DUMITRU T. BUIUC MICROBIOLOGIE MEDICALA Ghid pentru studiul si practica medicineiEditura Gr. J. Popa TASI, Str. Universititii nr. 16 Referenti stiintifici: Prof. dr. Marian NEGUT Prof, dr. Vasile LUCA Prof, dr. Sofia TIMOSCA Edifia Ia, 1974, LM.F. lagi Editia a Il-a, 1977, ILM.F. lagi Editia a Ill-a, 1982, .M.F. lagi Editia a [V-a, 1987, LMP. lagi Editia a V-a, 1992, Editura Didactica si Pedagogica Bucuresti Edifia a VI-a, 2003, Editura .,Gr.T-Popa” lasi Tehnaredactare: Sorin Oreste Popescu, Ana Vornicu. Grafica: Marius C. Atanasiu Coperta: Marius C. Atanasiu Descrierea CIP a Biblioteci BUIUC, DUMITRU MICROBIOLOGIE MEDICALA: ghid pentru studiul si practica medicinei / Dumitru T. Buiue. — Iasi : Editura Gr. T. Popa, 2003 ISBN 973-7906-16-0 tionale a Romaniei 579(075.8) * Toate drepturile asupra acestei lucriri apartin autorilor si Editurii Gr. T. Popa Iasi. Nici o parte din acest volum nu poate fi copiatd sau transmisa prin nici un mijloc, electronic sau mecanic, inclusiv fotocopiere, fir permisiunea scrist din partea autorilor sau editurii.LA 125 ANI 4] FACULTATI DE MEDICINA DIN [&S1 OMAGIU PROFESORULUL ALEXANDRU SLATINEANU SI COLABORATORILOR CU CARE A CTITORIT PRIMA SCOALA IESEANA DE BACTERIOLOGIE DISTRUSA DE VITREGIA YREMURILOR SI RAUTATEA OAMENILOR. , Dune Miriator , Doolin aw Laborato ‘ 2) Wer an muriylincele reer organs Tartar Anas Laboretsr De doi mifee “te tet Cont ° aimgrA dat de Dawe cbiom Master Suc. Sublres be he ami pum de Let 40.000. Gr acearti wet a dtede orprerizve ony (atonaber melant de comin — [daw ates Ye cum mer Lihoretn de Bathinda, / — ‘ —a "1) Nu am laboretor, 2) Nu am mijlowes pentru orga.rizaree unui lahorator: De doi ani ~ mi sa dat mumai 0 singurd dat de D-nu Arion Ministr Dist: Publice sie pe aturei suna de lei 10000. Cu acest: sumé.se poate organiza iw laborator volant d? campanie - dar nici de cum un laborator de invéigimant.” Alexandru Stitineans Jasi 22 Februarie 1914, Advesa ws: 13 oltre Ministeut Cuttelor si Insieuctienit Sublice, Bucuresti Vo on ee a (kr vet hg A bag Tete’ bom drotlpcnm ts Seach sich ~ fa tos ern nae Mita ho oem sn tm eg hay (a a ee Sori Flip barn tom iw BO pn oh Vas a att A ba inn lowe de phe Cron rb Pres SG fodtin® tpn kB tn PE Ray OG Caden = fue po Siectll Vypnite hE pote lok yom ba pm yr Wee Sale bitdig Coble, nin eae Ind” an” Edna" ol “inalt Prea Sfinte Doammnelar : Den Vai rog sd ingéiduiti unui Moldovean de sei receati - pentru ed din nastere sunt 9S Oltean - sa ian cuvéintul in aceastis aduneve care sve de scop propasiree Tasului. ep2G Sunt aproape 25 de ani de cand sunt profesor la lasi - si fapt curios am rimas Fp Tesean. - Intr’un sfert de veac am putut sa-mi dau seama de lipsurile lasului si de puting ingrijire pe care lasul a avut de la centru - precum si de defectele legenilor. ~ De la inceput pot spune cé nu voi crufa nici nepasarea centrului, nici «lasi-ma sa te las» al lesenilor". Alexandru Slatineanu, 1936 mind in calltate de Profesor de Bacteriologie la Iasi, va mrturisesc cl m& | -ptam si gésese un laborator foarte modest dac& nu chiar in mizerie, ca gi targul in care se afl, ca si alte laboratoare ale facultatii noastre iegene. Spre plicuta mea surprindere gi cu orgoliul de specialist si de bun roman, am constatat ¢& ldboratorul a c&irul conducere am luat-o e mai bogat ca cel al cArui titular am r&mas inca in institutul Pasteur din Paris. Aparate moderne gi extrem de costisitoare, microsoapele cele mai bune din lume; instalatie cu peste 25 de mese cu fatdi de lava (gi care azi costé.in medie peste 20000 lei bucata)...0 estimatia preliminaré m-a facut s& prefuiesc intre 10 gi 20 milioane lei averea laboratorului de Bacteriologis.” Stefan 8. Nicolau agi 3 Nolembrie 1939, Adresa nr. 88, | Domnului Judecstor de Instructie al Cab. IIT Trib. Tagi ” Tovardse Pregedinte, | Subsemnatul dr. Gheorghiu loan, fost profesor agregat Facultatea de Medicing lasi,..la 18 mai 1950 ‘am fost arestat, cu mandatul nr 3425/1951, pentru faptul de uneltire, condamnat la 15 ani munca silnica...dm luat parte la toate campaniile 1913, 1916, 1919, 1921...concentrat si mobilizat din 1940- 1945...am instruit 33 promofii de studenji.. ered cdi nu mai este cazul si dau concurs ca medic entra un servic find medic primar din 1927 si ca profesor universitar sd tree concursul inaintea unei comisitformaud din medici care altddatd mi-au fost studenyi la examene...Mi s-a adus vina cf as Ji fost legionar sau simpatizant, insd autoritijile de anchetd, ca si cercetirile din inchisoare, de la Suceava, Aiud yi Gherla, nu au gasit nici un indiciu in aceasta acuzayie..u am fost amnistiat in 4 iumie 1964 La lupta pentru pace!” Joan Gheorghiu, primul colaborator de la Iasi si sef de lucréri al Profesorului Slatineanu, din Memoriul adresat Presedintelui Republicii Populare Romane | @ BD Sn lun ficusbiic lary saa ep lay to daa, wdrlos emf od A shiotods | Stag id mrdic; Ce ale fection cs hw parsl onyra nasee wee Mode do a pow Fhe Tag, refed dorifde tel foltubl Mepe ocse. stun7 es avenue Mases fapatas ire the autuc ter ed IN Mate diy fof mekle rubs - th wweties deg re Page Hepineeren. bey — Ces gl EMS cle 0 bead de Jag’ 4: pune Meclaaal c8 UP hiasstpest ca Retprke S$ aosten © curt Mjurfonks: i weeiper” Meyer ea (ulerss/ Sep lie pe Ton Alexa, apropiat colaborator al Profesorului Slitineanu, arestat dupa ce a condus cu | succes campania antimalaricé, 1947, din judepul Tulcea ‘am fost demis din toate functille de la lasi in 194?....acelasi Minister ma demitea lunar din functia de medic sef de laborator jar autoritayile locale ma menfineau $i apelau la experienta mea in cazuri de epidemii.” Constantin Bart, condamnat politic, apropiat colaborator al Profesorului Slétineanu, din Curriculum Vitae |Plange CAPITOLUL 1PLANSA 1.1 1.1 IMAGINI DIN ISTORIA MICROBIOLOGIEI 1 ANTONIUS VAN LEEUWENHOEK (1632-1723) mare microscopist olandez, a descoperit microorganismele. Nascut la Delft, a fost initial contabil la un magazin de textile din Amsterdam. in 1654 a revenit in oragul natal. Catre varsta de 40 de ani a invafat sa slefuiasca lentile gi a construit microscoape al c&ror secret de constructie nu I-a divulgat. A comunicat ins observatiile sale microscopice, printre care primele protozoare (1674) si bacterii (1675), Societiii Regale din Londra. A fost cel mai faimos si fecund corespondent al acestei societati stiintifice, care I-a ales membru in 1680. 2 Facsimil din Arcana naturae ope microscopiorum detecta, Delft 1695, o sinteza a scrisorilor publicate intre 1674-1676 in revista Philosophical Transactions. Pagina cu animaleulii observati de Leeuwenhoek. Pot fi recunoscuti in desen: A un bacil, B traseul unui bacil mobil (linia punctaté dintre C si D), E coci, F bacili polimorfi, G un spiril. in 1923 C. Dobell recunostea in aceste desene Leptothrix buccalis (F) si o specie dz Selenomonas (G). 3 LOUIS PASTEUR (1822-1895) genial chimist francez. Profesor de fizica la liceul din Dijon, de chimie la Universitatea din Strassbourg (1852), Decan al Facultafii de stiinfe din Lille (1854), Director de studii la Scoala Normala din Paris. A fondat stereochimia prin studiul izomerilor acidului tartric, Este pirintele microbiologiei experimentale prin demonstrarea corelajiei a variate fermentafii cu microorganisme vii definite, studiul cauzelor unor boli infectioase ale animalelor si omului. A dat solufii pentru prevenirea pierderilor determinate de perturbarea fermentatiilor vinului si berii. A descoperit vaccinurile atenuate contra holerei gainilor, antraxului, rujetului porcilor, rabiei. Economiile aduse prin aplicarea acestor descoperiri in industria bauturilor fermentate si zootehnie depaseau cele 5 miliarde de franci aur, datoria de rizboi a Franfei cAtre Prusia in 1870. Inestimabilé ramane insi contribufia pe care a adus-o la dezvoltarea medicinei si chirurgiei. La moartea sa, in 1895, Franfa a organizat funeralii nationale cu onoruri militare si a fost inmormantat intr-o somptuoasa cripta de la Institutul pe care il fondase savantul la Paris. 4 ROBERT KOCH (1843-1910) chirurg in razboiul franco-prusian din 1870. in 1872 era medic al plasei Wollstein din Prusia. A devenit al doilea parinte al microbiologiei prin studiile si descoperirile sale epocale asupra cauzei antraxului (1876), etiologiei infectilor posttraumatice (1878), prepararea mediilor solide pentru izolarea bacteriilor in culturi pure (1881), descoperirea bacilului tuberculozei (1882), a vibrionului holeric (1883), a tuberculinei (1890), studiile asupra pestei bovine si a bolii somnului in Africa (1896). Premiul Nobel pentru medicina (1905).| unquam fanguinem emittar, Nec tat funt puri, quin , ubi cos per fpecult tuerer, viderim crefcéntem inter de oe fy a > i fen . cer foe dig a me rir fromm a s pe ani ht —— fali — ore fem =ePLANSA 1.2 1.2 IMAGINI DIN ISTORIA MICROBIOLOGIEI 1 JOSEPH LISTER (1827-1912). Vestit chirurg englez, profesor de Chirurgie la Edinburgh (1869), la King’s College din Londra (1877). Parintele chirurgiei antiseptice (pe baza principiilor pasteuriene). Innobilat ca baron Lister (1902). 2 VICTOR BABES (1854-1926). Vestit anatomopatolog si bacteriolog romvin, fotografie din 1886 cind devenise cel mai tanar profesor al Facult&tii de medicin& din Budapesta. $i-a aprofundat studiile la profesorii Bollinger si Zimssen (Munchen), Amold (Heidelberg), Recklinghausen si Waldeyer (Strassbourg). intre 1882 si 1884 era la Paris in Institutul Pasteur si preparator al profesorului Victor Cornil impreun’ cu care a publicat primul tratat de bacteriologie din lume. A continzat cercetirile in laboratoarele lui Koch si Virchow la Berlin (1884-1886). Din 1888 a fost profesor de anatomie patologic’ si bacteriologie la Facultatea de medicina din Bucuresti. .Numele meu a sunat ca oricare alt nume strein necunoscut la urechile comesenilor. Dar cénd s'a zis ca sunt din Romédnia, am fost apostrofat scurt $i cuprinzator ~ ah! vous étes de Bucarest! Connaisez-vous le professeur Babes, l'un des grands renoms de la science moderne?” (relatare din Geneva intr-o scrisoare a lui Dimitrie A. Sturza, presedinte al Partidului liberal si viitor prim-ministru). 