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htm
Labo de Microbiologie-2012

Labo de Microbiologie-2012

Horaire ............................................................................................................................................ 5
BARME ........................................................................................................................................ 6
LABO NO 1 ..................................................................................................................................... 7
DILUTIONS ET CONCENTRATIONS ........................................................................................ 7
POURCENTAGE ..................................................................................................................... 7
POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME ............................................................................. 8
MOLARIT.............................................................................................................................. 9
POIDS/VOLUME .................................................................................................................... 9
LES DILUTIONS EN SRIE: PRPARATION POUR LE LABO No2 .............................. 12
PRPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS .............................................. 12
LABO NO 2 ................................................................................................................................... 14
INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE .......................... 14
MILIEUX MICROBIOLOGIQUES ...................................................................................... 14
LA TECHNIQUE ASEPTIQUE ............................................................................................ 15
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement) ......................... 15
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES ....... 17
TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR CHANTILLONNER
LENVIRONNEMENT .......................................................................................................... 19
LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE ................................... 19
METTRE DES BACTRIES SUR GLOSE : TALEMENT ............................................. 19
ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMDIATION .......................................... 21
VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE ..................... 22
DNOMBRER LES BACTRIES ........................................................................................ 23
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) ...... 23
MORPHOLOGIES CELLULAIRES ..................................................................................... 25
LABO NO 3 ................................................................................................................................... 26
DNOMBRER LES BACTRIES .............................................................................................. 26
COMPTES VIABLES ............................................................................................................ 26
LES COMPTES LES PLUS PROBABLES ........................................................................... 27
COMPTES DIRECTS ............................................................................................................ 28
COMPTE LES PLUS PROBABLES ..................................................................................... 30
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM ............................... 34
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RSISTANTE............ 36
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES .......................... 37
LABO NO 4 ................................................................................................................................... 39
LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTRIES DU SOL ......................................... 39
BACTRIES DU SOL ........................................................................................................... 40
LES BACTRIES DANS DU COMPOST ............................................................................ 41
COMPTE DE BACTRIES AROBIES HTROTROPHES ............................................ 41
COMPTE DE BACTRIES ANAROBIES HTROTROPHES ...................................... 41
COMPTE DE BACTRIES GRAM NGATIVES ET POSITIVES .................................... 42
CYCLE DE L'AZOTE............................................................................................................ 43
BACTRIES QUI FIXENT L'AZOTE .................................................................................. 44
BACTRIES NITRIFIANTES .............................................................................................. 44
L'ASSIMILATION DU CARBONE ...................................................................................... 45
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BACTRIES QUI DGRADENT L'AMIDON .................................................................... 45
BACTRIES QUI DGRADENT LA GLATINE .............................................................. 46
ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS ............................................ 49
LABO No 5 ................................................................................................................................... 51
DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM POSITIVES ........................................... 51
IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS ....................................................... 51
MORPHOLOGIE COLONIALE ........................................................................................... 51
COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 51
MTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES .............................................. 52
FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU
D'ACTOINE ......................................................................................................................... 53
URASE ................................................................................................................................. 53
L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE ................................ 54
UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES
EXOCELLULAIRES ............................................................................................................. 54
RDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE ................................................................... 54
TOLRANCE DES CONCENTRATIONS LEVES DE SELS .................................... 55
CYTOCHROME OXYDASE ................................................................................................ 56
LA MOTILIT BACTRIENNE .......................................................................................... 56
CATALASE ........................................................................................................................... 57
IDENTIFICATION
DES
COCCI
GRAM
POSITIFS;
FAMILLES
DES
MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE .................................................. 58
Les Micrococcaceae ............................................................................................................... 58
Les Streptococcaceae ............................................................................................................. 58
DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NGATIF ................................ 59
HMOLYSE SANGUINE ..................................................................................................... 59
BILE-ESCULINE ................................................................................................................... 60
SENSIBILIT LA BACITRACINE ET LOPTOCHINE ............................................. 60
DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE .......................................................................... 61
GLOSES DE MANNITOL + SELS .................................................................................... 61
AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER ................................................ 61
SENSIBILIT LA NOVOBIOCINE ................................................................................. 61
COAGULASE ........................................................................................................................ 67
TEST DE COAGULASE SUR LAME .................................................................................. 67
LABO NO6 .................................................................................................................................... 69
CONTRLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE .............................................................. 69
COMPOSS ANTIBACTRIENS - ANTIBIOTIQUES ...................................................... 69
ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER ...................................................................... 69
DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE ..................................................... 70
DSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES ............................................................................ 72
L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS ........................................................................... 72
DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE ..................................................... 75
L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS ........................................................................... 76
CINTIQUE DE MORTALIT ............................................................................................ 76
LABO NO 7 ................................................................................................................................... 78
MICROBIOLOGIE DE LEAU ET DES ALIMENTS................................................................ 78
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Labo de Microbiologie-2012
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU ..................................................................... 78
MICROORGANISMES INDICATEURS DUNE CONTAMINATION FCALE ............. 78
ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES ........ 79
TEST DE COLIFORME PRSOMPTIF ............................................................................... 79
ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE LEAU POUR DES COLIFORMES ...... 81
ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES
FECAUX ................................................................................................................................ 81
TEST DES ENTROCOQUES ............................................................................................. 82
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS .......................................................... 83
SALMONELLOSE ................................................................................................................ 83
BACTRIES GRAM NGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES ................. 85
TEST DE COLIFORME CONFIRM................................................................................... 87
STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU EN ONTARIO ............ 87
ESSAI DE SALMONELLA CONFIRM ............................................................................. 88
STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU ........................ 88
COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION DINCONNUS GRAM NGATIFS ......... 89
LABO NO8 .................................................................................................................................... 91
DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM NGATIVES ........................................ 91
Les Enterobacteriaceae .......................................................................................................... 91
Les Pseudomonaceae ............................................................................................................. 91
Les Nesseriaceae .................................................................................................................... 91
DIAGNOSTIQUE DINCONNUS GRAM NGATIFS ....................................................... 92
COLORATION DE GRAM ................................................................................................... 92
OXYDASE ............................................................................................................................. 92
CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY ..................................................................... 92
L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE ..................... 92
URASE ................................................................................................................................. 92
CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) ............................................. 93
SIM: PRODUCTION DE SULFIDE DHYDROGNE, DINDOLE ET LA MOTILIT .. 94
PRODUCTION DE H2S ......................................................................................................... 94
MOTILIT ............................................................................................................................. 94
PRODUCTION D'INDOLE SUITE LA DGRADATION DU TRYPTOPHANE .......... 94
LES DCARBOXYLASES DORNITHINE ET DE LYSINE ............................................. 94
API 20E SYSTME ENTEROBACTERIACEAE ................................................................ 95
LABO NO 9 ................................................................................................................................. 104
HMATOLOGIE/ SROLOGIE ............................................................................................... 104
SROLOGIE MICROBIENNE ........................................................................................... 104
ELISA ................................................................................................................................... 104
L'HMATOLOGIE .............................................................................................................. 108
COMPTE DE GLOBULES ROUGES ................................................................................. 108
L'HMATOCRITE .............................................................................................................. 110
VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM) ....................................................................... 111
LES LEUCOCYTES ............................................................................................................ 112

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Horaire
Labo 1
Labo 2
Labo 3
Labo 4
Labo 5
Labo 6
Labo 7
Labo 8
Labo 9

Dilutions et concentrations
Introduction au travail dans le labo de microbiologie
Compter les bactries
Les milieux de croissance et les bactries du sol
EXAMEN DE MI-SESSION
Diagnostic bactrien Bactries Gram positives
SEMAINE DTUDE
Contrle de la croissance microbienne
Microbiologie de leau et des aliments
Diagnostic bactrien Bactries Gram ngatives
Hmatologie/Srologie
EXAMEN PRATIQUE
EXAMEN FINAL

11 et 13 sept.
18 et 20 sept.
25 et 27 sept.
2 et 4 oct.
11 oct.
16 et 18 oct.
21 au 27 oct.
30 oct. et 1 nov.
6 et 8 nov.
13 et 15 nov.
20 et 22 nov.
29 nov.
1 dec.

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BARME
Quiz
Devoirs
Examen de mi-session
Examen pratique
Examen final

5
20
30
15
30

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LABO NO 1
DILUTIONS ET CONCENTRATIONS

Jour 1
Une proprit trs importante au sujet des solutions qui doit tre adresse cest la concentration.
En gnral, la concentration indique la quantit dun solut dans une quantit donne dune
solution. Pour travailler avec des concentrations, vous devez comprendre la distinction entre le
solut, le solvant et la solution.
Puisque diffrentes quantits de soluts peuvent tre dissoutes dans une solution, la concentration
est une proprit variable. Nous avons donc besoin dune faon numrique pour indiquer comment
concentre est une solution. Une varit de diffrentes faons existent pour calculer et exprimer
les concentrations des solutions.
Ceci peut tre fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les
deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres la faon que les
composs chimiques ragissent entre eux (moles).
Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront prsents. Elles incluent le
pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la
molarit (lutilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume.
Vous obtiendrez de lexprience avec plusieurs des faons dtablir la concentration dune
solution. Vous pouvez prparer une solution partir des matires brutes et mesurer chacune des
composantes qui doivent tre prsentes dans la solution. Vous pouvez prparer une solution en
diluant une solution prexistante.
POURCENTAGE
Lutilisation des pourcentages est une faon commune dexprimer la concentration dune solution.
Cest une approche simple qui indique la quantit dun compos par 100. Les pourcentages
peuvent tre calculs en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une faon, que vous
connaissez, sans doute, dexprimer les concentrations est le pourcentage par volume. Une autre
faon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre faon est un hybride appel le pourcentage
par poids/volume.
Le pourcentage par volume est habituellement utilis quand la solution est prpare en
mlangeant deux liquides.

Par exemple, lalcool friction est habituellement 70% par


volume dalcool isopropyl. Ceci veut dire que 100 ml de solution
contient 70 mL dalcool isopropyl. Ceci veut aussi dire quun
litre (ou 1000 ml) de cette solution contient 700 mL dalcool
isopropyl et assez deau pour complter le volume un total de 1
litre ou 1000 ml.

Pourcentage par volume =

volume du solut
volume de solution
7

x 100

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Le pourcentage par poids est une faon dexprimer la concentration dune solution comme le
poids du solut/poids de la solution.
Pourcentage par poids =

Poids
du
Poids de la solution

solut

x 100

titre dexemple, considrons une solution


12 g NaCl
12 % NaCl solution =
de 12% NaCl par poids. Une telle solution
100 g solution
aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100
grammes de solution. Pour prparer une telle
solution, vous pourriez peser 12 grammes de
NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes deau,
12 g NaCl
afin que la masse totale de la solution soit de
= 12% NaCl solution
(12
g NaCl + 88 g eau)
100 grammes. Puisque les masses sont
conserves, les masses des composantes de
la solution sadditionneront la masse totale
de la solution.
Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse dune solution, vous devez
diviser la masse du solut par la masse de la solution (la somme combine de la masse du solut et
du solvant) et ensuite multiplie par 100 pour la changer en pourcentage.
POURCENTAGE PAR POIDS/VOLUME
Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le
pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantit de solut en grammes, mais mesure
la quantit de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle
contient 5 g de NaCl pour chaque 100 ml de solution.
Pourcentage par volume =

Poids du solut (en g)


Volume de solution (en mL)

x 100

Cette faon est la manire la plus couramment utilise dans ce cours pour exprimer les solutions
en pourcentages.

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MOLARIT
Une autre faon dexprimer une concentration
sappelle la molarit. La molarit cest le nombre de
moles de solut
moles de solut dissout dans un litre de solution. Les Molarit =
litre de solution
units sont donc moles par litre, plus prcisment,
cest les moles de solut par litre de solution.
Plutt dcrire moles par litre, labrviation M est utilise pour ces units. Alors, quand vous
voyez la lettre M cela signifie molarit et reprsente moles par litre (pas seulement moles). Vous
devez faire trs attention de distinguer entre moles et molarit. "Moles" est une mesure de la
quantit que vous avez dune composante; "molarit" mesure la concentration de la composante.
Alors quand un problme vous est donn, qui stipule que la concentration dune solution est 0.1
M, ceci veut dire quelle possde 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que
cest 0.1 mole.
POIDS/VOLUME
Cette faon dexprimer une concentration est trs semblable celle des pourcentages et reprsente
une des faons les plus populaires utilises par les biologistes molculaires. Contrairement au
pourcentage, la concentration est exprime par quelconque volume lutilisateur dsire utiliser. Plus
communment, ces concentrations sont exprimes par une unit de mesure. Par exemple, par 1 ml
ou 1 L ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions reprsentent la masse dun solut dans une
quantit donne de la solution. Par exemple, une solution qui est une concentration de 1mg/ml
contient 1mg de solut dans 1 ml de solution.
La formulation des dilutions est essentielle dans tous les domaines des sciences ainsi que dans la
vie de tous les jours. Les dilutions servent rduire de faon prcise la concentration d'lments,
soit chimiques ou vivants, se retrouvant en solution. Par exemple, si vous dsirez rduire la
concentration de matires grasses dans du lait de 3.5% 0.35%, vous devrez effectuer une dilution
de facteur 10. La comprhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La
concentration, le facteur de dilution, et la dilution.
La concentration se dfinit comme la quantit d'un compos pour un volume total de solution.
Puisqu'une quantit peut tre exprime de plusieurs faons, les concentrations sont exprimes
comme l'unit de mesure de la quantit du compos/volume total et final.
Ex. Gram/Litre
Molcules/Litre
Moles/Litre
Nombre d'organismes/Litre
Etc.

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Le facteur de dilution reprsente la multiple arithmtique par laquelle une concentration initiale
doit tre divise afin d'obtenir la concentration finale. Par exemple, si une solution contient 30
grammes de cafine par 1L de solution et que vous dsirez rduire la concentration de cafine
0.3 Gramme/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, le facteur de dilution.
Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de dterminer un facteur de dilution.
Le facteur de dilution = Concentration initiale
Concentration finale
La dilution reprsente la fraction du compos tant examin. Par exemple, dans le problme
prcdent, une dilution de 1/100 a t effectue. La dilution est exprime comme une fraction de 1
sur le facteur de dilution.
Afin de correctement prparer des dilutions, vous devez apprendre utiliser les pipettes de faon
approprie. Voici quelques directives gnrales :
Choisir la pipette dont la capacit se rapproche le plus du volume dsirez. Par exemple, pour
faire la mesure de 0.1ml il est prfrable dutiliser une pipette de 1.0 ml plutt quune de 10ml.
Minimiser le nombre de pipetages afin de minimiser les chances de faire des erreurs. Par
exemple, si vous dsirez distribuer 1 ml dans dix prouvettes il est prfrable de pipetter 10ml une
fois et de distribuer 1 ml dix fois plutt que de pipetter 1 ml dix fois et de distribuer 10 fois.
Changer de pipette pour chaque solution diffrente.
Faire des transferts en srie : quand vous faites des transferts en srie telle que pour les dilutions
en srie, il nest pas ncessaire dutiliser plusieurs pipettes. Utiliser les directives suivantes afin de
minimiser le nombre de pipettes utilises :

Source

Passer dune concentration plus leve une solution de concentration plus faible : Pipeter le
volume dsir de la source puis livrer la nouvelle prouvette ( A dans limage ci-dessous).
Rincer la pipette de haut en bas plusieurs fois (dans A dans limage ci-dessous). Pipetter le
volume dsir de cette prouvette ( A ) puis livr dans la prochaine prouvette ( B ). Rpter
cette procdure de A B avec la mme pipette.

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Livrer puis rincer la pipette dans cette prouvette avant de faire
la prise du volume dsir de cette nouvelle solution.

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Passer dune concentration moindre une solution de concentration plus leve : dans ce
cas-ci le pipetage et plus facile. Utiliser tout simplement la mme pipette pour le transfert du
volume voulu dune solution de concentration moindre une solution de concentration plus
leve. Aucun quilibrage ou de rinage nest requis dans ce cas-ci.
Calcul des dilutions en srie
Les dilutions sont essentiellement des fractions et suivent donc les mmes principes arithmtiques.
Ceci tant dit, la dilution (ou la fraction) indique quelle fraction du total est reprsente par le
compos tant dilu.
Ex. Vous dsirez diluer une solution par un facteur de 4. Pour ce faire, la fraction est donc 1/4; c.-d. quun quart du volume total doit tre reprsent par la chose tant dilu. Donc, deux fractions
qui sont gales, par exemple 2/4 et 4/8 reprsentent les mmes dilutions et facteurs de dilutions.
Prparation des dilutions : Les choses que vous devez dterminer avant de prparer une dilution
sont quel est le volume total final que je dsire, quel est le facteur de dilution dsir et quelle est la
concentration finale que je dsire (si celle-ci est connue).
Par exemple, je dsire avoir un volume final de 50 ml et un facteur de dilution de 4X. La fraction
dsirez est donc 1/4 o le dnominateur reprsente le total. Puisque je dsire un volume final de
50ml, 1/4 du 50 doit tre le compos tant dilu; donc 12.5. Ce que ceci signifie est que 1/4 =
12.5/50. Donc pour prparez cette dilution vous ajouteriez 12.5 ml de la solution tre dilu dans
(50 ml -12.5 ml = 37.5 ml) de solvant.
Si vous connaissez la concentration finale que vous dsirez, vous pouvez utiliser la formule
suivante pour dterminer quel volume de la solution mre de diluer :
Concentration que vous voulez
Concentration que vous avez

Le volume final dsir

Le volume de la solution
mre ajouter au mlange

Les dilutions en sries sont toutes simplement des dilutions squentielles o la solution mre
utilise pour chaque dilution reprsente la dilution prcdente. La dilution finale pour la srie est
le produit de chacune des dilutions individuelles.
Dil. finale = Dil.1 X Dil. 2 X Dil. 3 etc.

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Labo de Microbiologie-2012
LES DILUTIONS EN SRIE: PRPARATION POUR LE LABO No2
La semaine prochaine, vous diluerez des chantillons d'eau pour dterminer le nombre de
bactries. Votre matriel initial sera de l'eau d'un cours d'eau navigable que vous devrez diluer par
105X. Celles-ci doivent reprsenter des dilutions de 10X. Rdiger une mthode sur la faon dont
celles-ci doivent tre prpares. Utilisez des schmas et des instructions dtailles qui pourront
tre suivis par tout tudiant.
Matriaux
prouvettes striles
Eau strile
chantillon deau
PRPARATION DE MILIEUX: LES CONCENTRATIONS
Pour vous familiariser avec la formulation de divers milieux de croissance, vous devrez prparer
diffrents milieux de croissance qui seront utilisez pour certaines expriences au labo no4.
RECETTES
Milieu dammonium
Ammonium sulfate
2.0g
MgSO4
4mM
NaCl
0.002g/ml
K2HPO4
7mM
CaCO3
0.5% (m/v)
Microlments
1X
Eau
1L

Milieu dessai de fixation dazote


Glucose
1% (m/v)
CaCl2
5mg/ml
K2HPO4
7mM
MgSO4
4mM
Microlments
1X
Eau
1L

Complter et soumettre le tableau suivant


Milieu dammonium
Ingrdient
Conc. stock
Ammonium Sulfate
MgSO4
20% (m/v)
NaCl
20% (m/v)
K2HPO4
0.5M
CaCO3*
Eau
* Ajouter aprs la strilisation

Conc. Finale
2g/L
4mM
2.0mg/ml
7mM
0.5% (m/v)*
-

Quantit

Complter 200 ml

Milieu de fixation dazote


Ingrdient
Conc. stock
Conc. Finale
Quantit
Glucose
1% (m/v)
CaCl2
10% (m/v)
5mg/ml
K2HPO4
10% (m/v)
7mM
MgSO4
1M
4mM
Microlments*
100X
1X
Eau
Complter 200 ml
*Microlments: 100 X (0.1% FeSO4 + 0.05% Na2MoO4); Ajouter aprs la strilisation
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Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
Complter et soumettre pour la fin de cette priode de laboratoire la
partie I du premier devoir.

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Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 2
INTRODUCTION AU TRAVAIL DANS LE LABO DE MICROBIOLOGIE

Jour 1
Plusieurs faits doivent tre considrs avant de se lancer dans ltude des microorganismes.
Premirement, les microorganismes sont trs petits. Ainsi, moins qu'un trs grand nombre de
cellules (de l'ordre de plusieurs millions) ne soient prsentes dans un petit secteur, les
microorganismes ne peuvent pas tre observs lil nu. Dans leurs milieux naturels, non
seulement le nombre de microorganismes est-il relativement bas, mais en outre plusieurs espces
cohabitent habituellement au mme endroit. Par exemple, le bout de vos doigts est probablement
recouvert dau moins dix diffrentes espces microbiennes des niveaux relativement bas (de
l'ordre de quelques centaines quelques milliers). De plus, les conditions optimales requises pour
la croissance d'une espce microbienne donne (par exemple les exigences d'alimentation, de
temprature, de pH, etc.) sont extrmement diverses. En tenant compte de ces caractristiques, les
microbiologistes ont dvelopp plusieurs stratgies aptes permettre l'tude des microorganismes.
MILIEUX MICROBIOLOGIQUES
Il est habituellement peu pratique d'tudier un microorganisme dans son environnement naturel.
Par exemple, il serait impensable dexaminer l'effet d'un antibiotique nouvellement dvelopp sur
la croissance d'un pathogne bactrien chez ltre humain. En outre, l'effet sur lespce
bactrienne vise serait difficile interprter compte tenu de l'htrognit des populations
bactriennes prsentes. Par consquent, des mthodes ont t tablies pour croitre les bactries en
laboratoire en utilisant une varit de milieux de croissances, synthtiques ou non.
Les milieux de croissances sont disponibles sous forme liquide, semi-solide ou solide. Des
milieux de culture semi-solides et solides sont obtenus en ajoutant au milieu de croissances
liquides des agents de solidification. L'agent de solidification le plus commun est lAgar, un
polysaccharide driv dune algue. LAgar possde plusieurs proprits avantageuses : 1) il est
facilement liqufiable par un chauffage 100C dans une solution aqueuse, 2) sa forme liquide est
maintenue des tempratures aussi basses que 45C, 3) il se solidifie des tempratures en
dessous de 45C et enfin, 4) la plupart des bactries ne le digrent pas. Un autre agent de
solidification est la glatine. Son utilisation est moins commune puisque plusieurs espces
bactriennes la digrent.
Les milieux de culture liquides sont souvent appels "bouillons de culture". Les milieux solides
peuvent tre soit sous la forme de gloses ou de pentes. Tous les milieux de culture doivent
inclure les substances nutritives ncessaires pour la croissance et la survie bactrienne. D'autres
conditions, comme la temprature et la prsence ou l'absence d'oxygne, sont contrles par des
quipements spciaux, comme un incubateur temprature contrle. L'utilisation de conditions
appropries permet au microbiologiste de croitre et de maintenir les espces bactriennes l'tude.

