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UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCA Faculté de Médecine et de Pharmacie BIOLOGIE CELLULAIRE Pr TAHIRI JOUTI

UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCA

Faculté de Médecine et de Pharmacie

HASSAN II CASABLANCA Faculté de Médecine et de Pharmacie BIOLOGIE CELLULAIRE Pr TAHIRI JOUTI N .

BIOLOGIE CELLULAIRE

Pr TAHIRI JOUTI N.

Année Universitaire 2014-2015

METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE LE NOYAU INTERPHASIQUE LES CHROMOSOMES LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES
METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE
LE NOYAU INTERPHASIQUE
LES CHROMOSOMES
LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES
METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE
METHODES D’ETUDE DE LA
CELLULE
- La connaissance des cellules dépend des instruments dont nous disposons - les progrès majeurs
- La connaissance des cellules dépend des instruments dont nous disposons - les progrès majeurs

- La

connaissance

des

cellules

dépend

des

instruments dont nous disposons

- les progrès majeurs de la biologie cellulaire

souvent arrivés après l’introduction de nouvelles techniques

arrivés après l’introduction de nouvelles techniques Pour comprendre la biologie cellulaire, il est donc

Pour comprendre la biologie cellulaire, il est

donc nécessaire de connaître ces méthodes

METHODES D’ETUDE MICROSCOPIQUES

- MICROSCOPIE OPTIQUE (MO)

- MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)

Microscopie Optique

- Utilisé

analyser des

prélèvements tissulaires effectués chez le malade

pour poser et/ou compléter un diagnostic donné.

médecine

en

pour

- Il existe plusieurs types de prélèvements:

- cytologique: frottis, aspiration, liquides

- histologique: biopsie, pièce opératoire

en fonction de la nature du prélèvement

Techniques Cytologiques Pour La Microscopie Optique (1)
Techniques Cytologiques Pour La
Microscopie Optique (1)

1. Frottis

Utilisé pour des cellules libres, en

suspension:

- Sang

- Moelle osseuse

- Cellules de la muqueuse

vaginale (frottis vaginal)

pour des cellules libres, en suspension: - Sang - Moelle osseuse - Cellules de la muqueuse

Inclinaison de la lamelle (45°) contre la goutte de sang

Mettre la lamelle inclinée en contact de la goutte du sang

Lamelle Lame 1 2 3 4
Lamelle
Lame
1
2
3
4

Le sang s’étale par capillarité

Faire glisser la lamelle entraînement du sang par capillarité frottis

2. Cytocentrifugation

Cytocentrifugeuse permet:

- La concentration cellulaire et

- L’étalement en monocouche

2. Cytocentrifugation Cytocentrifugeuse permet: - La concentration cellulaire et - L’étalement en monocouche
2. Cytocentrifugation Cytocentrifugeuse permet: - La concentration cellulaire et - L’étalement en monocouche
Techniques Cytologiques Pour La Microscopie Optique (2)
Techniques Cytologiques Pour La
Microscopie Optique (2)

Technique :

- Fixation par dessication

(séchage par agitation lame)

- Coloration panoptique (MGG)

* May Grünwald 3 min,

* Eau tamponnée (pH 7) 1

min,

* Giemsa 10 min,

* Lavage eau courante)

- Séchage et observation au

MO.

rünwald 3 min, * Eau tamponnée (pH 7) 1 min, * G iemsa 10 min, *

La Microscopie

Microscopie:

-

ondulatoires:

utilise

flux

ondulatoire

de

particules

un

non chargés: photons Microscopie photonique ou optique

un non chargés: photons Microscopie photonique ou optique • - chargés : électrons Microscopie électronique Ce

-

chargés : électrons Microscopie électronique

Ce flux traverse un système de lentilles qui

Ce flux traverse un système de lentilles qui permet d’observer une image agrandie. Résolution :

permet d’observer une image agrandie.

Résolution : Distance minimale entre deux points voisins qui permet de les observer séparés.

Le Microscope Optique (1)

Ou Microscope

photonique

- utilise la lumière visible

(photons)

- résolution= 0.2μm

- grossissement = 1000

(1) Ou Microscope photonique - utilise la lumière visible (photons) - résolution= 0.2μm - grossissement =

Le Microscope Optique (2)

Le Microscope Optique

est constitué:

- d’une lampe à

photons

- de trois lentilles en verre:

- Le Condenseur

- L’ Objectif

- L’ Oculaire

- d’une lampe à photons - de trois lentilles en verre: - Le Condenseur - L’

1.

Oculaires

2.

Glissière de réglage de

l'écartement inter-pupillaire

3.

Tube binoculaire

4.

Potence

5.

Tourelle porte-Objectif

6.

Vernier de positionnement avec

vis de déplacement bidirectionnel du chariot

7. Chariot de fixation et de

positionnement de la lame porte-

objet

8. Platine porte-objet

9. Vis macrométrique de mise au

point

10. Vis micrométrique de mise au

point

11. Vis de réglage de la hauteur du

Condenseur

12. Pied

de mise au point 10. Vis micrométrique de mise au point 11. Vis de réglage de
 diamètre : 15µm  noyau: polylobé (3 ou 4 lobes  Cytoplasmes : grains
 diamètre : 15µm  noyau: polylobé (3 ou 4 lobes  Cytoplasmes : grains
 diamètre : 15µm  noyau: polylobé (3 ou 4 lobes  Cytoplasmes : grains
 diamètre : 15µm  noyau: polylobé (3 ou 4 lobes  Cytoplasmes : grains

diamètre : 15µm

noyau: polylobé (3 ou 4 lobes

Cytoplasmes : grains azurophiles = Fines granulations pourpres = granulations Ires = grands lysosomes

(3 ou 4 lobes  Cytoplasmes : grains azurophiles = Fines granulations pourpres = granulations Ires
Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (1)
Techniques Histologiques pour la
Microscopie Optique (1)

Biopsie et coupe histologique

Technique utilisée pour les tissus (foie, peau, muscle………) qui nécessite la réalisation de coupes minces avant l'observation au microscope.

