Kromatografi lapis tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa

menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.
Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat
sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai
metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua,
dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai
dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter et
al, 1991).
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya
hidrofobik seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan
senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa
yang tidak bereaksi dengan pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam
sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk
identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan
nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang
ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh
pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
Pelaksanaan KLT
1.

Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin
baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT
adalah adsorpsi dan partisi(Gandjar & Rohman, 2007).
2.

Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang
paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan
dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih
dan mengoptimasi fase gerak :

1.
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
2.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga
menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti
dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan
harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).
Tabel 2.1. Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons,
2006)

3.

Eluen

Fase
Diam

Keterangan

Heksan : Etil
asetat

Silika
Gel

Sistem umum yang digunakan

Petrol :
Dietileter

Silika
Gel

Sistem umum yang digunakan untuk

senyawa nonpolar seperti terpen dan
asam lemak

Petrol :
Kloroform

Silika
Gel

Berguna untuk pemisahan derivat

asam sinamat dan kumarin

Toluen : Etil
asetat : Asam
asetat (TEA)

Silika
Gel

Komposisi 80:18:2 v/v atau 60:38:2

v/v baik untuk pemisahan metabolit
asam

Kloroform :
Aseton

Silika
Gel

Sistem umum untuk produk dengan

polaritas sedang

n-Butanol :
Asam Asetat :
Air

Silika
Gel

Sistem polar untuk flavonoid dan

glikosida

Metanol : Air

C18

Dimulai dengan metanol 100%

dilanjutkan dengan penambahan
konsentrasi air

Asetonitril : Air

C18

Sistem umum Reverse phase

Metanol : Air

Selulosa

Memisahkan senyawa dengan

kepolaran tinggi seperti gula dan
glikosida

Penotolan Sampel

Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling

sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka
penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan (Gandjar & Rohman, 2007).
4.

Pengembangan

Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap
fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel
dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam
bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase
gerak sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai
ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase
gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah
mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah
jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).

5.

Deteksi Bercak

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia
yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi
melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang
dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan
radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama
untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas
(Gandjar & Rohman, 2007).
Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV
254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV
366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya
pada 254 atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang
bercahaya (Gibbons, 2006). Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan
pereaksi semprot. Pereaksi semprot yang umum digunakan dapat dilihat pada
tabel 2.2.
Tabel 2.2. Beberapa Jenis Pereaksi Semprot untuk KLT (Gibbons, 2006)
Pereaksi
semprot

Komposisi

Perlakuan

Keterangan

Vanilin
asam sulfat

1 gram vanilin
dalam asam sulfat
pekat

Disemprot
dan
dipanaskan
hingga
muncul warna

Pereaksi umum
yang digunakan.
Terpen akan
menghasilkan
warna merah

atau biru
Asam
fosfomolibd
at

Asam
fosfomolibdat 5%
b/v dalam etanol

Disemprot
dan
dipanaskan
hingga
muncul warna

Untuk
mendeteksi
terpen dengan
bercak biru
berlatar kuning

Reagen
Dragendorf

10 mL larutan KI
40% ditambahkan
dengan 10 mL
larutan 0,85 gram
bismuth subnitrat
dalam 10 mL asam
asetat dan 50 mL
air. Larutan
tersebut
diencerkan dalam
10 mL asam asetat
dan 50 mL air

Jika reaksi
tidak spontan
maka
diperlukan
pemanasan

Deteksi alkaloid
menghasilkan
warna oranye
pekat hingga
merah

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat
dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang
leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya,
kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari
campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik
langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat
ialah : (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2)
Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi,
penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke
keadaan uap (keatsirian) (Roy, 1991).
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi.
Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan
senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat
berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan
atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-

komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda

bergerak pada laju yang berbeda (Anggraeni, Megawati, 2009).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan
perambatan komponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi
pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang
bekerja di Universitas Warsawa ( Sudarmadji, 2007 ). Pada saat itu, Michael
Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen-pigmen lain dari ekstrak
tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium
karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan
berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan fase bergerak
( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak adalah fase yang akan melarutkan zat komponen
campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal atau
tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan
bergerak lebih cepat (Sudarmadji, 2007).
Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis
tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap
masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam
(penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat memakan
waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini
untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran
pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (Gandjar,
2008).
Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya menggunakan lapis tipis silica atau
alumina yang seragam pada sebuah lempengan gelas atau logam atau plastic
yang keras. Gel silica atau alumina mengandung substansi dimana substansi
tersebut dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa
digunakan adalah alumina (aluminum oksida). Sedangkan fase gerak
kromatografi disebut juga dengan eluent. Eluent adalah fase gerak yang
berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati
fase diam (adsorbent). Pemisahan komponen sangat dipengaruhi oleh adanya
interaksi antara adsorbent dan eluen. Dalam kromatografi lapis tipis, eluen
biasanya disebut sebagai larutan pengembang ( Kantasubrata, 1993 ).
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya
senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan 2
sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan
besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent
polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat di jadikan bukti dalam
mengidentifikasikan senyawa. Bila di identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama
maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau
mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya berbeda, senyawa tersebut dapat di katakan
merupakan senyawa yang berbeda (Lipsy, 2010).

1.2. Perumusan Masalah

Rumusan masalah dalam makalah ini antara lain:

Apa pengertian kromatografi lapis tipis?

Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis?

Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan

kromatografi lapis tipis?

Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?

Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?

Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi?

1.3. Tujuan Penulisan

Tujuan dari penulisan makalah ini adalah agar mahasiswa dapat memahami
mengenai kromatografi lapis tipis sehingga dapat mengaplikasikannya.

BAB II
PEMBAHASAN

2.1. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses
migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu
dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan
adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran
molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi
biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.
Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip
ini.
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu
sampel yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel
berdasarkan perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode
pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok),
dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat
gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler
(pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki
kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rfnya paling kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam
di bawah gerakan pelarut pengembang.
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat
langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak
relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh
komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap
senyawa berlaku rumus sebagai berikut:

Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu
Rf juga disebut factor referensi.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis
yang juga mempengaruhi harga Rf adalah :

Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari
penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar
terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang
sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika
menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat
(kalau ada) dicampur hingga homogen.

Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran
pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam

kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut
digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang

digunakan.

Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).

Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran

noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan
lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.

Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama

untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.

Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam

kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh
dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan
uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan
dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih
cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir

melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam

campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
berbeda.
Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini
ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercakbercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di
sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil
yang gelap.
Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan
posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari
daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut
tidak tampak kembali.

Gambar : Bercak yang ditimbulkan oleh sinar UV

Gambar : Sebelum dan sesudah di lakukannya kromatografi pada plat KLT

2.2. Prinsip Kerja KLT

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini
dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak,
serta kepolaran dan ukuran molekul.

Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting
pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam
(adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan
terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen
secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluentdan jumlah
umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya
pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang
banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.
Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak
polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara
senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak
tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like.

2.3. Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLT

Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan
oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan
gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Jadi, pada permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.
Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk
ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya,
sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.
Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi
dengansilica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam
dan setetes larutan campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam
berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran. Pembuatan garis harus
menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari
tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik
campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah
berisi fasa gerak dengan posisi fase gerak di bawah garis. Digunakan gelas
tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap
pelarut.

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran
dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Gambar tersebut menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak. Pelarut

diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan
memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Jarak yang ditempuh pelarut

Untuk identifikasinya dapat di gunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam

lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada
kertas harga Rfdidefinisikan sebagai berikut :

Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan

harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh
berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan,
meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan
penyerap dapat diperoleh.

2.4. Fase Diam dan Fase Gerak KLT

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen
campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran.
Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir
melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam
campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
berbeda.
Fase Diam
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel
atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik
yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk
kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat
berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan
adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga
memiliki gugus -OH.
Fase Gerak
Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada
proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent).
Interaksi antaraadsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya
pemisahan komponen.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak
digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.
Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.
Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang
relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:

Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada

bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini
tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.
2.5. Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis
Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi

warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending),

atau dengan cara elusi 2 dimensi.


Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon)
yang dengan metode kertas tidak bisa

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)

Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).

Preparasi sample yang mudah

Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak

mungkin

Kebutuhan ruangan minimum

Analisis KLT banyak digunakan karena :

Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif

tentang konstituen utama dalam sampel

Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel

Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk

analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

2.6. Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi

Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan
kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran
apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar
yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.
Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari
sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat
mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam
H2SO4 yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel
baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna
tertentu.
Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan
menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang
ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0.
Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika

senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa

senyawa tersebut sangat polar.

