Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa

Laboratorio de Gentica y Biologa Molecular

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DEL ADN

Asignatura: Laboratorio Gentica

Profesor(a): Marcela Aranda
Carlos Valdez
Integrantes: Cynthia Cerda
Karen Rodrguez
Nathalia Miranda

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Laboratorio de Gentica y Biologa Molecular

Introduccin
En el presente laboratorio se llev a cabo la tcnica de extraccin de ADN y
posteriormente la separacin de fragmentos de ADN mediante la tcnica de
electroforesis.
El ADN es una molcula presente en todas las clulas de los seres vivos y es
la encargada de codificar todo lo que nosotros somos, desde el color de los
ojos hasta nuestras protenas.
Para la extraccin de ADN de una estructura se requieren 3 pasos bsicos y
fundamentales que son lisis celular, desnaturalizacin de protenas y
precipitacin del ADN.
La lisis celular es la degradacin de membranas plasmticas mediante el uso
de detergentes o proteasas, la desnaturalizacin de protenas se realiza
mediante la adicin de sales que aumentan la fuerza inica y finalmente la
precipitacin del ADN se realiza mediante etanol (Informacin tomada de la
gua de laboratorio n3).
El PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa) es una tcnica que permite
obtener un gran nmero de copias de fragmentos de DNA, partiendo de una
nica copia o fragmento molde. Por lo tanto esta tcnica permite amplificar
un fragmento de DNA, siento esto de gran utilidad para estudios cientficos.
Esto se fundamenta en la habilidad de las DNA polimerasas para replicar
hebras de DNA, para lo cual emplean ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras formadas tras la replicacin y a
continuacin dejar que se vuelvan a unir para que puedan ser replicadas
nuevamente. Los productos de PCR se pueden mostrar en geles de agarosa
por medio de electroforesis.1

1 Nelson David L. Michael M. Cox (2009), Lehninger: Principios de Bioqumica. Quinta Edicin, Espaa, Editorial
Omega, captulo 9, pgina 317-318

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Imagen 1. Aqu se muestra la Tcnica de PCR, donde a partir de un pequeo fragmento se

obtiene varias copias.

Existen tcnicas de separacin de DNA, y que por lo tanto ayudan a

determinar la pureza del DNA extrado, entre ellas se encuentra la
electroforesis.
La electroforesis es una tcnica que se basa en el desplazamiento de
molculas cargadas en un campo elctrico. Es til como mtodo analtico y
su ventaja es que las molculas pueden visualizarse adems de separarse, lo
que le permite al investigador, hacer una estimacin rpida del nmero de
molculas en la mezcla y determinar sus propiedades2.
La electroforesis de protenas se lleva a cabo generalmente en geles
formados por el polmero entrecruzado poliacrilamida 3. En el gel se pueden
encontrar dos regiones, la parte de arriba que se conoce como concentrador
2 // Nelson David L. Michael M. Cox (2009), Lehninger: Principios de Bioqumica. Quinta Edicin,
Espaa, Editorial Omega, Capitulo 3 pgina 88

3 // Nelson David L. Michael M. Cox (2009), Lehninger: Principios de Bioqumica. Quinta Edicin,
Espaa, Editorial Omega, Capitulo 3 pgina 88-90.

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y la parte de abajo como separador (ver imagen 1), en el gel concentrador el

tamao de los poros del entrecruzado es ms grande que en el separador.

Imagen 2. Aqu se muestra el gel concentrador en la parte superior y el gel separador, el

cual se encuentra bajo el concentrador.

El bromuro de Etidio es un reactivo intercalante que se utiliza como

marcador de cidos nucleicos y cuando se expone a la luz UV (264-366nm)
torna coloracin roja-anaranjada, esta se torna 20 veces ms evidente al
unirse a una cadena de ADN, con lo cual se puede observar las bandas de
ADN en el gel.

Imagen 3. Aqu se muestra el Bromuro de Etidio como reactivo intercalante el cual torna
coloracin rojo-anaranjado.

La Polimerasa Taq es una enzima encargada del copiado de las cadenas a

partir de los cebadores, esta proviene de bacterias termfilas y por lo tanto
es estable a temperaturas elevadas.

