Manual Biotecnologia

Manual de
biotecnologa
Coordinadoras:
Claudia Segal Kischinevzky
y Beatriz Rodarte Murgua
Departamento de Biologa Celular

Facultad de Ciencias, UNAM
Autores en orden alfabtico:

Luisa Alba Lois,
Roberto Coria Ortega,
dgar Dantn Gonzlez,
Mara Isabel de la Cruz Laina,
Juan Luis Chvez Pacheco,
Mara Eugenia Muiz Daz de Len,
ngela Victoria Forero Forero,
Anglica Gonzlez Oliver,
Alejandra Abigal Gonzlez Valdez,
Laura Kawasaki Watanabe,
Suri Martnez Yee,
Beatriz Rodarte Murgua,
Bibiana Rodrguez Ponce,
Mara Isabel Saad Villegas,
Claudia Andrea Segal Kischinevzky,
Alfonso Jos Vilchis Peluyera,
Beatriz Ziga Ruiz.
Apoyado por PAPIME PE202707

Hacia una enseanza actual
de la Biotecnologa 2011
Manual de biotecnologa
1a edicin, 2011
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Facultad de Ciencias
ISBN
Impreso y hecho en Mxico
Contenido
Prctica 1.
Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae
Introduccin
Objetivo general
Objetivos especficos
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Bibliografa
Prctica 2.
Inteligencia tecnolgica competitiva
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Bibliografa
Prctica 3.
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Cuestionario
Bibliografa
Mapas de los plsmidos empleados en la prctica
17
21
Prctica 4.
Extraccin de dna e identificacin del sexo en humanos:
su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses 27
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Agradecimientos
Bibliografa
Prctica 5.
Sesin de bioinformtica
Objetivos
Metodologa
Discusin de resultados
Bibliografa
Prctica 6.
Anlisis de la actividad de catalasas
Introduccin
Objetivo general
Objetivo especfico
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Agradecimientos
Bibliografa
Prctica 7.
Sntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones
biotecnolgicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Agradecimientos
Bibliografa
33
43
47
Prctica 8.
Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz
por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses
Introduccin
Objetivo
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Bibliografa
Prctica 9.
Metabolismo secundario
Introduccin
Objetivos
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Discusin
Bibliografa
Prctica 10.
Degradacin de compuestos xenobiticos a travs
de actividades enzimticas
Introduccin
Objetivo general
Primera parte. Monitoreo de la actividad de lacasas
en hongos tolerantes al petrleo
Material y equipo
Resultados
Segunda parte. Actividad enzimtica
Material y equipo
Resultados
Bibliografa
Cultivo de tejidos vegetales. Introduccin
Prctica 11.
Fitorremediacin con helechos
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Resultados
Discusin
Bibliografa
51
55
7
61
65
67
Prctica 12.
Induccin y desarrollo de embriones somticos
de zanahoria
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Parte i. Germinacin de semillas in vitro
Parte ii. Induccin de callo embriognico
Parte iii. Embriognesis
Resultados
Anlisis
Bibliografa
Prctica 13.
Organognesis somtica de Nicotiana glauca
Introduccin
Objetivo general
Material y equipo
Metodologa
Parte i. Germinacin de semillas in vitro
Parte ii. Cultivo in vitro
Parte iii. Induccin de brotes
Parte iv. Rizognesis
Resultados
Anlisis
Bibliografa
73
79
Prctica 14.
Identificacin de organismos genticamente modificados 85
Introduccin
Objetivo
Material y equipo
Metodologa
Mdulo i. Extraccin de dna
Mdulo ii. Amplificacin de dna
Mdulo iii. Electroforesis en geles de agarosa
Resultados
Bibliografa
Anexo
93
Prctica 1
Fermentacin alcohlica
por Saccharomyces cerevisiae
Introduccin
El vino
El vino es un producto de la fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras a partir del
zumo de frutas y otros materiales ricos en azcar. Los factores que determinan la calidad de un
vino son el clima, el suelo, la variedad de uva empleada y el proceso de fermentacin.
Las levaduras implicadas en la fermentacin del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas
levaduras silvestres, que se encuentran presentes en las uvas, y las levaduras de vino cultivadas, como Saccharomyces cerevisiae, que se aaden al mosto para iniciar la fermentacin.
Los azcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol), con desprendimiento de CO2 como subproducto. El grado de etanol presente en el vino se encuentra
entre 6 y 13 Gay Lussac (gl) y hasta 20 gl en licores. Adems contiene sustancias orgnicas
como los cidos tartrico, mlico, succnico, etc., en concentraciones de 4-7 g/L de vino, as
como sustancias albuminoides, gomas, sales minerales y agua.
Microflora natural de la uva
Las uvas estn compuestas por el hollejo (cscara), semillas y pulpa. Sobre la superficie de las
uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la superficie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp.
En las uvas maduras se encuentran como microflora bacterias lcticas como Leuconostoc
oenus, Lactobacillus spp, Pediococus parvulus, entre otras. Otros microorganismos presentes
son las bacterias acticas, como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp.
Cintica de la fermentacin alcohlica
Durante la fermentacin alcohlica del mosto de la uva, las levaduras que participan en el
proceso atraviesan tres fases:
1.
Multiplicacin. En dos das las cuentas totales (medida directa de la divisin celular) y las viables alcanzan 107 clulas por mililitro.
2.
Fermentacin. Las cuentas totales se incrementan todava ms y despus permanecen constantes. Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentracin
mxima de las totales, pero muestran una fase estacionaria muy corta debido
principalmente a la falta de nutrientes, as como a que el etanol ejerce un efecto
txico y a una alteracin de la permeabilidad de la membrana celular.
3.
Fase de declinacin. La concentracin de las levaduras totales no vara mucho,

pero las cuentas viables disminuyen rpidamente a 105 clulas/ml, ya que al morir
las levaduras se presenta un fenmeno de hidrlisis de la pared celular (autlisis)
por su propia lisozima. Gracias a este proceso, el mosto es enriquecido con vitaminas, aminocidos y lpidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lcticas.
La cintica de consumo de los azcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la

temperatura del proceso, de que no exista sustrato limitante y de la concentracin de etanol
que se genera.
Manual de biotecnologa | prctica 1
10
Bioqumica de la fermentacin alcohlica

La primera parte del metabolismo de los azcares ocurre en presencia o en ausencia de oxgeno, siguiendo las rutas de Embden-Meyerhof-Parnas (gluclisis) o la de Warburg-Dickens
(pentosas-fosfato). Ambas vas funcionan simultneamente, pero satisfacen diferentes exigencias: la glucosa difosfato se encarga de la sntesis de energa y la fructosa monofosfato de
la creacin de precursores para la sntesis celular y del Nadph necesario.
Objetivo general
Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnologa de las fermentaciones tradicionales.

Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas tcnicas microbiolgicas.

Identificar las rutas metablicas principales asociadas al proceso de fermentacin
alcohlica.
Determinar el grado alcohlico de las muestras y la concentracin de azcares reductores presentes al inicio y al final de la fermentacin alcohlica.
Reconocer en la elaboracin del vino un proceso biotecnolgico de gran impacto en
la industria y en constante transformacin
Material y equipo
Parte I
Material
Equipo
* 2 kg de uvas (verdes o rojas)
Licuadora
* 1 garrafn de plstico c/tapa de 5 litros
Autoclave
* 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml
Incubadora con agitacin
* 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml
Refrigerador
1 asa de siembra metlica
Campana de flujo laminar
1 mechero
1 mechero
* 6 gasas grandes
* 100 gr de algodn, hilo y tijeras
* 1 L cloro comercial
*Material que debern traer los alumnos
Parte II
Material
Equipo
Botella con el inculo
Refrigerador
Botella con el macerado de uvas

* 1 frasco Gerber
Parte III
Equipo
2 botellas para centrfuga de 500 ml
Centrfuga de banco
1 alcoholmetro
Balanza de 2 platos
1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml
Refrigerador
1 jarra para jugo

1 bao de hielo
1 vaso de precipitados de 500 ml
1 colador de cocina
* 1 frasco Gerber
* 1 metro de manta de cielo
* Garrafn con el fermentado de uvas
Parte IV
Material
Equipo
10 tubos de ensayo de 5 ml
Vrtex
1 gradilla
Espectrofotmetro
1 micropipeta de 1,000 l
Bao mara
Puntas para micropipeta
Potencimetro
2 celdas para espectrofotmetro
1 piceta
1 cronmetro
Reactivos
Muestra inicial (tomada en la parte II)
Vino centrifugado
Glucosa
DNS
11
Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae | prctica 1
Material
Metodologa
12
Parte I. Maceracin e inculo del medio de cultivo (preparacin del mosto)

1. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta.
2. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inculo).
3. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1,000 ml, procurando no exceder del
nivel de la botella, reservar los matraces obtenidos.
4. Esterilizar ambas botellas en autoclave de 115 a 120 oC por 10 minutos.
5. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
6. En el matraz de inculo, aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces

cerevisiae en condiciones de esterilidad.
7. Incubar a 37 oC por tres das u ocho das a temperatura ambiente.
8. Almacenar la botella de 1,000 ml a 4 C hasta su utilizacin.
9. Esterilizar el garrafn, lavndolo con abundante agua y cloro concentrado, dejarlo
secar y almacenarlo hasta su utilizacin.
Parte II. Inoculacin e incubacin
1. Se depositan en el garrafn de plstico los 250 ml de inculo cultivado y la pasta de
uva restante (botella de 1,000 ml), agitando manualmente hasta su homogeneizacin. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizar en la parte IV como muestra inicial
(mantener a 4 C, en el frasco Gerber hasta su utilizacin).
2. Incubar a 29 C (los estudiantes se llevan el garrafn a casa, mantenindolo en un
sitio fresco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la fermentacin de los
azcares hacia la produccin de cido actico.
3. Agitar dos o tres veces al da (oxigenacin) y liberar el CO2 formado girando levemente la tapa del recipiente para permitir la salida del gas.

Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del semestre, mientras las partes III y IV se hacen al final para permitir una buena fermentacin.
Parte III. Obtencin del producto por centrifugacin
1. Filtrar el producto en una jarra, con manta de cielo y colador, hasta separar los
componentes de la uva del lquido.
2. Mantener en fro (bao de hielo) el producto hasta el momento de la centrifugacin.
3. Colocar el producto en botellas para centrfuga y balancearlas. Centrifugar a 8 Krpm
durante una hora.
4. Verter el sobrenadante en un matraz de 1,000 ml, limpio y previamente desinfectado
con cloro concentrado.
5. Eliminar las clulas del microorganismo que se depositaron en el fondo de la botella
(pastilla).
6. Volver a centrifugar todo el sobrenadante una vez ms. Tomar una muestra de 5 mL
que se utilizar en la parte IV como muestra final (mantener a 4 C en un frasco Gerber).
7. Determinar la concentracin de alcohol en grados Gl con ayuda de un alcoholmetro.
a. Calibrar el alcoholmetro sumergindolo suavemente en agua; esta medida

se toma como 0 Gl.
b. Sumergir suavemente el alcoholmetro en el vino, tomar la medida

que indique la escala.
Parte IV. Determinacin de la concentracin de azcares reductores.

1. Determinar el pH de las muestras inicial y final (por duplicado).
2. Preparar, para todo el grupo, 30 ml de una solucin de dns al 0.5% y 30 ml de solucin
de glucosa estndar (1.5 mg/ml).
3. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la siguiente tabla:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Sol. de glucosa
(ml)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-
Agua
(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
-
Muestra inicial
(ml)
0.5
0.5
-
Muestra final
(ml)
0.5
0.5
Tubo
Concentracin de glucosa (mg/ml)
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estndar.
4.
5.
6.
7.
8.
Agitar todos los tubos en vrtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente.

Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a bao Mara.
Sacar los tubos del bao y agregar 5 ml de agua destilada.
Agitar nuevamente en Vrtex.
Leer la absorbancia en el espectrofotmetro a 540 nm.
Resultados
1.
pH de las muestras inicial y final:

Muestra
TI1
TI2
TF1
TF2
pH
DNS
(ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
13
Tubo
2.
Construccin de una curva patrn de glucosa:

Tubo
Absorbancia (nm)
Concentracin
de glucosa
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
Curva patrn de glucosa
Absorbancia (nm)
14
Concentracin de glucosa (mg/ml)
3.
Linealizar la curva anterior por regresin lineal y obtener la pendiente (m) y la ordenada al origen (b), de acuerdo a la ecuacin de la recta:
Donde:
x es la concentracin de glucosa
y es la absorbancia
4.
y = mx + b
Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado).

Muestra
Absorbancia (nm)
TI1
TI2
TF1
TF2
5.
Sustituir en la ecuacin de la recta resultante de la regresin lineal, los datos de absorbancia de las muestras.
x=
y- b
m
Donde:
x es la concentracin de glucosa
y la absorbancia
m pendiente (obtenida en el paso 3)
b ordenada al origen (obtenida en el paso 3)
Tiempo
Absorbancia
(nm)
Concentracin
de glucosa (mg/ml)
TI1
TI2
TF1
TF2
Registrar la concentracin de alcohol en el producto (resultado de la determinacin

con el alcoholmetro).
Bibliografa
Madigan, M.T. J.M. Martinko, y J. Parker (2003) Brock. Biologa de los microorganismos. 10a ed.
Prentice Hall, Madrid.
Reyes, D.A. H.L. Escalilla, y C.J.R. Verde, (1992) Elaboracin de los vinos de mesa, vol. I, uam Iztapalapa, Mxico.
15
6.
16
Prctica 2
Inteligencia tecnolgica
competitiva
Introduccin
El primer paso en cualquier proyecto de investigacin, bsica o aplicada es buscar informacin
publicada acerca del tema. Contar con informacin suficiente del rea tecnolgica en la que
se pretende incursionar, que incluya tanto fuentes bibliogrficas como patentes publicadas
y datos econmicos y comerciales, resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos,
tcnicamente factibles y con un alto impacto social y econmico. Esto es importante para los
grupos de investigacin de universidades e institutos, pblicos y privados, pero resulta de especial relevancia para las empresas.
Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en Mxico y en el
entorno mundial que cada vez resulta ms competitivo, obligan a las empresas mexicanas a
observar atentamente el entorno tecnolgico en el cual se insertan. La informacin tecnolgica es actualmente condicin indispensable del xito en cualquier proceso relacionado con los
sistemas productivos: investigacin, planificacin industrial, desarrollo, fabricacin, comercializacin y gestin.
Se sabe que, incluso, existe una fuerte correlacin entre el nivel de desarrollo tecnolgico
de los pases y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la informacin y
utilizarla libremente.
La inteligencia tecnolgica competitiva establece una excelente base para administrar y
desarrollar proyectos tecnolgicos, porque permite identificar oportunidades y ventajas competitivas, elegir las tecnologas adecuadas y responder de forma oportuna y acertada a los
cambios del entorno.
Para acceder a informacin estratgica de un rea tecnolgica es indispensable utilizar
fuentes de informacin electrnica, porque cada ao aparecen publicados cientos de miles de
artculos cientficos en miles de revistas especializadas.
La mayor parte de los artculos publicados son del rea mdica, en segundo lugar estn
las publicaciones qumicas, en tercero las de biologa, en cuarto las del rea fsica y despus los
artculos relacionados con las ciencias sociales.
Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo particular, es importante hacer una bsqueda sistemtica y rigurosa que considere tanto la informacin cientfica, como las patentes y la informacin comercial del sector tecnolgico de
inters.
En los ltimos aos el proceso de diseo de las nuevas tecnologas ha visto incrementada
su complejidad y su dificultad. Se hace as ms necesario en cada momento disponer de un
buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnolgico, tanto en la investigacin aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovacin. La informacin
de patentes puede ser una herramienta muy eficaz, no slo para el seguimiento, sino para la
17
previsin y la planificacin del proceso de desarrollo tecnolgico, as como en la realizacin de

investigaciones econmicas, cientficas y tecnolgicas con diferentes propsitos.
El monitoreo y el anlisis sistemtico de la informacin permite construir el mapa completo del rea tecnolgica de inters. Se identifica cul es la oferta tecnolgica global y dentro de ella, cules son las tecnologas emergentes, las maduras y las que estn por entrar al
mercado; a quin pertenecen esas tecnologas, cul es su tendencia de desarrollo y el posible
impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. Con esta informacin es posible determinar cules son las tecnologas estratgicas para el grupo con el fin de disear
programas de investigacin y desarrollo, as como localizar socios potenciales para establecer
alianzas tecnolgicas en el nivel nacional e internacional; o bien, se puede identificar posibles
licenciatarios de tecnologa o tecnologas de libre acceso.
18
Objetivo general
Hacer una bsqueda sistemtica de artculos cientficos y de patentes, en torno a un tema de
investigacin biotecnolgico, en bases de datos especializadas

Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema.

Identificar las bases de datos ms adecuadas para la bsqueda.
Encontrar las palabras clave idneas.
Aprender a recuperar las listas bibliogrficas y los artculos especficos.
Aprender a recuperar patentes de las bases pblicas de Internet.
Material y equipo
Equipo
Material (individual)
Computadora con acceso

a Internet conectada a la * Unidad de memoria usb
red unam
* Un tema de investigacin biotecnolgico
lo suficientemente preciso

Metodologa
La prctica se llevar a cabo en un aula de cmputo en dos sesiones de tres horas. En la primera
sesin se realizar una bsqueda de fuentes bibliogrficas, en la segunda, se efectuar una
bsqueda de patentes.
Los alumnos podrn hacer bsquedas individuales o formar equipos de dos integrantes.
La informacin obtenida ser utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotecnolgico particular elegido libremente o sugerido por los profesores.
Segunda sesin: bsqueda de patentes

1. Ingresar a la oficina de patentes europea:

(http://ep.espacenet.com/quickSearch?locale=en_EP)
2. Se realiza una bsqueda con palabras clave (en ingls) localizadas en ttulo y abstract.
3. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet.
4. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsoft
Word.
Resultados
El alumno debe entregar:
1. La historia de la bsqueda.

a. Una lista de las bases de datos consultadas.

b. Las palabras clave utilizadas y el nmero de referencias obtenidas.

c.
La estrategia para acotar la informacin.
2.
3.
4.
5.
Una lista de las bases de datos ms adecuadas para la bsqueda.