La biopsie:

prélèvement in vivo, d'un fragment

le

d'organe,

soumettre

prélèvement

histologique,

n'emportant pas la lésion dans sa

totalité.

dans

à

le

but

de

un

examen

le

soumettre prélèvement histologique, n'emportant pas la lésion dans sa totalité . dans à le but de
soumettre prélèvement histologique, n'emportant pas la lésion dans sa totalité . dans à le but de
Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (2)
Techniques Histologiques pour la
Microscopie Optique (2)
Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (2) La Biopsie

La Biopsie

Techniques Histologiques pour la Microscopie Optique (2) La Biopsie
Techniques Histologiques
Techniques Histologiques

Prélèvement tissulaire

Techniques Histologiques Prélèvement tissulaire Différentes étapes techniques Lame colorée interprétable au

Différentes étapes techniques

Histologiques Prélèvement tissulaire Différentes étapes techniques Lame colorée interprétable au microscope

Lame colorée interprétable au microscope

La Fixation (1) - Définition : conservation du prélèvement dans un état aussi proche que

La Fixation (1)

- Définition : conservation du prélèvement dans un état aussi proche que possible de l’ETAT VIVANT

- Mécanismes :

- inhibition de l’autolyse cellulaire

- inhibition de la putréfaction - ponts intermoléculaires entre les macromolécules

La Fixation (2) Deux types de fixateurs: - Fixateurs chimiques sont les plus utilisés ;

La Fixation (2)

Deux types de fixateurs:

- Fixateurs chimiques sont les plus utilisés ; ce sont des composés qui font précipiter ou coaguler les macromolécules ;

Fixateurs simples: Formol, alcool éthylique, acide acétique, acide picrique, Fixateurs composés: mélange de Bouin, mélange de Carnoy, etc.

- Fixateurs physiques les plus utilisés en médecine sont

l’azote liquide (-196°C) et la neige carbonique (-60°C). Principe: Congélation

Réalisation d’une coupe histologique Après fixation chimique (Formol)
Réalisation d’une coupe histologique
Après fixation chimique (Formol)

Fixation formolée

histologique Après fixation chimique (Formol) Fixation formolée « Circulation » Inclusion Microtomie et coloration

« Circulation »

histologique Après fixation chimique (Formol) Fixation formolée « Circulation » Inclusion Microtomie et coloration

Inclusion

histologique Après fixation chimique (Formol) Fixation formolée « Circulation » Inclusion Microtomie et coloration

Microtomie et coloration

La Circulation (1) - Nécessité de rigidité du tissu But : permettre la microtomie et

La Circulation (1)

- Nécessité de rigidité du tissu

But : permettre la microtomie et la

réalisation de coupes minces

- Fixation durcit insuffisamment

de coupes minces - Fixation durcit insuffisamment Nécessité d’imprégnation du tissu par une matière

Nécessité d’imprégnation du tissu

par une matière rigide

La Circulation (2) - milieux d’inclusion : pas d’affinité pour l’eau Non miscibles à l’eau

La Circulation (2)

- milieux d’inclusion : pas d’affinité pour l’eau

milieux d’inclusion : pas d’affinité pour l’eau Non miscibles à l’eau - Milieu d’inclusion le plus

Non miscibles à l’eau

- Milieu d’inclusion le plus utilisé : la paraffine (liquide à 56°C)

le plus utilisé : la paraffine (liquide à 56°C) Il faut donc remplacer l’eau (fixateur en

Il faut donc remplacer l’eau (fixateur en phase aqueuse) par un solvant de la paraffine

l’eau (fixateur en phase aqueuse) par un solvant de la paraffine permettre l’imprégnation à la paraffine

permettre l’imprégnation à la paraffine

Paraffine : pas d’affinité pour l’eau

Paraffine : pas d’affinité pour l’eau Prélèvement Non miscible à l’eau Imprégnation à la paraffine H2O

Prélèvement

Non miscible à l’eau

Imprégnation à

la paraffine H2O Ethanol Toluène
la paraffine
H2O
Ethanol
Toluène
La Circulation (3)
La Circulation (3)

à

l’inclusion doit donc être précédée par :

La paraffine

n’est

miscible

pas

l’eau,

- une Déshydratation dans des bains d’alcools à concentration croissante

suivie

- de bains de toluène.

Cassette pour prélèvement

Cassette pour prélèvement - en plastique jetables pour tissus sont utilisées pour contenir et identifier les

- en plastique jetables pour tissus sont utilisées pour contenir

et identifier les échantillons de tissus lors des procédures de

traitement, d'inclusion

et

de

sectionnement.

