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UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCA

Facult de Mdecine et de Pharmacie

BIOLOGIE CELLULAIRE
Pr TAHIRI JOUTI N.

Anne Universitaire 2014-2015

METHODES DETUDE DE LA CELLULE


LE NOYAU INTERPHASIQUE
LES CHROMOSOMES
LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES

METHODES DETUDE DE LA
CELLULE

- La connaissance des cellules dpend des


instruments dont nous disposons
- les progrs majeurs de la biologie cellulaire
souvent arrivs aprs lintroduction de
nouvelles techniques
Pour comprendre la biologie cellulaire, il est
donc ncessaire de connatre ces mthodes

METHODES DETUDE MICROSCOPIQUES


- MICROSCOPIE OPTIQUE (MO)

- MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)

Microscopie Optique
- Utilis en mdecine pour analyser des
prlvements tissulaires effectus chez le malade
pour poser et/ou complter un diagnostic donn.

- Il existe plusieurs types de prlvements:


- cytologique: frottis, aspiration, liquides
- histologique: biopsie, pice opratoire
en fonction de la nature du prlvement

Techniques Cytologiques Pour La


Microscopie Optique (1)

1. Frottis

Utilis pour des cellules libres, en


suspension:
- Sang
- Moelle osseuse
- Cellules de la muqueuse

vaginale (frottis vaginal)

Inclinaison de la lamelle (45) contre


la goutte de sang

Mettre la lamelle incline en contact


de la goutte du sang

Lamelle
Lame

Le sang stale par capillarit

Faire glisser la lamelle


entranement du sang par capillarit
frottis

2. Cytocentrifugation
Cytocentrifugeuse permet:
- La concentration cellulaire et
- Ltalement en monocouche

Techniques Cytologiques Pour La


Microscopie Optique (2)
Technique :
- Fixation par dessication
(schage par agitation lame)
- Coloration panoptique
(MGG)
* May Grnwald 3 min,
* Eau tamponne (pH 7) 1
min,
* Giemsa 10 min,
* Lavage eau courante)

- Schage et observation au
MO.

La Microscopie
Microscopie:
- utilise un flux ondulatoire de particules
ondulatoires:
non chargs: photons
Microscopie photonique ou optique
chargs : lectrons
Microscopie lectronique
- Ce flux traverse un systme de lentilles qui
permet dobserver une image agrandie.
Rsolution : Distance minimale entre deux points
voisins qui permet de les observer spars.

Le Microscope Optique (1)


Ou Microscope
photonique
- utilise la lumire visible
(photons)
- rsolution= 0.2m
- grossissement = 1000

Le Microscope Optique (2)


Le Microscope Optique
est constitu:
- dune lampe
photons
- de trois lentilles en
verre:
- Le Condenseur
- L Objectif
- L Oculaire

1. Oculaires
2. Glissire de rglage de
l'cartement inter-pupillaire
3. Tube binoculaire
4. Potence
5. Tourelle porte-Objectif
6. Vernier de positionnement avec
vis de dplacement bidirectionnel
du chariot
7. Chariot de fixation et de
positionnement de la lame porteobjet
8. Platine porte-objet
9. Vis macromtrique de mise au
point
10. Vis micromtrique de mise au
point
11. Vis de rglage de la hauteur du
Condenseur
12. Pied

diamtre : 15m

noyau: polylob (3 ou 4 lobes)


Cytoplasmes : grains
azurophiles = Fines granulations
pourpres = granulations Ires =
grands lysosomes

Techniques Histologiques pour la


Microscopie Optique (1)
Biopsie et coupe histologique
Technique utilise pour les tissus
(foie, peau,
muscle) qui
ncessite la ralisation de coupes
minces avant l'observation au
microscope.
La biopsie:
prlvement in vivo, d'un fragment
d'organe, dans le but de le
soumettre

un
examen
histologique,
le
prlvement
n'emportant pas la lsion dans sa
totalit.

Techniques Histologiques pour la


Microscopie Optique (2)

La Biopsie

Techniques Histologiques

Prlvement tissulaire

Diffrentes tapes techniques

Lame colore interprtable au microscope

La Fixation (1)
- Dfinition : conservation du prlvement dans

un tat aussi proche que possible de lETAT


VIVANT

- Mcanismes :
- inhibition de lautolyse cellulaire
- inhibition de la putrfaction
- ponts intermolculaires entre les
macromolcules

La Fixation (2)
Deux types de fixateurs:
- Fixateurs chimiques sont les plus utiliss ; ce sont
des composs qui font prcipiter ou coaguler les
macromolcules ;
Fixateurs simples: Formol, alcool thylique, acide actique,
acide picrique,
Fixateurs composs: mlange de Bouin, mlange de Carnoy, etc.