Un archivo electrnico con la lista de referencias bibliogrficas y los artculos recuperados.
Un documento impreso con la bibliografa de los artculos encontrados.
Un archivo electrnico con la informacin bibliogrfica de las patentes recuperadas.
19
Inteligencia tecnolgica competitiva | prctica 2
Primera sesin: bsqueda de fuentes bibliogrficas

1. La bsqueda bibliogrfica se realiza en la pgina de la Direccin General de Bibliotecas de la UNAM: <http://www.dgbiblio.unam.mx/>
2. En donde dice colecciones, selecciona: Bases de datos.
3. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. La bsqueda en esta seccin se hace en espaol. Dependiendo del tema particular, pueden
utilizarse palabras clave como: biologa, biotecnologa o medicina.
4. Aparece una lista de bases de datos, con los temas particulares que cada base incluye y las empresas proveedoras del servicio.
5. Se selecciona un proveedor.
6. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar tiles para la bsqueda
7. Se hace una bsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en ingls. Se
anota el nmero de publicaciones encontradas en la base de datos.
8. Se localizan otras bases de datos tiles, se realiza la bsqueda con las mismas palabras clave y se comparan resultados.
9. Se realiza una bsqueda simultnea en las bases de datos que tienen el mayor nmero de citas, utilizando palabras clave en ingls.
10. La bsqueda se acota si es necesario (a los ltimos aos, buscando las palabras clave
slo en el ttulo o localizando slo revisiones) hasta obtener un nmero manejable
de citas (entre 150 y 200).
11. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes.
12. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad Usb.
13. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliografa consultada y se guarda en la
unidad Usb.
14. Se regresa a la pgina de las citas seleccionadas y se obtienen los artculos completos que se encuentran disponibles en formato Pdf.
15. Los artculos completos se guardan en la unidad Usb.
Bibliografa
Cruz, E, P. Escorsa, R. Maspons, G. Izquierdo e I. Ortiz (2003), La deteccin de las tecnologas
emergentes: El caso de los biomateriales, Seminario ALTEC 2003 Cdigo ES.03.145.
Zhu, D. y A. Porter. (2002) Automated extraction and visualization of information for technological intelligence and forecasting, Technological forecasting & social change 69: 495506.
Las patentes como fuente de informacin tecnolgica, Oficina Espaola de Patentes y Marcas,
<http://www.oepm.es/internet/inftecn/primera.htm.>
20
Prctica 3
Transformacin de levadura
y ensayo de doble hbrido
Introduccin
El sistema de doble hbrido en levadura se desarroll con la idea de identificar genes que codifican para protenas que se asocian fsicamente con una protena dada in vivo. En contraste
con los mtodos bioqumicos que detectan interacciones protena-protena, el sistema de doble hbrido se basa en un ensayo gentico en donde la interaccin entre dos protenas se mide
por la reconstitucin de un activador transcripcional funcional en la levadura. Aun desconociendo especficamente dnde y cmo acta una protena particular, es posible encontrar las
protenas con las que interacta y potencialmente utilizar esta informacin para conocer ms
sobre la posible funcin de dicha protena.
En este sistema se construye una fusin con el dominio de unin a dna proporcionado por el
represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plsmido que contiene el marcador selectivo
His3 (plsmido carnada). Por otra parte, se construye una fusin con el dominio de activacin
de la transcripcin B42 (acid blob) que se expresa en un plsmido que contiene el marcador
Trp1. Cuando las protenas fusionadas interactan, se reconstituye el factor transcripcional y se
activa la transcripcin ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plsmido)
o bien, de LexAoperador-Leu2 (localizado ro arriba del gen cromosmico Leu2 en la cepa EGY48).
La mayora de las protenas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble
hbrido; sin embargo, antes de intentar buscar posibles protenas que interacten con la protena de inters (carnada), es recomendable establecer si sta es adecuada para el proceso.
El sistema del doble hbrido tiene restricciones que impiden que algunas protenas funcionen
adecuadamente, por ejemplo, aquellas que tienen dominios transmembranales podran tener
dificultades al momento de la translocacin al ncleo, o bien, puede ser que no se genere el
plegamiento adecuado de la protena.
Objetivo general
El alumno aprender a utilizar el sistema de doble hbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae
como una herramienta para el anlisis de posibles interacciones entre protenas.
21

El alumno aprender a transformar a la levadura S. cerevisiae.

El alumno podr discriminar si dos protenas interactan o no mediante el ensayo
gentico del doble hbrido.
Material y equipo
22
Material
1 mechero
Equipo
Vrtex
Puntas estriles blancas, azules y amarillas
Incubadora a 30C
3 tubos eppendorf estriles de 1.5 ml
Incubadora a 42C
Agua destilada, estril
Microcentrfuga
* 1 masking tape
Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml
* 1 encendedor
Espectrofotmetro
* 1 marcador indeleble
Centrfuga
* 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo
Termomixer
* Cajas petri estriles

* Palillos de dientes estriles
Hielo
Tubos para centrfuga, estriles
Reactivos elaborados previamente por el profesor
Medio YPD
Medio SD + Leu
Medio SGal + Leu + XGal
Medio SGal + rafinosa
Solucin PEG/acetato de litio/TE
DMSO
* Material que debern traer los alumnos.
Material biolgico:
150 ml de clulas competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48
150 ml de DNA de esperma de salmn (10 mg/ml)
Plsmidos:
1 mg de pEG202+Gpa1
500 ng de pJG4-5+Ste4
500ng de pJG4-5+endoquitinasa
1 mg de pSH18-34
Cepas, plsmidos, soluciones y medios.
1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Mat,trp1, his3, ura3,6, LexAop-Leu2)
2. Los tres plsmidos empleados son multicopia, contienen orgenes de replicacin de E. coli
(pBR ori) y de levadura (2m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias.
a.
b.
c.
El plsmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se

utiliza para la expresin de las protenas fusionadas a LexA. El sitio mltiple de clonacin se localiza ro arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura
es His3 (figura A).
El plsmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios nicos EcoRI y
XhoI para obtener una fusin con la secuencia de localizacin nuclear de SV40 (NLS),
el dominio B42 (activador de la transcripcin) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). El
marcador selectivo es Trp1 (figura B).
El plsmido pSH18-34 contiene un sitio de unin a LexA seguido del gen reportero
lacZ de E. coli. Ura3 es el marcador selectivo para levadura.
Metodologa
Tubo 1: agregar 500 ng del plsmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng

de pSH18-34.
Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng
de pSH18.
Tubo 3: no agregar plsmidos.
11. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado fresco con 1 vol de TE 10X, 1 vol de acetato
de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%).
12. Mezclar en el vrtex e incubar 30 min a 30C
13. Agregar 40 ml de DMSO, mezclar en el vrtex
14. Dar un choque de calor a 42C por 15 min. Meter en hielo.
15. Centrifugar durante 5 segundos, eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 100 ml
de agua con ayuda del vrtex.
23
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido | prctica 3
Parte I. Protocolo para transformar levadura

1. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo
toda la noche a 30C y 250 rpm (profesor).
2. Al da siguiente, inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la
noche anterior. Medir la densidad ptica (do) inicial a 600 nm. Incubar a la misma temperatura y rpm.
3. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0.5-0.6 (aproximadamente 1 x 107 clulas/ml).
4. Centrifugar 5 min a 2 500 rpm, eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de
agua destilada estril. Resuspender en el vrtex.
5. Volver a centrifugar igual que en 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 1
ml de agua. Resuspender en el vrtex y pasar las clulas a un tubo de 1.5 ml estril.
6. Centrifugar en la microfuga 5 seg a mxima velocidad.
7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botn en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (preparado fresco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X)
8. Centrifugar igual que en el paso 6, eliminar el sobrenadante y resuspender las clulas en
300 ml de TE/acetato de litio.
9. En un tubo eppendorf limpio, colocar 50 ml de clulas y agregar 50 mg de dna de esperma
de salmn sonicado y hervido. Repetir el proceso con otros dos tubos. Marcar los tubos
con nmeros (1, 2 y 3).
10. Preparar los tubos de la siguiente manera:
16. Plaquear las clulas de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30C por dos das.
Transcurrido este tiempo, debe observarse el crecimiento de las colonias.
Parte II. Ensayo de doble hbrido
1. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transformadas, sembrar 5 o 6 colonias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7.0, en el cual previamente se plaquearon 50 ml de X-Gal. Para sembrar las transformantes se emplean palillos planos estriles,
tomando una sola colonia cada vez.
2. Incubar la caja a 30C por 2 das.
Resultados
24
1.
2.
Transformacin de levadura: anotar y explicar por qu hubo crecimiento o no en cada una

de las tres cajas.
Doble hbrido: anotar si las transformantes obtenidas generaron un color azul o no en el
medio SGal + X-Gal + leucina. Cmo interpretas los resultados obtenidos?
Plsmidos utilizados
Crecimiento en medio SD + Leu
Coloracin en medio
SGal + Leu (pH7) + XGal
pEG202 + GpaI
pJG4-5 + Ste4
pSH18-34
pEG202 + GpaI
pJG4-5 + endoquitinasa
pSH18-34
Sin plsmidos
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
5.
Por qu crees que es importante sembrar las transformantes en un medio que slo contiene leucina?
Cules son las diferencias entre un medio selectivo y un medio completo? Qu crees
que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transformantes en un medio completo?
En qu consiste el ensayo de doble hbrido y para qu sirve? Menciona un ejemplo.
Cul es la funcin del gen reportero lacZ?
Para qu sirve el compuesto X-Gal? Qu pasara si olvidaras adicionar este compuesto
a tus cajas de SGal + Leu?
Bibliografa
Adams, A., D.E. Gottschling, C.A. Kaiser y T. Stearns, (1997), Methods in yeast genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory Course Manual.
Fields, S. y O. Song (1989), A novel genetic system to detect protein-protein interactions, Nature 340: 245-246.
Fields, S. y R. Sternglanz (1994), The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions, Trends in Genetics 10: 286-292.
Guthrie, C. y G.R. Fink (1991), Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, vol. 194.
Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Figura A. pEG202: plsmido para la fusin a LexA.
25
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido | prctica 3
Mapas de los plsmidos empleados en la prctica
Figura B. pJG4-5: plsmido para la fusin al dominio de activacin de la transcripcin.
26
Fusion cassette
NLS
B42 domain
EcoRI
HA Tag
XhoI
ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT
M
G
A
P
P
K
K
K P
E
F
G
R
L
E
K
L
Figura C. Plsmido pSH18-34: plsmido con el gen reportero lacZ.
Prctica 4
Extraccin de dna e identificacin

del sexo en humanos:
su importancia en las ciencias
antropolgicas y forenses
Introduccin
En el campo de las ciencias sociales, la antropologa estudia el origen del hombre. Esta disciplina integra los descubrimientos de otras ciencias, como la sociologa, la economa, la historia,
la psicologa y la biologa. La antropologa ha sido subdividida en reas especializadas entre las
que est la antropologa fsica o biolgica, que estudia la evolucin y biologa de las poblaciones humanas.
Tradicionalmente, antes del nacimiento de un beb se tiene la expectativa de cul ser
su sexo. La identificacin del gnero es importante en muchos aspectos biolgicos y sociales
en la vida de una persona. Por otra parte, uno de los primeros registros que se realiza en excavaciones arqueolgicas es la identificacin del sexo en restos humanos; este dato es fundamental para reconstruir el contexto arqueolgico con la finalidad de entender a) aspectos
culturales en las poblaciones antiguas, por ejemplo, la participacin del hombre y la mujer en
las sociedades prehistricas, la interpretacin de artefactos y arte prehistricos, la seleccin
de vctimas en casos de infanticidio, etc., y b) la historia evolutiva humana relacionada con demografa, relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro, etctera.
Distintos mtodos morfolgicos permiten identificar el sexo en restos de esqueletos humanos de adultos. Para este anlisis la pelvis es considerada el hueso ideal, ya que permite
identificar el sexo con un ndice de certeza de aproximadamente 95%. Sin embargo, la identificacin mediante anlisis morfomtrico resulta incierta o imprecisa en restos seos de nios
y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfismo sexual, o en restos incompletos de adolescentes y adultos. En estos casos el mtodo molecular, basado en la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), es la herramienta idnea para la identificacin del sexo en los restos seos
incompletos. Esta identificacin por anlisis molecular tambin es utilizada con frecuencia en
antropologa forense.
La amelogenina es una protena del esmalte dental. En los humanos hay dos genes que
la codifican, stos se localizan en los cromosomas Y y X y fueron secuenciados en su totalidad
en 1991. Existen varias tcnicas de PCR que se basan en la amplificacin de la amelogenina
para identificar el sexo, las cuales funcionan adecuadamente en muestras forenses, individuos
modernos y restos arqueolgicos. As, recientemente el grupo de investigacin en antropologa molecular del laboratorio de bioqumica de la Facultad de Ciencias de la unam, propuso un
mtodo que se basa en la amplificacin del intrn 1 del gen de la amelogenina para identificar
el sexo en restos seos humanos. El mtodo utiliza dos primers especficos para las secuencias
de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer comn a ambos alelos; el
tamao de los productos de amplificacin es diferente en los dos alelos. El sexo masculino se
identifica por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y, mientras que el femenino se identifica por su ausencia. Las reacciones de amplificacin por PCR fueron optimizadas
27
y establecidas con dna humano moderno, por lo que este mtodo funciona adecuadamente
para analizar dna contemporneo y antiguo. Los productos de PCR son detectados directamente en electroforesis en gel de agarosa y/o poliacrilamida.
Objetivo general
Identificar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnologa con la finalidad de
que aprendan tres metodologas bsicas en el rea de la biologa molecular.
28
1.
2.
3.
Con el mtodo de extraccin de dna el alumno conocer las caractersticas requeridas para obtener y manipular la muestra biolgica de mucosa bucal y adquirir la
capacidad para extraer dna de sta.
Con el mtodo de PCR el alumno amplificar las regiones especficas del gen de la
amelogenina de los cromosomas X y Y para identificar el sexo en humanos, lo cual le
permitir entrenarse en una tcnica ampliamente utilizada en la antropologa molecular y la biologa.
Con la tcnica de electroforesis en gel de agarosa el alumno aprender a visualizar el extracto de dna y los productos de amplificacin de PCR. Tambin aprender a cuantificar
dna por comparacin con un marcador de tamao molecular. La electroforesis en gel es
una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigacin cientfica.
Material y equipo
Material
Equipo
Tubos de 1.5 ml y de PCR de 0.2 ml
Bao a 56C
Hisopos estriles
Vrtex
Micropipetas de 0.21ml y de 0.05 - 0.1 ml
Bao a ebullicin
Microfuga
Cmara de electroforesis
Soluciones
1. PBS 20X
2. 200ml de cloro al 30%
3. Solucin de lisis
4. Primers (200 ng c/u)
5. dNTPs (200 mM)
6. Buffer c/MgCl2 (1X)
7. Agua inyectable
8. Taq DNA polimerasa (1U)
9. GelRed
10. Agarosa
11. TAE 50X
12. Marcador de peso molecular para DNA
Metodologa
La prctica se lleva a cabo en tres mdulos:
I) Extraccin de dna de las muestras
II) Amplificacin del dna
III) Electroforesis en geles de agarosa
MDULO I. Extraccin de dna
Extraccin de dna

Transferir las clulas/PBS a tubos de 1.5 ml y centrifugar a 14 000 rpm durante 1 min.

Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 L de solucin de lisis.

Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta.

Incubar a 56C x 15 minutos.

Enfriar a temperatura ambiente por 30 segundos.

Agitar durante 15 segundos.

Calentar en bao a ebullicin por 10 minutos.

Enfriar a temperatura ambiente por 2 minutos.

Agitar vigorosamente por 2 minutos.

Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 minutos

Obtener el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio de 1.5 ml.