3 IOAN CANTACUZINO (1863-1934), fotografie din 1901 cand era numit profesor de Patologie experimentalé la Facultatea de medicina din Bucuresti. Descendent al Cantacuzinilor, care au dat Tarii Roménesti gi Moldovei domnitori, cirturari si mari dregatori Savant cu vasté cultura umanista. Studii la Paris: Liceul Louis le Grand (1881), licenfiat in filosofie (1885), in biologie (1889) si medicin (1894). Elev al lui Ilia Mecinikov. Profesor de morfologie animal la Facultatea de stiinte din Iasi (1894-1896). Reintors la Paris ca asistent al lui Ilia Mecinikov pani la numirea ca profesor la Facultatea de medicin& din Bucuresti. in 1918, la Spitalul militar francez din Iasi, era decorat cu Legiunea de Onoare france in grad de Comandor, ocazie cu care ministrul Maurice de Saint-Aulaire il numea ,Ambasador permanent al stiinjei si constiingei franceze in RomGnia”. A semnat in 1919, ca prim delegat al Romaniei, tratatul de pace de la Trianon, 4 ALEXANDRU SLATINEANU (1873-1939) fondator in 1912 a Catedrei de bacteriologie la Facultatea de medicind din Iasi. Licenfiat in chimie la Sorbona, extern al spitalelor din Paris si doctor in medicina (1901). Elev al lui Ilia Mecinikov. ,....2u a uitat exemplele de acasdi sau a strdbunilor ~ adica grija de cei multi obiditi. Daca strébunicul sé s-a silit sa traduc versurile lui Pietro Metastazio si chiar sii faci unele desene pe editia scoasci de el la Sibiu in 1797, nepotul s-a silit sd adune carti rare, stampe de Daumier $i felurite opere de arta. Dac& bunicul lui a fost printre pandurii lui Tudor Vladimirescu, doctorul Slétineanu se ocupa de farani $i muncitori pentru ca ei sa ducd o viafa mai omeneasca...nici doctorul, nici profesorul Slatineanu nu au avut 0 preferinfa pentru o problema, si mai pujin sii se anchilozeze intr-o disciplind a medicinei. El vedea medicina ca un tot, ca atare nu dicotomiza cazul clinic, de faptul experimental, va utiliza laboratorul ca i spitalul in acelasi scop $i pentru acelasi subiect si obiect: omul.” (Dr. Constantin Bart, ,care un timp a fost colaboratorul si, iar la boald I-a vegheat pant la obstescul sfarsit.” In memoriam, la centenarul Profesorului in 1973, undeva in fara, nu la Tasi)LISTA COLABORATORILOR (Catedra de Microbiologie, U.M.F. ,,Gr.T-Popa” Iasi) 1. DANIELA BOSNEA. 2. DUMITRU BUIUC 3. GABRIELA COMAN 4. MARIA DAN 5. OLIVIA DORNEANU 6. ROXANA FILIP 7. DRAGOS FLOREA 8. LUMINITA SMARAMDA IANCU 9. CARMEN PANZARU 10. IRINA POPOVIC 11. ANA VORNICU Sef de lucrari universitar, doctor mei Profesor universitar, doctor medic Profesor universitar, doctor medic Preparator universitar, medic Sef de lucrari universitar, doctor medie Sef de lucrari universitar, doctor medic Asistent universitar, medic Conferentiar universitar, doctor medic Conferentiar universitar, doctor medic Preparator universitar, medic Preparator universitar, medicPREFATA Omul, prin inteligenta sa, a modificat natura, in timp istoric, si continua si o modifice, tot ‘mai alert, pang la limitele echilibrului ecologic. Cum intr-un réstimp atat de scurt nu si-a putut modifica biologic propriul organism, a intrat in crizi de adaptare, manifestata printr-o patologie cu care este tot mai dur confruntat. Vezi evolutia morbiditatii prin tulburari psihice particulare crizei de adaptare, bolile cardiovasculare, cancerul si noua patologie infectioas S& ne limitam Ia aceasta din urma. In cursul celor 30 de ani trecuti de la prima editie a manualului au mai aparut 0 boala infectioasa care face ravagii, Sindromul Imunodeficientei Dobandite (SIDA) si 0 a doua boala infectioasa, Sindromul Acut Respirator Sever (SARS), prea recent pentru a-i aprecia potentialul evolutiv; au reaprut boli infectioase foarte grave, si agravate de context, ca tuberculoza, in general, si tuberculoza determinati de Mycobacterium tuberculosis multiplu rezistent la antibiotice, tuberculoza pacientilor cu SIDA; in conditiile pandemiei de SIDA si a utilizarii tot mai largi a imunosupresiei cunoastem acum potenfialul patogen a noi si noi microorganisme ,,nevinovate” cu numai 20 de ani in urma. Sub impactul mod brutale a ambientului am sirdcit si sérdcim fondul genetic al organismelor superioare, care dispar specie dup specie, nu insi si fondul genetic al microorganismelor — pe acesta, din contra, il dezvoltam. Numarul antibioticelor aparute numai in ultimii 25 de ani a crescut impresionant, dar mai impresionanti este viteza cu care icroorganismele dezvolta rezistenfA la aceste antibiotice, incét acum suntem confruntati cu leterminate de bacterii total rezistente. [ata numai céteva din motivele pentru care formarea medicilor (si nu numai a lor) trebuie regandits. Din aceste evenimente biologice si microbiologice traite de generafia mea, si care se vor amplifica in generafiile urmitoare, decurg modificarile apirute in prezenta edifie a manualului de Microbiologie Medical, pe care |-am dorit in continuare ghid in studiul si practica medicinei Am amplificat mult capitolele care privesc relafia microorganism — gazda si bazele ei, in primul rand genetica microbiand. Am incercat si expliciim mai clar ci, in confruntarea microorganisme — om, microorganismele prin maniera lor de ,,a face” au si loc (superorganismul bacterian planetar) si timp (evolueaz de aproape 3 miliarde de ani cu succesiuni de ordinul minutelor intre generafil) pe care noi, cu toatd inteligenta noastra rational, nu le aver. Privitor fa controlul infectiei am amplificat capitolul care trateaza bazele microbiologice ale antibioticoterapiei. Am consacrat un capitol distinct etiopatogeniei infectiei nosocomiale. Dupa ce am explicat potenfialul adaptativ si evolutiv al microorganismelor, urmeazi sublinierea consecintelor logice: sistemul imun stie sa se confrunte mai bine cu microorganismele decat oricare dintre substanjele pe care le-am inventat de 150 de ani incoace; s& revenim cu mai mare exigenfi la principiile pasteuriene ale antisepsiei prin agenji fizici, care omoard microorganismele si nu le permite si-si valorifice potenfialul genetic; si limitim la strictul necesar (ca loc si moment) utilizarea substanfelor antimicrobiene pentru cA acestea selectes: — vivariante rezistente; sa constientizam c& dezinfectantele gi insecticidele nu pot elimina matura, apa gi sipunul Am actualizat capitolele de microbiologie specials, Sper c& am ajuns la o prezentare mai clara a relagitlor clinica — laborator de microbiologie. in fine, dar nu in ultimul rand, am amplificat privirea retrospectiva si prospectiva a conexiunilor interdisciplinare ale microbiologiei pentru ci, cine nu cunoaste istoria riscd sci repete toate nenorocirile si este lipsit de valenfele educative ale exemplelor pozitive. Desigur, timpul studenfilor este limitat. De aceea am subliniat in text, prin caractere diferentiate, notiunile indispensabile de cele facultative, pentru moment, dar care pot fi consultate ulterior in raport cu nevoile. Nou este glosarul, util pentru accesul imediat la nofiuni Regindirea de aceasti manieri a rolului microbiologiei in formarea medicului si in practica medicald este un act temerar. De aceea suntem convinsi ed am avut si lipsuri, care pot fi inst depasite printr-o corespondenta colegial’ cu cititorii avizafi, arora le mulfumim anticipat. Dumitru Buiuc, lasi 2003 DIN PREFATA LA PRIMA EDITIE Cartea a fost conceputd ca un ghid pentru lucrarile practice de bacteriologie ale studenyilor din anul al [lI-lea al Facultafii de Medicina gi Pediatrie, intt-o epoca particularizata prin evidente mutatii in etiologia bolilor infectioase — interventia tot mai larg’ a bacteriilor conditionat patogene ~ iar experienga de trei decenii a antibioticoterapiei a amplificat scopurile diagnosticului microbiologic si a evidenfiat eroarea de a considera antibioticele ca panaceu in lupta contra infectiei. in materialul prezentat ne-am straduit si cuprindem de maniera comprehensiva toate aceste aspecte care ridica atitea probleme pentru medic, indiferent de specialitate, atat din punct de vedere diagnostic si terapeutic, cat si din perspectiva combaterii si profilaxiei infectiilor actnale. Pentru a usura munca studenfilor am plasat la sfarsitul capitolelor intrebari utile fixdrii cunostinfelor. Credem cf, reflecténd asupra rispunsurilor, studentul va sesiza mai usor esenta problemelor prezentate, Am folosit alte caractere pentru paragrafe sau subcapitole care cuprind aspecte facultative, dar utile infelegerii mai aprofundate a unor prevederi ale programei analitice. in masura in care studentii vor fi interesafi, si vor dispune de timp, vor putea parcurge gi aceste rinduri, Avem convingerea c& multe capitole vor putea fi revizute cu folos si de studentii ultimilor ani de studi Dumitru Buiue, lagi 1974 vuCUPRINS Lista planselor alb — negru Imagini color selectate si comentate: compact (Carmen Panzaru) isc (CD) anexa 1. Introducere in studiul microbiologiei (Dumitru T. Buiuc, Irina Popov’ 1.1. Definigii 1.2. Istoricu! microbiologiei 1.3. Lumea microorganismelor . Conexiuni interdisciplinare ale microbiologiei medicale Locul lui Babes i Cantacuzino in medicina roméneascd ‘Taxonomia microorganismelor Obiective instructionale ale microbiologiei medicale San 1 1 1 ie 2. Anatomia functionala a bacter 2.1. Protoplastul bacterian 2.2. Peretele bacterian 2.3. Straturile S 2.4, Glicocalixul procariot 2.5. Organitele de locomotie ale bacteriilor 2.6, Pilii bacterieni 2.7. Endosporii bacterieni 2.8. Microscopia uzuali lor (Dumitru T. Buiue, Maria Dan) 3. Nutrifia, metabolismul si cresterea bacter 3.1. Nutritia bacterian 3.2. Metabolismul bacterian 3.3. Cresterea bacteriilor 1 (Gabriela Coman) 4. Virusuri (Dumitru T. Buiuc, Dragos Florea) 4.1. Anatomia functional a virusurilor 4.2. Cultivarea virusurilor gi t 4.3, Replicarea virusurilor anit 4.4, Relatiile virus ~ celuld gazda 4.5. Taxonomie viral 4.6. Bacteriofagii 5. Genetica microbiand (Dumitru T. Buiue, Ana Vornicu) 5.1. Genetica bacteriilor 5.2. Genetica virusurilor 5.3. Genetica microbiana: de la cercetarea fundamentalé la inginerie XIV XIV 2 39 52 68 IxRelatiile microorganism — gazd umana (Du 6.1. Definirea relatilor gi particularititile lor 6.2. Colonizarea microbiand a omului. Microbiota indigend 6.3. Patogenitatea microorganismelor versus apararea antimicrobiand a gazdei, o istorie continua 6.4, Infectia u T. Buiue) 84 7. Controlul infectiei 112 7.1, Bazele microbiologice ale profilaxiei infectiei (Dumitru T. Buiuc, Ana Vornicu) 7.2. Actiunea agentilor fizici si chimici asupra microorganismelor (Gabriela Coman) 7.3. Agenti terapeutici antimicrobieni (Gabriela Coman) 8. Stafilococii (Luminifa Smaranda lancu) 154 8.1. Stafilococii coagulaza-pozitivi 8.2. Stafilococii coagulaza-negativi 9. Streptococii si enterococii (Carmen Panzaru) 161 9.1. Genul Streptococcus 9.2. Enterococcus 10. Neisseriile si moraxelele (Olivia