14

Labo de Microbiologie-2012
LA TECHNIQUE ASEPTIQUE
Dans le domaine de la microbiologie, la technique aseptique est une des procdures utilises par
les microbiologistes afin de prvenir la contamination de soi-mme, ce qui pourrait mener une
infection, la contamination de lenvironnement dans lequel ils travaillent et la contamination des
matriaux ou des spcimens avec lesquels ils travaillent. Elle est utilise dans tous les cas o un
transfert de cultures ou de milieu microbiologique est impliqu. Lutilisation de la flamme dun
bruleur Bunsen est centrale lexcution de cette technique. Vous utiliserez cette technique tout
au cours de la session et il est donc important pour vous de la maitriser.
La technique aseptique vous sera dmontre pour lutilisation de la boucle dinoculation, des
pipettes et de ltaleur de verre.
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : STRIES (Individuellement)
Les stries peuvent tre faites partir de milieu solide ou liquide, contrairement aux talements qui
sont toujours faits partir dun milieu liquide. Linstrument utilis dans ce cas-ci est la boucle
dinoculation, qui est essentiellement un fil de fer utilis pour faire la prise de bactries. Ne pas
confondre cet instrument avec laiguille dinoculation qui possde une extrmit droite plutt
quune boucle.

Matriaux
Glose dE.coli
Une glose TSA
Une pente TSA
Mthode
1. Avant dutiliser la boucle, elle doit tre strilise. Pour ce faire, placer la boucle dans la
flamme du bruleur Bunsen jusqua ce quelle devienne rouge. Permettre la boucle de
refroidir pour une minute avant de lutiliser. NE PAS LA DPOSER SUR LA TABLE.

2. Une fois refroidie, ramass des bactries de la culture sur glose fournie. Attention de ne pas
en ramasser trop.
3. Maintenant, strier la surface dune nouvelle glose telle quillustre
4. Rpter pour inoculer la pente telle quillustre.
15

Labo de Microbiologie-2012
5. Placer vos chantillons lendroit dsign pour quils soient incubs 37oC jusqu' la
prochaine priode de labo.

Glos
e
Pente

16

Labo de Microbiologie-2012
INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES
(Individuellement)
Faire des stries pour colonies simples est une mthode plus labore de stries utilise pour gnrer
des cultures pures o seulement quun organisme est prsent. Il existe plusieurs mthodes
diffrentes pour gnrer des cultures pures. Ces mthodes reposent gnralement sur le principe
de dilutions pour isoler l'organisme dsir de tous les autres. Prenons par exemple une population
de millions d'individus partir de laquelle vous ne voudriez en choisir qu'un seul. Si vous pouviez
diviser la population de telle faon ce qu'il y ait dans un secteur que quelques individus, il vous
serait plus facile de choisir et disoler l'individu qui vous intresse. Comme mentionne ci-dessus,
la dilution dune culture htrogne de dpart gnre habituellement des cultures pures. Les stries
pour colonies simples permettent daccomplir cela.
La procdure est essentiellement comme suit : initialement, des bactries sont ramasses dun
bouillon ou dun milieu solide avec la boucle dinoculation. Les bactries sont ensuite stries sur
une rgion de la glose, ainsi l diluant. La boucle et ensuite striliser encore une fois puis utilise
pour strier une nouvelle rgion de la glose en ramassant des bactries de la strie originale, la
diluant donc encore plus. (Voir la figure ci-dessous). Notez : vous devez striliser la boucle
entre chaque srie de stries et vous ne devez pas retourner la source.

Faires des tries de gauche droite pour recouvrir approximativement de la glose.


Restriliser la boucle densemencement et la refroidir en touchant une partie libre de la
glose.

Tourner la glose de 90o. Faire des stries de de la glose en commenant par des stries
qui traverse les stries originales au moins deux fois. Striliser la boucle densemencement
encore une fois.

17
Rpter une troisime fois.

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Bouillon de culture mixte
Glose dE.coli
2 gloses TSA (Jour 1)
Mthode
1. Telle que prcdemment, laide de la boucle dinoculation strile ramasser un peu de
bactries de la culture sur glose fournit et strier la glose TSA comme illustre dans le
premier panneau de la figure sur la page prcdente. SRILISER VOTRE BOUCLE aprs
cette srie de stries initiale.
2. Faire une deuxime srie de stries avec la boucle strile telle quillustre.
3. Rpter autant de fois que possible en vous assurant de striliser la boucle entre chaque srie
de stries pour isoler des colonies simples.
4. Sur une nouvelle glose, rpter la procdure pour lisolation de colonies simples partir de
bouillon de culture mixte.
5. Placer les deux isolations pour colonies simples lendroit dsign pour quelles soit incubes
37oC jusqu' la prochaine priode de labo.

18

Labo de Microbiologie-2012
TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES DE BASE POUR CHANTILLONNER
LENVIRONNEMENT
Dans l'exercice suivant, vous initierez un projet long terme concernant la biormdiation.
Chaque anne, environ 100 millions de gallons de ptrole sont dverss dans l'environnement.
Heureusement, en plus de l'intervention humaine, l'environnement contient des milliards de microorganismes qui travaillent dbarrasser l'eau de cette huile. Ces organismes microscopiques sont
appels bactries olophiles ou microbes qui consomment l'huile (OEM). Ce sont des bactries
qui utilisent normalement des huiles dans l'environnement comme source de nourriture.
Lassainissement est dfini comme un processus utilis pour rendre l'environnement scuritaire
par labsorption, la destruction, la neutralisation ou la fabrication de contaminants inoffensifs. Le
processus d'utilisation de microbes pour dcomposer les substances dangereuses (telles que le
ptrole) en leurs lments fondamentaux non toxiques est un exemple de biormdiation. Dans les
prochaines semaines, nous allons tenter d'enrichir pour, d'isoler, et partiellement identifier certains
de ces OEM.
LES BACTERIES PRESENTES DANS UNE VOIE NAVIGABLE (Groupes de 2)
Des techniques microbiologiques de base seront utilises pour poser des questions sur les
bactries prsentes dans un cours d'eau et de dterminer si les rsultats obtenus sont les mmes sur
diffrents milieux.
Matriaux
chantillon d'eau d'un cours d'eau navigable (emplacement indiqu)
Eau strile
Tubes striles
PRPARATION DE VOS DILUTIONS
Mthode (voir la mthode labore la semaine dernire)
1. Utiliser un maximum de 0,5 ml de votre chantillon d'eau pour prparer une srie de dilutions
de facteurs 10 jusqu' un facteur de dilution finale de 105 X.
METTRE DES BACTRIES SUR GLOSE : TALEMENT
Contrairement aux stries, ltalement est seulement utilis avec des liquides. Il permet de rpandre
les bactries de faon gale sur la surface dune glose. Par contre, contrairement aux stries, cette
mthode ne permet pas des dilutions dtre faites sur la glose elle-mme. Donc, si des dilutions
sont requises, celles-ci doivent tre faites au pralable. Linstrument utilis est un taleur de verre
communment appel bton de hockey . Tout comme avec la boucle, ltaleur doit tre strilis
pralablement chaque utilisation.

Bton de
hockey

19

Labo de Microbiologie-2012
o STRILISATION DE LTALEUR
Afin de striliser ltaleur, ce dernier est tremp dans lthanol, allum, puis on laisse
bruler lthanol. Ne pas garder ltaleur dans la flamme, car il deviendra trop chaud!
On permet ensuite ltaleur de refroidir, puis il est utilis pour taler lchantillon de
bactries sur la surface de la glose.

thanol
Tremper ltaleur
dans lthanol

Allumer lthanol

Permettre lthanol
de bruler

taler les bactries

Matriaux
Dilutions deau prpares prcdemment
6 Gloses TSA (Groupes pairs)
6 Gloses TSA + 0.1% glycrol (Groupes impairs)
Mthode
1. tiqueter de faon approprie 6 gloses TSA.
2. Transfrer et taler 0.1ml de chacune de vos dilutions, incluant lchantillon non dilu, aux
gloses correspondantes.
3. Amener toutes vos gloses lendroit dsign pour quelles soient incubes 28oC jusqu' la
prochaine priode de labo. Incuber vos gloses dans lorientation inverse.

20

Labo de Microbiologie-2012
ASSEMBLAGE DES CONDITIONS DE BIOREMDIATION
Matriaux
chantillon deau dune voie navigable
Engrais pour plantes
Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de mas (Gr. 5-8), huile darachides (Gr. 9-12), et huile diesel
(Gr.13-16)
Flacon de 250ml
1% (m/v) Solution de chlorure de triphenyltetrazolium (TTC)
Mthode
1. Ajouter 50 ml de lchantillon deau dune voie navigable au flacon de 250ml.
2. Ajouter de lengrais de plantes pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v).
3. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0.01% (m/v).
4. Ajouter approximativement 10ml de lhuile assigne au flacon. La quantit exacte nest pas
importante, mais vous dsirez avoir une quantit qui est suffisante afin dobtenir une fine
couche dhuile qui recouvre la surface.
5. tiqueter de faon approprie votre flacon avec votre numro de groupe, votre section et le
type dhuile.
6. Faire et enregistrer vos observations quant lapparence du mlange. Soyez aussi dtaill que
possible.
7. Amener le flacon lendroit dsign pour quil puisse tre incub avec agitation la
temprature de la pice (groupes pairs) ou 40C (groupes impairs).
8. Faire les taches suivantes daprs cet horaire dans les semaines suivantes.
Labo 3

25 & 27 sept.

Labo 4

2 & 4 oct.

Labo 5
Labo 6

16 & 18 oct.
30 oct. & 1 mai

Labo 7

6 & 8 nov.

Labo 8

13 & 15 nov.

Labo 9

20 & 22 nov.

Retirer 1ml et faire un entreposage long terme


Retirer 1ml et faire un entreposage long terme.
Inoculer nouveau milieu avec chantillon de 10ml
Retirer 1ml et faire un entreposage long terme
Retirer 1ml et faire un entreposage long terme
faire des comptes viables sur tous les chantillons
incluant celui prlev cette semaine
Choisir et strier pour colonies simples le type de
colonie prdominant obtenu lors du dernier
prlvement
Faire une coloration de Gram sur le type de colonie
prdominant obtenu lors du dernier prlvement
Soumettre une proposition des tests a faire pour
lidentification du genre
Faire une deuxime coloration de Gram sur lisolation
de colonies simples
Faire un deuxime striage pour colonies simples
Prparer des cultures en bouillon partir du deuxime
striage pour colonies simples
Faire les tests proposs pour lidentification du genre
21

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
STRIES POUR COLONIES SIMPLES
1. Obtenir et examiner vos gloses sur lesquelles vous avez fait vos stries pour colonies simples.
Avez-vous obtenu des colonies isoles?
2. Demander un aide enseignant dvaluer vos stries pour colonies simples.
3. Comparer vos stries pour colonies simples aux stries rgulires et vos pentes.
VISUALISATION MACROSCOPIQUE- MORPHOLOGIES COLONIALE
Lidentification prliminaire des microorganismes peut tre fonde sur la morphologie coloniale.
Chaque colonie simple reprsente une population de cellules bactriennes originaire d'une seule et
unique cellule qui, aprs de multiples cycles de division cellulaire, a gnr une colonie de
cellules sempilant les unes sur les autres selon une forme caractristique au type bactrien (tout
comme un amas de bananes a une apparence diffrente dun amas de pommes de terre). La
morphologie d'une colonie bactrienne est une fonction de plusieurs facteurs tels que la forme de
la cellule, sa taille et sa physiologie. Il est aussi important de noter que les colonies d'un type
bactrien donn ont souvent des couleurs, des textures et des odeurs distinctes.
Aprs une priode d'incubation approprie de vos comptes viables, vous devriez pouvoir voir des
colonies typiques de bactries. Remarquez la grande varit de couleurs, de formes et de textures
qu'assument les colonies de diffrentes espces. Rfrez-vous la figure ci-dessous pour
distinguer les morphologies des colonies observes. Ceci vous permettra d'obtenir une estimation
prliminaire du nombre d'espces qui se retrouvaient dans vos chantillons.

Forme

Circulaire

Irrgulire

Filamenteuse

Rhizode

lvation
Convexe

Bomb

leve

22

Bossue

Cratre

Labo de Microbiologie-2012
DNOMBRER LES BACTRIES
Le but de cet exercice tait d'utiliser des techniques microbiologiques de base pour rpondre aux
questions suivantes:
Combien de bactries et d'espces diffrentes est-ce quil y a dans la voie navigable?
Est-ce que les rsultats obtenus sont les mmes sur diffrents milieux?
cet effet, obtenir vos talements deau et compter le nombre de bactries obtenues. Choisissez
la dilution la plus approprie (pas trop ou trop peu de colonies, idalement environ 100 - 300).
Enregistrez vos comptes de colonies et enregistrer les sur le chiffrier Excel l'ordinateur au
podium. Vous aurez besoin des donnes de toute la classe pour votre devoir.
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2)
Les cellules microbiennes sont incolores et donc difficiles visualiser. Donc, plusieurs mthodes
de colorations ont t dveloppes pour visualiser et classifier les microorganismes. Les types de
colorations sont gnralement classifis comme simples ou diffrentiels. Dans le cas des
colorations simples, un seul colorant non spcifique et non discriminatoire, tel que le bleu de
mthylne, est utilis afin dexaminer les morphologies et les agrgations cellulaires bactriennes
au microscope. (Voir la figure sur la page 26)
Matriaux
Lames de microscope
Pipettes Pasteurs
chantillons environnementaux
Colorants
Mthode
1. Prparer des frottis de trois diffrentes colonies de votre chantillonnage environnemental.
Utiliser une boucle densemencement strile pour transfrer des bactries (TRS PEU) une
goutte deau dpose sur une lame de microscope.
2. Suspendre les bactries dans la goutte deau et taler sur une petite surface de la lame.
3. Laisser les frottis sasscher compltement lair sur votre table de travail.

23

Labo de Microbiologie-2012
4. Fixer vos frottis bactriens la chaleur en les passants rapidement dans la flamme du brleur
Bunsen. Ne chauffez pas trop vos lames!! Les bactries brles ne se colorent pas bien.
5. Assembler votre station de coloration comme suit :
Tapis de papier absorbant (ct plastique en dessous)
Contenant pour la coloration ( Gladware )
6. Dposer vos lames au-dessus des ouvertures du contenant Gladware . Ajouter une goutte
dun des colorants suivants chacun de vos frottis.
Bleu de mthylne
Cristal violet
Safranine

7. Laisser le colorant sur les frottis pour approximativement 30 secondes.


8. Rincer lexcdant du colorant avec de l'eau distille.
9. Asscher en tamponnant la lame entre les couches de papier absorbant.
10. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegarder.
Jetez vos solutions des colorations dans les tonneaux fournis cet effet.
NE PAS DVERSER LES COLORANTS DANS LES VIERS
Prsentation PowerPoint
1. Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo
de la prsentation doit inclure un titre, les noms de tous les membres du groupe, le numro du
groupe et la date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :
2. Un exemple de chacune des colorations simples avec les diffrents colorants incluant les
informations suivantes (3 images)
Type de coloration et le colorant utilis
Morphologie cellulaire
Agrgation cellulaire
Grossissement

24

Labo de Microbiologie-2012
MORPHOLOGIES CELLULAIRES

Neisseria

Micrococci

Micrococci

25

Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 3
DNOMBRER LES BACTRIES

Jour 1
Il existe plusieurs faons dobtenir une estime du nombre de bactries dans un environnement
donn. Parmi la plus commune est le compte viable que vous avez vu la semaine passe. Le
compte viable dtermine le nombre de bactries vivantes dans un chantillon. Cette mthode
ncessite la croissance des bactries sur un milieu appropri jusqu l'obtention de colonies
simples. Puisqu'on prsume quune colonie simple est le fruit d'une cellule unique, le nombre de
colonies reprsente le nombre de bactries viables prsentes dans l'chantillon. De plus, suite
leurs croissances, le chercheur peut valuer le nombre de diffrentes espces prsentes daprs les
diffrentes morphologies observes. Il existe plusieurs variantes des comptes viables. Un des
critres qui dicte le choix de la mthode est la source de lchantillon. Par exemple, est-ce que
vous dsirez chantillonner une surface, un chantillon solide, ou un chantillon liquide?
COMPTES VIABLES (Groupes de 2)
Matriaux
Bouillon de culture dE.coli
6 prouvettes de 10ml
100 ml de saline physiologique (0.9% m/v)
16 gloses TSA
Mthode
1. Prparer des dilutions en srie dans de la saline physiologique (SP) de la culture dE.coli telle
quillustre ci-dessous :
1.0mL

1.0mL

9.0mL
SP

9.9mL
SP

4.5mL
9.9mL
TSB
SP

1.0mL

9.0mL
SP

0.1mL

9.0mL
SP

0.1mL

9.9mL
SP

Culture
microbienne

0.1mL

H2 O

2. taler 0.1ml de chacune des dilutions (10-2-10-9) sur des gloses TSA tiquetes de faon
approprie.
3. Rpter ltape 1 sur un deuxime jeu de gloses.
4. Placer vos gloses dans le sac fourni cet effet. Fermer le sac avec du papier collant sur
lequel est indiqu votre nom et numro de groupe.
5. Incuber les gloses 28oC.
26

Labo de Microbiologie-2012
LES COMPTES LES PLUS PROBABLES (Groupes de 2)
Une variante des comptes viables dpend de la probabilit pour dterminer le nombre de bactries
dans un chantillon. Comme les comptes viables, cette mthode ncessite la croissance dans un
milieu appropri. Mais, contrairement aux comptes viables, la dtection est fonde sur la prsence
ou labsence de croissance ou la production dun sous-produit.
Matriaux
chantillon deau dune voie navigable
Eau strile
18 X 5 ml de bouillon TSB
3 prouvettes striles
Mthode
1. Prparer les dilutions suivantes de votre chantillon deau dune voie navigable dans un
volume final de 10ml deau : 10-2, 10-4 and 10-6.
2. tiqueter 6 jeux de 3 tubes contenant 5ml de TSB 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6.
3. Transfrer 0.1ml de lchantillon deau non dilu aux trois bouillons TSB tiquets 10-1.
4. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB tiquets 10-2.
5. Transfrer 0.1ml de la dilution (10-2) aux trois bouillons TSB tiquets 10-3.
6. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB tiquets 10-4.
7. Transfrer 0.1ml de la dilution (10-4) aux trois bouillons TSB tiquets 10-5.
8. Transfrer 1.0ml de la dilution (10-6) aux trois bouillons TSB tiquets 10-6.
9. Incuber vos tubes 28oC.

27

Labo de Microbiologie-2012
COMPTES DIRECTS (Groupes de 2)
Comme le nom lindique, un compte direct implique lnumration directe du nombre de
microorganismes prsents dans un chantillon, sans avoir les faire crotre a priori. Il est
important de noter qu'un compte direct ne permet pas de distinguer les microorganismes vivants
de ceux qui sont morts.
Pour obtenir une estimation rapide et prcise du nombre de cellules dans un chantillon donn, on
peut faire un compte direct. Ceci est accompli en utilisant une lame spciale possdant une cavit
laquelle un volume de liquide connu peut tre appliqu. La cellule de comptage d'une lame
dhemacytomtre standard possde deux cellules de comptage identiques burines dans le verre,
qui sont constitues de neuf carrs aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la
figure). Lorsque la lame d'hemacytomtre est recouverte d'une lamelle, l'espace libre disponible
est dune profondeur de 0.1 mm. Le volume de chaque carr est donc de 0.1 mm3 ou 10-4 cm3.
Une fois que l'chantillon dnombrer est appliqu, les cellules sont visualises et numres. Les
cellules dans chacun de trois carrs de tailles moyennes sont comptes. La moyenne est ensuite
calcule et le nombre total de cellules dans l'chantillon original est dtermin.
Exemple de calcul:
Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrs indpendants, l'on a une moyenne de 10
bactries par carr. Ce nombre quivaut avoir
10 bactries/0.1 mm3 ou 10 bactries/0.0001 cm3 ou 10 bactries /0.0001 ml
La concentration totale de bactries dans l'chantillon examin est donc de 1 X 105/ml.
Hmacytomtre

Y
Y

28

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Suspension de levure
Lame dhmacytomtre
Eau strile
Tubes
Pipettes Pasteurs
Mthode
1. Prparer les dilutions suivantes de la suspension de levure : 10-1, 10-2, et 10-3. Assurez-vous
de bien mlanger la suspension avant de faire vos prlvements.
2. Remplir la cellule de comptage de la lame dhmacytomtre avec un chantillon de la dilution
la plus leve (voir limage ci-dessous ou demander un aide enseignant de vous le
dmontrer). Assurez-vous de bien mlanger la suspension avant de faire vos
prlvements.
3. Compter le nombre de cellules dans chacun de trois carrs de la taille indiqu par un Y
dans limage sur la page prcdente.
4. Si le nombre de cellules est trop petit, recommencer avec la dilution prcdente. Si le nombre
de cellules est trop lev, prparer une dilution plus leve dun facteur de 10.
5. Enregistrer les donnes suivantes sur le fichier Excel au podium lavant :
Groupe

Dilution

No de cellules

Dimensions du carr

29

No de cellules/ml original

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
COMPTES VIABLE
1. Obtenir vos gloses sur lesquelles vous avez fait ltalement de vos dilutions dE.coli.
2. Compter le nombre de colonies sur les gloses qui possdent entre 30-300 colonies.
3. Rpter ltape 2 avec votre deuxime jeu de gloses.
COMPTE LES PLUS PROBABLES
Afin de comprendre la thorie du nombre le plus probable (NPP), pensez des dilutions en srie
de facteurs 10 qui sont faites avec des chantillons de 1ml de chaque dilution inocul dans
diffrents tubes qui contiennent un milieu donn.
Aprs lincubation, les bouillons sont observs pour la prsence ou labsence de croissance.
Thoriquement, si au moins un organisme tait prsent dans nimporte lequel des inocula, une
croissance visible devrait tre observe pour ce tube. Si le bouillon inocul partir de la dilution
10-3 dmontre de la croissance, mais que le bouillon inocul partir de la dilution 10-4 nen
dmontre pas, il est donc possible de dire quil y avait plus de 1X103 organismes par ml de
lchantillon original, mais moins que 1X104 par ml.
Les bactries ne sont que rarement, ou mme jamais, distribues de faon uniforme dans un
chantillon. Par exemple, si un chantillon de 10ml contient un total de 300 organismes, pas toutes
les aliquotes de 1 ml contiendront 30 organismes; certains contiendront plus ou moins de 30
organismes, mais en moyenne tous les dix aliquotes dans lchantillon entier de 10ml sera 30.
Ceci est tout aussi vrai pour nimporte lesquelles des dilutions desquelles des inocula sont pris.
Pour augmenter la prcision statistique de ce type de test, plus dun bouillon est inocul pour
chaque dilution. Le NPP standard utilise un minimum de 3 dilutions et 3, 5 ou 10 tubes par
dilution. Aprs lincubation, le patron de tubes positifs et ngatifs est not, puis un tableau de NPP
standardise est consult afin de dterminer le nombre le plus probable dorganismes (qui causent
les rsultats positifs) par unit de volume de lchantillon original.
Dans lexemple suivant, un jeu de 3 tubes de bouillons est inocul avec 1 ml partir de chacune
des dilutions de facteur 10.