- Surface inclinée permettant l'identification d'échantillons dans toutes les étapes d'inclusion

La Circulation (4)
La Circulation (4)

Définition : passage du prélèvement dans une série de liquides intermédiaires

du prélèvement dans une série de liquides intermédiaires But : permettre l’imprégnation du prélèvement par la

But : permettre l’imprégnation du prélèvement par la

paraffine liquide

L’Inclusion (1)
L’Inclusion (1)

- Définition : enrobage du prélèvement dans un bloc de paraffine

- But : permettre la manipulation et la fixation du prélèvement au niveau du microtome

Station d’Enrobage

Station d’Enrobage Moule d’Inclusion

Moule d’Inclusion

Station d’Enrobage Moule d’Inclusion
L’Inclusion (2)
L’Inclusion (2)
L’Inclusion (2)
L’Inclusion (3)
L’Inclusion (3)
L’Inclusion (3)
L’Inclusion (4)
L’Inclusion (4)
L’Inclusion (4)
Microtomie et Coloration
Microtomie et Coloration

- confection

et

étalement

tissulaires fines

de

coupes

- Colorations histochimiques des coupes

et Coloration - confection et étalement tissulaires fines de coupes - Colorations histochimiques des coupes lame

lame colorée

Microtomie (1)
Microtomie (1)
Microtomie (1) Les coupes - doivent être très fines (3-4 µm) afin que la lumière (photons)

Les coupes

- doivent être très fines (3-4

µm) afin que la lumière

(photons) du microscope puisse

les traverser.

sont

réalisées

-

microtome équipé d’une lame

par

un

Microtomie (2)

Microtomie (2) Coupe au microtome

Coupe au microtome

Microtomie (2) Coupe au microtome

Microtomie (3)

Microtomie (3) Coupes au microtome

Coupes au microtome

Microtomie et Etalement

Coupes : (2-4µm)

Porte-objet

Bloc de paraffine + pièce

Lame

Bloc de

paraffine

coupes

Coupes

pièce

Lame

Etalement des coupes sur la lame

Etalement des coupes (1)
Etalement des coupes (1)
Etalement des coupes (1) Les coupes obtenues sont étalées et collées sur des lames en verre

Les coupes obtenues

sont étalées et collées sur des lames en verre

à

l’aide

d’eau

gélatineuse

 

ou

albumineuse

sur

une

platine chauffante

Etalement des coupes (2)

Etalement des coupes (2) Collage et séchage des coupes Etalement des coupes sur la lame
Etalement des coupes (2) Collage et séchage des coupes Etalement des coupes sur la lame

Collage et séchage des coupes

Etalement des coupes (2) Collage et séchage des coupes Etalement des coupes sur la lame

Etalement des coupes sur la lame

La Coloration (1) Permet d’augmenter le contraste entre les structures cellulaires qui ont des indices

La Coloration (1)

Permet d’augmenter le contraste entre les structures

cellulaires qui ont des indices de réfraction très voisins et sont donc translucides au MO.

Un colorant est une substance colorée qui transmet sa couleur ; on rencontre des :

- colorants acides : ex. : éosine colore le cytoplasme en rose

- colorants basiques : ex.: hématéine colore le noyau

en bleu (autre: bleu de méthylène)

Coloration (2)

Coloration (2) Il faut procéder à la réhydratation des coupes par un: 1/ déparaffinage des coupes

Il faut procéder à la réhydratation des coupes par

un:

1/ déparaffinage des coupes par un solvant de la

paraffine (toluène) ;

2/ passage dans ensuite des bains d’alcools à titre décroissant (100°, 95°, 70°) qui permettent le remplacement progressif de la paraffine par l’eau.

Car

Les colorants sont en phase aqueuse

Coloration (3)
Coloration (3)
Coloration (4)
Coloration (4)
Coloration (4)
Coloration (4)
Coloration (5) On distingue: - les colorations de base ( H ématéine – E osine,

Coloration (5)

On distingue:

- les colorations de base (HématéineEosine, Trichrome

de Masson)

- des colorations spéciales

* Imprégnation argentique / fibres (Fibrose)

de réticuline

* Coloration de Perls /fer (Hémosidérose)

* Coloration PAS (Périodic Acid Schiff) /glucides

Coloration Hématéine-Eosine ou H&E
Coloration Hématéine-Eosine ou H&E
Coloration Hématéine-Eosine ou H&E
Coloration Hématéine-Eosine ou H&E
Tissu Hépatique: Les capillaires sinusoïdes sont entourés par un réseau de fibres réticuliniques, soulignées ici

Tissu Hépatique: Les capillaires sinusoïdes sont entourés par un réseau de fibres réticuliniques,

soulignées ici par une

imprégnation argentique

Coloration au nitrate d’argent

Biopsie hépatique:

L'hémosidérose est une

surcharge anormale des organes (particulièrement du foie) par l'hémosidérine, qui est un

pigment insoluble contenant

de l'hydroxyde de fer. Coloration de Perls

foie) par l'hémosidérine , qui est un pigment insoluble contenant de l' hydroxyde de fer .
Montage (1) La coupe tissulaire se retrouve « protégée » entre lame et lamelle, collées

Montage (1)

La coupe tissulaire se retrouve « protégée »

entre lame et lamelle, collées l’une à l’autre à

l’aide d’un liquide/résine de montage = colle

Eukitt, Néo-Entellan

Mais ces colles ne sont pas miscibles à l’eau

Montage (2) Après coloration: * Déshydratation dans des bains croissants d’alcool suivie * par un

Montage (2)

Après coloration:

* Déshydratation dans des bains croissants

d’alcool

suivie

* par un passage dans des bains de toluène

coloration: * Déshydratation dans des bains croissants d’alcool suivie * par un passage dans des bains
Montage (3)

Montage (3)

Montage (3)
Montage (3)

Periodic Acid Schiff: PAS

Periodic Acid Schiff: PAS L'hémalun colore le noyau et les substances basophiles eu bleu- violet; le

L'hémalun colore le noyau et les

substances basophiles eu bleu- violet; le ponceau-fuchsine colore le cytoplasme en rouge-

rosé et le vert lumière ou le bleu

d'aniline colore les fibres conjonctives respectivement en vert ou bleu.

