RESUMEN

El presente trabajo hace parte de la prctica de laboratorios, como complemento del

Curso de Microbiologa II. Previamente hemos recorrido a travs de la lectura, los
contenidos del curso. Recoge la experiencia de seis laboratorios, lo cual comenz con la
toma de muestra de microorganismos de la cavidad oral con un hisopo esterilizado,
posteriormente se realiz una siembra homognea con asa en Loop en una placa Petri
con agar nutritivo dejndolo incubar durante una semana.
De los microorganismos obtenidos se escogieron dos colonias distintas, una de color
amarilla pequeas y la otra de color blanco medianas, ambas con aspecto redondeado,
las cuales se depositan en dos tubos que contienen caldo BHI (cerebro corazn) para su
proliferacin.
Se escogi el tubo ms turbio que indica mayor proliferacin de microorganismo, del cual
se saca un inculo y por medio de la tcnica agotamiento por estras se realiza el
aislamiento en Agar B Parker, Agar nutritivo y Agar sangre dejndolo incubar por una
semana.
De los 3 medios de cultivo se escogi la mejor colonia para posteriormente sembrarla en
una placa Petri con agar nutritivo, se deja incubar por 48 horas.
Despus del tiempo necesario se tom un inculo para realizar la tcnica tincin Gram,
posteriormente se llev a microscopio ptico para identificar el tipo de microorganismo
aislado, observando a una colonia pura de estafilococo spp.
Despus de identificar la bacteria se procedi a realizar pruebas bioqumicas especfica
para la bacteria que se identific anteriormente (DNasa, manitol, glucosa, Mc conkey,
Lactosa, Indole, Glucosa, Gelatina) junto con estas pruebas se realiz antibiograma
escogiendo tres antibiticos (Streptomicina, Gentamicina y cloxacilina) se dej incubar y
se observ que nuestra bacteria es resistente a la streptomicina y sensible a la cloxacilina
y gentamicina , siendo esta ltima la de mayor sensibilidad, finalizando lo que se detallar
en el siguiente informe.

ANTECEDENTES MICROORGANISMO
Staphylococcus Epidermidis, corresponde a la especie bacteriana del gnero
Staphylococcus y es parte de la flora comensal de la piel. Es un coco en racimos Gram
positivo de aproximadamente 1um de dimetro, sus colonias son circulares, prominentes,
brillantes de 1-2 mm de pigmentos blanco-amarillo. No son especulados y no tienen
cpsula salvo excepciones, son tambin inmviles. De sus caractersticas fisiolgicas
podemos destacar que son anaerobios facultativos muy resistentes a condiciones
ambientales adversas. Es coagulasa-negativa, termonucleasa-negativo aunque a veces
varia, y se presenta frecuentemente en la piel de humanos y de animales y en
membranas mucosas. Es sensible al antibitico novobiocina, siendo sta sensibilidad la
distincin de otros organismos comunes de coagulasa negativa como S. saprophyticus.
Suele no ser patgeno, pero en pacientes inmunes comprometidos pueden desarrollar
infecciones nosocomiales o adquiridas en la comunidad.

Estaphylococcus epidermidis es tambin una preocupacin para personas con catteres u

otros implantes quirrgicos, ya que causa biopelculas que crecen en este tipo de
dispositivos siendo un importante factor de virulencia.

Taxonoma

Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Cocci
Orden: Bacilares
Familia: Staphylococcaceae
Gnero: Staphylococcus
Especie: S. epidermidis

Microoscopa de barrido de S. epidermidis

Enfermedad Relacionada
Estafilococo epidermidis causa biopelculas que crecen en los dispositivos de plstico que
se colocan dentro del cuerpo. Esto ocurre ms comnmente en los catteres intravenosos
y prtesis mdicas. La infeccin tambin puede ocurrir en pacientes sometidos a dilisis o
a cualquier persona con un dispositivo plstico implantado que puede haber sido
contaminado. Otra enfermedad que causa es la endocarditis en pacientes con vlvulas
cardacas.
En relacin a su mecanismo de patogenicidad S. epidermidis elabora glicoclix, que le
permite adherirse a cuerpos extraos y as evitar la fagocitosis y accin de
antimicrobianos.