- Fixateurs physiques les plus utiliss en mdecine sont


lazote liquide (-196C) et la neige carbonique (-60C).
Principe: Conglation

Ralisation dune coupe histologique


Aprs fixation chimique (Formol)

Fixation formole
Circulation
Inclusion
Microtomie et coloration

La Circulation (1)
- Ncessit de rigidit du tissu
But : permettre la microtomie et la
ralisation de coupes minces

- Fixation durcit insuffisamment


Ncessit dimprgnation du tissu
par une matire rigide

La Circulation (2)
- milieux dinclusion : pas daffinit pour leau
Non miscibles leau
- Milieu dinclusion le plus utilis : la paraffine
(liquide 56C)

Il faut donc remplacer leau (fixateur en phase


aqueuse) par un solvant de la paraffine
permettre limprgnation la paraffine

Paraffine : pas daffinit pour leau


Non miscible leau
Prlvement
H2O

Ethanol

Imprgnation
la paraffine

Tolune

La Circulation (3)
La paraffine nest pas miscible leau,
linclusion doit donc tre prcde par :
- une Dshydratation dans des bains dalcools
concentration croissante
suivie
- de bains de tolune.

Cassette pour prlvement

- en plastique jetables pour tissus sont utilises pour contenir


et identifier les chantillons de tissus lors des procdures de
traitement,
d'inclusion
et
de
sectionnement.
- Surface incline permettant l'identification d'chantillons dans
toutes les tapes d'inclusion

La Circulation (4)
Dfinition : passage du prlvement dans une srie
de liquides intermdiaires

But : permettre limprgnation du prlvement par la


paraffine liquide

LInclusion (1)
- Dfinition : enrobage du prlvement
dans un bloc de paraffine
- But : permettre la manipulation et la
fixation du prlvement au niveau
du microtome

Station dEnrobage

Moule dInclusion

LInclusion (2)

LInclusion (3)

LInclusion (4)

Microtomie et Coloration

- confection et talement de coupes


tissulaires fines
- Colorations histochimiques des coupes
lame colore

Microtomie (1)
Les coupes

- doivent tre trs fines (3-4


m)

afin

que

la

lumire

(photons) du microscope puisse


les traverser.

sont

ralises

par

microtome quip dune lame

un

Microtomie (2)

Coupe au
microtome

Microtomie (3)

Coupes au microtome

Microtomie et Etalement
Coupes : (2-4m)
Porte-objet

Bloc de paraffine + pice

Bloc de
paraffine

pice
Lame

Lame

coupes

Coupes

Etalement des coupes sur la lame

Etalement des coupes (1)


Les

coupes

obtenues

sont tales et colles


sur des lames en verre

laide

deau

glatineuse
albumineuse

ou
sur

platine chauffante

une

Etalement des coupes (2)

Collage et schage des coupes


Etalement des coupes sur la
lame

La Coloration (1)
Permet daugmenter le contraste entre les structures
cellulaires qui ont des indices de rfraction trs voisins
et sont donc translucides au MO.
Un colorant est une substance colore qui transmet sa
couleur ; on rencontre des :
- colorants acides : ex. : osine colore le cytoplasme
en rose
- colorants basiques : ex.: hmatine colore le noyau
en bleu (autre: bleu de mthylne)

Coloration (2)
Il faut procder la rhydratation des coupes par
un:
1/ dparaffinage des coupes par un solvant de la
paraffine (tolune) ;
2/ passage dans ensuite des bains dalcools titre
dcroissant (100, 95, 70) qui permettent le
remplacement progressif de la paraffine par leau.
Car
Les colorants sont en phase aqueuse

Coloration (3)

Coloration (4)

Coloration (5)
On distingue:

- les colorations de base (HmatineEosine, Trichrome


de Masson)
- des colorations spciales
* Imprgnation argentique / fibres
(Fibrose)

de rticuline

* Coloration de Perls /fer (Hmosidrose)