Aprs lincubation, le nombre de tubes qui dmontre de la croissance est enregistr. un certain
point, les dilutions sont si leves, quaucun organisme ne se retrouvait dans linoculum
30

Labo de Microbiologie-2012
(enregistr comme ngatif). Afin destimer le nombre dorganismes par ml dchantillon qui serait
responsable du patron de croissance observe, les observations faites dans une srie de trois
dilutions successive sont utilises daprs les critres suivants :
Cas 1. Une ou plusieurs des dilutions dmontrent toutes des tubes ngatifs; une extinction est
observe. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilu) qui donne des rsultats ngatifs
dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans lexemple ci-dessus). Vrifier que les prochains
jeux de dilutions aprs la srie choisie (10-4 dans lexemple ci-dessus), dmontre tous une
extinction (0 de 3).Choisir les trois jeux de dilutions prcdente (10-1, 10-2 et 10-3 dans lexemple
ci-dessus). (Tableau: ex. a et b).
Cas 2. Une extinction nest pas observe dans toutes les prochaines sries de dilutions qui
nont pas t choisies. Choisir la dilution la plus faible (le jeu le moins dilu) qui donne des
rsultats ngatifs dans tous les tubes (3 de 3) (la dilution 10-4 dans lexemple ci-dessus). Vrifier
que les prochains jeux de dilutions aprs la srie choisie (10-4 dans lexemple ci-dessus), dmontre
tous une extinction (0 de 3). Choisir les trois jeux de dilutions prcdentes (10-1, 10-2 et 10-3 dans
lexemple ci-dessus). Si une extinction nest pas observe dans le prochain jeu de dilutions non
slectionn (c.--d. Il y a encore des tubes positifs dans les dilutions plus leves non choisies)
additionner les rsultats positifs de ces dilutions plus leves aux rsultats pour le jeu de dilutions
le plus lev choisis (ex. c).
Cas 3. Les dilutions ntaient pas suffisamment leves pour dmontrer une extinction. Si le
nombre de dilutions testes ntait pas suffisamment lev pour pouvoir choisir trios dilutions
aprs lesquelles une extinction est observe, alors choisir les trois dilutions les plus leves (ex.
d).
Cas 4. Aucune des dilutions ne dmontre toute des tubes positifs. Choisir les trois dilutions
les plus faibles (moins dilu; ex. f). Si des rsultats positifs sont observs dans les dilutions plus
leves qui nont pas t choisies, additionnez ces rsultats positifs de ces dilutions plus leves
aux rsultats de la dilution la plus leve choisie (ex. e).

31

Labo de Microbiologie-2012
Tableau
Exemple

100

10-1

10-2

10-3

10-4

a
b
c
d
e
f

3
2
3
3
0
2

3
3
2
3
0
2

1
1
2
3
1
1

0
0
0
3
0
1

0
0
1
2
0
0

Combinaison
de positifs
3-1-0
3-1-0
3-2-3
3-3-2
0-0-1
2-2-2

NPP/ml
4.6
0.36
2.9
11
0.03
0.35

Une fois quun jeu appropri de dilutions a t choisi, les rsultats de ces trios jeux sont utiliss
pour dterminer le NPP dans le deuxime jeu de tubes partir du tableau de NPP standard sur la
prochaine page.
noter:
Des quantits autres quun millilitre peuvent tre inocules. Par exemple, une inoculation
de 0.1 ml dune dilution de 103 est quivalente une inoculation de 1 ml dune dilution de
104.
La quantit de milieux dans le tube na aucune importance puisque la mme croissance
serait observe dans tous les cas.

32

Labo de Microbiologie-2012
Tableau de NPP trois tubes
No de tubes positifs
dans:
1er
2e
3e
Jeu
Jeu
Jeu
0
0
0
0
0
1
0
0
2
0
0
3
0
1
0
0
1
1
0
1
2
0
1
3
0
2
0
0
2
1
0
2
2
0
2
3
0
3
0
0
3
1
0
3
2
0
3
3
1
0
0
1
0
1
1
0
2
1
0
3
1
1
0
1
1
1
1
1
2
1
1
3
1
2
0
1
2
1
1
2
2
1
2
3
1
3
0
1
3
1
1
3
2
1
3
3

No de tubes positifs
dans:
1er
2e
3e
Jeu
Jeu
Jeu
2
0
0
2
0
1
2
0
2
2
0
3
2
1
0
2
1
1
2
1
2
2
1
3
2
2
0
2
2
1
2
2
2
2
2
3
2
3
0
2
3
1
2
3
2
2
3
3
3
0
0
3
0
1
3
0
2
3
0
3
3
1
0
3
1
1
3
1
2
3
1
3
3
2
0
3
2
1
3
2
2
3
2
3
3
3
0
3
3
1
3
3
2
3
3
3

NPP de linoculum du
2e jeu de tubes
<0.03
0.03
0.06
0.09
0.03
0.061
0.092
0.12
0.062
0.093
0.12
0.16
0.094
0.13
0.16
0.19
0.036
0.072
0.11
0.15
0.073
0.11
0.15
0.19
0.11
0.15
0.20
0.24
0.16
0.20
0.24
0.29

NPP de linoculum du
2e jeu de tubes
0.091
0.14
0.20
0.26
0.15
0.20
0.27
0.34
0.21
0.28
0.35
0.42
0.29
0.36
0.44
0.53
0.23
0.39
0.64
0.95
0.43
0.75
1.2
1.6
0.93
1.5
2.1
2.9
2.4
4.6
11
>24

Vos Rsultats:
o Enregistrer vos rsultats pour vos NPP:
Groupe

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

33

10-6

Combinaison
de positifs

NPP/ml

Labo de Microbiologie-2012
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM (Groupe de 2)
Prcdemment, vous avez fait des colorations simples qui vous ont permis de comparer les tailles,
les formes et les agrgations cellulaires. Plusieurs autres mthodes de colorations ont t
dveloppes qui se disent diffrentielles. Ces mthodes colorent les bactries de faon
diffrentielle en fonction de diffrentes proprits de la cellule.
Le docteur Christian Gram a dvelopp une technique de coloration diffrentielle, la coloration de
Gram. La coloration de Gram permet non seulement d'observer la forme et la taille des bactries,
mais aussi de les classifier dans un de deux groupes: Gram positif ou Gram ngatif.
La technique de coloration de Gram utilise quatre composs chimiques: Le violet de cristal, un
colorant primaire qui teint bleu toutes les cellules sans distinction, L'iode de Gram, qui sassocie
avec le colorant primaire agissant comme un mordant, Lthanol, qui cause la dshydratation des
parois cellulaires et le Safran, un colorant qui teint rouge toutes les cellules sans distinction.
Lajout squentiel de ces 4 composs aura pour effet de colorer en mauve (Gram positif) ou en
rouge (Gram ngatif) les bactries, selon leur espce.
Le potentiel diffrentiel de la coloration de Gram est une fonction de la composition des parois
cellulaires des bactries. Typiquement, les bactries Gram positives possdent des parois
cellulaires trs paisses, composes de 10-20 couches de peptidoglycanes contenant trs peu de
lipides. Les bactries Gram ngatives ont plutt des parois cellulaires relativement minces
constitues de 1-3 couches de peptidoglycanes avec un contenu lev de lipides. Ltape critique
dans la technique de coloration de Gram, qui lui confre ses proprits discriminatoires, est le
rinage l'thanol. Dans le cas dorganismes Gram positifs, la paroi des cellules est trs
facilement dshydrate en raison de son faible contenu de lipides: ces cellules ont tendance
conserver le complexe d'iode de Gram/violet de cristal. Par contre, la paroi des organismes Gram
ngatifs nest pas facilement dshydrate par l'thanol en raison de sa haute teneur en lipides, ce
qui lui permet de conserver une grande permabilit. Ainsi, le traitement l'thanol russit laver
efficacement les complexes d'iode de Gram/violet de cristal, rendant les cellules incolores. Ces
cellules deviennent donc rouge suite leurs contre coloration avec le Safran.

34

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Lames de microscope
Culture en bouillon de S. aureus et dE. coli
NPP des chantillons deau
Colorants
Mthode
1. Prparer des frottis fixs la chaleur de chacun des bouillons de culture fournis.
2. Prparer des frottis fixs la chaleur de la dilution la plus leve et de la dilution la plus
faible de lessai de NPP qui a dmontr de la croissance.
3. Colorer avec le violet de cristal pour une minute.
4. Laver soigneusement lexcdant du colorant avec de leau distille.
5. Appliquer l'iode de Gram pour une minute.
6. Laver soigneusement lexcdant diode de Gram avec de l'eau distille.
7. Laver soigneusement lthanol 95% en appliquant le solvant goutte goutte jusqu ce que
lafflux dalcool soit incolore.
8. Laver lexcdant d'thanol avec de l'eau distille.
9. Contre-colorer avec le Safran durant 45 secondes.
10. Laver lexcdant de colorant avec de leau distille.
11. Asscher la lame l'aide de papier bilbueu.
12. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegard.

35

Labo de Microbiologie-2012
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RSISTANTE (Groupe
de 2)
La coloration acido-rsistante est une autre procdure de coloration spcialise. Cette technique
est particulirement utile pour colorer des bactries ayant des constituants semblables de la cire
dans leurs parois cellulaires. Les microbes de ce type incluent plusieurs pathognes de ltre
humain, comme les Mycobacteriaceae dont certains membres causent la tuberculose et la lpre.
La haute teneur en acide mycoque, une composante semblable la cire, des parois cellulaires des
les rend littralement impermables aux colorants. Cependant, une fois que le colorant a pntr,
il ne peut pas tre facilement retir par des dcolorants tels que lthanol. Le principe de la
technique est de rendre les bactries permables au colorant et ensuite de vrifier leur rsistance
une dcoloration ardue. Ces objectifs sont atteints en employant la fuchsine de carbol comme
colorant primaire. Ce compos, tant miscible dans les lipides, pntre facilement la couche
cireuse des Mycobactries. De par leur couche cireuse, les bactries rsistent au dur traitement de
dcoloration subsquent effectu avec de l'alcool acide.
Matriaux
Lames de microscope
Culture sur pentes de B. subtilis et de M. smegmantis
Carbol Fuschine de Kinyoun
Alcool acide
Mthode
1. Prparer un frottis fix la chaleur de chacune des cultures bactriennes.
2. Inonder les frottis avec fuchsine de carbol pour 5 minutes.
3. Rincer avec de leau distille.
4. Dcolorer avec de lalcool acide jusqu' ce quil ny a pu de colorant.
5. Rincer avec de leau distille.
6. Contre colorer avec du bleu de mthylne pour 30 secondes.
7. Rincer le colorant avec de l'eau distille.
8. Asscher la lame l'aide de papier bilbueu.
9. Examiner au microscope et faire la prise de photos numriques. Sauvegard.

36

Labo de Microbiologie-2012
VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES
Les cellules d'espces bactriennes appartenant aux genres Bacillus et Clostridium peuvent
prendre la forme de cellules vgtatives qui sont mtaboliquement actives ou la forme de spores
qui sont mtaboliquement inactives. Les spores reprsentent une forme cellulaire dormante qui
possde un grand niveau de rsistance des conditions environnementales extrmes telles que la
chaleur et la scheresse. Quand les conditions environnementales deviennent dfavorables la
poursuite de la croissance des cellules vgtatives, celles-ci initient la sporogense pour gnrer
une nouvelle structure intracellulaire, lendospore. Lendospore, telle que la semence dune
plante, est recouverte de plusieurs couches successives qui lui confrent une grande rsistance.
ventuellement, lendospore est relche comme entit indpendante de la cellule vgtative, sous
la forme dune spore. Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables la
croissance, les spores germent et reprennent la forme de cellules vgtatives.
La rsilience des spores les rend rsistantes aux mthodes de coloration standard, ce qui ncessite
l'utilisation d'une mthode de coloration spcialise. En bref, la coloration des spores se fait de la
faon suivante. Les cellules sont traites avec un colorant primaire, le vert de malachite. Comme
les spores sont impermables, le colorant est appliqu en chauffant le frottis, de faon augmenter
la permabilit des spores. Suite cette tape, la cellule vgtative et la spore sont colores en
vert. Le frottis est ensuite rinc leau pour enlever lexcdant de colorant. Le vert de malachite
ayant peu daffinit pour la cellule, les cellules vgtatives sont aisment dcolores alors que les
spores demeurent vertes. Finalement, le frottis est contre-color avec le Safran, lequel ne colore
pas les spores, mais par contre, colore les cellules en rouge.
Voir la lame de dmonstration
1. Prparer des frottis fixs la chaleur.
2. Inonder les frottis avec le vert de malachite.
3. Faire bouillir sur la flamme du brleur de Bunsen pendant cinq minutes. Assurez-vous que le
colorant ne s'assche pas. Ajouter du colorant au besoin.
4. Rincer le frottis l'eau distille.
5. Contre-colorer avec le rouge de safran.
6. Rincer l'eau distille, puis asscher.
7. Examiner au microscope.

37

Labo de Microbiologie-2012
Prsentation PowerPoint
Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo
de la prsentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numro du groupe
et la date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :
Une coloration de Gram de chacune des cultures en bouillon fourni. (2 images)
Une coloration de Gram partir des NPP (2 images)
Une coloration acido-rsistante de Mycobacterium smegmantis et de B. subtilis (2 images)
Chacune des images doit tre accompagne dune lgende approprie qui inclut linformation
suivante :
o Genre et espce bactrienne (si connue) ou la source
o Type de coloration utilis
o Morphologie cellulaire
o Agrgation cellulaire
o Grossissement
Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit tre sauvegard sur le disque K:\
dans un fichier nomm comme suit : Colorations_Groupe (votre numro de groupe)
BIOREMDIATION (Partie 2)
Matriaux
Flacon de Bioremdiation
Glycrol
Tube capuchon bouton-pression
Mthode
1. Enregistrer toute observation en ce qui trait lapparence de votre culture de
bioremdiation.
2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression.
3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v).
4. Mlanger la culture au vortex pour vous assurez que le glycrol et bien dispers
5. tiqueter de faon approprie avec votre numro de groupe et la date.
6. Congeler 20 C pour un entreposage long terme.

38

Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 4
LES MILIEUX DE CROISSANCE ET LES BACTRIES DU SOL

Jour 1
Il existe plusieurs types de milieux microbiologiques, qui se classent comme tant complexe
dfini, diffrentiel ou slectif. Les milieux dfinis sont trs varis et diffrent beaucoup dans leurs
compositions. Ils peuvent contenir trs peu ou beaucoup dingrdients. Leur particularit est que
la composition exacte du milieu et tous les ingrdients qui les composent sont connus. Par contre,
les milieux complexes sont crs partir dingrdients dont la composition exacte est inconnue;
par exemple un milieu fait dextraits de buf. Dans les deux cas, ces milieux peuvent tre rendus
soit diffrentiels ou slectifs. Les milieux diffrentiels possdent des composs qui permettent de
distinguer visuellement, habituellement par des changements de couleur, diffrents mtabolismes
bactriens. Par contre, les milieux dits slectifs contiennent des composs qui prviennent la
croissance de certains microorganismes.
La source de carbone et le mtabolisme par lequel celui-ci est utilis sont trs varis parmi
diffrentes bactries. En prsence de plus d'une source de carbones et de diffrentes conditions
environnementales, les bactries font des choix, d'aprs leurs capacits et leurs prfrences, du
type de mtabolisme utilis. Certaines bactries utilisent exclusivement un mtabolisme oxydatif,
qui require un capteur d'lectrons final inorganique, tel que l'oxygne. D'autres utilisent un
mtabolisme fermentatif qui require un capteur final organique.
Diffrents milieux de croissance diffrentiels ont t conus afin d'valuer le type de mtabolisme
utilis. Ces derniers incluent habituellement un indicateur de pH qui change de couleur en
fonction des sous-produits gnrs partir du mtabolisme et de la source de carbone utilise.
Gnralement, la prsence d'acide indique le mtabolisme d'un sucre par un mode oxydatif ou de
fermentation. Par contre, l'accumulation de sous-produits alcalins indique le catabolisme de
protines par un mode oxydatif.

39

Labo de Microbiologie-2012
BACTRIES DU SOL
Les bactries reprsentent les microorganismes les plus abondants dans les sols. Leurs nombres
peuvent atteindre 1 X 108 par g de sol. Elles peuvent tre gnralement classifies parmi les
catgories suivantes:
Les dcomposeurs : Ces bactries ont un rle important dans la dcomposition de matires
organiques. Les bactries du genre Bacillus et Pseudomonas sont des exemples de dcomposeurs.
Puisque la majorit des composs organiques initialement prsents dans les sols reprsente des
polymres complexes tels la cellulose ou l'amidon, plusieurs de ces bactries ont la capacit de
scrter dans leurs environnements des enzymes exocellulaires qui peuvent dgrader ces
polymres en unit plus facilement digrs.
Bactries qui fixent l'azote : Parmi ce type de bactries sont les Rhizobiums qui peuvent tablir
des relations symbiotiques avec les racines des plantes. Ces bactries font l'extraction de l'azote
gazeux de l'atmosphre qu'ils convertissent en une forme utilisable par les plantes. D'autres genres
bactriens, tels quAzotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Gluconobacter, Flavobacterium et
Herbaspirillum fixent eux aussi l'azote, mais sont non symbiotiques.
Bactries nitrifiantes : Ces bactries changent l'ammonium (NH4+) au nitrite (NO2-) et ensuite au
nitrate (NO3-) une source d'azote qui est prfre par la majorit des plantes.
Bactries dnitrifiantes: Ces bactries convertissent le nitrate l'azote gazeux. Celles-ci sont des
bactries qui vivent en absence d'oxygne; des anarobies.
Arobies et anarobies : La disponibilit d'oxygne tant trs variable dans les sols, les
exigences parmi les bactries et trs diverses. L'oxygne peut tre employ par quelques
organismes, tels que les tres humains et quelques espces bactriennes, comme capteur final
dlectrons dans la respiration en arobie. En ce qui trait leurs exigences, les bactries peuvent
tre places dans des classes diffrentes daprs leurs capacits dutiliser l'oxygne comme
capteur final dlectrons et leurs capacits de crotre en prsence d'oxygne.
Arobie strict
Anarobie facultatif
Anarobie
Anarobie strict

Le besoin doxygne est absolu pour survivre.


Le besoin d'oxygne est facultatif, mais la croissance en sa prsence est
optimale.
Nutilise pas l'oxygne pour la croissance, mais peuvent crotre en sa
prsence.
Nutilisent pas loxygne pour la croissance et ne peuvent crotre en sa
prsence.

Arobie
Anarobie
Anarobie Anarobie strict
strict
Facultatif
Croissance en prsence dO2
+
+
+
Croissance sans O2
+
+
+

Capteur e final : O2
+
+
La prsence ou labsence doxygne molculaire peut tre un facteur qui dterminera si une
espce bactrienne peut crotre.

40

Labo de Microbiologie-2012
LES BACTRIES DANS DU COMPOST (Groupe de 2)
Prparation de l'chantillon
Matriaux
Composte ( ct de la balance)
Bouteille de 250 ml qui contient 90 ml d'eau strile
Tube Falcon strile de 50 ml.
6 prouvettes striles
Eau strile
Mthode
1. Faire la pese d'un gramme de compost.
2. Ajouter le composte la bouteille d'eau strile. (Notez; ceci reprsente une dilution de 10-2).
3. Mlanger vigoureusement pour 1-2 minutes.
4. Laisser reposer pour 5 minutes sur votre table, puis rpter l'tape 3 une fois de plus.
5. Laisser reposer pour 10 minutes sur votre table.
6. Prudemment dverser approx. 20-30 ml du surnageant un tube Falcon strile de 50 ml.
viter autant que possible de rcolter du sdiment.
7. Prparer une srie de dilution dans 10 ml d'eau strile reprsentant les facteurs de dilutions
suivantes 102X, 103X, 104X, 105X et 106X.
COMPTE DE BACTRIES AROBIES HTROTROPHES (Groupes pairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
5 gloses TSA + 0.1% glycrol
Mthode
1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses TSA + 0.1%
glycrol tiquetes de faon approprie.
2. Incuber 28oC.
COMPTE DE BACTRIES ANAROBIES HTROTROPHES (Groupes impairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
5 gloses TSA + 0.1% glycrol
Mthode
1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses TSA + 0.1%
glycrol tiquetes de faon approprie.
2. Incuber dans la cuve d'anarobie 28oC.

41

Labo de Microbiologie-2012
COMPTE DE BACTRIES GRAM NGATIVES ET POSITIVES
Afin d'obtenir une estimation de la distribution de bactries Gram ngatives et positives dans le
sol, nous utiliserons des milieux diffrentiels et slectifs; l'Agar de MacConkey et l'Agar CNA de
Colombie
L'Agar MacConkey est un milieu slectif et diffrentiel qui contient du lactose et des protines
en tant que sources de carbones potentielles. La slectivit de ce milieu est attribuable l'ajout du
cristal violet qui inhibe la croissance d'organisme Gram positif et des levures. L'aspect diffrentiel
du milieu permet de distinguer la fermentation du lactose par l'inclusion d'un indicateur de pH.
Les bactries qui fermentent le lactose sont rose, tandis que les non-fermenteurs sont incolores.
L'Agar CNA de Colombie est un milieu riche qui contient une combinaison de peptones
(peptides protiques) obtenues de tissus animaux et d'extrait de buf. De l'extrait de levure est
inclus comme source des vitamines B. L'inclusion de l'acide nalidixique et du colistin rend ce
milieu slectif pour les bactries Gram positives. L'acide nalidixique bloque la rplication de
l'ADN tandis que le colistin perturbe la membrane plasmique d'organismes Gram ngatifs.
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
5 gloses MacConkey (Groupes pairs)
5 Glose CNA de Colombie (Groupes impairs)
Mthode (Groupes pairs)
1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 10-6) du compost sur des gloses de MacConkey
tiquetes de faon approprie.
2. Incuber 28oC.
Mthode (Groupes impairs)
1. taler 0.1 ml de chacune des dilutions (10-2 10-6) du compost sur des gloses de CNA de
Colombie tiquetes de faon approprie.
2. Incuber 28oC.