OBJETIVOS

Aislar microrganismo de la cavidad oral

Realizar tcnicas rigurosas en cada paso

Aplicar tcnicas aprendidas y estudiadas para identificacin de microorganismos

Observar las caractersticas de los microorganismos aislados

Realizar las pruebas correspondientes a cada microorganismo identificado

Esquematizar los procesos de las tcnicas a utilizar

Identificar los tipos de antibiticos a utilizar

INTRODUCCIN
La microbiota de la cavidad bucal es compleja y comprende ms de 700 especies,
que incluye microorganismos endgenos y exgenos capaces de colonizar y en algunos
casos comportarse como oportunistas si el medio bucal lo permite.
En la vida intrauterina la boca es estril, siendo el nacimiento el comienzo de la
colonizacin por bacterias del aparato urogenital de la madre y por bacterias del medio
ambiente, es por tanto que entre las 4 y 12 horas se establece Streptococcus procedentes
de la piel y/o mucosa de la madre. En los meses posteriores la colonizacin ser por parte
de organismos como estafilococos aerbios, anaerobios y diplococos entre otros.
Con la aparicin de la denticin se incorporan a la flora normal de la cavidad oral los S.
mutans, S. sanguis, espiroquetas anaerobias, bacteroides, fusobacterios, algunos
vibriones anaerobios y lactobacilos.
El siguiente informe detalla las actividades realizadas en las practicas de laboratorio con
el fin de obtener informacin sobre la presencia o ausencia de microorganismos
existentes en la cavidad oral y que pueden estar implicados en un proceso patolgico,
siendo sta herramienta la que nos permita conocer la etiologa microbiana de una
enfermedad y as seleccionar el antimicrobiano adecuado y tambin, determinar la
eficacia del tratamiento realizado.

PROTOCOLO DE TRABAJO

PRCTICO 1

10 Agosto 2015

Se realiza toma de muestra de la cavidad oral depositndolo en agar nutritivo con tcnica
de homogeneizacin.
PRCTICO 2

17 Agosto 2015

Se realiza la seleccin de las colonias crecidas en el agar nutritivo. La colonia es

depositada en dos tubos que contienen caldo BHI cerebro corazn para su proliferacin
* Colonia 1: de aspecto redondeado, tamao pequeo y color amarillo.
* Colonia 2: de aspecto redondeado, tamao mediano y color blanquecino
PRCTICO 3

07 Septiembre de 2015

De los tubos en ste prctico se selecciona el tubo que contiene la muestra de mayor
turbiedad y se procede a:
1-. Con el fin de aislar colonias de Staphiloccocus aureus se utiliza Agar Baird Parker, el
cual corresponde a un medio selectivo, lo que nos permitir posteriormente la deteccin
de ste tipo de microorganismo.
La tcnica utilizada fue agotamiento por estras.
Para determinar la existencia de microorganismo exigentes se utiliz un medio de
enriquecimiento y diferencial como Agar sangre el cual nos permite determinar la
hemlisis, la que corresponde a un criterio bsico en la orientacin a la diferenciacin
bacteriana.
La hemlisis es la descomposicin de los glbulos rojos. La capacidad de las colonias
bacterianas para inducir la hemlisis cuando se cultiva en agar sangre se utiliza
principalmente para clasificacin de estreptococos.
La tcnica utilizada fue siembra en zigzag.
PRCTICO 4

21 Septiembre de 2015

En este prctico se realiz tincin GRAM, la cual corresponde a una tincin diferencial
que nos permite reconocer dos grupos de bacterias, GRAM positivas y GRAM negativas.
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min.
Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lsis
osmotica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula GRAM positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano as como algo de acido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la clula GRAM positiva es peptidoglicano. La pared de la clula
gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacaridos, y lipoprotenas. Solo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa
es peptidoglicano.
Al microscopio se pudo observar: Un grupo de microrganismo de color violeta con forma
de coco en racimos. Estaphylococcus
PRCTICO 5

02 Noviembre de 2015

Realizacin de pruebas bioqumicas, en cul se hicieron las siguientes pruebas:

MC Conkey, Lactosa, Manitol, Glucosa, MR-VP, AP, Lia, TSI, CS , DNAsa y Gelatina
Tambin se realizaron pruebas sensibilidad en un antibiograma con 3 tipos de antibiticos
que fueron:

Streptomicina, Cloxacilina y Gentamicina.