* Coloration PAS (Priodic Acid Schiff) /glucides

Coloration Hmatine-Eosine ou H&E

Tissu Hpatique: Les capillaires


sinusodes sont entours par un
rseau de fibres rticuliniques,
soulignes
ici
par
une
imprgnation argentique
Coloration au nitrate dargent

Biopsie hpatique:
L'hmosidrose
est
une
surcharge
anormale
des
organes (particulirement du foie)
par l'hmosidrine, qui est un
pigment
insoluble
contenant
de l'hydroxyde de fer.
Coloration de Perls

Montage (1)
La coupe tissulaire se retrouve protge
entre lame et lamelle, colles lune lautre
laide dun liquide/rsine de montage = colle
Eukitt, No-Entellan
Mais ces colles ne sont pas miscibles leau

Montage (2)
Aprs coloration:
* Dshydratation dans des bains croissants

dalcool

suivie

* par un passage dans des bains de tolune

Montage (3)

Periodic Acid Schiff: PAS

Coloration des structures contenant


une
haute
proportion
de
glucides tels que le glycogne, les
glycoprotines et les protoglycanes

Utilise pour la dtection de certains


troubles du stockage de glycogne
dans les muscles stris
Trichrome de Masson

L'hmalun colore le noyau et les


substances basophiles eu bleuviolet;
le
ponceau-fuchsine
colore le cytoplasme en rougeros et le vert lumire ou le bleu
d'aniline
colore
les
fibres
conjonctives respectivement en
vert ou bleu.

LExamen Extemporan (1)


L'examen extemporan
- consiste raliser une coupe
histologique dun
prlvement ralis durant une intervention afin
d'orienter au mieux l'acte chirurgical.
- est indiqu pour :
* un choix immdiat entre deux gestes thrapeutiques
chirurgicaux

* Apprciation des limites ou de l'extension d'une


tumeur lors de son exrse

LExamen Extemporan (2)

Cet examen doit tre ralis dans des dlais


rduits (moins d'une demi-heure) alors que la
technique histopathologique standard est de
l'ordre de 24 heures aprs fixation.

LExamen Extemporan (3)


Technique
* Fixation par conglation
permet:
La fixation
Le durcissement de
lchantillon tissulaire.
* Ceci permet
ltape dinclusion.

dviter

Les Microscopes Optiques Spciaux (MOS)


Les MOS les plus utiliss en mdecine sont
le microscope fluorescence
le microscope contraste de phase

Microscope fluorescence (1)


Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications
qui portent sur la source lumineuse: UV au lieu de Visible
- Microscope fluorescence: microscope classique avec une

lampe vapeur de mercure sous pression.


- Certaines substances: Fluorochromes ont la proprit

dmettre une lumire visible lorsquelles reoivent un flux


de rayons ultra-violets.
- Le tissu peut mettre directement cette lumire ou bien
aprs avoir t imprgn de substances fluorochromes.

Microscope fluorescence (2)

- Fluorescein IsoThioCyanate: FITC fluorescence verte,


- Tetramethyl Rhodamine IsoThioCyanate: TRITC ,
fluorescence rouge
- Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndol
se fixe spcifiquement sur l'ADN

Microscope fluorescence (3)


1- il faut clairer la coupe histologique pour
exciter les molcules dont on veut obtenir la
fluorescence.
2- Une molcule fluorescente ne pourra tre
excite que par des radiations qu'elle peut
absorber.
3- Aprs avoir absorb la lumire
d'excitation, les molcules fluorescentes se
dsexcitent en mettant des photons.

Microscope fluorescence (4)


Un systme d'illumination sur le tube,
sous le bloc porte oculaire. Il comprend:
- une lampe vapeur de mercure entour
d'un miroir collecteur et d'une lentille
collectrice pour rcuprer un maximum la
lumire d'excitation.
- la lumire rencontre le filtre d'excitation.
- un intervalle spectral troit arrive sur le
miroir dichroque qui le rflchit vers le
bas, sur la prparation.
- La lumire d'excitation claire la
prparation par l'intermdiaire de
l'objectif.

Microscope fluorescence (5)


- Une partie des rayons diffuss
et mis par fluorescence
rentrent dans l'objectif et
remontent dans le tube o ils
rencontrent
le
miroir
dichroque qui laisse passer la
lumire sous cette incidence.
- Le filtre d'arrt bloque enfin la
lumire diffuse et seule la
lumire mise par fluorescence
remonte pour former l'image.