42

Labo de Microbiologie-2012
CYCLE DE L'AZOTE
Le cycle de l'azote implique cinq procds -- la fixation, l'absorption, la minralisation, la
nitrification, et la dnitrification -- qui sont tous entrains par des microorganismes.
La fixation (N2 NH4+) est un procd par lequel le N2 est converti en ammonium; compos
essentiel, car c'est la seule faon que les organismes peuvent obtenir d'azote directement de
l'atmosphre.
L'absorption de l'azote (NH4+ N organique) produit par les bactries est rapidement
incorpore dans les protines et d'autres composs azots organiques par les plantes, les bactries
ou d'autres organismes.
La minralisation (N organique NH4+) survient souvent par la dcomposition. Quand les
organismes meurent, des dcomposeurs tels que les bactries consument la matire organique et
convertissent des quantits importantes de l'azote dans l'organisme mort en ammonium. Sous la
forme d'ammonium, l'azote est disponible pour l'utilisation par les plantes ou pour tre transform
en nitrate (NO3-) par un procd appel la nitrification.
La nitrification (NH4+ NO3-) plusieurs bactries obtiennent de l'nergie en convertissant une
partie de l'ammonium, qu'ils utilisent comme source d'lectrons, produits par la dcomposition au
nitrate.
La dnitrification (NO3- NO2-) est faite par les bactries dnitrifiantes qui convertissent le
nitrate (NO3-) en nitrite (NO2-) et dans certain cas de l'azote gazeux :
NO3- NO2- NO N2O N2.

43

Labo de Microbiologie-2012
BACTRIES QUI FIXENT L'AZOTE (Groupes impairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
150ml de milieu dessai de fixation dazote
20 prouvettes striles
Mthode
1. Faire un compte NPP tel quindiqu ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu dessai de
fixation dazote pour les dilutions de 100 10-3.
2. Incuber 28oC.
BACTRIES NITRIFIANTES (Groupes pairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
150ml de milieu dammonium
20 prouvettes striles
Mthode
1. Faire un compte NPP tel quindiqu ci-dessous dans 4 jeux de 5 tubes de milieu d'ammonium
pour les dilutions de 100 10-3.
2. Incuber 28oC.
chantillon de
compost
100
100
10-2
10-2

Volume dinoculum

Vol. du milieu
5 tubes
5ml
5ml
5ml
5ml

1.0 ml
0.1 ml
1.0 ml
0.1 ml

44

Dilution finale
10-0
10-1
10-2
10-3

Labo de Microbiologie-2012
L'ASSIMILATION DU CARBONE
La grande majorit du carbone initialement disponible dans les sols est de sources vgtales et
reprsente des polymres de sucres, tel que la cellulose, composante des parois vgtale, et
l'amidon, forme principale de stockage des sucres chez les plantes. L'utilisation de ces composs
requiert la production et la scrtion d'enzyme exocellulaire qui ont pour but de faire la
dgradation de ces derniers en composs plus simples qui peuvent tre transports l'intrieur de
la cellule et mtaboliss. Ces enzymes sont donc trs communes chez les microorganismes
dcomposeurs.
Amylase
ou
Cellulase

Amidon
ou
Cellulose
BACTRIES QUI DGRADENT L'AMIDON (Groupes pairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
5 Gloses d'amidon
Mthode
1. taler 0.1ml de chacune des dilutions de compost (10-2 10-6) sur des gloses damidon
tiquetes de faon approprie.
2. Incuber 28oC.

45

Labo de Microbiologie-2012
BACTRIES QUI DGRADENT LA GLATINE (Groupes impairs)
Matriaux
Dilutions du compost prpar dans l'exercice prcdent
Agar fondu de tryptone + 4% glatine
5 botes de Ptri
Bcher de 1L
Mthode
1. Laisser couler leau chaude du robinet jusqu' ce quelle atteigne la temprature maximale.
2. Remplir deau chaude approximativement moiti d'un bcher.
3. Obtenir 5 tubes dagar fondus de tryptone + glatine et les placer dans le bcher deau
chaude.
4. Transfrer 0.1ml de votre dilution de compost de 10-2 au premier tube dagar fondu.
5. Bien mlanger quelques secondes, puis verser dans une premire bote de Ptri tiquete de
faon approprie.
6. Rpter ltape 4-5 pour chacun des dilutions suivantes (10-3-10-6).
7. Laisser les botes de Ptri coules refroidir jusqu' la solidification de lAgar.
8. Incuber les gloses 28oC.

46

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
LES BACTRIES DANS DU COMPOST
Chaque groupe doit obtenir les comptes suivants et dterminer le compte bactrien/g de compost
original :
Compte htrotrophe en arobie
Compte htrotrophe en anarobie
Compte de bactries Gram positives
Compte de bactries Gram ngatives
NPP des bactries qui fixent l'azote
NPP des bactries nitrifiantes
Compte de bactries qui dgradent l'amidon
Afin de dterminer quelles bactries dgradent l'amidon, inonder les gloses d'amidon
avec de l'iode de Gram. Liode de Gram ragit avec l'amidon gnrant une couleur bleue
noir. En absence d'amidon, l'iode demeure bruntre. Compter les colonies qui dmontrent
un halo d'iode qui ne ragit pas avec l'amidon.
Compte de bactries qui dgradent la glatine
Afin de dterminer quelles bactries dgradent la glatine, regarder pour des zones autour
des colonies. Compter les colonies qui dmontrent un halo nuageux autour delles.
COLORATIONS DE GRAM (Groupes de 4)
Faire des colorations de Gram et la prise de photo de la croissance obtenue pour les NPP des
bactries qui fixent l'azote et les bactries nitrifiantes.
Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies qui dgradent l'amidon et
de deux colonies qui dgradent la glatine.
Faire des colorations de Gram et la prise de photo de deux colonies obtenues sur le compte
htrotrophe en arobie et de deux colonies du compte htrotrophe en anarobie.

47

Labo de Microbiologie-2012
Tableau de NPP 5 tubes
noter : Les NPP sont donns par 100g ou 100ml dchantillon

48

Labo de Microbiologie-2012
ISOLATION DE BACILLES INCONNUS GRAM POSITIFS (Groupes de 2)
Matriaux
2 gloses TSA
Mthode
1. partir de la glose CNA, retrouver deux diffrentes colonies qui reprsentent des bacilles
Gram positifs. Pour ce faire, faites des colorations de Gram de quelques colonies. Notez: ne
pas utiliser la colonie au complet, car vous devrez faire des stries pour colonies simples
des colonies choisies.
2. Prendre des photos des colorations de Gram des colonies choisies.
3. Faire des stries pour colonies simples sur des gloses TSA des colonies choisies.
4. Incuber 28oC.
Prsentation PowerPoint
Chaque groupe doit prparer une prsentation PowerPoint de leurs images. La premire diapo de
la prsentation doit inclure un titre, les noms des membres du groupe, le numro du groupe et la
date. La prsentation doit inclure les images suivantes (une par diapo) :
Coloration de Gram de bactries qui fixent l'azote. (1 image)
Coloration de Gram de bactries nitrifiantes. (1 image)
Colorations de Gram de bactrie qui dgradent l'amidon. (3 images)
Colorations de Gram de bactrie qui dgradent la glatine. (3 images)
Colorations de Gram d'inconnus bactriens isols d'une glose CNA (2 images)
Le fichier PowerPoint, contenant toutes les images, doit tre sauvegard sur le disque K:\
dans un fichier nomm comme suit : Colorations_Groupe (votre numro de groupe)

49

Labo de Microbiologie-2012
BIOREMDIATION (Partie 3)
Matriaux
Flacon de bioremdiation
Glycrol
Huile de Canola (Gr. 1-4), huile de mas (Gr. 5-8), huile darachide (Gr. 9-12), et huile de diesel
(Gr.13-16)
Engrais pour plantes
Flacon de 250ml
Tube capuchon Bouton-pression
1% (m/v) Solution de triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Mthode
1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait lapparence de votre culture de
bioremdiation.
2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression.
3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v).
4. Mlanger la culture au vortex pour assurer une dispersion uniforme du glycrol.
5. tiqueter de faon approprie avec votre numro de groupe et la date.
6. Congeler 20 C pour un entreposage long terme.
7. Ajouter 40 ml deau distille un nouveau flacon de 250ml.
8. Ajouter de lengrais de plante pour obtenir une concentration finale de 0.1% (m/v).
9. Ajouter du TTC pour obtenir une concentration finale de 0.01% (m/v).
10. Transfrer 10ml de votre culture de bioremdiation ce nouveau milieu frais.
11. Ajouter approximativement 10ml de lhuile assigne au flacon. La quantit nest pas
importante, mais vous voulez avoir une quantit qui est suffisante pour obtenir une fine
couche qui recouvre la surface.
12. tiqueter de faon approprie le flacon avec votre numro de groupe, votre section et le type
dhuile.
13. Enregistrer toute observation en ce qui a trait lapparence du mlange. Soyez aussi dtaill
que possible.
14. Amener le flacon lendroit dsign pour quil soit incub avec agitation la temprature de
la pice (Groupes pairs) ou 40C (Groupes impairs).

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Labo de Microbiologie-2012
LABO No 5
DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM POSITIVES

Jour 1
IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS (Groupes de 2)
Les deux formes principales des bactries Gram positives sont les bacilles et les coques. Les
coques seront traites dans une section ultrieure. Les familles prdominantes des bacilles Gram
positifs incluent les Bacillaceae, les Clostridiaceae et les Lactobacillaceae. Ces familles sont
divises en deux groupes gnraux; les bactries sporulantes qui incluent les Bacillaceae et les
Clostridiacea, et les non-sporulantes, les Lactobacillaceae.
Les Bacillaceae comportent le genre bactrien Bacillus qui inclut des arobies et des anarobies
facultatifs. Ces bactries ont une vaste diversit dexigences de croissance. Une varit dactivits
biochimiques est note dans cette famille incluant des activits de fermentation, protolytiques, et
la capacit de dgrader des composs de carbones complexes.
La famille des Clostridiaceae, qui inclut le genre bactrien Clostridium, possde des
caractristiques trs semblables aux Bacillaceae, mais ceux-ci se distinguent par le fait quils sont
des anarobies stricts.
Les organismes dans la famille des Lactobacillaceae peuvent des anarobies ou des arobies
facultatifs, avec des exigences nutritionnelles trs complexes. Certains produisent de lacide
lactique de la fermentation des hydrates de carbone. Rarement pathogne, lexception du genre
Listeria, un arobie ou microarophile.
Matriaux
Gloses sur lesquelles vous avez isol et stri des bacilles inconnus Gram positifs
Mthodes
MORPHOLOGIE COLONIALE
1. Examiner les gloses sur lesquelles vous avez stri vos inconnus pour des colonies simples.
2. laide du microscope dissection, obtenir des photos numriques de colonies typiques de
chacun de vos inconnus.
3. Enregistrerez la morphologie coloniale ainsi que les couleurs de chaque inconnu.
COLORATION DE GRAM
1. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus.
2. Faire la prise de photos pour votre rapport.
3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et lagrgation cellulaire.

51

Labo de Microbiologie-2012
MTABOLISME DE SOURCES DE CARBONE SIMPLES
La source de carbone et le mtabolisme utilis sont trs varis parmi diffrentes bactries. La
croissance en bouillons de phnol rouge est trs utilise pour valuer le mtabolisme des sources
de carbones simples. Ces bouillons contiennent deux sources de carbones; un sucre de votre choix
et des protines. De plus, lindicateur de pH, le phnol rouge est inclus. Le phnol rouge tourne au
jaune en milieu acide et tourne au rouge en milieu alcalin. De plus, une fiole inverse est utilise
pour dceler laccumulation de gaz. Gnralement, la prsence d'acide et de gaz indique un
mtabolisme de fermentation, tandis quune croissance en absence de gaz indique un mtabolisme
oxydatif. Noter, la production de sous-produits neutres ou acides indique le catabolisme d'un
sucre, tandis que des sous-produits alcalins indiquent le catabolisme de protines.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isols la semaine passe
2 pairs de bouillons de phnol rouge avec glucose, arabinose, xylose ou mannitol
Saline physiologique (0.9% m/v)
Huile minrale
2 prouvettes striles

Bact. 1

Bact. 1

PRG:

PRG:

Mthode
1. Prparer des suspensions de 1 ml de chacun de vos inconnus dans de la saline physiologique.
Vous dsirez obtenir une turbidit qui est dtectable.
2. Inoculer une paire de bouillons phnols rouge + glucose avec 0.1 ml dun des bacilles.
3. Recouvrir d'huile minrale strile UN des tubes de bouillon de phnol rouge avec glucose que
vous avez inocul avec un millilitre dhuile minrale strile.
4. Inoculer une paire de bouillons phnols rouge + arabinose avec 0.1 ml dun des bacilles.
5. Recouvrir d'huile minrale strile UN des tubes de bouillon de phnol rouge avec arabinose
que vous avez inocul avec un millilitre dhuile minrale strile.
6. Inoculer une paire de bouillons phnols rouge + xylose avec 0.1 ml dun des bacilles.
7. Recouvrir d'huile minrale strile UN des tubes de bouillon de phnol rouge avec xylose que
vous avez inocul avec un millilitre dhuile minrale strile.
8. Inoculer une paire de bouillons phnols rouge + mannitol avec 0.1 ml dun des bacilles.
9. Recouvrir d'huile minrale strile UN des tubes de bouillon de phnol rouge avec mannitol
que vous avez inocul avec un millilitre dhuile minrale strile.
10. Rpter les tapes 2-9 avec le 2e inconnu. Donc 8 tubes/inconnu pour un total de 16 tubes.
11. Incuber 28C.

Huile minrale
Paire de bouillons phnol rouge glucose (PRG) inocules avec 0.1ml
de la mme suspension bactrienne.
Tube 1 reprsente des conditions darobie
Tube 2 est recouvert dhuile minrale pour crer des conditions
danarobies

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Labo de Microbiologie-2012
FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU
D'ACTOINE
Certaines bactries fermentant le glucose gnrent de grandes quantits d'acides de toutes sortes.
Ces acides sont facilement dcels en prsence du ractif mthylrouge. D'autres espces
bactriennes ne gnrent que de faibles quantits d'acides, mais de grandes quantits de sousproduits neutres comme l'thanol et le butanediole. Un des intermdiaires de la production de ces
sous-produits est l'actoine, compos qui peut tre dcel l'aide d'un ractif chimique. Le test de
Mthyl-Rouge-Vogues-Proskauer est utilis pour dterminer le type de fermentation utilis par
un microorganisme donn.

MR/VP : Bact. 2

Mthode
1. Inoculer avec 0.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons
MR-VP.
2. Incuber 28oC.

MR/VP : Bact. 1

Matriaux
Suspensions, prpares dans lexercice prcdent, des bacilles inconnus
2 bouillons MR-VP

URASE
Certains microorganismes peuvent d'utiliser l'ure comme source de carbone et ou dazote. L'ure
est un sous-produit gnr par le catabolisme des protines chez les vertbrs. Le catabolisme de
l'ure par les microorganismes ncessite lurase, une enzyme hydrolysant l'ure en l'ammoniac,
du bioxyde de carbone et de l'eau. L'ammoniac relch dans le milieu de culture le rend alcalin.
Un indicateur de pH dans le milieu de culture, le phnol rouge, permet de dceler la prsence de
produits alcalins, en changeant de couleur au rose.

53

Bact. 1

Bact. 2
Ure:

Mthode
1. Strier vos bacilles inconnus sur des pentes dAgar dures.
2. Incuber 28oC.

Ure:

Matriaux
Stries pour colonies simples dun bacille inconnu Gram positif isol la
semaine passe
2 Pentes dAgar dure

Labo de Microbiologie-2012

Bact. 2
Citrate

Mthode
1. Strier chacun de vos inconnus la surface dune pente de citrate de
Simmons
2. Incuber 28oC.

Bact. 1

Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isols la
semaine passe
2 Pentes de citrate de Simmons

Citrate

L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE


Cet essai est conu pour dterminer si un microorganisme peut utiliser le citrate comme source
unique de carbone et des sels d'ammoniums inorganiques comme source unique d'azote.
L'utilisation du citrate gnre des sous-produits alcalins qui sont dcels par l'inclusion d'un
indicateur de pH, le brome thymol bleu, qui est vert un pH de 6.8 et bleu
un pH de 7.6 ou plus.

UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES:


ENZYMES EXOCELLULAIRES
Les sources de carbone simple, tels les monosaccharides, les disaccharides et les acides amins
pntrent la cellule par diffusion simple ou par un systme de transport spcifique. Par contre, les
sources de carbones complexes, tels les polysaccharides et les protines, sont des molcules trop
grosses pour pouvoir employer lun ou lautre de ces mcanismes de transports. Afin dtre
utilises, ces molcules doivent d'abord tre clives en units plus petites, plus maniables. Le
clivage des molcules polymriques en units monomriques est fait par la scrtion d'enzymes
exocellulaires spcialises qui fonctionnent l'extrieur de la cellule. Des exemples de sources de
carbone complexes utilises par certaines bactries sont l'amidon, un polysaccharide, la casine,
un polypeptide (protines), la tributyrine, un polymre dacides gras (un lipide) et lADN, un
polymre dacides nucliques. Certaines espces bactriennes peuvent synthtiser et excrter l' amylase, une enzyme qui clive le lien -1,4 joignant les monomres de glucose dans l'amidon.
Certaines bactries synthtisent aussi des protases telles que la casinase, qui clive le lien
peptidique joignant les monomres dacides amins. Les lipides peuvent tre rduits en acides
gras simples par les lipases. Enfin, lADNase clive les liens phosphodiestres entre les nuclotides
dune chane polynuclotidique.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isols la semaine passe
2 gloses damidon, 2 de lait, 2 de tributyrine et 2 dADN
Mthode
1. Faire des stries pour colonies simples dun de vos bacilles inconnus sur chacune des gloses
damidon, de lait, de tributyrine et une dADN.
2. Rpter ltape 1 avec votre deuxime bacille inconnu.
3. Incuber 28oC.
RDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE
Certaines espces bactriennes peuvent rduire le nitrate en nitrite, puis rduire le nitrite en
ammoniac. Ces ractions sont faites par des enzymes nommes "nitrates rductases", lesquelles
54

Labo de Microbiologie-2012
sont requises pour l'assimilation du nitrate. L'ammoniac produit par ces ractions peut ensuite tre
utilis pour la synthse d'acides amins. D'autres espces bactriennes utilisent le nitrate plutt
que l'oxygne comme capteur final d'lectrons. La rduction du nitrate au nitrite constitue un
sentier dissimilatoire du nitrate. L'utilisation du nitrate comme capteur final d'lectrons reprsente
un exemple de respiration anarobie.
NO3NO2NH4+
N2
Nitrate rductase
Nitrite rductase
d'autres enzymes
Matriaux
Suspensions dinconnus bacilles prpars dans lexercice prcdent
2 bouillons de nitrates
Mthode
1. Inoculer avec 0.1 ml de chacun vos bacilles inconnus deux bouillons de nitrates.
2. Incuber 28oC.
TOLRANCE DES CONCENTRATIONS LEVES DE SELS
des concentrations leves, le sel agit comme un agent slectif qui interfre avec la permabilit
des membranes et lquilibre osmotique de la majorit des bactries. Les organismes tolrants au
sel nauront aucun problme pour crotre sous un tel environnement.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isols la semaine passe
2 bouillons TSB + 6.5% NaCl
Mthode
1. Inoculer chacun de vos inconnus dans un des bouillons TSB + NaCl.
2. Incuber 28oC.

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Labo de Microbiologie-2012
CYTOCHROME OXYDASE
Plusieurs espces de bactries arobies et quelques espces de bactries anarobies facultatives
possdent le cytochrome oxydase dans leur chane de transport dlectrons. Le cytochrome
transfre des lectrons l'oxygne, produisant de l'eau. La prsence du cytochrome oxydase est
facilement dtermine par lajout de p-aminodimethylaniline oxalate, ractif pouvant faire don
d'lectrons (devenant ainsi oxyd) la cytochrome oxydase. De ce fait, le p-aminomethylaniline
oxalate devient rose et ventuellement noir quand il est oxyd.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram
positifs isols la semaine passe
Ractif p-aminodimethylaniline oxalate
Mthode
1. Demander un aide enseignant dajouter une goutte du
ractif permettant la dtection du cytochrome oxydase sur
une des colonies de vos inconnus bactriens.
2. Examiner s'il y a un changement de couleur, de la colonie
et non pas du milieu, aprs 1-2 minutes.

LA MOTILIT BACTRIENNE
Plusieurs bactries peuvent nager en utilisant le flagelle. Le flagelle est semblable ceux des
eucaryotes, mais de structure trs diffrente. Pas toutes les bactries possdent des flagelles, ces
dernires sont beaucoup plus commune chez les bacilles, mais il y a quelques rares coques qui les
possdent aussi. Le fait quune bactrie soit motile ou non peut tre utilis pour permettre leur
identification. Une des faons de dceler la motilit est de faire croitre les cultures dans des
milieux contenant une faible concentration dAgar et dobserver si les bactries se sont loignes
de site initial de linoculation. Du triphenyl tetrazolium chloride est souvent inclus dans ces
milieux pour aider la visualisation. Cet indicateur est rduit par la majorit des bactries, le
rendant rouge.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram positifs isols la semaine passe
2 tubes profonds de TSA contenant 0.001% triphenyl tetrazolium chloride et 0.5% dagar

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Labo de Microbiologie-2012
Mthode
1. Utiliser une aiguille dinoculation strilise (pas la boucle) afin de rcolter de la croissance
dun de vos inconnus puis lenfoncer dans le milieu dessai de motilit en piquant au centre.
2. Rpter avec votre deuxime inconnu dans un autre tube profond.
3. Incuber 28oC.

CATALASE
La catalase est une enzyme qui se retrouve dans la plupart des organismes vivants en prsence
d'oxygne, comme les microorganismes arobies et facultatifs. Le mtabolisme de l'oxygne
gnre des radicaux libres, tel le peroxyde, qui endommage la cellule. Afin de se protger, ces
microorganismes gnrent la catalase qui rduit le peroxyde en le convertissant en eau et en
oxygne par le sentier suivant :
2H2O2

2H2O + O2

L'mission d'oxygne est facilement dcele en tant que


petites bulles.
Matriaux
Stries pour colonies simples de bacilles inconnus Gram
positifs isols la semaine passe
Peroxyde 3% (v/v)
Mthode
1. Ajouter 1-2 gouttes de peroxyde 3% sur une des colonies
de vos inconnus.
2. Observer s'il y a formation de bulles.