Dorneanu) 173 10.1. Neisseria 10.2. Moraxella 11. Enterobacteriaceele (Gabriela Coman) 181 11.1, Catactere generale 11.2. Genuri care includ speci cu patogenitate primara 11.2.1, Genul Escherichia 11.2.2. Genul Shigella 11.2.3. Genul Salmonella 11.2.4. Genul Yersinia 11.3. Genuri care includ specii oportuniste 11.3.1, Genurile Klebsiella, Enterobacter, Serratia 11.3.2. Genurile Proteus, Morganella, Providencia 11.3.3. Genul Citrobacter 12. Vibrioni, Spirili si bacterii inrudite 197 12.1, Familia Vibrionaceae (Roxana Filip) 12.2. Spirili ( Olivia Dorneanu ) 13. Pseudomonade, acinetobacterii si alfi bacili gram-negativi 206 (Roxana Filip) 13.1. Pseudomonas aeruginosa 13.2. Alte pseudomonade cu interes medical 13.3. Genul Acinetobacter 13.4. Genurile Flavobacterium $i Alcaligenes 14, Cocobacili gram-negativi (Roxana Filip) 212 14.1. Genul Haemophilus x - a14.2. Grupul bacterian HACEK 143. Gardnerella vaginalis 14.4, Genul Bordetella 14.5. Genul Brucella 14.6. Genul Pasteurella 14.7. Francisella tularensis 15. Legionele (Roxana Filip) 16. Bacili gram-pozitivi nesporulati (Daniels Bosnea) 16.1. Bacterii corineforme 16.2. Genul Listeria 16.3. Ensipelothrix rhusiopathiae 17. Bacili gram-pozi 17.1. Genul Bacillus 17.2. Genul Clostridium sporulati (Daniela Bosnea) 18. Bacteriile anaerobe nesporulate (Daniela Bosnea) 18.1, Privire general 18.2. Bacterii anaerobe nesporulate cu interes medical 19. Micobacteriile (Olivia Dorneanu) 19.1. Bacilii tuberculozei 19.2. Micobacteriile atipice 19.3, Mycobacterium leprae 20. Spirochetele (Olivia Dorneanu) 20.1. Genul Treponema 20.2. Genul Borrelia 20.3. Genul Leptospira 21, Micoplasmele (Olivia Dorneanu) 20.1. Mycoplasma pneumoniae 20.2. Micoplasmele genitale 22. Genul Bartonella (Dumitru T. Buiue) 23. Familia Rickettsiaceae (Dumitru T. Buiuc) 23.1. Rickettsia 23.2. Coxiella 23.3. Ehrlichia 24.1. Genul Chlamydia 24.2. Genul Chiamydophila 25. Picornavirusurile (Luminita Smaranda lancu) 25.1. Caractere generale 224 227 235 245 261 272 276 278 285 290 XI25.2. Enterovirusurile 25.3. Rinovirusurile 26. Reovirusurile si alte virusuri diareigene.(Dumitru T. Buiuc) 27, Orthomixovirusurile (Luminita Smaranda Iancu) 28. Paramixovirusuri, Virusul rubeolei si Coronavirusuri 28.1. Familia Paramyxoviridae (Luminita Smaranda Tancu) 28.2. Virusul rubeclei si alte virusuri teratogene (Dumitru T. Buiuc) 28.3. Familia Coronaviridae (Dumitru T. Buiuc) 29. Virusul rabic (Luminita Smaranda lancu) 30, Parvovirusurile (Dumitru T.Buiuc) 30.1. Virusul Bis 30.2. Dependovirusurile umane 31, Adenovirusurile (Luminita Smaranda [ancu) 32. Herpesvirusurile (Luminita Smaranda Iancu) 32.1. Caractere generale 32.2. Virusurile Herpes-Simplex (VHS) 32.3. Virusul Varicela~Zoster (VVZ) 324, Virusul citomegalic (VCM) 32.5. Virusul Epstein-Barr (VEB) 32.6. Alte herpesvirusuri umane 33. Poxvirusurile (Dumitru T.Buiue) 33.1. Virusul variolei 33.2. Alte poxvirusuri 34. Arbovirusuri si Robovirusuri (Luminita Smaranda Lancu) 34.1, Generalitati 34,2. Patogenitate naturala si patogenez’ 34.3. Diagnosticul de laborator 35. Virusurile hepatitei (Luminit 35.1. Virusul hepatitei A 35.2. Virusul hepatitei E 35.3. Virusul hepatitei B 35.4. Virusul hepatitei D 35.5. Virusul hepatitei C Smaranda Iancu) 36. Retrovirusurile si SIDA (Luminita Smaranda Iancu) 36.1. Generalitati 36.2. Virusul imonodeficientei umane 37. Oncogeneza viral (Dumitru T. Buiue, Dragos Florea) xn —— 296 298 302 310 313 315 318 327 333 340 34737.1. Generalitati 37.2, Virusurile tumorale ARN 37.3. Virusurile tumorale ADN 38, Prionii (Dumitru T. Buiue) 39. Diagnosticul de laborator al infectiei (Dumitru T. Buiue) 39.1. Erori gi variatii in investigatia microbiologic’ clinica 39.2. Performanjele testelor de laborator si relatia cost-beneficiu 39,3. Metodele microbiologiei clinice 40. Hemocultura in diagnosticul infectiei (Carmen Panzaru) + 41, Examenul lichidului cefalorahidian in diagnosticul + infectiilor sistemului nervos central (Olivia Dorneanu) 42, Examenul microbiologic al puroiului (Carmen Panzaru) -¥ 43. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior (Carmen Panzaru) 44, Diagnosticul de laborator al infectiilor respiratorii subglotice “ (Dumitru T. Buiuc) 45. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului urinar * (Carmen Panzaru) 46. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital * (Gabriela Coman) 47. Diagnosticul iafectiilor perinatale (Carmen Panzaru) 48, Examenul microbiologic in sindromul diareic infectios (Carmen Panzaru) 49. Investigatia etiologic in toxiinfectiile alimentare (Ana Vornicu) 50. Infectia nosocomial& (Dumitru T. Buiuc, Ana Vornicu) Glosar (Ana Vornicu) Bibliografia Index alfabetic (Dragos Florea) 353 356 372 378 383 387 393 398 406 414 418 423 429 439 476 480 XULISTA PLANSELOR ALB-NEGRU Dupa pagina 20 1.1 Imagini din istoria microbiologiei 1.2 Imagini din istoria microbiologiei 1.3 Imagini din istoria microbiologiei Dupa pagina 38 2.1 Anatomia functionala a bacteriilor 2.2 Anatomia functionala a hacteriilor 2.3 Anatomia furictionala a bacteriilor st notiuni de microscopic Dupé pagina 67 4.1 Anatomia funcfionala a virusurilor 4.2 Culturi celulare gi efecte citopatice determinate de virusuri 4.3 Eefecte citopatice determinate de virusuri 4.4 Efecte citopatice determinate de virusuri. Replicarea viral 4.5 Ciclul replicativ al bacteriofagilor, tipuri de bacteriofagi 4.6 Lizotipia Dupa pagina 83 5. Transpozitia gi conjugarea bacteriand 6.1 Colonizarea bacteriané normalé a invelisurilor; apararea antiinfectioasa a epiteliului respirator; efectul bacteriolitic al complementului LISTA IMAGINILOR COLOR ce apar pe compact discul anexat volumului la cerere 2-1. Coloratia Gram. 2-2. Controlul de calitate a coloratiei Gram. 2-3. Coloratia Ziehl-Neelsen. 3-1. Cresterea satelita a Haemophilus influenzae in jurul striei de cultura a Staphylococcus aureus. 7-1. Testul biologic de control al sterifizarii la autoclav, 7-2. Detectarea rapida a B-lactamazelor prin testul cu nitrocefin 8-1. Staphylococcus aureus, frotiu din puroi. 8.2. Staphylococcus aureus, frotiu din cultura. 8-3, Stafilococi in cultura pe geloza-singe. Staphylococcus aureus, coloniile mari galben-aurii si cu [-hemoliza; S.epidermidis. cotoniile mici albe, nehemolitice. XIV —8-4, Infecfii stafilococice — furuncul al cefei. 8-5. Infectii stafilococice — sindromul pielii opatrite. 9-1. Cultura pe gelozi-singe a unui streptococ B-hemoiitic: Streptococcus pyogenes. 9-1 bis. Tipurile de colonii ale S. pyogenes. 9-2. Cultura pe gelozi-sange a unui strepiococ a-hemolitic: streptococ viridans. 9-3, Frotiu din cultura de Streptococcus pyogenes . 9-4, Infectii streptococice — impetigo. 9-5, Frotiu din puroi: Streptococcus pyogenes. 9-6. Testul sensibilitatii la bacitracina si la cotrimoxazol: streptococ de grup A. 9-7. Testul sensibilitafii la bacitracina i la cotrimoxazol: streptococ non-grup A. 9-8, Testul CAMP: streptococ grup B. 9-9. Streptococcus pneumoniae: a-hemoliz8 pe gelozi-singe 9-10. Streptococcus pneumoniae. Colonii in curs de autoliza pe gelozd-singe (detaliu). 9-11, Scorul de calitate al sputei. Sputd Q = +3. 9-12. Streptococcus pneumoniae pe frotiu din sputa unui bolnav cu pneumonie. 9-13. Sput& cu scorul Q = 0. 9-14. Celule epiteliale scuamoase (CES) cu sroorganisme de contaminare, Q <1. 9-15. Streptococcus pneumoniae, testul sensibilitatii la optochin. 9-16. Streptococcus pneumoniae, depistarea polizaharidului capsular prin latexaglutinare. 10-1, Frotiu din puroi uretral colorafie cu albastru de metilen: gonococi. 10-2, Frotiu din sediment LCR colorafie Gram: meningococi. 10-3. Meningita meningococica — zone de necroza si petesii. 10-4, Meningococcemie — eruptie hemoragica. 11-1. Enterobacteriaceae (Escherichia coli) frotiu din cultura, coloratie Gram. L1-2. Klebsiella pneumoniae, amprenta de splina colorati Gram. 11-3. Klebsiella pneumoniae, cultura pe mediul MacConkey. 11-4, Proteus, cultivarea sub forma valurilor concentrice. ~ xv11-5, Enterobacteriaceae, cultura pe mediul MacConkey. 11-6. Coprocultura pe mediul Hektoen. 11-7, Aspectul microscopic al culturii de celule HEp-2 inoculata cu £, coli enteropatogen. 11-8. Aspectul microscopic al culturii de celule HEp-2 inoculata eu E. coli enteroagregativ. 11-9, Aspectul microscopic al culturii de celule HEp-2 inoculata eu £. coli aderent difuz. 11-10. Bubon pestos. 11-11. Yersinia pestis aspirat din bubon coloratia Leishman. 11-11 bis, Yersinia pestis aspirat din bubon coloratia Gram. 11-12. Cultura de Proteus: fenomenul Dienes. 12-1. Campylobacter jejuni fratiu din scaun diareic, coloratia cu albastru de metilen, 12-2. Helicobacter pylori frotiu din biopsie gastrica, coloratia Gram. 12-3. Helicobacter pylori testul ureazei cu fragment biopsic din mucoasa gastrica. 13-1. Pseudomonas aeruginosa frotiu din cultura, coloratie Gram. 13-2. Pseudomonas aeruginosa cultura pe gelozA nutritiva. 13-3, Pseudomonas aeruginosa culturi pe gelozi-singe. 14-1. Frotiu din sputd colorat Gram: Haemohpilus influenzae. 14-2, Frotiu din sputa: Haemohpilus influenzae (alb-negru). 16-1. Corynebacterium diphtheriae frotiu din cultura pe mediul Loeffler, coloratie Gram. 16-2. Corynebacterium diphtheriae cultura pe mediul Tinsdale (1/1). 16-3. Difterie: aspectul faringelui cu prezenta falselor membrane. 16-4. Difterie: desen al falselor membrane. 16-5. Difterie: tumefactia gatului 16-6, Listeria monocytogenes frotiu din cultur’. 16-7. Listeria monocytogenes cultura pe gelozi-singe de 72 ore (1/1). 16-8. Listeria monocytogenes cultura pe geloza-singe de 24 ore (detaliu, 3X). 16-9. Listeria monocytogenes culturd de 24 ore pe mediul selectiv PALCAM (1/1) XVI -17-1. Bacillus anthracis amprenta din splina de soarece, colorati cu albastru de metiten policrom. 17-2. Bacillus anthracis frotiu din cultura 17-3. Bacillus anthracis cultura de 24 ore pe gelozi nutritiva (1/1). 17-4, Bacillus anthracis cultura de 24 ore pe gelozi nutritiva (detaliu, 3X). 17-5. Bacillus anthracis cultura de 24 ore pe gelozi-sange. Comparativ cx B.cereus (1/1). 17-6. Bacillus anthracis cultura pe geloz#-singe de 24 ore (detaliu 3X). 17-7. C&rbune cutanat forma buloasa. 17-8. Carbune cutanat leziune necrotic’. 17-9, Bacillus cereus producere de lecitinazs. 17-10, Clostridie cu spori ovali subterminal, frotiu din cultura. 17-11. Clostridium éetani frotiu din cultura. 17-12. Clostridium perfringens frotiu din cultur’. 17-13. Clostridium tetani cultura pe gelozi-singe. 