Guardar en hielo o a 20 0C.
Visualizar y cuantificar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE
MDULO II. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
1.
2.
Marcar tubos de pared delgada de 0.2 o 0.5 ml de acuerdo con el termociclador que
se utilizar.
Poner en cada tubo:
Reactivo
Agua
Mezcla de reaccin
Concentracin final
cbp
ajustar a 25 l
Amortiguador 10X
2.5 l
1X
MgCl2 25 mM
2.5 l
2.5 mM
dNTPs 1.25 mM
2.0 l
0.1 mM
BSA 2.5 g/l
0.5 l
1.25 g/l
Primer COM
5 M
1.0 l
0.2 M
Primer XSP
5 M
0.5 l
0.1 M
Primer YSP
5 M
0.5 l
0.1 M
29
Extraccin de adn e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses | prctica 4
Obtencin de clulas
1. Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodn estril, raspar 30 veces
la parte interna de cada mejilla para obtener las clulas.
2. Colocar el hisopo en un tubo de 1.5 ml, aadir 1 ml de buffer PBS, enjuagar el hisopo
en el fondo y contra las paredes del tubo.
3. Colocar el hisopo en una solucin de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para descartarlo.
dna 10 - 20ng
1 - 3 l
Taq dna polimerasa
3.
4.
1U
Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera.
Colocar los tubos en el termociclador y programar:
Desnaturalizacin inicial: 94C por 5 minutos

40 ciclos

30
94C por 30 segundos

57 C por 30 segundos
72 C por 1 minuto
Extensin final: 72 C por 7 minutos

Guardar a 4 C
MDULO III. Electroforesis en gel de agarosa
Preparacin del gel de agarosa
1. a) Para dna genmico (agarosa al 1%):
Pesar 0.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X.
1. b) Para productos de PCR (agarosa al 2.5%):
Pesar 0.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X.
2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto
hasta que se disuelva completamente. Evitar que hierva, para lo cual se detendr el
horno cada vez que sea necesario.
3. Enfriar la agarosa aproximadamente a 50 C.
4. En una superficie plana nivelada colocar la base acrlica que soportar el gel y colocar
el peine para hacer los pozos
5. Vaciar la solucin de agarosa evitando la formacin de burbujas.
6. Dejar el gel solidificando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca.
Preparacin de la cmara de electroforesis y las muestras (extracto de dna y los productos de
PCR)
1. Colocar el gel dentro de la cmara de electroforesis.
2. Aadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel.
3. Preparar las muestras de la siguiente forma:
a)
Tomar 5 l de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1l
de GelRed para monitorear la movilidad electrofortica y para visualizar en UV.
Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta
manera se evita la contaminacin.
b)
Colocar cuidadosamente ~6 l de muestra en cada pozo utilizando la micropipeta de 10 l. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en
el gel una muestra del marcador de tamao molecular.
c)
Conectar la cmara de electroforesis, el cable y la fuente de poder. Unir los
electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cmara, el cable y la fuente de poder.
d)
e)
f)
Encender la fuente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. Cuando

el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Las
muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo.
Desplazar las muestras tres cuartos del tamao del gel.
Apagar la cmara de electroforesis para detener el desplazamiento de las
muestras.
Resultados
Agradecimientos
Se agradece al Dr. Alfonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioqumica de la Facultad de Ciencias por su participacin. Este mtodo fue diseado como parte de un proyecto apoyado por
papiit, unam y por el CONACyT.
Bibliografa
De la Cruz, I., A. Gonzlez-Oliver, B.M. Kemp, J.A. Romn, D.G. Smith, y A. Torre-Blanco (2008),
Sex identification of children sacrificed to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco, Current Anthropology 49: 519-526.
Brown, K.A. (2001), Identifying the sex of human remains by ancient DNA analysis, Ancient
Biomolecules 3:215-225.
Jurmain, R., L. Kilgore, W. Trevathan y H. Nelson (2003), Introduction to physical anthropology, 9
ed., Thomson, Wadsworth, Canada, 522 p.
31
Extraccin de adn e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses | prctica 4
Visualizacin del dna

El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarn con una lmpara de luz UV o sobre un transiluminador. El tamao de los fragmentos amplificados es
de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y.
Tomar un registro fotogrfico del gel con una cmara digital.
Prctica 5
Sesin de Bioinformtica
Bases de datos y herramientas
bioinformticas
Qu es la bioinformtica?
La bioinformtica es el campo cientfico que integra a la biologa, las ciencias computacionales
y la tecnologa de la informacin en una disciplina nica. Al inicio de la revolucin genmica
la bioinformtica se entendi como la creacin y mantenimiento de bases de datos en las cuales se guardara informacin biolgica tales como secuencias de nucletidos (genes, secuencias reguladoras, etc.) y de aminocidos (protenas).
Conforme estas bases de datos fueron creciendo, fue necesario desarrollar nuevas interfases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera, las
bases de datos iniciales Pir (Protein Information Resource) y GenBank fueron ampliando sus
recursos informticos para incluir programas de bsqueda y comparacin de secuencias de
nucletidos y aminocidos, traduccin de secuencias de nucletidos a aminocidos o bsqueda de seales estructurales o funcionales en las secuencias. As, para el resguardo y anlisis
de las bases de datos de dna, a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Informacin
Biotecnolgica (Ncbi, por sus siglas en ingls), dependiente de los institutos nacionales de
salud en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo
de Biologa Molecular (Embl) y el Banco de Datos de dna en Japn (DDBJ). Por su parte, las secuencias de protenas fueron depositadas en la base de datos Pir y, ms recientemente, en la
base de datos Protein DataBank (Pdb). Como se mencion anteriormente, todas estas bases
de datos cuentan con recursos bioinformticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a
cabo mltiples anlisis de las secuencias.
Con el desarrollo de la Red Internacional internet, todas estas bases de datos han sido
puestas a disposicin de todo el pblico de manera gratuita a travs de diferentes pginas
Web.
Qu es el ncbi?
Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de informacin en biologa molecular, el Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (ncbi) crea bases de datos
pblicas de dna, conduce investigacin en biologa computacional, desarrolla herramientas
de software para anlisis de datos genmicos y disemina informacin biomdica para investigacin bsica y clnica.
Adems de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), existen otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biologa Molecular
(http://www.ebi.ac.uk/embl), el dna Databank de Japn (ddbj; http://www.ddbj.nig.ac.jp) y
Ensembl, que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http://
www.ensembl.org). Todas estas bases de datos cuentan con mltiples recursos bioinformticos para la recuperacin, comparacin y anlisis de secuencias de nucletidos y protenas.
33
Objetivos

Presentar al alumno los conceptos bsicos y las herramientas computacionales en el

campo de la bioinformtica.
Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de bsqueda, recuperacin y anlisis de secuencias de genes y protenas.
Metodologa
34
1. Recuperacin de secuencias
En esta sesin de bioinformtica se acceder a la base de datos del ncbi, se har una bsqueda
de una secuencia determinada y se utilizarn algunas de las herramientas computacionales
que el ncbi pone a disposicin de la comunidad acadmica mundial.
Nota: Las bases de datos no slo incrementan constantemente sus contenidos, sino que
tambin vara el diseo de las pginas, sin embargo, siempre ser posible llevar a
cabo el ejercicio propuesto, mediante una bsqueda cuidadosa en toda la pgina.
Para recuperar una secuencia de un gen o una protena, la nomenclatura aceptada en las bases de datos seala lo siguiente:

Se puede buscar la secuencia del gen o de la protena sealando las tres primeras letras del
nombre o identificador en ingls; de esta manera, si se pretende recuperar la secuencia del
gen de la insulina teclear Ins, mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh.
Si el identificador de la protena cuenta con dos o ms palabras, teclear las iniciales de dichas
palabras; as, para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp.
Nota: Se pueden utilizar indistintamente maysculas y minsculas en la escritura del

identificador.
Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente direccin:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov> y aparecer la pgina de presentacin del sitio:
Como se muestra, la pgina contiene el localizador Search (bsqueda) y una ventana en la que
aparecen diversas bases de datos; al seleccionar Nucleotides (nucletidos) se est escogiendo
una base de datos especfica y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se
desea recuperar; en este caso, el del gen codificante de la protena de choque trmico Hsp10.
El programa de bsqueda generar un reporte de todas las entradas que existen en la base de
datos en las que aparece el registro Hsp10:
This search in Gene shows 164 results, including:
hsp10 (Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock
protein Hsp10
HSP10 (Bifidobacterium bifidum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES
hsp10
Hsp10hsp10 (Salmo salar): heat shock protein 10
This search in Gene shows 4 results, including:

HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10)
HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)
Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin)
Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human

se obtendrn muchos descriptores. Explralos y busca en el apartado de regiones genmicas,
transcritos y productos, en donde dice GenBank, para obtener la secuencia genmica de nucletidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank:
ORIGIN
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
acccgcgcag
gcctcgctcg
atcgcgtcat
aaaagcctag
gcagggccct
gggcgagggg
cacgtgtcgc
agtctgaggc
cctgtctgag
ttggtggcca
ccttttctcc
cgagaacccg
aatatcttgg
tttctggaaa
aaagctggtc
gggaattaaa
gaggtttggt
cctgttgata
ggacaagcgt
gctgaaactg
caagcaacag
ggaactattt
cgcttattaa
tttcttaaag
cttattttat
ggtgtgctag
gttccagaac
ttccgggagg
aaacagctcc
tggggcgaat
gctagcggcg
cagggccgga
ggagggagta
gcgtacgggg
ctcagtgacc
cccagggctc
ggcgcacgcg
gtaaaaatca
aacctgaaga
tggttgctca
cttggaatat
gttaactttc
atgtgattac
ttagaaagtt
taaccaaagg
tagtcgctgt
tttatagtgt
gtagagttta
ggaaatgact
gtgatagttt
cgcgctcagc
tttccagaaa
ggacgaaggg
ttttttcttc
cgcggtgcgc
accgctgggg
ctgcgagtct
atggtgagtc
atccctgacg
agcgcccgat
tttgcacgcg
cagcgtctca
tggtgccagg
aggaaaacat
ccggaggagc
tggttagtac
aaagccaaaa
atttagtttt
tcttccactc
aggcattatg
tggatcgggt
gcagtggagg
tgtcgttttc
aatataaagt
cagagtatta
cctctccggc
atgccgcgct
gtagttcttt
cgcctccgag
gtcggggcga
cgagcgcgcc
ctttgcggcg
ccgcgtggcc
cccctctttt
ggcaccttgg
cgtgtgctgc
cctgcttctg
cagggagctt
ttgaccttgg
gacaacgacc
attcaaatgc
cgtgttgaga
tgtttcaaaa
tttgaccgag
cttccagaaa
tctaaaggaa
gaaaagaagt
aagatcatta
tgcttatttt
aaaattgtcc
cggcttagtc
ccctacggct
cacctcggct
tcttcgcgtc
ccgccctccc
tgcgcgctgg
ctacactaga
ccgaggcctg
gttgggctgg
agcggcaagg
cggtgtgtaa
cagggccttt
gacccagcgt
aataaactaa
cctaacagac
gcttccttaa
tgtatagcac
catttctctt
tattggttga
aatctcaagg
aggtaaatgg
aattctggag
actgctttgg
atatgaccaa
tcaataggcc
tagttcccgg
caagggtcaa
gggcgcctag
agcgtcctgc
tccctgggag
gtgatttttt
gcagagtacg
caggcccggg
gcgggaggga
cccgcccgac
ggcagggggg
gtggatgtgt
ttcctgaaaa
ggttgacctt
gtaaggaatc
cgaataagct
ggtggcgttg
cctacaggca
aaggagtgct
aaaagtattg
gagctgcagt
tattaaaagt
ttctaatctg
tgctatgatg
gggtgcggtg
35
Sesin de Bioinformtica. Bases de datos y herramientas bioinformticas | prctica 5
Por otra parte, si se quiere restringir la bsqueda al gen que codifica a la protena Hsp10 humana, habr que escribir Hsp10 human. De esta manera el programa de bsqueda recuperar
la secuencia deseada:
36
//
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
3061
3121
3181
3241
3301
3361
3421
gctctcgcct
gttcaagacc
gccgggtgtg
catttgaacc
cagtatgggg
gcaatttggt
aaagaggctg
gaggatcgtt
tgagacctcc
gggcatttaa
tgccctaatc
cagtcttgtc
actttcttaa
tgttagtgta
aagattgcac
aagatctcag
ttctagttgc
aagactttgg
gaacaaaaca
gaaagaagga
ggtttatttc
gttaactaaa
tagtttaagc
tctgtaattc
atttgagtga
gaactagata
gttagcgtga
ctagatgaca
ttgtcttaac
ttcttggaaa
cccattccac
ataataaact
tataaacact
gtaatctcag
agcctgacca
gtggcatgcg
ctggaggcgg
gacagggcga
agcctagtgt
tgcgtggtgg
tgagctcagg
tgtctacaaa
gaattgagag
ttaaccagtt
caatctgcag
aacctgatat
ttttatgtgt
acctctgttt
ccaaaataca
ttctgaggag
ggagtggaca
atcacaagag
aaatatgacc
atatagttga
gttagctttt
cactgtgtat
tagtatgagt
ccatgtttca
tctttgctaa
aagttggaga
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taatggtttt
gtacgtagac
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aatgataact
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ataaataaat
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ttcttttgca
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tagatgttcc
cagtaaacgc
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tatgttctaa
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taagttatgt
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tatttcaaag
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taaacatcct
taaagttctt
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aaatctttcg
aatgacatcc
aatatgtaaa
ggccgaggtg
accccgtctc
cagctactgg
gagccgaggt
caaaaaaaaa
tgccttacat
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aggagttcaa
acaaaagatg
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gttgtatacc
ctctgaatgc
atttttttta
agttcttcca
tcagttaatt
cgttggggcc
ctgaggagct
gtccctttcc
atccaaaaaa
ggcattttct
taatatttaa
ttcttgaact
tgtaactaca
agccacgaaa
tgatttaaaa
tcctttttta
ctcccagaat
tctaaaaaga
aggattattt
cactattgaa
tcatgtaaat
agtgtctcca
tgagtggtta
tgcggatcac
tactaaagat
ggaggctgag
tgcaaggcgc
aaaaaaaaat
tctaaatttt
attttgggag
aatcagtctg
tgcttcaagg
aacccctaac
taccagagga
cgcctaacgc
agcttaccag
gtgtggccca
gtttaggcct
aaataatgtt
gtcatggagt
ccaaatctgt
actttaaatt
gggtgctggc
cagttataaa
tttacgttgg
gtggtatttt
tatattttta
gttaactgtt
agggtggaga
atggaggcac
agtcagatat
cctatttaga
atggcatcaa
aatttccata
aaattgtttc
atcttta
aaggtcagga
acaaaaatta
gcaggagaat
ccctgcattc
cccctcaata
taataagaca
gccaaagcag
ggcaacataa
taaaatgagg
acattgaaat
acaggttggt
aaatccctaa
ctactgctaa
gggaagccaa
cgggcttcta
aactgcattg
taggaatagg
tctttggagg
tttgtatgtt
tactgttgca
gttagcttta
agtcaggttt
tgagtgaaga
atataattgg
tatgttgggt
gattcaacca
caaagtagtt
ttgcaattag
gatggtgaca
catgatgctg
tttctctttt
cttgtactga
Como se puede observar, la secuencia contiene una numeracin que facilita la bsqueda de
una subsecuencia particular.
De igual forma se puede recuperar, dando clic en transcript, la secuencia del rna mensajero del
gen, y en este caso, la secuencia NM_002157.2 recuperada solamente muestra los exones
que conforman el rna mensajero maduro:
/gene=HSPE1
ORIGIN
HSPE1/RNAm
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
acccgcgcag
gcctcgctcg
atcgcgtcat
aaaagcctag
gcagggccct
gggcgagggg
cacgtgtcgc
agtctgaggc
accgagtatt
cagaaaaatc
aaggaaaggg
cagaatatgg
gtgacattct
atgctgccca
ggtgtgctag
gttccagaac
ttccgggagg
aaacagctcc
tggggcgaat
gctagcggcg
cagggccgga
ggagggagta
ggttgaaagg
tcaaggaaaa
tggagagatt
aggcaccaaa
tggaaagtac
ttccactgaa
cgcgctcagc
tttccagaaa
ggacgaaggg
ttttttcttc
cgcggtgcgc
accgctgggg
ctgcgagtct
atggcaggac
agtgctgctg
gtattgcaag
caaccagtta
gtagttctag
gtagactgaa
gttctgaaat
cctctccggc
atgccgcgct
gtagttcttt
cgcctccgag
gtcggggcga
cgagcgcgcc
ctttgcggcg
aagcgtttag
aaactgtaac
caacagtagt
gcgtgaaagt
atgacaagga
ataagtcact
ctttcgtcat
cggcttagtc
ccctacggct
cacctcggct
tcttcgcgtc
ccgccctccc
tgcgcgctgg
ctacactaga
aaagtttctt
caaaggaggc
cgctgttgga
tggagataaa
ttatttccta
attgaaatgg
gtaaataatt
tagttcccgg
caagggtcaa
gggcgcctag
agcgtcctgc
tccctgggag
gtgatttttt
gcagagtacg
ccactctttg
attatgcttc
tcgggttcta
gttcttctcc
tttagagatg
catcaacatg
tccatatttc
Con la secuencia del gen, ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de
rna mensajero, se iniciar una bsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la
finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia
de inserciones o deleciones de nucletidos a lo largo de la evolucin de ambas secuencias a
partir de un ancestro comn. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparacin de
secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Bsica de Bsqueda por Alineamiento Local). Este algoritmo est basado en la comparacin de similitudes
de nucletidos o aminocidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de bsqueda
(query) y cada una de las secuencias de la base de datos; para protenas, la longitud de las secuencias comparadas es de tres aminocidos y para nucletidos la longitud mnima es de 11.
Cuando el algoritmo encuentra regiones idnticas o similares, ampla la bsqueda en regiones
contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y
evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucletidos o aminocidos entre las secuencias. Al seleccionar en la pgina de entrada la opcin blast, aparecer una
ventana con la siguiente informacin:
En esta pgina se selecciona nucleotide blast para realizar la bsqueda con una secuencia de
nucletidos.
Aparecer una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anteriormente. Ms abajo, en seleccin de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar
sequences [blast n]) para permitir una bsqueda amplia.
Entre los parmetros opcionales ms importantes del algoritmo figuran:
Expect threshold: Nmero de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de
Expect con elevada significacin estadstica: 0.000001 = (1 x 10-6)).
Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias
relacionadas.
37
//
841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg

901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa
961 aaaaa
Filter: Elimina secuencias con baja complejidad composicional, por ejemplo:

AAAAAAAAAA.., TATATATATAT., AGAGAGAGAG.
Pulsar la tecla Blast, con lo cual el programa buscar en la bases de datos las secuencias
que muestren identidad total o parcial, segn se mencion antes. El resultado de la bsqueda
aparecer en el siguiente formato:
38
Las barras horizontales indican las secuencias con mayor ndice de similitud con la secuencia
de bsqueda, expresado esto como el valor de Score (puntuacin), que va en decremento desde la lnea superior a la inferior en funcin de los valores de puntuacin sealados: < 40 hasta
> 200. Al colocar el cursor sobre una lnea determinada aparecer en la pantalla la secuencia
correspondiente.
Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas, se selecciona en la ventana previa
slo la base de datos de humano, se puede obtener una visin cromosmica de las ubicaciones de las secuencias obtenidas con la opcin Human genome view y el programa desplegar
una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma, tal
como se observa en la siguiente ventana:
Chromosome view hsp10 human
2. Comparacin de secuencias
La base de datos del ncbi tambin da la opcin de llevar a cabo bsquedas de secuencias
relacionadas con la de inters en muy diversos genomas totalmente secuenciados, tanto procariontes como eucariontes, lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir relaciones filogenticas entre diversos organismos. Un ejemplo de lo anterior lo representa la
recuperacin de la secuencia homloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chimpanc; en la pantalla siguiente se muestra el formato de la ventana configurada en la opcin
Blast (Blast Home), listando una pequea muestra de los genomas secuenciados hasta la fecha con la opcin Blast Assembled RefSeq Genomes:
BLAST Assembled Genomes
Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases
Human
Mouse
Rat
Arabidopsis thaliana
Oryza sativa
Bos taurus
Danio rerio
Drosophila melanogaster
Gallus gallus
Pan troglodytes
Microbes
Apis mellifera
Tambin con la opcin list all Genomic Blast databases se tendr acceso a las bases de datos
de todos los genomas secuenciados hasta la fecha.
Si se selecciona el genoma del chimpanc (Pan troglodytes) para buscar en l la secuencia
del gen de inters, -Hsp10-, y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia
39
de Hsp10 en el cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opcin Begin Search (comenzar la bsqueda), el programa dar por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia
del gen de Hsp10 humano y las secuencias homlogas de Hsp10 en el genoma del chimpanc.
La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro:
40
Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos
secuencias en este caso de 93%, el valor de Expect, probabilidad de alineamientos al azar
entre dos secuencias no relacionadas, que en este caso es del orden de 1 x 10-6 y en donde no
hay lnea, las sustituciones que han ocurrido en estas protenas desde el tiempo de divergencia entre las dos especies.
Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminocidos, un recurso bioinformtico muy til es UniProt, el cual es una base de datos combinada de tres depositorios internacionales de secuencias de protenas, PIR, SwissProt y TrEMBL; el sitio Web es <http://www.
uniprot.org/>. Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la
casilla de bsqueda (QUERY), se obtendr el siguiente resultado:
La primera entrada corresponde a la protena de humano. Al dar un clic en esa entrada se

obtiene toda la informacin disponible sobre dicha proteina, incluyendo la secuencia de aminocidos:
Esta secuencia corresponde a la de 102 aminocidos de Hsp10; una vez recuperada, la secuencia se copia en formato FASTA y se lleva a cabo una nueva bsqueda de su secuencia homloga
en diversos organismos, de manera similar a como se realiz con la secuencia del gen. La base
de datos de UniProt tambin cuenta con el recurso bioinformtico del blast, as que se puede
conducir una bsqueda entre secuencias de protenas utilizando el algoritmo blast.
El programa realiza bsquedas de similitud entre protenas de todos los organismos que
estn en las bases de datos. En el siguiente ejemplo, la bsqueda mediante blast produjo los
alineamientos entre las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de diversas especies, saliendo
primero los de mamfero; se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de Hsp10
humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo, Q6WSP6:
41
42
En este ejemplo, el programa blast recuper y aline las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10
de cerdo (Sus scrofa) que muestran una identidad de 100%.
Discusin de resultados
Puntos a discutir:
a)
b)
c)
d)
Explicar cul es el mtodo de bsqueda del algoritmo blast.