Coloration des structures contenant

une haute proportion de

glucides tels que le glycogène, les glycoprotéines et les protéoglycanes

Utilisée pour la détection de certains

troubles du stockage de glycogène dans les muscles striés

Trichrome de Masson

Utilisée pour la détection de certains troubles du stockage de glycogène dans les muscles striés Trichrome
L’Examen Extemporané (1)
L’Examen Extemporané (1)

L'examen extemporané

- consiste à réaliser une coupe histologique d’un prélèvement réalisé durant une intervention afin

d'orienter au mieux l'acte chirurgical.

- est indiqué pour :

* un choix immédiat entre deux gestes thérapeutiques

chirurgicaux

* Appréciation des limites ou de l'extension d'une

tumeur lors de son exérèse

L’Examen Extemporané (2)
L’Examen Extemporané (2)

Cet examen doit être réalisé dans des délais réduits (moins d'une demi-heure) alors que la technique histopathologique standard est de l'ordre de 24 heures après fixation.

L’Examen Extemporané (3)

Technique

* Fixation par congélation permet:

La fixation

Le

durcissement

de

l’échantillon tissulaire.

*

l’étape d’inclusion.

Ceci

permet

d’éviter

La fixation – Le durcissement de l’échantillon tissulaire. * l’étape d’inclusion . Ceci permet d’éviter
Les Microscopes Optiques Spéciaux (MOS)
Les Microscopes Optiques Spéciaux (MOS)

Les MOS les plus utilisés en médecine sont

le microscope à fluorescence le microscope à contraste de phase

(MOS) Les MOS les plus utilisés en médecine sont le microscope à fluorescence le microscope à
(MOS) Les MOS les plus utilisés en médecine sont le microscope à fluorescence le microscope à
Microscope à fluorescence (1)
Microscope à fluorescence (1)
Microscope à fluorescence (1) Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications qui portent sur la source

Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications qui portent sur la source lumineuse: UV au lieu de Visible

- Microscope à fluorescence: microscope classique avec une

lampe à vapeur de mercure sous pression.

- Certaines substances: Fluorochromes ont la propriété

d’émettre une lumière visible lorsqu’elles reçoivent un flux

de rayons ultra-violets.

- Le tissu peut émettre directement cette lumière ou bien après avoir été imprégné de substances fluorochromes.

Microscope à fluorescence (2)
Microscope à fluorescence (2)

- Fluorescein IsoThioCyanate: FITC fluorescence verte,

- Tetramethyl Rhodamine IsoThioCyanate: TRITC ,

fluorescence rouge

- Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndol se fixe spécifiquement sur l'ADN

, fluorescence rouge - Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndol se fixe spécifiquement sur
Microscope à fluorescence (3)
Microscope à fluorescence (3)

1- il faut éclairer la coupe histologique pour

(3) 1- il faut éclairer la coupe histologique pour exciter les molécules dont on veut obtenir

exciter les molécules dont on veut obtenir la fluorescence.

2- Une molécule fluorescente ne pourra être

excitée que par des radiations qu'elle peut

absorber.

3- Après avoir absorbé la lumière d'excitation, les molécules fluorescentes se

désexcitent en émettant des photons.

Microscope à fluorescence (4) Un système d'illumination sur le tube, sous le bloc porte oculaire.
Microscope à fluorescence (4)
Un système d'illumination sur le tube,
sous le bloc porte oculaire. Il comprend:
- une lampe à vapeur de mercure entouré
d'un miroir collecteur et d'une lentille
collectrice pour récupérer un maximum la
lumière d'excitation.
- la lumière rencontre le filtre d'excitation.
- un intervalle spectral étroit arrive sur le
miroir dichroïque qui le réfléchit vers le
bas, sur la préparation.
-
La
lumière
d'excitation
éclaire
la
préparation
par
l'intermédiaire
de

l'objectif.

Microscope à fluorescence (5)
Microscope à fluorescence (5)
Microscope à fluorescence (5) - Une partie des rayons diffusés et émis par fluorescence rentrent dans

- Une partie des rayons diffusés

et émis par fluorescence rentrent dans l'objectif et remontent dans le tube où ils

rencontrent le miroir

dichroïque qui laisse passer la

lumière sous cette incidence.

- Le filtre d'arrêt bloque enfin la lumière diffusée et seule la lumière émise par fluorescence remonte pour former l'image.

Microscope à fluorescence (6)
Microscope à fluorescence (6)
Microscope à fluorescence (6) FILTRE D’ARRET FILTRE D’EXCITATION Résolution = 0.1μm
FILTRE D’ARRET FILTRE D’EXCITATION
FILTRE
D’ARRET
FILTRE
D’EXCITATION

Résolution = 0.1μm

Techniques d’Immunofluorescence (1)
Techniques d’Immunofluorescence (1)

La protéine cellulaire à mettre en évidence est révélée grâce à un anticorps

- La

- spécifique à cette protéine

- couplé à un fluorochrome:

fluorescéine,

rhodamine ………

réaction

antigène-anticorps

sur

coupe

histologique est révélée par l’émission de la

fluorescence

- La lecture de la lame se fait au microscope à

fluorescence

Techniques d’Immunofluorescence (1)
Techniques d’Immunofluorescence (1)
Techniques d’Immunofluorescence (1)
Techniques d’Immunofluorescence (1)
Techniques d’Immunofluorescence (1)

- Couplage direct de l’Ac à un fluorochrome : méthode directe

- Application de l’Ac couplé au fluorochrome sur

histologique

coupe

spécifique

susceptible

de

contenir

l’Ag

- Lavage éliminant les Ac fluorescents non fixés par

l’Ag spécifique

- Observation au microscope à fluorescence

du complexe Ac-Ag rendu fluorescent

Estomac de souris

Noyaux colorés au DAPI

E s t o m a c d e s o u r i s Noyaux

Neurones

E s t o m a c d e s o u r i s Noyaux
E s t o m a c d e s o u r i s Noyaux
E s t o m a c d e s o u r i s Noyaux
Neurones du cervelet
Neurones du cervelet
Neurones du cervelet
Neurones du cervelet

Neurones du cervelet

Le Microscope à Contraste de Phase (1)

-

La

diffraction

est

le

comportement

des ondes lumineuses lorsqu’elles rencontrent un

objet

- l’onde est diffusée par les points de l'objet.