PRCTICO 6

16 Noviembre de 2015

Se analizaron los resultados de la pruebas bioqumicas realizadas en el laboratorio

anterior junto al resultado del antibiograma. Se registraron los datos necesarios para la
realizacin de nuestro informe
DIAGRAMA PROTOCOLO
Tec. Homogenea

TOMA DE MUESTRA

Hisopo con MO cavidad oral

Depositar en 2 tubos con caldo BHI

Escoger el tubo mas turbio

Aislamiento por estras

Siembra en agar nutritivo

Escoger 2 colonias

Agar B. Parker
Agar nutritivo

Sembrar en Agar Nutritivo

Escoger un inculo

Antibiograma

Streptomicina
Cloxacilina
Gentamicina

Escoger la mejor colonia de los 3 cultivos

Tincin Gram

Agar Sangre

Identificacin bacteria

Observacin en microscipio optico

MCConkey Lactosa Manitol Glucosa MR-VP

AP
Pruebas Bioqumicas
Lia
TSI
CS
DNAsa Gelatina

MEDIOS DE CULTIVOS UTILIZADOS

Agar nutritivo
Tecnica: Homognea
Practico 1 y 3
Realizar movimientos circulares y de vaivn
Incubar invertidas a 37C durante 48 horas

Caldo BHI
Tecnica: Siembra en caldo nutritivo
Prctico 2
Tome el asa loop y esterilice
Tomar un inculo del agar nutritivo
Introduzca el asa con el microrganismo dentro del caldo
Flamear y tapar el tubo
Esterilizar el asa en el mechero

Agar B. Parker, Agar Nutritivo, Agar sangre

Tecnica: Agotamiento por estra
Prctico 3

Tomar un inculo del Caldo BHI con el asa estril

El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al
borde
Se esteriliza el asa y a partir del depsito anterior de traza otra estra
Luego repetir lo mismo
Despus no se debe esterilizar el asa y se traza la ltima estra
Se tapa la placa y se esteriliza el asa.

PRUEBAS REALIZADAS
Tincin Gram

Prctico 4

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial

empleado en bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en
muestras clnicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular
bacteriana, como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin
bacteriana, considerndose bacterias gram positivas a las que se visualizan de
color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa,
roja.
Pruebas Bioqumicas

Prctico 5

MCConkey
Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de
las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces
de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando
colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al
precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras.
Lactosa
Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa
resultando una reaccin cida en la superficie (amarilla) y cida en el fondo
(amarilla, a/a).
Manitol
Determina la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato
incorporado a un medio, produciendo cido y/o gas en una campana de Durham;
el medio es lquido y como indicador contiene rojo de fenol.
Glucosa
Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una
reaccin alcalina en la superficie ( roja) sobre un fondo cido (amarillo, k/a) debido
a que realizan una degradacin aerbica de la glucosa en la superficie,
convirtiendo el piruvato en agua y dixido de carbono
MR-VP
Voges-Proskauer es un epnimo doble, en honor de dos microbilogos que
trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en
observar la reaccin de color rojo producida en medios de cultivo adecuados
despus del tratamiento con hidrxido de potasio. Luego se descubri que el
producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil
metil carbinol, producto de la va del butilenglicol.

