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UE2 : Biologie cellulaire

Chapitre 2 :

Mthodes dtudes
en biologie cellulaire
Docteur Laurent PELLETIER
Anne universitaire 2010/2011
Universit Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits rservs.

Mthodes dtudes
Cellule animale : 10-20 m
Microscopie photonique
0,2 m 1 mm
1838 : Doctrine cellulaire de Schleiden et Schwann

Microscopie lectronique
1940 : 1-2 nm

Fixation, colorations

Mthodes dtude

Historique
DNA :

1944 O.T. Avery


1953 J.D. Watson & F.H.C. Crick

Genetic code : 1961-1966 M. Nirenberg


& H.G. Khorana
DNA cloning : 1972 P. Berg
Hybridization : 1975 E.M. Southern
Fast Sequencing : 1977 W. Gilbert & F. Sanger
PCR : 1983 K. Mullis
Transgenesis : 1993 S. Spielberg
Human genome sequenced : 2001

Mthodes dtude
Aujourdhui
Squenage du gnome
dun patient :
- Infarctus du myocarde
- Diabte type II
- cancers
Cet exemple nest pas
apprendre
par coeur
Lancet 2010; 375: 152535

Mthodes dtude

Mthodes dtude
Adipocyte

Mme gnome

Expression diffrente

Neurone

Mthodes dtude
30 Genome
000 gnes

Statique, connu

Transcriptome

Dynamique, dpendant du
context, inconnu

100Proteome
000 protines

Dynamique, dpendant du
context, inconnu

Mthodes dtude
Les techniques de ciblage molculaire
Immuno-histochimie
Immuno-fluorescence
Hybridation In Situ

Mthodes dtude
Immuno-histochimie, Immunofluorescence, FACS,
Hybridation In Situ, Southern-blot, western blot,
northern-blot

mme combat !
Enzyme, fluorochrome
Secondaire
Sonde
Cible

Mthodes dtude
Les techniques de ciblage molculaire
Immuno-histochimie

CD31

PCNA

Fort immuno-marquage nuclaire


PCNA des cellules pithliales
normales du colon.Marquage modr
dans les cellules musculaires.

Mthodes dtude
Les techniques de ciblage molculaire
Immuno-fluorescence

Actine -SM (FITC)

ICAM-2 (Cy5)

Immunohistochemistry markers
to distinguish between vascular
smooth muscle and endothelial
cells. A cryosection of mouse
heart ventricle was
simultaneously stained with
FITC-conjugated smooth muscle
-actin antibody (A) and an
antibody against the apical
endothelial membrane protein,
ICAM-2 (B). The secondary
antibodies to detect ICAM-2 was
Cy-5 conjugated donkey anti-rat
(pseudo-colored red for clarity).
Panel C is an overlay of the
preceding two panels.

Mthodes dtude
Les techniques de ciblage molculaire
Hybridation in situ (HIS)

Section de cerveau de
souris :
Les points noirs indiquent
lexpression dun gne dans
des rgions spcifiques

FACS
Cytomtrie en flux
(FACS : Fluorescence
Activated Cell Sorter)

FACS
2N-42C
2N-4C

2N-24C

2N-2C
2N-2C 2N-4C

FACS

225
150

Pic daneuplodie
(DNA index 1.21)

75

Nombre de cellules

300

DNA Analysis

200

400

1Q

600

2Q

Intensit de Fluorescence

800

1000

ELISA
(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Dosage dun anticorps

Dosage dun antigne

ELISA

ELISA
anticorps anti-HIV GP120

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/D3.html

Southern blot
Fragmentation mnage
du gnome

Sparation des fragments


gnomiques dans un gel

Transfert des fragments


spars sur une membrane

Incubation de la membrane
avec une sonde

Rvlation du marquage
(visualisation de la cible)

Western blot
Sparation & transfert des protines
+ dtection protine dintrt
=
WB
Electrophorse en gel dacrylamide
ou PAGE-SDS
(PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis Sodium
Dodecyl Sulfate)

Coloration des
protines au bleu de
Coomassie

Western blot
Prparation et sparation des protines

Western blot
Electro-transfert sur nylon ou nitrocellulose

Western blot

Culture cellulaire
Culture cellulaire 1907 : doctrine neuronale

Explants tissulaires
Cellules isoles
Dissociation mcanique, enzymatique, EDTA

Slection
EDTA : Acide thylne diamine ttractique

Slection

Culture cellulaire

Culture cellulaire
Culture primaire
Culture secondaire
Cellule unique
(clonage)

Culture primaire :
Population polymorphe
de cellules

Culture
secondaire

Culture
secondaire

Culture cellulaire
Observation
Microscopie contraste de phase
Vido-microscopie

Observation

Culture cellulaire

Immunofluorescence

Mitochondries : jaune
Filaments dactine : vert
ADN : rouge

Mitochondries : rouge
Filaments dactine : vert
ADN : bleu

Culture cellulaire
Conditions de culture
37C, pH, sels, CO2
Milieu de culture
Milieu de base
+/- Srum
Facteurs de croissance
Support