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El Gliceraldehdo-3-fosafato Deshidrogenasa es una enzima implicada en una

de las reacciones ms importantes de la Gluclisis, puesto que cataliza el
primer intermediario de elevada energa y adems genera NADH.
Objetivos
Realizar la extraccin de ADN a partir de un cultivo de clulas ERG-2.
Observar la estructura fibrilar del ADN.
Materiales y mtodos
Para la Extraccin de clulas de ERG-2

Lo primero que se hizo en el laboratorio fue dirigirse a una sala esterilizada, donde a
travs de un filtro se depuraban incluso las esporas, quedando solo el Mycoplasma
el cual tiene entre 500-1300 pb, este se encuentra en la boca, por lo tanto cuando
se trabaja aqu no se poda hablar, para evitar contaminacin de la muestra,
tambin cuando se trabajaba bajo esta campana, todo tena que ir alcoholizado e
incluso levantarse las mangas de la ropa, y agregar alcohol a medida que se
trabajaba.
Luego se observ un cultivo de clulas que estaban presentes en un tubo de plasma
bajo un microscopio especial a 40X, el cual tena el objetivo por abajo (todas las
clulas tienen una protena que hace que busquen un soporte, esto es mediante la
gravedad). Lo que se observ fue una monocapa completa, con clulas brillantes y
redondas que estaban en mitosis.

Imagen 4. Aqu se observar el filtro utilizado en el laboratorio.

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Imagen 5. Aqu se observar el microscopio con el objetivo abajo, el cual permite que por
gravedad se junten las clulas.

Luego se formaron cuatro grupos y se llev cabo la lisis y homogenizacin de las

clulas ERG-2.
Se tom 1ml de DNAZOL, se esper para que las clulas lisaran, agitando
suavemente la placa de cultivo, con el guante limpio se coloc en el microscopio y
se ve si ocurri la lisis, cuando no se ve una mono capa nos dice que se produjo la
lisis, luego se toman con una pipeta 700 l de lisado celular homogenizando la
solucin y cuidando de que no queden grumos finalmente se lleva a un tubo
eppendorf y se marca.
Luego se agregan 700 l de etanol absoluto para observar precipitado un pequeo
pellet, se llev a la centrifuga por casi 7 minutos, y se observ si haba pellet en el
fondo del tubo, se lav con etanol y se elimin el sobrenadante, esto con ayuda de
una pipeta quedndonos solo con el fondo, y ah agregamos etanol 75%, luego se
suspendi con NaOH.
Se busc el DNA en la fase acuosa, y se volvi a precipitarla para no perder la
muestra, se le agreg un poco de alcohol 70%, se dej un poco de muestra y se
agregaron 25 l de NaOH, se llevaron los tubos para centrifugar.
Luego se carg el buffer de cargar para los 4 grupos, es decir cuatro gotas de buffer
de carga, en cantidades 2 ms 10, es decir 2 l ms 10 l de muestra.
Luego se llev a cabo la electroforesis, cargando el Ladder y las muestras
correspondientes de cada grupo.

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Imagen 6. Electroforesis carga de Ladder y muestras de cada grupo.

Para la el PCR en GAPDH

Para realizar esta tcnica se necesitaron 3 tipos de control, un negativo sin DNA, el
estndar y un control con GAPH positivo, por tanto en la agarosa se tena el ladder,
el negativo y el positivo.
Cabe sealar que para llevar a cabo este laboratorio se tuvo un especial cuidado
con las puntas, para as no contaminar la muestra.
Se trabaj con un mix para PCR, por tanto se realiz todo junto excepto el DNA.
Para ahorrar tiempo, materiales y evitar errores se ocuparon el doble de medidas,
para luego solo dividirlas en los distintos tubos de eppendorf, por lo tanto a una
parte se le agreg DNA y a la otra se le agreg el agua correspondiente, en cuanto a
las medidas de cada reactivo, dependa de cada grupo y su resultado de acuerdo al
Ladder en relacin con su banda para ver que cantidad de muestra tenamos.
Finalmente se utilizaron 2 l, adems se trabaj con dos tubos de DNA en diferentes
concentraciones, y tres grupos hicieron el control negativo con agua.
La Taq polimerasa se agreg al final (1 l a cada tubo), esto lo hizo el ayudante, y se
llevaron al termociclador.

