAC was added ai the kginning of the low-flow ischcmic (LF) pend. and from similar hem
perfusion expcnrncnts whert NAC was added 5 min pnor ro the ricpcrfusion p e n d (R. n = 5 ) .
for UDHBZ. LDH. and GSH. values shown are the total qumciiy ncovertd in the effluent
pcrfuuic during the firsc 10 min of rcperfusion. For rhc comnary flaw n i e (CFR). values werc
avcnged for the fine 10 min of rrpcrfusion uid cxpmssed as % of the pmischemic value ( 5 Pt
value). Values uc mcuis z SE of four or seven kart perfwons. ' p < 0.01. 'p < 0.05. addition
of NAC ai iF or R venus no addiiion. and p < 0.001. addition of NAC at R venus addition
of NAC at LF. u i n g analysis o f variance followcd by Dunnett multiple cornpansan test.

'

hcarts has betn rcpeatedly and consistently documented w ith various te~hniques,"'~ including aromatic hydroxylati~n."~'~-~'
The latter technique. which
was used in this study, provides a spccific quantitative
anaiysis of 'OH p m d u c t i ~ n .ODFR
~
may also be
fonned during ischemi~~S.J9-~.4~-~.4a
but the nature,
magnitude, and time course of this pnxiuction, comparcd to chat obscrvcd undcr basal conditions or aftcr
rcpcrfusion, has not been so wclt characterizcd, and it
is a subject of contrqversy.
In this study, rat hcarts perfused under low-flow
ischemia produced 34DHBZ. an index of 'OH radical
production, at a low rate, comparable to that obscrved
under acrobic conditions (prcischemic period). The
concentration of 34DHBZ in the effluent perfusatt of
ischemic hcarts was, howevcr. sevcral-fold grrater than
that observed in the prcischemic pcnod, bcing closer
to that obscrved carIy aftcr reflow. The importance of
discriminating betwccn the ODFR vascular concentration and their ract of formation was ncently stresscd
by Blasig et ai* Only the fonner was found to k
significantly corrclated with indices of niicrovascular
(decrcased coronq flow rate) and myocardial mcchanical damage (anhythmias. depresscd contractile
function) in isolateci rat hearts sujecred to ischemiarcpcrfusion. Thus, from our data. it rnay bc suggcstcd
hat (i) those cells king pcrfuscd under low-flow ischtrnia produce ODFR in quantitics p a t e r than undcr
aerobic conditions. and (ii) possibly the highcr ODFR
concentmion contributes to the ischemia-induced
myocardid and micmvascular injury.
Very e d y upon rrpcrfusion (O- 120 s) of ischcmic
hcons. we obscrved. like many ~ t h C r s ~ ~ - an
~"~
incrcascd production of ODFR. more spccifically 'OH
ndicals. The pcak 34DHBZ fornation at rcpcrfusion

occuned in dl our experirnents. In their smdy, Tosaki

al.4sdettcted 23DHBZ or 25DKBZ formation from
salicylate in fibrillahg karts only. Thus, the incidence
of veniricular fibrillation in Our rcperfused heans was
pmbably high? although this was not assessed. The
magnitude and tirnetourse of the production and pcrfusate concentration of 'OH radical we observcd art
sirniiar to those reportcd by Takcmura et al? Thcsc
authors used aiso aromatic hydroxylation to assess 'OH
production. Because the duration of ischemia has bccn
shown to be a powerful determinant of the magnitude
of rhe postischcrnic production of ODFR, including
the 'OH radi~ai."~it rnay k suggestd chat 90 min
low-flow ischemia (this study) and 15-20 min global
ischemia (study of Takemura et ai.? producc comparable darnagc in rat heans. Takemura et ai.' prcsented
cvidence for limitcd mechanicd damage, that is, recovcry of heart contractiiity (dP/dt). hcart rate, and con+
nw flow rate. In our study, a rapid metabolic and
functional rccovery of our mperfused hearrs was indicated by the (i) maintenance of spontancous bcating
and coronary flow rate close to pccischcmic values,
and (ii) normalization of the cytosolic rcdox sta, as
indicated by the lactatc/pynrvatc ratio, and of the inuacellular reduced thiol status, as indicated by the rissue
GSWGSSG ratio.
et

Anrimidant effecr of NAC

Thc bencficial effects of NAC observai in several

ischcmia-rcpcrfusion modcls was mostly attributcd to
Howcver.
its ability to save as a prrcursor of GSH.'~'"
" NAC
' ~ ~ can
~ improvc c d i a c funcrion without incrwsing
tissue GSH level. '' suggesting alternate meehanism(s)
of action. Our dom indiute that direct scavcnging of

Table 3 Effect of 100 PM NNLA on rhc Coronxy

Flow Rate of Rcpcrfuscd Ischcmic Hcans Trcared

Wiih 100 p M NAC

Coronary Flow Rate

t % PI value)

Timc of NAC Addition

Rcisehcrnic pend
Begrnning of the LF p R o d
Begrnning of ricprfusion pcriad

175
5
82 z 18'
63 z 4'

5 min prior io reperfusion (not s h o w ) . and is ( i i )

diminished by the addition of ri 'OH radical scavenger
(NAC: Table 2). However. the chemical reaciion of
4HBZ with ihe 'OH radical probably occun mostly in
the coronary vasculaiure, such thai the assay of
34DHBZ fomation may underestimate the myocardial
'OH production. The latter would be expected to be
more closely related to the LDH relese.

Orhcr data fmm the hem perfusion expcrimenrs dcscnkd

in figure 1 . For al1 hem perfusions. 100 pM WNLA was

infuscd 20 min pnor CO the

bcginning of low-flow

ischemia

(Lm.NAC infusion (finai concentration 100 PM)was stlncd

e i h r (i) during the prciscticrnic priod. at the same tirne or
10 min prior to NNLA infusion (n = 31. (ii) ai the kginning
of LF period (n = 3). and (iii)at the bcginning of the reperfusion priod ( n = 21. Values atc meuis z SE. * p < 0.05
NAC addition ar the LF or npffusion pcriod vs NAC addi-

tion during the prc-ischcmic pcriod. using a one-way andysis

of variance follawcd by Dunnett multiple cornpuison test.

'OH radicais by the ischemic-rtpcrfused h e m should

be considercd. In fact, NAC decricascd the production
of 34DHBZ (i) by rhe ischemic hcarts and (ii) by the
rcperfuscd ischernic htarts evcn when added only 5
min prior 10 reperhision (Table 2). Also, the GSH con-

tent of reperfused-ischcmic hcarts trcated with NAC

from the beginning of low-flow isctiemia was sisniiar
to that of unutated hcarts. More likcly, NAC can significantly incrcase total tissue GSH only when added
prior to the ischcmic pri~d.'~'"'
However, our data
do not exclude the possibility that NAC could incrcase
the GSH pool locally." posribly in cndothclial cciis.
whcn addcd ai the bcginriing of the low-flow ischcrnia
A direct scavcnging of 'OH radicals by NAC is in
agreement with in vitro st~dies."-~~
NAC is also a
powcrful scavcngcr of hypochlomus acid, but not of
hydrogcn pcroxide or supcroxide anion. The prouction of al1 these oxidant spccies is incrrased in the
repufused ischernic h c ~ inu vivo,r" but in vitro, i h c ~
is no known source of hypochlorous acid. Nso, NAC
has effects similar to other 'OH scavengen~-"-" in
that it improved cardiac function,"-" but filcd to reduce tissue necrosis when added during ischcmia and/
or r~perfision.'~~'~~~'"'~*
In this sndy. the= was no
comlation bctween 34DKBZ production (index of
'OH radical) and LDH lealcage by the ischcmic-rcpcrfuscd rat hcatts, although ihc observai scqucncc of
cvents (an cariier pcak rclcasc of 34DHBZ than LDH
or GSH) suggcstcd a prion a cawtffcct dationship.
The rrason for this discrcpancy is not lcnown. In ow
systcm. the production of 34DHBZ apptars to reflet
'OH radical fomation rathtr than the activity of Ihe
h m cyiochmme P450 system? ln fact. the magnitude
of the mnsicnt peak of 34DHBZ ionnation observcd
at rcpcrfusion was (i) similar if 4HBZ w u d d c d only

Effecr of NAC rreatment on coronan. Jow rare

We report a possible preservative effeci of NAC
treatrncni during ischemia and reperfusion on the c o n
nary microvasculature, as evidenccd by a NO-dependent hypercmic response upon reperfusion of ischernic
rat hearts. This effect was lost when NAC was givcn
only bcforr the onset of reflow, as was also rcponed
for other bcneficial cffects of NAC such as improved
functjonl?.15l k l & 19
or dccrcased incidence of
arrhythrnias." 'fhe involvemcnt of NO was indicated
by the blunttd coronaq response in the pnsence of
NNLA, a NO synthase inhibitor, in rtpcrfused h e m
receiving NAC since the bcginning of ischcmia. Othcr
authors uscd LNNA (0.005 mM-1 mM) to show the
involvement of a NO-dependent process in the basal
regulation" of coronary biood flow. as well as hypoxic
va~odilation."'~ NO generationS8-' and myocardia!
hypercmia." NNLA.however. failed to prcvcnt an inc r a s e in coronay flow rate above prcischemic values
when NAC infusion started before that of the inhibitor,
during the pnischemic pcriod. This suggests mon than
one possible mechanism by which NAC can cxcrt its
effcct on coronary flow regdation.
To our knowledge, such an effect of NAC on c o n
nary flow rate has not bcen reporteci beforc, although
Ferrari et al." did report hypotension in humans with
caidiovascular disese rccciving NAC. Also. in one"
of many studies whcfc NAC was given to heart subjccted to ischemia-rcprfu~ion."~~~
iddI'-IP
a sipificantly bctter hemoynamic rtcovery of rcperfused
hcam receiving NAC was obscrvcd, although coronary
flow rates upon rcflow wcre significantiy lowcr than
preischcmic values. We do not have an exphnation
for thest diffcrcnccs. However. the type and cxtcnt of
the ischcmic insult is known to influence the coronary
l o w rcsponsc of ischcmic hearts upon rcflow (fce
H t v s e et al.' for nvicw). and. in a
s study. unlike
I'YJI NE was infused during low-flow
otj,crs,~m-~n.~~ischemia and nperfusion to simulait the excessive systcmic and/or local adnnergic discharge, which arc
h o w n ~omplicationsof myocardial ischemia and circulatory shoek in vivo."
It is now acccpicd ihat microvascular injury O C C ~ .
indepndcntly of myocdial injury. during ischcrnia

and rcpcrliision isrr Hcarsc et al.' and Trcuure"' et

for rcvicw). Even mild. reversiblr. ischemia causes
3 IOSS of vasodilator reserve and progressive vasoconstriction. Also. responses to dmgs are impaired. especil.

cially those which are cndothelium-depndent. Among

the mechanisms that have k e n proposed io contribure
CO the genesis of microvascular injury during ischemia
and repcrfusion arc ODFR. pnncipally the supermay impair the production
oxide an i ~ n . ' . ~ . 'which
'~
and action of endothehm-derived reiaxing factor
(EDRF)."?."which is proposed to be
We can only speculate on the possible mtchanisms
responsible for the observed increase in coronary flow
rates following NAC addition during ischemia and reperfusion. First, the effecc of NAC is more likcly to
be permissive or indirect, rather than a direct action on
vascular smooth muscle cells. In vitro, NAC induces an
endothelium-independent relaxation of rat vessels or
of resistance artcries prcconcractcd with NE.U Howevtr, in this study, NAC was withour effect on the
coronary flow rate of (i) acrobically perfused rat heam
(nor s h o w ) and of (ii) rcperfused ischemic hcarts if
added 5 min prior to rcflow (Table 3). Second, NAC
is unlikcfy to act by reducing NO degradation through
eithcr direct scavenging of superoxide anions produccd
at reperfusion or incrcased SOD activity. In fact, (i)
NAC addition at reperfusion failed to inducc an incrcased coronary flow rcsponse (Table 2), (ii) NAC
rcacts poorly, if at dl, with superoxide anions in vitro,'"
and (iii) NAC veaunent did not modify h e m SOD
activity in an ischernia-rtperfusion setting." The benefit of NAC's 'OH scavcnging property in this context
is hard to cvaiuatc because tbe role of 'OH, if any, in
microvascular injury i s noi clcar.
WC,therefore. consider the following three cxplanarions as k i n g more likcly. as well as not k i n g munially exclusive: (1) NAC trcatmcnt during ischcmia and
seperfusion prrserves the invacellular rhioi (including
GSH) pooI of endothetial cells dunng low-dow ischcmia. This explanaiion is supportcd by the demonstration that, upon rcperfusion, GSH-dcplctcd h e m show
increascd coronary rcsistance,"" whereas GSH-treatcd
h e m show incrcased posthypoxic coronary flow.* (2)
NAC serves as prtcursor for the formation of S-niuosothiois. cither S-nitrosocystcincor S-nitroso-N-acctylcysteinc, which arc (i) more stable and more porent
" (ii) p n t
vasodilatory cornpounds thnn ~ 0 " ~and
posed as endogenous pracunors of NO.^'-^ Although
thcm is no clcar evidtncc ihat S-nitrosothiols are an
invrcllular stongc form of NO," rhis could explain
vhy NAC addition bcforc NNLA and during the preischcrnic pctiod clicited an increascd comnvy flow
nsponse upon rcflow ihat was noi blunatd by NNLA
(Table 3). (3) NAC inhibits the angiotensin convcrting

enzyme (ACELrin enzyme localized rit the membrane

of the endot hrlium.'" This dccreoses the production
of mgiotrnsin II. a vuoconsuictor. and prevents the
degrridation of brady kinin. a vasodilator thai induces
the synthesis of NO."
In summary. this study provides evidence for a direct scavenging of 'OH radicals by NAC in reperfused
ischernic n t hearts whcther added at the beginning or
at the end of a 90 min low-flow ischemic period. We
also report an additional. possibiy beneficial. effcct
of NAC on the coronary flow rate regulation of the
reperfuscd ischemic hcart. The elucidacion of the exact
mechanism underly ing the incrcased hyperemic response of reperfused hcarts recciving NAC since the
bcginning of ischcrnia rnay help to better define the
conditions of NAC administration to humans. so as to
prcvent or betier conml the associared hypotension.''

nit authors thank Dr. Jane Montgomery and

Ms. t n e Sic-Mme for k i r hclp with the GCMS assay o f 4HBZ
and 34DHBZ. and Dr. Luc Vachon and M. Yves U o n d c for lhcu
dvict on statisiical analyses. This work wzs supponcd by granls
h m Lht Medical R c ~ v c h
Council of Canada (MT-IO8 16 and MT10920 to C. D t s Rosiers).

Acknowledgcmenrr

REFERENCES
1. Opic. L. H.,cd. The h e m : Physioiogy Md merobolrjm. New
York: Ravcn Rcss; 199 1.
2. Yellon. 0. M.: Jcnnings. R. B., cds. Myocardiol protecrion: The
porhophysiology ofreperfwion injury. New York: Raven Rtts.,

1992.

D. J.; Maxwell, 6;Saidanha, C.; Gavin, I. B. lk

myocvdid vasculanrrc during ischcmia md repcrfusion: A urger for injury and protection. J. Mol- Cefl. Cardioi. 2!k759am 1993.
Jemudi. M. O.: HYlley, C. J.; Bolli. R. Myocvdirl rcpcrfusion
injury: Role of oxygcn ndicais uui poccntial &npy wi* aniioxidants. Am 1. Cardiof. 7328-78; 1994.
Cunis. M. 1.: Rigsky. M. K.; Waiker. MIJ. A. Endogenous
chmiical mediaton of venviculrr urhyihmias in isckicmic hem
discase. CaFdiowtc. Rcs. n:703-7 19; 1993.
To&. A.; DU. D. K. Rcperfusion i n d u d mhythmiu ut
causcd by gemruian of free d i d s . Cadiovasc. Rcs. 2#:422;
1994.
Goldhaer. J. 1.; Weiss. J. N. Oxygen fret ndicals and cudiac
rrprfusion abnmliiics. Hype~enrion20: 1 18- 127; 1992.
Rrykltnk K.: Kloner. R. A. "Rcprfusion injury*' by oxygtnderived f n t ndicrls? Effm of supmxidc disrnuuse p l u al a . givcn a1 che tirne of nprfuion. on myocudid infnct si*.
c o n m i l e function. coronrry micmvlrculaiurc md ~ g i o n r l
myocudial blood ilow. Cimdution Res. 64~86-96; 1989.
Ambmsio, G.; Bcsker. L. C.; Hutchins. G. M.; Weismri.
H. F.; Weisfcldi. M. L. Reduclion in cxpcrinienul infarct si=
by tecornbinant human supuoxidt dismutut: Insighis inio tht
pathophysiology of nprfusion injuy. Cimulo~ion74:14241433; 1986.
Chamkn. D. E; W.D. A.; hiterson. G.: Roy. R.: McCord
1. M.; Yashida. S.: P m k y , L. F.; D6wncy. J. M. Xanthine
~ x i srb a murcc of frtc d i c a l drnup in myocudill iwhtmia. I. Mol. Cell. Curdiol. lt:l45- 152; 1985.
Lumfrlry. E. J. Rduction of infucr si= by all-pcnnublc
Jxygni mci~boliicscavcngcn. F e e Rodic. B i d Md. 12:429446; 1992.

3, HWK.

4.

5.
6.
7.

8.

9.

1O.

II.

f i . F r n m R.; Ceconi. C.. C u ~ l l u .S.. C . i r p m A.. Allicri. O..

Pard~ni.A.. ManoIla. P. Viwolo. O. Orygrn lrcc mdicsls and
mywarJ1~1
Jsmagc. Proiccirvc r o k ut thiol-coniaining qenir.
A m J M d . 91 :9Ss IUSx I Y 9 1 .
13. Amorna. O. 1.; Halliwcll. B.: Hocy. B. M.. Builcr. J. f h c aniioxidant action of N-acctylcystcinc: la maciion wiih hydmgen pcroxide. hydroxyl radical. superoride. and hypochlorous acid.
Frcc Radic. Bcol. M d . 6:S93-597: 1989.
14. Grcsstcr. B.: Cabanis. A.; Lckgue. S.; Brunet. C.:Dine, T.;
Luyckx. M.: Cuin. M.: Cuin. J-C. C k c r r j x of hypochlorous
=id and hydmxyl ndical genenicd by siimulaied human neuirophils: Cornprison rn v~rroof some ihiol-conaining dmgs.
Meth. Flnd &p. Clin. Pharmacni. 16:9- 1 3: 1994.
15. Forman. M. B.: Rieti. D. W.; Caies. C. U.;McCroskcy. D. E;
Bcckman. J. K.; Gmnc. H. L.; Vinnani. R. Glutaihionc ndox
parhway and ~pcrfustoninjury. Effeci of N-acetylcystcinc on
infarct sire and ventnculu funciion. Circulation 78:202-2 13;

1988.
16. Ceconi, C.; Currllo. S.; Cargnoni, A.; Ferrari. R.;Albcnini, A.;
Visioli. O. The role o f gluuthione sutus in the protection againsi
ischcmic and rcprfusion damage: Effecis o f N-acctylcysteine.
J. Mol. Cell- Curdiol. 2 0 5 13; 1988.
17. Tuii. M. Effccls of m i - f n c radical agents on Na'. Ca", uid
function in r t p r f i u c d n t heuu. Am. J. Physiol. 259:H 137-

H143; 1990.
18. Collis. C. S.; Davics. M. J.; Rice-Evans. C. Cornparison of
N-rnethyl hexanoylhydroxamic %id, a novel antioxiduit, with
dufemoxvnine and N-acctyf cysieinc againsi mperfusion-induced dysfundons in isolated nt herrt. J. Cardiovatc, Phannucol. 22336-342; 1993.
19. Qiu. Y.; Bernier. M.; H c Y ~ ~D.
. J. nie influence of N-acetylcysuinc on cudjlc funcuon and rhyrhm dimrden during isckmia
and rcprfusion. Cardioscience l:6S -74; 1990.
20. Hdliwcll. B.; Kaur. H.; Ingelman-Sundkrg, M. Hydmxylation
of salicylaie as an -y
for hydroxyl dicais: A cautionuy
note. Free R a d k Biol. M d 1 0 : 4 3 9 4 1; 1991.
21. Montgomery, J. A.; Stc-Muie. L: h n e t I . Quantitarion of
h.vdroxyben~tesinbiologicaffluids as indices of hydroxyl radical producrion. Roce+ding. 41st Amaicm Society of M w
Spccmrncny Confmncc on Mut Spcctrometry and Ailied
Topics. 322ab absu.; 1993.
22. Brunet 1.; Boily. M-1.: ktt. M.; Montgomey. J. A.; Des Rosien. C. Indices of the axi&tive and mcubolic sure during Iowflow ischcmia md Rprfusion in the isolatcd nt hem. Efftct
of gluunau and N-acciylcysicinc. FASEB 1. 8(5):4959 absu.;
1994.
23. cs Rosiers. C.: Montgomery, J. A.; G m u . M.; David F.;
M a r . O. A.; Dalozr, P.; Toffolo. G.; Coklli. C.; L u i b u .
B. R.; Bruncngnkr. H. Psclidoketogemsis in hcpatcctomittd
dogs. A m 3. Physiul. 25U:W194528; 1990.
24. Biingcr. R; Mdlct. R. T.;Hutmui, D. A. Pynivatc-tnhuiccd
phosphorytation potcntial and inotropisrn in norrnoxic and portischernic isolaicd woking hean. Nw-cornpletc ptvention o f
rrprfusion contractile failurr. Eur. 3. Siockm 1110:221-223;

1989.
25. Sunman. W.; Hughes. A. O.; Sever. P. S. Frcc-ndical scavcngers. rhiol-containing rcagmis an endoihelium&pndent relaxation in isolatcd ni and h u m rcsisfance ancria. Clin Sri
84:287-295; 1993.
26. Montgomery. J. A.: Jcni. M.: Hws S.: Dcs Rosiers. C. Acyloin
production from i~ldchydcsin thc prfused n t hcrrir nC potenrial role o f pyruvatc dehydm~myc.Biockm. 1. 29M27-733;
1993.
27. R o m J. C.; Fmmrtic. D. J. The impommc of wmple p m p
ration and siorage in glumihiau analysis. Ami. B x k m .
Zll:l83- 187; 1993.
28. Gay. R. 1.; McComb. R. B.; Bawrs. Jr.. G. N. Oplimum rr~etion
conditions for h u m k t a i c &hyrogcnw irocnrymes as ihq
a f f a toul Iacaic Jcshydrngenuc r t i v i t y . Clin. Chcm W74753; 19613.
29. Andcnan. M. E figluiihtonc. In: Grrcnmld. R. A. ah.

CRC Ircttit//hn*h

,J/

CRC Pmss. Inc..

t~tcihr~tf.\
/rtr 18 I \ ~ . t . r trurlri

tri r c r c t ~ n11 lun J;i.

I W 5 . J 17 - 3 3

30. Dcs Rusicrh. C.. Munlpmnsq. 1 A.. Dcswhcrl. S.. &meau.

M.. DavrJ. F..Marncr.. (3 A.; Bruncngrsbcr. H. Inicrfcrence of
3-hydroxyiwbuiyraic wiih mca~urcmcnlsof Leione body conccniratton and isoiopic enrichment by gas chmmaiopraphy-mass
specirorneiry. Anal. Btochem. 173%- 105; 1988.
31. b p l ~ n r c .A.; Comte. B.. Des Rosiers. C. A m y of blood and
tissue ox;iloaceiaic and a-kciogluunic by miope diluiion g a
chmmatopnphy- m s spccirurnciry. Ami. Biochcm. 224:580-

587; 1995.
32. Des Rosiers C.; Rivesi. M-J.; Body. M-J.: Jette. M.: C m & Cohen. A.; Kumr. A. Gas chmrnatognphic-mas spcmrnevic
assay of ssuc malondialdchyde. 4-hydmxynonenal. and othcr
aldehydcs aftcr thcir reduci~onto swble alcohols. Anal. Biochrm.
208:161- 170: 1993.
33. Powell. S. R.; HJI, D. Use of salicylate as a probe for 'OH
formation in isolatcd ischcmrc ni h e m . Frrc R d c Biol. Med.
9:133-141; 1990.
34. Montgomery. J. A.; Stc-MMe. L.; Boismenu. D.; Vachon. L.
Hydmxylation of uomaiic compounds as indices of hydroxyl
radicalproduciion: A cationary noie rcvisitcd. Fret R d c . Biol.
Med. In pms.
35. Zweier. J. L.: Flaherty. J. T.;Weisfeldi. M. L. Direct m a u r e ment o f fme ndical gencniion foltowing nprfusion of ischcmic rnyocardium. Proc. Narl. Aca. Sci. USA 84: 1404- t407;
1987.
36. Baker. J. E.; Fcliit. C. C.; Olinger, G. N.: Kalyanuunui. B.
Myocardiai iscfremia and rrpcrfusion: Direct evidcnce for frre
ndical gcnenuon by elccuon spin rcsonuicc spctroscopy.
Proc. Narl. A c d Sci USA 115:2786-2789; 1988.
37. Maupoil. V.; Rochene. L. EvaJuation of f m radical and lipid
pcmxide formahm during global ischemir and rcpcrfusion in
isolated n t h m . Cardimusc. Dmgs fhcr. 2:6 15-62 1 : 198%.
38. Ruugc. E. K.; Ledcnev. A. N.;Wrotnkin. V. L.; Konsmrinov,
A. A.; Kunzcnko. M. Y. F m ndicd mctabolites in myocudium during isckrnia and rcprfusion. Am. J. Physiol. 26I:8 1

86; 1991.
39. Gulick. P. B.; Davia. M. J.; Hearst, D. 1.; Slaicr. 7'.
F. Direct
dctcction of frec ndicais in the rrpcrfuscd ni hrui using c l a tron spin monancc spectmseopy. CircukrIon Re$. 61:757-760;
1987,
40. Bolli. R;hl.B. S.: J e d i . M. O.; iai. E K.;McCay. P. B.
Dtmonstntion of frrc d i c d genention in "stunncd" rnyocudium o f iniac; dogs with the use of spin tnp a-phcnyl N-rertbutyl nitrune. J. Clin. Invesr. 82:476-485; 1988.
41. Damenu. W.; Ikl, J.; hridi, T.:Aurd-,
H.; Zimmer.
G. Genmiion o f frrc ndicils in Litngmdodfuid working hcuis
during minnoxia, hypoxi& m d mxygenation. Basic Res.
Cordial. B:141-149; 1993.
42. Henry. T,D.; Archer. S. L.; Nelson. D.; Weir. f K.; Fmm.
A. H. L Postisckmic oxygen radial produciion vvies wiih
duntian o f ischernir. A n J. Physiof. 264:H 1478-H 1485; 1993.
43. Henry, T.O.; Airkr. S. L;Nelson. O.: Weir. E. K; From.
A. H. L. Enhanceci chemituminesccnct as a mesure of oxygenderived fret radial grneration during isckmia and reprfusion.
Circulo~wnRcs. 61:1453 146 1; 1990.
44. Arroyo, C. M.; Knmcr. J. H.: Dickens. 0. F.; Wcglicki. W. B.
ldcniificaiiono f fm d i c a l s in myocudial ischcmir/irperfusion
by spin rnpping with nitronc DMPO. F U S &II. 221: 101 I W;
1987.
45. Tosrki. A.; Bqchi. D.;Pdi. T.; Cordis. G. A.; Dm. O. K.
Cornpuisons o f SR and HPLC rneihods for the deteciion o f
O N ndicals in isckmif/reprCuscd hmru. Bioekm P h a m ml. 45:% 1 -969: 1993.
46. Takemun. .; Onodem. T.; Ashnf. M. Quantification of hydroryt radical and iu l x k o f rclevmx io myocardial injury
during m i y rcpcrfusion alter gndcd ischemia in n t karts.
Cirrvlurit~nR a . 7 1.96- 105; 1992.
47- Onodtm T.; Ashnf. M. I)iHccliori of hydrotyl d i n l s in ihc
postixhcmic rcpcrfuwd hrjn using sdiylaic as a inpping
qgeni. J. MO/. Cell. Crrnlid. 23:365-370; 1991.

48. Mmpril. V.. Rwhcilc. 1..Tdurd. A.. C1;iu.w.r. P.: H q c y . C.

Evoltiiit~nd (fer. r~dical1omi;itii~nduring low-llow I S C ~ C ~ I ; ~
and rcpcrl'usion in isol~icdmi han. Cur<lrc~vu.tc.D r u p Tiicr.
4:791-705; 1990.
49. Bluig. 1. E.; Shuicr. S.: Garlick. P.; Slaicr. T.Rclaiive iimcpmtiles tbr tm ndical tnpping. c o m n q Ilow. enzyme leahgt.
mhyihmiu. and funciion during myocardial rcprfusion. Free
Radic. BWJLMerl. 16%-4 1 : 1994.
50. Tosaki. A.; Bnquet. P. DMPO and reprfusion injury: Anhyihm i r hem function, elccmn spin monuice. an n u c k u magnaic
monancc siudics in isolattd working g u i m pig hem. A m
Hean J. 120:8 19-830 1990.
51. Mcnaschd. P.; Gmuuci. C.; Gaudwl. Y.: Mouu. C.: Piwnin.
A. Mainicnancr of the myocudial thiol pool by N-acctylcys-

tcinc. An effccrivc m a s of improvingd i o p l e g i c pmieaion.

J. 'fhomc. Cardiovarc. Surs. 103936-944; 1992.
52. Khalid. M. A.; Astuaf. M. Direct desecrion of endogenous hydmxyl ndical production in culiurcd adult cariomyocytes durin# anoxia and reoxygenauon. 1s the hydmxyl n d i u l d l y the
most bnuging radical spccics? Cire. RIS. 72:725-736: 1993.
53. Bolli. R.; Imudi. M. O.; Purl. B. S.; Amorm. O. 1.: Hailiwcll,
B.; Lu. E K.; McCay, P. B. Markcd reduclion of h c dirrl
gcncniion and conuacdlc dysfunciion by uitioxibni rhcnpy
kgun at rht tirne of ttprfusion. Evidcnec thrt m y o w d i d
"uunning" is a manifestaiion of irpcrfwion injwy. Cim. Res.

65607-622; 1989.
54. IngelmanSundkrg. M.; Kaur, H.; T m l i w . Y.; Peruon.
J.-0.; Hdliwell. B. Hydroxylacion of sdicyhatc by rnicmsaid
fncrions MCI cycochrorne P4S. k c k of production of 2.3dihydroxybenuutc unlcss hydmxyl ndiui fonnition is pemiiitcd Biochem J. 276:753-757: 1991.
55. B o u m P.; Fcrdinandy. P.: Sipbrm.