Microscope fluorescence (6)

Rsolution = 0.1m
FILTRE
DARRET

FILTRE
DEXCITATION

Techniques dImmunofluorescence (1)


La protine cellulaire mettre en vidence est
rvle grce un anticorps
- spcifique cette protine
- coupl un fluorochrome:
fluorescine, rhodamine
- La raction antigne-anticorps sur coupe
histologique est rvle par lmission de la
fluorescence
- La lecture de la lame se fait au microscope
fluorescence

Techniques dImmunofluorescence (1)

Techniques dImmunofluorescence (1)


- Couplage direct de lAc un fluorochrome : mthode
directe
- Application de lAc coupl au fluorochrome sur
coupe histologique susceptible de contenir lAg
spcifique
- Lavage liminant les Ac fluorescents non fixs par
lAg spcifique
- Observation au microscope fluorescence
du complexe Ac-Ag rendu fluorescent

Noyaux colors au DAPI

Estomac de souris

Neurones

Neurones du cervelet

Le Microscope Contraste de Phase (1)


-

La
diffraction
est
le
comportement
des ondes lumineuses lorsquelles rencontrent un
objet

- londe est diffuse par les points de l'objet.


- La diffraction se manifeste par le fait qu'aprs la
rencontre dun objet, la densit de l'onde lumineuse
nest pas conserve
- La diffraction est le rsultat de linterfrence des
ondes diffuses par chaque point.

Le Microscope Contraste de Phase (2)


-

Le microscope contraste de phase possde un


systme optique conu pour exploiter les proprits
de diffraction des cellules vivantes.

- La lumire traversant les parties relativement denses


ou paisses de la cellule est retarde par rapport
celle qui traverse une rgion voisine plus mince.
Cration des effets dinterfrences
produits par la recombinaison de ces
deux sries dondes
Images fortement contrastes

Le Microscope Contraste de Phase (2)


Quand les ondes lumineuses traversent
un objet non color:
- leur amplitude est trs peu change
- leur phase est modifie, ce qui cre
des interfrences.
Les effets de ces interfrences sont
exploits pour crer une image
Le

MCP est quip dobjectifs


spciaux
qui
transforme
les
diffrences
d'amplitude
en
diffrences de phase.

Le Microscope Contraste de Phase (3)


La lame de phase a deux effets
sur la composante de rflexion :
elle attnue considrablement son
intensit de manire la ramener
dans l'ordre de grandeur de
l'intensit de la diffusion
Un
dispositif
imageur
fait
converger les deux ondes au point
image P'.
L'intensit du point image est le
rsultat de l'interfrence des deux
ondes.
- deux ondes sont en phase le
point est brillant.
- deux ondes sont en opposition
de phase le point est sombre.

Les dfauts responsables de la


diffusion par diffraction apparaissent
ainsi par contraste.

Le Microscope Contraste de Phase (4)


Kratinocyte de la muqueuse
buccale
observ
au
microscope

lumire
transmise. Seul le noyau est
clairement observable

Kratinocyte de la muqueuse
buccale observ au microscope
contraste de phase .
Le noyau, ainsi que de nombreux
constituants
cytoplasmiques,
probablement
principalement
des
mitochondries, sont observables.

Le Microscope Contraste de Phase (5)

Cellules pithliales de Hamster


en
culture
observes
au
microscope contraste de phase

Microscopie Electronique (ME)


principal intrt:
Augmenter lagrandissement

Permettre lobservation
de lultrastructure
(organites) et des
reliefs cellulaires.
Rsolution = 1 2 nm

Microscope Electronique Transmission (1)


Au lieu dtre clair, lobjet
est bombard par un faisceau
dlectrons.
Limage mettra en vidence
les structures plus ou moins
opaques aux lectrons.
Le condenseur, lobjectif et
loculaire sont des bandes
magntiques

Microscope Electronique Transmission (2)


Un
systme
de
lentilles
magntiques permet de dvier
ou
focaliser
le
rayon
d'lectrons sur un chantillon
"extrmement fin".
L'image ou clich de diffraction
obtenue peut tre vue sur un
cran
phosphorescent,
enregistre
sur
un
film
photographique
ou
bien
dtecte par un capteur CCD.

Capteur CCD
- Le capteur CCD est une mmoire analogique qui
accumule des charges proportionnellement son temps
dexposition.
- Les trois lettres CCD signifie Charged Coupled Device
en franais DTC: dispositif transfert de charges qui
produit un signal vido partir des charges accumules
dans les lments du capteur.