BAB III
PENUTUP

3.1. Kesimpulan

Kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan

campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam
medium tertentu.Kromatografi lapis tipis merupakan salah
satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan
memisahkan komponen-komponen sampelberdasarkan perbedaan kepolaran.

Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah terjadinya hubungan

kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara
permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat
kepolaran antara senyawa dengan eluent maka senyawa akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut, sesuai dengan prinsip like dissolve like.

Pada prosedur pengerjaannya Pelarut (fase gerak) perlahan-lahan

bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan
pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang
berbeda.

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua

buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.

Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi

warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet, Dapat
untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa, dan masih banyak lagi keuntungan lainnya.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis

adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti
poldanmig.

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ) adalah suatu cara pemisahan yang berdasar pada
pembagian campuran dua senyawa dalam dua fasa dimana fasa gerak bergerak
terhadap fasa diam. Fasa diam berupa suatu bidang datar.

Keuntungan dari metode Kromatografi Lapis Tipis adalah :

Pemisahan yang amat baik (noda yang dipisahkan lebih jelas dan terlokalisir)

 Waktu yang diperlukan lebih singkat

Alat yang dipakai lebih sederhana dan relative murah

Kerugiannya :

Sukar dalam penyimpanannya

Ketelitian dan ketepatannya kurang baik

Teori Kromatografi Lapis Tipis umumnya sama dengan teori dari kromatografi
kolom. Pada Kromatografi Lapis tipis derajad retensi dinyatakan sebagai faktor
penghambatan (Retardation factor = Rf)

Jarak gerakan zat terlarut

Jumlah mol zat terlarut dalam fasa gerak

Rf = ------------------------- = ---------------------------------Jarak gerakan pelarut

Jumlah mol zat terlarut dalam kedua fasa

Jarak gerakan pelarut diukur sampai bidang batas pelarut

Jarak gerakan zat terlarut diukur sampai tengah-tengah bercak atau titik
kerapatan maksimum

Jarak lintasan yang ditempuh rata-rata molekul zat terlarut = kecepatan pelarut
x waktu yang dihabiskan dalam fasa gerak. Faktor penghambatan (Rf) dapat
dinyatakan sebagai perbandingan jumlah molekul dalam masing-masing fasa
atau sebagai pembagian zat terlarut antara dua fasa.
Harga Rf merupakan bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan dan
bergantung pada ukuran-ukuran retensi seperti halnya pada kromatografi kolom.
Nilai Rf dipengaruhi oleh beberapa variable seperti : penyerap, cara
pengembangan, ukuran dan kadar cuplikan, jarak perjalanan bercak serta
macam eluen yang dipakai. Oleh karena itu akan lebih baik jika digunakan nilai
Rf relatif terhadap Rf baku yaitu perbandingan jarak perjalanan yang ditempuh
bercak sampel dengan jarak perjalanan yang ditempuh zat baku dalam
pengembangan yang sama.

2. Teknis Eksperimental

a.

Garis Besar Metoda

Dibuat dahulu lapisan tipis dari bahan penyerap pada fasa pendukung yang inert
(kaca). Serbuk bahan penyerap yang halus dibuat bubur dengan air atau pelarut
organik yang mudah menguap. Bubur tersebut kemudian diratakan pada
lempeng pendukung dengan suatu alat dan dengan ketebalan yang dapat diatur.
Sesudah kering lempeng lapis tipis tersebut diaktifkan dengan cara dipanaskan
pada suhu 100 oC selama paling sedikit 30 menit. Jika aktivasi telah dijalankan
lempeng disimpan dalam eksikator, atau tempat lain yang bebas dari
kelembaban. Setiap kali akan digunakan lempeng sebaiknya diaktifkan lagi.
Sampel dilarutkan dalam pelarut organik yang mudah menguap dan sesuai.
Dengan pipet kapiler atau pipet micrometer, larutan sampel ditotolkan sedikitsedikit dengan bercak sekecil mungkin. Dibiarkan kering sebentar, kemudian
dimasukkan ke dalam bejana pengembangan yang telah dibuat jenuh dengan
uap pelarut pengembang/solvent. Fasa gerak dibiarkan mengembang dan
sedudah mencapai batas yang diinginkan lapisan tipis diambil dan dibiarkan
kering, kemudian dilakukan penentuan lokasi dan identifikasi bercak dengan cara
kimia, fisika atau biologi.

b.