17-14. Clostridium perfringens cultura pe gelozi-singe 17-15. Clostridii, cultur’ fr cofoani de gelozi moale in tub Weinberg. 17-6. Clostridium perfringens testul de neutralizare a a. toxine. 18-1. Actinomyces frotiu din cultura colorat Gram. 18-2. Actinomicoza: ,granule de sult”, 18-3. Prevotella melaninogenica, Bacteroides, Fusobacterium cultura de 5 zile pe mediul Witkins-Chalgren (detaliu, 4X). 18-4, Angina Vincent, examen microscopic: asociatia fusospirilard. 19-1. Mycobacterium tuberculosis frotiu din sput& coloratia Zichl-Neelsen. 19-2, Mycobacterium tuberculosis agezarea in corzi. 19-3. Mycobacterium tuberculosis cultur’ de 4 siptamani pe mediul Lowestein Jensen. 19-4, Micobacterii fotocromogene: cultura pe mediul Lowestein Jensen de 3 siptimani: a. M. marinum b. M. kansasii c. M. simiae - — - XVII19-5, Micobacterii scotocromogene: cultura pe mediul Lowestein Jensen de 2 siptimani. a. M. gordonae b. M. flavescens 19-6. Micobacterii cu crestere rapida: cultura pe mediul Lowestein-Jensen. Primele colonii observate dupa 6 zile. Fotografiile culturilor in varsta de 8 zile. a. M, chelonae b. M fortuitum 19-7. Mycobacterium leprae frotiu din raclatul unei leziuni ulcerate, colorafie Zichl~ Neelsen motificaté. Globi leprosi. 19-8. Lepr tuberculoida. 19-9. Lepr lepromatoasi, 19-9 bis, Lepra lepromatoasti: facies leonin. 20-1. Treponema pallidum, microscopie pe fond negru din exsudatul unui sancru sifilitic. 20-2. $ancru sifilitic al penisului. 20-3. Leziuni eruptive ale sifilisului secundar. 20-4, Sifilis terfiar: goma. 20-5. Pian: sancru de inoculare. 20-6. Borrelia recurentis frotiu din sange in cursul unui acces febril, coloratie Giemsa. 20-7. Leptospira: microscopie pe fond negru. 21-1. Mycoplasma pneumoniae, proteina P; si functia de adezina. 21-1 bis. Mycoplasma pneumoniae, proteina P; si functia de adezin’. 28-1. Rujeola: aspectul eruptiei. 32-1. Herpes labial. 32-2. Herpes genital. 32-3. Varicela: eruptia. 32-4, Herpes zoster. 40-1. Hemocultur’ in mediu difazic. XVIIIINTRODUCERE IN STUDIUL MICROBIOLOGIEI 1 DUMITRU T. BUIU IRINA POPOVICL win domeniul stinelor de observayie intémplarea ‘mu favorizeazt decat spiritele pregatite. LOUIS PASTEUR Ag veeea mult mai bine gridina, isi spuse Alice, dlacd as putea si ajung in varful coline: $i exist o ctrare.. Dar ce cotituri ciudate face!” LEWIS CARROL 1.1, DEFINITIL Microbiologia este un ansamblu de discipline experimentale care studiazit microorganismele si activitatile lor Microorganismele pot fi observate numai prin microscoape. Prima dati au fost vazute de olandezu! Antonius van Leeuwenhoek (planga 1.1,1). Excelent observator, Leeuwenhoek a studiat, cu microscoapele pe care si le construia, lumea cuprinsa in picaturi de saliva, sange, suspensie a propriilor fecale, de must al beri, apa de rau, infuzii de piper. Incepand cu 1673 a comunicat Societatii Regale din Londra observatiile sale in peste 200 de scrisori, din care multe semnaleazi existena unor minuscule formatiuni animate de migcéri, motiv pentru care Je-a numit animateuli (plansa 1.1,2). Prin comparatie cu hematiile, cu grauntele de nisip etc., a masurat animaleziii si preciza c& uni ,sunt de o mie de ori mai mici decdt ochiul unui purice”. in desenele lui Leeuwenhoek identificam ast&zi protozoare, bacterii si levuri Activititile microorganismelor — in esenfi nutritia, metabolismul, cresterea si inmultirea — au fost studiate abia din secolul XIX. Dar efecte ale acestor activitati erau cunoscute ined din preistorie si apar consemnate in texte antice. Pragmatici, stramosii nostri cAutau mai ales si le obtind (e.g., fermentatiile implicate in acrirea laptelui si prepararea branzeturilor, transformarea mustzlui de struguri in vin, dospirea aluatului pentru paine) ori s& le evite (e.g., bolile contagioase). Doar filosofi, poeti ori medici reflectau asupra cauzelor posibiie, fara a depasi stadiul de simple ipoteze, 1.2. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Nu cunoastem bine 0 sting dacit me it cunoastem istoria.” AUGUSTE COMTE Fermentafiile si putrefactia. Sacerdojii egipteni imbalsamav cadavre eviscerate pentru a intarzia utrefactia, pe care o eredeau cauzatt de un spirit din intestin. Biblia consemneaza: ,Atunci a inceput Noe sa fie lucritor de pamdnt si a sddit vie, A baut vin si, imbeidndu-se, s-a dezvelit in cornil sau.” (Geneza 9: 20, 21). Cuttul elenie al lui Dionysos era legat de efectul euforizant al vinului. Desi fierberea, spumarea mustului si cldura degajata in cursul vinificatiei erau stiute de mult, abia in secolele X-XI alchimigti, prin distilarea Vinului, au identificat alcoolul ca principiu eutorizant al bauturilor spirtoase. au ravagii, incat cauza lor era consideral a fl nde zerlor”. Dar Hippocratc - 1Introducere in microbiologie (460-377 a. Chr), medic din Cos, cauta cauza acestor boli in aer, apf, sol gi afirma c& miasmele ~ gaze putride care provin din alterarea resturilor animale sau vegetale pe cale de descompunere si transportate in aer, mai ales fn caldura umeda ~ transmit bolile contagioase. Poetul roman Titus Lucretius Carus (98-55 a. Chr.) explica aparitia pestei prin ,germenti boli si ai mort”. Microbiologia, sind experimental, a aptrut cénd savangii au demonstrat c& animalculi sunt cei care provoaci putrefactia, fermentafi ori boli. Metodee gi facilitiile de studiu au fost imaginate abia pe pareursul a douk secole de dispute savante in jurul a dous ipoteze: ipoteza heterogeniei, animalculii se nase spontan din materia organic in putrefactic sau fermentafie, si cea a germenilor drept cauza de boald. A mai existat un impuls al cercetirilor care au dus, incepénd cu anii 1860, la nagterea microbiologiei: crize industriale si eriza chirurgiei Céteva decenii dupa revolujia industrial au intrat in impas industria bauturilor fermentate (bolile vinului ori cea 8 matisii (bolile viermilor de matasc). Chirurgia, revolujionaté de introducerea anesteziei generale cu eter (William G. Morton, 1846), era in crizi din cauza mortalitiii post-operatorii de peste 60% dupa marile amputafii, o mortalitate aseménatoare cu cea din maternitajile vremii. ‘Glsuie indatt gi-izice lui Tes. ‘Eu mei-narmez si mii dc, dar foarte mi-e-n grija de una: Cét of fi ew la rizboi, & mu dea de mort si sa intre ‘Mustele-n ranele-i pricinuite de suliti, sé nasca Viermi rozitor si sivl facd batjocurd, schimonosindel Trupul de viata lipst i putred s-ajungé cu totul Zina picioare-de-argint aga lui Achile-i raspunse: «Eu am sé-l apar pe el de necrufatoarele goange.»” ILIADA XIX: 23-27 Infirmarea ipotezei heterogeniei. Accasts ipotezA era varianté a ,teoriei generatiei spontane”. Aristote! (384-322 a. Chr.) credea cd anghilele se nase spontan din nmol. Francesco Redi (1626-1697) a infirmat ipoteza aritnd cA este suficient si protejezi, printr-o bucata de pan2i, camea dintr-un vas de accesul mustelor pentru a impiedica aparitia viermilor. Deci viermii se nasc nu spontan, ci din ouale mustelor. Desi Leeuwenhoek considera c& animatculi provin din aerul unde ei exist ca ,.germeni” ori ,seminje”, naturalistul francez Georges Louis de Buffon (1707-1788) si abatele englez John Needham (1713-1781) susfineau c& moleculele inerte din lichidele organice se pot grupa pentru a forma animatculi, Aceasta era ipoteza heterogeniei: c& animalculi se nase spontan in lichidele organice. Italianul Lazaro Spallanzani (1729-1799) a publicat in 1765 un memoriu in care demonstra cd bulionul de came limpede si fiert se tulbura in teva ile, cu aparitia de animaicull, act era Kisat in contact cu aerul, dar Fiménea indefinit limpede iar animalculi nu apdreau cind era menfinut in balon ermetic. inchis. Contraargumentul lui Needham, c& animalculi apar numai la contactul bulionului cu aer proaspat, a fost combatut de germanii Theodor Schwann si Franz Schultze (1810) apoi de Theodor von Dusch si Heinrich Schroder (1854), Schwann gi Schultze au atras in balonul cu bulion fiert aertrecut printr-o spiral& infierbantata (fig.1-1A). Bulionul rimanea limpede. Ca inealzirea nu denatureaz& capacitatea de a genera animalculi a aerului au demonstrat-o von Dusch si Sehréder, care au atras in balonul cu bulion aer trecut printr-un filtre de vata (Bg. 1-1B), ® Scurgerealichidului Bullon 8 Scurgere creeaz’ Bulla ereeagi presiune ste resume negativa. seri negativd in sister insistem Fig 1-1 Dispozitive pentru sterilizarea aerului in experimentele care au discreditat ipoteza heterogeniei: A experimentul lui Schwann si Schultze, B experimentul lui von Dusch si Schréderfn 1836 disputa trecea din laborator in practica fermentatilor Louis Joseph Gay Lussac formulase deja ccuatia fermentajci alcootice (1810) dupa primele determinari cantitative ficute de Antoine Laurent de Lavoisier (1789). Acum. inginerul francez Charles Cagniard-Latour (1777-1859) sernnala c mustul in fermentare confine globule similare cu cele din drojdia de bere si sustinea c& sunt organisme vii, care se inmuljese prin inmugurire iar rezultatul activitatii lor vitale este transformarea glucozei in alcool gi COs, Le considera plante penta c& exau imobile, dar nu preciza cum apireau, Pentru unii erau simple precipitate albuminoase care catalizeazA fermentajia, pentru alti fiinje vii, dar nu cauza, ci efect al fermentafiei. in anii 1850 industria francezé a vinului_ intra in impas ameninjator din cauza unor pertarbri_ ale fermentarii mustului. Brau ,bolile vinului” boaia ingrosarit (vinuri filante, uleioase), boala amararii etc. Tocmai atunci un chimist genial, Louis Pasteur (planga {.1,3) studia fermentajia alcoolic’, descoperea fermentatia factic8, butiric gi aceticd. El preciza cf fiecare dintre noile fermentatii era cauzati de fermenfi torfologic diferiji de cei ai pig 1-2 Balonul cu gat de lebada ferment! skooice, i eA fermentatis but, spe dosebite de imaginat de Pasteur infiema! celelalte, are loc numai in absenja oxigenului, A mai constatat ¢& levura fare fermenteaza berea este facultativ anaeroba gi, pomind de aici, q POte?A heterogenied deseris efectul Pasteur, cunoscut de voi end afi studiat metabolismul glucozei. Pasteur a imaginat in 1861 balonul cu gat de lebdda (fig.1-2) in care acrul avea acces direct, dar mustul riménea limpede pentru c& fermenfii din aer erau opriti in meandrele tubutui care prelungea gatul balonului. Era suficient ca, printr-un tub lateral astupat cu vata si folosind o pipett capilara, s4 introducd in balon o picdtura de must in fierbere pentru ca fermentatia s& inceapa si in mustul limpede, Nu acclasi