Tube sous vide

Grille porte-objet

MET

MET

Prparations biologiques pour le MET :


Coupe ultramince (1)
Lobjet doit tre pralablement:
* coup en tranches ultrafines
* imprgn de sels de mtaux
lourds qui vont:
- se fixer diffrentiellement sur
les diffrentes structures
intracellulaires
- les rendre plus ou moins
opaques aux lectrons.

Prparations biologiques pour le MET :


Coupe ultramince (2)
Fixation : double fixation au glutaraldhyde puis au
ttroxyde dosmium
Le glutaraldhyde
pontages covalents
entre molcules protiques
Le ttroxyde dosmium
stabilisation des
doubles couches lipidiques et des protines mal ou
non fixes par le glutaraldhyde.
Inclusion : fait intervenir des rsines de synthse,
trs dures et transparentes aux lectrons (rsines
Epoxy, Araldite).

Prparations biologiques pour le MET :


Coupe ultramince (3)

Ultramicrotomie : coupes ultraminces (50-80 nm)


ralises par lultramicrotome quip dun couteau
en verre ou en diamant. Coupes recueillies sur des
grilles mtalliques.
Contrastage : Par des sels de mtaux lourds
(osmium, plomb, uranium) qui sont denses aux
lectrons.

Les structures cellulaires apparaissent plus ou moins


denses (noir et blanc) sur un fond clair

Pour augmenter le contraste des constituants


cellulaires, les coupes ultraminces sont trempes
dans une solution de sels de mtaux lourds
(actate duranyl et citrate de plomb)

Aspect Ultrastructural, MET

REG
Noyau

Aspect Ultrastructural, MET

Mitochondrie

Citernes de
REG

Prparations biologiques pour le MET :


Coloration Ngative (1)
Rappel:
En microscopie lectronique Transmission:

- lobjet ne peut tre visible que si, aprs fixation, il


est imprgn de substances contenant des atomes
de mtaux lourds opaques aux lectrons.
- La fixation et les ractions ultrieures peuvent
modifier notablement la structure de l'objet
biologique.

Prparations biologiques pour le MET :


Coloration Ngative (2)
Le contraste ngatif permet
d'assombrir le fond sans
colorer l'objet lui-mme et
donc de le rendre visible sans
le modifier, par simple
contraste.

Nuclocapside virus
de la rougeole

Prparations biologiques pour le MET :


Coloration Ngative (3)
Technique :
- Suspension dans une
solution opaque aux e- :
Acide Phosphotungstique
- dpt dune goutte de
cette suspension sur
une grille mtallique

- schage

Immunoglobine G: IgG

Prparations biologiques pour le MET :


Coloration Ngative (4)
Technique :

la substance opaque aux


e- se dpose autour de la
particule qui apparatra
claire sur un fond sombre

contraste inverse ou
ngatif
Papillomavirus Humain

Prparations biologiques pour le MET :


Coloration Ngative (5)
a) Particules virales,
isoles
d'une
verrue,
observes aprs coloration
ngative

l'acide
phosphotungstique.
b) Virions observs dans le
noyau d'un kratinocyte des
couches superficielles de
l'pithlium
malpighien.
Coloration
par
l'actate
d'uranyl et le citrate de
plomb.

Microscope Electronique Balayage (1)


- Permet lobservation des

reliefs ou images cellulaires


en 3 dimensions (3D).

Il est constitu :
-dun microscope faisceau
lectronique
- dun dtecteur de- dun convertisseur d e- dun moniteur (cran tl)

Microscope Electronique Balayage (2)


-

Le

microscope

lectronique balayage

utilise un faisceau trs


fin qui balaie point par
point

la

l'chantillon.

surface

de

Microscope Electronique Balayage (3)


Prparations biologiques pour le MEB

Matriel biologique :
cellules, bactries et virus.
Ces structures sont:
- fixes
- dshydrates
- recouvertes dune mince
couche de mtal (OrPalladium,
Platine)
vaporise sous vide.

Microscope Electronique Balayage (4)


Prparations biologiques pour le MEB
- la surface mtallise de lchantillon subit un balayage
rgulier par un faisceau dlectrons
- les surfaces en reliefs entranent lmission
dlectrons secondaires (points lumineux)
- Les dpressions sont sans mission dlectrons (points
sombres)
- Les lectrons mis sont collects par un dtecteur
dlectrons puis convertis en image par un
convertisseur dlectrons. Limage finale apparat en 3
dimensions sur un cran de tlvision.