Indole
Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias,
si esta presente degradar el triptofano y liberar al medio Indol, para revelar su
presencia usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formar un anillo rojo en
la superficie, sino este ser amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptofano
Lia
Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido
(lisina y arginina) para formar una amina.
El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para darcadaverina y CO2
por accin de la enzima especfica lisina-descarboxilasa.
TSI
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono
especfico incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de
gases, junto con la determinacin de posible cido sulfhdrico.
Citrato
Es una sal del acido ctrico. Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes
distintas de la fermentacin de los hidratos de carbono, con el citrato como nica
fuente de carbono. La medicin de esta caracterstica es importante para
identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio
usado para detectar la utilizacin del citrato por las bacterias que se van a probar
debe carecer de protenas e hidratos de carbono como fuente de carbono.
DNAsa
El alto nivel de cido desoxirribonucleico molecular hace posible la deteccin de la
desoxirribonucleasa (DNasa) que despolimeriza el ADN. Despus de la incubacin
del medio con la cepa de prueba, la placa se inunda con cido clorhdrico, que
causa la precipitacin del ADN polimerizado y hace al medio opaco. Los
organismos que degradan el ADN producen una zona transparente alrededor del
rea de crecimiento. Este medio se utiliza principalmente en la identificacin de los
estafilococos, pero tambin puede usarse para la deteccin de la actividad de la
DNasa en otros microorganismos.

Imagen tomada durante la realizacin de las pruebas bioqumicas

Gelatina
Aunque el valor de la gelatina como fuente nutricional es cuestionable ( dado que
es una protena incompleta, carece del aminocido esencial triptofano), su valor
comoprueba de identificacin de microorganismos se encuentra bien establecida. La
gelatina es una protena proveniente de la hidrlisis del colgeno, uno de los componentes
importantes del tejido conectivo y de los tendones en los humanos y otros animales.
Las protenas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar enla
clula bacteriana.

ANTIBIOGRAMA
Prctico 5
Segn la sepa obtenida, se escogieron 3 antibiticos, con el fin de identificar
nuestro microorganismo en placa Muller-Hilton.
Streptomicina
La estreptomicina fue el primer antibitico descubierto del grupo de los
aminoglucsidos; tambin fue el primer frmaco de la era de la quimioterapia
usado en el tratamiento de la tuberculosis. Es un antibitico bactericida de
espectro pequeo, derivado de la actinobacteria Streptomyces griseus.

Se distribuye en plasma extracelular y en mltiples tejidos del organismo,

exceptuando el cerebro; asimismo alcanza slo concentraciones muy bajas en
lquido cefalorraqudeo (LCR o cerebroespinal) en secreciones bronquiales y
vaginales, as mismo se puede encontrar un olor nauseabundo caracterstico a
heces.
La estreptomicina no penetra bien al interior de las clulas, por lo que es un
agente con efecto en contra de los bacilos exclusivamente extracelulares. Como
consecuencia, el tratamiento de la tuberculosis requiere el uso de agentes que
eliminen las bacterias intracelulares, que son el componente principal de la
infeccin tuberculosa.
Cloxacilina
Ejerce su actividad bactericida sobre el crecimiento y divisin de la bacteria
mediante la inhibicin de la sntesis de la pared celular bacteriana, aunque an no
se conocen exactamente los mecanismos implicados. Los peptidoglicanos
mantienen la pared celular bacteriana rgida, protegiendo a la bacteria contra la
ruptura osmtica.
Las bencilpenicilinas inhiben el paso final de la unin del peptidoglicano mediante
su unin a las transpeptidasas, protenas fijadoras de penicilinas [PBP), que estn
situadas en la superficie interior de la membrana celular bacteriana,
inactivndolas.
Otros mecanismos implicados incluyen la lisis bacteriana a causa de la
inactivacin de inhibidores endgenos de autolisinas bacterianas.
Concentraciones de cloxacilina de 0,1 a 0,8 mcg/ml inhiben in vitro cepas no
productoras de penicilinasa de Staphylococcus aureus y concentraciones de 0,3 a
1,6 mcg/ml inhiben in vitro cepas productoras de penicilinasa de S. aureus. S.
saprophyticus es inhibido in vitro por cloxacilina a concentraciones de 1 a 2
mcg/ml.
Gentamicina
La gentamicina es un aminoglucsido. Se emplea como antibitico para erradicar
infecciones contra bacterias sensibles. Sirve para tratar diversas enfermedades
graves de piel, pulmn, estmago, vas urinarias y sangre, as como heridas
cutneas y en el ojo. Su uso est indicado cuando la administracin de otros
antibiticos menos potentes haya sido ineficaz. Debido a su gran toxicidad y a los
mltiples efectos secundarios, ha de evitarse su uso si no es estrictamente
necesario. Se concentran en odo y rin, por lo tanto tienen efectos secundarios
ototxicos y nefrotxicos.