lucru se intimpla cénd introducea 0 picatura de suc aspirat din boabe ale unui ciorchine crescut i copt intr-un cilindru de sticl& astupat cu vatd la ambele capt. Studiile facute I-su convins pe Pasteur ca bolile vinului si berii apar prin contaminarea mustului cu alte microorganisme decat levurile (fermentii) normale i e& pot fi prevenite prin incalzirea acestor bauturi la 50° 60°C urmatt de racire brusci, procedeu utilizat si astizi, la scard industriala, si cunoscut sub qumele de pasteurizare. Pastcur si-a sintetizat observatiile din experimentele privind fermentatile in cinei memorii ramase celebre: ,Fermentatile” (1857-1863), ,Generafille zise spontane” (1860-1866), ,Studii asupra ofetului” (1861), Studi asupra vinului” (1866), Studi supra berei” (1876). Heterogenia era de acum o simpli ipotezi parfindnd istoriei Confirmarea teoriei germenilor. in 1762 Antonius von Plenciz (1705-1786) relua o idee mai veche a medicului italian Girolamo Fracastoro (1468-1553), aceea c& anumii germeni (agenti vii, seminaria morbi in conceptia lui Fracastoro) produc anumite boli Din primele decenii ale secolului XIX dateaz4 observatii c& injectarea de puroi Ia animale determina infectii aseminatoare celor umane: abcese diseminate, infectia putrida a sfngelui (septicemie). Chiar Pasteur se referea la aceste boli cu termenul de fermentafii putride. fn 1837 italianul Agostino Bassi (1773-1856) demonstra ci! muscardina, o boali contagioasd. a Viermilor de matase, era determinaté de un fung num, mai térziu, in onoarea sa Botrytis bassiana. Dupa 30 de ani Pasteur studia alte dou boli contagioase aie viermilor de matase,flageria gi pebrina, care produceau pierderi mari creseatorilor de viermi sf industriei matdsit din Franja. int-un voluminos memoriu, ,Studit asupra bolii viermilor de mate” (1870), recomanda masuri pentru prevenirea si combaterea acestor boli. La mijlocul secolului XIX, o boald contagioas8, mortal, a vitelor facea ravagii in turme gi cirezi. in 1850 Pierre Frangois Rayer si Casimir-Joseph Davaine descoperiser, micrascopic, in singele animalelor moarte prin antrax niste filamente pe care le considerau cauza bolii pentru ci un asemenea singe injectat la animale slinatoase le imbolnivea. Au fost dispute: filamentele observate in singe erau cauza sau efectut antraxului? Acestor controverse le-au pus capat studiile lui Pasteur, dar mai ales ale lui Robert Koch (plansa 1.1.4). La acea ‘vreme Koch era un tinar medic in plasa Wollstein din Prusia. El observa fa mieroscop microorganisme pe care le cultiva in picdturi suspendate de ser sanguin (cum este sugerat in fig.1-3). Intr-o asemenea picaturd a depus 0 infim cantitate din séngele unui animal mort de antrax iar in alta picdturé din séngele unui animal sintos, Dupa tun timp, microscopul i-aarétat aparitia filamentelor in prima picatura si absenja lor ina dova. A injectat cele ddoua picdturi ia animale difeite. Animalulinjectat cu serul in care aparusera filamente s-a imbolnavit de antrax sia murit, celalalt a rdmas santos. Animalele injectate cu alte microorganisme asemndtoare morfologie cu cel care determina antraxul (e.g, microorganisme din infuzia de fan) fie c& ficeau alte boi, fie nu se fmbolnaveau, Rezultatele acestor experimente au fost publicate in 1876 intr-un memoriu devenitIntroducere in microbiologie — istoric. Din acest memoriu au fost deduse cele trei postulate ale Ivi Koch, care findamenteaz’ experimental teoria germenilor gi stau la baza diagnosticului etiologic al bolilor infectioase: (1) Microorganismul trebuie si se gaseasca la tofi bolnavii suferind de o anumiti boala tioasd, distribuit in corpul bolnavilor in raport cu leziunile observate. (2) Microorgenismul trebuie izolat din corpul botnavului si menfinut in culturi pure mai multe generatii (3) Cultura purd inoculata la un animal receptiv trebuie s& determine boala tipica, Disputele privind heterogenia si teoria germenilor ne-au lsat primele metode si tehnici pentru studiul microorganismelor gi activitatilor acestora: « primul mediu de cultivare A Fig 1-3. Picatura suspendata de ser sanguin in care Koch a izolat Lamela~ Ulei de" Ser 'Godeu Lama bacteridia cirbunoas’ din singele parafing sanguin unui animal bolnay de antrax iar cu bacteridia izolat’ a indus experimental boala. Astfel a fost confirmata teoria germenitor. (bulionul de came), © modalitatea macroscopic’ de urmarire a cultivarii (tulburarea bulionului), © primele metode de sterilizare (prin caldurd si prin filtrare). ¢ importanta metoda de conservare (pasteurizarea), « un instrument pentru manipularea microorganismelor (pipeta capilara Pasteur), ¢ primele metode pentru studiul metabolismului mticroorganismelor (diferitele fermentafii), © un principiu al asepsiei (manipularea la adpost de pulberile din aer). Aceste metode $i tehnici au fost dezvoltate ulterior in scolile lui Pasteur $i Koch (tabelul 1-1), Repere semantice. Microorganismele au purtat nume diferite de-a lungul vremii, in raport cu cunostinfele asupra lor: miasme, germeni, animalculi, fermengi etc. Numele de ‘microb a fost inventat de un chirurg, Charles Sédillot (1804~1883), care I-a folosit prima data in 1878 in comunicarea ,,Despre influenja lucrérifor D-lui Pasteur asupra dezvoltarii chirurgiei” prezentata Academiei de Stiinfe din Paris. Desi acceptat de filologi, termenul de microb nu a patruns in mediul academic si raméne doar de uz. comun. Termenul stiinfific este cel de microorganism. Numai ocazional mai este utilizat, cu tent& de arhaism, numele de germen. 1.3. LUMEA MICROORGANISMELOR Lumea microorganismelor este vasti, divers’ si am cunoscut-o pe masura perfectionarii metodelor de studiu. Diferentiem microorganisme celulare si microorganisme acelulare, (1) Microorganismele celulare includ protozoarele, fungi microscopici, bacterile, algele albastre sau cianobacteriile. Au, in general, toate cele trei atribute ale viepii: flex material, flux energetic si flux informational, 4 -Tabelul 1-1 © cronologie a dezvoltarii tehnicilor microbiologice 1673 su. A. van LEEUWENHOEK 1867 L. SPALLANZANI 1854 T. von DUSCH gi H. SCHRODER, 1850 P-F.RAYER $i C. J. DAVAINE 1860-1864 L. PASTEUR 1876 R. KOCH 1876 L. PASTEUR 1877 R.KOCH 1877 L. PASTEUR gi CH. CHAMBERLAND 1877 JOHN TYNDALL. 1878 JOSEPH LISTER 188) J, TYNDALL 1881 _R.KOCH si G.WOLFFHUGEL 1882 R. KOCH 1883 CH, CHAMBERLAND. 1884 CHRISTIAN GRAM 1887 RICHARD JULIUS PETRI 1892_D. IVANOWSKI Lumea microorganismelor mentare ‘Construieste microscoape cu aberafiile lentilelor corectate si, folosind tehnici originale de iluminare, observa primul microorganisme. Prima argumentare ci aerul vehiculeaza germeni vitali in lichide putrescibile. Bulionul de came incalzt convenabil in recipiente ermetic inchise rmane indefinit limpede: primul experiment care implica actiunea cAldurii supra vitalititii microorganismelor si prima ‘manipulare aseptic (Ia adapost de mieroorganisme). Reiau experimentul tui Spallanzani. Pentru a nu inchide ermetic recipientul cu bulion fiert, imagineazA primele dispozitive de decontaminare a aerului: un tub spiralat si incalzit in flaciré. si respectiv un filtru din vaté prin care aerul are acces spre bulionul fiert. Observa bacteridia cirbunoasi sub forma unor filamente in singele animalelor bolnave de antrax. Imagineaza balonul cu gat de lebdidd, care decontamineazd aerul prin sedimentarea pulberlor in meandrele tubului efilat care continua gatul balonulu. in contact cu un asemenea aer, mustul de struguri sau ‘bufionul de carne fierte rman limpezi, Pipeta capilart Pasteur. ‘Memorial privind izolarea si cultivarea in vitro a bacteridiei clrbunoase cu care determina antraxul experimental, Baza postulatelor lui Koch. Conservarea prin pasteurizare. Tehnici de fixare si colorare a bacteriilor. Sterilizarea prin cildura umeda sub presiune (autoclavarea), Argumentul decisiv e& pulberile transmit microorganisme: bulionul de carne fiert si limpede expus la aer in tuburi deschise intr-o camera obscuri imaine limpede dacin cameré nu se observa fenomenal Tyndall (absenta pulberfor) dar se tulburd dupé ce fenomenul este produs prin introducerea in camera a unei pulberi (fig. 1-8); baza experimental a asepsie. Izolatea bacteriilor lactice prin dilufi seriate in mediu lichi. Constaté termorezistenfa diferentiata la fierbere a microorganismelor si concepe sterilizarea fractionata (tyndallizaea). Sterilizarea prin aer cald Uber Tuberculose” (Premiul Nobel, 1905) Filtrul din porfelan nesmaltut Colorarea diferentiala a bacterillor (colorajia Gram), Inventeaza cunia Petri Mozaicul tutunutui este cauzat de un agent infectios filtrabil «Fungii si protozoarele sunt microorganisme eucariote. ‘*Bacteriile sunt procariote, adica au structur celulara primitiva particularizata prinIntroducere in microbiologie —_____— iipsa oricarui sistem intern de membrane si prezenta unui singur cromosom (fig.1-4 versus 1-5). Ca urmare a adaptirii la parazitismul strict intracelular, unele bacterii au pierdut capacitatea de a initia catabolismul glucozei: rickettsiile sunt total dependente de coenzima A a celulei gazda si inifiaz metabolismul energetic numai din acizi tricarboxilici; altele au pierdut in totalitate metabolismul energetic: chlamidiile sunt complet dependente de ATP-ul celulei garda. Algele albastre sunt bacterii fotosintetizante. (2) Microorganismele acelulare, virusurile si viroizii, aw numai flux informational. *Virusurile sunt metabolic inerte, nu au mecanisme necesare sintezei_ proteice, producerii si stocirii energiei. Ca atare, virusurile nu eresc, nu se divid, ci sunt reproduse de catre o celula pe care o paraziteaza la nivel genetic. Fimbrii Mezosom Mezosom lateral cite Leaps Meroe ‘Complex | fy __—_— Spatiu. ies : Gy Bian Ribosomi- —S «. ———Lipopolizaharid Fig 1-4 Sectiune schematica printr-o celulé procariota cil Detaliu — Tubul ii — = cenial Cineratt Margine in perie ane _—— Complex bazal [vse ——— soos ~ Reticul endoplasmic \ Pinocitoza, Fagosom —__ Fagolizosom— granular Lizosom ‘Aparat Golgi : a Nileol Centrosferi — —_— Microwubuli— _-Membrana nuclear’ Mitocondrie cu pori nucleari ADN ‘itocondrial Filamente cromosomale ——— Reticul endoplasmic agranular Picaturi lipidice ——Granule de glicogen Detaliu Fig 1-5 Sectiune schematica printr-o celuld eucarioté— Conexiuni interdiseiplinare- *Viroizii sunt mici molecule de ARN nud, pe care ii cunoastem doar ca agenti infectiosi ai plantelor. Nici unul nu a fost depistat in celule animale. *Prionii sunt izomorfe ale unei molecule proteice normale din membrana citoplasmica. Apar prin mutatii punctiforme in gena care codifica proteing normala, dar pot fi transmigi pe orizontala (de la un organism adult la altul), intra- sau interspecific. in prezenta prionilor exogeni proteina prionicd normala suferd modificdri post-translationale, care au creat impresia replicirii lor. De aceea prionii sunt agenti psexdoinfectiosi iar bolile, inevitabil mortale, pe care le produc le numim pseudoinfectii. Le-am rezervat prionilor un capitol in acest manual doar pentru ca initial au fost studiafi prin metode virologice, un timp fiind considerai chiar virusuri particulare. Disciplinele microbiologice sunt tot atét de variate ca si microorganismele ori activitatile lor. Unele sunt fundamentale: protozoologia, micologia, bacteriologia, virologia, genetica si taxonomia mierobiand. Altele sunt aplicative, in variate domenii, cum sunt: medicina uman& gi veterinara, agricultura, zootehnia, variate biotehnologii, Chiar gi genetica microbiana a dat nastere unei discipline tehnologice: ingineria genetic’. 