- La diffraction se manifeste par le fait qu'après la rencontre d’un objet, la densité de l'onde lumineuse

n’est pas conservée

- La diffraction est le résultat de l’interférence des

ondes diffusées par chaque point.

Le Microscope à Contraste de Phase (2)

- Le microscope à contraste de phase possède un système optique conçu pour exploiter les propriétés

de diffraction des cellules vivantes.

- La lumière traversant les parties relativement denses

ou épaisses de la cellule est retardée par rapport à

celle qui traverse une région voisine plus mince.

Création des effets d’ interférences produits par la recombinaison de ces deux séries d’ondes des effets d’interférences produits par la recombinaison de ces deux séries d’ondes

Images fortement contrastées contrastées

Le Microscope à Contraste de Phase (2)

Quand les ondes lumineuses traversent un objet non coloré:

- leur amplitude est très peu changée

- leur phase est modifiée, ce qui crée des interférences.

Les effets de ces interférences sont

exploités pour créer une image

Le

équipé d’objectifs

spéciaux qui transforme les

différences d'amplitude en différences de phase.

MCP

est

Le équipé d’objectifs spéciaux qui transforme les différences d'amplitude en différences de phase. MCP est

Le Microscope à Contraste de Phase (3)

La lame de phase a deux effets

sur la composante de réflexion :

elle atténue considérablement son intensité de manière à la ramener

dans l'ordre de grandeur de

l'intensité de la diffusion

Un dispositif

converger les deux ondes au point

image P'.

imageur fait

L'intensité du point image est le résultat de l'interférence des deux

ondes.

- deux ondes sont en phase le point est brillant.

- deux ondes sont en opposition

de phase le point est sombre.

ondes sont en opposition de phase le point est sombre. Les défauts responsables de la diffusion

Les défauts responsables de la diffusion par diffraction apparaissent ainsi par contraste.

Le Microscope à Contraste de Phase (4)

Le Microscope à Contraste de Phase (4) Kératinocyte de la muqueuse buccale observé au lumière transmise.

Kératinocyte de la muqueuse

buccale

observé au

lumière

transmise. Seul le noyau est

clairement observable

microscope

à

Seul le noyau est clairement observable microscope à Kératinocyte de la muqueuse buccale observé au microscope

Kératinocyte de la muqueuse

buccale observé au microscope à contraste de phase . Le noyau, ainsi que de nombreux

constituants cytoplasmiques,

probablement principalement des mitochondries, sont observables.

Le Microscope à Contraste de Phase (5)

Le Microscope à Contraste de Phase (5) Cellules épithéliales de Hamster en culture observées au microscope

Cellules épithéliales de Hamster

en culture observées au microscope à contraste de phase

à Contraste de Phase (5) Cellules épithéliales de Hamster en culture observées au microscope à contraste
Microscopie Electronique (ME)
Microscopie Electronique (ME)

principal intérêt:

Augmenter l’agrandissement

(ME) principal intérêt: Augmenter l’agrandissement Permettre l’observation de l’ ultrastructure

Permettre l’observation

de l’ultrastructure

(organites) et des

reliefs cellulaires.

Résolution = 1 à 2 nm

Permettre l’observation de l’ ultrastructure (organites) et des reliefs cellulaires. Résolution = 1 à 2 nm

Microscope Electronique à Transmission (1)

Au lieu d’être éclairé, l’objet

est bombardé par un faisceau d’électrons.

L’image mettra en évidence les structures plus ou moins opaques aux électrons.

Le

l’oculaire

magnétiques

condenseur,

sont

l’objectif

des

et

bandes

structures plus ou moins opaques aux électrons. Le l’oculaire magnétiques condenseur, sont l’objectif des et bandes

Microscope Electronique à Transmission (2)

système de lentilles

magnétiques permet de dévier

ou focaliser le rayon d'électrons sur un échantillon

"extrêmement fin".

Un

L'image ou cliché de diffraction

obtenue peut être vue sur un

écran phosphorescent, enregistrée sur un film

photographique ou bien

détectée par un capteur CCD.

être vue sur un écran phosphorescent, enregistrée sur un film photographique ou bien détectée par un
Capteur CCD
Capteur CCD

- Le capteur CCD est une mémoire analogique qui

accumule des charges proportionnellement à son temps d’exposition.

- Les trois lettres CCD signifie Charged Coupled Device

en français DTC: “dispositif à transfert de charges” qui

produit un signal vidéo à partir des charges accumulées dans les éléments du capteur.

Tube sous vide Grille porte-objet MET

Tube sous vide

Grille porte-objet

Tube sous vide Grille porte-objet MET

MET

MET

MET
MET

Préparations biologiques pour le MET :

Coupe ultramince (1)

L’objet doit être préalablement:

* coupé en tranches ultrafines

* imprégné de sels de métaux lourds qui vont:

- se fixer différentiellement sur

les différentes structures

intracellulaires

- les rendre plus ou moins opaques aux électrons.

différentiellement sur les différentes structures intracellulaires - les rendre plus ou moins opaques aux électrons.
Préparations biologiques pour le MET : Coupe ultramince (2)
Préparations biologiques pour le MET :
Coupe ultramince (2)

Fixation : double fixation au glutaraldéhyde puis au tétroxyde d’osmium

Le glutaraldéhyde entre molécules protéiques

d’osmium Le glutaraldéhyde entre molécules protéiques pontages covalents Le tétroxyde d’osmium stabilisation

pontages covalents

Le tétroxyde d’osmium

protéiques pontages covalents Le tétroxyde d’osmium stabilisation des doubles couches lipidiques et des

stabilisation des

doubles couches lipidiques et des protéines mal ou non fixées par le glutaraldéhyde.