P.; A l l m C. P.;Westtfhof. N. Nitric oade is an important determinant o f comnuy

flow in the isolatcd blood p r f w d nt heuc Borie Res. Crdiol.
87570-584; 1992.
M. Brown. 1. P.; Thompson. C. 1.; Belkmi, F. L. Role of nimc
o x i k in hypoxic oronuy vuodibutiori in isolrrcd @scd
guinca pig hun. Am. J. Physwl. 261:H821-H829: 1993.
57. Puk, K. H.; Rubin. 1.E;Chas. S. S.; Levi. R Nioic oxidc
is a mediuor of hypoxic comnuy vrrodiliiiuion. Relation to
ldenosine and cyclooxygcnuedcrivcd metabolites. Cirnvhrion
R u . 713992-3001; 1992.
58. Wotsch. 1.; Schror, K. Romcyclin ruhtt thn mdogmws
nitn'c oxidc is a tissue proiective factor i n myoeudiil irchtmia.
A m J. Physwl. 263:H I3W-Hl396; 1992.
59. icipen, B.; Bcckcr. B. F.; Gcrlrch, E. Diffcrrnt mdoihc1i.l
mcthanisms involvecl in cornnuy mponsa to h w n v a d i l a talors. A m J. Physioi. 262:H 1676-H 1683: 1992.
60. Pinsky. D. 1.; 02.M. C.; Koga. S.: Taha 2;B r ~ ~ k m r M.
n , J.;
~ m &A.. J.; Liao. H.; N& Y.; Bmt. J.: Cannon. P. J.;
Nowygmd. R; Maiinski. T;S m . O. M. C d k prurnru'on
is enhartccd in a hcicmtopic nt truupluit modcl by uippkmcnting the nilric oxi& pathway. J. Clin. I n w . 9332291 -2297;
1994.
Maekawa, K.; SYto, D.: Chyuhi. N.: Uchidr, S.; Hvroka.
S. Rolc of endoihelium&rivcd nilric o d e urd denosine i n
funaional rnyocudid hyprrmia. A m A. Ph-vliol. 247:H166H173; 1994.
T r ~ ~ ~ u C.
r c .B.: Alexamkr. R W. 'lhc dysfunctionri endothrlium in htut failurc. J. A m Col!. CardioL 22: 129A- 134A;
1993.
K i t a h c , M.; Hori. M.; Takashima. S.: IwU, K.; Srto. H.; Inouc,
M.;Kiwhatake. A.: K;unadj. T.Superoxidc dismuiuc enhances

iwhcnii;i-induccdrcxiivc hyyicrcrnic flw and adcnosinc rrlcuc

rn d q s . A mlc UT 5'-Nuclcniiduc ;icirvtly. Cm. RCJ. 71:558566: 1992.

a.Tuo.

P. S.. Aoki. N.: Ldcr. 0.1.: Johnson III. Ci.; Lefer.

A. M. l i m e coune of endoihclial dysfunciion and myocudial

injury dunng rnyocvdial ischemi~and rrprfusion tn the cai.

Circulacton 82: IJ02- 14 12: 1990.
65. Mer. A. M.; Tsao. P. S.: Lefer. O. I.
Ma,
; X-L. Role of endothelia1 dysfunction in ihc pihogeneris of rcprfusion injury aftcr
rnyowdial ischcmia. FASEB J. WO29 -2034: 199 1.
66. fur ch pi^ R. F.; Khin. M. T.;lothiuundui. O. Cornparison
of cndoihciiumdepndcnt relaxation and nivic oxide-indud
nlaxrtion in rabbit mm.Ftd. Proc. 3893% absu.; 1987.
67. Palmer. R. M. I.F:t m p . A. Ci.; Momda. S. Nivic oxidc
r c l u wcounu
~
for the biologtal utiviiy of endoihelium-dcnwd n f u i n g factor. Nature 327:524-526: 1987.
68. Blrwiicin. A.; Dcnekc. S. M.: Siolr R. 1.;Buier, D.: Huley.
N.; Fuiburg. B. L. M y d i a l gluuthione depletion impain
movery dter shorr p c r i d of ischtmia. Circub~wn: 14491457; 1989,
69. Cirudwf. Y.: M m r u h , P.; Duvellcroy. M. Enzyme reluse and
miioehdrid wtivity i n reoxygcnaud cudiac muscle: Rcirtionthip wiih oxygen-induccd Iipid pmxidition. Gen. Physwl.
Biophys. 8:327-340; 1989.
70. Mym. P. R; Minor. JI., R. L.; Guan Jr.. R.; Baies. 1. N.;
)irrrUoci. D. G. V u o r r t u u i t pmpmiu of thc uidoihcliumdrriwd = k i n g fwtor m m c l w l y r#cmblc S-nitmysuine
thui Ninc oxidc. Nmure 3U:16 f - 163: 1990.
7 1. Ignrmi, L J. Endolhcliumderivtd nitic oxide: niumrcology
ud rrluionrhip to ihc rctioiu of orguiic niurte esm.Phucmoc.
Res. 6:6S 1-659: 1989.
72. Sumlrr. I. S.; Simon. O. L; OttKmK. J. A; Mullins. M. E;
I d . 0.;Michel. T-;Sinpl. D. J.; Lacdto. J.S-nimsyiauon
of pdicins wilh nimc oxidc: Synlhclis and chuicicriutioii of
biologicdiy active compoundr. P m . N d A d Sc USA
m444-448;
1992.
73. Kowduk. E A.: Fung. H-L. Spunaous l i k r u i o n of nirric
OU&cuunit m u n t for in Mm, v u n i l u nlurcion by S-nisothiols. J. P h o l l ~ t o l .4.&r. 25:1256- 1261; 1990.
74. Bsgurd S.; Aldcnhvilt, J.; Poulsen. H.E;Cbrisrenrrn. S.;
Digepcench H.: Gictc. J.N-wtylcysteirn inhibits angiotcnsin
convring enzyme in viw. J. Phormoc. &p. * r .
265:
123% 1244;1993.
75. Musoudy. P.; Becker, B. F.; GerWt. E BdyLinui r#ounts
for impaved portircbcmic function rnd dsnruad gluuthione
nlcrrc of guima pig htrn mme with the angio(cnrincorivming mzymc inhibitor nmipriiu J. &rdiovcucC Phormocol,

2k632-639; 1 W .

34DHBZ- 3,4-dihydroxyknzoate
GSH-duccd glutaihione
GSSG-oxidized glutathionc
LDH -lactate dchydrogenase
NAC-N-aceiylcystcinc
NE-nortpincphnnc
NNLA-N-u-nitro-L-arginine
NO-nitric oxide
ODFR-oxygcnderi vcd fm radid

ENERGY SUBSTRATES AND REACTIVE OXYGEN SPECIES MODULATE THE FLOW

RESPONSE OF RAT HEARTS REPERFUSED WlTH N-ACTYLCYSTEINE

Brunet, ~ulie',Laplante, Annick', Bouchard, Bertrand, Vincent, Genevihe'

and Des Rosiers, Christine8+'

Depanments of Nutrition' and Biochemistry' , University of Montrdal,

Montral, Qubec, Canada.

Running title: Coronary flow rate modulation.

To whom correspondence should be addressed: Laboratoire du mtabolisme

intermediaire, Centre de Recherches du CHUM, Campus Notre-Dame (Y-3616 ) , 1560
rue Sherbrooke est, Montreal, QuBbec, Canada, H2L 4M 1; Telephone; (5 14) 28 16000 t 7 4 7 7 . Facsimile; (5 14) 896-4762, E-mail; desrosiers@sympatico.ca.

80

ABSTRACT
We previously reported a N-acetylcysteine-induced sustained hyperemic response in

isolated rat hearts reperfused after 90 min low-fIow ischemia. This flow effect was
inhibited by a nitric oxide synthase inhibitor, but not if N-acetylcysteine was added
prior t o the inhibitor, suggesting that more than one rnechanism is involved. We here
report data in two different models of ischemia/reperfusion, showing that Nacetylcysteine flow effect is modulated by the energy substrate composition of the
perfusion buffer. Further, in agreement with Our previous study, this flow effect was
not correlated with improvement in cardiac function or tissue necrosis, nor was i t
correlated with hydroxyl radical production. However, it was found to be antagonized
by hydrogen peroxide and to a fesser extent by superoxide anions. Of rnany drugs,

only glibenclamide, a K *

, channel antagonist, decreased significantly the coronary

flow response of hearts perfused with N-acetytcysteine and energy substrates both
before and after ischemia. In conclusion, the coronary flow response of reperfused
hearts treated with N-acetylcysteine is acutely modulated by the presence of
exogenous energy substrates and reactive oxygen species, via a mechanism which
involve, a t least in part, K',,,

channels. Such interactions may explain why N-

acetylcysteine administration in vivo induced hypotension in some patients recovering

from cardiac surgery.

Keywords: thiol, heart preservation, Celsior solution,,,K

'

channels.

N-acetylcysteine (NAC) is one of many agents adrninistered in an anempt to

neutralize the deleterious effects of reactive oxygen species (ROSI and thus to
improve the recovery of heart function at reperfusion. It has shown promising effects
in cardiac patients (8,33).In a previous study (4), we documented a sustained

hyperemic response following NAC treatment in rat hearts reperfused after 90 min
low-flow ischernia. This flow effect was not related to NAC scavenging properties
nor was it associated with other beneficial effects on
against hydroxyl radicals (.OH),
cellular necrosis or cardiac function'. It was abolished by the nitric oxide synthase
inhibitor N-a-nitro-L-arginine, but only when the latter drug was added before NAC,
suggesting the involvement of more than one mechanism by which NAC modulates
coronary flow rates.

Only two of many studies on NAC treatment in cardiac

ischemia-reperfusion injury incfuding one in humans, reported soma flow effects

(8,351.

Most studies (22,301,but not al1 (9), documented an improvement of

contractile function, with no effect on tissue necrosis.

The reason for these

discrepancies is not clear, but it could be due to differences in experirnental models

or conditions.

Indeed, the type and extent of the ischernic insult is known to

influence the coronary flow response of ischernic/reperfused hearts as well as the

outcome of an antioxidant treatment (34). More promising indications for the use of
antioxidant therapy are clinical conditions where the ischemic insult is associated with
little cellular necrosis such as heart transplantation and surgery (20).

In transplantation, the recently developed Celsior solution (241, unlike other solutions

82
(such as Wisconsin and St-Thomas #2) was specifically designed for heart
preservation.

This extracellular type solution combines several advantages: (il

prevention of cell swelling by cellular impermeants (lactobionate and mannitol) and

high osrnolarity; (ii)enhancernent of endogenous thiol pools and antioxidant defenses
by addition of scavengers targeting different ROS; namely reduced glutathione

(hydrogen peroxide (H,O,),

superoxide anion

(O;.),peroxynitrite (ONOO')), histidine

(singlet oxygen ('0,))

and lactobionate (.OH); (iii)limitation of calcium overload by a
low calcium content. addition of a calcium chelator (lactobionate) and antagonist (high
Mg ' 1:

(iv) enhancement of anaerobic energy production (glutamate), and (v) high

buff ering capacity (lactobionate and histidine). Evidence for the superiority of this
preservation solution in the rat heart model led to ifs clinical investigation in Europe
(24). In spite of advantages offered by the Celsior solution for heart preservation. to
our knowledge, the effect of reperfusion conditions in this setting has not been
investigated aside from one study by Pietri et al. (29).

In view of the above considerations, we re-examined the effect of NAC in rat heans
reperfused after cardioplegic arrest and preservation in Celsior solution. Data from
these perfusion experirnents indicated an increased and sustained hyperemic response
in hearts treated with NAC only when the perfusion buffer contained energy

substrates mixture. This result led us to investigate the mechanism responsible for
this increased coronary flow response using another ischemia-reperfusion protocol.

c
Chemicals, enzymes and organic solvents were purchased from Aldrich Chernical Co.
(Milwaukee, W I), Sigma (St. Louis, MO), Boehringer Mannheim Canada (Laval,
Qubec), Fisher Scientific (Montral, Quebec), Anachernia (Montreal, Qubec),
Cardiotrol (Lactate dehydrogenase (LDH) from human serurn) was obtained from
Hoffmann-La Roche Ltd (Brampton. Ontario). N-Methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)trifluoroacetarnide was supplied by Regis Chernical Co- (Morton Grove, IL).
Glibenclamide (Giib), diphenyleneiodonium chloride (DPI), indomethacin, dirnethyl
sulfoxide and 1H-[1,2,4loxadiazoIo[4,3-a lquinoxalin- 1-one (ODQ) were bought from

Sigma (St. Louis, MO). All aqueous solutions were made with water purified by an

"Elgan system.

The Celsior cardioplegic solution, prepared essentially as described

by Menasche et al. (241, contained the following compounds (in mM): 15 potassium,

11 2 sodium, 13 magnesium, 0.25 calcium, 41.5 chlotide, 80 lactobionate, 60

mannitol, 30 histidine, 20 glutamate, 3 reduced glutathione (GSH).Final osmolarity

of the solution was 360 mOsm/L and pH at 4 "C was 7.4.

Al1 animal experirnents were approved by the local institutional animal care cornmittee
which follows guidelines of the Canadian Council on Animal Care. Male SpragueDawley rats weighing between 220-320 g were anesthetized by intraperitoneal

injection of sodium pentobarbital ( 7 0 mglkg) and received heparin (15 0

lu) by

intrajugular injection. After opening of the chest. hearts were rapidly excised, and
either promptly (i) installed on the Langendorff set-up as previously described (4) or

84
(ii) arrested by perfusing through an aortic cannula 30 mL (10 mL/min) o f cold Celsior

solution kept at 4 OC. Hearts were stored at 4 O

in 100 rnL of Celsior solution. After

4 h, they were flushed with 20 rnL (10 rnUmin) of Celsior solution and then perfused

aerobically for 60 minutes according to the Langendorff technique with a nonrecirculating modified Krebs-Henseleit bicarbonate buffer containing (in mM): 119
NaCI, 4.8 KCI, 1.3 CaCI,,

1.2 KH,PO,,

1.2 MgSO,, 24 NaHCO,,

1 1 glucose, 0.2

octanoate (a medium chain fatty acid) and 1 4-hydroxybenzoate (4HBZ). Note that
heart perfusion experiments with buffer containing 11 mM glucose and 0.2 mM
octanoate as sole ES are referred to s control conditions. 4-hydroxybenzoate was
added as a trapping agent for O H , as previously described (4). Other additions wete
as indicated. The perfusate concentration of the various agents infused was kept
constant despite variations in coronary flow using a cornputer program developed for
feedback control of the syringe pump (Harvard Instruments, South Natick, MA) (4).
Perfusion buffer, which had been filtered through a 5 pm membrane, was equilibrated
with 5% CO, and 95% 0,at the indicated temperature. A t all times, the heart was
enclosed in a tem perature-controlled, water-jacketed, chamber.

This study is divided in two parts. First, we exarnimd the effect of NAC in hearts
preserved for 4 h in cold Celsior solution. Then, perfusion experiments were designed
to identify the factor(s) or mechanism(s) responsible for the coronary flow effect
observed in the first set of experiments.

This was done using either in

preserved/reperfused heans (A) or using a second perfusion protocol (1 5 min global

ischemia and 30 min reperfusion) to allow treatment with various drugs before the

ischemic episode

(W.

P m / : Perfusion experhents in ~ e ~ e d / f e p e r f u s e
heerts.
d
Various indices of the

oxidative, metabolic andlor functional status of the hearts were documented in a total
of eight conditions.

This includes initial sets of perfusion experiments:

(i) t o

document the effect of preservation and (ii)to define conditions of pressure and
temperature under which hearts preserved for 4h in cold Celsior solution ought to be
reperfused to study the effect of NAC. Two different protocols of pressure and
temperature were tested: (i)Reperfusion for 60 min a t a constant pressure of 70 m m
Hg with a buffer equilibrated at pH 7.4 and 37

O C

with 5 % CO, and 95% 0,(sudden

reperfusion; n = 7 ) or (ii)reperfusion at a pressure of 30 mm Hg with a buffer

equilibrated at 23 O C with 5% CO, and 95% 0,(pH 7.2) for the first 10 min and then
at 70 mm Hg with a buffer equilibrated at 37 'C with 5% CO, and 95% 0,(pH 7.4)
for the remaining 50 min (gradua/ reperfusion; n = 7).

Then, the effect of NAC was examined using the sudden reperfusion protocol.

fffect

~f NAC: Hearts were reperfused at 70 mm Hg with buffer containing 1 1 mM glucose

and 0.2 mM octanoate alone (contro/conditions) or in combination with other energy

substrates (ES; in mMI: 0.5 lactate. 0.1 pyruvate, 0.2 fumarate, 0.2 glutamate, 0.2
valine. When indicated, NAC andlor dichloroacetate (DCA: a pyruvate dehydrogenase

activator), were infused for the first 20 minutes of the perfusion at a final
concentration of 0.1 and 1 mM, respectively. The stock solution of NAC (10 mM)
was prepared fresh before use with deionized nitrogen-equilibrated water. That of
DCA (100 mM) was kept frozsn until the experirnent. These solutions, whose pH

was adjusted t o 7.4, were protected from light.

Part II. Effect of va#ious intemtions on the coronary f/ow fesponse of heerts
perfused with NAC: (A) First. we enamined whether the following interventions
would modify the coronary flow response of preserved hearts reperfused with NAC,
ES and DCA as described above. (i) Removal of DCA, or (ii) increased ROS

concentrations. either O," or H,O,.

NAC (0.1 mM) was infused during the first 20

min of reperfusion. either (ilalone. (ii) with DCA (1 mM) and pyrogallol (an intracellular

O;' generator, 10 PMI, or (iii)with DCA ( 1 mM) and

HP ,(50 PM). (BI Then, we

docurnented the effect o f various drugs was documented on the coronary flow rate
of hearts subjected to 15 min global ischemia and 30 min reperfusion in the presence
of 0.1 mM NAC and 11 rnM glucose, either alone, or with ES (in mM: 1 lactate, 0.2
pyruvate, 0.2

octanoate and 0.2

fumarate).

NAC was infused at 0.1 rnM

throughout the perfusion, starting 30 min before the ischernic episode.

Stock

solutions of the various drugs, prepared in either 95% ethanol (indornethacin 100
mM) or dirnethyl sulfoxide (DPI 20 mM; ODQ 20 m M and Glib 20 or 100 mM), were

diluted either in saline and infused or added directly t o the perfusion buffer. The final
perfusate concentration of the vehicle, less than 0.01 %(ethanol) or 0.05% (dimethyl
sulfoxide), did not affect coronary flow rate (not shown).

Functional parameten: Parameters were rnonitored during the

perfusion experiments through instruments Iinked t o microcornputers (Hewlett
Packard Vectra ES and IBM compatible Logic AT 486) as described previously (41.
These included (il the coronary flow rate using an electromagnetic flow probe (Mode1

87
FM501, Carolina Medical Electronics Inc., King, NC) installed above the aortic
cannula, and (ii) the heart temperature, using a thermocouple (Yellow Springs
Instrument Co., Inc, OH) attached to the surface of the heart. Finally, the contractile
function was evaluated during the last 20-min of reperfusion by inserting into the left
ventricular cavity, a saline-filled latex balloon inflated t o yield a diastolic pressure
between 5 t o 10 mm Hg and connected t o a pressure transducer (Digi-Med Heart
Performance Analyser, Micro-Med, Louisville, KY). We favoured balloon insertion at
a later time in reperfusion t o limit mechanical stress ( 2 7 ) although this precluded
measurements of an increase in diastolic pressure.

Biochemical parameters: Effluent perfusates: Procedures for the assay of effluent

perfusate concentrations and release rates of the following parameters were
previously described (4): (il3,4-dihydroxybenzoate (340HBZ from the hydroxylation
of 4-hydroxybenzoate, an index of .OH formation; 4 mL untreated perfusate), ( i l LDH

(an index of cellular necrosis; perfusate diluted with 245 mM TRIS buffer pH 7.0 to
yield 10 U LDH/L) and (iii)lactate (an index of ischemic challenge and anaerobic
glycofysis, 0.5 mL untreated perfusatel. LDH was assayed within 20 minutes of
sample

collection

and

lactate

on

previously

frozen

samples,

using

spectrophotometer (Roche COBAS FARA). 340HBZ was assayed by selected ion

monitoring gas chrornatography-mass spectrometry (SIM-GCMS, Hewlett Packard; GC

5890 coupled to an MSD 5972) on previously frozen samples spiked with 1 nmol of
the external standard 2,5-dihydroxybenzoate.

AN sarnples were acidified, satured

with NaCI, and extracted with diethyl ether. The combined ether phases were dried
with anhydrous sodium sulphate and geritly evaporated under a nitrogen Stream. The

88
dry residues were converted t o t-butyldirnethylsilyl derivatives by the addition of 75
pL of N-methyl-N-(t-butyldimethylsilyl)-trifluoroacetamde.

34DHBZ data were

corrected for background noise as previousty described (4).

Tissue homugenates: For tissue content of GSH, oxidized glutathione (GSSG) and
adenine nucleotides (ATP, ADP, AMP), freeze-clamped hearts, which had been stored
a t -1 96

OC,

were pulverized in a mortar cooled with liquid nitrogen. The powdered

frozen tissue was homogenized using an ultrasonic disintegrator (Vibra Cell, Sonics
& Materials Inc., Danbury, CN). Conditions for GSH and GSSG assay (80mg tissue

homogenized in 1 mL of 5% sulfosalicyfic acidl were previously described (4).

Concentrations of adenine nucleotides (375 mg tissue homogenized a t 4" C in 1.5 mL
6% perchloric acid) were determined enzymatically using a kit (ATP, Sigma #366)and
standard rnethods (ADP and AMP) (11.

StatlStica/anaIys&. Data are expressed as means

SE. Effects of interventions on

the various parameters were analyzed using the indicated test. A probability of p <
0.05 was considered statistically significant. The average factor for conversion of

measured g wet weight to g dry weight was determined to be 8.85 i0.16 (n = 29).

89

BESUIS
E f i c t of hest?pmserva?ionin CeIsiorso/utl4n: Table 1 reports the content in GSSG,

GSH, and adenine nucleotides of hearts before and after 4 h cold preservation in
Celsior solution. Preserved hearts contained significantly more GSH and GSSG, but
maintained a similar [GSHI/[GSSGI ratio, than non-preserved hearts.

They also

showed a higher tissue level of adenine nucleotides and a lower value for the ratio
[ATPI/[ADPl. The increased total glutathione of heans preserved in Celsior solution

results from the composition of this cardioplegic solution. Indeed. for cornparison,
hearts preserved for 4 h in St-Thomas #2 solution showed a total glutathione and
adenine nucleotides ( 1 .O7 0.02 and 2.92 I 0.08 umollg wet weight, n = 5 )
content similar to non-presewed hearts. but a similar ratio [ATPl/[ADPI (1.68 IO. 14)
to hearts preserved in Celsior solution.

Reco very of preserved/mperfusetf rat hearts under control cond'ions: Figs 1 and 2

(open bars) show the functional and biochemical parameters rneasured in preserved
hearts reperfused at a ConRant pressure of 70 mm Hg with buffer containing 1 1 mM
glucose and 0.2 mM octanoate as sole energy substrates (control conditions/.
Cornpared to non-preserved rat hearts (data not shownl, preserved/reperfused rat
hearts maintained a similar coronary flow rate, but showed a lower contractile activity

(25-40% lower dP/dt), released several-fold more LDH (threefold), GSH + GSSG (400fold) and 34DHBZ (20-fold) and contained less adenine nucleotides (40%) despite
sirnilar ratio [ATPI/[ADPI. Cornpared t o hearts reperfused for 30 min after 90 min
low-flow

ischernia,

mode1

which

we

previously

charactetized

(4),

90
preserved/reperfused hearts showed 72% less LDH release, indicating that the
preservation model is associated with less tissue necrosis.

Note that none of the parameters rneasured were significantly modified by staged
reperfusion of preserved hearts Fig. 2. hatched bars), although the time-profile of the
coronary flow and LDH release rates showed a biphasic response, with maximal
values observed at 10-15 min, concomitant with the rise in pressure and temperature

(Fig. 1, hatched bars). This finding points out the importance of measuring LDH
release, as well as other indices, at several time points during reperfusion to assess
total release.

Effects of NAC in preserved/~epedrsedhearts:

Effects of NAC alone or in combination with a mixture of ES and DCA was

documented in preserved hearts reperfused at a constant pressure of 70 mm Hg.
Note that under control conditions, the ES present in Our perfusion buffer (glucose and
the medium chain fatty acid octanoate) supply acetyl-CoA from P-oxidation of
octanoate in non limiting amounts to the citric acid cycle whose activity is crucial for
the energy metabolism of the heart (5). Othet substrates were added t o our buffer

(lactate, pyruvate, glutamate, fumarate and valinei to feed al1 pathways of oxidative
and anaerobic energy production.

Lactate and pyruvate. added at physiological

concentrations, maximizes anaplerotic oxaloacetate supply for citrate formation (5).

Glutamate, fumarate and valine, which were shown to be cardioprotective by others,
favor formation of succinate by pathways linked to ATP formation by substrate level

91
phosphorylation (17.1 8.32). Finally, DCA, a pyruvate dehydrogenase activator.
enhances the post-ischernic myocardial functional recovery by favoring glucose over
fatty acid oxidation (19,381.

As shown in Fig. 2, none of the measured indices of contractile function (dP/dt,),

necrosis (LDH), energy status (tissue adenine nucleotide), oxidative stress (tissue
glutathionel or -OH production (34DHBZ1, were

significantly modified by

supplernentation of the perfusion buffer with NAC either alone, or with the ES
mixture and DCA.

However, as shown in Fig. 3, hearts reperfused with the

combination NAC, ES and DCA maintained a higher coronary flow rate. The three-way

ANOVA testing the effect of NAC, ES plus DCA or tirne revealed an effect of ES plus

DCA (p< 0.00 1 and an interaction between NAC and ES plus DCA (pc0.0011, w hich
was independent of time.

Effects of vadus interventions on the comnary tbw response of hearts pedused with

NAC. We attempted to identify factors undedying andlor modulating the coronary

flow response in preserved hearts repsrfused with NAC and ES plus DCA. As shown

in Fig. 4, we found that the flow response was antagonized by H2O2(p < 0.05). and
to some extent by pyrogallol, an intracellular O,.-generator (p =0.07). However, it

was not affected by the removal of DCA, nor did this intervention modify the recovery
of contractile function h o t shown).

Then, perfusion experiments were performed using another protocol. narnely 15 min

92
global ischemia and 30 min reperfusion, an insult considered t o be mild (12). This
protocol allowed treatment with drugs before the ischemic period. The choice of drug
tested was based on their known inhibitory effect on one of the many processes
proposed t o participate in coronary flow regulation (see discussion for details).

Similar to hearts reperfused after preservation, hearts subjected t o 15 min of ischemia

and 30 min reperfusion in the presence of NAC and ES (in mM: 11 glucose, 0.2
octanoate, 1 lactate, 0.2 pyruvate, 0.2 fumarate) maintained higher coronary flow
rates than those perfused with NAC and glucose atone (Fig. 5A). This flow difference
was significant both before and after the ischemic episode, except for peak hyperemic

flow rate values observed within the first few minutes of reperfusion. Of the various
diugs tested, neither DPI (10 NM; inhibitor of cytochrome b,,,-NADH-oxidase
indomethacin

(261,

(IOPM; inhibitor of the cyclo-oxygenase pathway) nor ODQ ( 10 pM or

30 gM; specific inhibitor of soluble guanylate cyclase (sGC)(31)) affected significantly

coronary flow rates of heans petfused with NAC and ES despite the fact that these

drugs were tested using various protocols2. However, preliminary experiments

showed a reversible. dose-dependent coronary flow rate inhibition by a K

',, channet

blocker (Glib;f O and 50 PM) in pre- and post-ischemic hearts perfused with NAC and

ES mixture3. On this basis, and considering that the presence of Glib during the
ischernic insuit could modify the post-ischemic recovery of heart function (10,361, we
chose the following infusion protocol. The infusion of Glib (10 PM), which lasted 10

min during the pre-ischemic period, was interrupted for 10 min prior t o ischemia and
then resumed for 20 min at the third min of reperfusion.

93
As shown in Fig. 56. Glib infusion significantly decreased the coronary flow rate of

pre- and post-ischemic hearts treated with NAC irrespectively of the energy substrate
composition of the perfusion buffer. although the recovery of flow at reperfusion was
significantly greater in hearts supplied with NAC plus the ES mixture. Note that Giib

infusion did not affect the peak hyperemic response shortly after reperfusion,
suggesting that it did not modify the magnitude of the ischemic insult.

The major findings of the present study can be summarized as follows.

Data

demonstrate that the coronary flow rate of rat hearts perfused with NAC depends on

the nature of the energy substrates feeding the heart. This effect of exogenous
substrates was documented under various perfusion conditions, namely normoxia,
reperfusion after 4h preservation in cold Celsior solution or after 15 min global
ischernia. Although other investigations are needed to identify the exact mechanism
underlying this effect. our data suggest that ROS and K',
considered in the overall mechanistic scherne.

channels ought to be

Indeed, data obtained in

preservedheperfused hearts indicated that the sustained hyperemic response observed

in the presence of NAC and ES was antagonized by H,O,. and t o some extent by

O;'.

However, it was not related to NAC's direct scavenging of .OH as indicated by the

34DHBZ data. suggesting that effect of NAC is probably related to its thiol function.
Further, data obtained in ischemic/reperfused hearts demonstrated t h a t the flow
response of heans perfused with NAC and ES was inhibited by Glib. a KIATpchannel
blocker.

To our knowledge, an interaction between NAC, ES and ROS (H,O, and to some
extent O;' but not .OH) in the flow rate modulation of reperfused hearts has not been
documented before.

Effects of exogenous metabolic substrates such as lactate,

pyruvate or glutamate, or of exogenous and endogenous thiols, on the recovery of

coronary flow rates of ischemic/reperfused hearts have been reported separately

95
(4,7.16,18,35). A modulating effect of exogenous substrates may explain why, in
our previous study, NAC treatment elicited a sustained hyperemic response in rat
hearts reperfused after 90 min low-flow ischernia (41. The exact nature of the energy
substrate(s) responsible for the flow effects reported in this and previous (4) studies
cannot be deterrnined. lactate (20.2 mM1 and/or octanoate (0.2 rnM) appear likely
candidates, since they are the only two common substrates present in al1 perfusions
experiments where an increased ffow rate in hearts treated with NAC was observed.

The involvement of K,+,,

channels in coronary flow regulation under our perfusion

conditions is suggested by the effect of Glib3 and would be supponed by the reported
modulation of K

+,,channels
,

activity by lactate concentration in the mM range

(1 1,151 as well as the thiol redox status (6,14,37). However, the implication of other
mechanisrns is by no rneans excluded. Coronary flow regulation is cornplex and
involves interactions between several vasodilating and vasoconstricting agents. Other
proposed factors are NO, adenosine and prostaglandins which would act by

modulating the activity of sGC, adenylate cyclase, and/or K

+,.

channels (3.28).

Among these processes, sGC activity was shown to be increased by lactate via a
rnechanism involving the participation of microsomal NADH-dependent cytochrorne
oxidase and the formation of H,O, (26). However, from perfusion experiments

with various drugs (DPI, an inhibitor of cytochrorne oxidase b5,.; ODQ. an inhibitor
of sGC; indomethacin, an inhibitor of cyclo-oxygenase). we obtained no evidence

indicating that those pathway could explain the increased flow of hearts perfused
with NAC and ES. However, an involvement of K',,

channels cannot be excluded.