1.4. CONEXIUNI INTERDISCIPLINARE ALE MICROBIOLOGIEI MEDICALE Conexiunile cu biochimia, chirurgia, morfopatologia, patologia experimentalé, epidemiologia, imunologia si biologia molecular sunt istoric determinate gi v4 vor ajuta s& {nfelegeti mai bine si sa aprofiundati studiul acestor discipline. Alte conexiuni aduc fondul aperceptiv pentru infelegerea microbiologiei medicale: cu biofizica pentru infelegerea functionarii unor structuri bacteriene (membrana citoplasmic membrana externa etc.), cu anatomia gi histologia pentru intelegerea functionarii unor bariere antimicrobiene mecanice (epiderm, corionul mucoaselor, fesutul conjunctiv dens, transportul mucociliar, spalarea membranelor mucoase prin secrefii si excrete) 5.a. (1) Conexiuni cu biochimis, Corelerea de citre Pasteur a diferitelor fermentafii eu microorganisme specifice a fost una din bazele microbiologiei. Desi in 1877 Moritz Traube afirma intuitiv 8 fermentapile sunt realizate de fermen} intracelutari de naturé proteied, Pasteur in 1878 mai sustinea cd fermentatia este rezultatul nforfei vitale” a intregit celule, Abia in 1898 Edouard Biichner separa din levuré extracte care fermentau, ir Vitro, glucoza cu producere de alcool in absenfa orieirei celule. Date importante privind legaturile reciproce dintre microbiologie si biochimie gasiti in tabelul 1-2 (2) Conexiuni cu chirurgia, La mijlocul secolului XLX, inci inainte de aparitia microbiologiel, doi obstetricieni, Oliver Wendell Holmes, la Boston, $i lgndc Fulop Semmelweis, la Viena, publicau, independent tunul de altl, observatile lor privind transmiterea febrei puerperale de Ia lehuzele bolnave si cadavee la lehuzele sndtoase prin instrumentarul si mainile medicilor contaminate cu lohii si singe. Holmes scria in 1843: Women in childbed should never be attended by phusicians who have been conducting postmortem sections or cases of puerperal fever”. Semmelweis indica utilzarea de instrumente separate la necropsi, la consultul boinavelor gi al Jehuzelor sanatoase. Mai recomanda medicilor si-si spele méinile si to final s8 Te clatease8 cu o solujie de hipoctorit de caleiv, Era prima aplicare a antisepsiei in medicind, dar nu a fost gencralizaté lipsindu-i baza experimental, iar chirurgifor fondul aperceptiv pentru infelegerea ei. Chiar la inceputul anilor 1870 Pasteur mai cra ridiculizat de edtre medic, in Academia de Medicina din Paris, find numit ,chimiatru”. A fost foarte bine fnfeles insi de cite chirurgul englez sir Joseph Lister (plansa 1.2,1) care, din 1867, introducea in serviciul séu aerosoliztrile gi pansamentele antiseptice cu solutie de acid fenic. lath ce ti seria Lister lui Pasteur in 1874: \Permitefi-mi sd vd exprim din toatd inima recunostinfa mea. Prin experientele Dv. strlucite m-afi convins cit tearia despre germenii putrefactiei este adevarata. Asifel mi-ati dat ideea fundamentalé pe care se bazeazd suecesul sistemului meu antiseptic. Dacé veti veni vreodatd la Edinburgh, cred cd veti gasi cea mai bogatd resplaté vdzdnd in spitalul nostru ce binefaceri produce pentru umanitate opera d-voastra™ In 1874 Alphonse Guérin, chirug la Hote! Dieu din Paris, comunica la Academia Franceza descoperirea pansamentului cu vati, iar Pasteur explica, pe baze microbiologice, eficienfa acestei proceduri:,,Vata acfioneazd evident, cum gdindeste d-l Guérin: ea mu aduce in plaga decat aer filtrat pur; poate are de asemenea, comparativ - ~ — 7Introducere in microbiologie cu pansamentul ordinar, avantajul unei ocluziuni mai reduse, de asa manierd incdt ea expune plaga pe toaté ddurata pansamentului contactului cu oxigenul pur, ceea ce ar putea desigur avea eficacitatea et asupra vindecdrit. Impreund cu J. Raulin, Pasteur a demonstrat experimental, in 1876, aceasta ipotez Experimentul prin care John Tyndall demonstra indubitabil, in 1877, c& pulberile din aer transmit iroorganisme (Fig1-6) a deschis calea spre chirurgia aseptic, conceputé de etre von Bergmann si aplicatt in 1894 (tabelul 1-3). (3) Conexiunt cu morfopatologia. Prim trast de bactriologie, Les Bactéries et leur role dans Uétiologie, l'anatomie et l'hystologie pathologiques des maladies infectieuses", a aparut in 1885 la editura pariziana Felix Alean sub semnaturile [ui Vitor Comil gi Victor Babes. Aces atta primi, larecomandarea Iu Pasteur, marele premiu Monthion al Academiei Franceze. Victor Comil era un cunoscut profesor francez de morfopatologie. Victor Babes (plansa 1.2,2) era un ténar medic roman specializat in morfopatologie prin Strlucte stdii la Budapesta, Viena, Paris si Bein, A fieut cecetari de bacteriologie In laboratoarele lu Pasteur (1882-1884) gi ale lui Koch (1884-1886). In 1886 era amit profesor exteordnar de histopatologie la Facultatea de Medicins din Budapesta. In 1887 accepta numirea la Catedra de Morfopatologe si Bacteriologie Faculti de Medicind din Bucuresti. A fost primal profesor romn de Bacteriologe. Tabelul 1-2 O cronologie a legaturilor dintre microbiologie si biochimie 1877 M. TRAUBE Tntuieste, fird demonstrafie experimental, c& fermenfii sunt proteine cendocelulare ale levuilor. 1898. E, BUCHNER Extracte acelulare ale omogenatelor de lever fermenteazA glucoza cu producere de alcool. (Premiul Nobel, 1907) 1886-1896 CHRISTIAN EUKMAN _Descoperd vitamina By (clev al lui R. Koch) (Premiul Nobel, 1929) 1905 ¢’HARDEN si YOUNG Fermentajia alcoolic& prin levuri sau extracte levurice necesita prezenfa fosfatului, intermediarii fosforilaji ai glucozei urmand a fi descoperiti de Neuberg si Robinson. 1911 su. NEUBERG Studii asupra a numeroase fermentafii microbiene. 1913. d’HARDEN si ZILVA. Corceteaza la bacterii activitafile dehidrogenazice. 1920-1940 MARJORIE STEPHENSON Studi biochimice pe bacterii non-proliferative, 1920 BANCROFT si Tehnicile respirometrice 0. H. WARBURG. (Premiul Nobel, 1931) 1920 ©. F. MEYERHOF ‘Similitudinea fermentirii levurice a glucozei cu glicoliza muscular. (Premiul Nobel, 1922) 1928 0. F, MEYERHOF si LOCHMANN _Introdue nofiunea de legiturl fosforic& macroergic’, 1929 LOCHMANN Lzoleaza adenozintrifosfatul (ATP) din muschi. 1936 KNIGHT si LWOFF Descoper fiactorii de crestere bacterin’ si omologia lor cu vitaminele necesare animaletor. 1937 HANS KREBS Descopert citul acizilortricarboxilck. (Premiul Nobel, 1953) 1946 FRITZ LIPMANN Descoperi acetl-coenzima A. (Premiul Nobel, 1955)‘Tub pentru introducerea pulberii (are voltaic) I Ny NZ —_______— Conexiuni interdisciplinare Tuburi spirale Aeschisein ar Sur Tumi DR Lentila Fig. 1-6 Dispozitivul prin care haat de Tyndall a demonstrat in 1877 c& lumina pulberile din aer vehiculeazd microorganisme | Bution steril Tabeluf 1-3 Date semnificative privind impactul microbiologiei in dezvoltarea Chirurgiel 18430. W, HOLMES 186) I. F. SEMMELWEIS 1867 J.LISTER 1874 A, GUERIN 1876 L. PASTEUR si J, RAULIN 1877 J. TYNDALL 1878 L. PASTEUR, J. JOURERT $i CH. CHAMBERLAND 1878 C. SEDILLOT 1887 C. FLUGGE 1894 E, von BERGMANN 1913. W.S. HALSTED “The Contagiousness of Puerperal Fever” “Die Aetiologie, der Begriff und die Prophylaxis des Kindbetfiebers” Chirurgia antiseptic’. Pansamentul antiseptic si aerosolizari cu enol “Du réle pathogénique des ferments dans les maladies chirurgicales: Nouvelle méthode de traitement des amputés”. Pansamentul eu vat Demonstreaza baza microbiologica a pansamentului cu vat Demonstreazi c microorganismele sunt ubicuitare in aer, vehiculate find prin pulberi. “La théorie des germes et ses applications a la médecine et @ la chirurgie”. “De Vinfluence des découvertes de M. Pasteur sur le progrés de la chirurgie". Inventeaza numele de “microb”, acceptat de Litt si introdus in dicfionare. Importanfa picaturilor de secretie nasofaringana pentra transmiterea tuberculozei Chirurgia aseptic3. Manugile chirurgicale elimina vehicularea in plagi a microorganismelor dde pe mainile chirurgilor. (4) Conexiuni cu patoiogia experimentali, Microbiologii au facut primele cercetiti de patologie experimental pentrv 4 microorganismele crau primii agenti care produceau boli experimentale in condi strict controlate, Diz Patologia Experimentala a evoluat Fiziopatologia. - - 9Introducere in mierebiologie in 1901 se infiinya la Facultatea de Medicina din Bucuresti Catedra de Patologie Experimentalé al c&rei titular fondator a fost Ioan Cantacuzino (plansa 1.2,3), savant cu o vast cultura (filosof, biolog si medic), A Iucrat fn laboratoarele lui Pasteur ca elev al lui Ilya Mecinikov. fntre 1902-1911 seful de Iucrari al Profesorului Cantacuzino a fost doctoral Alexandra Slatineamy (plansa 1.2,4), eare in anul 1912 devenea primul Profesor titular al Catedrei de Bacteriologie la Facultatea de ‘Medicina din Iasi, Toatt viata i-a legat o calda prietenie si strinsa colaborare (plansa 1.3,1). (5) Conexiuni eu epidemiotogia. Textele biblice consemneaza primele concepte pragmatice de combatere si prevenire a unor boli contagioase. Parinfi epidemiologei sintfice sunt primi microbiologi: Epidemiologia Sa niseut ca 0 epidemiologie a bolilor contagioase, Repete itorice ale legiturilr dntre microbiologic si epidemivogie ssf in abel 1-8 Tabelul 1-4 Ropere istorice ale legaturilor epidemiologiel cu Microbiologia 3. Xia. Chr. MOISE ‘Concepie pragmalice despre bolile contagioase: surst de infeojie, cai de transmitere, carantinare, decontaminare. Cunoastetransmiterea prin elemente ale mediului, cea prin-contact direct, inclusiv prin contact sexual. 