Fasa Diam

Fasa diam yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis adalah bahan
penyerap (adsorbent). Sifat umum dari bahan penyerap untuk Kromatografi
Lapis Tipis sama dengan yang digunakan untuk Kromatografi Kolom. Dua sifat
penting yang harus diperhatikan untuk Kromatografi Lapis Tipis adalah
besar/kecilnya (ukuran) serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada
pendukung sangat ditentukan oleh kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak
dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk memperbaikinya dapat
digunakan butiran yang halus. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 25
mikron. Berbeda dengan tujuan untuk kromatografi kolom, dimana partikel yang
kecil dan halus dapat memperlambat aliran pelarut, sedang pada Kromatografi
Lapis Tipis malahan akan mempercepat aliran pelarut.
Beberapa macam bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis
Tipis :
1)

Silika gel

Paling banyak dipakai dan bersifat asam, zat pengikatnya untuk memberikan
kekutan pada lapisan dan menambah adisi pada gelas penyokong, biasanya
dalah Kalsium sulfat (CaSO4 ) = Plaster of Paris = Gypsum.
Dalam perdagangan biasanya silica gel telah diberi zat pengikat misalnya Silica
gel G Merck. Suspensi silica gel yang G telah dicampur dengan air harus
dipakai paling lambat 3 4 menit sesudah dibuat. Disamping Kalsium sulfat
(CaSO4) semihidrat dapat pula dipakai tepung beras sebagai pengikatnya, tetapi
kurang baik. Jika zat yang dipisahkan basa-basa, maka pelarut sebaiknya

mengandung sedikit Amonium hidroksida atau dietilamin ( 1 % ). Jika asamasam yang akan dipisahkan perlu ditambah asam asetat ( 1 % ). Asam dan
basa ini bersifat pertolongan aditif sebagai bufer untuk zat yang akan
dipisahkan akan tetap dalam bentuk non ionik, sehingga dapat memberikan
noda yang kompak. Disamping air dapat pula dipakai pelarut organik misalnya
aseton, atau kloroform dan metanol ( 2 : 1) untuk membuat pastanya. Untuk
memudahkan identifikasi ditambah lagi dengan zat yang berfluoresensi sehingga
dikenal Silica gel GF.
Beberapa tipe silica gel :
a) Silika gel G : Silika gel dengan zat pengikat, yang biasa digunakan adalah
CaSO4 dengan kadar antara 5 15 %.
b) Silika gel S : Silika gel yang menggunakan zat tepung (pati) sebagai zat
pengikat. Tetapi penggunaan pati sebagai pengikat mempunyai kelemahan,
terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat dan atau Iodium.
c) Silika gel GF 254 : Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis
silica gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultra violet
panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya digunakan Timah
Kadmium Sulfida atau Mangan Timah Silika aktif.
d) Silika gel H / N : Silika gel tanpa pengikat. LApisan ini dibandingkan dengan
yang mengandung CaSO4, menunjukkan hasil yang lebih stabil.
e) Silika gel HF254 : Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator
fluoresensi.
f)
Silika gel PF 254 = 366 : Silika gel untuk keperluan preparatif yang
mengandung campuran dua indikator untuk cahaya ultra violet panjang
gelombang panjang dan pendek.
g) Silika gel modifikasi Silika gel yang ditambah dengan polisiloxane biasanya
disebut silika gel Silanised dan digunakan untuk Kromatografi Lapis Tipis fasa
terbalik.
2)

Alumina

Alumina atau aluminium oksida ( Al2O3 ) suatu adsorban yang sedikit bersifat
basis. Tetapi kini dalam perdagangan ada juga yang bersifat asam dan netral
a)

Al2O3 bersifat basis ( pH = 9 )

b)

Al2O3 bersifat netral ( pH = 7,5 )

c)

Al2O3 bersifat asam ( pH = 4 )

Daya menyerapnya tidak sekuat silika gel. Tidak baik untuk memisahkan asamasam karena akan diikat lebih kuat pada adsorben dan sangat susah bergerak.
Edge efect disebabkan penyerapan yang tidak rata dari pelarut. Komponen
yang mudah menguap,pada sisi keping lapis lebih mudah daripada di

tengah karena itu harga Rf makin ke pinggir (sisi) makin besar perlu
penjenuhan, dipakai kertas saring pada sisi bejana. Terutama dipakai untuk
memisahkan basa-basa.
3)