96
Indeed, Bolotina et al. (3) reported that .NO directly activates K+,

channels in

vascular smooth muscle, without requiring cGMP formation. This latter observation
suggests that .NO could be involved in the modulation of coronary flow in our model

even in the presence of ODQ, a specific

sGC inhibitor.

This view would be

strengthened by data from our previous study indicating that NAC's effect on fiow
involve the formation of NO either via the NO synthase pathway andlor possibly
formation of S-nitrosothiol. An involvement of N O could also explain the slight
inhibition of flow observed in the presence of the superoxide generator (pyrogallol).
Indeed, O;' are known to react rapidly with .NO to form ONOO-, thus decreasing .NO
concentration (21). However, another explanation must be sought t o explain the
greater inhibitory effect of H,O,

compared t o pyrogallol addition. One possibility is

that H,02 lowers the open probability of

,,'K

channels through changes in the thiol

redox status (6.14.371. Thess changes could occur following oxidation of the cellular
thiol redox status. since the reduction of H,O,
GSH to GSSG.

to H20is linked to the conversion of

This explanation is, however, speculative and remains to be

investigated.

Other data presented in this paper should also be discussed, such as the effect of
NAC alone, or combined with an energy substrate therapy, in heans subjected ta a

mild ischemic insult, Le. inducing little necrosis. It turned out that the choice of our
presewation solution was probabty a determining factor in dernonstrating a sustained
coronary flow response in the presence of NAC and ES, although this effect was not
associated with an irnproved recovery of contractile function or decteased cellular

97
necrosis. Note, however, that we did not evaluate the early recovery of function or
the contractile reserve ("stunning" cornponent e.g., following adrenergic stimulation

( 2 ) ) . This could have revealed differences in the functional recovery of preserved

hearts reperfused under the various conditions.

We favored measurements of

contractile function at a later time in the reperfusion period to delineate effects of

reperfusion on measured indices from those due t o mechanical stress of balloon
insertion into the ventriculai cavity. This view was strengttiened by Our observation

of a transiem increase in LDH and GSH release rates upon balloon insertion (from 1.5
I0.2

to 3.8 I0.6 U15 min and from 22 r 5 to 6 1

10 nrnolf5 min, respectively;

p <O.OO5).

Nevertheless, ouf data contrasts with those of many other studies with preserved
hearts where a beneficial effect of a single intervention (either addition of an
antioxidant, an energy substrate, or gradua1 rise of pressure) was reported (23,25,321.
However, none of these studies used the Celsior solution, a solution which contains
elements to rninimize oxidative damage, oedema, calcium overload and maximire
anaerobic energy metabolism. Under these conditions, the effect of any reperfusion
intervention on the biochernical and functional paiameters measured might have been
mitigated. This raises the possibility that when hearts are adequately protected
during the preservation period, the reperfusion technique is not crucial.

In conclusion, our data demonstrate that the coronary flow rate of post-ischemic
heans is acutely modulated by interactions between exogenous ES. W C . ROS (H,O,

98
or O;-, but not -OH). These interactions are likely t o be mediated, at least in part, by
changes in
,,'K

channel activity. However, other investigations are needed to (i)

evaiuate a possible effect of .NO on K+,, channel activity, and to identify (ii)the
nature of the energy substrate(s), although the presence of lactate with or without
octanoate appears to be crucial and (iii) the mechanism by which NAC exerts its
effect, either directly, after its conversion to GSH or via nitrosothiol formation.
Clarification of these aspects would appear to be relevant to a more effective use of
NAC in vivo in cardiac patients. Indeed, although increased K',

channel activity

could benefit hypertensive patients, it could also elicit hypotension in others as

reported by Ferrari et al. ( 8 ) and Horowitz et al. (13). Finally, altogether our data
underline the importance of considering the nature of energy substrates feeding the
hean (defined by the composition of the perfusion buffer in vitro, or of the blood in
vivo), as well as the rnyocardial redox thiol status, on the regulation of coronary flow.

99

Footnotes
1

The functional recovery of hearts subjected t o 90 min low-flow ischemia and

30 min reperfusion i n the absence or presence of NAC evaluated by the rate

pressure product [(RPP in beatdmin X mm Hg) X 10' = (heart rate X (systolicdiastolic pressure))] was 141 6 (NAC; n = 2) and 13 I 1 (control; n =3),
respectively (unpublished data).

Indomethzcin (10pM; n = 2) or DPI (10pM; n = 2) or ODQ (10 pM;n = 4 ) was

infused for 20 min prior to ischemia, starting 10 min after NAC, and during
reperfusion. In addition, ODO (10pM; n =4) was also infused for 30 min prior
to ischemia, starting 10 min prior t o NAC, and during reperfusion. When the
concentration of ODQ was raised to 30pM, the coronary flow rate was not
decreased as would be expected from sGC inhibition.

An implication of K',,,

channels in the preservation/reperfusion protocol,

though not systematically examined, was supported by the results of t w o

experiments: the coronary flow rate of preserved hearts reperfused for 30 min
with NAC and ES was rapidly decreased by 15 I3% (n = 2 ) upon the infusion
of Glib (50 PM).

This work was supported by grants from the Medical Research Council of Canada
(MT-1081 6 and MT-10920 to C. Des Rosiers) and by a Studentship from the
Department of Nutrition of the University of Montreal (to J. Brunet).

DCA: dichloroacetate
DPI : diphenyleneiodonium chioride

ES: energy substrates

34DHBZ: 3,4-dihydroxybenzoate
Glib: glibenclamide

GSH: reduced glutathione

GSSG: oxidized glutathione

LDH: lactate dehydrogenase
NAC: N-acetylcysteine

000:1H-[l,2,4loxadiazolo[4,3-a Iquinoxalin-1-one
ROS: reactive oxygen species

sGC: soluble guanylate cyclase

101

References
1.

Bergmeyer, U.H. Methods of Enzymatic Analysis (Second English Edition).

New York, Academic Press, Inc., 1 974, p2127-213 1 .

2.

Bolli, R., W-X. Zhu, M.L. Myers, C.J. Hartley, R. Roberts. Beta-adrenergic
stimulation reverses post-ischemic myocardial d ysfunction without producing
subsequent functional deteriotation. Am. JI Cardiol. 56:964-968, 1988.

3.

Bolotina, V.M., S. Najibi, J.J. Palacino, P.J. Pagano, R.A. Cohen. Nitric oxide
directly activates calcium-dependent potassium channels in vascular smooth
muscle. Nature 368:850-853, 1994.

4.

Brunet, J., M-J. Boily, S. Cordeau, C. Des Rosiers. Effects of N-acetylcysteine

in the rat hean reperfused fter tow-flow ischemia: Evidence for a direct
scavenging of hydroxyl radicals and a nitric oxide-dependent increase in
coronary flow. Free Radic. Biul. Med. 19:627-638, 1995.

5.

Comte, B., G. Vincent, B. Bouchard, M. Jett, S. Cordeau, C. Des Rosiers. A

13Cmass isotopomer study of anaplerotic pyruvate carboxylation in petf used
rat hearts. J. Biol. Chem. 42:26 125-26 1 31, 1997.

6.

Coetzee, W.A., T.Y. Nakamuta, J-F. Faivre. Effects of thiol-modifying agents

on Km channels in guinea pig ventricular cells. Am. J. Physiol. 269:H 1625H1633, 1995.

7.

de Groot, M.J.M., G.J. van der Vusse. The effects of exogenous lactate and
pyruvate on the recovery of coronary flow in the rat heart after ischaemia.

Cardiovasc. Res* 27:1088-1093, 1993.

8.

Ferrari, R., C. Ceconi, S. Curello, A. Cargnoni, O. Alfieri, A. Pardini, P.

Marzollo, O. Visiolo. Oxygen free radicals and myocardial damage: Protective

role of thiol-containing agents. Am. J. Med. 9 1 :(supp1.3C):95s-1 OSs, 199 1.

9.

Forman, M.B., D.W. Puett, C.U. Cates, D.E. McCroskey, J.K. Beckrnan, H.L.
Greene, R. Virmani. Glutathione redox pathway and reperfusion injury. Effect
of N-acetylcysteine on infarct size and ventricular function.

Circulation

78:202-213,1988.

10.

Grover, G. J. Pharmacology of ATP-sensitive potassium c hannel (KM,) openers

in models of myocardial ischemia and reperfusion. O n . J. Physiol. Pharmacol.
75:309-315, 1997.

11.

Han, J., 1. So., E-Y. Kim, Y.E. Earm. ATP-sensitive potassium channels are

modulated by intracellular lactate in rabbit ventricular myocytes. Pflgers

Arch. 425546-548, 1993.

12 .

Henry, T.D.,

S.L.Archer, D. Nelson, E.K. Weir, A.H.L. From. Postischemic

oxygen radical production varies with duration of ischemia. Am. J. Physiol.

1 3.

Horowitz, J.D., C.A. Henry, M.L. S yrjanen, W. J. Louis, D. Fish, T. W. Smith,

E.M. Antman.

Combined use of nitroglycerin and N-acetylcysteine in the

management of unstable angina pectoris. Circulation 77:787-794, 1988.

14.

Islam, S., P-O. Berggren, O. Larsson. Sulfhydryl oxidation induces rapid and
reversible closure of the AT?-regulated K + channel in the pancreatic P-cell.
FEBS Lett. 319 :1 28-1 32, 1993.

1 5.

Keung, E.C.,

a. Li.

Lactate activates ATP-sensitive potassium channels in

guinea pig ventricuiar myocytes. J. Clin. lnvest. 88: 1 772- 1777, 199 1 .

16.

King, LM., F. Boucher, L.H. Opie. Coronary flow and glucose delivery as
determinants of contracture in the ischernic myocardium. J Mol. Ce//. Cardiol.
27:7Ol-72Or 1995.

1 7.

Laplante, A., G. Vincent, M. Poirier, C. Des Rosiers. Effects and metabolism

of fumarate in the perfused rat heart. A l3C mass isotopomer study. Am. J.
Physiol. 272:74-E82, 1997.

18.

Lazar, H.L., X. Yang, S. Rivers, D. Stockwell, R.J. Shemin. Superiority of

substrate enhancement over oxygen free-radical scavengers during extended
periods of cold storage for cardiac transplantation. Surgery 108:423-430,

19.

Lopaschuck, G.D., M. Saddik. The relative contribution of glucose and fatty

acids t o ATP production in hearts reperfused following ischernia. Molec. Ce//.
Biochem. 1 16:111-116, 1992.

20.

Manch, A., S.J. Edmondson, D.J. Hearse. Dynamics of early postischemic

myocardial functional recovery. Evidence of reperfusion-induced injury?

Circulation 92:526-534, 1995.

21.

Marin, J. M.A. Rodriguez-Martinez. Nitric oxide, oxygen-derived free radicals

and vascular endotheliurn. J. Auton. Pharmacol. 15:279-307,1995,

22.

Menaschd, P., C. Grousset, Y. Gauduel, C. Mouas, A. Piwnica. Maintenance

of the rnyocardial thiol pool by N-acetylcysteine: An effective rneans of
improving cardioplegic protection. J. Thorac. Cadiovasc. Surg. 103:936-944,

1992.

23.

MenascM, P., C. Grousset, C. Mous, A. Piwnica. A promising approach for

improving the recovery of heart transplants. Prevention of free radical injury
through iron chelation by deferoxamine. J. Thorac. Cadiovasc. Surg. 1 00: 13-

21, 1990.

24.

Menasche, P., J.L. Termognon, F. Pradier, C. Grousset, C. Mouas, G. Alberici,

1 O5
M. Weiss, A. Piwnica, G. Bloch. Experimental evaluation of CeIsior, a new

heart preservation solution. Eur. J. Cardio-thorac. Surg. 8:207-213, 1994.

25.

Minor, T., J. Sturz, H. Klauke, W. Isselhard. Reduction of oxidative tissue

injury and endothelial dysfunction by graduated reperfusion after cardioplegic
arrest in isolated rat hearts. Free Radic. Biol. Med. 18:621-626, 1995.

26.

Mohazzab-H, K.M., P.M. Kaminski, R.P. Fayngersh, M.S. Wolin.

Oxygen-

elicited responses in calf coronary arteries: Role of H,O, production via NADHderived superoxide. Am. J. Physiol. 27O:H 1044-H1053, 1 996.

27.

Nishimura, M., H. Takami, M. Kaneko, S. Nakano, H. Matsuda, K. Kurosawa,

T. Inoue, K. Tagawa.

Mechanism of rnitochondrial enzyme leakage during

reoxygenation of the rat hean. Cardiuvasc. Res. 27: 1 1 16-1122, 1993.

28.

Park, K.H.,

L.E. Rubin, S.S. Gross, R . Levi.

Nitric oxide is a mediator of

hypoxic coronary vasodilatation. Relation to adenosine and cyclooxygenasederived metabolites. Circ. Res. 7 1:992-100 1, 1992.

29.

Pietri, S., M. Culcasi, B. Albat, G. Albdrici, P. Menasch6. Direct assessment

of the antioxidant effects of a new heart preservation solution, Celsior. A
hemodynamic and electron spin resonance study. Transplantation 58:739-742,

1994.

1O 6

30.

Qiu, Y., D.J. Hearse.

The influence of N-acetylcysteine on cardiac function

and rhythm disorders during ischemia and reperfusion. Cardioscience 1:65-74,

1990.

31.

Schrammel,

A-.

S.

Behrends, K.

Schrnid. D.

Koesling,

B.

Mayer.

-one as a heme-site
Characterization of 1H-[l,2,4]0xadiazoloi4,3-alquinoxalin-1
inhibitor of nitric oxide-sensitive guanyl yl cyclase. Molec. Pharmacol. 50: 1-5,
1996.

32.

Shug, A L . , D. Madsen, R. Dobbie, D.J. Paulson. Protection of mitochondrial

and heart function by amino acids after ischemia and cardioplegia. Life Sci.
54:567-577, 1994.

33.

Sochman. J.. J.H. Peregrin. Total recovery of l e h ventricular function after

acute myocardial infarction: Comprehensive therapy with streptokinase, Nacetylcysteine and percutaneous transluminal coronary angioplasty. /nt. J.

Cardiol. 35:116-118, 1992

34.

Takernura, G.. T. Onodera. M. Ashraf. Quantification of hydroxyl radical and

its lack of falevance to myocardial injury during early reperfusion after graded

ischemia in rat heart. Ckc. Res. 7 1 :96-lO5, 1992.

35.

Tang,

L.D., J-2. Sun, K. Wu, C-P. Sun, 2-M. Tang. Beneficial effects of N-

acetylcysteine and cysteine in stunned myocardium in perfused rat heart. Br.

36.

Tosa ki, A., F.A. Hellegouarch. Adenosine triphosphate-sensitive potassium

channel blocking agent arneliorates, but the opening agent aggravates,
ischemiaheperfusion-induced injury. J. Am. Col/. Cardiol. 23:487-496, 1994.

37.

Tricarico, D.,

O. Conte Camerino. ATP-sensitive K' channels of skeletal

muscle fibers from young adult and aged rats: Possible involvement of thioldependent redox mechanisms in the age-related modifications of their
biophysical and pharmacological properties. Molec. Pharmacol. 46: 754-76 1 ,

1994.

38.

Wahr, J.A., D. Olszanski, K.F. Childs, S. Bolling. Dichloroacetate enhanced

rnyocardial functionai recovery post-ischemia: ATP and NADH recovery. J.
Surg. Res. 63:220-224, 1996.

108
TABLE 1.

Effect of 4 h hypothermie presenration in Celsior solution on the

myocardial glutathione and adenine nucleotide status.

GSH + GSSG (ymollgww)

0.95

GSHIGSSG

81 9 (9)

I0.02 (9)

2.27 I0.02 (51"

98

* 6 (5)

Hearts were freeze-clamped either before or after preservation for 4 houis in cold

Celsior solution. They were pulverized and homogenized for the determination of
concentrations of reduced and oxidized glutathione (GSH and GSSG) and adenine
nucleotides (ATP, ADP, AMP). Values are means

* SE (n- 4 to 9). *p < 0.05. using

an unpaired two-sided t-test. gww = g wet weight.

FIGURE 1.

Effect of sudden vs staged reperfusion of preseived hearts on the timeprofile of coionary flow (A) and LDH release (8) rates.

Preserved hearts were reperfused with standard buffer either (il at a constant
pressure of 70 mm Hg and at 37

O C

for 60 min (sudden reperfusion), or (ii)a t a

pressure of 30 mm Hg and at 23 "C for 10 min and then at 70 mm Hg and at 37

"C

for 50 min (stagedreperfusion). Samples of effluent perfusate for the assa y of LDH
were collected for 5 min ending at the indicated tirne.

The coronary flow rate was

continuously monitored and averaged for 5-min period ending at the indicated time.

Values are means ISE (n = 7 ) . ' p ~ 0 . 0 5using an unpaired two-sided t-test.

110

FIGURE 2.

Biochemical (A & 6 ) and functional parameters (Clmeasured in hearts

reperfused under various conditions after 4 h hypotherrnic presewation.

Hearts were preserved for 4 hours in cold Celsior solution. They were then reperfused

for 60 min a t a constant pressure of 70 m m Hg (sudden reperfusion), with standard

buffer alone (control; CTRL) or enriched in ES (in mM: 0.5 lactate, 0.1 pyruvate, 0.2
fumarate, 0.2 glutamate, 0.2 valine). When indicated, NAC (0.1 mM) and/or DCA ( 1
mM), were infused for the first 20 min.

In addition, one group of hearts was also

reperfused with standard buffer at a pressure of 30 mm Hg and a t 23

O C

for 10 min,

and then at 7 0 m m Hg and at 37 OC for 50 min (stagedrepedusion). Values shown

are means ISE (n =3-71. For LDH and 34DHBZ (n =6-7), values reflect cumulative
release during the first 30 min or 15 min of reperfusion, respectively. Functional
parameters (LVDP: left ventricular developed pressure; dPldt; n = 3-61 are reported for
the indicated number of non-fibrillating hearts (see fractional number above the dP1dt
bars).

The tissue glutathione and adenine nucleotide status was determined in

homogenates of pulverized freeze-clamped hearts (n = 3-61. One wa y analysis of

variance: NS in al1 cases. gww =g wet weight.

111

Effect of an antioxidant andlor energetic interventions on the coronary

FIGURE 3.

flow iesponse of preservedlreperfused heans.

Other data from experiments described in Fig. 2 with preserved hearts reperfused in
the presence of NAC and /or ES (in mM: 0.5 lactate, 0.1 pyruvate, 0.2 fumarate, 0.2
glutamate, 0.2 valine) and DCA. The coronary flow rate was continuously monitored
and averaged for a 5 min period ending at the indicated tirne. Values are means I
SE (n= 6-71. A three-way analysis of variance: Time independent effect of treatment:

NAC: NS; ES
NAC x ES

+ DCA: p < 0.001 ; time independent interaction between treatments:

+ DCA: p <0.001.

112

FIGURE 4.

Effects of ROS addition and of DCA removal on the coronary flow

response of preserved hearts reperfused with NAC and the energetic
therapy .

Hearts, presewed for 4 hours in cold Celsior solution, were reperfused a t 70 mm Hg

and 37 O C with standard buffer enriched in ES (in mM: 0.5 lactate, 0.1 pyruvate, 0.2

fumarate, 0.2 glutamate, 0.2 vaiine). NAC (0.1 mM) was infused during the first 20
min of ieperfusion, either (i) alone (-DCA) or (ii) with DCA (1 rnM) and pyrogallol

(PYRO; an intracellular 0;-generator, 10 PM), or (iii)with DCA ( 1 mM) and H, O, (50

PM). The coronary flow was continuously monitored and was averaged for the first

30 min of reperfusion. Flow values are means I SE (n = 3-81, One way analysis of

variance: 'p < 0.05 and #p< 0.07, al1 conditions vs NAC + ES

+ DCA (NONE}.

113
FIGURE 5.

Effects of exogenous energy substtates in the absence (A) or presence

(8) of a K',,

channel inhibitor (glibenclamide) on the coronary flow

rate of NAC-treated hearts subjected to 15 min global ischemia and 30

min reperfusion.

Hearts perfused with buffer containing 1 1 mM glucose, either alone (O), or with other

ES (in mM: 0.2 mM octanoate, 1 lactate, 0.2 pyruvate and 0.2 fumarate;
subjected to 15 min global ischemia and 30 min reperfusion.

a),were

Further, NAC was

infused at 0.1 mM throughout the perfusion experiment, starting 20 min before the
ischemic episode. The infusion of Glib 10 yM ( 6 , as indicated) which lasted 1O min
during the pre-ischemic period, was interrupted 10 min prior to ischernia, and then
resumed for 20 min a t the third min of reperfusion. The coronary flow rate was
continuously monitored. Flow values shown are averages of 3 min period starting at
the indicated time, and they are means ISE (n =4-8). For perfusion experiments in
the presence of glibenclamide (BI, values are expressed in percentage of those
obtained in the absence of glibenclamide (A) at the corresponding time-period. p

0.05 using an unpaired two-sided t-test: Effect of

ES(*),or of glibenclamide ('1.

<

Fig. 1 .

TIME PERIOD (min)

CTRL SUDDEN

CTRL STACED

Fig. 2.
A Tissue

0 Effluent

C Function
t

LD H

34DHBZ

dP/dt

( ~ / 3 0min) ( p m o l / 3 0 min)

611 CTRL
m N A C

SUDDEN

E S + D C A

LVDP

( m r n ~ ~ / s e c O-'
) ~ l (mmH9)

A-V

CTRL STAGE0
mNAC+ES+DCA

CONTROL

V NAC
O ES+DCA

TlME PERIOD ( m i n )

Fig. 5.

1 Glib 1

TlME PERIOD (min)

Chapitre IV. -SION

QENERALE
C

Chapitre IV. DlSCUSSION

1. INTRODUCTION

Ce projet de doctorat s'intgrait dans un programme de recherche dont le but long

terme tait une meilleure dfinition des modalits et indications de la thrapie
antioxydante pour la protection du coeur contre les dommages associs I'ischrniereperfusion. Au debut du projet, plusieurs tudes sur les antioxydants avaient t
publies. Toutefois, la controverse rgnait en partie A cause d'un manque de rigueur
de plusieurs de ces tudes, lesquelles ne permettaient pas d'tablir clairement une
relation de cause effet. Entre autre, il semblait pertinent de clarifier la contribution

de chacune des espces radicalaires aux dommages observs, puisque ceci s'avre
determinant pour le choix de ou des antioxydants prconiser.

Nous avons donc entrepris d'valuer le rle du radical hydroxyle, lequel &ait reconnu
comme une espce radicalaire trs ractive, en utilisant conjointement: (il une
mthode de dgtection et (ii)un antioxydant soluble ayant une bonne affinit6 pour ce
radical. La production de radicaux hydroxyles, l'effet du NAC, ainsi que l'ampleur des
dommages associds

A 11isch6mie-reperfusion (ndcrose, fonction cardiaque et debit

coronarien) ont donc et4 document& dans des coeurs isol6s de rats perfuss selon
deux protocoles differents de privation d'oxygne et de reperfusion. Les rsultats de

ces expriences ont mis en vidence un effet modulateur du NAC sur le dbit
coronarien, indpendant de son activit6 de pidgeur de radical hydroxyle, pouvant
expliquer les effets hypotenseurs du NAC observds lorsqu'administr chez des
patients souffrant de maladies cardiaques. A notre connaissance, une seule Btude a
rapporte un tel effet du NAC sans toutefois proposer de mecanisme d'action40T.
Aussi, les mdcanismes impliques dans cet effet du NAC ont bt6 investiguks.

2.1. Les modles d16tude

Pour tudier les phnomnes lies au syndrome d'ischmie-reperfusion, nous avons

choisi de travailler avec le coeur isol6 de rat, sur un montage Langendorff avec un
tampon non-recirculant. Le choix de l'espce animale a t6 orient par la grosseur du
coeur, le nombre d'tudes antrieures et le cot par animai. Le modhle classique de

~ a n g e n d o r f f " qui
~ est utilis pour une majorit6 d'tudes de perfusions a 6tB choisi
pour sa simplicit et parce qu'il etait dj au point dans notre laboratoire. II est
Bvident que le modele de coeur au travail qui est plus complexe, est aussi plus
physiologique que le modde Langendorff. Avec ce dernier, la perfusion est retrograde
ce qui signifie que seules les coronaires sont irriguees et que les ventricules
contractent contre la pression de l'air. Par consquent, les coeurs perfuss par la
mthode Langendorff ont une consommation d'oxygne plus basse que les coeurs
perfuss au travail'.

En outre, d'autres differences ont t6 rapportes entre ces deux

modles de coeurs dont une production de E R 0 plus faible dans les coeurs perfuses
sur un montage ~angendorff'~. Puisqu'il s'agissait d16tudes comparatives o
l'influence de la pression de travail n'tait pas une composante de premibre
importance, le modele Langendorff semblait satisfaisant dans nos conditions.

Diffrents protocoles d'l-R ont Bt utiliss dans cette 6tude.

Le choix de ces

protocoles &ait bas6 sur des Btudes pr6liminaires et sur la l i t t ~ r a t u r e ' ~ en

~ * tenant
~~'
compte de la s6v6rit6 de I'ischdmie quant au degr6 de ncrose cellulaire et dans
certains cas, de la presence de debit r6siduel pendant 11isch6mie permettant le
prlvernent de perfusat effluent pour la quantification de divers indices (.OH, GSH,
LDH, lactate, pyruvate). Ces paramtres se sont avr6s des critetes importants 8
diverses Btapes du projet.

Pour la premidte partie de I'dtude, le protocole utilis6 est I'ischdrnie partielle de 90

minutes suivie d'une reperfusion de 30 minutes. Une comparaison des divers indices
mesures dans ce modele et ceux rapportes dans la litterature indique que cette insulte

ischmique quivaut une ischmie globale de 20 minutes. Quoique le protocole

dfisch6mie partielle soit moins utilis que I'isch6mie globale dans la littrature, ce
choix s'est avr avantageux pour la comparaison de la formation de O H pendant
l'ischmie et la reperfusion. Ainsi, tel qu'il sera discut la section 3 de ce chapitre,
cette premiere srie d'expriences a permis de clarifier des rsultats controverss de
la littrature ce sujet.

Pour la deuxime partie de 1'6tude. nous avons utilis l'arrt cardioplgique et la

prservation de 4 heures 4

OC,

suivies d'une reperfusion de 60 minutes sur un

montage Langendorff. Dans ce protocole, la composante de ncrose cellulaire est

nettement inferieure celle du protocole d'ischmie partielle-reperfusion de la
premire srie d'expdriences. Aussi, dans la littrature, une dure de prservation de
4 heures est juge skcuritaire, peu importe la solution cardioplgique utilisde. Par

ailleurs, la cardioplgie hypotherrnique a 6t6 abondamment dtudie

245.445

et est utiliske

en clinique par plusieurs groupe^'^.^^^ bien qu'elle comporte des inconvdnients. La

principale diffrence avec la plupart des 6tudes en cardioplgie est que nous n'avons
pas perfus les coeurs avant la cardioplgie afin de mesurer des paramhtres pr6ischmiques de la fonction contractile.

Cependant, nous avions pralablement

effectu une tude de la fonction contractile en normoxie sur une autre srie de
coeurs. Finalement, les rsultats obtenus avec le protocole de C-R ayant souleve
plusieurs questions relatives

la modulation du dbit coronarien du coeur reperfus6,

il nous est apparu judicieux d'utiliser un troisidme protocole, soit 15 minutes

dfisch6mie globale suivies d'une reperfusion de 30 minutes pour valuer l'effet de
diffrentes drogues. Cette dernidre serie d'expdriences consiste en une i s c h h i e de
courte durde ou la s6vdritd de I'ischdmie est consid6rde comme modre sur la base
du degr6 de ndcrose

Dans l'ensemble, l'utilisation de trois protocoles d'ischemie-teperfusion s'est avdrde

un avantage du fait qu'il a permis de mettre en dvidence l'effet modulateur du NAC
sur le ddbit coronarien des coeurs reperfuses aprbs une pdriode d'iscMrnie,
independamment du protocole choisi.

2.2. tes paramhtres d16valuationde la condition des coeurs

2.2.1. indice de production de ERO
Comme indice de production d'esphces ractives oxygen6es. nous avons utilise le
34DHBZ. lequel provient de I'hydroxylation du 4-hydroxybenzoate (4HBZ) par les
radicaux -OH. Le 34DHBZ est dos6 par GCMS selon une technique mise au point dans
notre institution3'?

Cette methode s'apparente celle decrite pour le salicylate o

le 2.3 et le 2.5DHBZ sont mesures par H P L C ~7-398*41

~ ~ '.~ ~L'hydroxylation
~ ~ '
de
produits aromatiques n'est Bvidernment qu'une des nombreuses approches employdes
pour Bvaluer la formation des ERO. Parmi les autres mthodes les plus utilisdes,
mentionnons les techniques de PR e t de SR, la chimiluminescence et la mesure du
MDA.

Ces mdthodes, dcrites au chapitre 1 (section 2.3.51, ont toutefois leurs

limitations.

La technique de PR a dtd critiqude du fait que certains spectres de r6sonance ne

seraient pas dus

A des ERO. mais plutt la conglation et la manipulation

rndcanique du tissu?

De plus. cette technique n'est pas spdcifique pour un radical

en paniculier et permet une quantification subjective de la production de ERO. L'ajout

d'agents servant pidger les lectrons non-apparies (ESRI rendrait la rndthode plus
spdcifique mais des effets
Bt rapportde

secondaire^^'^ et la toxicitd de certains de ces produits a

concentration 61ev6e3?

Par ailleurs, la chimiluminescence est une

technique sensible, non invasive qui peut servir a valuer la gnration de E R 0 en

c ~ n t i n u e ' ~.~ Le
* " ~problme de cette technique est qu'elle n'est pas spdcifique a un
type radicalaire. Enfin, le MDA est un produit de la peroxydation des lipides qui est
souvent dos6 par spectrophotorn6trie aprds une rdaction avec l'acide thiobarbiturique,
d'o le nom du test TBA''". Ce dosage est toutefois non-specifique pour le MDA et

ne peut donner qu'une ide globale du processus de peroxydation lipidique dans une
situation d0nn6e"~.

Plus rdcemment, le dosage du MDA par HPLC a permis

d'augmenter la spcificit et la sensibilitd, cependant la principale critique vient du fait

que seulement certains produits de la peroxydation lipidique genrent le M D A ' ~ ~ .

Le principal avantage de la mthode d'hydroxylation des produits aromatiques, surtout

avec le 4HBZ. est que cette mthode soit spcifique pour le radical hydroxyle et que
les artfacts relies a l'utilisation de l'acide salicylique227semblent vits. En effet.
l'inhibition de la cyclo-oxygnase par le salicylate pourrait influencer non seulement
la production de radicaux hydroxyles mais aussi le dbit coronarien suite une
diminution de la synthse des prostaglandines. Malgr que la structure du 4HBZ soit
semblable celle du salicylate, nous n'avons pas obtenu d'vidences indiquant que
le 4HBZ avait de tels effets. De plus, puisqu'il est prsent en tout temps dans le
tampon de perfusion. le 4HBZ ne peut expliquer les effets observs sur le dbit
coronarien dans nos modles. En outre, puisque notre mthode avec le 4HBZ ne
fournit qu'un seul produit d'hydroxyiation (34DHBZ) et non deux comme le salicylate
(2,3DHBZ et 2,5DHBZ), elle s'avre plus spcifique, d'autant plus que l'analyse par

GCMS est plus sensible que celle par HPLC.