Inclusion : fait intervenir des résines de synthèse, très dures et transparentes aux électrons (résines

Epoxy, Araldite).

Préparations biologiques pour le MET : Coupe ultramince (3)
Préparations biologiques pour le MET :
Coupe ultramince (3)

Ultramicrotomie : coupes ultraminces (50-80 nm)

réalisées par l’ultramicrotome équipé d’un couteau en verre ou en diamant. Coupes recueillies sur des

grilles métalliques.

métaux lourds

(osmium, plomb, uranium) qui sont denses aux

Contrastage

Par

des

sels de

:

électrons.

sont denses aux Contrastage Par des sels de : électrons. Les structures cellulaires apparaissent plus ou

Les structures cellulaires apparaissent plus ou moins

denses (noir et blanc) sur un fond clair

Pour augmenter le contraste des constituants cellulaires, les coupes ultraminces sont trempées

dans une solution de sels de métaux lourds

(acétate d’uranyl et citrate de plomb)

ultraminces sont trempées dans une solution de sels de métaux lourds (acétate d’ uranyl et citrate

Aspect Ultrastructural, MET

Aspect Ultrastructural, MET REG Noyau

REG

Noyau

Aspect Ultrastructural, MET

Aspect Ultrastructural, MET Mitochondrie Citernes de REG

Mitochondrie

Aspect Ultrastructural, MET Mitochondrie Citernes de REG

Citernes de REG

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (1)
Préparations biologiques pour le MET :
Coloration Négative (1)

Rappel:

En microscopie électronique à Transmission:

- l’objet ne peut être visible que si, après fixation, il

est imprégné de substances contenant des atomes de métaux lourds opaques aux électrons.

- La fixation et les réactions ultérieures peuvent

modifier notablement la structure de l'objet

biologique.

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (2)
Préparations biologiques pour le MET :
Coloration Négative (2)
biologiques pour le MET : Coloration Négative (2) Le contraste négatif permet d'assombrir le fond

Le contraste négatif permet d'assombrir le fond sans

colorer l'objet lui-même et

donc de le rendre visible sans

le modifier, par simple

contraste.

Nucléocapside virus

de la rougeole

lui-même et donc de le rendre visible sans le modifier, par simple contraste. Nucléocapside virus de
Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (3)
Préparations biologiques pour le MET :
Coloration Négative (3)

Technique :

- Suspension dans une solution opaque aux e- :

Acide Phosphotungstique

- dépôt d’une goutte de cette suspension sur une grille métallique

- séchage

- dépôt d’une goutte de cette suspension sur une grille métallique - séchage Immunoglobine G: IgG

Immunoglobine G: IgG

Préparations biologiques pour le MET : Coloration Négative (4)
Préparations biologiques pour le MET :
Coloration Négative (4)

Technique :

la substance opaque aux e- se dépose autour de la particule qui apparaîtra claire sur un fond sombre

de la particule qui apparaîtra claire sur un fond sombre contraste inverse ou négatif Papillomavirus Humain

contraste inverse ou négatif

de la particule qui apparaîtra claire sur un fond sombre contraste inverse ou négatif Papillomavirus Humain

Papillomavirus Humain

Préparations biologiques pour le MET :

Coloration Négative (5)

biologiques pour le MET : Coloration Négative (5) a) Particules virales, isolées d'une verrue,
biologiques pour le MET : Coloration Négative (5) a) Particules virales, isolées d'une verrue,

a) Particules virales,

isolées

d'une

verrue,

observées

après

coloration

négative

phosphotungstique.

à

l'acide

b) Virions observés dans le noyau d'un kératinocyte des

couches superficielles de

l'épithélium malpighien. Coloration par l'acétate

d'uranyl et le citrate de

plomb.

Microscope Electronique à Balayage (1)

- Permet l’observation des reliefs ou images cellulaires en 3 dimensions (3D).

Il est constitué :

-d’un microscope à faisceau électronique

- d’un détecteur d’e-

- d’un convertisseur d’ e-

- d’un moniteur (écran télé)

électronique - d’un détecteur d’e - - d’un convertisseur d’ e- - d’un moniteur (écran télé)

Microscope Electronique à Balayage (2)

microscope

électronique à balayage

utilise un faisceau très

fin qui balaie point par

de

Le

-

point

l'échantillon.

la

surface

à balayage utilise un faisceau très fin qui balaie point par de Le - point l'échantillon.

Microscope Electronique à Balayage (3)

Préparations biologiques pour le MEB

Matériel biologique :

cellules, bactéries et virus.

Ces structures sont:

- fixées

-

déshydratées

-

recouvertes

d’une

mince

couche de

métal

(Or-

Palladium, vaporisée sous vide.

Platine)

- recouvertes d’une mince couche de métal (Or- Palladium, vaporisée sous vide. Platine)

Microscope Electronique à Balayage (4)

Préparations biologiques pour le MEB - la surface métallisée de l’échantillon subit un balayage régulier par un faisceau d’électrons

-

les

surfaces

en

par un faisceau d’électrons - les surfaces en reliefs entraînent l’émission d’électrons

reliefs

entraînent

l’émission

d’électrons secondaires (points lumineux)

- Les dépressions sont sans émission d’électrons (points sombres)

- Les électrons émis sont collectés par un détecteur d’électrons puis convertis en image par un convertisseur d’électrons. L’image finale apparaît en 3 dimensions sur un écran de télévision.