Analizar, desde el punto de vista estadstico, por qu se deben filtrar las secuencias
de baja complejidad.
Sealar cul es el significado estadstico del valor de Expect en el programa bioinformtico Blast.
Discutir el impacto de la bioinformtica en la biologa.
Los alumnos presentarn un informe sobre el desarrollo de la sesin que incluya la discusin
de los incisos a), b), c), y d).
Bibliografa
Burks, C., et al. (1990), GenBanK: Current status and future directions, Methods in enzimology
vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic
Acid Sequences, Academic Press, Inc.
Collado, J. y A. Medrano (2003), La biologa computacional antes, durante y despus de los
genomas, Fronteras de la biologa en los inicios del siglo Xxi. Mdulo 1: Genmica, protemica y bioinformtica. Bolvar F. (coord.), El Colegio Nacional, Mxico.
Collins, J. y A. Coulson (1990), Significance of protein sequence similaritie, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Proteinand
Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc.
Dolittle, R. (1990), Searching through sequence databases, Methods in Enzimology vol. 183,
R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc.
Mount, D. (2004), Bioinformatics. Sequence and genome anlisis, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Second Edition, N.Y.
Prctica 6
43
Introduccin
El oxgeno es una molcula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a diversos agentes qumicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxgeno (Ros,
por sus siglas en ingls). Estas formas de oxgeno son altamente dainas para los componentes celulares, incluyendo a los cidos nucleicos, los lpidos y las protenas. Adems de estas molculas muy reactivas, tanto el perxido de hidrgeno (H2O2) como el anin superxido (O2-),
son incluidos tambin como ros, ya que llevan a la produccin de ms especies reactivas, particularmente en presencia de iones metlicos. Las Ros se pueden generar endgenamente en
las clulas como consecuencia de los procesos metablicos. Tambin se forman por la exposicin de las clulas a agentes ionizantes, radiacin y recicladores redox presentes en el medio y
por la exposicin a metales pesados. As, todos los organismos aerbicos estn expuestos continuamente al ataque de agentes oxidantes a travs de estos mecanismos. El estrs oxidativo
ocurre cuando la concentracin de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad
amortiguadora antioxidante de la clula. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que
todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares
contra estos oxidantes altamente reactivos.
Para defenderse contra estas especies reactivas de oxgeno las clulas contienen enzimas
antioxidantes, como la superxido dismutasa, las catalasas y varias peroxidasas, adems de
que tambin producen molculas antioxidantes como el ascorbato, el tocoferol y el glutatin.
Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxificacin
de los metabolitos de oxgeno generados en los diversos procesos celulares:
2 H2O2
O2 + 2 H2O
La ingeniera gentica es la tcnica que se utiliza con el fin de cambiar alguna o algunas caractersticas del cdigo gentico. Estos cambios pueden consistir en retirar, modificar o agregar
genes al dna de un organismo. Al modificar esta informacin, la ingeniera gentica cambia el
tipo o cantidad de protenas que puede producir un organismo, con lo cual hace posible que
ste elabore sustancias nuevas o desempee funciones distintas.
En esta prctica se utilizarn dos cepas que han sido genticamente manipuladas y su
cepa parental, con el fin de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes puedan apreciar la diferencia en la expresin gentica entre una cepa silvestre y cepas genticamente alteradas, adems de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y
limitaciones de la manipulacin gentica.
Objetivo general
Identificar cmo a travs de la ingeniera gentica se puede alterar la expresin gentica de
los organismos.
Objetivo especfico
Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberacin de
oxgeno.
44
Material y equipo
Material
Equipo
Crculos de 3 cm de dimetro de papel filtro
Vrtex
Perlas de vidrio para romper
2 vasos de precipitados de 250 ml
Centrfuga
1 pipeta de 5 ml
Incubadora con agitacin
1 pipeta de 10 ml
Cronmetro
1 probeta de 1 00 ml
Cmara de video
1 probeta de 1,000 ml
Reactivos
2 tubos de cultivo de vidrio estriles
Tubos eppendorf de 1.5 ml
Tubos para centrfuga
Bao de hielo
Agua destilada
Pinza para papel filtro
Triptona
Extracto de levadura
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
NaOH
Ampicilina(50 mg/ml)
Hielo
* Perxido de hidrgeno (agua oxigenada, H2O2)
* Material que debern traer los alumnos
a
Reactivos para preparar medios de cultivo. La elaboracin de los medios de cultivo est en el anexo.
Material biolgico: cepas de Rhizobium etli

CFN42, cepa silvestre, contiene cromosoma y 6 plsmidos
CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del plsmido p42f complementada para
actividad de catalasa ++)
CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del psmido p42f, catalasa )
Metodologa
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Inocular las tres cepas (silvestre, catalasa- y catalasa+) cada una por separado en tubos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. Incubar
a 37 0C con agitacin constante (250 rpm) durante 12 hrs.
Centrifugar los cultivos tres minutos a 13,000 g.
Resuspender las pastillas en 200 l de PBS, aadir perlas de vidrio cubriendo hasta
del lquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vrtex.
Centrifugar a 13,000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo.
En este momento preparar 400 ml de una solucin al 1% de H202 en agua destilada
y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio.
Empapar los crculos de papel filtro con el sobrenadante de cada cepa, tener cuidado
de marcar antes con lpiz cada uno de los crculos. Tener lista la cmara y el cronmetro.
Cada uno de los crculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan
en la solucin de H2O2 depositndolos hasta al fondo del vaso.
Se observa durante cinco minutos.
Resultados
1.
2.
3.
4.
5.
De acuerdo con los resultados, discutir los siguientes puntos:

En qu vaso se formaron ms burbujas? En cul vaso no se formaron? Por qu?
Por qu se forman estas burbujas?
Las burbujas se generaran de la misma forma con otro reactivo?
Qu aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa?
Agradecimientos
Se agradece al Dr. Alejandro Garca de los Santos del Centro de Ciencias Genmicas por permitirnos utilizar sus cepas.
Bibliografa
Daz, A. (2003), La estructura de las catalasas, REB 22 (2): 76-84.
Luque, J. y A. Herrez (2001), Biologa molecular e ingeniera gentica, Harcourt.
45
Anlisis de la actividad de Catalasas | prctica 6
1.
46
Prctica 7
Sntesis de celulosa bacteriana

de Gluconacetobacter xylinum
para aplicaciones biotecnolgicas
47
Introduccin
La celulosa es el polmero de mayor abundancia natural, conformado por una larga cadena
lineal de molculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace 14, ver figura).
Estructura lineal de la celulosa.
Diversas especies dentro de los gneros Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen
celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de sntesis.
Al estudiar la fermentacin de vinagre se observ que se formaba una masa gelatinosa
sobre la superficie del medio de cultivo a la que se denomin madre del vinagre. Anlisis posteriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium
aceti era el organismo responsable de su produccin.
Posteriormente, la bacteria fue referida como Acetobacterium xylinum Bacterium xylinodes; el nombre deriv a Acetobacter xylinum y finalmente la denominacin actual de esta
bacteria es Gluconacetobacter xylinum.
G. xylinum es un miembro de la familia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negativa con forma de bacilo cuyo tamao vara entre 0.6 0.8 m x 1.0 1.4 m. Es un microorganismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en forma incompleta azcares
y alcoholes fermentacin oxignica. Su hbitat natural son frutas y vegetales en proceso
de descomposicin.
En cultivo esttico, la bacteria secreta microfibrillas de celulosa, las cuales en el exterior
se ensamblan formando una nata gruesa o pelcula. Se ha propuesto que la celulosa permite
a las clulas alcanzar la superficie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de
O2 para su crecimiento.
48
La pelcula de celulosa posee funciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su

capacidad para colonizar sustratos, evita la desecacin y protege a la bacteria contra la radiacin ultravioleta.
La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la
celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en condiciones de cultivo esttico se genera una pelcula en la interfase aire/lquido mientras que
en cultivo agitado se forman grnulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de celulosa.
El mecanismo de sntesis de celulosa bacteriana le confiere una pureza superior a la de la
celulosa vegetal y posee caractersticas peculiares: alto grado de cristalizacin, alta resistencia
a la presin, elasticidad y durabilidad, elevada absorcin de agua y mayor rea superficial que
la que presenta la celulosa vegetal. Adems, es inerte metablicamente, no es txica ni provoca reaccin alrgica al contacto, propiedades de particular importancia para fines biomdicos
y cosmticos.
G. xylinum no lleva a cabo gluclisis (carece de la enzima fosfofructocinasa-1), pero en
cambio a partir de triosas fosfato realiza gluconeognesis; la ruta de las pentosas fosfato y el
ciclo de Krebs son las vas anfiblicas ms activas en la bacteria. Mediante estas vas se produce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas fosfato (glucosa, fructosa, manosa) como
por sntesis a travs de la va gluconeognica.
La sntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energa y
fuente de carbono; sin embargo, la pelcula permite a G. xylinum situarse cerca de la superficie
del medio y obtener as un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al oxgeno, indispensable para la sntesis de Atp.
Aplicaciones biotecnolgicas
La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades nicas que no estn presentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningn
otro material comn en la celulosa de otras fuentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de
hidrofilicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se
ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta fuerza
tensil y resistencia a la presin; es inerte metablicamente y no tiene propiedades alergnicas;
estas ltimas caractersticas le permiten una variedad de aplicaciones en la industria cosmtica, farmacutica y biomdica (ver cuadro).
Industria
Aplicaciones
Turstica
Ropa deportiva, equipo para acampar.
Textil
Material de alta absorcin acuosa.
Papel
Restauracin de documentos, papel de alta calidad.
Alimentos
Aditivo de alimentos, emulsificante, fibra diettica.
Refinera
Material para la absorcin de aceites.
Maquiladora
Componente de partes y refacciones para autos, aviones, etc.
Tecnologa
Diafragmas de alta sensibilidad en micrfonos y audfonos.
Investigacin
Inmovilizacin de protenas y clulas, resinas para cromatografa.
Mdica
Fabricacin de piel artificial en terapia de quemaduras. Componente en implantes

dentales.
Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano.
Objetivo general
Que el alumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza.

Demostrar las aplicaciones biotecnolgicas industriales de los productos del metabolismo bacteriano.
Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la produccin de la celulosa
bacteriana vs la celulosa vegetal.
Material y equipo
49
Material
Equipo
200 ml de medio BEGG
Potencimetro
1 matraz Erlenmeyer de 500 ml
Balanza analtica
Pipeta serolgica de 5 ml
Horno (opcional)
* Caja Petri (estril)
Pinza (estril)
* Recipiente para colocar la pelcula de celulosa en NaOH
Papel aluminio
1 bistur (con navaja estril)

50 ml de NaOH 0.5 M
* Algodn y gasas para elaborar un tapn
*Material que debern traer los alumnos.
Metodologa
Inocular G. xylinum cultivada por el profesor durante una semana anterior a la fecha de la
prctica a una temperatura ~ 30C. Para inocular se utilizar un fragmento de la pelcula de
celulosa formada en el cultivo esttico, ya que G. xylinum crece en la matriz de la pelcula de
celulosa en estas condiciones. Para hacer ms fcil la inoculacin de G. xylinum, se sugiere que
en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar o cerca del mechero) se coloque, con
la ayuda de unas pinzas, la pelcula de celulosa formada en una caja de Petri vaca y una sola
persona corte cinco fragmentos con el bistur; cada equipo inocular su respectivo matraz con
un fragmento de celulosa.
Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es
importante no mover estos matraces para evitar que la pelcula de celulosa se hunda).
Sntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnolgicas | prctica 7
Resultados
Transcurrido el tiempo, se obtiene la pelcula de celulosa. Determinar el peso hmedo y el pH
final del medio de cultivo.
La pelcula de celulosa se coloca en NaOH O.5 M por 30 min. a 100 C, con el fin de blanquearla; posteriormente, se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente
para determinar su peso seco. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a temperatura ambiente por varios das.
El alumno reportar el rendimiento de celulosa tanto en peso hmedo como seco. Tambin debe reportar, con base en este rendimiento, cul es el porcentaje de humedad que retiene la pelcula de celulosa.
50
Agradecimientos
Se agradece al Dr. Jos Edgardo Escamilla Marvn, investigador del Instituto de Fisiologa Celular de la unam por la donacin de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693.
Bibliografa
Brown, A.J. (1886), On acetic ferment which forms cellulose J. Chem. Soc. 49: 432-439.
Englehardt, J. (1995), Sources, industrial derivatives, and commercial applications of cellulose, Carbohydr. Eur, 12: 514.
Ross, P., R. Mayer y M. Benziman (1991), Cellulose biosynthesis and function in bacteria, Microbiol 55: 35-58.
Yamanaka, S. y K. Watanabe (1994), Applications of bacterial cellulose in cellulosic polymers,
Chapter 11, Gilbert, R. (ed.), Hanser Publishers Inc, Cincinnati, OH.
Yamanaka, S. y K. Watanabe, N. Kitamura y M. Iguchi (1989), The structure and mechanical
properties of sheets prepared from bacterial cellulose, J. Mater. Sci. 24: 3141-3145.
Prctica 8
Emulsificacin de diesel, gasolina

y aceite de maz por Pseudomonas
aeruginosa y Serratia marcenses
Introduccin
Los ramnolpidos son molculas tensoactivas que actan como biosurfactantes. La funcin
principal de los biosurfactantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmiscibles en agua a travs de la reduccin de la tensin superficial. Los ramnolpidos estn formados por una molcula hidrofbica que generalmente es un dmero de cido -hidroxidecanoico y una parte hidroflica constituida por una (monorramnolpido) o dos (dirramnolpido),
molculas de ramnosa. En particular, los ramnolpidos producidos por P. aeruginosa han sido
estudiados para su aplicacin en distintas reas, que incluyen la detoxificacin de suelos contaminados con petrleo, la eliminacin de metales txicos de suelos, recuperacin terciaria
de petrleo, proteccin contra plagas, as como en la industria cosmtica y farmacutica. Son
tambin una fuente importante de L-ramnosa, que es usada en qumica fina y como materia
prima para la sntesis de compuestos orgnicos.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede proliferar en diversos hbitats, incluyendo agua, suelo y plantas. Esta bacteria secreta numerosos compuestos que
se encuentran involucrados en el xito de colonizar diferentes ambientes. Dentro del gnero
Pseudomonas, solo P. fluorescens (viscocina) y P. aeruginosa tienen la capacidad de producir
biosurfactantes llamados ramnolpidos. Los factores de virulencia son expresados de una manera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora
de qurum (Qs).
Aunque la funcin fisiolgica de los ramnolpidos en P. aeruginosa no ha sido completamente establecida, se les ha considerado como factores de virulencia y antimicrobianos y se
les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregacin de las biopelculas,
as como en la movilidad tipo swarming de esta bacteria.
La sntesis de ramnolpidos se lleva a cabo por la ramnosiltranferasa I (Rt 1), codificada por
el opern rhlAB; rhlA produce el dmero de cidos grasos (HAAs), el papel de RhlB es el de transferir una molcula de dTDP-L-ramnosaal dmero de HAAs. La ramnosiltranferasa II (Rt 2), toma
una segunda molcula de dTDP-L-ramnosa. La produccin de ramnolpidos por P. aeruginosa
depende de factores nutricionales y medioambientales, como la limitacin de nitrgeno, el pH,
y la temperatura. La biosntesis de ramnolpidos ocurre durante la fase exponencial tarda y la
fase estacionaria de crecimiento, bajo condiciones de limitacin de nitrgeno o de fosfatos.
51
Objetivo
Evaluar la emulsificacin del diesel y del aceite de maz por las cepas Pseudomonas aeruginosa,
Serratia marcenses y Escherichia coli.
Material y equipo
Material
Equipo
4 matraces Erlenmeyer de 125 ml
Incubadora a 30 C
Tubos para centrfuga
52
Incubadora a 37 C
1 gradilla
Centrfuga
12 tubos con tapa de 15 ml
Vrtex
Pipetas de 10 ml
Reactivos
* Papel peridico
Medio PPGAS
* Regla
Medio PG
Tritn X-100
*10 ml de gasolina
*10 ml de diesel
*10 ml de aceite de maz
Metodologa
Obtencin de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia
marcenses.
1. Inocular, en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS, una colonia
fresca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio inocular una colonia de Escherichia coli, e incubar ambos matraces a 37 C con agitacin
de 200 rpm durante 24 horas. Al mismo tiempo, inocular en otro matraz Erlenmeyer
de 125 ml con 50 ml de medio PG, una colonia fresca de la cepa Serratia marcenses, e
incubar a 30 C con agitacin de 200 rpm durante 24 horas.
2. Transferir los cultivos crecidos a tubos para centrfuga. Centrifugar a 4 000 rpm por
diez minutos y guardar el sobrenadante (fuente de biosurfactantes) a 4 C.
3. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos.
Prueba de emulsificacin.
1. Cubrir la mesa de trabajo con papel peridico antes de comenzar.
2. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye, 3 ml de gasolina a c/u de los
otros tres tubos, 3 ml de aceite de maz a c/u de los tres tubos y a un ltimo se le
colocan 3 ml de tritn, que ser utilizado como blanco de reaccin. Los tubos deben
etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. aeruginosa Diesel, y as los dems
tubos), PaG, PaA, PaT, SmD, SmG, SmA, SmT, EcD, EcG,EcA y EcT. Agregar 2 ml del
sobrenadante de cada cepa a evaluar; los que estn marcados con Pa corresponden
al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa, mientras que los que llevan las letras
Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con
las letras Ec corresponden al sobrenadante de Escherichia coli, de acuerdo con la