Malgr plusieurs avantages, la mthode utilishe n'est pas exempte de tous problmes.
Certains auteurs proposent que la concentration de 3 4 D H B Z retrouve dans le
perfusat effluent reflbte I'activit6 du cytochrome P450 plutt qu'une formation de

OH''^, bien que nous n'ayons note aucune Bvidence de ce phnomne. Aussi, le site
de formation de 34DHBZ n'est pas connu, mais il y a peu de chance que la quantit
mesure soit reprsentative de la production totale de .OH des coeurs pouvant
provenir de diffrents mcanismes enzymatiques. Finalement, il est important de
corriger la production pour la formation non-sp6cifique de 34DHBZ attribude B la
prsence de faible quantite (trace) de metaux (fer et cuivre) dans le tampon de
perfusion3" car cela peut augmenter la variabilith dans la mesure.

2.2.2. Indice du stress oxydatif

Dans les protocoles d'iscMmie partielle-reperfusion et C-R, nous avons dos le
glutathion dans le perfusat et dans le tissu (GSH+GSSG et ratio GSHIGSSG).
Plusieurs dtudes suggdrent que ces mesures refltent le niveau de stress oxydatif du
C08U162.81

,121

. La libration de GSH + GSSG par des coeurs perfusds sujets

de brves

priodes d'ischmies serait un meilleur indice de stress oxydatif que le contenu

tissulaire de ces mtabolites selon Massoudy et collaborateur^^^^. Cependant, puisque

le GSH semble avoir plusieurs fonctions au niveau du myocarde et que sa libration

pourrait tre module par diffrentes voies, le GSH libr dans le perfusat doit tre
utilis avec discernement comme indice de stress oxydatif, d'autant plus que de
nombreuses vidences rcentes montrent l'importance du GSH dans la conversion des
nitrates en -NO et n i t r o s o t h i ~ l s ~ ~ -

2.2.3. hdice de /a ncrose ceiluiaife

L'activit d'enzymes cytosoliques, telles la LDH et la CK, libres dans le perfusat
effluent des coeurs perfuss, sert souvent d'indice de la ncrose cellulaire, Cette
perte d'enzyme intracellulaire est attribue soit un "washout" des zones sous
perfuses qui deviennent endommages irrversiblement durant l'ischmie, etlou
l'effet nfaste de la reperfusion elle-mme, qui par la pression, produit un stress
mchanique2".

Dans notre tude, la mesure de la LDH semble avantageuse du fait

que l'activit de la CK est sensible B la presence de EROJgO. Mais l'indice LDH a

rcemment Bt critiqu6'" et l'examen h i s t ~ l o g i q u e ' aurait
~ ~ ~ 'pu
~ ~tre
~ ~utile
~ ~ bien
que cela necessite l'utilisation du tissu et empche donc le dosage des m6tabolites
tissulaires.

2.2.4. /ndr'ce du statut Bnergtique

Le dosage spectrophotomtrique d'ATP, d'ADP, d'AMP, dans le tissu sert d'indice du

statut nergdtique du coeur. La creatine phosphate (CP) est un indice plus pr6cis qui
est influencde par les variations rcentes du statut nergdtique. D'autres indices
auraient pu Btre dos&,

soit la mesure des produits de degradation de I'ATP

(adhosine, inosine et hypoxanthine) dans le perfusat effluent des coeurs perfuss.

II est propos6 que ces indices refldtent mieux les variations rapides du statut
nergdtique du coeur lorsqu'ils sont doses par HPLC.

2.2.5. Pararndtres foncthnels

Dans notre Btude, le debit coronarien est mesure constamment e t prcis6ment grce

A un debitmdtre instali en amont d u coeur. Cela contraste avec plusieurs Btudes o

le debit est mesure qu'occasionnellement 9 l'aide d'un cylindre gradu et expliquerait

peut-tre. en partie, pourquoi un tel effet sur le debit a pu tre document6 dans notre
recherche. Par ailleurs, le rythme cardiaque, le LVDP (pression dveloppe par Ie
ventricule gauche). le RPP (rythme cardiaque X pression dveloppe) et le dP1dt
(driv de pression) sont mesurs l'aide d'un ballonnet install dans le ventricule
gauche du coeur. II s'agit d'une mthode couramment utilisee qui produit toutefois
un stress mcanique289dmontrd par une lvation des indices biochimiques de
ncrose et du dbit coronarien lors de l'insertion du ballonnet. Dans le protocole de
C-R, la possibilit d'un stress mcanique additionnel nous a incit a insrer le ballon

seulement pour les 20 dernires minutes de reperfusion.

Ceci nous a empchd

d'6valuer les changements fonctionnels immddiatement aprhs la reperfusion, une

priode o la relation EROIfonction aurait pu tre plus ~ v i d e n t e ~ ' ~ .

Par ailleurs, l'installation d'dlectrodes sur le coeur permet de mesurer l'incidence

d'arythmie. Cette technique a t difficile

maitriser et I'interprdtation des r4sultats

obtenus, qui semblaient influencs par les conditions environnantes (champs

magntiques), a t ardue.

L'valuation subjective par inspection visuelle, une

pratique prBconis6e par Walker et ses c o ~ l a b o r a t e u r s ~

s'est
~ ~ , avdr6e un bon outil de
validation.

2.3. Le NAC comme antioxydant

Pour tre efficace, un antioxydant doit atteindre le site de formation du E R 0 en assez
grande concentration et a u bon moment1?

Nous avons choisi le NAC car il s'agit

d'une mol6cule de faible poids moldculaire qui pdntre facilement la cellule et qui est
pr6curseur de cyst6ine et cons6quemment de G S H ' ~ * ' ~ ' De
. plus, les premieres
Btudes chez des patients souffrant de MCV semblaient prometteuses1210"7 et l'effet
antioxydant direct du NAC sur les .OH avait d6jA et6 document6 in v i t r ~ " ~ " ~mais
,
non
dans des organes intacts. Finalement, le choix d'une concentration d'infusion de 100
pM de NAC repose sur des Btudes dose-r6ponse effectuees in vitro12'.

Par ailleurs, l'utilisation du NAC plutdt qu'un autre pi6geur de .OH, tel le

rnercaptopropionyl glycine, a t dterminante pour la prsente tude. De fait. les

principaux effets du NAC documents sont attribuables la prsence sur cette
molcule d'un groupement SH plutt qu' son effet antioxydant envers les .OH.

2.4. La solution de prdservation

Le fondement thorique, biochimique, pour l'incorporation de divers substrats dans

les solutions de cardiopldgie ou de prservation est bien compris. Cependant,

quel

moment et dans quelles conditions la provision de substrats exognes rsulte en

transport, utilisation et amlioration du devenir des coeurs prservs, ceci est moins
vident3?

Pour des questions de commodit et de flexibilit, nous avons dcid

d'utiliser une solution cristallode, moins visqueuse que la solution sanguine, tant
donne qu'elle ne contient pas de protines.

Parmi les solutions de prdservation existantes, la solution Celsior est une des rares
qui, tout en combinant les principes gdndraux de la prdservation d'organe en
hypothermie, a t mise au point spcifiquement pour le coeur.

Quoiqu'elle ait 6t

relativement peu Btudide, elle est sous investigation clinique en rance^^^. Cette
solution offre la possibilit d'etre utilise non seulement pour la prservation mais
aussi pour l'arrt du coeur du donneur, durant la r6implantation et

la reperfusion.

Le GSH, le mannitol et l'histidine contenus dans cette solution ont des effets

antioxydants2", alors que le glutamate a d6montrd des effets cardioprotecteurs grace

son r81e de substrat BnergdtiqueJoL. Le lactobionate de sodium prdsent dans la

solution Celsior rdduit drastiquement la production de 2,3 et 2,5DHBZ. des index de

production du . O p 5 et s'avre un bon chdateur de calcium2".

Des coeurs prserv6s

pendant 4h en pr6sence de lactobionate montrent une rcup6ration amliore de la

contractilite (LVDP et dP/dt BlevBs) b la t e p e r f ~ s i o n ~ ~ ' .
Pour toutes ces raisons, le choix de la solution Celsior nous est apparu adquat pour
le deuxidme protocole de ce projet. Il est probable que la pr6servation dans une
solution moins appropride pour le coeur, avec un niveau plus faible d'antioxydants,

aurait par contre permis d'observer plus d'effets bhfiques lors des thrapies
antioxydantes et/ou nergetiques la reperfusion. Toutefois, l'utilisation de cette
solution riche en GSH a probablement permis de mettre en vidence le rle permissif
du NAC sur la rgulation du dbit coronarien.

2.5. La composition des tampons de perfusion

La perfusion des coeurs dans notre tude s'effectue l'aide d'un tampon Krebs
Henseleit modifi, ou la concentration de calcium est diminu de moiti (1.3 mM) et
la concentration de glucose doublde (1 1 mM) par rapport
plus, contrairement

la recette originale. De

une rnajoritd d'tudes dans ce domaine, divers substrats

Bnergtiques ont t6 ajoutes dans les trois protocoles. L'octanoate, un acide gras

ZI

chane moyenne (0.2 mM) est prsent presqu'en tout temps. Son oxydation produit
une quantit non-limitante d'actyl-CoA pour le cycle de Krebs dont l'activit est
cruciale pour le mtabolisme nergtique du coeur.

Dans les deux derniers

protocoles, le lactate et le pyruvate sont ajouts des concentrations et dans un

rapport retrouve normalement dans la circulation sanguine, soit respectivement 0.5-1
et 0.1-0.2rnM. D'autres substrats tels le glutamate, la valine et le fumarate, ont
aussi

dtd ajoutes

dans

les

deux

derniers

protocoles pour

leurs

effets

cardioprotecteurs303.300.392 . L'ajout de ces substrats a permis de mettre en dvidence

leur r0le modulateur de l'effet du NAC sur le debit coronarien des coeurs reperfuss.

3.CONSIDRATIONS PHYSIOLOGIQUES

Tout en tenant compte des considrations mthodologiques mentionnes & la section

2 de ce chapitre, les rsultats obtenus au cours de ce projet apportent quelques
prcisions quant au rle du .OH dans la pathologie radicalaire sous-jacente au
syndrome d'ischmie-reperfusion. De plus, les rsultats de la prsente tude mettent
en hidence un effet modulateur du NAC sur le debit coronarien, lequel dpend de la
nature des substrats exognes prsents et serait attribuable la prsence d'un
groupement SH ou thiol sur la molcule de NAC, plutt qu' son activit de pigeur
de +OH.

3.1

. R6les des ER0 dans le syndrome d'ischbmie-teperfusion

Malgr le nombre 6lev d'tudes sur le r61e des E R 0 dans la pathophysiologie

cardiaque relie au syndrome d'f-RI la contribution de chacune des espces

radicalaires aux dommages observ&, reste tre clarifide. Chacune de ces espkces
peut ragir avec les composantes cellulaires pour induire diverses altrations.
Gnralement, le rdle des E R 0 est mis en vidence de faon indirecte par I'dtude des
effets de diverses substances interfrant avec leur production ou pouvant les liminer
et par l'utilisation de systmes gdndrateurs de ERO. Seulement un autre groupe de
chercheurs a specifiquement Bvalu6 l'effet du

OH^^^^^^^ .

Dans notre dtude,

l'utilisation simultan6e d'une methode de dtection (34DHBZ par GCMS) e t d'un

piegeur (NACI de 'OH et aussi de deux protocoles d'l-R avec des degres d'insulte
diffrents, a permis de prciser le rle d w O H dans la necrose, la fonction cardiaque
et le debit coronarien.

3.1.1 Producth de -OH

Avec les protocoles d'ischdrnie partielle-reperfusion et de C-R dans cette &tude, nous

avons montre une augmentation de la production des -OHdans les premires minutes
de la pdriode de reperfusion, tel que rapport dans quelques tudes utilisant

130

'

I'h ydroxylation aromatique par H P L C ~ ~ l~ OU* la

~ technique
~ ~ ~ ~ de
~ ~ESR4'
. ~ .484.
'

En raison de sa trs grande ractivit, le .OH a t particulirement mis en cause dans

le dveloppement des altrations cellulaires induites par l'ischmie et la reperfusion
myocardique. II y a quelques annes, certaines 6tudes ont rapport que les .OH
produits de faon exogne causaient des dommages aux cellules endothliales et
rnyocardiq~es~
~ . ~. ~C'est
~ ' pourquoi nous avons choisi d'agir sur ces radicaux et
87.347
d'en mesurer la production et la concentration, autant durant I1isch8mie qu' la
reperfusion des coeurs.

La production d'.OH dans ie protocole C-R n'est pas influence par le mode de
reperfusion. En effet, la reperfusion graduelle n'a pas permis de rduire ou de retarder
la production de .OH. Ces rsultats vont 2~ l'encontre des conclusions de Minor et
collaborateurs2", lesquelles reposaient sur une diminution du MDA mesur avec le
test TBA, une technique donnant des resultats discutables. De plus, ces auteurs
mesuraient la peroxydation lipidique alors que nous avons mesure la production de +OH

intervalles rguliers au cours de la reperfusion.

Les .OH sont aussi forms durant la pbriode d'ischmie tel que dmontr B l'aide du
protocole d'isch6mie partielle-reperfusion. Bien que certains auteurs9~42184~'72*24g
aient
observ une production de E R 0 durant I'ischdmie, ZI notre connaissance, personne
n'avait rapport de production spdcifique du .OH durant cette priode. Aussi, la
nature, l'importance et la s6quence de cette production

Itisch6mie dtaient sujets

la controverse. Notre Atude a permis de clarifier certains dments car avec notre
rndthode, nous pouvions facilement exprimer les *OH mesures en terme de production

et de concentration. Peu d'auteurs" ont fait cette distinction qui permet de voir que
durant l'ischmie la production de -OH diminue mais la concentration intravasculaire
augmente.

Nos travaux suggrent donc la possibilit d'une exposition ocale des

cellules endothaliales des concentrations devaes de -OH.

Par ailleurs, cette recherche ne nous permet pas de prdciser le site ou la source

(section 2.3.2.,chapitre 1) de formation du .OH durant l'ischmie et la reperfusion.

En prsence de Fe"

libre, le O;' et le H 2 0 2sont convertis en -OH par la raction de

Fenton, laquelle pourrait 6tre favorise par la plus grande quantit de fer libre lors
II est aussi propose que le .OH puisse tre
de la reperfusion d'un coeur is~hrnique'~~.

form 6 partir du ONOO- lequel provient de la raction entre le O;' et le NO^'.^". Les
rsultats d'expriences prliminaires oh la production de -OH a t mesure dans des
coeurs soumis l'ischmie partielle-reperfusion en prsence d'un inhibiteur de la NO
synthase, le N-a-nitro-L-arginine (NNLA), suggrent que ce radical soit form par la
raction de Fenton plutt qu'a partir du ONOO-. Aussi, tant donn le type de mesure
utilis (34DHBZ) et le fait que les coeurs soient perfuss avec une solution cristallode
dans notre 6tude, il semble probable qu'une partie de la formation des .OH soit
intravascuiaire, endothliale ou du muscle lisse.

3.1.2. Relation -OH et ncrose cettulaire

Dans les deux premires sdries d'expriences, nous avons demontr que la production
de.OH

la reperfusion prcde la libration de LDH. La dissociation entre ces deux

phdnornhnes est encore plus marquee lorsqu'on utilise une reperfusion graduelle. En
effet, l'intervention rndcanique avec le protocole de C-R met en dvidence que le profil
de libration de la LDH est influenc par la pression etlou la temperature de
reperfusion mais, sur une pdriode de 60 minutes, la libdration totale de LDH demeure
inchangde. Au contraire, le 34DHBZ produit n'est pas affect par la pression et la
temprature de reperfusion. Aussi, nous n'avons observ aucune corrlation au
niveau de l'ampleur de ces ph6nornnes puisqu'avec le protocole d'isch6mie partiellereperfusion la ndcrose cellulaire &ait Blevde et la production de .OH faible, alors
qu'avec le protocole de C-R, la necrose cellulaire &ait plus faible et la production de
E R 0 plus leve. De plus, avec le premier protocole, le NAC rhduisait la production
de -OH sans influencer significativement la libration de LDH. Tous ces rdsultats
suggrent que la production de .OH la reperfusion ne soit pas un facteur determinant

de la necrose cellulaire, corroborant ainsi les rsultats de Takemura et

collaborateurs3" et de Khalid et

collaborateur^^^^.

3.1 .3.Relation -OH, fonction cardiaque et d&t

coronarien

Une majorit6 d'tudes supporte le rle prkponderant des E R 0 dans la sidration

endothliale et myocardique plutt que dans le dveloppement de ncrose cellulaire.

Les rsultats de notre tude tendent dmontrer qu'il n'y a pas de relation entre la
production de .OH 8 la reperfusion et la fonction cardiaque ou la production de .OH et
le dbit coronarien mesurs la reperfusion. En effet, on remarque une production
plus leve d'-OH dans le protocoie de C-R par rapport au protocole d'ischmie
partielle-reperfusion (21.6 f 1 1.5 vs 3.7 I0.7 nmol 34DHBZ/10 min), bien que la
fonction cardiaque soit quivalente (RPP: 15

+ 2 vs 13

f 1 (battlminxmrn Hg)X103).

De plus, l'ajout du NAC & la reperfusion dans le protocole d'ischmie partiellereperfusion diminue la production de -OH sans influencer la fonction cardiaque ni le
dbit coronarien. Finalement, l'ajout de H,O,

ou de O,';

prcurseurs de .OH,dans le protocole de C-R,

deux E R 0 potentiellement

diminue le debit coronarien la

reperfusion mais n'influence pas significativement la fonction cardiaque. Les rsultats

obtenus appuient ceux de Takemura et collaborateur^^^^.

Par ailleurs, il convient de mentionner les limites sous-jacentes

la comparaison de

la fonction contractile des coeurs reperfuss dans les diffrents protocoles utiliss,
mme si ces considrations n'influencent pas les conclusions de 1'6tude. La fonction
cardiaque des coeurs reperfuss dpend, d'une part, de l'ampleur de la necrose et
d 'autre part, de la sidration.

Cette dernire composante est hentuellement

reversible si le temps d6 reperfusion allou6 est assez long (plusieurs heures, voir
~.
il est
mme jours) ou si les coeurs sont stimul6s avec une c a t 6 ~ h o l a m i n e ' ~Ainsi,
probable que la fonction cardiaque mesuree dans des coeurs reperfuses pendant 30
minutes en prhsence de nordpinphrine aptes 90 minutes d'ischemie partielle (premier
protocole), soit une valeur maximale. Au contraire, la fonction cardiaque des coeurs
reperfushs pendant 60 minutes aprs une cardiopldgie hypothermique de 4 heures
(deuxidme protocole) est une valeur minimale. Puisque ce dernier modele est associd
Ci peu de ndcrose, il est donc probable qu'il comporte une composante importante de
dysfonctionnement cardiaque du la siddration.

Lors de la reperfusion avec le

protocole de C-R, une infusion d'isoprotrdnol (1 PMI aurait permis de determiner la

fonction contractile maximale de ces coeurs.

3.1.4. Impottance es pidgeurs de .OH dans la prdvention du syndrome d'l-R

Dans l'ensemble, les rsultats prsents dans cette dtude suggrent qu'une thrapie
antioxydante de reperfusion ciblde pour les .OH, du moins avec le NAC, ne permet pas
d'attnuer de faon importante les dommages associs au syndrome d'l-R, autant sur
la ncrose que la fonction cardiaque ou le dbit coronarien. Plusieurs raisons peuvent
tre invoques. En effet, il est possible que l'efficacit d'une thrapie antioxydante
cible pour le .OH soit limitde par la grande ractivit de ce radical. Par ailleurs, il n'est
dans ces conditions et