Selulosa

Penyerap jenis ini dapat digunakan dengan atau tanpa bahan pengikat. Pada
Kromatografi Lapis Tipis, penyerap ini terdapat sebagai butiran-butiran yang
halus dan ukurannya sama, berbeda seperti pada Kromatografi kertas dimana
selulosa berupa serabut. Lapisan tipis yang dibuat dari sellulosa mempunyai
ruang antara yang lebih kecil,akan tetapi lebih teratur sehingga aliran pelarut
lebih cepat dan peristiwa difusi lebih sedikit.
4)

Sephadex

Jenis penyerap ini yang digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis mempunyai
ukuran 10 40 mm dan digunakan untuk pemisahan zat atas dasar perbedaan
besar molekul seperti protein, hormon, enzim, asam amino dan lain lain.
5)

Kiesulguhr ( Diatomaceus earth )

Adalah suatu adsorben yang netral, tetapi daya adsorpsinya lebih lemah
daripada silika gel atau alumina dan mempunyai daya pemisahan lebih kecil.
Dapat ditambahkan pada silika gel untuk mendapatkan bentuk yang kurang
aktif, untuk memisahkan zat-zat yang sangat polar misalnya : karbohidrat, asamasam amino.
6)

Magnesium silikat

1 bagian Magnesium silikat dengan 3 bagian air dikocok dan dioleskan.

Bahan penyerap yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis

c.

Bahan penyerap

Digunakan untuk memisahkan

Silika gel

Asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak,

lipida, mimyak menguap, anion dan kation organik,
steroid dan terpenoid

Alumina

Alkaloid, zat warna, fenol, steroid,

vitamin,karotenoid dan asam amino

Keisulguhr

Gula, oligosakarida, asam-asam lemak, trigliserida,

asam-asam amino, steroid

Serbuk selulosa

Alkaloid,asam amino dan nukleotid

Pati ( Amylum )

Asam amino

Sephadex

Asam amino dan protein

Poliamida

Protein, asam-asam aromatik, antioksidan,

antosianin dan flavonoid

Fasa Gerak

Pemilihan fasa gerak untuk Kromatografi Lapis Tipis tergantung pada faktor yang
sama pada pemilihan fasa gerak untuk keperluan Kromatografi Kolom
penyerapan. Sebaiknya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah sebab
pelarut dengan polaritas yang tinggi sifat kromatografi berubah menjadi
kromatografi pembagian, disamping itu pelarut tersebut dapat mempermudah
lepasnya/rusaknya lapisan tipis. Selain pelarut tunggal dapat juga digunakan
campuran pelarut tetapi sebaiknya jangan lebih dari 3 jenis pelarut sebab
campuran yang lebih kompleks akan cepat mengalami perubahan-perubahan
fasa terhadap perubahan suhu.Kemurnian pelarut penting karena dalam hal ini
digunakan untuk pemisahan sampel dengan jumlah sedikit.

Skema hubungan antara fasa diam, gerak dan senyawa yang dipisahkan
Untuk memisahkan senyawa hidrokarbon dengan cara kromatografi penyerapan,
maka hidokarbon yang jenuh akan sukar diadsorpsi hingga perjalanannya paling
cepat. Hidrokarbon yang mempunyai ikatan rangkap akan lebih kuat diserap dan
banyak ikatan rangkapnya makin kuat penyerapannya. Adanya gugus fungsional
akan menaikkan afinitas adsorpsi, dimana akan bertambah menurut urutan
berikut : CH3, OR ( Alkali ), C=O ( Karbonil ), NH2 ( Amina ), OH ( Hidroksil ) dan
COOH ( Karboksil ). Maka untuk memisahkan hidrokarbon yang banyak
mempunyai ikatan rangkap diperlukan yang aktif dan pelarut yang polar. Untuk
penentuan fasa gerak dan diam pada pemisahan suatu senyawa maka dapat
dilakukan pergerakan dari segitiga ke tengah. Misalnya unrtuk pemisahan

senyawa non polar (lipida), pertama-tama ujung segitiga digerakkan ke kata non
polar dari senyawa yang dipisahkan. Dua ujung segitiga lain akan menuju angka
I pada aktivitas fasa diam dan kata non polar pada deret Eluotropik pada fasa
gerak. Artinya untuk memisahkan senyawa yang non polar ( misal lipida atau
hidrokarbon ) harus digunakan bahan penyerap yang aktif dan pelarut yang
kurang polar.

d.