Su mecanismo de accin consiste en interferir en la sntesis normal de protenas,

originando protenas no funcionales en microorganismos susceptibles.
Para ejercer su accin deben ingresar en la clula bacteriana. Esto ocurre en 2
etapas por un mecanismo de transporte activo. En la primera fase, el ingreso a la
clula depende del potencial transmembrana generado por el metabolismo
aerobio. La segunda fase es de ingreso acelerado, y se ve favorecida por la unin
previa del aminoglucsido al ribosoma bacteriano. Ciertas condiciones que
reducen el potencial elctrico de la membrana como la anaerobiosis o el bajo pH
del medio, disminuyen el ingreso de estos compuestos al citoplasma bacteriano.
Una vez dentro de la clula, los aminoglucsidos se unen de manera irreversible a
la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. Esta unin interfiere con la elongacin
de la cadena peptdica. Tambin causan lecturas incorrectas del cdigo gentico
formndose protenas anmalas. Algunas de estas son protenas de membrana y
el resultado es la formacin de canales que permiten el ingreso de ms drogas a
la clula.

RESULTADOS
En el prctico N 6 se realizaron pruebas bioqumicas las que arrojaron el
siguiente resultado:
Prueba
bioqmica

Resulta
do

Observacin

Interpretacin

MC Conkey

Se observ microrganismo de color

rosa

Fermentadora de lactosa

Lactosa

Presencia de burbujas con fondo

turbio

Capacidad de fermentar lac

Manitol

Sin presencia de burbujas, color

amarillo

Sin capacidad de fermentar

Glucosa

Presencia de burbujas con fondo

turbio

Capacidad de fermentar glu

MR-VP

Color amarillo

La produccin de cido no e
Suficiente para bajar el ph

AP

Lia

K/K

Se observ el medio de color

amarillo

No producto de degradacin

Presencia de un color Violeta

Reaccin alcalina,decarbox

triptfano

Lisina
TSI
CS

A-A
-

Color amarillo, reaccin acida

Fermentacin glucosa y lac

Se observ el medio de color verde

Microrganismo sin capacida

Producir subproducto
Alcalino

DNAsa

Gelatina

Tabla de
pruebas
realizadas en
microorganismo
microbiologa

ANTIBIOGRAMA

No hubo observacin de halo

No hay presencia de enzima
alrededor del crecimiento bacteriano
desoxirribonucleasa
Se observ precipitacin de la estra

Produce Enzima proteoltica

resultados de
bioqumicas
laboratorio
cavidad oral
2015

Antibiticos

Observacin

Interpretacin

Streptomicina

Sin Halo

Resistente

Cloxacilina

15 mm

Medianamente sensible

Gentamicina

20 mm

Sensible

CONCLUSIN

En conclusin y segn las pruebas realizadas en laboratorio se puede determinar que la

muestra de la mucosa oral aislada es una colonia de Staphylococcus epidermidis, siendo
descartado el Staphylococcus aureus ya que la prueba DNAsa dio como resultado
negativo, siendo sta prueba utilizada para identificar especies como S. aureus por su
capacidad de producir DNAsa termoestable que hidroliza DNA.
Por otro lado se determina gracias a la tincin Gram, que se trata de una bacteria Gram
positiva, que se ti de violeta y la que al ser observada al microscopio presenta una

forma coccea dispuesta en racimos, lo que afirma nuestra teora de ser un

Staphylococcus.
Finalmente se procedi a realizar la prueba de antibiograma, la que nos describe
mediante halos dispuestos alrededor de los antibiticos la eficacia de stos sobre el
microorganismo, siendo la Gentamicina la ms sensible para nuestra bacteria con un halo
de 4cm de dimetro. Gracias a sta prueba fue que pudimos determinar que corresponda
a Staphylococcus epidermidis ya que la gentamcina acta sobre S. aureus y S.
epidermidis, pero como se mencion anteriormente S. aureus fue descartado de
inmediato al arrojar en la prueba de la DNAsa negativo.

BIBLIOGRAFA

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Medl