Culture cellulaire
Immortalisation

Croissance cellulaire

Les cellules normales ont un nombre de


divisions limit

Culture cellulaire
Immortalisation
Introduction dun oncogne (SV 40, Myc)
qui immortalise la cellule sans la rendre
tumorale
Cellules tumorales
exple : He(nrietta) La(cks)

Culture cellulaire
Cellule
normale

Cellule
immortalise

Cellule
transforme
Divisions

Cellules normales

Ancrage,
Fact. Croiss.,
Inhib. Contact.
cellules cancreuses

Ulex Europeaus Agglutinin-1


Culture de cellules de
Culture
cellulaire
(UEA-1)
moelle osseuse humaine

Facteur de Von Willebrand (vWF)

N
N
N

Collagne IV

Culture cellulaire
Actine SM
C

vWF
A

Techniques dtude des fonctions


cellulaires
Aspirating canula

Ultrasonic
dissociation

Dissociated
tissues

"human auto-culture medium"

Mthodes dtude in vivo


Greffes de cellules
cellules souches
cellules tumorales

Transfert de gnes
Souris transgniques
souris mucoviscidose
souris prdisposes au cancer

Souris Knock-out

Mthodes dtude in vivo


Modles de tumorigense

Tmoin

Volume tumoral

Anti-angiognique

Tmoin
Anti-angiognique

6
9
12
Temps (jours)

15

Mthodes dtude in vivo


Transfert de gnes :
Modifications exprimentales du patrimoine gntique

Transfert de gnes in vitro ou in vivo


Vecteurs viraux ou non viraux
Une exprience heureuse ou malheureuse lhpital Necker ?

Mthodes dtude in vivo


Transfert de gne
Promoteur

Intron

cDNA

AAAA

Profil dexpression
spatial et temporel

Gne dintrt

AAAA

Transgne
<1kb to >200kb

Mthodes dtude in vivo


Transfert de gne
Promoteur

cDNA

1- Constitutif
2- Spcifique dun tissu (Cerveau, foie, muscle )
3- Inductible (ttracycline, interfron...)

Gain de fonction

Perte de fonction

- Gne sauvage
- mutant

- dominant ngatif
- antisens

Mthodes dtude in vivo


Gne rapporteur :
Promoteur
du gne X

Promoteur
du gne X

Gne X

Gne rapporteur

- galactosidase
- Lucifrase
- GFP
- autres.

Aequorea victoria

GFP : Green Fluorescent Protein

Mthodes dtude in vivo


Green Fluorescent
Protein (GFP)

Tmoin

Mthodes dtude in vivo

Mthodes dtude in vivo


Cellules de
moelle osseuse
GFP

Coupes de cervelet
4 semaines

Souris irradie
lthalement

Cellules sanguines

15 semaines

Mthodes dtude in vivo


Hmisphre tmoin

Hmisphre ls

1j
Aprs lsion

14 j
Aprs lsion

Mthodes dtude in vivo


FVB/N-TgN(MMTVneu)202Mul
Promoter: MMTV, mouse mammary tumor virus
Gene : Erbb-2 (HER-2; HER2; Neu; Neu oncogene; c-erbB2; cneu; neu protooncogene)

Souris homozygotes viables et fertiles


Pas de phnotype chez les mles
Expression du transgne dtectable dans lpithlium
mammaire normal, les glandes salivaires et le poumon.
Tumeurs focales apparaissent autour de 4 mois

Exemple de thrapie gnique


Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999

Dficit Immunitaire Combin Svre li lX


(DICS-X)

Moelle osseuse : cellules prcurseurs

c : sous-unit des R des IL-2, 4, 7, 9, 15

c absente ou inoprante

Exemple de thrapie gnique


Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Dficit Immunitaire Combin Svre li lX (DICS-X)
10 patients de 1-9 mois
Aspiration mdullaire
Selection des progniteurs CD34+
Exposition des vecteurs rtroviraux contenant le
cDNA de la chane c
Greffe des cellules

Exemple de thrapie gnique


Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Suivi prcoce :
T, NK Reconstitution normale du pool
Rponses vaccinales normales
3 mois : Retour la maison

Exemple de thrapie gnique


Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999

Science 17th October 2003

Octobre 2002 : 2 patients dveloppent une leucmie


Vecteur rtroviral intgr dans ou proximit de LMO2
Surexpression de LMO2

Exemple de thrapie gnique


Alain Fischer, Hpital Necker, Paris - 1999
Intgration alatoire
Des rtrovirus
NON !!!
Insertion dans
la chromatine ouverte
transcriptionnellement active

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