Pembuatan lapisan tipis

Pendukung yang biasa digunakan adalah kaca dengan ukuran 20 x20 cm atau 20
x 10 cm. Permukaan pendukung harus rata dan bebas noda lemak. Kadangkadang untuk pemisahan secara cepat dan untuk keperluan kualitatif dapat
digunakan obyek gelas yang digunakan pada mikroskop.
Bahan penyerap dibuat bubur dengan air dengan perbandingan 1 bagian
penyerap dengan 2 bagian air. Bila dipakai bahan penyerap yang mengandung
bahan pengikat, maka pembuatan bubur sampai lapisannya harus selesai dalam
waktu 4 menit, sebab setelah itu akan terjadi pengerasan. Kadang-kadang dapat
ditambahkan pula suatu zat yang berfluoresensi.
Pada kromatografi lapis tipis, tebal lapisan merupakan faktor penting pada pola
pemisahan komponen, biasanya tebal lapisan 0,25 mm tetapi untuk keperluan
preparatif tebal lapisan dapat lebih tebal ( 0,5 2,0 mm ).
Pada waktu pemanasan, lapisan yang amat tipis memberikan hasil pemisahan
yang tidak tetap.
Pembuatan lapisan tipis dapat dilakukan dengan 4 cara :
1)

Pembentangan

Cara yang biasa dilakukan adalah wadah tempat bubur, bahan penyerap
digerakkan pada kaca yang berkedudukan tetap. Ada juga cara pembentangan
dimana kaca yang bergerak.
2)

Penuangan

Bahan penyerap yang sangat halus, homogen dan tidak mengandung bahan
pengikat dituangkan pada pendukung dan dibiarkan mengalir sampai rata. Cara
penuangan ini biasanya dilaksanakan untuk alumina sebagai bahan penyerap
dan sebagai cairan adalah pelarut yang mudah menguap
3)

Penyemprotan

Dengan cara ini sukar didapat lapisan yang rata dan ketebalannya sukar
diketahui.
4)

Pencelupan

Cara ini terutama untuk pembuatan lapisan dengan ukuran kecil seperti sebesar
gelas mikroskop. Dapat dilakukan dengan mencelupkan pendukung ke dalam
bubur bahan penyerap dalam pelarut yang mudah menguap. Tebal lapisan yang
pasti tidak diketahui dan kadang-kadang kurang rata. Untuk kualitatif cara ini
cukup memadai.

Lapisan tipis yang sudah jadi dan kering kemudian diaktifkan dengan jalan
dipanaskan pada 100 oC selama 30 menit dan kemudian disimpan dalam
eksikator. Pada saat ini telah banyak diperdagangkan lapisan tipis yang
kebanyakan lebih baik, kompak, rata dan memberikan pemisahan yang
sempurna.

e.

Pengembangan

Bila cuplikan telah ditempatkan maka kemudian lapisan dimasukkan ke dalam

bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap pelarut
yang digunakan. Tepi bagian bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak (pelarut)
kira-kira 0,5 1 cm.Bejana kromatografi harus ditutup rapat, kalau dapat
volumenya sekecil mungkin serta tidak berhubungan dengan atmosfir di luar
bejana. Untuk penjenuhan bejana biasanya pada dindingnya dilapisi kertas
saring yang tercelup dalam fasa gerak.

Ada tiga cara pengembangan dalam Kromatografi Lapis Tipis :

1)

Menaik

Cara yang umum digunakan

2)

Menurun

Dimaksudkan untuk memperpanjang jarak gerakan. Komponen yang mempunyai

nilai Rf kecil dapat terpisah dengan baik. Lapisannya tebal, fasa geraknya kental.
3)

Mendatar

Pengembangan mendatar dapat berupa pengembangan satu arah ataupun

radial.

Pengembangan satu arah dimaksudkan untuk pemisahan dengan suhu yang

lebih rendah dari suhu kamar, dapat dikerjakan dengan menggunakan alat
pendingin. Pengembangan radial digunakan dengan memenfaatkan efek
konsentrasi dan penyebaran zona-zona dalam garis-garis tipis dan bukan sebagai
bercak-bercak. Dengan cara ini dapat dipisahkan komponen-komponen yang
mempunyai harga Rf berdekatan. Pengembangan radial, fasa geraknya dialirkan

dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan, senyawa
terlarut bergerak cepat dari tengah totolan lingkaran.

f.