1796. K. JENNER Vaccineaza primul copil contra variole folosind exsudatul leziunilor veziculare de pe ugeral unei vaci (agentul activ identificat ulterior: virusul vaceinal), 1879 E, PERRONCITO Izoleaza agentul holerei glinilor. Pasteur confirma descoperirea: Pasteurella hemolytica 1880 L. PASTEUR Vaceinul vin atenvat contra holerei gainilor objinut prin repicisi repetate ale agentului etiologic pe un mediu de culturd ta intervale de cteva luni. 1881 L. PASTEUR La propunerea lui Pasteur, in memoria Iui Jenner, Congresul Internafional de Medicin’ (Londra) adopt numele de vaccin pentru metoda de protectie contra bolilor contagioase prin injectare de microorganisme atenuate. 1881 L, PASTEUR Prepard vaccinul anti-c&rbunos atenuat prin cultivare repetata a bacteridiei cfrbunoase 1a 41°-43°C. Celebra demonstratie de Ia Pouilly-le-Fort unde a vaccinat 24 de oi, sase vaci si 0 capra; toate animalele vaccinate au supraviejuit c&nd, dupa tei luni, au fost injectate cu o tulpina virulenta de bacteridie cirbunoasa. 1883 L. PASTEUR giL. THUILLER —_Descoper Erpsipelothrix rhusiopathiae, cauza rujetului porcului si prepara vaccinul viui atenuat prin pasaje repetate ale bacteriei la iepuri 1883. L. THUILLER ‘Moare prin holera fulgeritoare la Cairo unde studia epidemia de holera. R. Koch si colab. studiau aceeasi epidemic. 1884 R. KOCH Studiu epidemiologic al holerei la Calcutta. Descopera vibrionul holerie. 1885 JAIME FERRAN ‘Spania, prima tentativa de vaccinare anidoleril cu vacein viuatenut. 1885. L. PASTEUR Prepard vaccinnl antiabic viu atenuat, Primul vaceinat, copilul Joseph Meister, supraviequieste dupa mugoatura de edine turbat. ‘Va deveni, pand la pensionare, portar al Institutului Pasteur. Al doilea salvat — ciobanul de 15 ani muycat cnd apara un grup de copii contra unui cine turbat — grup statuar memorial in curtea Institutului Pasteur din Pari. 10 -Conexiuni interdisciplinare (6) Conexiuni cu imunologia. Bazele Imunologiei au fost puse de citre Hya Mecinikov (1845-1916), profesor de zoologie la Universitatea din Odessa. In 1882 Mecinikov a descoperit fagocitoza studiind la Messina larva transparentd a unei stele de mare infepati cu un spin. A observat cum in jurul corpului strain se acumulau celule amoeboide. Intuieste c& la animalele superioare gfobulele albe ale singelui ar avea rol asemanstor. Din 1888 si-a continuat studiile in laboratoarele fui Pasteur gi a descoperit c& leucocitele de iepure inglobeaza si digerd bacterile care produc antraxul si rujetul porcului. A constatat c& fagocitoza era mai intensi la iepurii ‘vaccinati decat la cei nevaccinat. in alte studi a demonstrat rotul macrofagelor in distrugerea celulelor moarte sau imbatrénite. Considera fagocitoza ca principal mecanism, chia exclusiva imunitai Tabelul 1-5 Aportul bacteriologiei la aparitia 9i dezvoltarea imunologiel, o cronologie 1882 I. MECINIKOV Descoperd fagocitoza, studiul dela Messina 1888 su Studi asupra fagocitozei in laboratoarle lui Pasteur 1901 1 Tmunité dans les maladies infectieuses” 1902 Legon sar la pathologie comparée de V inflammation” (Premiul Nobel, 1908) 1888 HANS BUCHNER Puterea bactericidi naturala a serului sanguin este distrusa prin ‘neAlzire o ord la 55°C. 1889 V. BABES Substanfe imunizante circula in sAngele animalelor imunizate si pot fi transferate altor animale. 1890E. von BEHRING siS. KITASATO Descopera antitoxina tetanic3. 1890. E. von BEHRING Descopert antitoxina difterca. Bazefe seroterapiei. (Premiul Nobel, 1901) 1891 PAUL EHRLICH Bazele imunologiei experimental. Largest sferairmunitaii umorale: * anticompii apar fata de o mare varietate de substanfe patogene sau nu (imunologia iese din sfera bacteriologiei); * teoria catenelor laterale: reactia antigen-anticorp apare datorita complementartiti unor “receptori" de pe molecula antigenetor si anticorpilor. (Premiul Nobel, 1908) 1893-1895 RICHARD PFEIFFER Vibrionii holerici sunt rapid lizaji de substanfe confinute in cexsudatul peritonea! al cobailor vaceinati antiholeric 1895. JULES BORDET Numeste complement sau alexin# factoul seri bactericd termolabil si aati cl este prezent in seraltuturoranimalelor normale. Anticorpi sunt specifici si apar dupa vaccinare. Interactiunea anticorpi- complement este neesard pentru bacteriliza descoperiti de Pfeiffer. (Premiul Nobel, 1919) {in 1890 Emit von Behring (1854-1917) si Shibasaburo Kitasato (1852-1931), elevi ai lui Koch, descopercau antitoxina tetanic’, primii anticorpi cunoscufi, si puneau bazele imunologiei umorale si seroterapie ind la descoperirea in 1902 a anafilaxiei de citre Charles Richet si Paul Portier imunologia era un domeniu exclusiv al bacteriologilor(tabelul 1-5), (7) Conexiuni cu genetica moleculard. Bazele geneticii moleculare au fost puse cand bacterile au devenit obiect de studiu al geneticienilor. Particulariti structurale si functional ale bacteriilor au favorizat trecerea de la clasica geneticd a populatilor de organisme superioare la genetica moleculara: ~ rrIntroducere in microbiologie. $$ #Viteza cu care bacteriile genereazd populatii enorme ale céror caractere fenotipice pot fi usor examinate prin etalare pe medii de cultura selective. + Simplitatea genomului, numarul limitat de caractere fenotipice ale bacteriilor permit chimistilor si ‘urmireasca simultan $i s& coreleze statistic modificarile structurale ale ADN cu cele ale moleculelor proteice si caracterelor fenotipice. Din 1944, cdnd O. T. Avery si colab. au reprodus in vitro experimentul de transformare @ pneumococilor descris de F. Griffith, dezvoltarea biologie! moleculare a fost exploziva si cu impact enorm asupra micrsbiologici medicale, a descifririi mecanismelor oncogenezei ori apartiei de tehnologii grew imaginate in trecut (abelul 1-6). Microbiologia este deci o stiinti de varf purtitoare a progresului in numeroase Tabelul 1-6 Evenimente care au marcat aparitia si dezvoltarea geneticii moleculare 1912 F.P. ROUS 1937 PIEKARSKI 1941- G. W. BEADLE, E. L. TATUM si 1946 J, LEDERBERG 1943 S. LURSA si M. DELBRUCK 1944 0. T. AVERY, C. MAC LEOD $i M. MC CARTHY 1950 A. LWOFF, L. SIMIONOVITCH si N.KJELGAARD 1952 VOGEL $i B. D, DAVIS 1952N. D. ZINDER gi J. LEDERBERG 1952 J. LEDERBERG 1952 J. LEDERBERG si E. WOLLMAN 1953 W. HAYES 1953 J. WATSON si F. CRICK Deseoperirea virusurilor oncogene. (Premiul Nobel, 1966) Descoperii transformarea pneumococilor in vivo: soarecii injectaji eu amestec de pneumococi capsulati serovar I omorafi_ prin ceildurd si pneumococi vii ai variantei necapsulate din serovarul 2 ‘mureau iar in hemoculturile soarecilor morfi izola pneumococi capsulafi serovar 1. Evidenfiazi nucleoidul bacterian, Izoleazk mutanfi biochimici ai Neurospora crassa si afirm’ ch fiecare funojie pierdutd este controlati de 0 anume gen’, Descopera recombinarea genetic la bacteri (Premiul Nobel, 1958) Demonstreazi caracterul spontan al mutafiilor bacteriene: testul fluctuatiilor. (Premiul Nobel, 1969) Reproduc in vitro experimentul fui Griffith si aratt c& agentul transformant este ADN. Descopess inductia bacterilor lizogene si concep nojiunea de profag. Introduc nojiunea de represie enzimatic’. Descoperti transductia: transferul de informatie genetic’ prin bacteriofagi tempera. Descoperi plasmidele. Localizeaza profagul in cromosomul de Escherichia coli. Descoperi mutantele Hf. Stabilese structura in dublu helix a ADN si semnificafiile sale in ‘ransferul informatiei genetice. (Premiul Nobel, 1962) 12eased Locul lui Babes si Cantacuzino in medicina rom Tabelu! 1-6 (continuare) “OST. CZAMECNIRGIE, B, KELLER Pe exravie acelilare, demonsttaai Gi ribosomil Sint soda Sntaai proteice, 1961 F. JACOB si E. WOLLMAN Stabilese notiunea de episom. 1961 F. CRICK 5,0 Descopera codul genetic 1961 A. LWOFF, J. MONOD si ‘Conceptul de operon si controlul genetic af sintezei enzimelor. F.JACOB (Premiat Nobel, 1965) {967- W. ARBER, D. NATHANS si Descopera enzimele de restritie si utilizarea acestora in genetica 1970.0. SMITH ‘moleculara, (Premiul Nobel, 1978) . 1967 R. DULBECO,H.M.TEMIN si escoperint privind interactiunea dintre virusurile tumorale si su. D. BALTIMORE rmaterialul genetic al celulei, (Premiul Nobel, 1975) 1976 M. BISHOP si H. WERMUS Descoperirea originii celulare « oncogenelor retrovirale (Premiul Nobel, 1989) 1972 P. BERG Prima disectie si reconstructie de genom: hibridul SV 40 — fag gal. 1983 KARY B. MULLIS Concepe o cale de amplificare exponentiala a secventelor ADN (PCR). (Premiul Nobel pentru chimie, 1993) activititi umane, inclusiv medi it de valabi! este aceasta in medicind o dovedeste faptul cf, intr-o perioad de 90 de ani dupa instituirea in 1905 a premiilor Nobel, 46 dintre cei 162 de laureati pentru medicind au obtinut distinofia prin cercetiri care au avut ca obiect sau instrument microorganisme. 1.5. LOCUL LUI BABES $I CANTACUZINO IN MEDICINA ROMANEASCA Un popor se defineste mu att prin oamenii sai mari, cat mai ales prin felul in care acel popor isi recunoaste i igi cinsteste oamenii sai mari.” FRIEDERICH NIETZSCHE Prin charisma, vast culturd si totala diruire in tot ce faiceau, Victor Babes si Ioan Cantacuzino au atras in jurul for numerosi studenti, tineri medici si biologi. Au iubit tineretul si au fost iubiti de tineri. Asa au creat dou’ scoli din care s-au ridicat multe, foarte multe, personalitafi ale medicinei romanesti. Unii dintre cei care au trecut prin laboratoarele lor au condus multi ani dup’ aceea destinele microbiologici, igienei gi a variate specialitati clinive, alfii, uneori aceiasi, au fost oameni de arti, scriitori, pictori (tabelele 1-7 si 1-8). até ce rispundea Victor Babes acelor tineri entuziasti din Societatea studengilor in medicind care, in 1914, au organizat banchetul jubiliar pentru cei 60 ani de viata ai maestrului lor: ,Manifestarea Voastra inflacarata si plecaté din sufletele voastre tinere, sincere, pe mine ma inviazé, imi ridicd moralul, grew incercat in ultimele timpuri; voi imi dafi o noué forfa de muncii $i cel mai frumos sprifin moral, pe care-l poate astepta sufletul meu amar.”Introducere in microbiologie — $$ Tabel 1-7 Personal medicale din scoala profesorului Victor Babes. Emi Pageariu Profesor de Histologie la Fac. de Medicing din Iagi (1893-1928). (1859-1928) Director al Insttutului Antirabic din Iasi (1893-1928?) Secretar general in Ministerul Cultelor (1899-1901) Profesor suplinitor de Bacteriologie (1907—1911) George Bogdan Profesor de Medicin Legala (1891-1930) si Decan (1891-1930) al Fac. (1859-1930) dde Medicina din