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Labo de Microbiologie-2012
IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS; FAMILLES DES
MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE (Groupe de 2)
Les Micrococcaceae
La famille des Micrococcaceae inclut des organismes pathognes et non pathognes souvent
associs la flore naturelle humaine. Cette famille inclut deux genres principaux, les
Staphylococcus et les Micrococcus. Tous deux peuvent utiliser loxygne et possdent un
mtabolisme typiquement respiratoire. Plus spcifiquement, les membres du genre Micrococcus
sont des arobies stricts tandis que ceux du genre Staphylococcus sont des arobies facultatifs. En
effet, les Micrococcus produisent de lacide du glucose seulement en conditions darobie tandis
que les Staphylococcus le font sous des conditions darobies et danarobies.
Plusieurs espces de Micrococcus ont des colonies pigmentes, tel que M. luteus (jaune) ou M.
roseus, (rose). Leurs cellules ont souvent un arrangement de ttrade. Rsident de la peau, ce genre
bactrien est rarement pathogne, tant plutt un opportuniste.
Contrairement aux Micrococcus, les Staphylococci sont des parasites humains qui peuvent sous
certaines conditions tre la cause de maladies graves. Les trois espces principales du genre
Staphylococcus sont S. aureus, S. saprophyticus et S. epidermidis. S. epidermidis est un organisme
non pigment non pathogne habituellement retrouv sur la peau ou les muqueuses. S. aureus, une
espce de couleur jaune, est souvent associ lacn, les pneumonies, des mningites, et le choc
toxique. S. Saprophyticus, un autre organisme souvent retrouv sur la peau, est non pigment et
souvent associ aux infections urinaires.
Les Streptococcaceae
Cette famille inclut les bactries du genre Streptococcus, qui inclut des espces pathognes et non
pathognes. Ce genre est divis en trois groupes despces apparentes; les Lactococcus, qui
inclut les streptocoques dimportance pour lindustrie laitire, les Enterococcus, qui inclut les
streptocoques dorigine fcale et les Streptococcus, qui regroupe la majorit des espces
pathognes. Ces dernires sont classifies daprs le systme de classification de Lancefield,
divisant ces bactries en 8 groupes (A-H et K-U). Cette classification est fonde sur la raction
immunologique des polysaccharides de leurs parois. Les membres d'importance clinique du genre
Streptococcus incluent celle du groupe A; S. pyogenes. Cette bactrie est la cause principale des
streptococcies de la gorge et dans de rares cas cause la dtrioration massive des tissus
( mangeuse de chair ). S. agalactiae, seul membre du groupe B, cause des septicmies chez les
nouveau-ns, causant la mort dans 75% des cas. Les entrocoques du groupe D, sont impliqus
dans les infections du systme urinaire, les endocardites, ainsi que les infections des plaies.
Dautres Streptococci qui ne sont pas classifi daprs les groupes de Lancfield incluent, S.
pneumoniae, la cause principale des pneumonies ainsi que S. mutans et S. mitis responsables des
caries dentaires.

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Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Bouillon de culture catalase positif (C+No)
Bouillon de culture catalase ngatif (C-No)
2 gloses de chocolat
Mthodes
Morphologie Coloniale
1. Faire des stries pour colonies simples de chacun de vos inconnus sur des gloses de chocolat.
2. Incuber la culture catalase ngative 37oC dans la cuve chandelle.
o
3. Incuber la culture catalase positive 37 C.
Coloration de Gram
1. Faire une coloration de Gram de chacun des inconnus.
2. Faire la prise de photos numriques pour votre rapport.
3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et lagrgation cellulaire.
DIAGNOSTIC DE COCCI GRAM POSITIF CATALASE NGATIF
HMOLYSE SANGUINE
LAgar de sang (BA) contient des nutriments gnraux et 5% de sang de mouton. Il est utile pour
la croissance dorganisme fastidieux et pour la dtermination des capacits hmolytique. Certaines
bactries produisent des exoenzymes qui lysent les globules rouges et dgradent lhmoglobine;
les hmolysines. Il existe diffrents types dhmolysines. Les Beta-hmolysines lyse les globules
rouges et dgradent lhmoglobine compltement. Ceci rsulte en une zone dclaircissement
complte. De tels rsultats se disent une hmolyse-. Plusieurs espces pathognes des
Streptococcus et quelque une des Staphylococcus appartiennent ce groupe. Lhmolysine alpha
dgrade partiellement les globules rouges laissant une couleur verdtre. Ceci se dit une hmolyse. La couleur verdtre est cause par la prsence de biliverdine, un sous-produit de la
dgradation. Plusieurs espces non pathognes des Streptococcus sont de ce groupe. Si
lorganisme ne produit pas dhmolysines et ne dgrade pas les globules rouges, il ny aura pas
dclaircissement. Ceci sappelle une hmolyse-. La plupart des Streptococcus de ce groupe ne
sont pas pathognes.
Matriaux
Bouillon de culture catalase ngatif (C-No)
Glose de sang
Mthode
1. Faire des stries pour colonies simples de linconnu catalase ngatif sur une glose de sang.
2. Incuber 37oC dans la cuve chandelle.

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Labo de Microbiologie-2012
BILE-ESCULINE
Ce test est utile pour lidentification des streptocoques de groupe D; les Enterococcus. Ceux-ci
font lhydrolyse de lesculine lesculitine et du glucose. Lesculitine ragit avec un sel du fer, le
citrate ferrique, gnrant complexe brun fonc ou noir. De la bile est incluse pour inhiber la
croissance de bactries Gram positive autre que les Enterococci.
Matriaux
Bouillon de culture catalase ngatif (C-No)
Pente de bile esculine
Mthode
1. Strier une pente de bile-esculine avec votre inconnu catalase ngatif.
2. Incuber 37oC.
SENSIBILIT LA BACITRACINE ET LOPTOCHINE
La sensibilit ces antibiotiques permet lidentification prsomptive de diffrents membres du
genre S. pyogenes et S. pneumoniae.
Matriaux
Bouillon de culture catalase ngatif (C-No)
Applicateur embout de coton strile
1 Glose de chocolat
1 disque de bacitracine
1 disque doptochine
Mthode
1. Plonger un applicateur embout de coton strile dans la culture de votre inconnu catalase
ngatif.
2. taler la bactrie sur la surface d'une glose de chocolat, recouvrant autant de la superficie que
possible.
3. Utiliser des forceps striles pour dposer un disque de bacitracine et un disque doptochine sur
la surface de la glose.
4. Incuber la glose 37C dans la cuve chandelle.

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Labo de Microbiologie-2012
DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE
GLOSES DE MANNITOL + SELS
Ce milieu contient une concentration leve de sels (7.5%) qui permet denrichir les bactries du
genre Staphylococcus. Comme les bouillons phnol rouges, ce milieu fournit deux sources de
carbones, le mannitol ou des protines. Linclusion dun indicateur de pH, le phnol rouge,
permet de discriminer les Staphylococcus fermenteurs, tel que S. aureus, des non-fermenteurs.
Matriaux
Bouillon de culture catalase positif (C+No)
1 Glose mannitol + sels
Mthode
1. Strier pour colonies simples linconnu catalase positif sur une glose de mannitol + sels.
2. Incuber 37oC.
AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER
Ce milieu est slectif pour lidentification prsomptive de staphylococci coagulase positifs. La
slectivit de ce milieu est due au chlorure de lithium et une solution de 1% de Potassium de
Tellurite, qui inhibent la croissance dorganismes autres que les staphylococci. La discrimination
de staphylococci coagulase-positif est fonde sur le Potassium Tellurite et une mulsion de jaune
duf. Les staphylococci qui possdent la lecithinase dgradent le jaune duf causant une zone
dclaircissement autour des colonies. La rduction du Potassium de Tellurite, une caractristique
des staphylococci coagulase-positifs, cause le noircissement des colonies.
Matriaux
Bouillon de culture catalase positif (C+No)
1 glose dagar de Tellurite
Mthode
1. Strier pour colonies simples linconnu catalase positif sur une glose de Tellurite.
2. Incuber 37oC.
SENSIBILIT LA NOVOBIOCINE
La sensibilit la novobiocine permet de discriminer S. saprophyticus des autres bactries du
genre Staphylococcus; S. saprophyticus tant rsistant.
Matriaux
Bouillon de culture catalase positif (C+No)
Une glose de chocolat
Applicateur embout de coton strile
Mthode
1. Plonger un applicateur embout de coton strile dans la culture catalase positive.
2. taler la bactrie sur la surface d'une glose de chocolat, recouvrant autant de la superficie que
possible.
3. Avec des forceps striles, dposer un disque de novobiocine sur la surface de la glose.
4. Incuber la glose 37C.
61

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIFS
INTERPRTATION DES TESTS
Mtabolisme de sources de carbone simples
1. Obtenir vos pairs de tubes de phnol rouges et faire les observations suivantes :
Est-ce quil y a eu croissance
De quelle couleur est le bouillon
Est-ce quil y a accumulation de gaz

Acide
Alcalin
Acide + Gaz
2. Daprs vos observations, dterminez quels sucres ont t utiliss et par quel mtabolisme.
FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES
MIXTES OU D'ACTOINE
1. Afin de complter les tests de MR et VP, transfrer 1 ml du
bouillon de culture MRVP que vous avez prpar au labo
prcdant chacun de deux nouveaux tubes.
2. Pour le test de MR, ajouter 2 gouttes de mthyl rouge l'un des
deux tubes. Observer la couleur la surface du bouillon. Une
couleur rouge indique la prsence d'une grande quantit d'acides,
tandis qu'une couleur jaune indique une absence d'acides.

3. Afin de complter le test de VP, ajouter 6 gouttes d'alpha-naphtol


au deuxime tube.
4. Ajouter 3 gouttes de KOH 40% au tube.
5. Bien mlanger et laisser la raction se poursuivre pour 10-15
minutes.
6. Observer s'il y a un changement de couleur. Le dveloppement
d'une couleur rouge indique la prsence d'actoine.

62

Negatif

Positif

Positif

Negatif

Labo de Microbiologie-2012
URASE
1. Examiner vos pentes pour tout changement de couleur au rose.
Cette couleur indique la prsence de produits alcalins gnrs par
laction de lurase.

UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE


1. Examiner vos pentes pour un changement de couleur au bleu. Cette
couleur indique que des sous produits alcalins ont t gnrs ce qui
indique que le citrate a t utilis comme source de carbone.

Negatif Positif

Negatif

Positif

UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES: ENZYMES


EXOCELLULAIRES
1. Obtenir les gloses damidon, de lait, de tributyrine et dADN que vous avez inocules.
2. Examiner les gloses de lait, de tributyrine et dADN pour un claircissement autour de la
croissance. Un tel claircissement indique la production de lenzyme exocellulaire.
3. Dans le cas de la glose damidon, inonder la croissance sur la glose avec de liode de Gram.
Liode de Gram ragit avec lamidon pour donner une couleur bleu fonc. Labsence de cette
couleur indique la dgradation de lamidon

Amylase

Casinase

Lipase

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ADNse

Labo de Microbiologie-2012
RDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE
1. Afin de dterminer si vos inconnus peuvent rduire le nitrate, ajouter 3 gouttes d'acide
sulfanilique et 3 gouttes d'alpha-naphtylamine votre culture dans le bouillon de nitrate. Ces
ractifs ragissent avec le nitrite gnrant une couleur rouge.
2. Observer s'il y a un changement de couleur aprs une minute. S'il n'y a pas changement,
ajouter un peu de poussire de zinc.
3. Observer s'il y a un changement de couleur. Le zinc rduit les nitrates aux nitrites qui
ragissent avec l'acide sulfanilique et alpha-naphtylamine gnrant une couleur rouge.

Rsultats aprs lajout de l'acide


sulfanilique et alpha-naphtylamine

Rsultats aprs lajout de zinc

LA MOTILIT BACTRIENNE
Examiner vos tubes profonds afin de dterminer si vos
inconnus bactriens sont motiles.

TOLRANCE DES CONCENTRATIONS LEVES DE SELS


Examiner vos cultures pour une croissance abondante.
IDENTIFICATION DE VOS BACILLES GRAM POSITIFS INCONNUS
Utiliser lorganigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espces
bactriennes de vos inconnus. http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts.pdf

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Labo de Microbiologie-2012
DIAGNOSTIC DES MICROCOCCACEAE ET DES STREPTOCOCCACEAE
DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE NGATIF
HMOLYSE SANGUINE
1. Examiner vos gloses de sang et dterminer le type dhmolyse observ : alpha, bta ou
gamma.

BILE-ESCULINE
1. Examiner vos pentes de bile esculine. Lassombrissement du milieu
indique la prsence desculitine qui rsulte de lhydrolyse de
lesculine

SENSIBILIT LA BACITRACINE ET LOPTOCHINE


Les tests de sensibilit la bacitracine et loptochin sont
utiliss pour identifier Streptococcus pyogenes et
Streptococcus pneumoniae, respectivement. Seules ces
deux espces de Streptococcus sont sensibles aux
antibiotiques respectifs quand le test est fait.

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Labo de Microbiologie-2012
DIAGNOSTIC DES COCCI GRAM POSITIFS CATALASE POSITIF
GLOSES DE MANNITOL + SELS

Ngatif

Positif

AGAR DE TELLURITE
Vrifier votre talement sur lagar de Tellurite pour dterminer si des colonies typiques de
Staphylococcus aureus sont observes. Si une identification positive prsomptive de S. aureus est
faite, faire le test de Coagulase indiqu ci-dessous.

66

Labo de Microbiologie-2012
COAGULASE
Ce test est utile pour diffrentier S.aureus des autres staphylococci coagulase ngatifs. La majorit
des souches de S.aureus produisent 2 types de coagulases, libre et lie. La libre est une enzyme
screte extracellulairement, tandis que celle lie est associe la paroi. La coagulase libre est
dtecte en tube tandis que la coagulase lie est dtecte sur lame.
TEST DE COAGULASE SUR LAME
Principe: La coagulase lie est aussi connue comme le facteur dagglutination. Elle cre des liens
croiss entre les chanes et du fibrinogne du plasma formant des caillots de fibrine qui se
dpose sur la paroi cellulaire. En consquence, les coccus individuels se collent les uns aux autres
et une agglutination est observe.
Matriaux
Colonies simples de la culture de S.aureus suspecte sur glose de chocolat
Plasma citr de lapin
Eau strile
Mthode
1. Diviser une lame en deux sections avec un crayon-feutre tel quillustr ci-dessous:

Test

Control

2. tiqueter un ct Test et lautre Contrle.


3. Ajouter une petite goutte deau chaque ct.
4. Avec la boucle dinoculation strile, suspendre deux trois grosses colonies de la bactrie

suspecte dans chacune des gouttes deau. Bien mlanger pour obtenir une bonne suspension
turbide.
5. Ajouter une goutte de plasma de lapin citr la rgion test et bien mlanger.
6. Lagglutination des cocci observe dans les 5-10 secondes est interprte comme positif.

noter: Quelques souches de S. aureus pourraient ne pas produire de Coagulase lie et de


telles souches doivent tre identifie par le test de coagulase en tube.
67

Labo de Microbiologie-2012
SENSIBILIT LA NOVOBIOCINE
1. Mesurer la zone d'inhibition. Un diamtre de 17mm ou moins indique une rsistance, tandis
quun diamtre de plus de 17mm indique que lisolat est sensible.
OXYDASE
Ce test permet de discriminer les bactries du genre Staphylococcus de celles du genre
Micrococcus. Contrairement aux staphylocoques, les microcoques sont oxydase positive.
1. Ajouter une goutte du ractif de loxydase sur la croissance de votre inconnu.
2. Examiner s'il y a un changement de couleur aprs 1-2 minutes.
Identification de vos inconnus de la famille des Micrococcaceae
Utiliser lorganigramme sur la page web du cours pour identifier les genres et espces
bactriennes de vos inconnus. http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/microlab/IDFlowcharts.pdf
BIOREMDIATION (Partie 4)
Matriaux
Flacon de bioremdiation
Glycrol
Tube capuchon bouton-pression
Mthode
1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait lapparence de votre culture de
bioremdiation.
2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression.
3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v).
4. Mlanger au vortex afin de vous assurer que le glycrol est dispers uniformment.
5. tiqueter de faon approprie avec votre numro de groupe et la date.
6. Congeler 20 C pour un entreposage long terme.
RAPPORT SUR LIDENTIFICATION DINCONNUS BACTRIENS
Chaque personne ou quipe de deux doit rdiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs
rsultats. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit:
A. Titre et les noms des auteurs
B. Introduction : Cette section devrait traiter des raisons pourquoi lisolation et
lidentification dorganismes bactriennes est importantes ainsi que les techniques
gnrales qui sont utilises a cette fin (Non seulement celle vue en labo).
C. Rsultats : Prsenter les tests qui ont t faits, quelles observations ont t faites et leurs
interprtations respectives. Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section.
Prsentez comment certains ou tous les rsultats obtenus ont permis didentifier
lorganisme inconnu. Un organigramme serait une bonne ide pour cette section.
D. Discussion : Dans cette section vous devez crire (environ une page pour chaque
organisme) une description dtaille de lorganisme identifi. Vous devriez trouver de
linformation sur leurs caractristiques gnrales, physiologie, impacte environnementales
(sil y en a) utilits, importance clinique et traitement.
E. Rfrences : Lister toutes les rfrences utilises daprs le style recommand par le
Journal of Bacteriology .
68

Labo de Microbiologie-2012
LABO NO6
CONTRLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE

Jour 1
COMPOSS ANTIBACTRIENS - ANTIBIOTIQUES (Groupe de 2)
Les antibiotiques sont des composs synthtiques, semi-synthtiques ou naturels qui inhibent ou
tuent les bactries. Les antibiotiques sont gnralement classs selon leurs modes daction :
bactriostatique, bactriolytique ou bactricide. Les antibiotiques bactriostatiques inhibent les
bactries sans les tuer. Les bactriolytiques tuent les bactries en lysant les cellules alors que les
bactricides tuent sans lyse concomitante.
ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER
Avant de pouvoir utiliser un antibiotique sur un nouveau pathogne il est essentiel d'valuer la
sensibilit du pathogne l'antibiotique. Initialement, la sensibilit du pathogne cible une
varit d'antibiotiques est teste afin de dterminer lesquels peuvent tre utiliss. Cela est
habituellement fait par un essai semi-quantitatif appel la mthode de sensibilit de disque de
Kirby-Bauer . Cet essai consiste valuer la sensibilit d'une espce bactrienne une varit
dantibiotiques. L'essai est fait sur une glose sur laquelle est tal un inoculum de la bactrie
tant examine. Des disques contenant des quantits connues d'antibiotiques tre values sont
alors dposs sur la surface de la glose. Aprs une priode d'incubation approprie pour la
croissance optimale de la bactrie examine, lefficacit des antibiotiques est value en fonction
des tendues des zones dinhibitions de la croissance bactrienne proximit des disques; les
zones d'inhibition forment des halos autour des disques. Le diamtre du halo form constitue une
mesure de la sensibilit relative de la bactrie l'antibiotique (voir la figure) Les
recommandations des tailles des zones dinhibitions pour linterprtation de lessai de KirbyBauer (rsistant, intermdiaire, sensible) ont t tablies par des organisations impliques dans le
contrle des maladies.

69

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Bouillon de culture de 5 ml de S. aureus
Bouillon de culture de 5 ml de S. epidermididis
Bouillon de culture de 5 ml dE.coli
3 gloses de chocolat
couvillons striles
Disques imprgns d'antibiotiques
Forceps
Mthode
1. tiqueter trois gloses de chocolat daprs la souche bactrienne tre teste (Staphylococcus,
Streptococcus et E.coli)
2. Immerg un couvillon dans le bouillon de culture jusqu ce quil soit compltement imbib.
Enlever le surplus de la suspension de lcouvillon en exerant une pression contre la paroi de
lprouvette.
3. taler la culture approprie sur la surface entire de chaque glose approprie. Une
distribution gale est essentielle; tal de faon uniforme dans trois directions afin quun
talement gal et une croissance confluente en rsulte.
4. Les gloses tant recouvertes, permettez aux inocula de sasscher pour 3 5 min.
5. Dposer les disques dantibiotiques sur vos gloses. Utiliser des forceps striles pour
appliquer une lgre pression sur chaque disque afin dassurer un bon contact avec lAgar.
6. Incuber les gloses inverses 37C.
DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE
Lorsqu'un antibiotique est utilis des fins thrapeutiques, on doit au pralable dterminer sa
concentration efficace minimale, dfaut de quoi, un dosage trop lev ou trop faible pourrait tre
prescrit. Pourquoi lun ou lautre de ces scnarios reprsente-t-il un problme? La mthode
de dilution de bouillon est la faon la plus courante de dterminer la concentration minimale
inhibitrice (CMI) et la concentration minimale bactricide (CMB) d'un antibiotique. Cette
mthode consiste ensemencer une quantit constante de bactries dans un bouillon de croissance
avec diffrentes concentrations de l'antibiotique tre valu. La plus basse concentration
d'antibiotique pour laquelle aucune croissance bactrienne n'est observe, aprs une priode
d'incubation approprie, reprsente le CMI.
Croissance

CMI

70

Pas de
Croissance

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Bouillon de culture de 5 ml de S. aureus
Bouillon de culture de 5 ml de S. epidermididis
Bouillon de culture de 5 ml dE.coli
10 ml de l'antibiotique assign (1mg/ml dans du TSB)
Approx. 100 ml de TSB
27 prouvettes striles
Antibiotique
Ampicilline
Kanamycine
Acide naladixique
Ttracycline
rythromycine

Classe
Bta-lactamine
Aminoglycoside
Quinolone
Ttracycline
Macrolide

Abrviation
A
K
N
T
M

Mthode
1. tiqueter trois jeux de 8 prouvettes (Un jeu/espce bactrienne) avec lespce bactrienne
tant teste, lantibiotique test et votre numro de groupe.
2. Ajouter 2.5ml de TSB chacune des prouvettes.
3. Ajouter 2.5ml de la solution stock de lantibiotique assign au premier tube de chaque jeu de
huit. Bien mlanger.
4. Transfrer 2.5ml du premier tube de chaque jeu au second tube de chaque jeu. Bien mlanger.
5. Transfrer 2.5ml du deuxime tube de chaque jeu au troisime tube de chaque jeu. Bien
mlanger.
6. Poursuivre cette dmarche pour les 8 prouvettes. Vous devriez donc avoir gnr huit jeux de
dilutions en srie de facteurs 2 de lantibiotique assign. Toutes les prouvettes devraient
contenir 2.5ml de milieu sauf pour la dernire.
7. Retirer et jeter 2.5ml de la dernire prouvette de chaque jeu.
8. Dilu dans du TSB chacune des cultures fournit afin dobtenir 5 ml de bouillon qui reprsente
un facteur de dilution de 1 000X.
9. Ensemencer chacune des 8 prouvettes dun jeu avec 0.1 ml de la culture de Staphylococcus
que vous avez dilu prcdemment.
10. Ensemencer chacune des 8 prouvettes de la deuxime srie avec 0.1 ml de la culture de
Streptococcus que vous avez dilu prcdemment.
11. Ensemencer chacune des 8 prouvettes de la troisime srie avec 0.1 ml de la culture dE.coli
que vous avez dilu prcdemment.
12. Incuber les prouvettes ensemences 37oC.