siguiente tabla:
Gasolina
Aceite de
maz
Tritn
Sobrenadante
P. aeruginosa
Sobrenadante
S.marcenses
Sobrenadante
E.coli
3 ml
2 ml
PaG
3 ml
2 ml
PaA
3 ml
2 ml
PaT
3 ml
2 ml
SmD
3 ml
2 ml
SmG
3 ml
2 ml
SmA
3 ml
2 ml
SmT
3 ml
2 ml
EcD
3 ml
2 ml
EcG
3 ml
2 ml
EcA
3 ml
2 ml
EcT
3 ml
2 ml
3.
Agitar en el vrtex cada tubo a velocidad mxima durante dos minutos y dejar reposar 30 minutos, hasta que se forme una nata blanca que es el indicador de emulsificacin.
Resultados
Cada equipo deber determinar los mililitros de nata que se forman en cada tubo y obtener
el porcentaje de emulsificacin, con base en la siguiente apreciacin: si la nata blanca que se
forma es de 5 ml y existe una sola fase, el porcentaje de emulsificacin es del 100%; en caso de
que la nata formada sea de menor volumen y coexistan dos fases se deber hacer una relacin
con una regla de proporciones.
Anotar el porcentaje (%) de emulsificacin en la siguiente tabla:
Diesel
Gasolina
Aceite de maz
Tritn X-100
P. aeruginosa
S. marcenses
E. coli
En el pizarrn se anotarn los resultados de todos los equipos y con stos se obtendr el promedio y la desviacin estndar de cada muestra.
53
Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses | prctica 8
PaD
Diesel
Bibliografa
54
De Kievit, T.R., R. Gillis, S. Marx, C. Brown y B.H. Iglewski (2001), Quorum-sensing genes in
Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and their expression patterns, Appl. Environ.
Microbiol. 67: 1865-1873.
Maier, R.M. y G. Sobern-Chvez (2000), Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis
and potential applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633.
Medina, G., K. Jurez, B. Valderrama y G. Sobern-Chvez (2003), Mechanism of Pseudomonas
aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter, J. Bacteriol 185: 59765983.
Medina, G., K. Jurez y G. Sobern-Chvez (2003), The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon
is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of its activator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone, J. Bacteriol. 185: 377-380.
Sobern-Chvez, G., F. Lpine y E. Dziel (2005), Production of rhamnolipids by Pseudomonas
aeruginosa, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:718-725.
Prctica 9
Introduccin
A medida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminocidos,
protenas, carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos, cidos carboxlicos, a travs de las mismas o
similares vas de biosntesis, de manera paralela, se originan tambin otro tipo de compuestos
que de acuerdo con sus caractersticas particulares y especficas se denominan compuestos o
metabolitos secundarios.
Las vas estn interrelacionadas con el metabolismo primario; ste provee un cierto nmero de pequeas molculas que son empleadas como precursores de todas las vas metablicas secundarias importantes. Existen tres precursores principales:
1.
El cido shikmico, precursor de muchos compuestos aromticos, incluyendo los

aminocidos aromticos, los cidos cinmicos y ciertos polifenoles.
2. Los aminocidos que dan origen a los alcaloides y a los antibiticos peptdicos incluyendo las penicilinas y las cefalosporinas.
3. El acetato, precursor de los poliacetilenos, las prostaglandinas, antibiticos macrocclicos, polifenoles e isoprenoides.
Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuentran los alcaloides, terpenos, glucsidos, flavonoides, fenoles, etc., por mencionar los principales y ms comunes. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal;
por su abundancia o ausencia, proporcionan a la planta caractersticas qumicas tiles para su
sobrevivencia, su clasificacin botnica y su aprovechamiento por parte del hombre, y como
principios activos que pueden presentar alguna actividad biolgica para un gran nmero de
organismos, an de diferentes reinos.
Las pruebas especficas para la determinacin de grupos de metabolitos secundarios se
llevan a cabo con un extracto de planta y a travs de las tcnicas colorimtricas y de precipitacin reportadas por Domnguez. Se identifica cualitativamente la presencia o ausencia de
cada uno de los grupos segn el cambio de coloracin o la precipitacin:

Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard.

Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff.
Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda.
Glucsidos: se determinan mediante la prueba de Mlish.
55
Objetivos

Que el alumno determine, a travs de pruebas qumicas preliminares la presencia de

grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexnico de hoja de planta.
Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli.
Material y equipo
Material
Equipo
* 2 frascos Gerber
* Alcohol de curacin (para elaborar el extracto)
56
3 goteros
Vrtex
Parte I
1 esptula
Propipeta

4 pipetas serolgicas de 5 ml
Cloroformo
5 tubos de ensaye
cido clorhdrico
Esptula
Draguendorff
1 vaso de precipitados de 500 ml para el bao

de agua hielo
cido sulfrico
Metanol
Mlish
Liebermann-Burchard
Viruta de Mg
Material biolgico
*a Extracto de planta
Parte II
Material
Equipo
* 3 cajas de Petri
Mechero
Perlas estriles para espatular
Sensi-discos o papel filtro (1 cm dimetro)
Incubadora a 37 oC
Pinzas
Reactivos
* Regla o Vernier
Agar nutritivo
Violeta de genciana
Hexano
Material biolgico
Cepa de Escherichia coli GM2163, cultivada en LB entre
8-24 horas previo a la prctica
*a Extracto de planta
Preparacin del extracto:

Una semana antes de llevar a cabo la prctica, colocar clavo entero (especia), hasta aproximadamente de volumen de un frasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del frasco con
etanol al 70%; tapar y dejar macerar. El da anterior a que se lleve a cabo la prctica, tomar ~ 10
ml del extracto lquido y transferir a otro frasco Gerber limpio. Dejar destapado para evaporar
el etanol. Una vez reducido el volumen, tapar y llevar ambos frascos a la clase.
a
Metodologa
Esta prctica se lleva a cabo en dos partes, en la primera se determinarn los grupos de metabolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinar la actividad
biolgica del extracto mediante un ensayo biolgico con bacterias.
Parte I. Determinacin de los grupos de metabolitos secundarios
1. Se prepara una solucin madre del extracto y se toma 1 ml colocndolo en un tubo
de ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de
ensaye).
2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo:

Tubo 1. Control. Slo se agrega 1ml del extracto.

Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado, se agita
un minuto y se deja reposar, si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. A la
fase inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera positiva la prueba si se observa un cambio de coloracin al azul-verdoso o rojo-naranja.

Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le aade una gota de cido clorhdrico
concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. La prueba se considera positiva
si se observa un precipitado de color naranja-marrn.

Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (24
mm) y dos gotas de cido clorhdrico concentrado, si se observa un cambio de coloracin hacia el verde o naranja la prueba se considerar positiva.

Tubo 5. Glucsidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; despus, se le
agregan dos gotas de Mlish. Se coloca el tubo en un bao aguahielo y se aade 1
ml de H2SO4 concentrado dejando que ste se deslice por las paredes del tubo de ensaye formando as una interfase. Se toma lectura de la coloracin del anillo formado
en la interfase, se considera la prueba positiva si se observa un color violeta.
3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales, de acuerdo al
viraje o precipitado segn la prueba.
Parte II. Determinacin de la actividad biolgica de un extracto de planta
1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua
purificada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolucin y esterilizar
en autoclave a 121 0C a 15 lb de presin por 15 minutos. Dejar enfriar a 45 50 0C.
2. Vaciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar.
3. Distribuir, con perlas estriles, 0.2 ml de cultivo lquido de Escherichia coli GM2163.
4. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del
frasco 1 (20, 40, 60 y 80 ml) y uno ms que ser el control positivo, que se impregnar
con 20 ml de violeta de genciana. Realizar el ensayo por triplicado.
5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja,
para que se evapore el solvente.
Metabolismo secundario | prctica 9
57
6.
Distribuir los cinco discos por caja, separndolos de manera que se alejen lo ms
posible entre ellos y del borde de la caja (ver figura).
Distribucin de los discos
58
7.
8.
9.
Incubar las cajas por 24 horas a 37 C.

Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriosttica, esto es, presencia de un halo de inhibicin alrededor de los filtros, con una densidad
celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a
la inhibicin parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibicin total de
crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente.
Medir con una regla o Vernier el dimetro de los halos
Resultados
Para las pruebas colorimtricas y de precipitacin, completar la tabla siguiente y asignar valores (+), (++), (+++) y (++++) segn la intensidad de la reaccin y (-) para aqullas en las que no
se observa reaccin.
Grupo qumico
Intensidad
Terpenos
Alcaloides
Glucsidos
Flavonoides
Para el ensayo con E. coli, elaborar una tabla como la indicada abajo, en donde se especifique
el dimetro de los halos, indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida.
Caja
1
2
3
4
5
20l
40 l
60 l
80 l
Dimetro del halo (mm)
Graficar el promedio de los halos por la cantidad de extracto en una grfica de lnea:
40
60
80
extracto (l)
Discusin
1.
2.
3.
De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimtricas y de precipitacin, analizar los valores asignados (+) segn la intensidad de la reaccin y determinar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios.
Para el bioensayo con E. coli, analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibicin
en cada una de las concentraciones y de qu tipo principalmente (bacteriosttico o
bactericida).
En la grfica, al observar la media del dimetro de los halos de inhibicin, analizar
si la actividad biolgica (bacteriosttica o bactericida) depende de la cantidad de
extracto.
Bibliografa
Anaya, L. A. L. (2003), Ecologa qumica, Instituto de Ecologa, unam/ Plaza y Valds, Mxico.
Domnguez, X. A. (1988), Mtodos de investigacin fotoqumica, Limusa, Mxico.
Romeo, J. T. (2004), Secondary metabolism in model systems, Elsevier, Amsterdam.
Hui, Y. H. (2008), Food drying science and technology: microbiology, chemistry applications, Lancaster Pennsylvania.
59
Metabolismo secundario | prctica 9
20
Prctica 10
Degradacin de compuestos
xenobiticos a travs
de actividades enzimticas
Introduccin
La biorremediacin es el proceso que se ocupa de la utilizacin de sistemas biolgicos para
degradar compuestos txicos, contaminantes y sustancias de importancia ambiental (denominados genricamente compuestos xenobiticos) en suelos, aguas y aire, generando compuestos de menor o ningn impacto ambiental, o bien aislando la sustancia txica.
Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza entonces se denomina atenuacin natural sin embargo, la velocidad de tales cambios es
baja. Mediante una adecuada manipulacin, los sistemas biolgicos pueden ser optimizados
para aumentar la velocidad de cambio o degradacin para que puedan ser usados en sitios con
una elevada concentracin de contaminantes.
Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediacin: pesticidas, herbicidas, petrleo y sus hidrocarburos derivados, gasolinas y metales pesados, entre otros.
Entre los sistemas ms interesantes para la biorremediacin se encuentran los hongos
ligninolticos. Estos organismos degradan la madera a travs de un conjunto de enzimas oxidasas poco especficas que pueden usar como sustrato un sinnmero de compuestos xenobiticos. Entre estas enzimas, las lacasas han sido ms estudiadas ya que son enzimas robustas y con un amplio rango de sustratos. Las lacasas pertenecen al grupo de las fenol oxidasas y
contienen cuatro tomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reacciones de xido reduccin.
En esta prctica se harn ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas
en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolticos, as como su determinacin
por mtodos colorimtricos.
Objetivo general
Determinar la actividad enzimtica de lacasas y relacionarla con su funcin como agentes de
biorremediacin.

Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolticos en presencia

de petrleo.
Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior.
61
Parte I. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes a petrleo

Material y equipo
Material
Reactivos
1 mechero
Petrleo crudo Maya
2 vasos de precipitados de 1,000 ml
K2HPO4
1 probeta de 1,000 ml
MgSO47H2O
3 matraces Erlenmeyer de 1,000 ml
Lecitina de soya
Bistur
KCl
* 24 cajas Petri de 45 mm de dimetro
Agar
* Frasco de vidrio de boca ancha de 500 ml (previa- ABTS (2,2-azinobis 3 etilbenzotiazolina-6-cido

mente esterilizado) (de caf Oro)
sulfnico)
* Papel aluminio
62
Carbonato de calcio
* Jugo V8
Equipo
Autoclave
Incubadora
Cmara fotogrfica
Balanza

Material biolgico
Cepa de hongo resistente a petrleo
Cepa de hongo no resistente a petrleo
Metodologa
Preparacin del medio V8 + petrleo crudo Maya y crecimiento de hongos
1.
En un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuacin:

Reactivo
Por litro de volumen final
Jugo V8
180 ml
CaCo3
2.0 g
Agar
20 g
Composicin del medio V8

2.
3.
Aforar a 1,000 ml y dividir en dos matraces con 500 ml c/u. A uno de ellos se le agrega lecitina de soya (0.25% p/v). Esterilizar ambos matraces durante 15-20 min a una
temperatura de 120 C y 1 atm de presin.
Al salir de la autoclave y mientras sigue caliente el medio que contiene lecitina de
soya, se vaca en el frasco de vidrio de boca ancha y se agrega 20 g de petrleo crudo
Maya, para una concentracin final de 200 000 partes por milln (ppm). Agitar vigorosamente hasta alcanzar un mezclado homogneo.
4.
5.
6.
Se vacan ~ 10 ml de medio con petrleo en cada caja Petri (45 mm de dimetro) y lo

mismo del medio sin petrleo.
Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un fragmento de 44
mm de la caja original, inoculando por triplicado en las cajas V8 con y sin petrleo
bajo condiciones de esterilidad.
Los hongos se dejan crecer 30 das a temperatura ambiente y se observa el resultado.
Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarn los hongos tolerantes y no tolerantes
cultivados en medio V8 de esta primera parte de la prctica.
Resultados
Anotar las observaciones, teniendo en cuenta los siguientes puntos:

1. Qu mecanismos son los responsables de comportamientos diferentes en los hongos bajo estas condiciones?
2. Qu efectos tendr el petrleo en los organismos vivos?
Parte II. Actividad enzimtica
Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos
compuestos, entre estas enzimas se encuentran las lacasas, que estn involucradas en la
transformacin de una amplia variedad de compuestos fenlicos.
Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninoltica de estos hongos a travs de
un ensayo colorimtrico, en donde un sustrato es oxidado (cambiar el color del sustrato como
indicador) en presencia de la enzima lacasa.
Material y equipo
1. Preparacin del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modificado de Olsson, 2001.