pas exclu que I"O, soit aussi une espce

qu'elle devrait tre cible. De plus, l'utilisation d'un antioxydant liposoluble devrait
aussi tre e n v i ~ a g 8 ~ ~Finalement,
~.
le temps allou6 pour le traitement avec
I'antioxydant dans les protocoles utiliss dans cette tude n'est peut-tre pas
suffisant pour que les effets escompts soient observs. En fait, dans des tudes o
les animaux taient traites avec une intervention antioxydante pour plusieurs heures
ou jours avant d'induire une ischdmie, le traitement antioxydant a diminu la durde de
la sideration rny~cardique~~,
a am6lior la rdcupbration de la fonction contractilez22et
a diminue les dommages m i t o c h ~ n d r i a u x ' ~ 'observs
~~~~
la reperfusion.

sugghre que les bdnefices d'une intervention antioxydante

Ceci

moyen et long terme,

pourraient impliquer une regulation de l'expression g6nique2?

3.2. Potentiel thdrapeutique du NAC

3.2.1 Effets cadoprotecteurs du NAC

Dans notre etude, l'effet antioxydant directe du NAC sur les -OH, document pour la
premire fois dans un organe intact, a t6 observe durant l'ischmie et aussi
reperfusion.

Toutefois, contrairement

certaines

tud des' o+'2~121

la

, le NAC n'a pas

augment6 le contenu en GSH du myocarde dans les protocoles dtisch6mie partiellereperfusion et de C-R. Dans le premier protocole, ceci s'explique en partie par le
temps d'addition du NAC au moment de 11isch6miepartielle. En outre, ceci n'exclut

pas une augmentation locale de GSH dans les cellules bordant les vaisseaux. Aussi,
contrairement plusieurs autres tudes

10.62.121 .2S6.323.376-37BB40t

, nous n'avons pas

rapport d'effets bnfiques du NAC sur la fonction contractile ou la ncrose des

coeurs reperfuss aprs une priode de privation d'oxygne. Nos rsultats sont
cependant en accord avec ceux de certains auteur^'^^.^^^ utilisant diffrents protocoles
d'l-R o l'administration du NAC dbute soit 10 minutes avant ou pendant l'ischmie
partielle. Par ailleurs, la controverse demeure quant au rle des E R 0 dans l'arythmie,

'~~
tant donn l'inefficacit des antioxydants pour contrer ce p h n ~ r n n e " ~ ~Dans
notre tude, l'ajout de NAC 100 PM au moment de la reperfusion dans le modle C-R,
semble diminuer l'arythmie, bien que le nombre de perfusions soit insuffisant pour
atteindre une signification statistique.

Parmi les raisons invoquer pour expliquer les diffrences entre les effets du NAC
rapports dans notre 6tude et ceux rapports par d'autres, mentionnons: (i) le choix
unique des conditions de perfusion, telle la prdsence de substrats (lactate) dans le
tampon, (ii) le temps d'addition du NAC et (iii) les diffrents protocoles d'l-R;
I'ischmie partielle cornbin6e Ci une infusion de norpinphrine (premihre partie) et la
cardioplgie hypothermique avec la solution Celsior (deuxime partie) riche en
antioxydants (GSH).

Rtrospectivement, les observations suivantes, lesquelles sont centrees sur I'activitd

des canaux K+,

myocardiques (voir section 3.2.2.3 de ce chapitre), sugghrent que

la prsence des divers substrats dans le tampon de perfusion contribue, du moins en

partie, ii cette disparit6. Ainsi, les travaux de Sargent et collab~rateurs~~~drnontrent

un lien entre les effets cardioprotecteurs de certains thiols dont le NAC et les canaux
K

. En effet, les effets cardioprotecteurs du NAC, ddrnontrs dans des coeurs

perfuses en pr6sence de glucose et soumis une 1-R, sont renverss par un inhibiteur

des canaux K+,

le glibenclamide. Aussi. des travaux r6alisds recemment dans

notre laboratoire2" sugghrent que la probabilitd d'ouverture des canaux K+,

dans

les coeurs perfusds avec un melange de substrats soit plus grande que dans les
coeurs perfus6s avec le glucose seul.

Donc sur la base de ces deux etudes, nous

pourrions prdire que le NAC peut tre plus bnfique pour des coeurs perfuss en
prsence de glucose seul, comme c'est le cas dans la plupan des tudes mentionnes
plus tt, qu'en prsence d'octanoate, lactate, pyruvate, fumarate, ajouts aux
perfusats dans notre tude.

3.2.2.Modulation par le NAC du d#M coronarien

Dans la prsente tude, l'utilisation du NAC comme antioxydant dans trois protocoles

d'l-R a permis de mettre en vidence son effet modulateur sur le debit coronarien des
coeurs reperfuss. Cet effet semble attribuable la prsence sur cette molcule d'un
groupement thiol plutt qu' son activit6 de pi6geur de .OH. De fait, aucune
corrlation n'a t observe entre les effets rapports sur le dbit coronarien et la
production de OH. La modulation du dbit coronarien par le NAC semble impliquer
plusieurs mcanismes, lesquels varieraient en fonction du temps d'addition du NAC
et des conditions de perfusions. La prsence de substrats exoghnes, possiblement le
lactate, la formation de .NO, de S-nitrosothiols et l'action des canaux K',,

semblent

des facteurs importants. Les protocoles de C-R et d'ischmie globale-reperfusion ont

confirme les effets modulateurs du NAC sur le debit coronarien observs avec le
premier protocole, tout en prcisant davantage les facteurs intervenants dans ces
effets, soit le rle permissif de certains substrats exogdnes prdsents dans le tampon
de perfusion et l'implication des canaux K,'.

Un tel effet du NAC sur le debit dans

un modele d'l-R cardiaque n'avait Bte rapporte que dans une Btude4O1,alors qu'une
autre3'* observait une amlioration du dbit des coeurs perfuss en normoxie e t que
des cas d'hypotension avaient Bt nots lors de l'administration de NAC chez des
patients

coronarien^'^'^^^^.

3.2.2.1. R61e des thiols et des ERON: Notre premidre srie d'expdriences, o des
coeurs ont 6tB soumis I1isch8mie partielle suivie d'une reperfusion, suggerait
l'importance du groupement thiol du NAC (ou du GSH form B partir du NAC) et le
r61e des ERON dans la modulation par le NAC du debit coronarien. Dans ce protocole,

une protection de la microvasculature coronaire par le traitement au NAC est sugg6r6e

par la rdponse hyperdmique soutenue observee lors de la reperfusion. II semble qua

plus d'un mcanisme soit impliqu et que ceux-ci dpendent du temps d'addition du
NAC. De fait, le NAC devait tre prsent pendant ou avant l'ischmie partielle pour

observer I'effet sur le dbit coronarien. L'implication du .NO est mis en vidence pr
l'ajout de NNLA, un inhibiteur de NO synthase, lequel doit toutefois tre prsent avant
I'ajout de NAC pour inhiber le dbit. Ceci suggre l'implication d'un autre mcanisme
qui n'a pas t6 identifi.

Malgr que le traitement au NAC durant l'ischmie et la reperfusion n'ait pas

augment significativement le "pool" intracardiaque global de glutathion des coeurs
reperfuss, il n'est pas exclu que celui-ci ait t mieux prserv localement dans les
cellules endothliales et de la musculature lisse. Ces cellules bordent les vaisseaux
et sont les premires bnficier de l'apport en NAC. Par ailleurs, il a 6t montr que
le NAC, autant que le GSH, peut ragir avec le peroxynitrite formant des Snitrosothiols, des vasodilatateurs plus puissants et stables que le . ~ 0 ' ~De~ * ~ ~
mme, la formation de S-nitrothiol provenant de la raction entre le NO,' et un thiol
pourrait avoir des effets similaires de vasorelaxationes qui impliqueraient aussi la
stimulation de la sGC par le .NO. La formation d'un compos S-nitrosothiol ou Snitrothiol, soit driv du NAC lui-meme ou du GSH, pourrait expliquer le fait que le
NNLA doit tre ajoute avant le NAC pour inhiber I'effet sur le dbit. L'importance du

statut en thiol (GSH) semble dterminant pour la rgulation du dbit coronarien

puisqu'il a t6 rapport6 que des coeurs d4pl6t6s en GSH ddrnontrent une resistance
coronarienne accrue3=, alors que ceux traitds au GSH montrent une augmentation
post-hypoxique du debit coronarien13'.

Dans la deuxime partie de l'tude avec le protocole de C-R, I'implication du .NO nous
semblait toujours probable car il peut tre l i b M seul dans I'endoth8liurn ou coup14
une mol6cule contenant un groupement SH comme le N-actylcyst6ine ou le
glutathion. Les complexes S-nitroso ainsi forms permettent une diffusion graduelle

et etendue de NO. Cependant, dans la troisidme partie de l'tude, avec le protocole

d1isch8mie globale-reperfusion, l'utilisation d'un inhibiteur de la sGC, le 1H-

[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alquinoxalin-1-one (ODQ), n'a pas russi r6duire le ddbit

coronarien la reperfusion, suggrant que le -NO via l'activation la sGC, n'est pas
directement impliqu dans la modulation du dbit coronarien.

Par contre, selon

Bolotina e t colt ab orateur^^^", il n'est pas exclu que le .NO puisse avoir un effet sur la
modulation du dbit coronarien par son rle dans I'activation des canaux K',,,

laquelle

pourrait entraner une relaxation des muscles vasculaires indpendamment du cGMP.

Mise part le rle de l'O,.',

lequel reagit avec le .NO pour former le ONOO*, celui des

autres ERON dans la rgulation du debit coronarien n'est pas plus clair. Le H,O,,
peut tre soit vasodilatateur

qui

ou vasoconstricteur349, serait trs ractif en

concentration non-physio~ogique"~,mais peu actif en concentration physiologique.

Cependant, dans un milieu o il y a des ions mtalliques, le H,02 ragit avec ces
? ailleurs, I ' o x y g h e
derniers pour former le .OH qui agit comme v a ~ o d i l a t a t e u r ~ ~Par
singulet ('O,) a Bt6 moins Btudi e t ses effets sur le dbit coronarien non-document&

'

En effet, certains auteurs ont observ une corrlation entre la production de O, et les
dysfonctions cardiaque^'^^. Le mecanisme de contribution de 'O, aux dommages de
reperfusion post-ischBrnie demeure toujours incompris. Les interactions entre les
diverses espces ractives drives de I'oxygne et de l'oxyde nitrique sont
complexes et restent tre Blucides. Les rsultats obtenus pour les coeurs ayant
6th prserv6s puis reperfuses avec un tampon additionne de H,O,

suggrent que dans

ces conditions du moins, le H20, serait vasoconstricteur.

3.2.2.2.Raie des substrats Bnergbtiques: La deuxime serie d'expdriences, r6alisee

avec des coeurs reperfuses aprds une prdservation hypothermique de 4 heures dans
la solution Celsior, a permis de mettre en 6vidence l'importance des substrats
exognes, tel le lactate, dans l'effet modulateur du NAC sur le debit coronarien. Dans
la premier0 partie de I'dtude, le lactate n'&ait pas ajout& mais sa concentration dans
le perfusat effluent, surtout pendant I'isch6mie partielle et dans une moindre mesure,
durant la reperfusion, &ait augmentde par rapport aux valeurs basales. Des effets
modulateurs du lactate sur le ddbit coronariens0et le tonus artrielzg5ont d'ailleurs et6
rapportes dans la littdrature. Le lactate pourrait agir sur le debit coronarien via son
e f f e t sur le pH et/ou sur le rapport NADH~NAD". A la lumihre des observations

dcrites dans la littrature, des rsultats de la premire partie de I'tude et des effets
dmontrs par le H,02 et le pyrogallol avec le protocole C-R. il nous apparaissait
essentiel que le mcanisme propos inclut des interactions entre un des substrats
utiliss dans le tampon de perfusion, plus particulirement le lactate. le H,O,.

l'O;-,

le .NO, les thiois etlou les S-nitrosothiols. Pour ces raisons, nous avons d'abord
considr et adapt un mcanisme dcrit dans une srie d'articles par Mohazzab-H
et ses c o i l a b o r a t e ~ r s ~ ~ ~ * ~ ~ ~ .

Tel que prsent dans la Figure 9. ce mecanisme met e n vidence le rle d'une
oxydase-cytochrome b558 NADH-dpendante. L'activit de cette enzyme serait
relie au mtabolisme du lactate par la LDH via le couple d'oxydo-rduction
NAD'/NADH.

En effet. l'oxydation du NADH par l'enzyme est coupl6e avec la

rduction de l'oxygne en O.';

lequel est transforme par la SOD en H,02. Ce dernier

est m6tabolis6 par la CAT. laquelle interagit avec la sGC pour former le cGMP qui
produit une vasodilatation par un mecanisme impliquant probablement une protine
kinase.

Ce schma montre aussi l'interaction possible de l'O2-' avec le -NO pour

former le ONOO- et le rle des thiols qui reagissent avec le ONOO' et/ou le NO,' pour
former des S-nitrosothiols etlou des S-nitrothiols. lesquels rdg6nhrent le N O qui induit
une vasodilatation via le cGMP. L'implication d'un tel mecanisme nous apparaissait
possible d'autant plus qu'il pouvait expliquer les effets du H,02 observes dans le
protocole de C-R. De fait. lors d'une production excessive d'O,' et par consequent
de H,O,

ce dernier peut agir via les prostaglandines et les thromboxanes pour

produire une vasoconsttiction. Finalement, en favorisant indirectement la conversion

du lactate en pyruvate, le DCA, ajout6 au tampon de perfusion dans la deuxidme
partie de l'tude. jouerait un rdle d'amplificateur pour la production d'O;-.

Pour vdrifier l'implication de ce rn8canisme. il a fallu faire appel b un troisihrne

protocole d'l-R, lequel &ait associd a peu de necrose et nous permettait de prd-traiter
les coeurs avec diverses drogues inhibitrices avant de les soumettre 8 I'ischdmie puis

la reperfusion. Dans ce protocole, les coeurs perfus6s avec le NAC et des substrats

Lactate

*-p

Pyruvate

AC-(--A

+ C Y C de
~ lhts

DCA

NADH

NAD

ONOO

O2

- - - - -

-)

NO

---)

sGC

prostaglandines

A
PGI,

NO;

TxA2

cGMP

GSH-NO
MAC-NO

/
GSH

#AC

I
Figure 9.

GSH-NO,

NAC*NO,

vasodilatafion

vaoconstriction

Rdle potentid d'une NADHoxydase dans la modulation du debit

coronarien.
A brdviations: PDH = pyruvate d6shydrog6nase. DPI = chlorure de

diphdnyleneiodonium, PYRO = pyrogallol

avaient un dbit plus lev que ceux perfusgs avec le NAC seul avant et aprs
l'ischmie,

L'absence d'effet sur le dbit d'un inhibiteur de la NADH-oxydase-

cytochrome b558, le chlorure de diphnyleneiodonium (DPI 10 PM) et d'un inhibiteur

de la sGC, I'ODQ (10 PM), ne supportait pas une contribution du mcanisme propos

la figure 9. Mme qu'en augmentant la concentration de I'ODQ 30 PM, nous

avons observ une plus grande vasodilatation plutt qu'une vasoconstriction.

En

outre, l'absence d'effet d'un inhibiteur de la cyclo-oxygnase, I'indomthacine,

suggre que la voie des prostaglandines n'intervient pas n'ont plus dans le mecanisme
de rgulation du ddbit coronarien dans cette tude.

Ces resultats ndgatifs nous ont incit considdrer la possibilit de l'implication d'un
autre mcanisme dans la modulation du dbit coronarien. Suite une recherche dans

la littrature, notre choix s'est arrt I'implication des canaux .,K,'

3.2.2.3. R61e des canaux K',,:

Dans la cellule musculaire lisse, il existe diffkrents

types de canaux potassiques dont les canaux K,'.

Ces canaux sont reguls par

plusieurs f a ~ t e u r s ~dont
~ * le~ statut
~ ~ . mdtabolique
~ ~ ~
et leur ouverture est associde A
une diminution du calcium intracellulaire qui produit une relaxation

puis

cons4quemment. une vasodilatation. De fait, la probabilit d'ouverture des canaux

est augmentee par une diminution du rapport ATPIADP, une diminution du pH, par
l'augmentation de la concentration de lactate et d'acyl-CoA et par une faible activit6

de la glycolyse. Tous ces changements, qui augmentent la probabilitd d'ouverture des

canaux, sont observs lors du syndrome d'l-R. De plus, I'Btat de p h o s p h ~ r y l a t i o n ~ ~ ~ ,
qui est rgule par diverses kinases dont la protdine kinase A (PUA) et la prothine
kinase C (PKC) et peut htre aussi la proteine kinase G (PKG)~". est aussi un facteur
influenant l'ouverture des canaux K.,'

Par ailleurs. quelques etudes rapportent que

la prsence de thiols reduits, tel le GSH, semble ouvrir ces canaux, alors que celle des
thiols oxyd6s. tel le GSSG. les ferme72*416.Le mecanisme molt5culaire irnpliqu4 n'est
pas connu et seules quelques Bvidences indirectes montrent la prsence d'un
groupement thiol sur les canaux K*,"'.
au niveau cardiaque, mais Weik et

Ce type de rdgulation a Bt6 peu document6

collaborateur^"^ ont suggdr6 que le groupement

SH soit situ prs du site de liaison de I'ATP sur les canaux ,,K
,'

du muscle

squelettique.

Dans la troisime srie d'expriences, l'utilisation de glibenclamide, un inhibiteur des

canaux,,,K
'

a permis de diminuer significativement et d'une faon dose-dpendante

le dbit coronarien des coeurs ischmiques et reperfuss. Ces rsultats dmontrent

l'importance de ces canaux dans la rgulation du debit coronarien dans notre modle
Les facteurs modulant
et corroborent les rdsultats de quelques suteurs5'~B7~'84~'98d356.
l'activit de ces canaux, ainsi que les mcanismes molcutaires par lesquels ces
facteurs agissent. restent

tre prciss. Cependant, quelque soit ces lments ou

mcanismes, ceux-ci doivent tenir compte de l'interaction entre le NAC et un ou des

substrats exoghes, probablement le lactate. documente dans notre tude.

cet

effet. il est connu qu'autant le ~ a c t a t e ' ~ que

~ , ' ~la~prdsence de thiols r d d u i t ~ ~ ~ ~ ~ ' ~ ,
augmentent la probabilitb d'ouverture des canaux K',,,,

ce qui est associ

ti

une

vasodilatation. Les mcanismes mol6culaires potentiels pour les effets du lactate

impliquent, entre autres, les ion

H' et le rapport NADH/NAD'~~. De plus, les

mecanismes molculaires pouvant tre envisages pour expliquer l'effet du NAC doivent
faire intervenir une modulation de I'activite des canaux K',

par l'tat d'oxydation des

groupements thiols associs au complexe proteines-canals.

Mme si nos rsultats ne nous permettent pas d'exclure une action directe du NAC
ou d'un deriv S-nitroso-NAC, il nous semble plus probable que le mcanisme impliqu
fasse intervenir la conversion du NAC en GSH. Ainsi, le rapport GSH/GSSG serait
dterminant pour 1'8tat d'oxydation des groupements SH des protines-canals.
L'ouvertute et la fermeture des canaux pourraient s'effectuer par un mecanisme
impliquant la formation de disuifhydes mixtes prothines-SH et protines -S-SG via une
thiol tran~f6rase'~'.Un tel mcanisme pourrait expliquer l'effet du H202 qui diminue
le ddbit coronarien dans le modle de C-R.
expliquant une partie de nos r&ultats,

La Figure 10 propose un m6canisme

lesquels appuient ceux de Tricarico et

collaborateur^^'^. Ce mecanisme et l'effet du H,O, document6 dans notre tude

laquelle a d6montr4 que
contredisent toutefois l'tude de lchinari et co~laborateurs'~~.

NAC

Protine-S-SG

GSHrx

GSSG

Figure 10.

thiol transfrase

protine-SH

Rdle du H,0, et des thiols dans la rbgulation du debit coronarien.

Plut&

que d'agir via

les prostaglandines pour produire une

vasoconstriction, le H,O, pourrait oxyder 1s GSH en GSSG, ce qui

entranerait une accumulation de thiols oxydes et 6ventuellement la

fermeture des canaux K*.,
R5P=

Abrdviations: G6P = glucose-6-phosphate,

ribose-5-phosphate,

G6P-OH = glucose-6-phosphate-

ddshydrog6nase. EM = enzyme malique, L-arg = L-arginine.

les ERO, plus spcifiquement le H,O,, augmentait la probabilit d'ouverture des

canaux.

Finalement, la Figure 7 7 illustre les divers facteurs pouvant intervenir pour moduler la
rgulation du dbit coronarien observe dans des coeurs perfusds en prsence de NAC
et d'un melange de substrats Bnergtiques. Bien que ce schma ne soit pas complet,
nous pouvons en dduire que le principal mcanisme d'action n'origine pas de la voie
de la sGC, de la voie des prostaglandines ou de la NADH-oxydase. Les rsultats
obtenus avec la panoplie d'inhibiteurs tests, suggrent que le mcanisme implique les
canaux Kd
,'ans

la modulation du dbit coronarien. La probabilit d'ouverture de ces

canaux serait module par les substrats exognes, probablement le lactate et l'tat
d'oxydation des thiols.

Les mcanismes mol4culaires restent 6tre prcise.

mme, l'effet observ des canaux K',,

De

n'exclut pas la participation simultane de

d'autres types de canaux, principalement les canaux K ' , , ~ ~ ~ ~ ~ ' .

L-NNA
O

1
6

1-arginine
indomthacine
n

Ad

ACYJ-COA

K'c~

Lactate
et autres mtabolites

relaxation

4
vasodilatation
Figure 11.

Principaux facteurs intervenant dans la modulation du dbit coronarien.

voies: connues---)

, proposes

- - O

Abrviations: A.A. =acide arachidonique, AC = adnylate cyclase,

SH = thiof, Glib = glibenclamide

4. PROJETS FUTURS

Pour des raisons de limites de dbtection, les dosages directs de cGMP et le -NO (NO;
e t NO,.) sur le perfusat effluent n'ont pas russi a clarifier les mcanismes d'action
impliqubs dans la modulation du dbit coronarien dans le modele de cardioplgiereperfusion. L'analyse de ces facteurs, au niveau tissulaire, de mme que le dosage
du GSH tissulaire dans le troisime modle d'tude, permettraient d'augmenter notre
comprhension de la sdquence d'vnements lors du syndrome d ' M . La mesure des
molcules S-nitroso ou S-nitrothiol au niveau tissulaire permettrait galement de
documenter les conditions de formation de ces molcules. De plus, l'utilisation d'une
solution de prservation sans GSH permettrait peut-tre d'observer une protection
relie A I'effet antioxydant du NAC. Finalement, une analyse plus systmatique de
l'effet de chacun des substrats ajoutes la solution de reperfusion permettrait d'isoler,
hors de tous doutes, le ou les rn6tabolites responsables des effets observes sur le

dbit coronarien.

Chapitre V. CONCLUSION

- .

Chapitre V. CONCLUSION O

Ce travail nous a permis d'atteindre l'objectif fix qui tait de prciser le rble de la
thrapie antioxydante pour la protection du coeur contre les dommages relis
l'ischmie-reperfusion. De plus, paralllement, nos resultats mettent en vidence un
e f f e t modulateur du NAC sur le dbit coronarien des coeurs reperfuss tout en

identifiant des facteurs impliqus dans cet effet.

Concernant la thrapie antioxydante, nos rsultats soulvent un questionnement

quant la co~tributiondu .OH aux dommages observs lors de I'l-R dans le coeur
isol.

L'utilisation simultane d'une methode de detection par chromatographie

gazeuse couplde 8 la spectrom6trie de masse et d'un pigeur spcifique des . O H l ainsi

que la mesure temporelle de divers indices, ont permis de prciser la squence des
kvenements lors de I'ischdmie et de la reperfusion des coeurs isols.

Malgr4

ItBvidence d'une production accrue de 'OH par les coeurs ischemiques e t reperfuss,
aucune corrlation n'a pu 8tre observe entre la production d'ER0 et un des ldments
suivants: la ncrose cetlulaire, la fonction cardiaque ou le debit coronarien.

Ainsi, dans l'ensemble, nos rsultats sugghrent qu'une thrapie antioxydante ciblde
pour les .OH, du moins avec le NAC, n'apporte pas de b6ndfice tangible pour le coeur.
Une contribution du 'OHaux dommages associds l'ischmie-reperfusion ne peut tre
exclue pour autant puisque l'efficacit de la th6rapie antioxydante pourrait tre limite
par fa trop grande reactivitd de ce radical. De plus, les effets dommageables de cette
esphce r6active oxygdnde pourraient se manifester plus long terme. Ainsi, il aurait
et6 intdressant de poursuivre ce projet en Bvaluant l'effet de l'administration
prolong6e d'une thdrapie antioxydante cibl6e sur les -OH et de v6rifier I'hypothdse
d'un rdle sur le systhme immunitaire ou l'expression gnique. Toutefois, pour cibler
spcifiquement le -OH, il serait pr6fdrable d'utiliser un autre antioxydant que le NAC
puisque cet agent pourrait exercer ses effets majoritairement par un autre mecanisme
que son activit6 de pi6geur pour ce radical.

En effet, ce travail met aussi en vidence un effet modulateur du NAC sur le dbit
coronarien des coeurs reperfuss. Cet effet semble attribuable la prsence sur cette
molcule d'un groupement thiol plutt qu'Ci son activit de pigeur des -OH. De fait,
aucune corrlation n'a t observe entre les effet rapports sur le dbit coronarien
et la production de .OH. notre connaissance. une seule tude avait rapport un tel
effet du NAC sans toutefois propos de mdcanisme. Pourtant, suite 4 l'administration

de NAC. un effet hypotenseur avait t rapport chez certains patients souffrant de

maladies cardiaques. La mise en Bvidence de cet effet du NAC dans notre tude, et
ce dans trois protocoles diffrents d ' M . pourrait tre attribuable au choix de nos
conditions uniques de perfusion, soit l'ajout de substrats nergtiques exognes
autres que le glucose dans le tampon de perfusion des coeurs.

En ce qui a trait au mecanisme implique dans cet effet modulateur du NACI il semble
que celui-ci varie en fonction du temps d'addition du NAC et des conditions de
perfusion.

Parmi les facteurs mis en cause l'aide de substances inhibitrices,

mentionnons l'effet permissif de substrats exognes, probablement le lactate, la

formation de .NO et de drivs S-nitrosothiols et I'activite des canaux .,,K'
Toutefois, d'autres experiences ou mesures auraient BtB ncessaires afin de prdciser
avec exactitude le rle de chacun de ces facteurs. En ce qui a trait aux canaux,,K
'
vasculaires, les r6sultats de notre etude suggrent que les mecanismes molculaires
impliqus doivent faire intervenir une modulation de I'activite des canaux par I'tat
d'oxydation des groupements thiols associds au complexe protines-canals. De fait,

il semble que la probabilite d'ouverture de ces canaux soit augmenthe par un effet
combin (il d'un ou des substrats exognes, entre autre le lactate, et (ii)de l'tat
rduit des thiols rdsultant de l'ajout de NAC.

Finalement, une meilleure comprdhension des mkanismes impliques dans cet effet
modulateur du NAC sur le debit coronarien stav&e pertinente

son utilisation en

clinique, autant pour le traitement des MCV que pour les autres indications telles que
les maladies pulmonaires chroniques.

De fait, ceci pourrait prevenir ou traiter

addquatement les problhmes Bventuels d'hypotension.

Chapitre VI.

Chapitre VI. RFRENCES

Aasum, E., Larsen, T. Pyruvate reverses fatty-acid-induced depression of

ventricular function and calcium overload after hypothermia in guinea pig
hearts. Cardiovasc. Res. 33:370-377;1997.
Abrams, J. Interactions between organic nitrates and thiol groups. Am. J.
Med. 91:(suppi.3C)106s-112~;1991.
Allen, B.S., Okamoto, Fm, Buckberg, G.D., Bugyi, H., Young, H., Leaf, J.,
Beyersdorf, F., Sjostrand, F.1 Maloney, J.V. lmmediate functional recovery
after six hours of regional ischemia by careful control of conditions of
reperfusion and composition of reperfusate. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
92:621-635; 1986.
Ambrosio, G., Santoro, G., Tritto, I., Eiia, P.P., Duiiio, C., Basso, A.,
Scognarniglio, A., Chiariello, M. Effects of ischernia and reperfusion on cardiac
tolerance to oxidative stress. Am. J. Physiol. 262:H23-H30; 1 992.
Ambrosio, G., Zweier, J.L., Duilio, C., Kuppusamy, P., Santoro, G a , Elia, P.P.,
Tritto, l., Cirillo, P., Condorelli, M., Chiariello, M. Evidence that mitochondrial
respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit
hearts subjected to ischemia and reflow. J. Bol. Chem. 268: 18532-18541 ;
1993.
Ambrosio, G., Zweier, J.L., Jacobus, W.E., Weisfeldt, M., Flaherty, J.T.
lrnprovement of postischernic myocardial function and metabolism induced by
administration of deferoxamine at the time of reflow: The role of iron in the
pathogenesis of reperfusion injury. Circulation 76:906-9 15; 1 987.
Anderson, M.E., Meister, A. Intracellular delivery of cysteine. Methods in
Enzymology t43:313-325; 1987.
Archer, S.L., Nelson, D.P., Weir, K. Detection of activated O, species in vitro
and in rat lungs by chemiluminescence. J. Appl. Physiol. 67:1912-1921;
1989.
Arroyo, C.M., Kramer, J.H., Dickens, B.F., Weglicki, W.B. Identification of free
radicals in myocardial ischemia/reperfusion by spin ttapping with nitrone
DMPO. FEBS Letters221:lOl-104; 1987.
Arstall, M.A., Yang, J., Stafford, I., Betts, H., Horowitz, J.D. N-acetyfcysteine
in combination with nitroglycerin and streptokinase for the treatment of
evolving acute myocardial infarction. Safety and biochemical effects.

Circulation 92:2855-2862; 1 995.

Aruorna, O.].,Halliwell, B., Hoey, B.M., Butler, J. The antioxidant action of Nacetylcysteine: Its reaction with hydrogen peroxide. Free Radic. Biol. Med.
6:593-597; 1989.
Asai, T., Grossi, E.A., LeBoutillier III, M., Parish, M.A., Baumann, F.G.,
Spencer, F.C., Colvin, S.B., Galloway, A.C. Resuscitative retrograde blood
cardioplegia. Are amino acids or continuous warm techniques necessary? J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 109:242-248; 1995.
Atar, O.,Mortensen, S.A., Flachs, H., Herzog, W.R. Coenzyme 010 protects
ischemic myocardium in an open-chest swine mode!. Clin. Investig. 71:S 103S111; 1993.
Axford-Gatley, R.A., Wilson G.J. Reduction of experimental myocardial infarct
size by oral administration of alpha-tocopherol. Cardiovasc. Res. 2589-92,
1991.
Baker, J E , Felix, C.C.,Olinger, G.N., Kalyanaraman, B. Myocardial ischemia
and reperfusion: Direct evidence for free radical generation by electron spin
resonance spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2786-2789; 1988.
Bando, K., Teramoto, S., Tago, M., Seno, S., Murakami, T., Nawa, S., Senoo,
Y. Oxygenated perfluorocarbon, recombinant human superoxide dismutase,
and catalase ameliorate free radical induced myocardial injury during heart
preservation and transplantation. J. Thorac. Cadiovasc. Surg. 96:9 30-9 38;
1988.
Barner, H. B. Blood cardioplegia: A review and comparison with crystalloid
cardioplegia. Ann. Thorac. Surg. 52:1354-1 367; 199 1.
Barsacchi, R., Coassin, M., Maiorino, M., Pelosi, G.,Simonelli, C., Ursini, F.
lncreased ultra weak cherniluminescence emission from rat heart at
postischemic reoxygenation: Protective role of vitamin E. Free Radic. Biol.
Med. 6:573-579; 1989.
Bany, P.R., Hicks, C L . , DeWeese, J.A., Wang, T. Optimal osmolarity for
cold storage of the cardiac explant. J. Surg. Res. 48:601-605; t 990.
Becker, L.C., Arnbrosio, G. Myocardial consequences of reperfusion. Prog.