71

Labo de Microbiologie-2012
DSINFECTANTS & ANTISEPTIQUES (Individuellement)
Il existe plusieurs classes de produits antibactriens, tels que les antiseptiques, les dsinfectants et
les antibiotiques. Ceux-ci ont tous pour but de soit rduire le nombre de bactries, de les liminer
ou dinhiber leurs croissances. Certains ont un usage thrapeutique, tels les antiseptiques et les
antibiotiques tandis que dautres sont utiliss pour des buts prventifs ou esthtiques, tels les
dsinfectants. L'utilisation des antiseptiques et des dsinfectants vise rduire de faon
significative le nombre de bactries dans un secteur donn et dempcher leurs croissances. Les
antiseptiques sont des composs chimiques destins l'utilisation humaine, tandis que les
dsinfectants sont destins aux objets.
L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS
Probablement les dsinfectants/antiseptiques les plus couramment utiliss dans la vie de tous les
jours sont les savons. Une de leurs utilisations populaires est le lavage des mains; soit avant de
commencer cuisiner ou dans le cas dun chirurgien, avec quil opre sur un individu. Le but de
se laver les mains est double. liminer les bactries que vous auriez pu acqurir de la
manipulation de diffrents objets (la flore transitoire) et de rduire le nombre de bactries qui
rsident normalement sur vous (la flore rsidente). videmment, la strilisation des mains n'est
pas possible, car les microorganismes vivent non seulement la surface, mais aussi, dans les
couches profondes de la peau. Cette flore naturelle est principalement constitue de bactries non
pathognes du genre Staphylococcus. Dans l'exercice suivant, nous valuerons l'efficacit de
diffrents savons mains et de diffrents antiseptiques pour les mains.

The skin microbiome


Elizabeth A. Grice & Julia A. Segre
Nature Reviews Microbiology 9, 244-253
(April 2011)

72

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Savon assign: Purell, Savon antibiotique, Savon naturel (glycrine), Eau
4 gloses de chocolat
couvillons striles
Eau strile
Mthode
1. Assigner chacune des personnes du groupe de 4 un des traitements ci-dessus.
2. Chaque personne devra obtenir 4 gloses de chocolat.
3. tiqueter trois des gloses avec votre nom, la lettre D et le numro du traitement (0, 1 et
2). Ces gloses sont celles sur lesquelles vous talerez des chantillons de votre main
dominante (celle avec laquelle vous crivez)
4. tiqueter la quatrime glose avec votre nom, la lettre M (pour mineure) et 0 (pas de
traitement). Cette glose sera celle sur laquelle vous talerez des chantillons de votre autre
main (celle que vous utilisez le moins souvent)
5. Humecter un couvillon strile avec un peu deau strile. Nettoyer avec lcouvillon humect
autant de la surface de la paume de votre main mineure (votre main gauche si vous tes
droitier).
6. taler sur toute la surface de la glose tiquete M0 avec cet chantillonnage.
7. Rpter les tapes 3 et 4 pour votre main dominante et taler cet chantillonnage sur la glose
tiquete D0.
8. Aprs votre chantillonnage initial, lavez vos mains pour deux minutes avec le traitement
assign.
9. chantillonner la paume de votre main dominante telle que prcdemment et taler cet
chantillonnage sur la glose tiquete D1.
10. Rpter le lavage de vos mains pour 2 minutes additionnelles, puis chantillonner la paume de
votre main dominante telle que prcdemment et taler cet chantillonnage sur la glose
tiquete D2.
11. Incuber les gloses inverses 37oC.
Remplir le questionnaire suivant :
Genre (male ou femelle)
Main dominante (Droite ou gauche)
Traitement

73

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
COMPOSS ANTIBACTRIENS - ANTIBIOTIQUES
ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER
Obtenir les diamtres des zones dinhibitions pour chacun des antibiotiques avec chacune des
cultures bactriennes testes.

Utiliser les donnes du tableau ci-dessous afin de dterminer la susceptibilit de chacune des
bactries.
I = mm
tendue

AMC

R = mm
ou moins
19

S = mm
ou plus
20

AMC

13

14-17

18

Ampicilline (Staph)

AM

28

Ampicilline (autre bactries)

AM

11

12-13

14

Carbnicilline (Pseudomonas)

CB

13

14-16

17

Carbnicilline (autres bactries)

CB

17

18-22

23

Cfoxatime

CTX

14

Cphalothin

CF

14

15-17

18

Chloramphnicol

12

13-17

18

rythromycine

13

14-22

23

GM

12

13-14

15

M (or DP)

10-13

14

Pnicilline

28

Streptomycine

11

12-14

15

SXT-TMP

10

11-15

16

TE

14

15-18

19

Agent antimicrobien

CODE

Amoxicilline (Staph)
Amoxicilline (autres bactries)

Gentamycine
Mthicilline (Staph)

Sulfamethoxazole-trimethoprim
Ttracycline

74

29

23

29

Labo de Microbiologie-2012
DTERMINATION DE LA DOSE THRAPEUTIQUE
Puisque la plupart des antibiotiques sont bactriostatiques de faibles concentrations, il n'est pas
possible de dterminer par le CMI la dose laquelle un antibiotique bactricide a une efficacit
maximale. Pour ce faire, il faut avoir recours la dtermination du CMB. La mthode utilise est
la mme que celle utilise pour la dtermination du CMI sauf que des sous-cultures sont
prpares partir des essais du CMI pour lesquels aucune croissance n'a t observe, dans du
bouillon de croissance dpourvu dantibiotiques: La concentration d'antibiotique pour laquelle
aucune croissance bactrienne nest rchappe reprsente la CMB.
Croissance

CMI

Pas de
Croissance

Inoculation partir du CMI


dans du milieu dpourvu
dantimicrobien

Matriaux
Essai de CMI fait prcdemment
Tubes contenant 5ml de TSB

CMB

Mthode
1. Obtenir un tube contenant 5 ml de bouillon TSB pour chaque concentration laquelle aucune
croissance n'a t observe dans l'exprience de la dtermination du CMI.
2. tiqueter chaque tube avec la concentration d'antibiotique laquelle aucune croissance n'a
t observe.
3. Ensemencer chaque tube avec 0.1 ml du bouillon de culture qui correspond aux tubes
dessais du CMI o aucune croissance n'a t observe.
4. Incuber jusqua demain 37oC.
5. Dterminer la plus basse concentration d'antibiotique o la croissance bactrienne ne pouvait
pas tre rchappe.

75

Labo de Microbiologie-2012
L'EFFICACIT DES SAVONS MAINS
1. En premier lieu, vous allez vouloir dterminer la superficie approximative
de la paume de vos mains. Pour ce faire, placer votre main, paume vers le
bas, sur une feuille de papier tel quillustr, puis tracer le contour sans
inclure la rgion de votre poignet. Ensuite, dterminez le poids de la
feuille de papier. Aprs avoir dtermin le poids de la feuille, dcoupez le
profil de votre main et dterminez son poids.
2. Une feuille de papier standard (8po X 11po) possde une superficie

dapproximativement 603 cm2. Dterminez la relation entre le poids et la


superficie, puis utilisez cette mme relation afin de dterminer la
superficie approximative de votre paume.
3. Dterminer le nombre dUFC sur chacune des gloses et enregistrer vos donnes comme suit

dans le chiffrier Excel au podium:


Genre

Traitement

Superficie de la main
dominante

UFC
D0

D1

D2

CINTIQUE DE MORTALIT
Diffrents microorganismes possdent des susceptibilits varies aux traitements Par exemple,
les spores sont particulirement rsistant. Tout comme pour la croissance bactrienne, la
mortalit survient de faon exponentielle. Donc, des fonctions mathmatiques qui dcrivent le
profil de la mort cellulaire sous une condition donne ont t formules. De telles fonctions sont
utiles pour dterminer le temps minimal requis pour rduire une population microbienne sous un
seuil nfaste. Le temps de rduction dcimale, sappelle la valeur D, qui reprsente la dure de
temps sous de conditions donne ncessaire pour rduire une population de microorganismes par
une valeur de un log ou de 90%. En autres mots, si la valeur D dE. coli est 1 minute, ceci
indique quune exposition dune minute est requise pour rduire la population bactrienne de
90%. Donc, pour rduire une population de 1 x 106 1 x 104 cellules dE. coli cela prendrait 2D
se qui quivaut 2 minutes. Les valeurs D sont influences par lespce bactrienne, leur forme,
ainsi que les conditions dans lesquelles elles se retrouvent. Par exemple, la valeur D pour des
spores est habituellement beaucoup plus leve que celle de cellules vgtatives.
Lire larticle de recherche disponible sur la page web de ce cours sous la rubrique Devoirs, afin de rpondre
aux questions pertinente dans votre devoir.

76

Labo de Microbiologie-2012
BIOREMDIATION (Partie 5)
Matriaux
Flacon de bioremdiation
Glycrol
Tube capuchon bouton-pression
Mthode
1. Enregistrer toute observation en ce qui a trait lapparence de votre culture de
bioremdiation.
2. Transfrer 0.85 ml de la culture bactrienne un tube capuchon bouton-pression.
3. Ajouter 0.15 ml de glycrol strile (15%, v/v).
4. Mlanger au vortex afin de vous assurer que le glycrol est dispers uniformment.
5. tiqueter de faon approprie avec votre numro de groupe et la date.
6. Congeler 20 C pour un entreposage long terme.

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Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 7
MICROBIOLOGIE DE LEAU ET DES ALIMENTS

Jour 1
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU (Groupe de 2)
L'importance de l'approvisionnement en eau potable (buvable) ne peut pas tre surestime. Avec
l'industrialisation croissante, les sources d'eau disponibles pour la consommation et les loisirs ont
t corrompues par des dchets industriels ainsi que de source animale et humaine. En
consquence, l'eau est devenue un formidable facteur de transmission de maladies. Les eaux
pollues contiennent de grandes quantits de matire organique qui sont d'excellentes sources
nutritionnelles pour la croissance et la multiplication des micro-organismes. La prsence et le
nombre de bactries coliformes, des bactries qui sont normalement rsidents de l'intestin des
mammifres, et d'autres organismes entriques dans l'eau est un signe de contamination fcale et
peut suggrer la prsence d'agents pathognes. Ces agents pathognes sont responsables
d'infections intestinales telles que la dysenterie bacillaire, la fivre typhode, le cholra et la
fivre paratyphode. L'analyse des chantillons d'eau sur une base routinire ne serait pas
possible si la dtection de chacun des pathognes tait requise. Par consquent, l'eau est
examine pour dtecter les micro-organismes indicateurs tels quEscherichia coli. Il convient de
souligner que la prsence de bactries indicatrices ne signifie pas que l'eau contient des microorganismes pathognes, mais plutt que le potentiel existe pour la prsence de pathognes
puisque les bactries indicatrices signalent la prsence de matires fcales dans l'chantillon.
Des mthodes qualitatives et quantitatives sont utilises pour dterminer l'tat sanitaire de l'eau.
La contamination de l'eau potable ou des rservoirs d'eau naturels avec ces micro-organismes
indicateurs est une bonne indication de la mauvaise gestion des dchets. Plusieurs microorganismes indicateurs diffrents sont utiliss pour dterminer le niveau de contamination par
des matires fcales.
MICROORGANISMES INDICATEURS DUNE CONTAMINATION FCALE
Coliformes totaux : des petits bacilles de la famille des Enterobacteriacae qui fermentent le
lactose 37oC avec formation dacide et de gaz en 48 heures. Elles incluent des bactries
rsidentes de lintestin des mammifres et de lenvironnement tel quEscherichia coli, Klebsiella
sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Serratia sp., Shigella sp., et Proteus sp.
Coliformes fcaux (Escherichia coli): seule bactrie coliforme qui n'est pas retrouve
naturellement hors de lenvironnement intestinal. Sa prsence est donc une excellente indication
de contamination fcale. Mais, leurs viabilits rduites en dehors de son environnement naturel
font quun test ngatif nest pas ncessairement indicateur dune absence de contamination
fcale.
Streptococci fcal : Inclus des espces des Streptococcus et Enterococcus, parmi lesquels
plusieurs ont des origines entriques ou fcales. Ceux-ci ont lavantage de survivre pour de plus
longues dures dans lenvironnement. Par contre, il est difficile de les distinguer des habitants
naturels des sols et des cours deau.

78

Labo de Microbiologie-2012
ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DES EAUX POUR DES COLIFORMES
Les trois tests de base pour dtecter les coliformes bactriens de l'eau sont prsums confirms,
et complts. Les tests sont effectus de faon squentielle sur chaque chantillon en cours
d'analyse. Ils dtectent la prsence de bactries coliformes (indicateurs de contamination fcale)
qui sont des bacilles Gram ngatifs non sporulant qui fermentent le lactose avec production
d'acide et de gaz qui est dtectable aprs une priode d'incubation de 48 heures 37 C.
TEST DE COLIFORME PRSOMPTIF
Dtermination du nombre le plus probable de coliformes
But :
1. valuer la prsence de coliformes dans un chantillon deau
2. Obtenir un indice quant au nombre possible dorganismes prsents dans lchantillon sous
analyse
Principe :
Le test prsomptif est spcifique pour la dtection des bactries coliformes. Des aliquotes deau
mesures tester sont ajouts un bouillon de fermentation du lactose contenant une fiole
invers de collecte de gaz (Tube Durham). Puisque ces bactries sont capables d'utiliser le
lactose comme source de carbone (d'autres organismes entriques ne le sont pas), leur dtection
est facilite par l'utilisation de ce milieu. Des tubes de ce milieu au lactose sont inoculs avec des
aliquotes de 10 ml, 1 ml, et 0,1 ml de l'chantillon d'eau. La srie se compose d'au moins trois
groupes, chacun compos de trois tubes du milieu spcifi. Les tubes de chaque groupe sont
ensuite inoculs avec le volume dsign de l'chantillon d'eau. Le dveloppement de gaz dans
l'un des tubes est une prsomption de la prsence de bactries coliformes dans l'chantillon. Le
test prsomptif permet galement au microbiologiste destimer le nombre dorganismes prsents
au moyen du test du nombre le plus probable (NPP). Le NPP est estim en dterminant le
nombre de tubes dans chaque groupe qui montrent de l'acide et du gaz suite la priode
d'incubation.
Bouillon Lauryl-trypotose. Ce milieu contient des peptones comme source de carbone et
d'azote ainsi que d'autres nutriments. En outre, ce milieu contient du lactose comme un glucide
fermentescible et du lauryl sulfate de sodium qui inhibe la croissance des organismes autres que
les coliformes. Une fiole inverse est incluse pour dtecter l'accumulation de gaz. Un test positif,
l'accumulation de gaz aprs une priode d'incubation de 48 heures 37 C indique la prsence
prsume de coliformes.

79

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
chantillon deau
3 bouillons de lauryl sulfate lactose double force
6 bouillons lauryl sulfate lactose force simple
Mthode
1. tiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate double force "10".
2. tiqueter trois tubes de bouillons de lauryl sulfate force simples "0.1" et les trois autres "1".
3. Inoculer les trois tubes double force avec 10 ml de leau tre teste.
4. Inoculer trois des tubes force simple avec 1 ml de leau tre teste.
5. Inoculer trois des tubes force simple avec 0.1 ml de leau tre teste.
6. Incuber tous vos tubes 37oC.

Inoculums deau
0.1 ml

[1X]

[1X]

1.0 ml

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[1X]

Bouillons Lactose

80

[2X]

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012
ANALYSE QUANTITATIVE STANDARD DE LEAU
POUR DES COLIFORMES
Lessai de Ptrifilm. Ce test reprsente une variable du compte
viable sur des milieux slectifs et diffrentiels. Les plaques de
Ptrifilm sont de minces couches de milieu dshydrat qui
possdent plusieurs avantages comparativement aux gloses
conventionnelles; telles que la confirmation biochimique
visuelle, la facilit d'utilisation, le plus petit espace qu'ils
occupent et le fait qu'aucune prparation du milieu n'est requise.
Matriaux
chantillon deau
Plaque de Ptrifilm
Mthodes
1. Appliquer 1 ml de leau tre teste sur le Ptrifilm tel
quillustr.
2. Recouvrir de la couche de plastique, puis tendre
lchantillon par le roulement dune pipette de 10 ml sur la
surface.
3. tiqueter et incuber 37oC.

ANALYSE QUALITATIVE STANDARD DE L'EAU POUR STREPTOCOQUES


FECAUX
Les excrments humains et des animaux contiennent un grand nombre de bactries streptocoques
qui peuvent tre classes comme appartenant au groupe des streptocoques fcaux. Il existe six
espces de streptocoques: S. faecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum, S. Source Rapport
bovis et S. quin. Ces bactries sont des cocci Gram positifs, anarobies Homme 4.4
facultatifs, catalase ngative, non sporulantes, qui fermente le glucose 37 C. Canard 0.6
Ils se trouvent principalement dans les excrments des animaux sang chaud. Mouton 0.4
Contrairement aux coliformes, le nombre de streptocoques fcaux est
Poulet
0.4
gnralement plus lev que pour les coliformes fcaux. En outre, le rapport
Porc
0.4
entre leurs nombres (CF / SF) dans un chantillon d'eau est une indication de la
Vache
0.2
source de la contamination fcale (humaine vs animale).

81

Labo de Microbiologie-2012
TEST DES ENTROCOQUES
Les entrocoques sont un sous-groupe des streptocoques fcaux qui incluent les quatre premires
espces de streptocoques fcaux numrs ci-dessus. Des mthodes de culture analogues aux
tests de coliformes ont t dveloppes pour dterminer la prsence et la concentration de ces
bactries dans des chantillons d'eau. Comme pour le test prsomptif pour les coliformes, des
aliquotes mesurs de l'eau tester sont ajouts un milieu slectif (bouillon SF). La croissance
de toutes les bactries cocci Gram ngatives et d'autres est inhibe dans ce milieu par l'azote de
sodium. La fermentation du glucose est indique par un changement de couleur dans le bouillon.
Le pourpre de bromocrsol est l'indicateur.
Matriaux
chantillon deau
3 bouillons SF double force
6 bouillons SF simple force
Mthode
7. tiqueter trois tubes de bouillons SF double force "10".
8. tiqueter trois tubes de bouillons SF simple force "0.1" et les trois autres "1".
9. Inoculer les trois tubes double force avec 10 ml de leau tre teste.
10. Inoculer trois des tubes simple force avec 1 ml de leau tre teste.
11. Inoculer trois des tubes simple force avec 0.1 ml de leau tre teste.
12. Incuber tous vos tubes 37oC.

Inoculums deau
0.1 ml

[1X]

[1X]

1.0 ml

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[1X]

Bouillons SF

82

[2X]

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS (Groupe de 2)
Les bactries dans les aliments contribuent la dtrioration (autolyse) des aliments et aux
maladies. Les microorganismes provoquant lautolyse appartiennent principalement la famille
des Pseudomonaceae. Ces bactries contribuent la dtrioration des proprits organoleptiques
des aliments. Elles gnrent des odeurs et des arrire-gots dplaisants, altrent la texture et
peuvent causer une dcoloration. Les espces de cette famille sont des petits bacilles Gram
ngatifs arobies stricts. Une des espces particulirement problmatiques est Pseudomonas
aeruginosa.
Les maladies alimentaires peuvent tre regroupes en deux classes: Les infections alimentaires
et les intoxications alimentaires. Les infections alimentaires sont le rsultat de lingestion
suivie de la croissance de bactries pathognes. Les genres principaux impliqus incluent des
membres de la famille des Enterobacteriacae, telle quE. coli, Salmonella sp., et Shigella sp., et
quelques genres Gram positifs non sporulants de la famille des Listeriaceae, telle que Listeria et
quelques espces sporulantes de genre Bacillus tel que Bacillus cereus.
Contrairement aux infections alimentaires, les intoxications sont le rsultat de lingestion de
toxines prformes qui peuvent saccumuler dans les aliments entreposs de faon inadquate ou
pour des priodes prolonges permettant donc la croissance de microorganismes. Les espces
prdominantes responsables appartiennent au genre Clostridium. Les espces de ce genre sont de
courts bacilles Gram-positif sporulants qui sont des anarobies stricts.
La dtection des contaminants alimentaires est faite tout comme avec l'eau. Des tests qualitatifs
et quantitatifs fonds sur l'utilisation de milieux slectifs et diffrentiels sont faits.
SALMONELLOSE
La salmonellose est l'une des plus importantes maladies d'origine alimentaire et provoque
d'importantes charges mdicales et conomiques travers le monde. La nourriture est la
principale source de l'infection par Salmonella chez l'homme. Les ufs, ovoproduits, et la
volaille sont les sources les plus importantes de la salmonellose humaine. Les salmonelles
peuvent entrer dans la chane alimentaire tous les stades, et les consquences pour les tres
humains aprs la consommation du produit final contamin dpendent des conditions de
transformation des aliments. Par exemple, une source bien connue de contamination est
l'environnement des abattoirs. Plus tard, les salmonelles peuvent se multiplier des niveaux
nuisibles dus des conditions dentreposage inappropries. En gnral, Salmonella ne croit pas
sur la viande de poulet des tempratures infrieures 6C, tandis quune croissance
significative est observe 8 C. Le test du nombre le plus probable (NPP) est particulirement
utile pour la dtermination de faibles concentrations de la bactrie Salmonella. Dans ce cas-ci,
trois chantillons ou cinq rpliquas sont prpars partir de dilutions de facteur 10. Le rapport
entre les rsultats positifs et ngatifs relativement la concentration permet dobtenir une valeur
NPP/g.
Le bouillon de Rappaport-Vassiliadis Est un milieu slectif utilis pour l'enrichissement des
espces de Salmonella. La slectivit est due la prsence du vert de malachite, une pression
osmotique leve, et un faible pH. La forte concentration de chlorure de magnsium augmente la
pression osmotique, et en combinaison avec le vert de malachite, inhibe les bactries autres que
Salmonella. Le faible pH du milieu augmente la slectivit en inhibant la flore associe, y
compris les bactries intestinales.
83

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Pilon de poulet frais avec la peau dans un sac Ziploc (Goupes pair)
Pilon de poulet avec la peau entrepos au frigidaire pour 7 jours dans un sac Ziploc (Groupes
impairs)
3 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis double force
6 bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis simple force
Mthode
Prparation de lchantillon
1. Peser et enregistrer le poids de votre chantillon de poulet dans le sac.
2. Ajouter 2 ml deau par gramme de poulet dans le sac.
3. Mlanger en berant et en massant le poulet pour 5 minutes.
4. Rcolter et transfrer autant de la solution de lavage un tube Falcon strile.
NPP
1. Inoculer les bouillons bouillon de Rappaport-Vassiliadis avec la solution de lavage tel
quillustr ci-dessous :

Inoculums de la solution
de lavage1.0 ml

0.1 ml

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

[1X]

10 ml

[2X]

Bouillons de Rappaport-Vassiliadis

84

[2X]

[2X]

Labo de Microbiologie-2012
BACTRIES GRAM NGATIVES ET LES INFECTIONS ALIMENTAIRES
Il ya de nombreux groupes de bactries Gram ngatives dont la plupart ne sont pas pathognes.
La plupart des pathognes d'origine alimentaire appartiennent au groupe appel Proteobacteria
qui comprend plusieurs agents pathognes potentiels tels quE. coli, Salmonella, Pseudomonas,
Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Legionella, et bien d'autres. L'infection par ces
bactries conduit la libration d'endotoxine (une substance toxique associe la paroi cellulaire
bactrienne) provoquant une inflammation des tissus et des gastro-entrites.
La dtermination du nombre dhtrotrophes arobies
Gram ngatifs est habituellement effectue sur des
gloses MacConkey, un milieu slectif et diffrentiel qui
contient du lactose et des protines en tant que sources
potentielles de carbone. La slectivit de ce milieu est due
l'inclusion du cristal violet qui inhibe la croissance des
organismes Gram positifs et des levures. La proprit
diffrentielle de ce milieu permet de discriminer la
fermentation du lactose par l'addition d'un indicateur de
pH. Les bactries qui fermentent le lactose sont de
couleur rose, tandis que les non-fermenteurs sont blancs.
Matriaux
Solution de lavage du poulet frais (Groupes pairs)
Solution de lavage du poulet entrepos au rfrigrateur pour 7 jours (Groupes impairs)
75 ml saline physiologique strile
5 tubes striles
5 Gloses MacConkey
Mthode
1. Prparer des dilutions en srie de facteurs 10 (100-10-4) dans de la saline physiologique de la
solution de lavage du poulet prpar prcdemment.
2. taler 0.1ml de chaque dilution sur des gloses MacConkey tiquetes de faon approprie.
3. Incuber 370C
BIOREMDIATION (Partie 6a)
Matriaux
chantillons de bioremdiation entreposs
12 Gloses
Eau strile
Mthode
1. Prparer les dilutions 10-1, 10-3, et 10-5 de chacun des chantillons de bioremdiations
entreposs.
2. taler 0.1ml de chaque dilution de chacun des chantillons sur des gloses TSA tiquetes
de faon approprie. Vos plaques devraient tre tiquetes avec votre numro de groupe et la
date dchantillonnage.
3. Incuber 28oC.