Composicin del medio mineral 20X (stock 1 L):
Reactivo
K2HPO4
2g
MgSO47H2O
2g
KCl
2g
En un vaso de precipitados, preparar:

Reactivo
Stock medio
mineral 20X
50 ml
ABTS [1mM]
0.5487 g
Agar
20 g
63
Degradacin de compuestos xenobiticos a travs de actividades enzimticas | prctica 10
La cepa del hongo tolerante a petrleo deber crecer de manera similar a la condicin control,
mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notar afectado.
Nota: Este medio es slo para la determinacin de actividad, la abundancia del hongo no es
relevante.
2.
3.
64
Aforar a 1 litro con agua destilada. Transferir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar

durante 1520 min. a una temperatura de 120 oC y 1 atm de presin. Vaciar 10 ml de
medio en cada caja Petri (45 mm de dimetro). Colocar a 4 oC en oscuridad (envolver
con papel aluminio).
Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio V8 y se cortan
en cuadros de 1 cm2; se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. Se incuban
durante una semana a 28 oC. en ausencia de luz, cubriendo las cajas con papel aluminio. El ensayo se lleva a cabo por triplicado.
Resultados
El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloracin a verde o
azul oscuro, por lo que la cepa del hongo tolerante a petrleo deber hidrolizar al ABTS, mientras que la cepa no tolerante no tendr reaccin alguna.
De acuerdo con lo observado, responder:
1. Qu relacin tiene el ABTS con el petrleo?
2. Por qu cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa?
Bibliografa
Baldrian P. (2006), Fungal laccases - occurrence and properties, FEMS Microbiol 30: 215-242.
Field, J.A., E. De Jong, G. Feijoo-Costa, y J.A.M. De Bont (1993), Screening for ligninolytic fungi
applicable to the biodegradation of xenobiotics. Trends Biotechnol 11: 44-49.
Rojas-Avelizapa, N., E. Olvera-Barrera y L. Fernndez-Linares (2005), Feasibility study of bioremediation of a drilling-waste-polluted soil: Stimulation of microbial activities and hydrocarbon removal. Journal of environmental science and health, Part A, Toxic/hazardous
substances & environmental engineering 40: 2189-2201.
Margesin, R., A. Zimmerbauer y F. Schinner (2000), Monitoring of bioremediation by soil biological activities, Chemosphere 40: 339-346.
Cultivo de tejidos
vegetales
Se conoce como cultivo de clulas vegetales a una serie de tcnicas encaminadas a conseguir
la reproduccin de clulas, tejidos u rganos de una planta bajo condiciones controladas y
aspticas. Mediante el empleo de estas estrategias se puede reproducir una gran cantidad
de plantas completas, en poco tiempo y espacio, a partir de pequeas porciones de una sola
planta.
La reproduccin de plantas in vitro puede darse por dos rutas: organognesis y embrio
gnesis somtica. En la organognesis las plantas se reproducen por formacin secuencial de
rganos vegetales. Primero tallo y hojas y despus races. La embriognesis somtica involucra
la formacin de pequeas semillas, llamadas embriones bipolares (porque tiene la capacidad
de dar origen a races y tallos), que pueden germinar y formar plantas completas.
Solo excepcionalmente es posible reproducir a una especie por las dos rutas, por lo general, una de estas tcnicas de propagacin in vitro es la elegida porque es ms eficiente que la
otra, o incluso porque es la nica que produce plantas completas y frtiles.
Pueden iniciarse cultivos a partir de hojas, tallos o races de plantas crecidas en suelo, pero
los mejores resultados en los cultivos de tejidos vegetales se obtienen cuando se emplean
como explantes tejidos de plantas que han sido germinadas in vitro en condiciones estriles.
Esto ocurre porque los tratamientos de desinfeccin pueden ser ms severos en semillas que
en rganos de las plantas, ya que las primeras cuentan con una o varias cubiertas que protegen a las clulas meristemticas del efecto de los agentes antispticos.
66
Prctica 11
Introduccin
La polucin de ambientes naturales con metales pesados es un problema muy complejo que
ha llevado a la bsqueda de estrategias menos costosas y ms efectivas que las utilizadas
hasta ahora para su control. La eliminacin biolgica de contaminantes de los ambientes naturales es sin lugar a duda la mejor alternativa disponible. Los contaminantes orgnicos como
el petrleo, aguas residuales, agrcolas y pesticidas son generalmente susceptibles a ser degradados por microorganismos; pero los contaminantes inorgnicos como los metales pesados,
nitratos, cianuros y los istopos radioactivos son ms difciles de tratar. Una posibilidad muy
promisoria de biorremediacin para elementos txicos se encuentra en el empleo de especies
vegetales para remover contaminantes de los ecosistemas.
La fitorremediacin es una tecnologa emergente que utiliza a plantas y a los microorganismos asociados a la rizsfera para remover, transformar o contener sustancias contaminantes localizadas en suelos, sedimentos, acuferos, cuerpos de agua superficiales e incluso en
la atmsfera. Las plantas son el grupo biolgico con las ms altas capacidades biosintticas
de la tierra, por lo cual pueden transformar y mineralizar una amplia variedad de complejos
orgnicos.
En el caso de los contaminantes orgnicos, la meta de la fitorremediacin es la mineralizacin de las sustancias hasta componentes no txicos (fitodegradacin o fitotransformacin). Los contaminantes elementales, que incluyen metales txicos y radio nucletidos, son
esencialmente inmutables a la accin enzimtica. Las plantas sin embargo pueden secuestrarlos y almacenarlos en sus tejidos (fitoextraccin y fitoacumulacin).
La eliminacin biolgica de contaminantes ambientales se lleva a cabo generalmente por
organismos que han logrado adaptarse a las condiciones particulares del sitio a tratar. Las
plantas silvestres que crecen en sitios contaminados con metales pesados pueden ser una
fuente muy importante de posibilidades para la biorremediacin. Uno de los grupos biolgicos ms resistentes a la presencia de contaminantes elementales son los helechos.
Pteridium aquilinum (L.) Kuhn es un helecho silvestre ampliamente distribuido en todo
el mundo. Es una especie helifila, pionera, que tiene propiedades alelopticas, fungicidas,
antibacterianas y cancergenas. Esta planta se encuentra como especie dominante en zonas
perturbadas o con una alta concentracin de cromo -el cromo hexavalente es un agente mutagnico y altamente cancergeno que tiene efectos adversos para la salud humana y animal,
lo cual sugiere su gran potencial como especie til para la fitorremediacin de suelos contaminados.
67
Objetivo general
Determinar la tolerancia a cromo VI de los gametofitos de Pteridium aquilinum.
1.
2.
3.
68
Probar el efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinacin de

esporas de Pteridium aquilinum.
Determinar cul es el efecto del cromo VI sobre el desarrollo de gametofitos y su
maduracin.
Probar el efecto del cromo sobre el desarrollo de esporofitos.
Material y equipo
Material
Equipo
Vrtex
Autoclave
Micropipeta de 1,000 l
Microcentrfuga
Mechero
Potencimetro
10 tapas para frascos Gerber
Balanza analtica
Puntas para micropipetas de 1,000 L estriles
Microtubos de 2 ml estriles
Incubadora de vegetales
Papel filtro estril
Microscopio estereoscpico
Embudo de cristal estril
Cmara digital
6 filtros Millipore con membrana de 0.22 m estriles Reactivos

* 1 paquete de cajas Petri de 10 cm de dimetro esMedio MS
triles
* 1 esptula delgada
Sacarosa
* 10 frascos Gerber grandes
Agar
* Papel aluminio
Dicromato de potasio
* 2 pinzas largas estriles
Alcohol etlico
* Un frasco de vidrio con algodn
* Cloro
* Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack
* Material que debern traer los alumnos.

Material biolgico
Esporas de Pteridium aquilinum
Metodologa
Los experimentos se llevarn a cabo empleando un medio de cultivo ms (Murashige y Skoog)
modificado se emplea solo la mitad de la concentracin de macronutrientes (ver anexo).
Se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizar en autoclave durante 20
minutos a 120 0C. El medio de cultivo se deja enfriar. Cuando llegue a 55 o 60 0C se agregarn diferentes concentraciones de dicromato de potasio (0, 25, 50, 100, 150, 200 m) esterilizado por
filtracin con membranas Millipore de 0.22 m (cada equipo probar uno de los tratamientos).
Germinacin de esporas in vitro
1. Se colocan 90 mg de esporas en un microtubo de 2 ml que contiene 1.5 ml de una
solucin de hipoclorito de sodio al 0.3%.
2. El tubo se agita vigorosamente durante dos minutos en un agitador Vrtex.
Nota: Es importante que la solucin de hipoclorito de sodio se prepare en el momento en
que va a usarse y que las esporas no permanezcan en la solucin un tiempo mayor
al indicado.
Se centrifuga el tubo en microcentrfuga durante un minuto a 14 000 rpm.
Nota: Antes de centrifugar debe tenerse listo un tubo con 1.5 ml de agua para equilibrar
la centrfuga.
A partir de este punto el procedimiento se realiza en condiciones estriles.
4.
Se vierte el sobrenadante con las esporas suspendidas, en un papel filtro estril colocado en un embudo de vidrio.
5. Las esporas que se encuentran adheridas al papel filtro se enjuagan tres veces con 5
ml de agua destilada estril.
6. El papel filtro se coloca en una caja de Petri estril.
7. Las esporas se resuspenden en 10 ml de agua destilada.
8. Se inoculan 250 l de suspensin de esporas de P. aquilinum, en cajas de Petri de 10
cm de dimetro con 25 ml de medio de cultivo semislido.
9. Los bordes de las cajas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack).
10. Las cajas se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 C, en foto-periodo de 16
horas luz 8 oscuridad, bajo lmparas fluorescentes.
Induccin de formacin de esporofitos
11. Despus de 21 das de sembradas las esporas, los gametofitos se transplantan a
frascos Gerber con el mismo medio utilizado en la germinacin, los gametofitos se
riegan con 1 ml de agua destilada cada semana hasta la aparicin de los esporofitos
La respuesta se evaluar a los 7, 14, 21 y 56 das despus de la siembra, por el porcentaje de
germinacin de las esporas y la capacidad de desarrollar gametofitos y esporofitos.
Los resultados de todos los equipos se reunirn y el reporte de la prctica se har con el resultado de todos los experimentos.
Para determinar el porcentaje de germinacin de las esporas y el desarrollo protlico, se
observan los cultivos en un microscopio estereoscpico (a 320 aumentos) y se toman cuatro
fotografas de diferentes campos (de cada caja Petri), a los 7, 14 y 21 das despus de la siembra. Se considera que una espora ha germinado cuando aparece la clula rizoidal (ver figura). A
los 56 das despus de la siembra se determina en cules de los tratamientos se desarrollaron
esporofitos.
69
Fitorremediacin con helechos | prctica 11
3.
70
Espora trilete (a). Germinacin tipo Vittaria, dos a cinco das (b). Filamentos cortos de cuatro
a seis clulas, seis das (c). Gametofito espatulado, ocho das (d). Gametofito cordiforme,
desnudo, con simetra bilateral y meristemo apical, 11 das (e). Gametofito masculino con
anteridios en la superficie ventral de la lmina, entre los rizoides, 13 das (f). Acercamiento
de los anteridios (g). Morfologa del anteridio, mostrando la clula basal, la clula media
y la clula opercular (h). Gametofito femenino con los arquegonios cerca de la muesca,
17 das (i). Cuello del arquegonio con cuatro clulas (j). Gametofito monoico, 21 das (k).
Gametofitos dioicos con dimorfismo sexual marcado: masculinos (), pequeos con alas
poco desarrolladas, femeninos () de talla mayor con alas amplias (l). an= anteridio, ar=
arquegonio, cb= clula basal, cm= clula media, co= clula opercular, cr= clula rizoidal, cu=
cuello, es= espora, fi= filamento, me= meristemo, mu= muesca, ri= rizoide.
Resultados
Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinacin de esporas
de P. aquilinum
Tratamiento *
Porcentaje de germinacin (siete das)

Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Control
Cromo VI 25 M
Cromo VI 50 M
Cromo VI 100 M
Cromo VI 150 M
Cromo VI 200 M
Tratamiento *
Porcentaje de germinacin (14 das)

Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Control
Cromo VI 25 M
Cromo VI 50 M
Cromo VI 100 M
Cromo VI 150 M
Cromo VI 200 M
Tabla 2. Evaluacin del desarrollo protlico de los gametofitos de P. aquilinum por tratamiento *(Cromo VI 25 M)
Tratamiento *
Porcentaje (14 das)

Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Caja 5
Promedio
Gametofito filamentoso
Gametofito laminar
Gametofito maduro
Tratamiento *
Porcentaje (21 das)
Gametofito laminar
Gametofito maduro
* Cada equipo reporta slo sus resultados
Caja 4
Fitorremediacin con helechos | prctica 11
71
Tabla 3. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre el desarrollo protlico de los

gametofitos de P. aquilinum.
Etapa
Porcentaje (14 das)

0 M
25 M
50 M
100 M
150 M
200 M
0 M
25 M
Porcentaje (21 das)

50 M
100 M
150 M
200 M
Gametofito laminar
Gametofito maduro
Etapa
Gametofito laminar
72
Gametofito maduro
Discusin
Temas que se sugieren para el anlisis:
1. Cul es la ventaja de la fitorremediacin sobre otros mtodos de limpieza de sitios
contaminados?
2. Cules son las condiciones ms importantes que pueden influir en el proceso de
germinacin de las esporas?
3. Cul es la condicin indispensable para que los anterozoides realicen la fecundacin de las oosferas?
4. Comparar los resultados obtenidos y los reportados en la literatura con otras especies vegetales.
5. Pteridium aquilinum es una especie prometedora para la fitorremediacin de suelos contaminados con metales pesados?
6. Cul es la fase haploide y cul la diploide en el ciclo de vida de los helechos?
7. Cul es la ventaja que puede tener hacer seleccin de organismos haploides en un
sistema de mejoramiento gentico de esta especie?
Bibliografa
Arthur, E., P. Rice, T. Anderson, S. Baladi, K. Henderson y J. Coats (2005), Phytorremediation-An
overview, Critical Review in Plant Science 24:109-122.
Cervantes, C., J. Campos-Garca, S. Devars, F. Gutirrez-Corona y H. Loza-Tavera (2001), Interactions of chromium with microorganisms and plants, FEMS Microbiology Reviews 25:
335 347.
Gomez V. y M.P. Callao (2006), Chromium determination and speciation since 2000, Trends in
Analytical Chemistry 25: 1006-1015.
Lewandowski, I., U. Schmidt, M. Londo y A. Faaij (2006), The economic value of the phytoremediation function-assessed by the example of cadmium remediation by willow (Salix
spp.), Agricultural Systems. 89: 68-89.
Lone, M.I., Z. He, P.J. Stoffella y X. Yang (2008), Phytoremediation of heavy metal polluted soils
and water: Progresses and perspectives, J. Zhejiang Univ. (Sci B) 9:210-220.
Padmavathiamma, P.K. y L.Y. Li, (2007), Phytoremediation technology: Hyper-accumulation
metals in plants, Water, Air, Soil Pollut 184:105-126.
Prctica 12
Induccin y desarrollo de embriones

somticos de zanahoria
Durante la embriognesis somtica las clulas en cultivo experimentan un proceso de desarrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se forman las semillas. El desarrollo de un
embrin tanto in vivo como in vitro est codificado por los mismos genes. La embriognesis
somtica es un proceso complejo regulado por tres programas genticos que se prenden de
forma secuenciada y son los responsables de la formacin de tejido competente para la embriognesis, del desarrollo y la maduracin de los embriones. La obtencin de un embrin maduro, frtil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento
adecuado.
Generalmente, la produccin de embriones somticos se divide en tres etapas: En la primera, conocida como induccin, se induce el desarrollo de un tejido embriognico. Sometidas
a los estmulos adecuados, las clulas meristemticas suelen dar dos tipos de respuestas: a)
se multiplican y generan una masa desorganizada de clulas que recibe el nombre de callo
embriognico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones), o bien, b) se dividen
para formar directamente embriones. Cuando se obtiene callo embriognico es necesario estimular el desarrollo de los embriones. Durante la etapa de desarrollo, el callo embriognico se
transplanta a un nuevo medio de cultivo, donde se estimula a los cmulos de clulas potencialmente embriognicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y formen
embriones.
En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduracin. Durante este proceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrin pierde paulatinamente humedad. La maduracin de los embriones mejora la eficiencia de germinacin y es
muy conveniente cuando los embriones no estn destinados a producir de inmediato plantas
completas, tambin hay semillas sintticas que emplean otros propgulos: brotes (tallos con
algunas hojas) o races, los cuales pueden generar despus de uno o varios pasos de cultivo in
vitro plantas completas. Pero la mayor parte de las veces, las plantas se generan directamente
por germinacin de embriones sin madurar. Como los requerimientos de cultivo de estas tres
etapas son distintos, se ocupan en las diferentes etapas, medios de cultivo diferentes.
El principal modelo de estudio de la embriognesis somtica es la zanahoria. Esta posibilidad tecnolgica se descubri precisamente en esta especie. Steward, en 1958 y Reinert en
1959, observaron que las clulas de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensin,
tenan la capacidad de formar unidades estructurales discretas, con una forma de desarrollo
similar a la que presentan los embriones cigticos. Si estos embriones se ponan en condiciones adecuadas, germinaban y producan plantas completas. Ellos llamaron a estos propgulos
embriones somticos.
73
Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria | prctica 12
Introduccin
Objetivo general
Obtener embriones somticos de zanahoria.

74
Germinar semillas de zanahoria en condiciones estriles.

Probar el efecto de diferentes concentraciones de 2,4-D sobre la induccin de callo
embriognico de zanahoria.
Determinar cul es el mejor explante para la induccin de callos embriognicos de
zanahoria.
Probar el efecto de la concentracin de sacarosa y la fuente de nitrgeno en el desarrollo de embriones somticos de zanahorias.
Material y equipo
Material
Equipo
1 esptula estril
Autoclave
Potencimetro
Pinzas largas estriles
Balanza analtica
2 mecheros
2 mallas de acero inoxidable estriles
*1 paquete de cajas Petri estriles

*12 frascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml)
Reactivos
*Mango para bistur del no. 4
Medio MS
2, 4-D (2, 4 cido diclorofenoxiactico)
Alcohol etlico al 70%
*5 hojas para bistur estriles del no. 21 o 22
Agar
*Papel aluminio
Sacarosa
*Una caja de cartn
L-glutamina
*Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack
Cloro al 30%
HCl 1N
Material biolgico
KOH 1N
Semillas de zanahoria
Metodologa
Los experimentos se llevarn a cabo empleando el medio de cultivo bsico ms (ver anexo), al
que se le agregarn distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes
experimentos efectuados. En todos los casos se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH
1N y se esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.
El proceso de induccin de embriognesis somtica se efectuar en tres etapas: germinacin in vitro de semillas, induccin de callo embriognico y embriognesis.
PARTE I. Germinacin de semillas in vitro
Cultivo in vitro
Se emplearn frascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo bsico ms semislido (ver anexo)
adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa.
1. El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero
2. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada frasco (cada equipo sembrar cinco frascos).
Nota: Las pinzas, despus de usarse, se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodn en el fondo para que no se confunda con
los frascos de agua). Antes de volver a usar las pinzas, se flamean y cuando el alcohol
remanente se apaga, se sumergen en un frasco con agua destilada estril para que
se enfren.
3.
4.
5.
6.
Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rpidamente por la flama y se tapa el frasco
con las semillas.
Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack).
Los frascos se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 C en foto-periodo de
16 h luz/8 h oscuridad, bajo lmparas fluorescentes.
Despus de seis semanas de cultivo las plantas estn listas para utilizarse como explantes.
PARTE II. Induccin de callo embriognico

1.
2.
3.
Se probarn tres tratamientos para la induccin de callo embriognico: Medio semislido ms (ver anexo) con 1, 1.5 y 2 mg/L de 2,4-D.
En todos los casos se colocarn cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Se
ocuparn porciones de tallos, races y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos
meses de edad) como explantes. Se harn cinco repeticiones por tratamiento.
Las cajas se mantendrn a 25 C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probar
uno de los tratamientos).
75
Desinfeccin de semillas
1. Las semillas se colocan en una solucin jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo.
2. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta
que se elimine el detergente por completo.
3. Se baan con alcohol al 70% para eliminar aceites, grasas y ceras
4. Se sumergen en una solucin al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solucin
comercial). Las semillas se mantienen en la solucin de cloro durante 20 minutos en
agitacin constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan ms tiempo
en la solucin.
5. En la campana de flujo laminar, se remueve la solucin con ayuda de un colador de
acero inoxidable estril.
6. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estril.
7. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo.
4.
La respuesta se evaluar despus de cinco semanas de tratamiento por la presencia de

callo embriognico y la frecuencia de respuesta. Los resultados de todos los equipos se
reunirn y el reporte de la prctica se har con el resultado de todos los experimentos.
PARTE III. Embriognesis

1.
2.
3.
Resultados
Germinacin de semillas
Da
Frasco
10
1
2
3
4
5
Promedio
DS
Germinacin
Germinacin (%)
No. de semillas germinadas
76
Se probarn cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somticos de zanahoria: Medio ms con 3% de sacarosa, medio ms con 6% de sacarosa, medio ms con 3%
de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio ms con 6% de sacarosa y 750 mg/L
de L-glutamina (cada equipo probar uno de los tratamientos).
En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarn cuatro porciones de callo
(del mejor callo obtenido en la etapa de induccin, se harn tres repeticiones por
tratamiento).
Las cajas se mantendrn en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas,
el resultado se evaluar por la presencia de embriones somticos en estado cotiledonario. Los resultados de todos los equipos se reunirn y el reporte de la prctica se
har con el resultado de todos los experimentos.
Das
Grfica de velocidad de germinacin
12
14
16
Induccin de callo embriognico*

Presencia de callo embriognico por explante**
Frasco
1 mg/L de 2,4-D
1.5 mg/L de 2,4-D
2.0 mg/L de 2,4-D
1
2
3
4
5
Total
% de respuesta
por explante
* La evaluacin se hace a las cinco semanas de tratamiento
** Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos
Desarrollo de embriones somticos*

Nmero de brotes por explante**
Frasco
3% de sacarosa
6% de sacarosa
3% de sacarosa
750 mg/L de glutamina
6% de sacarosa
750 mg/L
de glutamina
1
2
3
4
5
No. de brotes
por tratamiento
* La evaluacin se hace a las cuatro semanas de tratamiento
Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos
** Se emplearn como explante los mejores callos obtenidos en la etapa anterior
Anlisis
1.
2.
3.
4.
5.
A qu se llama clulas totipotenciales?