Microscope Electronique à Balayage (5)

Microscope Electronique à Balayage (5) Globules Rouges Chromosomes X et Y

Globules Rouges

Chromosomes X et Y

Microscope Electronique à Balayage (5) Globules Rouges Chromosomes X et Y

METHODES D’ETUDE

- BIOCHIMIQUE

- DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

METHODES D’ETUDE BIOCHIMIQUE

Fractionnement cellulaire par ultracentrifugation • Sépare en fractions les différents organites de la cellule

Fractionnement cellulaire par ultracentrifugation

Sépare en fractions les différents organites de la cellule (noyau, mitochondries, etc.) en vue

d’une étude biochimique.

Se déroule en quatre étapes :

- Dissociation

- Isolement

- Eclatement

- Fractionnement cellulaire ou

subcellulaire

La Dissociation cellulaire
La Dissociation cellulaire
La Dissociation cellulaire - Consiste à dissocier les cellules d’un même tissu - réalisée mécaniquement ou

- Consiste à dissocier les cellules d’un même tissu

- réalisée mécaniquement ou

chimiquement.

Dissociation mécanique : dans un milieu isotonique à 0°C avec un broyeur cellulaire ou Potter.

Dissociation enzymatique : par

des enzymes protéolytiques (trypsine ou collagénase) et des

Chélateurs de calcium (EDTA :

Ethylène Diamine Tétracétique Acide).

Broyeur de Potter
Broyeur de
Potter
L’Isolement / Tri cellulaire (1)
L’Isolement / Tri cellulaire (1)
L’Isolement / Tri cellulaire (1) Sépare les différentes catégories cellulaires résultant de la dissociation

Sépare les différentes catégories cellulaires résultant de la dissociation cellulaire.

Fait intervenir des anticorps fluorescents spécifiques

à chaque catégorie cellulaire

L’isolement des cellules couplées à l’anticorps

marqué est réalisé par un appareil spécial pour le tri cellulaire, le cytofluorimètre ou cytomètre en flux.

par un appareil spécial pour le tri cellulaire, le cytofluorimètre ou cytomètre en flux. Cytométrie en

Cytométrie en Flux: CMF

L’Isolement / Tri cellulaire (2) Principe et but de la CMF: Mesure (-métrie) des propriétés

L’Isolement / Tri cellulaire (2)

Principe

et

but

de

la

CMF:

Mesure (-métrie) des

propriétés optiques de

cellules (cyto-)

transportées par un

liquide vecteur (flux) jusqu’à une source

d’excitation lumineuse

(souvent un laser)

Puis Tri Cellulaire

par un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source d’excitation lumineuse (souvent un laser) Puis Tri Cellulaire
L’Eclatement cellulaire Permet de recueillir le contenu de la cellule par l’une des techniques suivantes

L’Eclatement cellulaire

Permet de recueillir le contenu de la cellule par l’une

des techniques suivantes :

- Broyage mécanique au Potter

- Choc osmotique en milieu hypotonique (0,5% NaCl)

- Vibration ultrasonique

- Passage des cellules à travers un petit orifice.

Au terme de cette étape, un lysat (homogénat) avec les différents organites mélangés est obtenu.

Le Fractionnement cellulaire
Le Fractionnement cellulaire
Le Fractionnement cellulaire Les organites cellulaires sont séparés en plusieurs fractions contenant chacune un

Les organites cellulaires sont séparés en plusieurs fractions contenant chacune un seul type d’organites

La séparation se base sur la forme, la taille et la densité des organites.

Deux procédés différents sont utilisés :

- ultracentrifugation différentielle - ultracentrifugation en gradient de densité

Ultracentrifugation différentielle

- C’est une succession de centrifugations de plus en plus rapides et de plus en plus prolongées.

-

On

recentrifuge le surnageant.

retire

le

culot

à

chaque

étape

et

on

- L’ordre de sédimentation des organites est :

1. noyaux, 2. mitochondries, 3. lysosomes, 4. microsomes,

5. ribosomes,

6. ARN et cytosol

Ultracentrifugation en gradient de densité (1)

Ultracentrifugation :

- dans une solution (saccharose, chlorure de césium) présentant un gradient de concentration

décroissant du bas vers le haut

- dans un tube à essai avec des graduations de concentrations réalisées artificiellement.

Ultracentrifugation en gradient de densité (2)

Ultracentrifugation en gradient de densité (2) Les organites mélangés sont - introduits dans le tube gradué

Les organites mélangés sont - introduits dans le tube

gradué

- centrifugés une seule fois en utilisant le temps et la

vitesse les plus élevés.

fois en utilisant le temps et la vitesse les plus élevés. chaque type d’organites se répartit

chaque type d’organites se répartit

- sous forme d’une bande séparée

- dans la zone de gradient de densité voisine ou égale à la sienne.

Coefficient de sédimentation

- unité de vitesse de sédimentation (VS) dans un champs centrifuge

- est exprimée en Svedberg (S)

- propre à chaque organite cellulaire. Ex :

Ribosome procaryote : 70 S ;

Ribosome eucaryote : 80 S.