Cardiovasc. Disease 30:23-44; 1987.
Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A., Freeman, B.A.
Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: Implications for

endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:l62O-l624;1990.
Belzer, F.O.,Southard, J.H. Principles of solid-organ preservation by cold
storage. Transplantation 45:6 7 3-676; 1988.
Benvenuti, C., Cachera, J-P. La prservation du greffon cardiaque. Pour la
science 162:46-52; 199 1 .
Berne, R.M. The role of adenosine in the regulation of coronary blood flow.
Circ. Res. 47:807-813; 1980.
Bernier, M., Manning, A.S., Hearse, O.J. Reperfusion arrhythrnias: Doserelated protection by anti-free radical interventions. Am. J. Physiol.
256:H1344-H1352; 1989.
Beyersdorf, F., Kirsh, M., Buckberg, G.D., Allen, B.S.
Warm
glutamatelaspartate-enriched blood cardioplegic solution for perioperative
sudden death. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:1141-1147; 1992.
Bharadwaj, L.A., Prasad, K.
Mechanism of hydroxyl radical-induced
modulation of vascular tone. Free Radic. Biol. Med. 22: 381 -390; 1997.
Biaglow, J.E. Role of glutathione and other thiols in cellular response t o
radiation and drugs. Drug Metab. Rev. 20: 1-12; 1989.
Biesalski, H.K., Bohles, H., Esterbauer, H., Frst, P., Gey, F., Hundsdorfer, G.,
Kasper, H., Sies, H., Weisburger, J. Antioxidant vitamins in prevention. Clin.
Nutrition 16: 1 5 t -1 55; 1997.
Bindoli, A., Barzon, E., Rigobello, M.P. lnhibitory effect of pyruvate on release
of glutathione and swelling of rat heart mitoc hondria. Cardiovasc. Res.
30~821-824;1995.
Bing, O.H.L. Hean muscle viability following hypoxia: Protective effect of
acidosis. Science 180:1 297- 1 298; 1 973.
Bittl, J.A., Shine, K. Protection of ischemic rabbit myocardium by glutamic
acid. Am. J. Physiol. 245:H406-H412; 1983.
Bixler, T.J., Gardner, T.J., Flaherty, J.T., Gotdman, R.A., Gott, V.L. Beneficial
effects of alkalotic reperfusion following ischemic cardiac arrest. J. Surg. Res.
24:488-494; 1978.
Blasig, LE., Shuter, S., Garlick* P., Slater, T. Relative tirne-profiles for free

radical trapping, coronary flow, enzyme leakage, arrhythmias, and function

during myocardial reperfusion. Free Radic. Biol. Med. 16:35-41; 1 994.
Blaustein, A., Deneke, S.M., Stolz, RA., Baxter, O., Healey, N., Fanburg, B.L.
Myocardial glutathione depletion impairs recovery after shon periods of
ischemia. Circulation 80: 1449-1457; 1989.
Blaustein, A.S., Schine, L., Brooks, W.W., Fanburg, B.L., Bing, O.H.L.
Influence of exogenously generated oxidant species on myocardial function.
Am. J. Physiol. 250~595-599;1986.
Boban, M., Stowe, D.F., Kampine, J.P., Goldberg, A.H., Bosnjak, Z.J. Effects
of 2,3-butanedione monoxime in isolated hearts: Protection during reperfusion
after global ischemia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1OS:532-540; 1993.
Boehm, D.H., Human, P.A., von Oppell, U., Owen, P., Reichenspurner, H.,
Opie, L.H., Rose, A.G., Reichan, B. Adenosine cardioplegia: Reducing
reperfusion injury of the ischaemic myocardium? Eur. J. Cardio-Thorac. Surg.
5:542-545; 199 1.
Boesgaard, S. Thiol compounds and organic nitrates. Danish Medical Bulletin
42:473-484; 1995.
Bolli, R., Jeroudi, M.O., Patel, B.S., Aruoma, O.I., Halliwell, B., Lai, E.K.,
McCay, P.B. Marked reduction of free radical generation and contractile
dysfunction by antioxidant therapy begun at the time of reperfusion. Evidence
that myocardial "stunning" is a manifestation of reperf usion injury. Circ. Res.
65:607-622; 1989.
Bolli, R.
1990.

Mechanism of myocardial "stunning".

Circulation 82:723-738;

Bolli, R., Patel, B.S., Jeroudi, M.O., Lai, E.K., McCay, P.B. Demonstration of
free radical generation in "stunned" myocardium of intact dogs with the use
of spin trap a-phenyl N-tert-butyl nitrone. J. Clin. Invest. 82:476-485, t 988.
Bolli, R.; Triana, F.; Jeroudi, M.O. Prolonged impairment of coronary
vasodiiatation after reversible ischemia. Evidence for microvescular "stunning".
Circ. Res. 67:332-343; 1990.
Bolling, S.F., Childs, K.F., Ning, X-H. Amino acid substrate preloading and
postischemic myocardial recovery. J. Surg. Res. 53:342-348; 1992.
Bolotina, V.M., Najibi, S., Palacino, J.J., Pagano, P.J., Cohen, R A . Nitric
oxide directly activates calcium-dependent potassium channeis in vascular

smooth muscle. Nature 368:850-853; 1994.

Bondy, S.C., Naderi, S. Contribution of hepatic cytochrome P450 systems to
the generation of reactive oxygen species. Biochem. Pharmacol. 48: 1 55-1 59;
1994.
Bouchard, J-F., Dumont, E., Lamontagne, D. Evidence that prostaglandins I,
E,l and D, may activate ATP-sensitive potassium channels in the isolated rat
heart. Cardiovasc. Res. 28:901-905; 1994.
Boudrillon, P.D.V., Poole-Wilson, P.A. Effects of ischemia and reperfusion on
calcium exchange and mechanical function in isolated rabbit myocardiurn.
Cardiovasc. Res. 15: 121-1 30; 198 1.
Bouma, P., Ferdinandy, P., Sipkema,, P., Allaart, C.P., Westerhof, N. Nitric
oxide is an important determinant of coronary flow in the isolated blood
perfused rat heart. Basic Res. Cardiol. 87:570-584; 1992.
Braunwald, E., Kloner, R A . Myocardial reperfusion: A double-edged sword?
J. Clin. Invest. 76:1713-1719; 1985.
Bredt, D.S., Snyder, S.H. Nitric oxide: A physiologie messenger molecule.
Ann. Rev. Biochem. 63: 175-1 95; 1994.
Bril, A., Laville, M-P., Gout, B. Effects of glibenclamide on ventricular
arrhythmias and cardiac function in ischemia and reperfusion in isolated rat
heart. Cardiovasc. Res. 26: 1069-1076; 1992.
Buckberg, G.D., Beyersdorf, F., Allen, B.S., Robertson, J.M. lntegrated
myocardial management: Background and initial application. J. Card. Surg.
10:68-98; 1995.
Bunger, Re, Mallet, R.T., Hartman, D.A. Pyruvate-enhanced phosphorylation
potential and inotropism in normoxic and postischemic isolated working heart.
Eur. J. Biochem. 180:221-233; 1989.
Burton, G.W. Vitamin E as an in vitro and in vivo antioxidant. Ann. N.Y. Acad.
Sci. 570:7-22; 1989.
Burton, K.P., McCord, J.M., Ghai, G. Myocardial alterations due t o free-radical
generation. Am. J. Physiol. 246:H776-H783; 1984.
Bush, L.R., Warren, S., Mesh, C.L., Lucchesi, B.R. Comparative effects of
aspartate and glutamate during myocardial ischemia. Pharmacology 23:297304; 1981.

Camacho, S.A., Parmley, W.W., James, T.L., Abe, H., Wu, S.T., Botvinick,
E.H., Watters, T.A., Schiller, N., Sievers, R., Wikman-Coffelt, J. Substrate
regulation of the nucleotide pool during regional ischaemia and reperfusion in
an isolated rat heart preparation: A phosphorus-3 1 magnetic resonance
spectroscopy analysis. Cardiovasc. Res. 22: 193-203; 1988.
Cartier, R., Carrier, M., Buluran, J., Miltette, O., Dagenais, F. 2,3-butanedione
monoxime preserves coronary artery endothelium-dependent relaxation during
myocardial ischemia in the isolated rat heart. Can. J. Cardiol. 11:505-510;
1995.
Cartier, R., Hollmann, C., Dagenais, F., Buluran, J., Pellerin, M., Leclerc, Y.
Effects of University of Wisconsin solution on endothelium-dependent coronary
anery relaxation in the rat. Ann. Thorac. Surg. 57:255-257; 1994.
Canier, R., Pellerin, M., Hollmann, C., Pelletier, L.C. Effects of pressure and
duration of hyperkaliemic infusions on endothelial function. Ann. Thorac.
Surg. 55:700-705; 1993.
Cavallini, L., Valente, M., Pia Rigobello, M. The protective action of pyruvate
on recovety of ischemic rat heart: Cornparison with other oxidizable
substrates. J. Mol. Cell. Cardiol. 22:143-154, 1990.
Ceconi, C.,Curello, S., Cargnoni, A., Ferrari, R., Albertini, A., Visioli, O. The
role of glutathione status in the protection against ischernic and reperfusion
damage: Effect of N-acetylcysteine. J. Mol. Cell. Cardiol. 205-13; 1988.
Chambers, D.J., Astras, G., Takahashi, A., Manning, A.S., Braimbridge, M.V.,
Hearse. D.J. Free radicals and cardioplegia: Organic anti-oxidants as additives
t o the St-Thomas' Hospital cardioplegic solution. Cardiovasc. Res. 23:35 1358; 1989.
Chambers, D.J., Takahashi, A., Hearse, D.J. Long-term preservation of the
hean: The effect of infusion pressure during continuous hypotherrnic
cardioplegia. J. Hean Lung Transplant. 11:665-675; 1992.
Charloux, C., Paul, M., Loisance, D., Astier, A. Inhibition of hydroxyl radical
production by lactobionate, adenine, and tempol.
Free Radic. Biol.
Med. l9:699-704;1995.

Chello, M., Mastroroberto, P., Romano, R., Castaldo, P., Bevacqua, E.,
Marchese. A R . Protection by coenzyme Q,, of tissue reperfusion injury during
abdominal aortic cross-clarnping. J. Cardiovasc. Surg. 37:229-235; 1996.

Chen. R.H. The scientific basis for hypocalcemic cardioplegia and reperfusion
in cardiac surgery. Am. Thorac. Surg. 62:W 0-914; 1996.
Chirkov, Y .Y., Horowitz, J.D. N-acetylcysteine potentiates nitroglycerininduced reversai of platelet aggregation. J. Cardiovasc. Pharmacol. 28: 3 75380; 1996.
Choong, Y.S., Cottier, D.S., Edgar. S.G. Protective effects of oxygenated St.
Thomas' Hospital cardioplegic solution during ischaemic cardiac arrest:
lmproved function, metabolism and ultrastructure. J. Cardiovasc. Surg.
34:423-433; 1993.
Choong. Y.S.. Gavin. J.B. L-aspartate irnproves the functional recovery of
explanted h e a ~ stored
s
in St. Thomas' Hospital cardioplegic solution at 4" C.
J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 99:5 10-5 17; 1990.
Choong, Y.S., Gavin, J.B., Armiger. L X . Effects of glutamic acid on cardiac
function and energy metabolism of rat heart during ischaemia and reperfusion.
J. Mol. Cell. Cardiol. 20: 1043-105 1; 1988.
Coetzee. W.A., Nakamura, T.Y., Faivre, J-F. Effects of thiol-nodif ying agents
on KAT channels in guinea pig ventricular cells. Am. J. Physiol. 269:H1625H1633; 1995.
Coetzee, W.& Owen. P.. Demis, S.C.. Saman, S., Opie. L.H. Reperfusion
damage: Free radicals mediate delayed membrane changes rather than early
ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 24: 156-1 64; 1990.
Constant, J. Alcohol, lschemic hean disease, and the French paradox. Clin.
Cardiol. 20:420-424; 1997.
Cotgreave, 1.. MoI~Bus.P.. Schuppe, 1. The metabolism of N-acetylcysteine
by human endothelial cells. Biochem. Pharmacol. 42: 13- 16; 199 1.
Creager, M.A., Roddy, M-A., Boles, K., Stamler, J.S. N-acetylcysteine does
not influence the activity of endothelium-derived relaxing factor in vivo.
Hypertension 29:668-672; 1997.
Crooke. G.A., Harris, L.J., Grossi. E.A., Baumann. F.G.. Esposito. R., Spencer,
F.C., Colvin, S.B., Galloway, A.C. Role of amino acids and enhancement
cardioplegia in routine myocardial protection. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
106:497-501; 1993.
Cross, A.R., Jones. O.T.G. Enzymatic mechanisms of superoxide production.
Biochim. Biophys. Acta 1O57:28 1-298; 199 1.

Cross, H.R., Clarke, K., Opie, L.H., Radda, G. K. 1s lactate-induced myocardial

ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate?
J. Mol. Cell. Cardiol. 27: 1369-1 381 ; 1995.
Cross, H.R., Opie, L.H., Radda, G.K., Clarke, K. 1s a high glycogen content
beneficial or detrimental to the ischemic rat heart? Circ. Res. 78:482-49 1 ;
1996.
Curello, S., Ceconi, C., Cargnoni, A., Medici, O., Ferrari, R. Oxidative stress
during myocardial ischaemia and reperfusion: Experimental and clinical
evidences. J. Appl. Cardiol. 1:31 1-327; 1986.
Curtis, M.J., Pugsley, M.K., Walker, M.J.A. Endogenous chernical mediators
of ver~uiculararrhythmias in ischemic hean disease. Cardiovasc. Res. 27:703719; 1993.
Dagenais, F., Cartier, R., Hollmann, C., Buluran, J., Carrier, M., Pelletier, L.C.
L'influence de diffbrentes solutions de prservation sur la fonction endothliale
des artdres coronaires du rat. Ann. Chir. 47:848-854; 1993.
Damerau, W., Ibel, J., Thrich, T., Assadnazari, H., Zirnmer, G. Generation
of free radicals in Langendorff and working hearts during normoxia, hypoxia,
and reoxygenation. Basic Res. Cardiol. 88: 1 4 1 -1 49; 1993.
Darley-Usmar, V., Halliwell, B. Reactive nitrogen species, oxygen species,
transition rnetal ions, and the vascular system, Pharmaceutical Res. 13:649662; 1996.
Das, D. K., Engelman, R.M., Kimura, Y. Molecular adaptation of cellular
defences following preconditioning of the heart by repeated ischaemia.
Cardiovasc. Res. 27:578-584; 1 993.

Daut, J., Klieber, H-G., Cyrys, S., Noack, T. ,K,

channels and basal coronary
vascular tone. Cardiovasc. Res. 28:811-817; 1994.
Davidson, C.A., Kaminski, P.M., Wu, M., Wolin, M.S. Nitrogen dioxide causes
pulmonary anerial relaxation via thiol nitrosation and NO formation. Am. J.
Physiol. 27O:H 1038-H1043; 1 996.
Deboer, L.W.V., Bekx, P.A., Han, L., Steinke, L. Pyruvate enhances recovery
of rat heans after ischemia and reperfusion by preventing free radical
generation. Am. J. Physiol. 265:H 1 57 1-H 1 576; 1 993.

90.

de Groot, M.J.M., van der Vusse, G.J. The affects of exogenous lactate and

pyruvate on the recovery of coronary flow in the rat heart after ischaemia.
Cardiovasc. Res. 27:1088-1093; 1993.
de Groot, M.J.M., van t-telden, M.A.B., de Jong, Y.F., Coumans, W.A., van der
Vusse, G.J. The influence of lactate, pyruvate and glucose as exogenous
substrates on free radical defence mechanisms in isolated rat hearts during
ischaemia and reperfusion. Molec. Cell. Biochem. 146:147-155; 1995.
de Jong, J.W., van der Meer, P., Nieukoop, A.S., Huizer, T., Stoeve, R.J., Bos,
E. Xanthine oxidoreductase activity in perfused hearts of various species,
including humans. Circ. Res. 67:770-773; 1990.
Dellsperger, K.C. Potassium channels and the coronary circulation. Clin. Exp.
Pharmacol. Physiol. 23: 1096-1 101 ; 1996.
DeMaster, E.G., Quast, B.J., Redfern, B., Nagasawa, H.T. Reaction of nitric
oxide w i t h the free sulphydryl group of human serum alburnin yields a
sulphenic acid and nitrous oxide. Biochemistry 34:1 1494-1 1499; 1995.
Demmy, T.L., Haggerty, S.P., Boley, T.M., Curtis, J.J. Lack of cardioplegia
uniformiw in clinical myocardial preservation. Ann. Thorac. Surg. 57:648-65 1;

1994.
Depr, C., Firain, L., Hue, L. Activation of nitric oxide synthase by ischernia
in the perfused heart. Cardiovasc. Res. 33:82-87; 1997.
Depr, C., Vanoverschelde, J-L., Goudernant, J-F., Mottet, I., Hue, L.
Protection against ischemic injury by nonvasoactive concentrations of nitric
oxide synthase inhibitors in the perfused rabbit heart. Circulation 92: 19 11-

1918; 1995.
Des Rosiers, C., Rivest, M-J., Boily, M-J., Jette, M., Carrobe-Cohen, A.,
Kurnar, A.
Gas chrornatographic-mass spectrometric assay of tissue
malondialdehyde, 4-hydroxynonenal, and other aldehydes after their reduction
t o stable alcohols. Anal. Biochem. 208:16 1-170; 1993.
de Wit, L., Coetzee, A., Kotze, J., Lochner, A. Oxygen requirements of the
isolated rat hean during hypothermie cardioplegia. Effect of oxygenation on
metabolic and functional recovery after five hours of arrest. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 95:310-320; 1988.
Dimassi, N., MI, A., Autissier, NI, Bralet, J., Rochette, L. Relations between
repetfusion arrhythmias and myocardial norepinephrine and accumulation of
calcium in the rat. Cardioscience 3:7-12; 1992.

Donnelly, A.J. Adenosine is a useful alternative to verapamil when negative

inotropic effects must be avoided. AORN J. 54: 129-1 30; 19 9 1.
Donnelly, A.J., Djuric, M.
48:2444-2460; 199 1.

Cardioplegia solutions. Am. J. Hosp. Pharm.

Doring, H.J., Dehnert, H. The isolated perfused heart. According t o

Langendorff. 1re dition anglaise: Biornesstechnik-Verlag March GmbH, D7806 March, 1987.
Drinkwater, D-C.. Stein, DG., Permut, L.C., Laks, il. Clinical trial of University
of Wisconsin solution for cardiac transplantation: Pretiminary results. J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 102:798-808; 199 1.
Driokwater, D.C*, Ziv, E.T., Laks, H., Lee, J.R., Bhuta, S., Rudis, E., Chang,
P. Extracellular and standard university of Wisconsin solutions provide
equivalent preservation of myocardial f unction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
110:738-745; 1995.
Eddy, L.J., Stewart, J.R., Jones, HP., Engerson. T.D., McCord, J.M.,
Dow ney, J. M.
Free radical-producing enzyme, xanthine oxidase, is
undetectable in human heans. Am. J. Physiol. 253:H709-H711; 1987.
Eicher, J.C., Gabrielle, F., Abadie, C., Maupoil, V., Wolf, J E , David, M.,
Rochette, L. Exparimental preservation of the heart transplant: Effects of
deferoxamine on functional recovery and lipid peroxidation of the isolatedperfused rat heart subjected to ischemia and reperfusion. Transplantation
Proceedings 27: 16 54; 1995.
Emerit, J., Klein, J.M., Coutellier, A., Congy, F.
Radicaux libres e t
peroxydation lipidique en biologie cellulaire:
Perspectives physiopathologiques. Path. Biol. 39:316-327; 199 1.
Engelman. R.M., ROUSOU.J.A., Flack III, J E , lyengar, J., Kimura, Y.. Das,
D.K. Reduction of infarct site by systemic amino acid supplementation during
reperfusion. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 101:855-859; 1 99 1

Epstein, S.E.,Speir, E., Unger, E.F., Guzman, R.J., Finkel, T. The basis of
molecular straegies for treating coronary restenosis after angioplasty. J. Am.
Coll. Cardiol. 23: 1278-1288; 1 994.
Esterbauer, H. The role of vitamin E and carotenoids in preventing oxidation
of low density Iipoproteins. Ann. N.Y. Acad. Sci. 570:254-267, 1989.

112.

Esterbauer, H.. Zollner, H., Schaur. R.J.

Aldehydes formed by lipid

peroxidation: Mechanisms of formation, occurrence, and determination. In

Membrane lipid oxidation, Vigo-Pelfrey, C. Ed., CRC Press, 239-268; 1 992.
Euler, D.E. Reperfusion induced arrhythmias are not caused by generation of
free radicals. Cardiovasc. Res. 28:423; 1994.
Evans, P.J., Whiteman, M., Tredger, J.M., Halliwell, B. Antioxidant properties
of S-adenosyl-L-methionine: A proposed addition to organ storage fluids. Free
Radic. Biol. Med. 23: 1002-1008;1997.
Feelisch, M., te Poel, M., Zamora, R., Deussen, A., Moncada, S.
Understandingthe controversy over the identity of EDRF. Nature 368:62-65;
1994.
Feigl, E.O. EDRF-a protective factor? Nature 331:490-49 1 ; 1988.
Feldman, L.J., Tahlil, O., Steg, G. Perspectives of arterial gene therapy for the
prevention of restenosis. Cardiovasc. Res. 32: 194-207; 1996.
Ferrari, R. Oxygen-free radicals a t the myocardial level: Effects of ischaemia
and reperfusion. Adv. Exp. Biol. Med. 366:99-111; 1994.
Ferrari, R. The role of free radicals in ischaemic myocardium. British J. Clin.
Practice M : 3 O 1-305; 1 990.
Ferrari, R., Ceconi, C., Curello, S., Cargnoni, A., Agnoietti, G.,Boffa, G.M.,
Visioli, O. intracellular effects of myocardial ischaemia and reperfusion: Role
of calcium and oxygen. Eur. Heart J. 7(Suppl Al:3-12; 1986.
Ferrari, R., Ceconi, C., Curello, S., Cargnoni A., Alfieri, O., Pardini, A.,
Marzollo, P., Visiolo, O. Oxygen free radicals and myocardial damage:
Protective role of thiol-containing agents. Am. J. Med. 91 :(suppI. 3C):95s105s; 1991.
Ferrari, R., Ceconi, C., Curello, S., Pepi, P., Mazzoletti, A., Visioli, O.
Cardioprotective effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors in patients
with coronary arten/ disease. Cardiovasc. Drugs. Therapy 10:639-647; 1996.
Ferreira, R., Burgos, M., Llesuy, S., Mokeni, L., Milei, J., Gonzalez Flecha, B.,
Boveris, A. Reduction of reperfusion injury with mannitol cardioplegia. Ann.
Thorac. Surg. 48:77-84; 1989.
Ferrera, R. J., Marcsek, P., Larese, A., Girard, C., Guidollet, J., Dittmar, A.,
Dureau, G. J. Comparison of continuous microperfusion and cold storage for
pig heart preservation. Heart Lung Transplant. 12:46 3-469; 1993.

125.

Flanagan, R.J., Meredith, T.J. Use of N-acetylcysteine in clinical toxicology.

Am. 3. Med. 91 :(supp1.3C):13 1s-139s; 199 1 .

126.

Folette, D.M., Fey, K., Buckberg, G.D. Helly, J.J., Steed, D.L. Foglia, R.P.,
Maloney, J.V. Reducing postischemic damage by temporary modification of
reperfusate calcium, potassium, pH, and osrnolarity. J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 82:221-238; 1981.

127.

Forman, M.B., Puett, D. W., Cates, C.U., McCroskey, D E , Beckman, J.K.,

Greene, H.L., Virmani, R. Glutathione redox pathway and reperfusion injury,
Effect of N-acetylcysteine on infarct sire and ventricular function. Circulation
78:202-213; 1988.

7 28.

Fraber, N.E., Vercellotti, G.M., Jacob, H.S., Pieper, G.M., Gross, G. Evidence
for a role of iron-catalyzed oxidants in functional and metabolic stunning in the
canine heart. Circ. Res. 63:% 1-360; 1988.

129. French, B.A., Mazur, W., Ali, N.M., Geske, R.S., Finnigan, J.P., Rodgers, G.P..
Roberts, R., Raizner, A.E. Percutaneous transluminal in vivo gene transfer by
recombinant adenovirus in normal porcine coronary arteries, atherosclerotic
arteries, and two models of coronary restenosis. Circulation 90:2402-2413;
1994.
130.

Friedl, H.P., Smith, D.J., Till, G.O., Thomson, P.D., Louis, D.S., Ward, P.A.
Ischemia-reperfusion in humans. Appearance of xanthine oxidase activity.
Am. J. Pathol. l36:49 1-495; 1990.

1 3 1. Furchgott, R.F., Zawadzki , J.V. The obligatory role of endothefial cells in the
relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288: 37 3-376;
1980.

132. Galinanes, M., Bernocchi, P., Argano, V., Cargnoni, A., Ferrari, R., Hearse,
3.J. Dichotomy in the post-ischemic metabolic and functional recovery
profiles of isolated blood-versus buffer-perfused heart. J. Mol. Cell. Cardiol.
28:531-539; 1996.
1 33.

Galinanes, M., Chambers, D.J., Hearse, D.J. Effect o f sodium aspartate on

the recovery of rat heart from long-term hypothermie storage. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 1 0 3 5 2 1-53 1; 1992.

134.

Galinanes, M., Chambers, D.J., Hearse, D.J. Should adenosine continue t o be

ignored as a cardioprotective agent in cardiac operations? J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 105: 180- 183; 1993.

135.

Ganote,

C.E., Nayler, W.G. Contracture and the calcium paradox. J. Mol.

Celt. Cardiol.. 171733-745; 1985.

Garlick, P.B., Davies, M.&, Hearse, D.J., Slater, T.F. Direct detection of free
radicals in the reperfused rat heart using electron spin resonance
spectroscopy. Circ. Res. 61:757-760; 1987.
Gauduel, Y., Menasch, P., Duvelleroy, M. Enzyme release and mitochondrial
activity in reoxygenated cardiac muscle: Relationship with oxygen-induced
lipid peroxidation. Gen. Physiol. Biophys. 8:327-340; 1989.
Geffin, G.A., Reynolds, TA., Titus, J.S., O'Keefe, D.D., Daggett, W.M.
Relation of myocardial protection t o cardioplegic solution pH: Modulation by
calcium and magnesium. Ann. Thorac. Surg.. 52:955-964; 199 1 .
Gharagozloo, F., Melendez, F.J., Hein, R.A., Laurence, R.G., Shemin, R.J.,
DiSesa, V.J., Cohn, L.H. The effect of amino acid L-glutamate on the
extended preservation ex vivo of the heart for transplantation. Circulation
76(suppl V):65-70; 1987.
Ghomeshi, H.R.. Tian, G., Ye. J., Sun, J., Hoffenberg, E.F., Salerno, T.A.,
Deslauriers, R. Cardiopulmonary bypass, myocardial management, and support
techniques. Aspartatelglutamate-enriched blood does not improve myocardial
energy metabolism during ischemia-reperf usion: A P rnagnetic resonance
spectroscopic study in isolated pig hearts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
lt3:1068-1080; 1997.
Goidhaber, J.I.. Weiss, J.N. Oxygen free radicals and cardiac reperfusion
abnormalities. Hypertension 20: 1 18-127; 1992.
Goldhaber, J.1 . Free radicals enhance Na +/Ca2 exchange in ventricular
myocytes. Am. J. Physiol. 271 :H823-H833; 1996.
+

Goto, R., Tearle, H*, Steward, D.J., Ashmore, P.G. Myocardial oedema and
ventricular function after cardioplegia with added mannitol.
Can. J.
Anaesthesia 38:7-14; 199 1 .
Gow. A.J., Buerk, D.G., Ischiropoulos, H. A novel reaction rnechanism for the
formation of S-nitrosothiol in vivo. J, Biol. Chem, 272:2841-2845; 1997.
Gressier, B.. Cabanis. A., Lebegue, S., Brunet, C., Dine, T., Luyckx, M..
Cazin, M., Carin. J-C. Decrease of hypochlorous acid and hydroxyl radical
generated by stimufaed human neutrophils: Cornparison in vitro of some thiolcontaining drugs. Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 16:9-13; 1994.
146. Grum, C.M., Gallagher, K.P., Kirsh. M.M., Shlafer, M. Absence of detectable

xanthine oxidase in human myocardium. J. Mol. Cell. Cardiol. 21:263-267;

1989.
Guarnieri, C., Turinetto, B., Coli, G., Muscari, I., Cattabridge. 1.. Vaona, I.,
Finelli, C., Pigini, F., Caldarera, C.M. Effect of glutathione monoethyl ester on
glutathione level and cardiac energetics in reperfused pig heart. Res.Comm.
Chem. Pathol. Pharmacol. 81:33-44; 1993.
Gunnes, S. Ytrehus, K.; Sorlie, D. Effects of initial reperfusion temperature
and pressure after prolonged cardioplegic ischemic arrest. Scand. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 24: 1 35-1 39; 1990.
Guth, B.D., Schulz, R., Heusch, G. Time course and mechanisms of
contractile dysfunction during acute myocardial ischemia. Circulation 87:fV35IV42; 1993.
Gutteridge, J.M.C., Quinlan, G.J. Malondialdehyde formation from lipid
peroxides in the thiobarbituric acid test: The rote of lipid radicats, iron salts,
and metal chelators. J. Appl. Biochem. 5:293-299; 1983.
Haan C.K., Lazar, H.L., Rivers, S., Coady, C., Shemin, R.J. lrnproved
myocardial preservation during cold storage using substrate enhancement.
Ann. Thorac. Surg. 50:80-85; 1990.
Hahimoto, K., Mashburn, J.P., Cartier, R., Schaff, H.V. Control of Ca2' influx
by manipulation of Ca2+and/or Ca2 antagonist in cardioplegic arrest. Jpn.
Circ. J. 57:237-244; 1993.
+

Halliwell, B. Antioxidants in human health and disease. Ann. Rev. Nutr.

16:33-50; 1996.
Halliwell, B., Gutteridge, J.M. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition
metals and disease. Biochem. 3. 2 W : l - l 4 ; 1984,
Halliwell, B., Gutteridge, J.M. Role of free radicals and catalytic metal ions in
human disease: An overview. Methods in Enzymology 186: 1-85; 1990.
Halliwell, B., Hu, M-L., Louie, S., Duvall, T.R., Tarkington, B.K., Motchnick, P.,
Cross, C.E. Interaction of nitrogen dioxide with human plasma. Antioxidant
depletion and oxidative damage. FEBS Letters 313:62-66; 1992.
Hamon, M., Bauters, C., McFadden, E.P., Wernert, N., Lablanche, J.M.,
Dupuis, B., Bertrand, M.E. Restenosis after coronary angioplasty. Eut. Hean

Han, J., So, I., Kim, E X , Earm, Y.E. ATP-sensitive potassium channels are
modulated by intracellular lactate in rabbit ventricular myocytes. Pflgers
Arch. 425546-548; 1993.
Hanley, P.J., Cooper, P.J., Loiselle, D.S. Effect of hyperosmotic perfusion on
rate o f oxygen consumption of isolated guinea pig and rat hearts during
cardioplegia. Cardiovasc. Res. 28:485-493; 1994.
Harding, R.J., Duncan, C.J. Protection against cellular damage in the perfused
rat heart by lowered pH. Eur. J. Pharmacoi. 330347-53; 1997,
Harjula, A., Mattila, S., Mattila, I., Harkonen, M., Myllarniemi, H., Nickels, J.,
Merikallio, E. Coronary endothelial damage after cristalloid cardioplegia. J.
Cardiovasc. Surg. 25: 147- 15 2; 1984.
Haywood, G.A., Tsao, P.S., von der Leyen, H.E., Mann, M.J., Keeling, P.J.,
Trindade, P T . , Lewis, N.P., Byrne, C.D., Rickenbacher, P.R., Bishopric, N.H.,
Cooke, J.P., McKenna, W. J., Fowler, M.8. Expression of inductible nitric
oxide synthase in human heart failure. Circulation 93:1087-1094; 1996.
Hearse, D.J. Ischemia, reperfusion and the determinants of tissue injury.
Cardiovasc. Drugs Ther. 4:767-776; 1990.
Hearse D.J. Reperfusion of the ischemic myocardium. J. Mol. CelI. Cardiol.
9:6O5-616; 1 977.
Hearse, D. J. Stunning: A radical re-view. Cardiovasc. Drugs Ther. 5:853876; 1991.
Hearse, D.J., Humphrey, S.M., Bullock, G.R. The oxygen paradox and the
calcium paradox: Two facets of the same problem? J. Mol. Cell. Cardiol.
10:641-668; 1978.
Hearse, D.J., Humphrey, SM., Chain, .B. Abrupt reoxygenation o f the
anoxic potassium arrested perfused rat h e m : A study of myocardial enzymes
release. J. Mol. Cell. Cardiol 51395-407; 1973.
Hearse, D.J., Maxwell, L., Saldanha, C., Gavin, J.B.
The myocardial
vasculature during ischernia and reperfusion:
A target for injury and
protection. J. Mol. Cell. Cardiol. 25:759-800; 1993.
Hearse, D.J., Tosaki, A. Free radical and calcium: Simultaneous interaction
triggers as deterrninants of vulnerability t o reperfusion-induced arrhythmias in
the rat heart. 3. Mol. Cell. Cardiol. 20:213-223; 1988.

Heinemeyer, Da, Belles, G., Stapenhorst, K. lntracellular pH measurement

during cardiac arrest in ventricular myocardium by Bretschneider's cardioplegic
solution HTK and St. Thomas Hospital solution with and without procaine.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 35:48-52; 1987.
Held, K.D., Sylvester, F.C., Hopcia, K.L., Biaglow, J.E. Role of Fenton
chemistry in thiol-induced toxicity and apoptosis. Radiation Res. 145:542-553;
1996.
Henry, T.D., Archer, S.L., Nelson, D., Weir, E.K., From, H.L. Enhanced
cherniluminescence as a measure of oxygen-derived free radical generation
during ischemia and reperfusion. Circ. Res. 67:1453-146 1 ; 1990.
Henry, T.D., Archer, S.L., Nelson, D., Weir, E.K., From, A.H.L. Postischemic
oxygen radical production varies with duration of ischemia. Am. J. Physiol.
264:H 1478-Hl 484; 1993.

Heusch, G. Ischemia-selectivity: A new concept of cardioprotection by

calcium antagonists. Basic Res. Cardiol. 89:2-5; 1994.
Hisatomi, K., Maruyama, H., Isomura, T., Aoyagi, S., Kosuga, K., Ohishi, K.
Beneficial effect of the addition of nitroglycerin to the cardioplegic solution on
the cold-stored repeifused isolated rat heart. Jpn. Circ. J. 57558-562; 1993.
Hoffman RB., Lefkowitz, R.J. Chapitre 10:
Catecholamines,