Deteksi Bercak Pemisahan

Bercak pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis umumnya merupakan bercak

yang tidak berwarna dan untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia,
fisika maupun biologi.
1)

Cara kimia

Yang biasa digunakan adalah direaksikan dengan suatu pereaksi sehingga noda
jadi tampak terlihat. Pada Kromatografi Lapis Tipis tidak dilakukan dengan cara
pencelupan tetapi penyemprotan. Untuk senyawa organik dapat dilakukan
dengan disemprot dengan asam sulfat pekat dan kemudian dipanaskan pada
200 oC selama 10 menit. Bercak dari senyawa organik akan berwarna hitam.
Pereaksi lain untuk senyawa organik adalah Iod. Lapisan yang berisi hasil
pemisahan diletakkan dalam bejana tertutup yang telah diisi dengan kristal Iod.
Dibiarkan beberapa saat untuk memberi kesempatan terjadinya uap Iod. Warna
bejana ungu, sedang bercak berwarna coklat, senyawa organik tidak jenuh akan
tidak berwarna. Jika dikeluarkan, warna bercak akan cepat hilang, sehingga perlu
cepat-cepat menandai bercak. Keuntungan Iod sebagai penampak bercak adalah
tidak merusak senyawa. Untuk senyawa-senyawa lain, kadang-kadang dapat
digunakan pereaksi yang spesifik untuk senyawa tersebut.
2)

Cara fisika

Yang dapat digunakan untukmenampakkan bercak adalah dengan pencacahan

radioaktif dan fluoresensi sinar ultra lembayung. Fluoresensi sinar ultra
lembayung terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak
akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan
penyerapannya yang diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian
bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya yang kelihatan
berfluoresensi.
3)

Cara biologi

4) Dapat digunakan untuk senyawa yang misalnya mempunyai aktivitas

biologis, seperti anti bakteri atau dapat menghidrolisis.Lapisan hasil pemisahan
dialiri dengan suspensi bakteri misalnya, maka pada bercak itu akan terlihat
tidak adanya pertumbuhan bakteri.

g.

Identifikasi Harga Rf

Faktor yang mempengaruhi harga Rf

1)

Bahan penyerap, sifat dan aktivitasnya

Penyerap yang berbeda memberikan hasil pemisahan yang berbeda walaupun

fasa gerak dan bahan yang dipisahkan sama. Harga Rf dipengaruhi oleh aktivitas
dari bahan penyerap karena dapat mempengaruhi daya adsorpsi. Aktivitas dapat
dicapai dengan pemanasan yang berarti pengusiran terhadap molekul-molekul
air.

2)

Tebal dan kerataan dari lapisan

Ketidakrataan lapisan menyebabkan aliran fasa gerak tidak sama sehingga harga
Rf juga tidak sama. Tebal baku yang biasa digunakan adalah 0,25 mm
3)

Kemurnian fasa gerak

Pelarut yang tidak murni akan memberikan pemisahan yang kurang baik.
Demikian juga jika digunakan fasa gerak yang berupa campuran, maka
perbandingan yang dipakai harus diperhatikan dan ditepati.
4)

Kejenuhan bejana kromatografi

Pemisahan yang dilakukan dalam dua bejana yang mempunyai kejenuhan tidak
sama juga memberikan harga Rf yang tidak sama.
5)

Suhu

Pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu yang tetap, dimaksudkan untuk

mencegah perubahan komposisi fasa gerak atau kejenuhan dari bejana.
6)

Jumlah cuplikan yang dianalisis

Jumlah cuplikan yang dianalisis jika terlalu banyak maka ada dianalisis jika
terlalu banyak maka ada kecenderungan terjadi penyebaran-penyebaran bercak
atau terjadinya ekor sehingga akan memperbesar kesalahan harga Rf. cuplikan
1020 mg
7)

Kesetimbangan

Faktor kesetimbangan ini terlihat lebih nyata pada Kromatografi Lapis Tipis
dibanding pada Kromatografi kertas,sehingga sangat perlu untuk kromatografi
Lapis Tipis diusahakan ruangan di dalan bejana jenuh dengan uap pelarut.
Ketidakseimbangan di dalam bejana akan terlihat dari permukaan fasa gerak
yang berbentuk cekung atau fasa gerak lebih cepat pada bagian tepi dibanding
bagian tengah.
8)