85

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU
ESSAIS QUALITATIFS DE L'EAU
1. Rcolter tous vos tubes pour les essais prsomptifs.
2. Pour chacun des essais, dterminer le nombre de tubes sur trois (pour chaque jeu de 3) qui
sont positifs pour lorganisme tant test.
Bouillon Lauryl sulfate: Prsence de gaz (>10%)
Bouillon SF : Production dacide
3. Utiliser le tableau ci-dessous pour dterminer le NPP/100 ml pour chaque microorganisme.
Indice NPP pour Diffrentes Combinaisons de Rsultats dans les Essais Prsomptifs:
Nombre de tubes avec une raction positive:
3 de 10 ml chacun 3 de 1 ml chacun
3 de 0.1 ml chacun
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
1
1
2
0
2
0
0
2
0
1
2
1
0
2
1
1
2
2
0
2
2
1
3
0
0
3
0
1
3
0
2
3
1
0
3
1
1
3
1
2
3
2
0
3
2
1
3
2
2
3
3
0
3
3
1
3
3
2
3
3
3

Indice NPP
par 100 ml
<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1,100
>2,400

Source: Standard methods for the examination of water and waste water, 13th ed., American public health association, New York, 1971.

4. Obtenir les donnes pour les quatre chantillons deaux distribues dans la classe.

86

Labo de Microbiologie-2012
TEST DE COLIFORME CONFIRM
La prsence d'un test prsomptif positif suggre
immdiatement que l'chantillon d'eau est non potable. La
confirmation de ces rsultats est ncessaire, tant donn
que les tests positifs prsomptifs peuvent tre le rsultat
d'organismes d'origine non-coliformes qui ne sont pas
reconnus comme des indicateurs de pollution fcale. Le test
a confirm exige que des milieux slectifs et diffrentiels
tels que l'agar endo soient stris partir d'un bouillon de
lactose positif. Les bactries Gram positives sont inhibes
sur ce milieu par le sulfate de lauryl et le dsoxycholate.
Les fermenteurs du lactose produisent des aldhydes qui
ragissent avec le ractif de Schiff (fuchsine basique et le
sulfite de sodium) pour donner des zones rouges autour des colonies. Les colonies des coliformes
sont donc rouges avec un clat mtallique typique.
Mthode
1. Faire des stries pour colonies simples partir de tous les bouillons de lauryl sulfate positifs.
2. Incuber 37oC pour 24 heures.
3. Enregistrer le nombre de tubes confirm lordinateur au podium.
Une personne de chaque groupe devra se prsenter au temps dsign afin dobtenir les
rsultats.

ESSAIS QUANTITATIFS (ESSAI DE PETRIFILM)


1. Dterminer le nombre/ml de coliformes (colonies rouges ou bleu
avec gaz) ainsi que le nombre dE.coli (colonies bleues avec gaz)
2. Obtenir les donnes pour les quatre chantillons deaux
distribues dans la classe.

STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DE LEAU EN ONTARIO


Bactries coliformes totales:
Escherichia coli:
Streptoccoci fcaux:

Eaux potables
0/100ml
0/100ml
0/100ml

87

Eaux rcratives
100/100ml
100/100ml
S.O.

Labo de Microbiologie-2012
QUALIT MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS
SALMONELLOSE: NPP DE SALMONELLA
1. Obtenir tous vos bouillons de Rappaport-Vassiliadis.
2. Dterminer le nombre de tubes positifs sur trois (pour chaque jeu de 3) qui montrent de la
croissance.
3. Utilisez le tableau la page 87 afin de dterminer le NPP/g de poulet.
4. Obtenir les donnes pour tous les chantillons de poulet rpartis dans la classe.
ESSAI DE SALMONELLA CONFIRM
Comme pour le test de coliformes, la prsence de
Salmonella doit tre confirme sur un milieu slectif
comme lagar de Salmonella et Shigella. De lextrait de
buf, une digestion enzymatique de la casine, et une
digestion enzymatique de tissus animaux fournissent des
sources d'azote, de carbone, et les vitamines ncessaires
la croissance des organismes. Le lactose est le glucide
prsent dans lagar de Salmonella et Shigella. Des sels
biliaires, du citrate de sodium et du vert brillant inhibent les
bactries Gram positives et la majorit des bactries
coliformes, tout en permettant Salmonella de crotre. Le
sodium de thiosulfate et du de fer de citrate permettent la
dtection du sulfure d'hydrogne par la production de
colonies avec un centre noir.
1. Faire des stries pour colonies simples partir de tous les bouillons positifs de RappaportVassiliadis.
2. Incuber 37 C pendant 24 heures.
3. Enregistrer le nombre de tubes confirms l'ordinateur podium.
Une personne de chaque groupe devra passer aux temps prciss afin dobtenir leurs
rsultats.
BACTRIES GRAM NGATIVES ET LES
INFECTIONS ALIMENTAIRES
1. Dterminer le compte de bactries Gram ngatives/g
de poulet.
2. Dterminer le nombre de bactries qui fermentent le
lactose/g de poulet.
3. Dterminer le nombre de bactries qui ne
fermentent pas le lactose/g de poulet.
4. Obtenir les donnes pour tous les chantillons de
poulet distribus dans la classe.

Non-fermentor
Fermentor

STANDARDS DE QUALIT MICROBIOLOGIQUE DU POULET CRU


Coliformes :
Escherichia :
Salmonella

500 UFC/g
100 UFC/g
Pas plus de 5 chantillons positifs parmi 51-chantillons
88

Labo de Microbiologie-2012
COLORATIONS DE GRAM ET ISOLATION DINCONNUS GRAM NGATIFS
(Groupes de 2)
Matriaux
Une glose TSA
Mthode
1. Faire des colorations de Gram et la prise de photos de chacun des chantillons suivants :
Un des bouillons positifs de Lauryl-tryptose pour le NPP des coliformes dans leau
Un des bouillons positifs de SF pour le NPP des Enterococci fcales dans leau
Un des bouillons positifs de Rappaport-Vassiliadis pour le NPP de Salmonella
Une des colonies sur les gloses MacConkey
Notez, si vous navez pas obtenu de croissance ou vous navez pas fait lessai en question,
empruntez un chantillon dun autre groupe
2. Faire des stries pour colonies simples sur une glose TSA dune colonie obtenue de la glose
MacConkey dont vous avez confirm que cest une bactrie Gram ngative.
3. Incuber 37oC.
4. Prendre en note si la colonie choisie fermente le lactose ou non.

89

Labo de Microbiologie-2012
BIOREMDIATION (Partie 6b)
Matriaux
Comptes viables des chantillons de bioremdiations
1 Glose TSA
Mthode
1. Obtenir des comptes de colonies appropris pour chacun des temps dchantillonnage de
lessai de bioremdiation.
2. Faire des observations en ce qui a trait aux nombres de diffrentes morphologies coloniales
et leurs nombres relatifs pour chaque temps dchantillonnage.
3. partir du dernier temps dchantillonnage, identifier le type de colonie prdominant et
faire une coloration de Gram. Obtenir une photo numrique.
4. Faire des stries pour colonies simples du type prdominant de colonie et incuber 28oC.
Celles-ci seront entreposes 4oC aprs une priode dincubation de 48 heures.
Devoir
Soumettre une courte proposition de tests que vous utiliserez pour lidentification du
genre bactrien isol. Basez-vous sur les organigrammes disponibles sur la page web de
ce cours.
Votre proposition doit inclure un organigramme clair qui dmontre les rsultats attendus
et le procd didentification.
Seulement rquisitionner des tests qui ont t faits prcdemment dans ce cours de
laboratoire (incluant ceux de la semaine prochaine).
Indiquer dans la section des matriaux, les tests requis et le nombre requis.
Votre proposition ne doit pas dpasser une page.

90

Labo de Microbiologie-2012

LABO NO8
DIAGNOSTIC BACTRIEN BACTRIES GRAM NGATIVES

Jour 1
Les Enterobacteriaceae
Les bactries de la famille des Enterobacteriaceae sont parmi les microorganismes le plus
souvent retrouvs dans les spcimens cliniques. Les Enterobacteriaceae reprsentent une grande
famille diverse quon appelle communment les bacilles Gram ngatifs entriques fermenteurs,
indiquant quils sont des btonnets Gram ngatifs qui fermentent les sucres. Plusieurs font partie
de la flore naturelle du tractus intestinal des humains et des animaux. Certains infectent le tractus
intestinal. Les membres de cette famille ont les quatre caractristiques suivantes en communs:
1.
2.
3.
4.

Ce sont des btonnets Gram ngatifs


Ce sont des anarobies facultatifs
Ils sont oxydase ngative
Ils fermentent tous le glucose, mais variant normment quant leurs caractristiques
biochimiques

Les Pseudomonaceae
Contrairement aux Enterobacteriaceae, les Pseudomonaceae sont des bacilles Gram ngatifs
non-fermenteurs. Les bacilles Gram ngatifs non-fermenteurs sont des rsidents naturels des sols
et des eaux. Ils peuvent causer des infections chez lhumain quand ils colonisent des individus
immunodprims ou obtiennent accs lintrieur du corps suite un traumatisme. Le plus
commun des bacilles Gram ngatifs non-fermenteur qui cause des infections chez les humains
est Pseudomonas aeruginosa.
Les Nesseriaceae
Cette famille inclut les genres Neisseria et Moraxella des organismes non motiles, Gram ngatifs
diplocoques. Les membres de cette famille sont tous oxydase-positifs un test biochimique cl
pour lidentification de cette famille. Le genre Neisseria inclut plusieurs espces saprophytiques
qui se retrouvent dans la flore naturelle des membranes muqueuses des tractus respiratoires et
gnitaux. Deux espces pathognes sont: N. gonorrhoeae (agent de la gonorrhe) et N.
meningitidis (responsable de mningites).

91

Labo de Microbiologie-2012
DIAGNOSTIQUE DINCONNUS GRAM NGATIFS (Groupes de 2)
Dans lexercice suivant, on vous demandera didentifier un inconnu Gram ngatif que vous avez
isol la semaine passe ainsi que de confirmer lidentit dun inconnu Gram ngatif qui vous sera
fourni.
Matriaux
Bouillon de culture TSB dune bactrie Gram ngative oxydase ngative connue
Colonies simples sur glose TSA dun inconnu Gram ngatif isol la semaine prcdente
2 gloses MacConkey
2 pentes de citrate de Simmons
2 pentes dure
2 pentes TSI
2 tubes profonds SIM
2 bouillons de dcarboxylase dpourvus dacides amins
2 bouillons de dcarboxylase avec ornithine
2 bouillons de dcarboxylase avec lysine
Une Bande API
Mthodes Faire tous les tests suivants avec chacune de vos 2 bactries Gram ngatives
COLORATION DE GRAM
1. Faire une coloration de Gram de chacune des bactries.
2. Faire la prise de photos pour vos rapports.
3. Prendre en note la coloration de Gram, la forme cellulaire et lagrgation cellulaire.
OXYDASE
1. Faire le test doxydase sur les gloses de linconnu que vous avez isol.
CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY
1. Faire des stries pour colonies simples de vos deux bactries sur des gloses MacConkey et
incuber 37oC.
L'UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE CARBONE
1. Strier vos deux bactries sur des pentes de citrate de Simmons et incuber 37oC.
URASE
1. Strier vos deux bactries sur des pentes d'ures et incuber 37C.

92

Labo de Microbiologie-2012
CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER)
Ce milieu de croissance est couramment utilis pour l'identification prliminaire de membres de
la famille des Enterobacteriacae. Il contient quatre diffrentes sources de carbones potentielles,
dont le glucose, le lactose, le sucrose, et des protines. La prsence d'un indicateur de pH permet
de distinguer entre l'utilisation des sucres et des protines. L'utilisation de sucre par un mode de
fermentation donne lieu une raction acide, tandis que l'oxydation de protines gnre une
raction alcaline. Le milieu est pourvu sous forme de pente, crant ainsi des conditions
darobies et danarobies. La surface de la pente est essentiellement arobie, tandis que la
portion interne est plutt anarobie; favorisant ainsi la fermentation.
Parmi les trois sucres, le glucose est limitant (0.1%) tandis que le sucrose et le lactose sont en
excs (1.0%). Puisque les Enterobacteriaceae peuvent tous mtaboliser le glucose, son
mtabolisme rend le milieu initialement acide (jaune). Pour une croissance continue, suite
lpuisement du glucose, une des autres sources de carbone devra tre utilise. Si le sucrose et le
lactose ne peuvent pas tre utiliss, la source de carbone qui sera mtabolise sera donc les
protines, gnrant des produits alcalins. La hausse de pH rsultante changera le milieu une
couleur neutre ou alcaline (orange ou rouge respectivement). Par contre, si le sucrose et/ou le
lactose peuvent tre utiliss en anarobies, les acides produits feront que le milieu demeurera
acide (jaune).
En plus de permettre la distinction entre la fermentation de diffrents sucres, le milieu de
croissance TSI permet de dterminer si une bactrie peut dgrader des acides amins qui
possdent un groupement sulfhydrile, tel que la mthionine et la cystine. La dgradation de ces
acides amins gnre du sulfure d'hydrogne qui ragit avec le sulfate ferreux, gnrant un
prcipit noir.
1. Inoculer la surface et le bout de pentes TSI avec vos deux bactries. (Voir limage)
2. Incuber 37oC.

Introduire la boucle dinoculation Pente


jusquau fond du milieu dans le bout. En
sortant, strier la surface de la pente.

Bout

93

Labo de Microbiologie-2012
SIM: PRODUCTION DE SULFIDE DHYDROGNE, DINDOLE ET LA MOTILIT
PRODUCTION DE H2S
Tout comme avec le milieu TSI, la dgradation dacides amines base de soufre peut tre
dtermine par la production dun prcipit noir.
MOTILIT
Certains microorganismes possdent la capacit de se mouvoir l'aide de flagelles. Cette
caractristique peut tre observe par l'inoculation de milieux semi-solides. Les bactries non
motiles croissent seulement dans la rgion qui est inocule, tandis que les bactries motiles
dmontrent une croissance qui s'tend au-del de la rgion d'inoculation.
PRODUCTION D'INDOLE SUITE LA DGRADATION DU TRYPTOPHANE
Un autre acide amin qui peut tre utilis comme source de carbone par certains
microorganismes est le tryptophane. La dgradation du tryptophane gnre un sous-produit,
l'indole, et l'acide pyruvique. L'acide pyruvique est utilis comme source de carbone, tandis que
l'indole est excrt dans le milieu en tant que dchet. La production d'indole peut tre dcele par
sa raction avec le ractif dimethylaminobenaldehyde (ractif de Kovacs).
1. Obtenir des tubes de milieu SIM solide.
2. Utiliser une aiguille dinoculation pour inoculer chacune de vos bactries jusquau bas du
tube le long dune ligne droite.
3. Incuber 37oC.
LES DCARBOXYLASES DORNITHINE ET DE LYSINE
Le milieu utilis pour vrifier la prsence de diffrentes dcarboxylases dacides amins contient
du glucose, source de carbone fermentable, et lacide amin dsir, lornithine ou la lysine.
Lacide produit par la fermentation du glucose rduit le pH du milieu et change la couleur de
lindicateur de pH du mauve au jaune. Ces conditions acides permettent de stimuler lactivit des
dcarboxylases. La dcarboxylation de la lysine gnre de la cadavrine, tandis que la
dcarboxylation de lornithine gnre de la putrescine. Ces derniers causent une hausse du pH,
qui change la couleur de lindicateur du mauve au violet. Si lorganisme ne produit pas lenzyme
approprie, le milieu demeure acide (jaune).
1. Inoculer des bouillons du milieu de dcarboxylase dpourvu dacide amine avec chacune de
vos bactries.
2. Inoculer des bouillons de dcarboxylase contenant de la lysine avec chacune de vos
bactries.
3. Inoculer des bouillons de dcarboxylase contenant de lornithine avec chacune de vos
bactries.
4. Recouvrir tous les bouillons dhuile minrale pour crer des conditions danarobies.
5. Incuber 37oC.

94

Labo de Microbiologie-2012
API 20E SYSTME ENTEROBACTERIACEAE
Cette bande test API-20E (de bioMerieux, Inc.) qui est utilise pour identifier les bacilles Gram
ngatifs entriques possde 20 compartiments de test dshydrat spars. Une suspension
bactrienne est utilise pour rhydrater chacun des puits. Certains des puits auront des
changements de couleur rsultants des diffrences de pH. Dautres produisent des sous produits
qui doivent tre identifis avec des ractifs.
Mthode (Ce test est tre fait seulement avec la bactrie Gram ngative connue qui vous a
t fournie)
1. Prparer une dilution de 1/10 de la culture bactrienne dans de la saline physiologique.
Inoculer la bande API
1. Voir lanimation pour une description du procd dcrit ci-dessous. Cette animation est
disponible sur le site web de ce cours : suivre le lien pour API.
2. En tenant la bande un lger angle avec le dessus de la table, vous allez maintenant inoculer
la suspension bactrienne dans chacun des puits avec une pipette pasteur strile.
3. Toucher lextrmit de la pipette sur le ct de la cupule permettant au fluide de pntrer
dans le puits par laction capillaire tout en appliquant une pression lgre sur le bulbe. Ceci
devrait prvenir la formation de bulles dans les puits. Chaque puits doit tre rempli jusquau
cou (voir diagramme).
Puits ou cupule

Ligne de remplissage
pour la majorit des
puits ou cupule

4. Remplir le tube et la section de la cupule des tubes [CIT], [VP] et [GEL].


5. Suite linoculation, remplir compltement la section de la cupule des microtubes ADH,
LDC, ODC, H2S et URE avec de lhuile minrale.
Incuber la bande dans sa chambre
6. Remplir le bas de la chambre avec juste assez deau pour remplir les indentations.
7. Placer la bande dans ce rservoir du bas.
8. Placer le dessus de la chambre dincubation sur le bas et tiquete l.
9. Placer la bande 37o C.

95

Labo de Microbiologie-2012
BIOREMDIATION (Partie 7a)
Matriaux
Stries pour colonies simples dOEM
1 glose TSA
Mthode
1. Faire une coloration de Gram sur votre isolation de colonies simples et obtenir une photo
numrique.
2. Faire des stries pour colonies simples pour une deuxime fois et incuber 28oC.

96

Labo de Microbiologie-2012

Jour 2
CROISSANCE SUR MILIEU MACCONKEY
Examiner la croissance sur votre glose MacConkey afin de dterminer si vos bactries
fermentent le lactose.

Fermenter

Non Fermenter

URASE
Examiner vos pentes dure afin de dterminer si vos bactries peuvent
utiliser l'ure en tant que source de carbone.

UTILISATION DU CITRATE EN TANT QUE SOURCE DE


CARBONE
Examiner vos pentes de citrate de Simmons afin de dterminer si vos
bactries peuvent utiliser le citrate en tant que source de carbone.

97

Negatif Positif

Negatif Positif

Labo de Microbiologie-2012
CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER)
Faire lanalyse de vos pentes TSI afin dobtenir les donnes suivantes :
Quelle est la raction de pente : acide, alcaline ou neutre
Quelle est la raction bout : acide, alcaline ou neutre
Est quil y a production de H2S
o Si oui, est-elle produite sous arobie, anarobie ou les deux
Est-ce quil y a accumulation de gaz

A
A.
B.
C.
D.