sympathomimetic drugs, and adrenergic receptor antagonists, p l 99-248. The
pharmacological basis of therapeutics, Ninth ed. Goodman & Gilman 1996,
McGraw-Hill (Maison d'dition), Montreal.
Hogg, N., Singh, R.J., Kalyanaraman, B. The role of glutathione in the
transport and catabolism of nitric oxide. FEBS Letters 382:223-228;1996.
Holscher, M., Groenewoud, A.F.
Current status of HTK solution of
Bretschneider in organ preservation. Transplantation Proc. 23:2334-2337;
1991.
Hori, M., Kitakaze, M., Sato, H., Takashima, S., Iwakura, K., Inoue, M.,
Kitabatake, A., Kamada, T. Staged reperfusion attenuates myocardial
stunning in dogs. Role of transient acidosis during early reperfusion.
Circulation 84:2135-2145; 199 1,
Horowitz, J.D., Henry, C.A., Syrjanen, ML., Louis, W.J., Fish, D., Smith,
T.W., Antman, E.M. Combined use of nitroglycerin and N-acetylcysteine in the
management of unstable angina pectoris. Circulation 77:787-794; 1 988.

Huaable, B.J.
1992.

Physiological actions of taurine. Physiol Rev. 72:101-163;

Ichinari, K., Kakei, M., Matsuoka, T., Nakashima, H., Tanaka, H. Direct
activation of the ATP-sensitive potassium channel by oxygen free radicals in
guinea-pig ventriculai cells: Its potentiation by MgADP. J. Molec. Cell.
Cardiol. 28: 1867-1877; 1996.
Ignarro, L.J. Endotheliurn-derived nitic oxide: Pharmacology and relationship
to the actions of organic nitrate esters. Pharmac. Res. 6:65 1-659; 1989.
Imamura, Y., Tomoike, H., Narishige, T., Takahashi, T., Kasuya, H., Takeshita,
A. Glibenclamide decreases basal coronary blood flow in anesthetized dogs.
Am. J. Physioi. 263:H399-H404; 1992.
Ingelman-Sundberg, M., Kaur, H., Terelius, Y ., Persson, J-O., Halliwell, B.
Hydroxylation of salicylate by microsomal fractions and cytochrome P-450.
Lack of production of 2.3-dihydroxybenzoate unless hydroxyl radical formation
is permitted. Biochem. J. 276:753-757; 199 1.
Islam, S., Berggren, PO.,Larsson, O. Sulfhydryl oxidation induces rapid and
reversible closure of the ATP-regulated K' channel in the pancreatic B-cell.
FEBS Letters 31 9: 128-1 32; 1993.
Jackson, C.V., Mickelson, J.K., Pope, T.K., Rao, P.S., Lucchesi, B.R. O, free
radical rnediated myocardial and vascular dysfunction. Am. J. Physiol.
251:H1225-H1231; 1986.
Jaffe, A.S., Landt, Y., Parvin, C.A., Abendschein, BR., Geltman, E.M.,
Ladenson, J.H. Comparative sensitivity of cardiac troponin I and lactate
dehydrogenase isoenzymes for diagnosing acute rnyocardial infarction. Clin.
Chernistry 42: 1 770-1 776; 1996.
Janero, D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic
indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. Free Radic. Biol.
Med. 9:515-540; 1990.
Janero, D.R. Therapeutic potential of vitamin E against myocardial ischemicreperfusion injury. Free Radic. Biol. Med. 1U:3 15-324; 199 1

Jeevanandam, V., Auteri, J.S., Sanchez, J.A., Barr, M.L., Ott, G.Y., Hsu, D,,
Marboe, C., Smith, C.R., Rose, E.A. lmproved hean preservation with
University of Wisconsin solution: Experimental and preliminary human
experience. Circulation 84:111324-111328; 199 1.

Jeevanandarn, V., Auteri, J.S., Sanchez, J.A., Hsu, O., Marboe, C., Smith,
C.R., Rose, E.A. Cardiac transplantation after prolonged graft preservation
with the University of Wisconsin solution. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
104:224-228; 1992.
Factors involved in salvaging ischernic
Jennings, R B . , Reimer, K.A.
myocardium: Effect of reperfusion of arterial blood. Circulation 68: 125-136;
1983.
Jessen, M.E., Kovarik, T.E., Jeffrey, F.M., Sherry, A.D., Storey, C.J., Chao,
R.Y., Ring, W.S., Malloy, C.R. Effects of amino acids on substrate selection,
anaplerosis, and left ventricular function in the ischemic reperfused rat heart.
J. Clin. Invest. 92:831-839; 1 993.
Jewett, S.L., Eddy, L.J ., Hochstein, P. Is the autoxidation of catecholamines
involved in ischemia-reperfusion injury? Free Radic. Biol. Med. 6: 185-188;
1989.
Kanatsuka, H., Sekiguchi, N., Sato, K., Akai, K., Wang, Y., Komaru, T.,
Ashikawa, K., Takishima, T. Microvascular sites and mechanisms responsible
for reactive hyperemia in the coronary circulation of the beating canine heart.
Circ. Res. 71:912-922; 1992.
Kavanaugh, M.P. Voltage dependence of facilitated arginine flux mediated by
the systern y basic arnino acid transporter. Biochemistry 32:5781-5785;

1993.
Keaney, J.F., Simon, BI., Stamler, J.S., Jaraki, O., Scharfstein, J., Vita, J.A.
Loscalzo, J. NO forrns an adduct with serum albumin that has endotheliumderived relaxing f actor-li ke properties. J. Clin. Invest. 91:1582- 1589; 1993.
Keung, E.C., Li, O. Lactate activates ATP-sensitive potassium channels in
guinea pig ventricular myocytes. J. Clin. Invest. 88: 1772-1 777; 199 1 .
K halid, M.A., Ashraf, M. Direct detection of endogenous hydroxyl radical
production in cultured aduh cardiomyocytes during anoxia and reoxygenation.
Is the hydroxyl radical really the most damaging radical species? Circ. Res.

72:725-736; 1993.
King, LM., Boucher, F.. Opie, L.H. Coronary flow and glucose delivery as
determinants of contracture in the ischemic myocardium. J Mol. Cell. Cardiol.
27:70t-720; 1995.
Kingma, J.G. jr., Rouleau. J.R. Effects of N-acetylcysteine on tissue necrosis
during acute rnyocardial infarction in rabbits. Can. J. Cardiol. 5:321-326;

Kitakaze, M., Minamino, T., Node, K., Komamura, K., Shinozaki, Y., Mori, H.,
Kosaka, H., Inoue, M., Hori, M., Karnada, T. Beneficial effects of inhibition of
angiotensin-converting enzyme on ischemic myocardium during coronary
hypoperfusion in dogs. Circulation 92:95O-96 1 ; 1995.
Kitakaze, M., Weisfeldt, M L , Marban, E. Acidosis during early reperfusion
prevents myocardial stunning in perfused ferret heans. J. Clin. Invest. 82:920927; 1988.
Kjellman, U., Bjork, K., Ekroth, R., Karlsson, H., Jagenburg, R., Nilsson, F.,
Svensson, G ., Wernerman, J. a-Ketoglutarate for myocardial protection in
heart surgery. The Lanczt 345:552-553; 1995.
Kleinveld, H.A., Demacker, P.N.M., Stalenhoef. Failure of N-acetylcysteine t o
reduce low-density lipoprotein oxidizability in healthy subjects. Eur. J. Clin.
Pharmacol. 43:639-642; 1992.
Kohno, H., Shiki, K., Ueno, Y., Tokunaga, K. Cold storage of the rat heart for
transplantation. Two types of solution required for optimal preservation. J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 93:86-94; 1987.
Kojima, S., Wu, S.T., Watters, T.A., Parmley, W.W., Wikman-Coffelt, J.
Effects of perfusion pressure on intracellular calcium, energetics, and function
in the perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 2W:H 183-Hl 89; 1993.
Konorev, E.A., Tarpey, M.M., Joseph, J., Baker, J.E., Kalyanaraman, B. Snitrosoglutathione irnproves functional recovery in the isolated rat heart after
cardioplegic ischemic arrest. Evidence for a cardioprotective effect of nitric
oxide. J. Pharmacol. Exp. Therap. 274:200-206; 1995.
Konorev, E. A., Joseph, J., Tarpey, M.M., Kalyanaraman, B. The mechanisrn
of cardioprotection by S-nitrosoglutathione monoethyl ester in rat isolated
heart during cardioplegic ischaemic arrest. Mt. J. Pharmacol. 119: 5 1 1 -5 18;
1996.
Korthuis, R.J., Granger, D.N. Reactive oxygen metabolites, neutrophils, and
the pathogenesis of ischemic-tissue/reperfusion. Clin. Cardiol. 16:119-126;
1993.
Kiamer, J.H., Weglicki, W.B. A hydroxylated analog of the beta-adrenoceptor
antagonist, carvedilol, affords exceptional antioxidant protection t o
postischemic rat hearts. Free Radic. Biol. Med. 21:813-825; 1996.

Kukreja, R.C., Hess, M.L. The oxygen free radical system: From equations
through membrane-protein interactions to cardiovascular injury and protection.
Cardiovasc. Res. 26:641-6 55; 1992.
Kukreja, R.C., Loesser, K.E., Kearns, A.A., Naseem, S.A., Hess, M.L.
Protective effects of histidine during ischemia-reperfusion in isolated perfused
rat hearts. Am. J. Physiol. 26Q:H 1 370-Hl 381 ; 1993.
Laplante, A., Brunet, J., Bouchard, B., Boucher, C., Becker, B.F., Comtois,
A.S., Des Rosiers, C. The role of ,K
'
channels in metabolic cardioprotection
by furnarate. Manuscrit soumis Am. J. Physiol.
Lazar, ML., Yang, X., Rivers, S., Stockwell, O., Shemin, R.J. Superiority of
substrate enhancernent over oxygen free-radical scavengers during extended
periods of cold storage for cardiac transplantation. Surgery 108:423-430;
1990.
Leclerc, G. Le transfert gnique intia-vasculaire. Union Mdicale du Canada
122:204; 1993.
Lecompte, T., Marnas, S. Prostanodes et hmostase. Thrapie 46:227-230;
1991.
tedingham, S.J.M., Baimbridge, MM., Hearse, D. J. The St. Thomas' Hospital
cardioplegic solution. A cornparison of the efficacity of t w o formulations. J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 93:240-246; 1 987.
Lefer, A.M. Attenuation of myocardial ischemia-reperfusion injury with nitric
oxide replacement therapy. Ann. Thorac. Surg. 60:847-85 1; 1995.
Lefer, A.M.; Tsao, P.S.; Lefer, D.J.; Ma, X.L. Role of endothelial dysfunction
in the pathogenesis of reperfusion injury after myocardial ischemia. FASEB J.
52029-2034; 1991.
Lehman, J.O., Dyke, C., Abd-Elfattah, A., Yeh, T., Ding, M.. Ezrin, A..
Wechsler, A.S.
Polyethylene glycol-conjugated superoxide disrnutase
attenuates reperfusion injury when administered twenty-four hours before
ischemia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:1597-1601 ; 1992.
Li , X-S., Uriuda, Y., Wang, Q.-D., Nordlander, R., Sjoquist, P.-O., Pernow, J.
Role of L-arginine in preventing myocardial and endothelial injury following
ischaemiahperfusion in the rat isolated heart. Acta Physiol. Scand. 156:3744; 1996.

224.

Light, P. Regulation of ATP-sensitive potassium channefs by phosphorylation.

Biochim. Biophys. Acta 1286:65-73; 1996.

Lindal, S., Gunnes, S., Lund, I., Straurne, B.K., Jorgensen, L., Sorlie, O.
Ultrastructural changes in rat hearts following cold cardioplegic ischemia of
differing duration and differing modes of reperfusion. Scand. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 24:213-222; 1990.
Lin, M.R., Jeremy, R.W.. Weisman, H.F.. Winkelstein, J.A., Becker, L.C.
Neutrophil depletion limited to reperfusion reduces myocardial infarct size after
90 minutes of ischemia. Evidence for neutrophil-mediated reperfusion injury.
Circulation 80: 18 16-1827; 1989.
Liu, X.K., Tosaki, A., Engleman. R.M., Das, D.K. Salicylate reduces ventricular
dysfunction and arrhythmias during reperfusion in isolated rat heart. J.
Cardiovasc. Pharmacol. 19:209-215; 1992.

Llesuy, S., Milei, J., Picone, V., Gonzalez Flecha, B., Beigelman, R., Boveris,
A. Effect of vitamins A and E on ischemia-reperfusion damage in rabbit heart.
Molec. Cell. Biochem. 145:45-5 1; 1995.
Lopukhin, S.Y ., Southard, J.H., Belter. F.O. University of Wisconsin solution
containing 2.3-butanedione-monoxime extends myocardium preservation time.
Transplantation Proc. 25: 301 7-30 18; 1993.
Loscalzo, J. Welch, G. Nitric oxide and its role in the cardiovascular system.
Progress Cardiovasc. Diseases 38:87-104; 1995.
Loskove, J.A., Frisfiman, W.H. Nitric oxide donors in the treatment of
cardiovascular and pulmonary diseases. Am. Hean J. 129:604-613; 1995.
Lucchesi, B.R. Modulation of leukocyte-mediated myocardial reperfusion
injury. Ann. Aev. Physiol.
1-5 76; 1990.
Ma, X.L., Tsao. P.S., Viehman, G.E., Lefet, A.M. Neutrophil-mediated
vasoconstriction and endothelial dysfunction in low-flow perf usion-reperf used
cat coronary artery. Circ. Res. 6 W 5 -106; 199 1 .
Ma, X-L., Weyrich. A.S., Lefer, D.J., Lefer, A.M. Diminished basal nitric oxide
release after myocardial ischemia and reperfusion promotes neutrophil
adherence t o coronary endothelium. Circ. Res. 72:403-4 12; 199 3.

Maekawa, K.. Saito. D.. Obayashi. N., Uchida, S.. Haraoka, S. Role of
endothelium-derived nitric oxide and adenosine in functional myocardial
hyperemia. Am. J. Physiol. 267:H166-H173; 1 994.

Manch, A., Edmondson, S. J., Hearse. D. J. Dynamics of early postischemic

myocardial functional recovery. Evidence of reperfusion-induced injury?
Circulation 92526-534; 1995.
Manciet, L.H., Larson, D.F.. Copetand, J.G. Low-pressure perfusion results in
effective microvascular perfusion of isolated rabbit hearts during hypotherrnic
preservation for twenty-four hours. J. Heart Lung Transpl. 1O:7 10-716; 199 1.
Mankad, P.S., Chester, A.H., Yacoub, M.H. Role of potassium concentration
in cardioplegic solutions in mediating endothelial damage. Ann. Thorac. Surg.
51 :89-93;199 1.
Mankad, P., Slavik, Z.,Yacoub, M. Endothelial dysfunction caused by
University of Wisconsin preservation solution in the rat heart. The importance
of temperature. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:16 18-1 624; 1992.
Manning, A.S. Reperfusion-induced arrhythmias: Do free radicals play a
critical role? Free Radic. Biol. Med. 4:305-316; 1988.
Marin, J.. Rodriguez-Martinez, M.A. Nitric oxide, oxygen-derived free radicals
and vascular endothelium. J. Auton. Phaimacol. 15:279-307; 1995.
Masaki, T. Possible role of endothelin in endothelial regulation of vascular
tone, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:235-255; 1995.
Massoudy, P., Becker, B.F.. Gerlach, E. Bradykinin accounts for improved
postischemic function and decreased glutathione release of guinea pig heart
treated with the angiotensin-converting enzyme inhibitor ramiprilat. J.
Cardiovasc. Pharmacol. 23:632-6 39; f 994.
Massoudy, P., Becker, B.F., Gerlach, E. Nitric oxide accounts for postischemic
cardioprotection resulting from angiotensin-converting enzyme inhibition:
Indirect evidence for a radical scavenger effea in the isolated guinea pig hean.
J. Cardiovasc. Pharmacol. 25:440-447; 1995.
Masters, T.N., Robicsek, F., Schaper, J., Jenkins, S., Rice, H. Effects of
canine donor h e a preservation
~
temperature on posttransplant left ventricular
function and myocardial metabolism. Transplantation 57:807-811; 1994.
Matsuda, N., Kuroda, H., Mori, T. Seneficial actions of acidotic initial
reperfusate in stunned myocardium of rat heans. Basic Res. Cardiol. 86:317326; 1991.
Matsushima,T., Sueda, T-, Matsuura, Y., Kawasaki, T. Protection by
coenzyme O,, of canine myocardial reperfusion injury after reperfusion. J.

Thorac. Cardiovasc. Surg. 1O3:945-95 1 ; 1 992.

248.

Matsuura, H., Lazar, H.L., Yang, X., Rivers, S., Treanor, P., Bernard, S.,
Shemin, R.J. Warm versus cold blood cardioplegia. 1s there a difference? J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 10545-5 1 ; 1993.

249.

Maupoil, V., Rochette, L. Evaluation of free radical and lipid peroxide

formation during global ischemia and reperfusion in isolated perfused rat heae.
Cardiovasc. Drugs Ther. 2:6 15-622; 1 988.

250.

Maupoil, V., Chaillot, B., Brunotte, F., Rochette, L. Identification et valuation

des radicaux libres dans la squence ischmie-reperfusion cardiaque. Arch.
Mal- Coeur 86:63-68; 1993.

25 1 . Maxwell, S.R., Lip, G.Y. Reperfusion injury: A review of the pathophysiology,

clinical manifestations and therapeutic options. Int. J. Cardiol. 58:95- 1 17;
1997.
25 2.

McCord, J.M. Oxygen-derived free radicals in postischernic tissue injury. New

Engl. J. Med. 312: 159-163; 1985.

253.

Meister, A., Anderson, M.E. Glutathione. Ann. Rev. Biochem. 52:7 11-760;

1983.
254.

Menasch, P. Blood cardioplegia: Do we still need t o dilute? Ann. Thorac.

Surg. 62:957-960; 1996.

255.

Menasch, P., Grousset, C., de Boccard, GaI Piwnica, A. Protective effect of

a asanguineous reperfusion solution on myocardial performance following
cardioplegic arrest. Ann. Thorac. Surg. 37:222-228; 1984.

256.

Menasch, P., Grousset, C., Gauduel, Y., Mouas, C., Piwnica, A. Maintenance
of the myocardial thiol pool by N-acetylcysteine an effective means of
improving cardioplegic protection. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1O3:936-944;

1992.
257.

Menasch, P., Grousset, C., Gauduel, Y., Mouas, C., Piwnica, A. Prevention
of hydroxyl radical formation: A critical concept for improving cardioplegia.
Circulation 76:V180-VI 85; 1987.

258.

MenaschB, P., Grousset, C., Gauduel, Y., Piwnica, A. A comparative study of

free radical xavengers in cardioplegic solutions. J. Thorac. Cadiovasc. Surg.
92:264-27 1; 1986.

259.

Menaschb, P., Grousset, C., Peynet, J., Mouas, C., Bloch, G., Piwnica, A.

Pretreatment with captopril improve myocardial recovery after cardioplegic

arrest. J. Cardiovasc. Pharmacol. 19:402-407; 1 992.
Menasch, P., Grousset, C., Mouas, C., Piwnica, A. A promising approach for
improving the recovery of heart transplants. Prevention of f ree radical injury
through iron chelation by deferoxamine. J. Thorac. Cadiovasc. Surg. 100: 1321; 1990.
Menasch, P., Hricak, Be, Pradier, F.1 Cheav, S.L., Grousset, C., Mouas, C.,
Albrici, G., Bloch, G., Piwnica, A. Efficacy of lactobionate-enriched
cardioplegic solution in preserving compliance of cold stored heart transplants.
J. Heart Lung Transplant. 12:1053-1061; 1993.
Menasch, P., Pradier, F., Grousset, C., Peynet, J., Mouas, C., Bloch, G.,
Piwnica, A. lmproved recovery of heart transplants with a specific kit of
preservation solutions. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 105:353-363; 1993.
Menasch, P., Pradier, F., Peynet, J., Grousset, C., Mouas, C., Bloch, G.,
Piwnica, A. Limitation of free radical injury by reduced glutathione: An
effective means of improving the recovery of heart transplants. Transpl.
Proceed. 23:2240-2242; 199 1.
Menasch, P., Termognon, J-L., Pradier, F., Grousset, C., Mouas, C., Atberici,
G., Weiss, M., Piwnica, A., Bloch, G. Experirnental evaluation of Celsior, a
new heart preservation solution. Eur. J. Cardio. Thorac. Surg. 8207-213;
1994.
Mezzetti, A., Calafiore, A., Lapenna, D., Deslauriers, R., Tian, G., Salerno,
T.A., Verna, A.M., Bosco, G., Pierdomenico, S.D., Caccurullo, F. Intermittent
antegrade warm cardioplegia reduces oxidative stress and improves
metabolism of the ischemic-reperfused human myocardiurn. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 109:787-795; 1 995.
Miller, LW., Jellinek, M., Codd, J.E., Kolata, R.J. lmproved rnyocardial
preservation by control of the oxidation-reduction potential. Hean Transplant.
IV:319-324; 1985.
Milliken, J.C., Billingsley, A.M., Laks, H. Modified reperf usate after long-term
preservation of the heart. Ann. Thorac. Surg. 47:725-728; 1989.
Minor, T., Sturz, J., Klauke, H., Isselhard, W. Reduction of oxidative tissue
injury and endothdial dysfunction by graduated reperfusion after cardioplegic
arrest in isolated rat hearts. Free Radic. Biol. Med. 18:621-626; 1995.

269. Misra, H.P., Fridovich, 1.

The generation of superoxide radical during the

autoxidation of hemoglobin. J. Biol. Cham. 247:6960-6962; 1972.

270.

Miyoshi, H., Nakaya, Y ., Moritoki, H. Nonendothelial-derived nitric oxide

activates the ATP-sensitive K + channel of vascular smooth muscle cells. FERS
Letters 34547-49; 1994.

271.

Mohanlal R.W., Mauve, I., Zoet, A.C.M., van der Laarse, A. Reperfusion
induced enzyme release: Washout effect or manifestation of reperfusion
damage? Cardiovasc. Res. 22:603-61O; 1988.

272.

Mohazzab-H, K.M., Kaminski, P.M., Fayngersh, R.P., Wolin, M.S. Oxygenelicited responses in calf coronary arteries: Role of H,O, production via NADHderived superoxide. Am. J. Physiol. 27O:H 1044-Hl 053; 1996.

273.

Mohazzab-9, K.M., Kaminski, P.M., Wolir;, M.S. Lactate and PO, modulate
superoxide anion production in bovine cardiac myocytes. Potential role of
NADH-oxidase. Circulation 96:6 14-620; 199 7.

274.

Mohazzab-H, K.M., Kaminski, P.M., Wolin, M.S. NADH oxidoreductase is a

major source of superoxide anion in bovine coronary artery endothelium. Am.
J. Physiol. 266:H2568-H2572; 1994.

275.

Moncada, S., Palmer, R.M.J., Higgs, E.A.

Nitric oxide:
Physiology,
pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43: 109-142; 199 1 .

276.

Morishita, R., Gibbons, G.H., Kaneda, Y., Ogihara, T., Dzau, V.J.
Pharmacokinetics of antisense oligodeoxyribonucleotides (cyclin BI and CDC
2 kinase) in the vesse1 wall in vivo: Enhanced therapeutic utility for restenosis
by HVJ-liposome delivery. Gene 149: 13-19; 1994.

277.

Morita, K., Ihnken, K., Buckberg, GD., Young, H.H.

Studies of
hypoxernic/reoxygenation injury: Without aoflic clamping. VI 1. Counteraction
of oxidant damage by exogenous antioxidants: Coenzyme Q,,. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 110: 1221-1 227; 1995.

27 8.

Moro, M.A., Darley-Usrnar, V.M., Goodwin, D.A., Read, N.G., Zamora-Pino,

R., Feelisch, M., Radornski, M.W., Moncada, S. Paradoxical fate and
biologieal action of peioxynitrite on human platelets. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:6702-6706; 1994.

279.

Murry, C.E., Jennings, R B . Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A

delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 74: 1124- 1 136 ;
1986.

280.

Myers, P.R., Minor, R.L., Guena, R., Bates, J.N., Harrison, D.G. Vasorelaxant

properties of the endothelium-derived relaxing factor more closely resernble Snitrosocysteine than nitric oxide. Nature 345: 16 1- 1 6 3; 1 990.
Myers, C.L., Weiss, S.J., Kirsh, M.M., Shlafer, M. Involvement of hydrogen
peroxide and hydroxyl radical in the "oxygen paradox": Reduction of creatine
kinase release by catalase, allopurinol or deferoxamine, but not superoxide
dismutase. J. Mol. Cell. Cardiol. 17:675-684; 1985.
Nakanishi, K., Vinten-Johansen, J., Lefer, D.J., Zhao, Z., Fowler III, W.C.,
McGee, D.S., Johnston, W.E. lntracoronary L-arginine during reperfusion
improves endothelial function and reduces infarct size. Am. J. Physiol.
263:H 1650-H1658; 1 992.
Nakazawa, H., Ichimoro, K., Shinozaki, Y., Okino, H., Hori, S. 1s superoxide
demonstration by electron-spin resonance spectroscopy really superoxide? Am.
J. Physiol. 255:H 13-H215; 1988.
Naseem, S.A., Kontos, M.C., Rap, P.S., Jesse, R.L., Hess, M.L., Kukreja, R.C.
Sustained inhibition of nitric oxide by NG-nitro-L-arginineirnproves myocardial
function following ischemia/reperfusion in isolated perfused rat heart. J. Mol.
Cell. Cardiol. 27:419-426; 1995.
Nataf, P., Pavie, A., Bracamontes, L., Bors, V., Cabrol, C., Gandjbakhch, 1.
Myocardial protection by blood cardioplegia and warm reperfusion in heart
transplantation. Ann. Thorac. Surg. 53:525-526; 1992.
Neely, J.R., Rovetto, M.J., Oram, J.F. Myocardial utilkation of carbohydrate
and lipids. Progr. Cardiovasc. Diseases 15:289-329: 1972.
Nichols, W.W., Mehta, J.L., Donnelly, W.H., Lawson, D., Thompson, L., ter
Riet, M. Reduction in coronary vasodilator reserve following coronary
occlusion and reperfusion in anesthetized dog: Role of endothelium-derived
relaxing factor, rnyocardial neutrophil infiltration and prostaglandins. J. Mol.
Cell. Cardiol. 20943-954; 1 988.
Ning, X-H., Ding, X., Childs, K.F., Bolling, S.F., Gallager, K.P. Flavone
improves functional recovery after ischemia in isolated reperfused rabbit
hearts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1O5:W 1-549; 1993.
Nishimura, M., Takami, H., Kaneko, M., Nakano, S., Matsuda, H., Kurosawa,
K., Inoue, T., Tagawa, K. Mechanism of mitochondrial enzyme leakage during
reoxygenation of the rat hean. Cardiovasc. Res. 27:1116-1122; 1993.
Nishino, T. The conversion of xanthine dehydrogenase t o xanthine oxidase
and the tole of the enzyme in reperfusion injury. 3. Biochem. 116: 1 -6; 1 994.

Node, K., Kitakaze, M., Kosaka, H., Komamura, K., Minamino, T.. Tada, M.,
Inoue, M., Hori, M., Kamada, T. Plasma nitric oxide end products are
increased in the ischernic canine heart. Biochem. Biophys. Res. Com.
211:370-374; 1995.
Nohl, H. A novei superoxide radical generator in heart mitochondria. FEBS
letters 214:269-273; 1987.
Obadia, J.F., Baouali, AB., Maupoil, V., Rochette, L. Crystalloid versus cold
blood cardioplegia in patients operated for myocardiai revasculariation. J.
Cardiovasc. Surg. 37:45-51; 1996.
Ohashi, T., Yamamoto, F., Yamamoto, H., Ichikawa, H., Shibata, T.,
Kawashima, Y. Transient reperfusion with acidic solution affects postischemic
functional recovery: Studies in the isolated working rat heart. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 111:6 13-620; 1996.
Omar, H.A., Mohazzab-H., K.M., Mortelliti, M.P., Wolin, M.S. O,-dependent
modulation of calf pulmonary anery tone by lactate: Potential role of H,O, and
cGMP. Am. J. Physiol. 264:Ll4l-LI 45; 1993.
Onodera, T., Ashraf, M. Detection of hydroxyl radicais in the post-ischemic
reperfused heart using salicylate as a trapping agent. J. Mol. Cell. Cardiol.
23:365-370; 1991.
Opie, L.H.

Proposed role of calcium in reperfusion injury. Int. J. Cardiol.

23:159-164; 1989.
Opie, L.H., Coetzee, W.A. Role of calcium ions in reperfusion arrhythmias:
Relevance to pharrnacologic intervention. Cardiovasc. Drugs Therapy 2:623636; 1988.
Owen, P., du Toit, E.F., Opie, L.H. The optimal glucose concentration for
intermittent cardioplegia in isolated rat hean when added t o St. Thomas'
Hospital cardioplegic solution. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1O5:995- 1006;
1993.

Oz, M.C., Pinsky, D.J., Koga, S., Liao, H., Marboe, C.C., Han, D., Kline, R.,
Jeevanandam, V., Williams, M., Morales, A., Popilskis, S., Nowygrod, R.,
Stern, D.M., Rose, E.A., Michler, R.E. Novel preservation solution permits 24hour preservation in rat and baboon cardiac transplantation. Circulation
88:291-297; 1993.
Pace-Asciak, C.R., Hahn, S., Diamandis, E.P., Soleas, G., Golberg, D.M. f he
red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet

aggregation and eicosanoid synthesis: Implication for protection against

coronary heart disease. Clin. Chimica Acta 235:207-219; 1995.

302. Palmer, R.M.J. , Ferrige, A.G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for
the biological activity of endothelium-derivedrelaxing factor. Nature 327524526; 1987.
303.

Pearl, 3-M., Hiramoto, J., Laks, H., Drinkwater, D.C., Chang, P.A. Fumarateenriched blood cardioplegia results in cornplete functional recovery of
immature myocardium. Ann. Thorac. Surg. 57: 1636-1 641 ; 1994.

304.

Philipson, K.D., Bersohn, M.M., Nishimoto, A.Y. Effectsof p H o n Na+-Ca2+

exchange in canine cardiac sarcolemmal vesicules. Circ. Res. 501287-293;
1982.

305.

Pietri, S., Culcasi, M,, Albat, B., Albrici, G., Menasch, P. Direct assessment
of the antioxidant effects of a new heart preservation solution, Celsior. A
hemodynamic and electron spin resonance study. Transplantation 58:739-742;
1994-

306.

Pietri, S., Culcasi, M., Stella, L., Cozzone, P.J. Ascorbyl free radical as a
reliable indicator of free-radical-mediated myocardial ischemic and postischemic injury. A real-time continuous-flow SR study. Eur. J. Biochem.
193:845-854; 1990.

307.

Pijl, A.J.. Pfaffendorf, M., Mathy, M-J., van Zwieten, P.A. Cardioprotection
by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three
different types of experirnental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21:70-76;
1993.

308.

Pisarenko, .O .l. Mechanisms of myocardial protection by amino acids: Facts

and hypotheses. Clin. Experim. Pharmacol. Physiol, 23:627-633; 1996.

309. Pisatenko, O.I., Lakomkin, V.L., Studneva, I.M., Timoshin, A.A., Kuzmin, A.I.,
Ruuge, E.K., Kapelko, V.I. Allopurinol-enhanced postischemic recovery in the
isolated rat heart involves repletion of high-energy phosphates. Biochem. Med.
Metabol. Biol. 51:1 6-26; 1994.

3 10.

Pisarenko, O.I., Poftnoy, V.F., Studneva, I.M., Arapov, A.D., Korostyley, A.N.
Glutamate-blood cardioplegia improves ATP preservation in human
myocardium. Biomed. Biochim. Acta 46:499-504; 1987.

31 1. Pisarenko, 0.1.. Rosenfelt, EL., Langley, L., Convers, R.A.J., Richards, S.M.
Differing protection with aspartate and glutamate cardioplegia in the isolated
rat heart. Ann. Thorac. Surg. 59: 1541-1 548; 1995.

Pisarenko, O.I., Shulzhenko, V.S., Studneva, LM., Kapelko, V.I. Effects of

gradua1 reperfusion on postischemic metabolism and functional recovery of
isolated guinea pig heart. Biochem. Med. Metabol. Biol. 50:127-134;1993.
Podesser, B., Wollenek, G., Windischbauer, A., Zegner, M., Hausleithner, V.,
Seitelberger, R., Losert, U., Wolner, E.
Myocardial protection with
Bretschneider cardioplegic solution-an evaluation of full oxygenation. Eur.
Surg. Res. 26: 133- 140; 1 994.
Poole-Wilson, P.A., Harding, D.P., Bourdillon, P.D.V., Tones, M.A. Calcium
out of control. J. Mol. Cell. Cardiol. 16: 1 75-187; 1 984.
Pou, S., Hassett, D.J., Britigan, B.E., Cohen, M.S., Rosen, G.M. Problems
associated with spin trapping oxygen-centered free radicals in biological
systems. Ana!. Biochem. 177:l-6;1989.
Powell, S.R., Wapnir, R.A. Adventitious redox-active metals in KrebsHenseleit buffer can contribute to Langendorff heart experimental results. J.
Mol. Cell. Cardiol. 26:769-778;1994.
Prasad, M.R.,Liu, X., Rousou, J.A., Engelman, R-M-,Jones, ZR*, George, A.,
Das, D.K.
Reduced free radical generation during reperfusion of
hypotherrnically arrested hearts. Mol. Cell. Biochem. 111:97- 1 02;1 992.
Pr, J. La lipoperoxydation. Path. Biol. 39:7 16-736;1 991 .
Prichard, B. N. Beta-blockage therapy and cardiovascular disease.
present, and future. Postgraduate Medicine. Spec No:8-18; 1988.

Past,

Pryor, W.A., Squadrito, G.L. The chemistry of peroxynitrite: A product from

the reaction of nitric oxide with superoxide. Am. J. Physiol. 268: L69SL722;
1995.
Przyklenk, K. Oxygen-derived free radicals and "stunned myocardium". Free
Radic. Biol. Med. 4:39-44; 1988.
Przyklenk, K., Kloner, R A . "Reperfusion injury" by oxygen-derived free
radical? Circ. Res. 64:86-96; 1989.