Struktur dan sifat kimia senyawa yang dipisahkan

Sifat kimia seperti mudah larut, tekanan uap dan kepolaran dapat
mempengaruhi harga Rf dari suatu senyawa dibanding senyawa yang lain.
9)

Mutu pelarut

Harus dipakai pereaksi yang pro analisa jika diperlukan pelarut campur, maka
harus diperbaharui pada waktu-waktu tertentu,karena menguapnya pelarut yang
mudah menguap akan mengubah susunan pelarut.
10)

Teknik

Sudut yang dibentuk waktu meletakkan plat/keping dalam bejana tidak begitu
mempengaruhi harga Rf, tetapi bila dipakai metoda menurun atau
mendatar/horisontal (tidak menaik) akan mempengaruhi

4. Variasi Kromatografi Lapis Tipis

Dengan tujuan untuk mencapai pemisahan yang sempurna dan memperluas
pemakiannya maka Kromatografi Lapis Tipis mengalami berbagai perubahan
seperti :
a.

Kromatografi lepas tipis

Pada pendukung dari kaca, serbuk kering bahan penyerap dibentangkan dan
diratakan. Cuplikan ditempatkan dan dilakukan pengembangan mendatar. Untuk
penentuan lokasi dapat dilakukan penyemprotan
b.

Lapisan bertingkat ( gradient plate )

Cara ini mempunyai daya adsorpsi yang berbeda sepanjang lapisan. Dapat
dibuat dengan alat khusus yang disebut gradient spreader dimana diisi dengan
dua macam bubur bahan penyerap misalnya A dan B. Lapisan berubah dari 100
% A ke 100 % B. Cara ini dapat digunakan untuk menemukan campuran bahan
penyerap yang terbaik.

c.

Pengembangan Bertingkat ( gradient elution )

Komposisi fasa gerak selalu berubah selama pengembangan. Lapisan dapat

dimasukkan ke dalam fasa gerak misalnya suatu pelarut dan kemudian fasa
gerak yang kedua ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-aduk.
d.

Pengembangan berganda ( multiple elution )

Pengembangan dilakukan pada arah yang sama dan dilakukan berkali-kali baik
dengan pelarut yang sama atau yang divariasi.
e.

Lapisan beralur ( grooved plates )

Pendukung yang berasal dari kaca gelas yang diberi garis-garis, maka setelah
bahan penyerap dibentangkan akan terjadi lapisan yang beralur. Pada tiap jalur
ditempatkan bercak cuplikan.
f.

Lapisan dengan pendukung yang lentur

Lapisan ini sudah banyak diperdagangkan misalnya pendukung lembaran

poliester dimana bahan penyerap dengan pengikat polivinil asetat dibentangkan
di atasnya. Contoh pendukung lain adalah kertas selulosa yang dilapisi dengan
bahan penyerap.
g.

Kromatografi fasa balik ( Reversed phase partition chromatography )

Lapisan tipis yang sudah jadi dicelupkan dalam pelarut yang non polar tetapi
mudah menguap atau pelarut tersebut dibiarkan mengalir melewati lapisan tadi.
Dengan cara itu maka fasa diam bersifat non polar. Sebagai fasa gerak
digunakan pelarut polar seperti air, metanol atau asetonitril. Hasil pemisahan
berbeda dengan kromatografi normal dimana pada cara ini komponen yang
paling polar terelusi lebih dahulu.

Perkembangan dari kromatograf lapis tipis (TLC) adalah kromatografi lapis tipis
penampilan tinggi (HPTLC), perbandingan TLC dan HPTLC sebagai berikut

Parameter

TLC

HPTLC

Ukuran partikel

12 50 mm

5 6 mm

Tebal layer

0,1 0,3 mm

0,1 atau 0,2 mm

Jarak
pengembangan

10 ~ 15 ~ 20 cm

3 6 cm

Jarak pemisahan

100 120 mm

50 mm

Volume penotolan

0.5 5 mL

0,1 1 mL

Ukuran sampel

3 4 mm

1 1,5 mm

Keuntungan HPTLC :
Memperkecil difusi sehingga meningkatkan efisiensi pemisahan
LOD menurun 1/10 hingga 1/15 x lebih kecil
Lebih ekonomis (plate / solven per sampel lebih kecil)