Microscope Electronique Balayage (5)


Chromosomes X et Y

Globules Rouges

METHODES DETUDE
- BIOCHIMIQUE
- DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

METHODES DETUDE BIOCHIMIQUE

Fractionnement cellulaire par


ultracentrifugation
Spare en fractions les diffrents organites de

la cellule (noyau, mitochondries, etc.) en vue


dune tude biochimique.
Se droule en quatre tapes :
- Dissociation
- Isolement
- Eclatement
- Fractionnement cellulaire ou
subcellulaire

La Dissociation cellulaire
- Consiste dissocier les cellules
dun mme tissu
Broyeur de
Potter
- ralise mcaniquement ou
chimiquement.
Dissociation mcanique : dans
un milieu isotonique 0C avec
un broyeur cellulaire ou Potter.
Dissociation enzymatique : par
des
enzymes protolytiques
(trypsine ou collagnase) et des
Chlateurs de calcium (EDTA :
Ethylne Diamine Ttractique
Acide).

LIsolement / Tri cellulaire (1)


Spare les diffrentes catgories cellulaires rsultant
de la dissociation cellulaire.

Fait intervenir des anticorps fluorescents spcifiques


chaque catgorie cellulaire
Lisolement des cellules couples lanticorps
marqu est ralis par un appareil spcial pour le tri
cellulaire, le cytofluorimtre ou cytomtre en flux.
Cytomtrie en Flux: CMF

LIsolement / Tri cellulaire (2)


Principe et but de la
CMF:

Mesure (-mtrie) des


proprits optiques de
cellules (cyto-)
transportes par un
liquide vecteur (flux)
jusqu une source
dexcitation lumineuse
(souvent un laser)
Puis Tri Cellulaire

LEclatement cellulaire
Permet de recueillir le contenu de la cellule par lune
des techniques suivantes :
- Broyage mcanique au Potter
- Choc osmotique en milieu hypotonique (0,5% NaCl)
- Vibration ultrasonique
- Passage des cellules travers un petit orifice.
Au terme de cette tape, un lysat (homognat) avec
les diffrents organites mlangs est obtenu.

Le Fractionnement cellulaire
Les organites cellulaires sont spars en plusieurs
fractions contenant chacune un seul type
dorganites
La sparation se base sur la forme, la taille et la
densit des organites.
Deux procds diffrents sont utiliss :
- ultracentrifugation diffrentielle
- ultracentrifugation en gradient de
densit

Ultracentrifugation diffrentielle
- Cest une succession de centrifugations de plus en plus
rapides et de plus en plus prolonges.
- On retire le culot chaque tape et on
recentrifuge le surnageant.
- Lordre de sdimentation des organites est :
1. noyaux,
2. mitochondries,
3. lysosomes,
4. microsomes,
5. ribosomes,
6. ARN et cytosol

Ultracentrifugation en gradient de densit (1)

Ultracentrifugation :

- dans une solution (saccharose, chlorure de

csium) prsentant un gradient de concentration


dcroissant du bas vers le haut

- dans un tube essai avec des graduations de

concentrations ralises artificiellement.

Ultracentrifugation en gradient de densit (2)


Les organites mlangs sont
- introduits dans le tube
gradu
- centrifugs une seule fois
en utilisant le temps et la
vitesse les plus levs.

chaque type dorganites se rpartit


- sous forme dune bande spare
- dans la zone de gradient de densit voisine ou gale
la sienne.

Coefficient de sdimentation
- unit de vitesse de sdimentation (VS)
dans un champs centrifuge
- est exprime en Svedberg (S)
- propre chaque organite cellulaire.
Ex :
Ribosome procaryote : 70 S ;
Ribosome eucaryote : 80 S.

METHODES DETUDE DU
FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

Culture cellulaire (1)


Technique permettant de
maintenir
des
cellules
vivantes hors de lorganisme
(in vivo) dans des rcipients
de
culture
(in
vitro)
contenant
des
milieux
nutritifs
(pour
la
prolifration cellulaire) tout
en respectant les conditions
adquates de strilit, de
temprature et de pH.