METHODES D’ETUDE DU

FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

Culture cellulaire (1)
Culture cellulaire (1)

Technique permettant de

maintenir des cellules vivantes hors de l’organisme

(in vivo) dans des récipients de culture (in vitro)

contenant des milieux

nutritifs

(pour

la

prolifération cellulaire) tout

en respectant les conditions adéquates de stérilité, de

température et de pH.

tout en respectant les conditions adéquates de stérilité, de température et de pH. Kératinocytes en culture

Kératinocytes en culture

Culture cellulaire (2)
Culture cellulaire (2)

Technique

*Prélèvement d’un fragment tissulaire vivant

*Digestion par une enzyme dissociant les cellules ;

ex : trypsine, collagénase

*Numération cellulaire

*Addition d’un milieu de culture (10 6 cellules/10ml)

*Repiquage des cellules

Milieux de culture

- liquides ou solides (gel)

- composition chimique de base : eau, sels minéraux, vitamines, acides aminés ou protéines, glucose, antibiotiques, sérum de veau fœtal (SVF) et facteurs de croissance.

Ex. de milieu de culture : MEM , RPMI 1640

Facteur de croissance

- petit peptide sécrété par un tissu pour stimuler la

croissance, la multiplication et la différenciation de ses

cellules et ou des cellules d’autres tissus

- non véhiculé par le sang et possède un récepteur

spécifique au niveau des cellules de ce tissu ; ex.

:

EGF, NGF (Epidermal Growth Factor, Nerve Growth

Factor).

Récipients de culture

-

sont en verre ou en plastique (mono-usage).

- Exemples:

les

flacons,

les

boîtes de Pétri,

les tubes

à

essai, les plaques de puits.

Microscope inversé

- La lumière arrive sur l’échantillon par le haut: la source de lumière est placée au-dessus de l’échantillon

- L’observation se fait par le dessus

- les objectifs en dessous.

Cette configuration non-standard d’observation peut être adaptée à toutes les méthodes de microscopie

(fluorescence, contraste de phase).

de microscopie (fluorescence, contraste de phase … ). Utilisation du microscope inversé Ce microscope est

Utilisation du microscope inversé

Ce microscope est utilisé pour l’observation de cellules en culture in vitro, mais peut l’être en général pour observer des objets épais ou situés sur le fond de boîtes de culture.

Conditions de culture

Stérilité : maximum en

utilisant une hotte à flux

laminaire, des lampes à UV germicides.

pH : 7 à 7, 4

Température : + 37°C (étuve)

Ambiance : 95 % d’air

et 5 % de CO 2 (étuve) qui permet le maintien

du pH.

: + 37°C (étuve) • Ambiance : 95 % d’air et 5 % de CO 2

Comportement des cellules en culture (1)

Les cellules normales se divisent un certain nombre de fois puis meurent (50 à 100 fois pour

les cellules de la peau) alors que les cellules

cancéreuses sont immortelles in vitro; elles

constituent des lignées cellulaires spéciales.

Ex de lignées cellulaires communes et immortelles in

vitro :

- souche Héla : cellules épithéliales du col de

l’utérus d’Henriette Lacks décédée en 1953.

- souche KB : carcinome oral humain

- souche MRC-5 : poumon fœtus humain.

d’ He nriette La cks décédée en 1953. - souche KB : carcinome oral humain -

Comportement des cellules en culture (2)

Comportement des cellules en culture (2) L’Inhibition de Contact : propriété des cellules normales in vitro

L’Inhibition de Contact : propriété des

cellules normales in vitro et qui se manifeste

par un arrêt de leurs divisions lorsqu’elles

confluent (se touchent).

Marquage cellulaire (1)
Marquage cellulaire (1)

Permet la détection d’une molécule cellulaire précise après marquage soit par des isotopes radioactifs soit par des anticorps.

Marquage par les isotopes radioactifs (IR)

Les IR sont des corps naturels qui

- diffèrent légèrement par la masse de leurs noyaux

- ont le même nombre d’électrons périphériques

- sont instables

- subissent des désintégrations et des émissions de particules

énergétiques ou radiations.

Les IR sont des traceurs du métabolisme cellulaire. Ils permettent de suivre la synthèse d’une molécule donnée dans la cellule.

Marquage cellulaire (2)
Marquage cellulaire (2)

Détection des IR

Compteur Geiger : les radiations des IR ionisent un gaz qui se trouve dans

l’appareil. La détection se fait alors par

des bip Sonores.

Compteur à scintillation ou

scintigraphe

- permet la détection visuelle des radiations des IR qui ionisent un liquide scintillant dans l’appareil

-

éclairs

Il

émission

y

a

de

petits

lumineux.

- Autoradiographie

ou autohistoradiographie : permet de

détecter et de localiser les radiations des IR sur des coupes histologiques.

ou autohistoradiographie : permet de détecter et de localiser les radiations des IR sur des coupes

Marquage cellulaire (3)

Technique

- Injection de l’IR à l’animal ou addition aux cellules en culture

- Prélèvement à des intervalles variés (t0, t1, t2, intégrées les IR

- Fixation et préparation des cellules pour le MO ou pour le ME

- Application d’une émulsion photographique sur les coupes

- Maintien des coupes à l’obscurité pendant une durée (des jours ou des

) de cellules ayant

semaines) nécessaire à la désintégration des IR

Observation des coupes au

- MO

- ME (dépôts sombres sur les

zones de la coupe présentant

des IR).

ou

des IR Observation des coupes au - MO - ME (dépôts sombres sur les zones de

Marquage cellulaire (4)

Explication :

- L’émulsion photographique

est composée de bromure

d’argent (Br-, Ag+).

- Les radiations émises par

les IR réduisent les grains de bromure d’argent

invisibles en grains d’argent

visibles au niveau de la zone

cellulaire

sont

d’où

elles

issues.

bromure d’argent invisibles en grains d’argent visibles au niveau de la zone cellulaire sont d’où elles