Qu son los meristemos?
Cules son los factores que determinan la induccin de un cultivo embriognico?
Qu caractersticas debe tener un tejido que se usa como explante para embriognesis somtica?
Cules son los factores ms importantes durante el desarrollo de embriones somticos?
77
Bibliografa
Berleth, T. y S. Chatfield, (2002), Embryogenesis: Pattern formation from a single cell, Arabidopsis Book 7: 1-22.
Feher, A., T.P. Pasternak, y D. Dudits, (2003), Transition of somatic plant cells to an embryogenic
state. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 201-228.
Jimenez, V.M. (2005), Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro
somatic embryogenesis. Plant Growth Regulation 47: 91-110.
Murashige, T. y F. Skoog (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473- 497.
Rose, R.J. y K.E. Nolan (2006) Genetic regulation of somatic embryogenesis with particular reference to Arabidopsis thaliana and Medicagotruncatula. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 42: 473-481. Invited review.
Thorpe, T.A. (2007), History of plant tissue culture. Molecular Biotechnology 37: 169-180.
78
Prctica 13
Organognesis somtica
de Nicotiana glauca
La organognesis somtica ha resultado ser una herramienta muy valiosa para la propagacin
comercial de cultivos industriales, plantas ornamentales y hortalizas. Las condiciones de organognesis son variables para cada especie vegetal. El enfoque emprico que ha sido extensamente usado en estudios in vitro de organognesis ha mostrado que el proceso depende principalmente de tres factores, la eleccin del explante, el medio de cultivo y el control del ambiente
fsico. La manipulacin de estos factores lleva a la induccin del desarrollo organizado.
En general es mejor utilizar explantes jvenes con crecimiento activo y con meristemos
abundantes. Las hojas y los nudos de los tallos suelen dar muy buenos resultados. Cuando los
explantes se colocan en un medio de cultivo con ciertas hormonas vegetales, generalmente
citocininas (solas o en combinacin con una proporcin mucho menor de auxinas), los brotes
axiales emergen y forman un agrupamiento de brotes. Una vez que estos brotes se desarrollan pueden subdividirse en grupos ms pequeos o brotes individuales que pueden a su vez
cultivarse en medio fresco con auxinas, para inducir la formacin de races.
Los explantes de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum L.) pueden formar brotes o races
directamente, dependiendo de las fitohormonas presentes en el medio. La organognesis de
novo inicia a partir de clulas en divisin activa localizadas en los centros meristemticos de
las plantas, clulas que generan primordios que finalmente formarn brotes y races.
El proceso de organognesis ocurre en diferentes etapas que incluyen: la adquisicin de
competencia, la induccin o determinacin de una ruta morfogentica particular y la diferenciacin morfolgica y el desarrollo. La determinacin se completa cuando el tejido es capaz
de continuar su programa de desarrollo en ausencia de reguladores de crecimiento exgenos.
Recientemente se ha encontrado que los explantes de hojas de tabaco requieren permanecer
de cuatro a seis das en el medio de cultivo para que se determine la formacin de brotes y slo
requieren un da en el medio de cultivo para que se determine la formacin de races.
Nicotiana glauca es una planta perteneciente a la familia Solanaceae con una amplia
distribucin en Mxico y el mundo. Es una especie con rpido crecimiento y alta produccin
de biomasa que produce alcaloides repelentes de herbvoros. Esta planta se comporta como
pionera en ecosistemas perturbados y resiste concentraciones elevadas de diversos contaminantes. Existen varios estudios que reportan su capacidad de retener en sus tejidos altas concentraciones de Pb, Zn, Cd y Co. Por estas caractersticas, N. glauca es considerada un modelo
ideal para llevar a cabo estudios de fitorremediacin.
Por tratarse de una especie silvestre, su empleo en biorremediacin de suelos contaminados depende en gran medida del desarrollo de un protocolo eficiente de reproduccin para
la especie.
79
Organognesis somtica de nicotiana glauca | prctica 13
Introduccin
Objetivo general
Obtener plantas completas a partir de cultivos in vitro de Nicotiana glauca por organognesis
somtica
1.
2.
3.
80
Probar el efecto de diferentes concentraciones de bencil aminopurina (Bap) en combinacin con cido naftalenoactico (Ana) sobre la induccin de brotes adventicios
de tabaco.
Determinar cul es el mejor explante para la induccin de brotes.
Probar el efecto de la composicin del medio de cultivo en la rizognesis de los brotes obtenidos.
Material y equipo
Material
Equipo
2 mecheros
Autoclave
Potencimetro
Tubos eppendorf de 1.5 ml
Balanza analtica
1 esptula estril
Pinzas largas estriles
1 jeringa hipodrmica estril
Reactivos
*1 paquete de cajas Petri estriles de 10 cm de dimetro
Sales del medio ms
*15 frascos Gerber grandes de boca ancha
Sacarosa
*Papel aluminio
Agar
*Algodn
Ana
*Mango para bistur del nmero 4
Bap
*5 hojas para bistur estriles del no. 21 o 22
Alcohol etlico 70%
*Un rollo de plstico Parafilm o Plastipack
HCl 1N
Material biolgico
KOH 1N
Semillas de N. glauca
Cloro 30%
Metodologa
Los experimentos se realizarn empleando el medio de cultivo bsico ms (Murashige y Skoog,
al que se le agregarn distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes
experimentos efectuados. En todos los casos se ajustar el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH
1N y se esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 120 0C.
El proceso de induccin de organognesis somtica se efectuar en tres etapas: germinacin in vitro de semillas, induccin de brotes y rizognesis.
Parte I. Germinacin de semillas in vitro
Parte II. Cultivo in vitro

Se emplearn frascos Gerber de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo bsico Murashige y
Skoog (1962) semislido, adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa.

El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero.

Con ayuda de unas pinzas y una esptula delgada estriles, se colocarn entre 10 y
15 semillas en cada frasco (cada equipo sembrar 5 frascos).
Nota: Las pinzas y la esptula despus de usarse se colocan en un frasco con alcohol (al
frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodn en el fondo para que no se
confunda con los frascos de agua). Antes de volverse a usar, las pinzas y la esptula
se flamean, cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un frasco con
agua destilada estril para que se enfren.

Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rpidamente por la flama y se tapa el frasco
con las semillas.
Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plstico (Parafilm o Plastipack).
Los frascos se mantendrn en una cmara de incubacin a 25 oC, en foto-periodo de
16 h luz 8 h oscuridad, bajo lmparas fluorescentes.
Despus de 6 semanas de cultivo las plantas estarn listas para utilizarse como explantes.
81
Desinfeccin de semillas
Las semillas se colocan en un microtubo de 1.5 ml con una solucin jabonosa ligera
(una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar
basura y polvo.
Con ayuda de una jeringa hipodrmica se retira la solucin jabonosa (cuidando no
succionar las semillas, que deben permanecer en el fondo).
Se enjuagan las semillas con agua corriente empleando una jeringa hipodrmica,
hasta eliminar el detergente por completo.
Se baan con alcohol al 70% durante un minuto para eliminar aceites, grasas y ceras.
Se adiciona a las semillas una solucin al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la
solucin comercial) que debe prepararse en ese momento y se mantienen en la solucin de cloro durante 20 minutos en agitacin constante. Es muy importante que las
semillas no permanezcan ms tiempo en la solucin.
En la campana de flujo laminar se remueve la solucin con ayuda de una jeringa
hipodrmica estril.
Empleando la jeringa estril, se enjuagan las semillas tres veces con agua destilada
estril.
Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo.
Deben sembrarse las semillas inmediatamente en los frascos con medio de cultivo.
Parte III. Induccin de brotes

Se probarn seis tratamientos (uno por equipo) para la induccin de brotes en hojas y races
de N. glauca:
Tratamiento
82
bap
ana
(mg/L)
(mg/L)
0.5
0.0
1.0
0.0
2.0
0.0
0.5
0.1
1.0
0.1
2.0
0.1
Se emplearn como explantes hojas y races provenientes de plantas germinadas in vitro de

dos meses de edad. Cada equipo sembrar cinco frascos con races y cinco frascos con hojas.
Los experimentos se evaluarn despus de cinco semanas de tratamiento por la frecuencia de
respuesta y el nmero de brotes obtenidos por explante. Los reportes de las prcticas deben
contener los resultados de los experimentos efectuados por todos los equipos.
Parte IV. Rizognesis
Para la induccin de races en los brotes obtenidos se probar el efecto de la osmolaridad del
medio de cultivo sobre el desarrollo de races.
Se utilizarn como medio de induccin: el medio ms completo, el medio ms con la mitad
de los macronutrientes y el medio ms con un cuarto de los macronutrientes.
Los brotes ms desarrollados obtenidos en la etapa anterior se emplearn como explantes. Se sembrarn tres brotes por frasco, cinco frascos por tratamiento (un tratamiento por
equipo). La respuesta se evaluar despus de cuatro semanas de tratamiento por la frecuencia
de respuesta y la biomasa fresca promedio de las races obtenidas.
Resultados
Induccin de brotes de N. glauca*
Tratamiento**
% de respuesta
Nmero de brotes
por explante***
Nmero de brotes
por tratamiento
Grado de desarrollo
de los embriones
1
2
3
4
5
6
* La respuesta se evaluar despus de cinco semanas de tratamiento
** Se incluirn los resultados de todos los equipos
*** El resultado debe incluir desviacin estndar. Los valores debern estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarn que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey.
Enraizamiento de los brotes*

Tratamiento**
% de respuesta
Biomasa promedio
de raz ***
Biomasa de races
por tratamiento
1
2
3
* La respuesta se evaluar despus de cuatro semanas de tratamiento
** Se incluirn los resultados de todos los equipos
*** El resultado debe incluir desviacin estndar. Los valores debern estar seguidos por letras (a-d). Los valores con
la misma letra indicarn que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la
prueba de Tukey.
1.
2.
3.
4.
5.
Cul es el papel de las hormonas de crecimiento en la induccin de brotes?

Cmo se comporta la planta en respuesta a las fitohormonas utilizadas?
Observaciones en relacin con la eficiencia del proceso de micropropagacin generado.
Comparar los resultados de esta planta con los procesos de micropropagacin de
plantas del mismo gnero
Cul puede ser la utilidad de contar con un protocolo eficiente de micropropagacin para el proceso de domesticacin de la especie?
Bibliografa
Debnath, M., C.P. Malik y P.S. Bisen (2006), Micropropagation: A tool for the production of high
quality plant-based medicines, Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49.
Parc, G., J. Rembur, P. Rech y D. Chriqui, (2007), In vitro culture of tobacco callus on medium
containing peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stability, Plant Cell Reports 26: 145-152.
Pennazio, S. (2002), The culture of single plant cells: A historical view, Rivista Di Biologia - Biology Forum 95: 455-472.
Thorpe, T.A. (2007), History of plant tissue culture, Molecular Biotechnology 37: 169-180.
Ziv, M. (2005), Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 81: 277-285.
Anlisis
83
Prctica 14
Identificacin de organismos
genticamente modificados
Introduccin
85
Los jitomates, semillas de soya y granos de maz fueron los primeros organismos genticamente modificados en ser aprobados en Estados Unidos en los aos noventa. A partir de entonces
la biotecnologa de alimentos contina creciendo rpidamente.
La introduccin de genes especficos a travs de la biotecnologa puede proveer de ciertas
ventajas. Como ejemplo, una planta genticamente modificada se protege a s misma contra
parsitos despus de la introduccin de un gen para la produccin de una endotoxina capaz
de destruirlos. Las plantas tambin pueden ser modificadas para inhibir la expresin de genes
especficos que estn involucrados en la maduracin de la fruta.
Existen varios procedimientos biotecnolgicos que pueden ser usados para la ingeniera
gentica de plantas. Como ejemplo podemos mencionar el uso de pistolas genticas, la introduccin de genes mediante el plsmido Ti y la tecnologa antisentido.
Objetivo
Los alumnos podrn identificar la presencia de transgenes en muestras vegetales adquiridas
comercialmente.
Material y equipo
Material
Equipo
20 Tubos eppendorf de 1.5 ml limpios y estriles por equipo
Bao Mara a 65 oC por grupo

Licuadora o mortero por grupo
Micropipetas por equipo
Centrfuga por grupo
1 mechero por equipo

*100 g de soya
*Material que debern traer los alumnos. La idea es que traigan soya adquirida en distintos sitios: mercados, supermercados, tiendas orgnicas, pueblos, etctera.
Reactivos por grupo

1. 50 ml de amortiguador de extraccin CTAB pH 8.0 (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 1 M
y Na2 EDTA 0.02 M).
2. 50 ml de amortiguador de precipitacin CTAB (CTAB 5 g/l y NaCl 0.04 M)
3. 50 ml de NaCl 1.2 M
4. 50 ml de solucin fisiolgica salina (NaCl 0.9%)
5. 1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) o pronasa (50 mg/ml)
6. 50 ml de cloroformo
7. 50 ml de isopropanol
8. 50 ml de etanol al 75%
9. 10 ml de agua estril
86
Metodologa
Esta prctica se realiza en tres mdulos:
I) Extraccin de dna de las muestras.
II) Amplificacin del dna.
III) Electroforesis en geles de agarosa.
MDULO I. Extraccin de dna
Extraccin de dna usando ctab (bromuro de hexadeciltrimetilamonio)
1. En una licuadora se trituran 100 g de muestra con 25 ml de solucin fisiolgica salina, el homogenizado servir para todo el grupo.
2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml se colocan de 50-300 mg de muestra (1 tubo por
alumno)
3. Agregar 1.0 ml de amortiguador de extraccin CTAB precalentado a 65 C, agitar e
incubar por 30 min.
4. Adicionar 10 l de proteinasa K (20 mg/ml), incubar a 55 oC por 30 min.
5. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. El sobrenadante se transfiere un tubo nuevo y
limpio.
6. Agregar un volumen de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 15 min.
7. Tomar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo y limpio.
8. Agregar 2 volmenes del amortiguador de precipitacin CTAB, incubar a temperatura ambiente por 60 min. Posteriormente centrifugar a 14 000 rpm por 15 min.
9. El sobrenadante se descarta y el dna precipitado se disuelve en 350 l de NaCl 1.2 M.
10. Adicionar 350 l de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 10 min.
Transferir la fase superior a un tubo nuevo y limpio.
11. Agregar 600 l de isopropanol, mezclar suavemente e incubar 20 min a temperatura
ambiente.
12. Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min, descartar el sobrenadante.
13. Adicionar 500 l de etanol al 75%, mezclar con vrtex por 2 min.
14. Centrifugar a 14 000 rpm por 2 min, descartar el sobrenadante.
15. Secar la pastilla en el mechero y posteriormente resuspender en agua estril (aproximadamente 100 l).
La pureza y concentracin del dna puede calcularse de la siguiente manera:

1. Hacer una dilucin 1:100 de la muestra obtenida y medir la DO a 260 y 280 nm. La
pureza se estima sacando la siguiente proporcin: DO260/DO280. La concentracin se
calcula de acuerdo con la siguiente formula: 1.0 de DO260 = 50mg/l para dna de
doble cadena.
Mdulo II. Amplificacin del dna
Metodologa
Mezcla de reaccin:
1. Volumen total 25 l
2. 2.5 l de amortiguador de reaccin (10X)
3. 50 pmol de cada primer
4. 2.5 U de Taq dna polimerasa
5. X l de agua libre de nucleasas estril
6. 1-5 l de dna
7. 2.5 l dNTPs 2 mM.
Es conveniente que el profesor haga un stock para todo el grupo con el fin de optimizar el uso
de los reactivos.
La cantidad de reacciones de PCR ser determinada por el profesor, ya que no se pueden
realizar para todo el grupo debido al elevado costo de los reactivos.
Oligonucletidos utilizados para la amplificacin
Promotor CaMV 35S
CaMV 35SF
CaMV 35SR
Tamao esperado del amplicn: 196 pb
87
Identificacin de organismos genticamente modificados | prctica 14
La produccin de plantas genticamente modificadas se lleva a cabo mediante la insercin

selectiva de genes forneos de inters dentro de su genoma. El proceso mediante el cual se
realiza la construccin requiere el corte y empalme de diferentes elementos para formar una
unidad genticamente funcional. La modificacin generalmente incluye dos elementos regulatorios, un promotor y un terminador, as como un gen que confiere una ventaja. Dos de los
elementos regulatorios ms utilizados son el promotor para una elevada expresin constitutiva en tejidos de plantas, CaMV-35, aislado del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor y el
terminador Nos aislado del gene de la nopalina sintasa (nopaline synthase) de Agrobacterium
tumefaciens, el cual da la seal de terminacin de la transcripcin y dirige la poliadenilacin.
Estos dos elementos pueden estar juntos o separados.
Al inicio de los aos ochenta, Chua y colaboradores en la Universidad de Rockefeller aislaron el promotor responsable de la transcripcin del genoma completo del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV, por cauliflower mosaic virus). El promotor fue nombrado CaMV 35S o promotor 35S por su coeficiente de sedimentacin. El promotor 35S es un promotor constitutivo muy
fuerte, ya que provoca altos niveles expresin de genes en plantas dicotiledneas, aunque es
menos efectivo en plantas monocotiledneas, especialmente en cereales. La discrepancia se
debe probablemente a la diferencia en la cantidad y/o cualidad de los factores de regulacin.
Terminador NOS
NOSF
NOSR
Tamao esperado del amplicn: 180 pb
Programa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Desnaturalizacin
94 C, 5 min.
Desnaturalizacin
94 C, 30 seg.
Alineamiento
54 C, 30 seg.
Extensin
72 C, 30 seg.
Extensin final
72 C, 7 min.
Nmero de ciclos
30 ciclos
88
Mdulo III. Electroforesis en geles de agarosa

La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromolculas en una solucin.
Muchas molculas biolgicamente importantes (aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como especies cargadas,
bien como cationes, o bien como aniones. La electroforesis permite separar molculas de dna
al ser sometidas a un campo elctrico, ya que son atradas hacia el polo opuesto a su carga
neta. Hay dos fuerzas de accin opuesta que determinan la velocidad de la partcula. Primero,
la fuerza elctrica atrae el dna hacia el electrodo y la intensidad de la atraccin es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migracin y su
intensidad depende del tamao y la forma de la partcula.
La electroforesis permite adems, hacer una aproximacin de la cantidad de dna que se
obtiene despus de un proceso de extraccin. Tambin se utiliza para visualizar el resultado de
procesos como la restriccin y PCR.
Reactivos
Amortiguador TAE 50X
GelRed
Agarosa
Metodologa
Preparacin del gel de agarosa
1.
2.
Determinar la concentracin y el volumen de gel que se necesita. Si el dna tiene un

tamao desconocido se debe utilizar un gel de agarosa al 1.0% (1g/100 ml).
Preparar el gel al porcentaje de agarosa deseado segn se indica en el siguiente
ejemplo.
Ejemplo 1: preparar 30 ml de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Hay que determinar qu cantidad de agarosa se necesita para preparar 30 ml:
(30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)
Se despeja la ecuacin para la X. El resultado en este caso es 0.3 g

3.
Preparacin de la cmara y de las muestras

1.
2.
3.

4.
5.
6.
7.
8.
Colocar el gel dentro de la cmara de electroforesis.

Aadir suficiente TAE 1X para cubrir completamente el gel (aproximadamente 0.5
cm)
Las muestras se preparan de la siguiente forma:
Tomar 5 l de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1ml de GelRed
para monitorear la movilidad electrofortica. Siempre se debe de usar una punta de
micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin.
Cargar cuidadosamente ~ 6 l de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Cargar todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra de
un marcador de peso molecular.
Conectar el equipo de electroforesis. Unir los electrodos positivos (rojos) y negativos
(negros) a las terminales correspondientes.
Encender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100 voltios).
Si el equipo est funcionando bien, entonces se podrn observar burbujas saliendo
de los electrodos. Conviene asegurarse de que las muestras estn corriendo en la
direccin correcta, hacia el electrodo positivo.
Correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido aproximadamente
entre la mitad y tres cuartos de la charola.
Apagar el equipo.
Resultados
Visualizacin del dna
Colocar el gel en una lmpara de luz UV o transiluminador
Fotografiar el gel usando una cmara digital.
89
Identificacin de organismos genticamente modificados | prctica 14
Pesar la cantidad de agarosa que se necesita (ejemplo 1 = 0.3 g) y transferir a un matraz Erlenmeyer.
4. Aadir el volumen deseado de solucin amortiguadora Tris acetato EDTA (TAE) 1X
(ejemplo 1 = 30 ml).
5. Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente
(aproximadamente un minuto), pausando el horno cada vez que sea necesario para
impedir que hierva.
6. Enfriar la agarosa hasta unos 50 C.
7. Colocar el molde para hacer los pozos en la charola que soporta el gel. Para que el gel
quede de un espesor uniforme la charola debe estar en una superficie plana nivelada.
8. Vaciar la solucin de agarosa en la charola evitando la formacin de burbujas. Si se
forman burbujas, se pueden remover usando una punta para micropipeta.
9. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos). El gel slido tiene una apariencia opaca.
Bibliografa
Elenis, D.S., D.P. Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou y T.K. Christopoulos (2008), Advances in
molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms, Anal Bioanal Chem 392: 347-354.
Gryson, N., K. Messens y K. Dewettinck (2004), Evaluation and optimization of five different
extraction methods for soy DNA in chocolate and biscuits. Extraction of DNA as a first
step in GMO analysis, J Sci Food Agric 84:1357-1363.
Michelini, E., P. Simoni, L. Cevenini, L. Mezzanotte y A. Roda (2008), New trends in bioanalytical
tools for the detection of genetically modified organism: an update, Anal Bioanal Chem
392: 355-367.
Oraby, H.A.S., A. A. Hassan y A.A. Mossallam, (2005), Screening food products for the presence
of CaMV 35S promoter and NOS 3 terminator, J Sci Food Agric 85: 1974-1980.
90
Anexo
Prctica 1.
Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae se mantendr sembrada en cajas de medio rico (YPD) y se utilizar
para el inculo una caja con no ms de una semana de haber sido sembrada.
DNS
(Miller, 1959)
Hidrxido de Na
cido 3,5- dinitrosaliclico
Tartrato de Na y K
Fenol
Metabilsulfito de Na
1%
2%
2%
2%
1.40 %
0.75 %
21.60 %
0.54 %
0.59 %
Prctica 3.
Transformacin de levadura y ensayo de doble hbrido
Preparar por grupo:
Medio YPD (g/L) (5 matraces con 30 ml c/u para el grupo): Extracto de levadura 10 g, peptona
20 g, dextrosa (glucosa) 20 g.
Cajas de SD + Leu (3 por equipo): Base nitrogenada para levaduras, sin aminocidos (YNB) 0.67
%, glucosa 2 %, leucina 20 mg/L, agar 2%.
Cajas de SGal + Leu, pH 7.0 (1 por equipo): YNB 0.67%, galactosa 2%, leucina 20 mg/L, ajustar
el pH a 7.0, agar 2%.
Cajas SGal + rafinosa al 1% sin leucina (1 por equipo): YNB 0.67%, rafinosa 1%, agar 2%.
TE 10X, pH 8.0 (10 ml para el grupo): Tris 100 mM, EDTA 10 mM.
Acetato de litio 10X (10 ml para el grupo): Preparar una solucin 1 M de acetato de litio, pH 7.5.
PEG 50%: Disolver 25 g de PEG 3350 en 50 ml de agua y esterilizarlo.
X-Gal: solucin al 2% en N,N-dimetilformamida (guardar a -20 C).
dna de esperma de salmn: Solucin de trabajo 10 mg/ml, preparado segn Sambrook et al.,
1989.
Prctica 4.
Extraccin de dna e identificacin del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropolgicas y forenses
PBS 20X (0.2 M PBS, pH 7.2):
Na2HPO4 (anhidro)
21.8 g
93
Manual de biotecnologa | Anexo
YPD
Y (extracto de levadura)
P (peptona de casena)
D (glucosa)
Agar
NaH2PO4 (anhidro)
NaCl
Agua destilada
Ajustar pH a 7.2
Guardar a temperatura ambiente
6.4 g
180 g
1,000 ml
Solucin de Lisis:
Tris-HCl 1 M, pH 7.5
1 ml
EDTA 500 mM
2 ml
NaCl 5 M
1 ml
SDS 20% (p/v)
10 ml
Agua libre de nucleasas
cbp 100 ml
Esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.
94
TAE 50X (1L):

Tris base
cido actico
EDTA 0.5 M, pH 8.0
242 g
57.1 ml
100 ml
EDTA 500 mM, pH 8.0:

EDTA (sal de sodio)
18.61 g
Ajustar a pH 8.0 con lentejas de NaOH.
Aforar a 100 ml, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente
Proteinasa K o Pronasa (20 mg/ml)
Proteinasa K o pronasa
100 mg
Agua estril
5 ml
Almacenar a -20 C en alcuotas de 400 l
Acetato de sodio 3 M pH 5.2 (100 ml)
Acetato de sodio trihidratado
40.8 g
Ajustar el pH a 5.2 con cido actico glacial.
Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada.
Esterilizar con autoclave y almacenar a temperatura ambiente
Prctica 6.
Preparacin de medio PY, en un vaso de precipitados, preparar como se enlista a continuacin:
Reactivo
Por litro de volumen

final
Peptona de casena
5g
Extracto de levadura
3g
Esterilizar en autoclave 20 minutos a 120 0C y 1 atm de presin. Despus, aadir 10 ml de CaCl2

0.7 M.
Preparacin de PBS 10X: en un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuacin:

Reactivo
Por litro de volumen

final
KCl
2g
NaCl
80 g
Na2HPO4.2H2O
14.4 g
KH2PO4
2.4 g
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH
Preparar 200 ml (por equipo) de medio de cultivo BEGG (g/L): Glucosa* 40, extracto de levadura
5, glutamato de sodio 10, KH2PO4, 13.6, MgSO4.7H2O 0.5, etanol** al 1.4% (v/v) pH 6.0.
NaOH 0.5 M 50 mL (por equipo): 1 g de hidrxido de sodio, aforar a 50 mL con H2O
* La glucosa se esteriliza por separado y se aade posteriormente al medio para evitar que el grupo amino de las
protenas del extracto de levadura reaccionen con la glucosa.
** El etanol se aade despus de la esterilizacin y una vez que el medio se encuentre a una temperatura 30 C
para evitar su volatilizacin.
Prctica 8.
Emulsificacin de diesel, gasolina y aceite de maz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses.
Medio MS 100 ml (por equipo), para preparar 1 L:
Cloruro de amonio
20 mM
Cloruro de potasio
20 mM
Tris - HCl
120 mM
Peptona
1%
Dextrosa (20%)
0.5%
Sulfato de magnesio (1.0 M)
1.6 mM
1.068 g
1.492 g
18.912 g
10g
26ml
1.6ml
Pesar y disolver los reactivos excepto la dextrosa y el sulfato de magnesio en 200 ml de H2O
desionizada, ajustar el pH a 7.4 y aforar a 975 ml. Esterilizar durante 20 minutos.
Stock de Dextrosa al 20%, 100 ml
Dextrosa
20%
20g
Pesar y disolver en 85 ml de H2O desionizada y aforar a 100ml. Esterilizar durante 20 minutos.
Sulfato de magnesio 1.0 M
12.32g
Pesar y disolver en 50 ml de H2O desionizada. Esterilizar por filtracin.
95
Prctica 7.
Sntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnolgicas, utilizando Gluconacetobacter
xylinum
Antes de usar el medio PPGAS, se aaden 26 ml de glucosa al 20% y 1.6 ml de sulfato de magnesio.
MEDIO PG (50 ml por equipo), para preparar 1,000 ml:
Bacto peptona
5g
Glicerol
10 ml
Ajustar pH a 7.2
Aforar a 1 L
Esterilizar 20 minutos
Prctica 9.
96
Preparacin de reactivos:
Liebermann-Burchard (1 ml por equipo). Mezclar 1 ml de anhdrido actico y 5 ml de cloroformo a 4 C (en bao de agua-hielo), aadir una gota de cido sulfrico concentrado.
Draggendorff (2 gotas por equipo). Preparar por separado dos soluciones:
Solucin A.- mezclar 10 ml de cido actico y 40 ml de agua y agregar 0.85 g de nitrato de
bismuto bsico.
Solucin B.- Disolver 20 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua.
Mezclar la solucin A con la solucin B y guardar en un frasco mbar.
Mlish (2 gotas por equipo). Pesar 0.5 g de -naftol y disolver en 10 ml de etanol.
Prctica 11.
Prctica 12.
Induccin y desarrollo de embriones somticos de zanahoria
Prctica 13.
Organognesis somtica de Nicotiana glauca
Estas tres prcticas contemplan el manejo de cultivos vegetales, por lo que se utilizar el medio Murashige y Skoog, Ms, modificado.
Medio Ms modificado:
Preparar soluciones stock. Las soluciones stock se preparan por separado para evitar que se
precipiten:
Stock
Componente
gramos/litro
10X (g/L)
1
macros
(NH4)NO3
KNO3
MgSO4 7H2O
KH2PO4
1.65
1.9
0.37
0.17
16.5
19
3.7
1.7
CaCl2
0.44
20X (g/L)
44
0.01689
0.0086
0.0062
0.00083
0.00025
0.000025
0.000025
1.352
0.688
0.496
0.020
0.020
0.002
0.002
4*
FeSO47H2O
Na2EDTA
0.0278
0.0373
2.224
2.984
5
vitaminas
TiaminaHCl
c. nicotnico
PiridoxinaHCl
0.0001
0.0005
0.0005
0.008
0.040
0.040
Inositol
0.10
8.0
Glicina
0.002
0.160
Sacarosa
30
*Pesar y disolver el fierro y el EDTA por separado. Calentar el EDTA sin ebullir hasta que se disuelva y luego mezclar con el fierro, debe quedar una solucin color
mbar (amarillenta).
Preparar 1 L de stock 1(10X). Elaborar 200 ml de c/u de los stock 20X restantes. Todas las soluciones deben conservarse en refrigerador, de preferencia juntas en un recipiente de plstico.
Preparacin del medio Ms, 1 L: Poner 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitados
y en agitacin constante, se agregan 100 ml del stock 1 y de manera secuencial 10 ml de cada
uno de los dems stocks. Al final se agrega la sacarosa necesaria y cuando se haya disuelto por
completo, se aade agua destilada hasta llegar a 950 ml y ajustar el pH de la solucin a 5.7 con
HCl KOH 1N. Finalmente se afora el medio nutritivo a un litro.
Para que los alumnos prueben los distintos tratamientos, se llevan a cabo los siguientes
pasos durante la prctica con el grupo:
Cuando el medio nutritivo va a vaciarse a cajas Petri: se vierte en un matraz Erlenmeyer de 2L
(es importante que el volumen del matraz sea mucho mayor que el del medio) y se le agrega
el agar (8 g por litro) directamente. El medio se esteriliza en autoclave durante 20 minutos a
120 oC. Se deja que el medio enfre hasta alcanzar alrededor de 60 0C y se vaca en cajas Petri
estriles en una campana de flujo laminar.
Cuando el medio va a vaciarse en frascos de 125 ml (Gerber), se disuelve con agar en una
parrilla con agitacin hasta que se torna claro y transparente (generalmente cuando llega al
punto de ebullicin). Se vacan 25 ml del medio de cultivo a cada frasco. Los frascos con el
medio se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120 oC. Es importante dejar que la
autoclave se enfre lentamente para evitar que las tapas de los frascos se boten por cambios
bruscos de presin.
<
97
3
micros
MnSO4 H2O
ZnSO4 7H2O
H3BO3
KI
NA2MoO4
2H2O
CuSO45H2O
CoCl2 6H2O
98

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Fase de declinacin. La concentracin de las levaduras totales no vara mucho,

La cintica de consumo de los azcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la

Manual de biotecnologa | prctica 1

Bioqumica de la fermentacin alcohlica

Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnologa de las fermentaciones tradicionales.

Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas tcnicas microbiolgicas.

* 2 kg de uvas (verdes o rojas)

* 1 garrafn de plstico c/tapa de 5 litros

* 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml

Incubadora con agitacin

* 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml

1 asa de siembra metlica

Campana de flujo laminar

Botella con el inculo

Botella con el macerado de uvas

2 botellas para centrfuga de 500 ml

1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml

1 jarra para jugo

Puntas para micropipeta

Manual de biotecnologa | prctica 1

Parte I. Maceracin e inculo del medio de cultivo (preparacin del mosto)

Parte IV. Determinacin de la concentracin de azcares reductores.

Concentracin de glucosa (mg/ml)

Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estndar.

Agitar todos los tubos en vrtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente.

pH de las muestras inicial y final:

Construccin de una curva patrn de glucosa:

Curva patrn de glucosa

Manual de biotecnologa | prctica 1

Concentracin de glucosa (mg/ml)

Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado).

Registrar la concentracin de alcohol en el producto (resultado de la determinacin

Manual de biotecnologa | prctica 1

previsin y la planificacin del proceso de desarrollo tecnolgico, as como en la realizacin de

Manual de biotecnologa | prctica 2

Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema.

Computadora con acceso

*Material que debern traer los alumnos

Segunda sesin: bsqueda de patentes

Una lista de las bases de datos ms adecuadas para la bsqueda.

Primera sesin: bsqueda de fuentes bibliogrficas

Manual de biotecnologa | prctica 2

El alumno aprender a transformar a la levadura S. cerevisiae.

Manual de biotecnologa | prctica 3

Puntas estriles blancas, azules y amarillas

3 tubos eppendorf estriles de 1.5 ml

Agua destilada, estril

Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml

* 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo

* Cajas petri estriles

El plsmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se

Tubo 1: agregar 500 ng del plsmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng

Parte I. Protocolo para transformar levadura

Transformacin de levadura: anotar y explicar por qu hubo crecimiento o no en cada una

Crecimiento en medio SD + Leu

Figura A. pEG202: plsmido para la fusin a LexA.

Mapas de los plsmidos empleados en la prctica

Figura B. pJG4-5: plsmido para la fusin al dominio de activacin de la transcripcin.

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