Bout et pente acide + accumulation de gaz


Pente alcaline et bout acide
Bout acide et pente alcaline + H2S en anarobie
Pente alcaline et bout neutre

Observations typiques en milieu TSI de bactries de la famille des Enterobacteriaceae


Ractions TSI
Bactrie
Bout
Pente
H2 S
Gaz
Enterobacter
A
A
+
Escherichia
A
A
+
Klebsiella
A
A
+
Proteus mirabilis
A
C
+
+
Proteus vulgaris
A
A/C
+
+
Morganella
A
C
+
Serratia
A
C
Shigella
A
A
Salmonella
A
K
+
A= acide, C = alcalin

98

Labo de Microbiologie-2012
SIM: PRODUCTION DE SULFIDE DHYDROGNE, DINDOLE ET LA MOTILIT
Faire lanalyse de vos tubes profonds de milieu SIM afin dobtenir les donnes suivantes :
Vos bactries sont-elles motiles
Est quil y a production de H2S
Le tryptophane est-il utilis comme source de carbone
o Est-ce quil y a production dindole? Afin dobtenir ce rsultat, ajoutez quelques
gouttes du ractif de Kovacs. Si de lindole a t produit, le ractif devient rouge

A
A.
B.
C.
D.

Motile +H2S
Motile + Indole
Non-motile
Aucune croissance
Rsultats typiques
Microorganismes
Escherichia
Enterobacter
Citrobacter
Klebsiella
Salmonella
Shigella
Prot. vulgaris
Prot. mirabilis
Morganella
Serratia

H2S
+
+
+
+
-

99

Indole
+
+/+
+
-

Motilit
+/+
+
+
+
+
+
+

Labo de Microbiologie-2012
LES DCARBOXYLASES DORNITHINE ET DE LYSINE

LDB : Milieu avec acide amin (ornithine ou lysine)


DCB : Milieu sans acide amin
1. Rsultat ngatif : Raction alcaline avec et sans acide amin
2. Rsultat positif : Raction alcaline avec acide amin, mais raction acide sans acide amin
3. Rsultat ngatif : Raction acide avec ou sans acide amin

100

Labo de Microbiologie-2012
SYSTME ENTEROBACTERIACEAE API 20E
Interprtation
1. Ajouter les ractifs appropris aux compartiments
o 1 goutte de Kovac's au IND (faire la lecture dans les minutes qui suivent)
o 1 goutte de 40% KOH et alpha-naphtol au VP (une raction positive peut prendre jusqu'
10 minutes)
o 1 goutte de FeCl3 au TDA
2. Faire la lecture de tous les autres tests, tel que dans le tableau, sans lajout de ractifs.
3. Noter les rsultats et comparer les ractions positives avec le tableau de diffrentiation.
TESTS SUBSTRAT

REACTION TEST

RESULTATS -

RESULTATS +

ONPG

ONPG

bta-galactosidase

incolore

jaune

ADH

arginine

arginine dihydrolase

jaune

rouge/orange

LDC

lysine

lysine dcarboxylase

jaune

rouge/orange

ODC

ornithine

ornithine dcarboxylase jaune

rouge/orange

CIT

citrate

utilisation de citrate

Vert ple/ jaune

bleu/bleu-vert

H2S

Na thiosulfate

production dH2S

incolore/gris

dpt noir

URE

ure

hydrolyse dure

jaune

rouge/orange

TDA

tryptophane

daminase

jaune

brun-rouge

IND

Tryptophane

production dindole

jaune

rouge (2 min.)

VP

Na pyruvate

production dactoine

incolore

rose/rouge(10 min.)

GEL

charbon glatine glatinase

GLU

glucose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

MAN

mannitol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

INO

inositol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

SOR

sorbitol

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

RHA

rhamnose

fermentation/oxydation bleu/bleu-vert

jaune

SAC

sucrose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

MEL

melibiose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

AMY

amygdalin

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

ARA

arabinose

fermentation/oxydation bleu/bleu vert

jaune

OX

oxydase

oxydase

violet

Pas de diffusion du noir Noir diffus

incolore/jaune

101

Labo de Microbiologie-2012
GNRER LE NUMRO DE PROFIL
En lisant la bande, inscrire + ou sur le formulaire du rapport. Le formulaire a des lignes
verticales plus fonces qui divisent les sept sections. Faire la somme de toutes les ractions
positives dans chaque bloc de trois tests et inscrire la valeur dans la bote du bas. Vous aurez
besoin des rsultats pour la raction doxydase pour le dernier numro (suit le panneau de
fermentation des hydrates de carbone). Voir lexemple ci-dessous :

Enregistrer votre numro de profil sur lordinateur au podium.

102

Labo de Microbiologie-2012
RAPPORT SUR LIDENTIFICATION DINCONNUS BACTRIENS
Chaque personne ou quipe de deux doit rdiger et remettre un manuscrit qui rapporte leurs
rsultats. Le manuscrit devrait inclure ce qui suit :
A. Titre et les noms des auteurs
B. Introduction: Cette section devrait traiter des raisons que lisolation et lidentification
dorganismes bactriens sont importantes, ainsi que les techniques gnrales qui sont
utilises a cette fin (non seulement celle vue en labo).
C. Rsultats: Prsenter les tests qui ont t faits, quelles observations ont t faites et leurs
interprtations respectives. Des tableaux et figures seraient utiles pour cette section.
Prsentez comment certains ou tous les rsultats obtenus ont permis didentifier
lorganisme inconnu. Un organigramme serait une bonne ide pour cette section.
D. Discussion: Dans cette section vous devez crire (environ une page pour chaque
organisme) une description dtaille de lorganisme identifi. Vous devriez trouver de
linformation
sur
leurs
caractristiques
gnrales,
physiologie,
impacte
environnementales (sil y en a) utilits, importance Clinique et traitement.
E. Rfrences: Lister toutes les rfrences utilises daprs le style recommand par le
Journal of Bacteriology .
BIOREMDIATION (Partie 7b)
Matriaux
Isolation pour colonies simples dOEM
1 bouillon TSB (5ml)
Mthode
1. Faire une coloration de Gram sur votre isolation pour colonies simples et obtenir une photo
numrique.
2. Inoculer 5ml de TSB et mettre le bouillon lendroit dsign pour une incubation 28oC
pour 48 heures. Aprs la priode dincubation, les bouillons de culture seront entreposs
4oC.

103

Labo de Microbiologie-2012
LABO NO 9
HMATOLOGIE/ SROLOGIE

Jour 1
SROLOGIE MICROBIENNE (Groupes de 2)
Une des mthodes de laboratoire utilises pour le diagnostic des maladies infectieuses humaines
est la srologie microbienne. Elle inclut des mthodes indirectes fondes sur la recherche dans le
srum dun patient danticorps spcifiques contre lagent microbien, quil soit bactrien, viral, un
parasite ou un champignon responsable de la pathologie. Il existe aussi des mthodes directes qui
utilisent des anticorps afin de dtecter le microorganisme dintrt. Ces mthodes diagnostics
sont essentielles pour le diagnostic dinfections par des microorganismes qui sont difficiles
identifier ou dont la croissance en laboratoire est difficile ou mme impossible; particulirement
les virus, les bactries strictement intracellulaires, et les bactries intracellulaires facultatives.
Techniquement, la srologie microbienne pour but de dceler dans le srum du patient une
raction antigne : o lantigne est reprsent par le microorganisme entier ou une partie de ce
dernier et lanticorps est reprsent par des immunoglobulines spcifiques lagent microbien
infectieux. Plusieurs mthodes immunologiques sont utilises cette fin. Le plus commun de ces
tests et lessai immunoabsorbant denzyme lie communment connu sous lappellation
dELISA.
ELISA
Cet essai reprsente un systme deux composantes. La premire composante dpend
danticorps qui peuvent reconnatre de faon spcifique et lier lagent quon dsire dceler;
lanticorps primaire. La deuxime composante dpend dune enzyme conjugue un deuxime
anticorps qui gnrera un produit color.
Il y a plusieurs variantes de lELISA. Dans lexercice suivant, vous ferrez un ELISA direct afin
de dtecter la prsence dun agent infectieux (lantigne). Brivement, cette procdure est faite
comme suit : premirement, les protines dans lchantillon (le srum du patient) qui inclut
lagent tre dcel sont fixes sur une matrice solide telle que le plastique. Des anticorps qui
peuvent spcifiquement reconnatre et li lagent dintrt sont ensuite ajouts. Si la matrice a
des antignes qui y sont lis, quelques anticorps se lieront lantigne qui est li la matrice.
Donc, tous deux, lantigne et lanticorps auquel il est li sont maintenant immobiliss sur le
support solide. Le but est ensuite de dterminer sil y a des anticorps spcifiques lantigne qui
sont lis. La dtection de lanticorps spcifique lantigne est faite laide dun anticorps
secondaire (lanticorps dtecteur) qui reconnait de faon spcifique la rgion constante du
premier anticorps. Ce deuxime anticorps possde une enzyme qui lui est lie. Donc, si
lanticorps primaire a t immobilis par sa liaison lantigne, le deuxime anticorps et
lenzyme lie celui-ci seront aussi immobiliss. Un substrat incolore est ensuite ajout qui peut
tre cliv par lenzyme qui est li lanticorps secondaire. Le produit du clivage enzymatique du
substrat est color et peut donc tre quantifi avec un spectrophotomtre. La quantit de couleur
qui est dcele est directement proportionnelle la quantit denzyme qui a t immobilise.

104

Labo de Microbiologie-2012

tape 1: Liaison de lantigne au support solide.


tape 2: Liaison de lanticorps primaire.
tape 3: Liaison de lanticorps secondaire auquel une enzyme est lie.
tape 4: Conversion du substrat incolore en un produit color.

105

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Tube de fluides corporels inconnu
Fluides corporels positifs
Fluides corporels ngatifs
Pissette de solution de lavage (PBS)
Anticorps primaire (IgG de mouton anti - N. gonorrhea)
Anticorps secondaire conjugu la peroxydase de raifort (IgG de souris anti - IgG de mouton
Substrat pour peroxydase
Plaque de 96 puits
Micropipette de 0.2 ml
Micropipette de 1 ml
Mthode
Propagation de lagent infectieux
1. Quand on vous indiquera de le faire, chaque groupe partagera leurs fluides corporels avec
ceux dun autre groupe sur une autre table. Prendre en note le groupe avec lequel le partage
a t fait pour la premire ronde.
Pour faire le partage, transfrer la totalit du contenu du tube de vos fluides corporels
inconnu (approx. 500L) dans le tube des fluides corporels inconnu du groupe avec
lequel vous faites le partage. Bien mlanger l'aide de la micropipette, puis diviser
lchantillon de faon gale entre vous. Notez le numro du groupe avec qui vous
partagez les fluides ainsi que la ronde du partage.
2. Aprs que tout le monde aura fini avec la premire ronde, on vous demandera de rpter le
processus en partageant avec un autre groupe. Encore une fois, prendre en note le groupe
avec lequel le partage a t fait pour cette deuxime ronde.
3. Aprs que tout le monde aura fini avec la deuxime ronde, on vous demandera de rpter le
processus en partageant avec un autre groupe. Encore une fois, prendre en note le groupe
avec lequel le partage a t fait pour cette troisime ronde.
ELISA
1. Transfrer 50 L des fluides partags dans chacun de trois puits dune plaque dELISA.
2. Transfrer 50 L du tmoin positif dans chacun de trois diffrents puits dune plaque
dELISA.
3. Transfrer 50 L du tmoin ngatif dans chacun de trois diffrents puits dune plaque
dELISA.
4. Laissez la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes.
5. Vider la plaque dans lvier. Afin de compltement vider les puits, frapper la plaque contre le
ct de lvier.
6. Utiliser la pissette de solution de lavage pour laver les puits, puis retirer le tampon de lavage
tel quindiqu ci-dessus.
7. Rpter l'tape de lavage deux fois de plus.
8. Aprs avoir lav les puits trois fois, frapper fermement la plaque lenvers sur des essuietout pour retirer tout fluide rsiduel. Une fois les lavages complts, il ne devrait plus y avoir
de liquide dans la plaque.

106

Labo de Microbiologie-2012
9. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 L de la solution de lanticorps
primaire chacun des puits. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes.
10. Vider la plaque et faire les lavages tel quindiqu aux tapes 6-7 ci-dessus.
11. Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 L de la solution de lanticorps
secondaire. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 15 minutes.
12. Vider la plaque et faire les lavages tel quindiqu aux tapes 6-7 ci-dessus.
13. Dernire tape: Utiliser un nouvel embout de micropipette pour ajouter 50 L du substrat
pour la peroxydase chacun des puits. Laisser la plaque sur votre table de travail pour 10
minutes
14. Observer les rsultats. Les puits ngatifs (non-infect et les tmoins ngatifs) demeureront
totalement clairs. Les puis positifs (infect et les tmoins positifs) tourneront bleu.
Rcolte des rsultats:
lordinateur au podium lavant, inscrire votre numro de groupe et indiquer un plus (+) ou un
moins (-) ses cots, daprs vos rsultats. Faire de mme et inscrire un plus ou un moins suivi
du numro de la ronde de partage au cot des trois groupes avec qui vous avez partag des
fluides corporels. C.--d., si votre rsultat tait positif vous devriez inscrire un plus au cot du
numro de votre groupe ainsi que ceux de trois autres groupes, et si votre rsultat tait ngatif
vous inscririez un symbole moins pour votre groupe et trois autres.
Ex. Pour mon groupe (Groupe 2)
Groupes avec qui les partages ont t faits
Votre No de groupe
Ronde 1
Ronde 2
Ronde 3
+2
+14
+7
+8
-8
-12
-5
-2
BIOREMDIATION (Partie 8a)
Matriaux
Isolation pour colonies simples de lOEM
Bouillon de culture de lOEM
Mthode
1. Faire les tests que vous avez proposs pour lidentification du genre de lOEMs.
2. Incuber tous les tests (si ncessaire) 28oC.

107

Labo de Microbiologie-2012

Jour 1 ou 2
L'HMATOLOGIE (Groupes de 2)
L'hmatologie est un des domaines cliniques qui se proccupe de l'tude du sang et de ces
composantes. Le sang est compos de deux parties : le plasma et les lments forms. Les
lments forms sont les cellules et les fragments cellulaires retrouvs dans le sang. Ceux-ci
incluent les rythrocytes (globules rouges ou GR), les leucocytes (globules blancs ou GB) et les
plaquettes (fragments cellulaires qui aident la coagulation). Plus de 99 % des cellules sanguines
sont des rythrocytes, qui transportent l'oxygne. La capacit du sang de transporter l'oxygne
dpend sur la concentration de l'hmoglobine dans les GR ainsi que le nombre de GR dans le
sang. Un nombre anormal de globules rouges reprsente soit une anmie (nombre sous la
normale) ou une polycythmie (nombre plus lev que la normale).
COMPTE DE GLOBULES ROUGES
Afin de pouvoir dterminer le compte de globules rouges (GR), un chantillon du sang est dilu
et ensuite appliqu une cellule de comptage de volume connu d'une lame d'hmacytomtre.
La cellule de comptage d'une lame dhemacytomtre standard possde deux secteurs de
comptage identiques burins dans le verre, qui sont constitus de neuf carrs aux dimensions de
1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la figure). Lorsque la lame d'hemacytomtre est recouverte
d'une lamelle, l'espace libre disponible est dune profondeur de 0.1 mm. Le volume est donc de
0.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'chantillon dnombrer est ajout dans l'hemacytomtre, les
cellules sont visualises au microscope et numres. Les cellules contenues dans chacun de trois
des carrs tiquets "R" sont comptes pour en calculer une moyenne; aprs quoi le nombre de
globules rouges/mm3 est dtermin.

108

Labo de Microbiologie-2012

B
R

Exemple de calcul
Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrs indpendants, l'on a une moyenne de 10
cellules par carr. Ce nombre quivaut avoir
10 cellules/(0.2mm X 0.2mm X 0.1mm) ou 10 cellules/0.004 mm3 ou 2500 cellules/mm3
Afin d'obtenir la concentration originale, vous devez ensuite multiplier par le facteur de dilution.
Par exemple si l'chantillon de sang a t dilu par un facteur de 1 000, votre rponse finale
serait 2.5 X 106 cellules /mm3.

109

Labo de Microbiologie-2012
Matriaux
Un chantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4
Saline physiologique de 0.9% (m/v)
Lame d'hmacytomtre
Pipette pasteur
Mthode
1. Dans de la saline physiologique, prparer trois dilutions en srie de facteurs 10 du sang.
2. Appliquer la dilution la plus leve la chambre de comptage de lhmacytomtre.
3. Compter le nombre de GR observes dans chacun de trois carrs (R) indpendants et
dterminer le nombre total de cellules dans la suspension originale. Si le nombre de cellules
est trop petit, recommencer avec la dilution prcdente.
4. Faire la moyenne de votre compte et de celui du groupe en face de vous.
tendues de concentrations normales
males: 4.55.2*106/mm3
femelles: 44.5*106/mm3
L'HMATOCRITE
Tel que mentionn prcdemment, le sang est compos de deux parties : les lments forms et
le plasma. Les cellules reprsentent la fraction la plus dense. Le plasma constitue un peu plus de
la moiti du sang d'un adulte. Cette fraction est 90% 92 % d'eau avec divers solut qui y sont
dissouts. Le pourcentage d'rythrocytes qui se retrouve dans un volume donn de sang s'appelle
l'hmatocrite. L'hmatocrite d'un adulte male est en moyenne 45 %, est peux varier entre 37 %
48 %. Une lecture plus faible indique possiblement une anmie. L'hmatocrite est habituellement
dtermin suite la centrifugation d'un tube capillaire remplie de sang. Le pourcentage de la
colonne reprsente par la fraction des globules rouges est ensuite dtermin.

Mnisque

Plasma

Globules Blancs

Globules Rouges

110

Labo de Microbiologie-2012
VOLUME CELLULAIRE MOYEN (VCM)
Les valeurs obtenues pour le compte de GR et l'hmatocrite peuvent tre utilises pour la
dtermination du volume cellulaire moyen (VCM) qui est utile pour la discrimination de
diffrents types d'anmies. La taille moyenne des globules rouges est exprime en femtolitres (1
femtolitre = 10-15 litres). Il est calcul en divisant le volume des cellules sdimentes
(l'hmatocrite) par le nombre de GB:
VCM =

Hmatocrite
No de GB

NOTEZ: si l'hmatocrite = 40%, inscrire 0.4 dans l'quation, pas 40.


L'tendue normale est typiquement 80-100 fl.
En prsence d'anmie hmolytique ou macrocytique le VCM peut tre plus grand que 100
femtolitres. Ce type d'anmie est associ l'alcoolisme et des dficiences d'acide folique.
Une dficience en fer cause communment une anmie microcytique, dans quel cas le VCM est
plus petit que 80 femtolitres. Une telle anmie peut aussi tre observe dans les cas de
thalassmie ou suite aux menstruations chez la femme.
Le type d'anmie le plus commun se dit normocytique. Dans ce cas-ci, le VCM est normal
(entre 80-100 fl.) mais le nombre de GR est faible.
Matriaux
Un chantillon de sang dans tampon Alserver par groupes de 4
Tube capillaire
Mthode
1. Remplir par capillarit le tube capillaire de sang.
2. Boucher une des extrmits du tube capillaire avec un peu d'argile.
3. Centrifuger dans la centrifuge pour les capillaires pour 15 minutes.
4. Mesurer l'aide d'une rgle la hauteur totale de la colonne de fluide ainsi que la hauteur de la
colonne de GR.
5. Dterminer l'hmatocrite. Faire la moyenne de votre hmatocrite et de celui du groupe en
face de vous.
6. Calculer le VCM de votre chantillon de sang. Faire la moyenne de votre VCM et de celui
du groupe en face de vous.

111

Labo de Microbiologie-2012
LES LEUCOCYTES
Les leucocytes ou GB (globules blancs), qui reprsentent les cellules qui dfendent le corps
humain contre les infections, sont sous-diviss en cinq catgories : les neutrophiles, osinophiles,
basophiles, monocytes et lymphocytes. Ces cellules jouent un rle vital dans les rponses
immunitaires. Il est rare qu'une augmentation dans le nombre d'une de ces classes de leucocytes
cause une augmentation dans le nombre d'une autre classe de leucocytes. Dpendamment du
nombre de laquelle des classes de leucocytes sont observ diffrentes pathologies sont
associes : lymphocytose, neutrophilie, osinophilie, monocytose et basophilie. Un nombre
gnralement lev de globules blancs se dit une leucocytose. Ceci peut tre le rsultat
d'infections bactriennes, une inflammation, la leucmie, un traumatisme ou mme le stress.
Chacun des leucocytes possde des caractristiques spcifiques qui peuvent tre observes suite
une coloration (voir le tableau sur la prochaine page).
Matriaux
Lame prpare d'un frottis de sang humain
Mthode
1. Examiner la lame prpare d'un frottis de sang humain afin d'identifier les diffrentes
catgories de leucocytes.
2. Faire le balayage de la lame prpar (voir ci-dessous) au plus faible grossissement (10x) et
compter le nombre de diffrents types de leucocytes sur un total de 100 leucocytes compt.

3. Calculer le pourcentage de chaque classe de GB en divisant le nombre de chaque type par le


nombre total de GB compt.
Compte diffrentiel de globules blancs
Type cellulaire No de chaque % de chaque
Neutrophiles
osinophiles
Basophiles
Lymphocytes
Monocytes
Total:

112

Labo de Microbiologie-2012

Les leucocytes
Nom

Granulocytes:
Neutrophiles

Caractristiques
Fonction
principale
morphologiques
Granules
Deux lobes spars par un
Phagocytose des
mince filament de
bactries
chromatine

Granulocytes:
osinophiles

Granules
Noyau bilob

Destruction des
vers parasites

Granulocytes:
Basophiles

Granules trs abondants


qui habituellement
cachent le noyau

Libration de
mdiateurs
chimiques (raction
inflammatoire)

Lymphocytes B

Lymphocytes T

Monocytes

Production
d'anticorps (rponse
humorale)

Absence de granules
Noyau occupe la majorit
Attaque des cellules
du cytoplasme
infectes (rponse
cellulaire)

Pas de granules
Noyau de forme
irrgulire

Phagocytose (les
monocytes se
transforment en
macrophages dans
les tissus)

Vous tes responsable de cette matire pour lexamen final!

113

Labo de Microbiologie-2012
Devoir: Hmatologie
Soumettre un tableau qui prsente les donnes suivantes pour votre chantillon de sang.

Compte GR
Hmatocrite
VCM
Compte GB
% Neutrophiles
% osinophiles
% Basophiles
% Lymphocytes
% Monocytes
Assurez-vous dindiquer les valeurs avec les units appropries. Inclure un commentaire,
qui indique et explique toute condition mdicale vidente sil y en a une.
BIOREMDIATION (Partie 8b)
Mthode
1. Obtenir vos rsultats et vos observations pour les tests mtaboliques faits pour pouvoir
identifier lOEM.

114