Kratinocytes en culture

Culture cellulaire (2)


Technique
*Prlvement dun fragment tissulaire vivant

*Digestion par une enzyme dissociant les cellules ;


ex : trypsine, collagnase
*Numration cellulaire

*Addition dun milieu de culture (106cellules/10ml)


*Repiquage des cellules

Milieux de culture
- liquides ou solides (gel)
- composition chimique de base : eau, sels minraux,
vitamines, acides amins ou protines, glucose,
antibiotiques, srum de veau ftal (SVF) et facteurs de
croissance.
Ex. de milieu de culture : MEM , RPMI 1640
Facteur de croissance
- petit peptide scrt par un tissu pour stimuler la
croissance, la multiplication et la diffrenciation de ses
cellules et ou des cellules dautres tissus
- non vhicul par le sang et possde un rcepteur
spcifique au niveau des cellules de ce tissu ; ex. :
EGF, NGF (Epidermal Growth Factor, Nerve Growth
Factor).

Rcipients de culture
- sont en verre ou en plastique
(mono-usage).

- Exemples: les flacons, les


botes de Ptri, les tubes
essai, les plaques de puits.

Microscope invers
- La lumire arrive sur lchantillon
par le haut: la source de lumire
est
place
au-dessus
de
lchantillon
- Lobservation se fait par le dessus
- les objectifs en dessous.
Cette configuration non-standard
dobservation peut tre adapte
toutes les mthodes de microscopie
(fluorescence, contraste de phase).
Utilisation du microscope invers
Ce microscope est utilis pour lobservation de cellules en culture
in vitro, mais peut ltre en gnral pour observer des objets
pais ou situs sur le fond de botes de culture.

Conditions de culture
Strilit : maximum en
utilisant une hotte flux
laminaire, des lampes
UV germicides.
pH : 7 7, 4
Temprature : + 37C
(tuve)
Ambiance : 95 % dair
et 5 % de CO2 (tuve)
qui permet le maintien
du pH.

Comportement des cellules en culture (1)


Les cellules normales se divisent un certain
nombre de fois puis meurent (50 100 fois pour
les cellules de la peau) alors que les cellules
cancreuses sont immortelles in vitro; elles
constituent des lignes cellulaires spciales.

Ex de lignes cellulaires communes et immortelles in


vitro :
- souche Hla : cellules pithliales du col de
lutrus dHenriette Lacks dcde en 1953.
- souche KB : carcinome oral humain
- souche MRC-5 : poumon ftus humain.

Comportement des cellules en culture (2)

LInhibition de Contact : proprit des


cellules normales in vitro et qui se manifeste
par un arrt de leurs divisions lorsquelles
confluent (se touchent).

Marquage cellulaire (1)


Permet la dtection dune molcule cellulaire prcise aprs
marquage soit par des isotopes radioactifs soit par des anticorps.

Marquage par les isotopes radioactifs (IR)


Les IR sont des corps naturels qui
- diffrent lgrement par la masse de leurs noyaux
- ont le mme nombre dlectrons priphriques
- sont instables
- subissent des dsintgrations et des missions de particules
nergtiques ou radiations.
Les IR sont des traceurs du mtabolisme cellulaire. Ils
permettent de suivre la synthse dune molcule donne dans la
cellule.

Marquage cellulaire (2)


Dtection des IR
Compteur Geiger : les radiations des
IR ionisent un gaz qui se trouve dans
lappareil. La dtection se fait alors par
des bip Sonores.
Compteur

scintillation
ou
scintigraphe
- permet la dtection visuelle des
radiations des IR qui ionisent un liquide
scintillant dans lappareil

- Il y a mission de petits clairs


lumineux.
- Autoradiographie
ou autohistoradiographie : permet de
dtecter et de localiser les radiations des
IR sur des coupes histologiques.

Marquage cellulaire (3)


Technique
- Injection de lIR lanimal ou addition aux cellules en culture
- Prlvement des intervalles varis (t0, t1, t2, ...) de cellules ayant
intgres les IR
- Fixation et prparation des cellules pour le MO ou pour le ME
- Application dune mulsion photographique sur les coupes

- Maintien des coupes lobscurit pendant une dure (des jours ou des
semaines) ncessaire la dsintgration des IR

Observation des coupes au


- MO ou
- ME (dpts sombres sur les
zones de la coupe prsentant
des IR).

Marquage cellulaire (4)


Explication :
- Lmulsion photographique
est compose de bromure
dargent (Br-, Ag+).

- Les radiations mises par


les IR rduisent les grains
de
bromure
dargent
invisibles en grains dargent
visibles au niveau de la zone
cellulaire do elles sont
issues.