Qiu, Y., Bernier, M., Hearse, D.J. The influence of N-acetylcysteine on cardiac
function and rhythm disorders during ischemia and reperfusion. Cardioscience
1:65-74; 1990.
Qiu, Y., Galinanes, M., Haddock, P.S. Hearse, J. Continuous warm versus
intermittent cold cardioplegic infusion: A cornparison of energy metabolisrn,

sodium-potassium adenosine triphosphate activity and postischemic f unctional

recovery in the blood-perfused rat heart. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
112:797-805; 1996.
Quayle, LM., Nelson, M.T., Standen, N.B. ATP-sensitive and inwardly
rectifying potassium channels in smooth muscle. Physiol. Rev. 77: 1 1651232; 1997.
Racey-Burns, L.A., Burns, A.H., Summer, W.R., Shepherd, R.E. The effect of
dichloroacetate on the isolated no flow arrested rat heart. Life Sciences
44:2015-2023; 1989.
Radi, R., Cosgrove, T.P., Beckman, J.S., Freeman, B.A. Peroxynitrite-induced
luminol cherniluminescence. Biochem. J. 290:s 1-57; 1993.
Radi, R., Beckman, J.S., Bush, K-M., Freeman, B.A. Peroxynitrite oxidation
of sulphydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. J. Bol.
Chem. 266:4244-4250; 199 1 .
Raschke, P., Massoudy, P., Becker, B.F. Taurine protects the heart from
neutrophil-induced reperfusion injury. Free Radic. Biol. Med. 19:461-471;
1995.
Rector, T.S., Bank, A.J., Mullen, K.A., Tschumperlin, L.K., Sih, R., Pillai, K.,
K u ~ o , S.H.
Randomized, double-blind, placebo-controlled study of
supplemental oral L-arginine in patients with heart failure.
Circulation

93:2135-2141; 1996.
Reed 0 . 3 . Glutathione: Toxicological implications. Ann. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 30:603-631; 1990.
Reed, M.K., Barak, C., Malloy, C R , Maniscalco, S.P., Jessen, M.E. Effects
of glutamate and aspartate on myocardial substrate oxidation during potassium
arrest. J. Thotac. Cardiovasc. Surg. 112: 165 1-1 660; 1996.
Reichenspurner, H., Russ, C., berfuhr, P., Nollert. G., Schlter, A., Reichart,
B., Klovekorr, W.P., Schler, S., Hetzer, R., Brett, W., Posival, M., Korner,
M.M.. Korfer. R. Myocardial preservation using HTK solution for heart
transplantation. A multicenter study. Eur. J. Cardia-Thorac. Surg. 7:414-419;
1993.
Reilly, P.M., Schiller, H.J., Buckley, G.B. Pharmacologie approach to tissue
injury mediated by free radicals and other reactive oxygen metabolites. Am.
J. Surg. 161:488-503; t 99 1 .

Reimer, K.A., Murry. C.E.. Richard, V.J. The role of neutrophils and free
radicais in the ischemic-reperfused heart: Why the confusion and controversy.
J. Mol. Cell. Cardiol. 21:1 225-1 239; 1 989.
Rice-Evans, C.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy. Free
Radic. Biol. Med. 1577-96; 1993.
Rigobello. M.F.. Bindoli, A. Effect of pyruvate on rat heart tniol status during
ischemia and hypoxia followed by reperfusion. Mol. Cell. Biochem. l Z 2 : W 100; 1993.
Robertson R.M.. R0bertson.D. Chapitre 32: Drugs used for the treatment of
myocardial ischemia. ~ 7 5 9 - 7 7 7 .The pharmacological basis of therapeutics,
Ninth ed. Goodman & Gilman 1996. McGraw-Hill (Maison d'dition). Montreal.
Robinson, L.A., Schwarz, G.D.. Goddard. 0.0.. Fleming. W.H., Galbraith. T.A.
Myocardial protection for acquired heart disease surgery: Resuits of a national
survey. Ann. Thorac. Surg. 59:361-372; 1995.
Rojas, C., Cdenas. S.. Lapez-Torres, M.. Perez-Campo, R., Barja. G. lncrease
in heart glutathione redox ratio and total antioxidant capacity and decrease in
lipid peroxidation after vitamin E dietary supplernentation in guinea pigs. Free
Radic. Biol. Med. 21:907-915; 1996.
Rose. R.C., Bode, A.M. Biology of free radical scavengers: An evaluation of
ascorbate. FASEB J. 7: 1 135-1 142; 1993.
Rosenkranz, E.R.,
Buckberg. G.D. Myocardial protection during surgical
coronary reperfusion. J. Am. Coll. Cardiol. 1:1235-1246; 1983.
Rosenkranz. E R , Okamoto, F.. Buckberg. GD., Robertson, J.M.. VintenJohansen, J.. Bugyi, H.I. Safety of prolongad aoRic clamping with blood
cardioplegia. III. Aspartate enrichment of glutamate-blood cardioplegia in
energy-depleted hearts after ischemic and reperfusion injury. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 91:428-435; f 986.
Rosenkranz, E.R.
Substrate enhancernent of cardioplegic solution:
Experimental studies and clinical evaluation. Ann. Thorac. Surg. 60:7 9 7-800;
1995.
Roth, E., Matos. G.. Guarnieri, C., Papp, B., Varga, J. Influence of the betablocker therapy on neutrophil superoxide generation and platelet aggregation
i n experimental myocardial ischemia and refiow. Acta Physiol. Hungarica
83:f 63-1 70; 1995.

181

346.

Rousou, J.A., Engelman, R.M., Anisirnowicz, L., Lemeshow, S., Dobbs, W.A.,
Breyer, R.H., Das, D.K. Metabolic enhancement of myocardial preservation
during cardioplegic arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 91:270-276; 1 986.

346a. Rousou, J.H., Dobbs, W.A., Meeran, M.K., Engelman, R.M. The temperature
dependence of recovery of metabolic function following hypothermie
potassium cardioplegic arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 83: 1 17-12 1;
1982.
Rowe, G.T., Manson. N.H., Caplan. M., Hess, M.L. Hydrogen peroxide and
hydroxyl radical mediation of activated leucocyte depression of cardiac
sarcoplasmic reticulum: Participation of the cyclooxygenase pathway.
Circulation Res. S3:584-591 ; 1983.

Rowland, R.T., Cleveland, J.C. Jr., Meng, X., Harken, A.H., Brown, J.M.
Potential gene therapy strategies in the treatrnent of cardiovascular diseases.
Ann. Thorac. Surg. 60:721-728; 1995.
Rubanyi, G.M. Vascular effects of oxygen-derived free radicals. Free Radic.
Biol. Med. 4: 107-120; 1988,
Rubanyi, G.M., Ho, E.H., Cantor, EH., Lumma, W.C., Parker Botelho, L.H.
Cytoprotective function of nitric oxide: Inactivation of superoxide radicals
produced by human leukocytes. Biochem. Biophys. Res. Corn. 181:1392-

1397; 1991.
Rubbo, H., Darley-Usmar, V., Freeman, B.A. Nitric oxide regulation of tissue
free radical injury. Chern. Res. Toxicol. 9:809-820; 1996.
Russell, J., Spickett. CM.,Reglinski, J., Smith, W.E., McMurry, J., Abdullah,
1.0. Alteration of the erythrocyte glutathione redox balance by Nacetylcysteine. captopril and the exogenous glutathione. FEBS Letters
347:215-220; 1994.
Ruuge, E.K., Ledenev, A.N., Lakomkin, V.L., Konstantinov, A. A., Ksenzenko,
M.Y. Free radical metabolites in myocardium during ischemia and reperfusion.
Am. J. Physiol. 261:81-86; 1991.
Saeki, A., Recchia, F.A., Senzaki, H., Kass, D.A. Minimal role of nitric oxide
in basal coronary flow regulation and cardiac energetics of blood-perfused
isolated canine heart. J. Physiol. 491:455-463; 1996.
Sala, R., Moriggi, E., Corvasce, G., Morelli, D. Protection by N-acetylcysteine
against pulrnonary endothelial cell damage induced by oxidant injury. Eut.
Respir. J. 6:440-446; 1993.

356. Samaha, F.F., Heineman, F.W., Ince, C., Fleming, J., Balaban, R.S.

ATPsensitive potassium channel is essential t o maintain basal coronary vascular

tone in vivo. Am. J. Physiol. 262:C1220-Cl227; 1992.

357.

Sargent, C.A., Sleph, P.G., Dzwonczyk, S., Smith, M.A., Normandin, D.,
Antonaccio, M.J., Grover, G.J. Cardioprotection in ischemic rat hearts with
the SH-containing angiotensin-converting enzyme inhibitor zofenopril: Possible
involvement of the ATP-sensitive potassium channel. J. Pharmacol. Exp.
Therap. 265:609-6 1 7; 1 993.

358.

Sawatari, K. J Kadoba, K.; Bergner, K.A.; Mayer, J.E. Influence of initial

reperfusion pressure. Thorac. Cardiovasc. Surg. 101:777-782;1 99 1 .

359.

Schaefer, S., Prussel, E., Carr, L.J. Requirement of glycolflic substrate for
metabolic recovery during moderate low flow ischemia. J. Mol. Ceil. Cardiol.
27:2167-2176;1995.

360.

Schrammel, A., Behrends, S., Schmidt, K., Koesling, D., Mayer, B.

Characterization of 1 H-t 1,2,4loxadiatolo~4,3-alquinoxalin-1
-one as a heme-site
inhibitor of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Molec. Pharmacol. 50: 1 -5;
1996.

361.

Schulz, R., Wambolt, R. Inhibition of nitric oxide synthesis protects the

isolated working rabbit heart from ischaemia-reperfusion injury. Cardiovasc.
Res. 30~432-439;1995.

362.

Seccombe, J.F., Schaff, H.V. Coronary artery endothelial function after

myocardial ischemia and reperfusion. Ann. Thorac. Surg. 60:778-788; 1995.

363.

Segel, L.D., Folette, D.M., Contino, J.P., Iguidbashian, J.P., Castellanos, L.M.,
Berkoff, H.A. Importance of substrate enhancernent for long term heart
preservation. J. Heart Lung Transplant l2:61 3-623; 1 993.

364.

Sellin, L.C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.

Pharmacol. Toxicol. 74:305-3 13; 1 994.

365.

Shekher, A., Singh, M. Role of eicosanoid inhibition in ischernia reperfusion

injury: Intact and isolated rat heart studies. Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol.

l9:223-229;1997.
366.

Shug, A L , Madsen, D.C. Proteaion of the ischemic rat heart by procysteine

and arnino acids. J. Nutr. Biochem. 5:356-359; 1 994.

367.

Shug, A.L., Madsen. D., Dobbie, A., Paulson, D.J. Protection o f mitochondrial
and heart function by amino acids after ischemia and cardioplegia. Life Sci.

Siegmund, B., Klietz, T., Schwartz, P., Piper, H.M. Temporary contractile
blockade prevents hypercontracture in anoxic-reoxygenated cardiornyocytes.
Am. J. Physiol. 260:H426-H435; 199 1.
Sies, H. Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem. 215 9 1 3-21 9;
1993.
Singat, P.K., Beamish, R.E., Dhalla, N.S. Potential oxidative pathways of
catecholamines in the formation of lipid peroxides and genesis of hean
disease. Adv. Exp. Med. Biol. 161:39 1-40 1; 1983.
Singh, A., Lee, K.J., Lee, C.Y., Goldfarb, RD., Tsan, M-F. Relation between
myocardial glutathione content and extent of ischemia-reperfusion injury.
Circulation 80: 1795-1 804; 1989.
Skjelbakken, T., Valen, G,. Vaage, J. Perfusing isolated rat hearts with
hydrogen peroxide: An experimental mode1 of cardiac dysfunction caused by
reactive oxygen species. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 56:431-439; 1996.
Smith, LX., Eisensrnith, R.C., Woo, S.L. Gens therapy in heart disease. Adv.
Exp. Med. Biol. 369:79-88; 1995.
Smith, M.P., Humphrey, S.J., Kerr, S.W., Mathews, W.R.
In vitro
vasorelaxant and in vivo cardiovascular effects of S-nitrosothiois: Cornparison
to and cross tolerance with standard nitrovasodilators. Meth. find. Exp. Clin.
Pharmacol. 16:323-335; 1994.
Snaith, C.D., Wright, G., Lofkin, M. The effects of aspartate and 2oxoglutarate upon glycolytic energy metabolites and mechanical recovery
following global ischaemia in isolated rat hearts. J. Mol. Cell. Cardiol. 24:305315; 1992.
Sochman, J., Kolc, J., Vrana, M., Fabian, J. Cardioprotective effects of Nacetylcysteine: The reduction in the extent of infarction and occurence of
reperfusion arrhythmias in the dog. Int. J. Cardiol. 28: 1 91-196; 1990.
Sochman, J., Peregrin, J.H. Total recovery of left ventricular function after
acute myocardial infarction: Comprehensive therapy with streptokinase, Nacetyicysteine and percutaneous translurninal coronary angioplasty. Int. J.
Cardiol. 35:116-118; 1992.
Sochman, J., Vrbska, J., Musilova, B., Rocek, M. lnfarct size limitation:
Acute N-acetylcysteine defense (ISLAND) trial. Start of the study. Int. J.

Cardiol. 49: 181-1 82; 1995.

Southard, J.H., Belzer, F.O. Organ preservation. Annu. Rev. Med. 46:235247; 1995.
Stacpoole, P.W. The pharmacology of dichloroacetate. Metabolism 38: 1 1241144; 1989.
Statistics Canada. Heart disease and stroke in Canada. Ottawa, june 1997.
Ste-Marie, L., Boismenu, D., Vachon, L ., Montgomery, J. Evaluation of
sodium 4-hydroxybenzoate as an hydroxyl radical trap using gas
chromatography-mass
spectrometry
and
high-performance
liquid
chromatography with electrochemical detection. Anal. Biochem. 241 : 67-74;
1996.
Steeves, G., Singh, N., Singal, P.K. Preconditioning and antioxidant defense
against reperfusion injury. Ann. N.Y. Acad. Sci. 723:116-127; 1994.
Stein, D.G., Drinkwater, D.C., Laks, H., Permut, L.C., Sangwan, S., Chait,
H.I., Child, J*S*, Bhuta, S. Cardiac preservation in patients undergoing
transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1O2:6 5 7-665; 1 99 1 .
Stephens, N. Anti-oxidant therapy for ischaernic hean disease: Where do we
stand? Lancet 349: 1 7 10-17 1 1; 1997.
Stewart, J.R., Frist, W.H ., Merrill, W.H. Oxygen scavengers in myocardial
preservation during transplantation. Methods in Enzymology 186:742-748;
990.
Stringham. J-C., Paulsen, K.L., Southard, J.H., Fields, B.L., Belzer, F.O.
improved myocardial ischemic tolerance by contractile inhibition with 2,3butanedione rnonoxime. Ann. Thorac. Surg. 54:852-860; 1992.
Stringham, J.C., Paulsen, K.L., Southard, J.H., Mentzer, R.M., Belzer, F.O.
Prolonging rnyocardial preservation with a modified University of Wisconsin
solution containing 2,3-butanedione monoxime and calcium. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 107:764-775; 1994.
Sultan, I., Sunamori, M., Suzuki, A. Heart preservation: Analysis of
cardioprotective infusate characteristics. Membrane stabilization, calcium
antagonism, and protease inhibition on myocardial viability: A biochemical,
ultrastructural, functional study. J. Heart Lung Transpl. 11:607-618; 1992.

390.

Suzuki, Y .Je, Edmondson, J.D.,

Ford, G.D.

Inactivation of rabbit muscle

creatine kinase by hydrogen peroxide. Free Radic. Res. Com. 16: 13 1 - 1 36;
1992.
Svedjeholm, R., Ekroth, R., Joachimsson, P.O., Ronquist, G., Svensson, S.,
Tyden, H. Myocardial uptake of amino acids and other substrates in relation
to myocardial oxygen consumption four hours after cardiac operations. J.
Thorac. Cardiovasc. Surg. 101:688-694; 199 1.
Svedjeholm, R., tiakanson, E., Vanhanen, 1. Rationale for metabolic support
with amino acids and glucose-insulin-potassium (GIKI in cardiac surgery. Ann.
Thorac. Surg. 59:S15-22; 1995.
Swanson, D.K., Myerowitt, P.D., Watson, K., Banaszak, S.A., Lasser, T.A.
Effect of reperfusion temperature and pressure on the functional and metabolic
racovery of preserved hearts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86:242-25 1 ; 1983.
Taegtmeyer, H., Goodwin, G.W., Doenst, T., Frazier, O.H. Substrate
metabolism as a determinant for postischemic functional recovery of the heart.
Am. J. Cardiol. 80;3A-10A; 1997.
Takahashi, A., Braimbridge, M.V., Hearse, D.J., Chambers, D.J. Long-term
preservation of the mammalian myocardium. Effect of storage medium and
temperature on the vulnerability t o tissue injury. J. Thorac. Cardiovasc. Surg.
102:235-245; 1991.
Takayanagi, R., Takeshige, K., Minakami, S. NADH- and NADPH-dependent
lipid peroxidation in bovine heart submitochondrial particules. Biochem. J.
l92:85 3-860;1 980.
Takemura, G., Onodera, T., Ashraf, M. Quantification of hydroxyl radical and
its lack of relevance to myocardial injury during early reperfusion after graded
ischemia in rat heart. Circulation Res. 71:96-105; 1992.
Takemura, G., Onodera, T ., Millard, R.W., Ashraf, M. Demonstration of
hydroxyl radical and its role in hydrogen peroxide-induced myocardial injury:
Hydroxyl radical dependent and independent mechanisms. Free Radic. Biol.
Med. 15: 13-25; 1993.
Takeo, S., Liu, J-X., Tanonaka, K., Nasa, Y., Yabe, K., Tanahashi, H., Sudo,
H. Reperfusion at reduced ftow rates enhances postischemic contractile
recovery of perfused heart. Am. J. Physiol. 268:H2384-H2395; 1995.
Takeuchi, K., McGowan, F.X., Danh, H-C., Glynn, P., Simplaceanu, E., del
Nido, P.J. Direct detrimental effects of L-arginine upon ischernia-reperfusion
injury to myocardium. J. Mol. Cefi. Cardiol. 27: 1 405-14 14; 1 995.

Tang, L.D., Sun, J-2. Wu, K., Sun, C-P. Tang. 2-M. Beneficial effects of Nacetylcysteine and cysteine in stunned myocardium in perfused rat heart. Br.
J. Pharmaco1.102:601-606; 1991.
Tanonaka, K., Kamiyama, T., Takezono, A., Sakai, K., Takeo, S. Beneficial
effects of angiotensin 1 converting enzyme inhibitor on post-ischemic
contractile function of perfused rat heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 28: 1 6591670; 1996.
Tardif. J-C., Ct, G., Lesprance, J., Bourassa, M., Lambert, J., Doucet, S.,
Bilodeau, L., Nattel, S., de Guise, P. Probucol and multivitamins in the
prevention of restenosis after coronary angioplasty. New Engl. J. Med.
337:365-372; 1997.
Taylor, A-L., Golino, P., Eckels, R-, Pastor, P., Buja, L.M., Willerson, J.T.
Differential enhancement of postischemic segmental systolic thickening by
diltiazem. J. Am. Coll. Cardiol. 15:737-747; 1990.
Teboul, J., Doustaly, C., Monnot, F., Sanchez, B., Popoff, G. Kreitmann, P.
Protection et reperfusion du myocarde par cardioplgie au sang enrichie en
aspartate et glutamate. Technique et rhultats prliminaires. Ann. Chir.
44:615-623; 1990.
Tesfamariam, B., Cohen, R A . Role of superoxide anion and endothelium in
vasoconstrictor action of prostaglandin endoperoxide. Am. J. Physiol.
262:HlgfS-H1919; 1992.
Thaulow, E., Dale,
Myhre, E. Effects of a selective thromboxane
synthetase inhibitor, dazoxiben, and of acetylsalicylic acid on myocardial
ischemia in patients with coronary artery disease. Am. J. Cardiol. 53: 1 2551258; 1984.
J e t

Thoenes, M., Forstermann, U., Tracey, W.R., Bleese, N.M., Nssler, A.K.,
Scholz, H., Stein, B. Expression of inductible nitric oxide synthase in failing
and non-fading human heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 28: 165- 169; 1996.
Thomassen, A.R. Myocatdial uptake and effects of glutamate during nonischaemic and ischaemic conditions. Danish Med. Bulletin 39:47 1-488; 199 2.
Thompson-Gorman, S.L., Zweier, J.L. Evaluation of the role of xanthine
oxidase in the myocaidial reperfusion injury. J. Biol. Chem. 265:6656-6663;
1990.
Tosaki, A, Bagchi, D., Pali, T., Cordis, G A . , Das, D.K. Cornparisons of ESR
and HPLC methods for the detection of .OH radicals in ischernic/reperfused

hearts. A relation between the genesis of free radicals and reperfusion

arrhythmias. Biochem. Pharmacol. 45:96 1-969; 1993.
Tosaki, A., Das, D.K. Cardiovascular controversies. Reperfusion induced
arrhythmias are caused by generation of free radicals. Cardiovasc. Res.
28:422; 1994.
Tosaki. A. DMPO and reperfusion injury: Arrhythmia, heart function, electron
spin resonance, and nuclear magnetic resonance studies in isolated working
guinea pig hearts. Am. Heart J. 120:819-830; 1990.
Toshima, Y., Kohno, H., Matsuzaki, K., Mitani, A., Mayumi, H., Yasui, H.,
Tokunaga, K. Collin's solution for cold storage of the heart for transplantation
must be reversed with cardioplegic solution before reperfusion. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 104:1572-1581; 1992.
Toshima, Y., Matsuzaki, K., Mitani, A., Kohno, H., Mayumi, H., Yasui, H.,
Tokunaga, K. The myocardial recovery mode after cold storage for
transplantation with Collin's solution and cardioplegic solution. A functional
and metabolic study in the rat heart. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:13201328; 1992.
Tricarico, D., Conte Camerino, D. ATP-sensitive K + channels of skeletal
muscle fibers frorn young adult and aged rats: Possible involvement of thioldependent redox mechanisms in the age-related modifications of their
biophysical and pharmacological properties. Molec. Pharmacol. 46954-76 1 ;
1994.
Tsao, PS., Aoki, N., Lefer, D.J., Johnson, G., Lefer, A.M. Time course of
endothelial dysfunction and myocardial injury during myocardial ischemia and
reperfusion in the cat. Circulation 82: 1402-141 2; 1990.
Tsunoda, R., Okumura, K., Ishizaka, H., Matsunaga, T., Tabuchi, T ., Tayama,
S., Yasue, H.
Enhancement of myocardial reactive hyperernia with
manganese-superoxide dismutase: Role of endothelium-derived nitric oxide.
Cardiovasc. Res. 31:537-545; 1995.
Urban, Th., Hurbain, I., Urban, M., Clbrnent, A., Housset, 0. Oxydants et
antioxydants. Effets biologiques et perspectives thdrapeutiques. Ann. Chir.
49: 427-434; 1995.
Valen, G., Vaage J. The effect of exogenous adenosine on functional injury
caused by hydrogen peroxide in the isolated rat hearc. Free Rad. Res. 24:3138; 1996.

Vandenberg, J.I., Metcalfe, J.C., Grace, A.A. Mechanisms of pHi recovery

aher global ischemia in the perfused heart. Circ. Res. 72:993-1003; 1993.
Vandeplassche, G., Thon, F.. Borgers, M. Cytochemical evidence of NADHoxidase activity in the isolated working rabbit heart subjected t o normothermic
global ischemia. Histochem. J. 22: 1 1-17; 1990.
van der Vusse, G.J., Glatz, J.F.C., Stam, H.C.G., Reneman, R S . Fatty acid
homeostasis in the normoxic and ischemic heart. Physiol. Rev. 72:88 1-940;
1992.
van Jaarsveld, H., Kuyl, J.M., Alberts, D.W., Wiid, M.N. Antioxidant
supplementation partially protects against myocardial mitochondrial ischemiareperfusion injury, but ascorbate in the perfusate prevented the beneficial
effect. Res. Comm. Molec. Pathol. Pharmacol. 85:33-44; 1994.
van Jaarsveld, H., Kuyl, J.M., Schulenburg, D.H., Wiid, N.M. Effect of
flavanoids on the outcome of myocardial mitochondrial ischemia/reperfusion
injury. Res. Comm. Molec. Pathol. Pharmacol. 91:65-75; 1996.
Vanoverschelde, J-L., Depr, C., Wijns, W.. Bol, A., Dion, R., Gerber, B.,
Borgers, M., Melin, J. Physiopathologie de l'hibernation myocardique
Apports de la tomographie par mission de positrons.
chronique:
MBdecinelSciences 11:13 15-1322; 1995.
Vanoverschelde, J-L. J., Janier, M.F.,Bakke, J.E., Mershall, D.R., Bergman,
S.R. Rate of glycolysis during ischemia determines extent of ischemic injury
and functional recovery after reperfusion. Am. J. Physiol. 267:H 1785-H 1794;
1994.
Vercillo, A.P., Squier, R.C+,Chawla, S., Houser, S., Hashmi, F., Becker, D.R.
Procaine versus magnesium in cardioplegia solution. A prospective study.
Connecticut Medicine 51:74-76; 1987.
Villa, L.M., Salas, E., Darley-Usmar, V.M., Radornski, M.W*, Moncada, S.
Peroxynitrite induces both vasodilatation and impaired vascular relaxation in
the isolated perfused rat heart. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:12383-12387;
1994.
von Oppell, U.O., King, L.M., Du Toit, E.F., Owen, P., Reichart, B., Opie, L.H.
Effect of pH shifts induced by oxygenating crystalloid cardioplegic solutions.
Ann. Thorac. Surg. 52:903-907; 1991.

von Oppell, U.O., Pfeiffer, S., Preiss, P., Dunne, T., Zilla, P., Reichart, B.
Endothelial cell toxicity of solid-organ presewation solutions. Ann. Thorac.

Surg. 50:902-9 10; 1990.

Wahr, J.A., Olszanski, D., Childs, K.F., Bolling, S.F. Dichloroacetate enhanced
myocardial functional recovery post-ischemia: ATP and NADH recovery. J.
Surg. Res. 63:220-224; 1996.
Wajner, M., Harkness, R A . Distribution of xanthine dehydrogenase and
oxidase activities in human and rabbit tissues. Biochim. Biophys. Acta 991:7984; 1989.
Walker, M.J.A., Curtis, M.J., Hearse, D.J., Campbell, R.W.F., Janse, M.J.,
Yellon, D.M., Cobbe, S.M., Coker, S.J., Harness, J.B., Harron, D.W.G.,
Higgins, A.J., Julian, D.G., Lab, M.J., Manning, A.S., Northover, B.J.1 Parratt,
J.R., Riemersrna, R A . , Riva, E., Russell, D.C., Sheridan, D.J., Winslow, E.,
Woodward, B. The Lambeth Conventions: Guidelines for the study of
arrhythmias in ischaemia, infarction, and reperfusion. Cardiovasc. Res.
221447-455;
1988.
Wang, P., Zweier, J.L. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite
generation in the postischernic heart. J. Biol. Chem. 271:29223-29230;

1996.
Wang, Q-D., Morcos. E., Wiklund, P., Pernow, J. L-arginine enhances
functional recovery and Ca2+-dependent nitric oxide synthase activity after
ischemia and reperfusion in the rat hean. J. Cardiovasc. Pharmacol. 29: 29 1296; 1997.
Warner, T.D., Schmidt, H.H., Murad, F. Interactions of endothelins and EDRF
in bovine native endothelial cells: Selective effects of endothelin-3. Am. 3.
Physiol. 262:H1600-H1605; 1992.
Watkins, M.W., Slinker, B. K., Goto, Y., LeWinter, M.M. 2,3-Butanedione
monoxirne increases contractile efficiency in the rabbit ventricle. Am. J.
Physiol. 263:H 181 1- H l 818; 1992.
Weik, R., Neumcke, B. ATP-sensitive potassium channels in adult mouse
skeletal muscle: Characterization of the ATP-binding site. J. Membrane Biol.
110:217-226; 1989.
Weldner, P.W., Myers, J.L., Miller, C.A., Arenas, J.D., Waldhausen, J.A.
lmproved recovery of immature myocardium with L-glutamate blood
cardioplegia. Ann. Thorac. Surg. 55: 102-105; 1993.
Werns, S.W., Shea, M.J., Mitsos, S.E., Dysko, R.C., Fantone, J.C., Schork,
M.A,, Abrams, GD.,P i , B., Lucchesi, B.R. Reduction of the size of infarction

by allopurinol in the ischemic-reperfused canine heart. Circulation 7 3 5 18524; 1986.

Weyrich, A.S., Ma., X-L., Lefer, A.M. The role of L-arginine in ameliorating
reperfusion injury after myocardial ischemia in the cat. Circulation 86:279288; 1992.
Wheeldon, O.,Sharples, LI,WalIwork, J., English, T. Donor hean preservation
survey. J. Heart Lung Transplant 11:986-993; 1992.
Wicomb, W.N., Collins, G.M. 24-Hours rabbit heart storage with UW solution.
Effects of low-flow perfusion, colloid and shelf storage. Transplantation 48:69; 1989.
Wiklund, L., Mantovani, V., Nilsson, B., Nilsson, F.N., Serggren, H.E.
Temperature-dependent coronaiy reactivity after perfusion with University of
Wisconsin solution in the isolated rat heart. Transplantation 579 314-1 31 7;
1994.
William, M.W., Taft, C.S., Ramnauth, S., Z-Q., Zhao, Vinten-Johansen.
Endogenous nitric oxide (NO) protects against ischaemia-reperfusion injury in
the rabbit. Cardiovasc. Res. 30:79-86; 1995.
Woodman, O.L., Pannangpeth, P. N-nitro-L-arginine and indomethacin do not
affect endothelin-induced constriction of large ands small coronary arteries in
the anaesthetized greyhound. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:50-56;1996.
Wu, M., Pritchard, K.A., Kaminski, P.M., Fayngersh, R.P., Hintze, T.H., Wolin,
M.S. Involvement of nitric oxide and nitrosothiols in relaxation of pulmonary
arteries to peroxynitrite. Am. 3. Physiol. 266:H2 108-H21 13; 1994.
Xia, Y., Dawson, V.L., Dawson, T.M.. Snyder, S.H., Zweier, J.L. Nitric oxide
synthase generates superoxide and nitric oxide in arginine-depleted cells
leading to peroxynitrite-mediated cellular injury. Proc. Natl. Acad. Sci.
93:6770-6774; 1996.
Xia, Y., Zweier, J.L. Substrate control of free radical generation from xanthine
oxidase in the postischernic heart. J. Biol. Chem. 270: 18797- 18803; 1 995.
Yamamoto. F., Manning. AS.. Braimbridge, M.V.. Hearse, D.J. Cardioplegia
and slow calcium-channel Mockers. Studies with verapamil. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 86:252-26 1; 1983.
Yarnazaki, S.; Fujibayashi, Y.; Rajagopalan. RE.; Meerbaum, S.; Corday, E.
Effects of aaged versus sudden reperfusion after acute coronary occlusion in

the dog. J. Am. Coll. Cardiol. 7:564-572; 1986.

Yang, B.C., Mehta, J.L. Inhibition of nitric oxide does not affect reperfusioninduced myocardial injury, but it prevents lipid peroxidation in the isolated rat
heart. Life Sciences 61:229-236; 1997.
Yasmin, W., Strynadka, K.O., Schulz, R. Generation of peroxynitrite
contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts. Cardiovasc.
Res. 33:422-432; 1997.
Yau, T.M., Ikonomidis, J.S., Weisel, RD., Mickle, D.A., Hayashida, N,, Ivanov,
Which techniques of
J., Carson, S., Mohabeer, M.K., Tumiati, L.C.
cardioplegia prevent ischemia? Ann. Thorac. Surg. 56: 1 020-1028; 1 99 3.
Yeh, T., Hanan, S.A., Johnson, D E , Rebeyka, LM., Abd-Elfattah, A.S., Lee,
F., Wectrcler, A.S.
Superior rnyocardial preservation with modified UW
solution after prolonged ischemia in the rat heart. Am. Thorac. Surg. 49:932939; 1990.
Yellon, D.M., Jennings, RB., eds.
Myocardial protection.
pathophysiology of reperfusion injury. New York: Raven Press; 1992.

The

Yokoyama, H., Lingle, D.M., Crestanello, J.A., Karnelgard, J., Kott, B.R.,
Momeni, R., Millili, J., Monensen, S.A., Whitman, G.J. Coenzyme O,,
protects coronary endothelial function from ischemia reperfusion injury via an
antioxidant effect. Surgery 120:189-196; 1996.
Zhai, X., Ashraf, M. Direct detection and quantification of singlet oxygen
during ischemia and reperfusion in the rat hearts. Am. J. Physiol. 269:H1229H l 236; 1995.

Zughaib, M.E., Tang, X-L., Sun, J-2.. Bolli, R. Myocardial reperfusion injury:
Fact or myth? A 1993 appraisal of a seemingly endless controversy. Ann.
N.Y. Acad. Sci. 723:218-228; 1993.
Zweier, J.L., Broderick, R., Kuppusarny, P., Gorman-Thompson, S., L m y ,
G.A. Determination of the mechanism of free radical generation in human
aonic endothdial cells exposed t o anoxia and reoxygenation. J. Biol. Chem.
269324156-24162; 1 994.
Zweier, J.L., Flaherty, J.T., Weisfeldt, M.L. Direct measurement of free
radical generation following reperfusion of ischemic myocardium. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 84:1404-1407; 1987.

463.

Zweier, J.L.. Jacobus. W.E.

Substrate-induced alterations of high energy

phosphate metabolism and contractile function in the perfused heart. J. Biol.

Chern. 262:8O 15-8021 ; 1987.

464.

Zweier, J.L., Kuppusamy, P., L m , G.A. Measurement of endothelial cell free

radical generation: Evidence for a central rnechanism of free radical injury in
postischernic tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4046-4050; 1988.

465.

Zweier, J.L., Kuppusamy, P., Williams, R., Rayburn, B.K., Smith, D., Weisfeldt,
M.L., Flaherty, J.T. Measurement and characterization of postischemic free
radical generation in the isolated perfused heart. J. Biol. Chem. 264: 18890-

18895; 1989.
466.

Zweier, J.L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide

generation in the ischemic hean using electron paramagnetic resonance
spectroscopy. J. Biol. Chem. 270:304-307; 1995.