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Resultados

Discusin.
El ADN extrado en este prctico corresponde a un cultivo celular de clulas de estmago de ratas (ERG2). La presencia de ADN es verificada a travs de un mucus blanco que aparece en la superficie del tubo.
Para poder llegar a este resultado es necesario usar un detergente y una sal, ya que de lo contrario no se
obtendra el resultado esperado. La importancia de estos dos elementos es la siguiente: Para extraer
ADN es necesario romper las clulas, para luego separar al ADN del resto de sus componentes celulares
como protenas y membranas lipdicas. El detergente es quien realiza esta funcin de separacin, ya que
su solucin es capaz de disolver a las membranas. As el contenido celular se libera permitiendo que este
detergente sea capaz de unirse a las protenas que estn junto al ADN. Posteriormente se utiliza una sal,
como la sal de mesa (NaCl), ya que permite que el ADN precipite en presencia de alcohol al cambiar sus
propiedades qumicas. Este cambio de propiedades se logra, ya que la sal posee un catin que es el
sodio (Na+) el cual se une a la molcula de ADN al tener esta una carga negativa. Esto permite que el
ADN precipite en presencia de alcohol (etanol), ya que el alcohol en presencia de estos cationes induce
un cambio estructural en el ADN que causa la agregacin y segregacin del mismo. Adems el alcohol
disuelve los azucares y las protenas, permitiendo que el ADN adquiera mayor flexibilidad. En este caso
se utiliza el reactivo Dnazol que se basa en una solucin de lisis de guanidina-detergente que permite la
precipitacin selectiva de ADN con etanol, logrando una recuperacin del 70-100%.

Uno de los problemas que podran surgir es la no visualizacin del ADN, uno de estos indicadores es que
deben haber burbujas pequeas alrededor del alcohol, comnmente son grumos de ADN que se unen
suavemente a las burbujas. Otra causa es que no haya suficiente ADN, se debe asegurar que la solucin
no est muy aguada o no habr suficiente ADN visible. Tambin se debe asegurar que la mezcla con el

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detergente este bien hecha y que repose al menos 5 minutos, no se debe dar mucho tiempo para que
cada reaccin ocurra. Todos estos problemas estn asociados a errores procedimentales.

Los mtodos de extraccin de ADN permiten obtener ADN purificado para despus realizar anlisis
especficos como las tcnicas de electroforesis y PCR (reaccin en cadena de la polimerasa). Es decir,
estos tipos de anlisis permiten verificar la pureza y calidad del ADN, luego de la extraccin. Con esto se
comprueba si el procedimiento utilizado fue o no el correcto.

La tcnica de electroforesis utilizada en este prctico, la cual fue en gel de agarosa, permiti determinar
cualitativamente el xito de la tcnica de extraccin del cultivo de clulas ERG-2, ya que como se
muestra en la figura se pueden observar las bandas correspondientes a este cultivo. Por lo que con esta
tcnica de electroforesis se pudieron obtener los resultados esperados (identificar ADN de cultivos de
clulas ERG-2).Ya que esta tcnica permiti que los fragmentos de ADN migraran por el gel de agarosa
debido a la naturaleza qumica del ADN. Esta naturaleza permite que los fragmentos migren desde el polo
negativo hacia el polo positivo, al estar la molcula de ADN negativamente cargada por la presencia de
grupos fosfato en su estructura, separando as cada porcin de ADN.
Esta tcnica al ser sencilla y rpida permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos.
Si bien la tcnica de electroforesis empleada funciono para obtener los resultados esperados, no significa
que est exenta de ser afectada. Entre los factores que pueden afectarla se encuentran los siguientes:

Conclusin.

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Bibliografa.

Nelson David L. Michael M. Cox (2009), Lehninger: Principios de Bioqumica. Quinta

Edicin, Espaa, Editorial Omega, Capitulo 3 pgina 88-90.
Nelson David L. Michael M. Cox (2009), Lehninger: Principios de Bioqumica. Quinta
Edicin, Espaa, Editorial Omega, captulo 9, pgina 317-318