lasi Magnificus Rector al Universiti din lagi Vasile Sion"? Profesor de Igiend la Fac. de Medicina din Iasi (1900-1903) si Bucuresti (1861-1923) (din 1904) . Director general al Serviciului Sanitar Gheorghe Marinescu. *, Profesor de Clinica boalelor nervoase la Fac. de Medicin’ din Bucuresti (1863-1938) (4397-19387) Valeriu Rosculet Profesor suplinitor de Histologie (1899-1901) si de Bacteriologie (186-2) (4901-1906) ta Fac. de Medicind din tagi Gheorghe Proca Profesor de Igiend la Fac. de Medicina din lagi (19¢4~1908) (3867-1943) Profesor de Patologie Generali la Fac. de Medicina din Bucweesti (din 1909) Suplineste Catedra de Anatomie Patologiea tmpreunt eu Aurel Babes (8926-1930) Poet Mihai Mani Profesor de Clinic& Infantil la Fac. de Medicina din Lagi (1901-1920) si (1867-1954) Bucuresti (1920-1937) Paul Riegler Profesor de Anatomie Comparati si Bacteriologie (din 1900) si Decan (1367-1937) (1926-1930) la Fac, de Medicina Vererinara din Bucuresti Director al Institutului Pasteur din Bucuresti Constantin Bacalogl Profesor de Clinica Medicalé la Fac. de Medicina din Iasi (1913-1930) si (a87i~1942) din Bucuresti (1930-1942) unde suplineste Catedra de Anatomie Patologic’ (1930-1931) Francise Reiner” Profesor de Anatomie si Embriologie 1a Fac. de Medicina din Iasi (1874-1944) (1913-1920) si Bucuresti (1920-1940) Stefan Gh Nicolau Profesor de Dermato-Venerologie Ia Fac. de Megicind din Clyj (1874-1970) (1919-1920) si Bucuresti (1920-1938) ‘Theodor Mironescu Profesor de Boli Infectioase (1919-1941) la Fac. de Medicini din (1877-1954) Bucuresti Constantin Levaditi Preparatox al lui Victor Babes (1897~1898) (4879-1953) Continua studiile la Paris; naturalizat cetajean francez (1908) Profesor la Institutul Pasteur din Pais Pionier al Virusologiei; importante studii asupra sifilisului. Conferinge in smumeroase fri 1907, 1912 i se refuza post de profesor in Romania, Profesor de Patologie generala si experimentald la Fac. de Medicina din Clyj (1920); contract, reziliat dup& 3 luni de autoritaile centrale. Titw Vasiliu Profesor de Anatomie Patologic’ la Fac, de Medicins din Chuj (1885-1961) (1920-1947) Profesor la Institurul de perfecyionare a medicilor in Bucuresti (1952-1953) Aurel Babes Conferenfiar de Anatomie Patologict la Fac. de Medicina din Bucuresti (1886-1962) Emil Craciun Profesor de Anatomie Patologici la Fac. de Medicina din Bucuresti (1896-2) 1936-1966) ° fn 1908 il gasim fotografiat in grupul prietenilor Profesorului Yoan Cantacuzino gi al personalulti laboratorului de Medicina experimentalt pe care acesta il conducea. ® Colaborator al Profesorului Cantacuzino la intocmlirea Legii sanitare din 1910 14i Taxonomiia microorganismetor in 1942 marele anatomist care a fost profesorul Grigore T Popa seria: ,,...mai ales m-am apropiat de acel strilucit model de om complet, clocotitor de influenta bine-fcdtoare, din a carui scoali mi mandrese cd fac parte, fara sa fi fost o singurd zi elevul sdu de banca. Acel om de care nu se va despirti gandirea mea niciodata, a fost profesorul Cantacuzino. O scoala nu se face numai cu banci si ziduri; ea nu se face numai cu catalog, cu ore de curs si cu examene. Ba chiar, aproape paradoxal, ea nu se face nici cu stiint de carte (dacd-i numai att). Fireste, trebuie din toate acestea cate ceva gi mai ales trebuie cunostinge cat mai multe; dar fara elan, fara suflet, fara apropiere umané nu se poate face scoal. Un adevitrat maestru este un instigator, un starnitor de energii potengiale, un incendiator de spirite, 1.6. TAXONOMIA MICROORGANISMELOR Diversitatea tot mai crescut’ a microorganismelor utile sau diundtoare impune identificarea lor cat mai precisi in scopul separirii celor dorite de cele nedorite ori a) diagnosticului etiologic si terapiei etiotrope a bolilor infectioase, La lucrurile si fiinfele inconjuritoare ne referim cu un nume, nu le deseriem cu ansamblul caracterelor pe care te au, Pentru aceasta omul a observat, a comparat lucrurile, fiinjele sau fenomenele, le-a reunit pe cele asemindtoare in grupe (unitii) pe care le-a aranjat intr-o anumita ordine (clasificat) gi le-a marcat (numit). in raport cu aceste sisteme de unitati mareate putem identifica, prin comparatie, un object, un fenomen sau o fiinfS nou observati. Aceasta este esenfa stiinfei pe care o numim taxonomie si care inmanuncheaza trei domenii distinete, dar intrepatrunse, ale cunoasierii: clasificarea, numirea si identificarea, Metaforic, taxonomia a fost comparati cu un coctail pe care consumatorul il savureaz, dar numai cei initiati ti recunose ingredientele. (1) Clasificarea obiectelor este facut dupa insusiri aparente, Esve o clasificare in chei. O cheie reuneste obiectele care au in comun caractere usor de recunoscut. In lumea vie o asemenea clasificare expune la erori din cauza evolutiei divergente sau convergente a unor caractere (¢.g., liliecii zboar’, dar nu sunt pasari etc.). De aceea unitatea de clasificare a vietuitoarelor trebuie si corespunda unei grupari naturale particulare. Un taxon biologic reuneste indivizi asemdnatori datorita descendentei dintr-un strémos comun, deci posesori ai unei informatii genetice comune. Asadar, clasificarea organismelor vii este filogeneticd. Specia, taxonul de baz al lumii vii, este 0 comunitate reproduetiva format din populayii care habiteazi un anumit areal si ai carei indivizi se incrucigeaz4 liber in natura, cu orice individ de sex opus, dand descendenti viabili si fertili. Speciile aparute prin evolujie divergent dintr-un strimos comun sunt reunite intr-un gen; genurite cu origine comund in familii; familiile in ordine; ordinele in clase; clasele in diviziuni; diviziunile in regnuri. Spre deosebire de clasificarea organismelor eucariote, clasificarea celor procariote Intémpind dificultayi, dintre care refiner ~Numiérul redus de caractere morfologice; ~Insuficienta amprentelor fosile, care reflectd filogenia; —Nu poate fi studiat un individ, ci populatie, pe care o numim tulpind; —Aparijia freoventé in populajiile bacteriene a unor variante genetice, care, sub presivni selective ale mediului, genereaz clone diferite prin unele caractere, fri ca apartenenta la aceeasi specie si fie alterata; —inmultirea exclusiv vegetativa face dificil de recunoscut discontinuitafile in evoluia divergent a unei specii procariote. Ca atare, specia bacteriana este definitd ca un grup de tulpini cu multe caractere comune prin care diferd semnificativ de alte tulpini. In stadiul actual specia bacteriant este format dintr-un grup de tulpini alese de taxonomist. — ~ — 15Introducere in microbiologie $$$ Tabelul 1-8 Cateva personalitati, colaboratori si elevi din scoala Profesorului loan Cantacuzino “Alexandru Slitineanu (1873-1939) Stefan Irimescu (1873-1956) Mihail Butoiana (1876-1935) Constantin Gorescu (1819-1935) Alexandru Ciuc (4880-1972) Mihail Botez (1881-1960) Constantin Ionescu Mihtiesti (1883-1962) Mihai Ciuc (1883-1969) Vitold Baroni (1883-2) Nicolae Gh Lup (1884-1966) ‘Max Marbe (1884-2) Daniel Danielopolu (1884-1955) 1@———— Tnspector sanitar pentru epidemil din 1907 Fondatorul Catedrei de Bacteriologie la Fac. de Mediciné din Iasi (1912-1938) Magnificus Rector Universitatea din lagi (1923-1926) Director al Serviciului Sanitar (1918-1920) Director al Institutului de Igiend din lasi (1930-1938) Secretar general Ministerul SanataiiPublice (1931~1932) Director Societatea pentru profilaxia tuberculozei Merite deosebite in combaterea tuberculozei Conferentiar (1920-1923), profesor titular de Medicing Operatorie Fac. de Medicind din lagi (1924-1927); Inspector sanitar general al Armatei (1928) General de divizie (1930-1935) Organizeazd primele Laboratoare ale Ministerului ‘Sin8tafi, in Craiova si Constanta Sef de seetie Insttutul Cantacuzino Profesor de Patologie Contagioasi Fac. de Medicina Veterinara din Bucuresti (1921-1950) Fondatorul Catedrei de Bacteriologie la Fac. de Medicin’ din Clyj (1921-1923) Profesor de Patologie Generala si Experimentala la aceeasi facultate (1923-1941) Decan al Fac. de Medicina din Cluj (1927-1928) Profesor de Patologie Generala si Experimentala Fac. de Medicina din lagi (1925-1930) Profesor la Fac, de Medicina din Bucuresti de Patologie Experimentala (1930-1934), de Bacteriologie din 1934) Director al Institutului{. Cantacuzino” din Bucuresti Profesor de Igiend la Fac. de Medicina din lagi (1922-1934) Delegat al Roméniei in Organizatia de Igien a Societagii Natiunilor (1929-1934) Profesor de Bacteriologie Fac. de Medicina din Bucuresti (din 1934) Directorul Laboratorului de Igien& din Galati si Membru in Comisia dunareané si Organizatia de ‘giend a Societatii Natiunilor (1910-1920) Profesor de Bacteriologie Fac. de Medicina din Cluj (1925-1947) Suplineste Catedra de Anatomie Patologica din Bucuresti (1931-1936) Conferenjiar (1931-1935) si Profesor de Clinica Medicala Fac. de Medicin& din Bucuresti (din 1936) Sef de sectie in Instirutul Cantacuzino din Bucuresti Medic chirurg la Ploicsti Profesor de Clinics Medical Fac. de Medicina din Bucuresti (1920-1955) Director al Institutului Cinico-Medical din Spitalul Filantropia devenit Institutul de Fiziologie al Academiei Rominei _Taxonomia microorganismelor Tabelul 1-8 (continuare) Ton Nicolau (1885-1963) Gheorghe Zotta (1886-1942) Dumitru Combiescu (1887-1961) Alexandru Tupa (1886-1955) Ton Balteanu (1887-1968) Petru Condrea (1888-1967) Marius Nasta (1890-1962) Grigore T Popa (1892-1948) Gheorghe Magheru (1892-1952) Dumitra Ghiags (1888-1972) Sef de secjie la Instinutul Cantacuzino Bucurest Profesor de Patologie Generala si Medicina Experimentala (1936-1939) gi de Clinick Infantil’ (1939-1952) la Fac, de Medicin® din Iasi Profesor de Pediatrie la Fac. de Medicina din Bucuresti (din 1952) Sef de sectie Institutul Cantacuzino Profesor de Parazitologie la Fac. de Medicin& din Bucuresti Sef de seoje in Instturul Cantacuzino din Bucuresti Profesor de Patologie Generalé la Fae. de Medicina din Bucuresti (din 1937) si de Epidemiologie Profesor de Histologie si Embriologie la Fac. de ‘Medicina din lagi (1930-1955) Conferentiar (1927-1929) si profesor de Epidemiologic si Clinica boalelor infectioase (1930-1942) la Fac. de Medicina din lasi Profesor de Clinica boalelor infectioase la Fac. de Medicina din Bucuresti (din 1942) Conferentiar de Patologie Comparata Fac. de Medicina din Bucuresti (1929-1945) Sef de sectc Institutul Cantacuzino Bucuresti (1932-1945), asi (1946-1958) Profesor de Microbiologie Fac. de Medicina din lagi (1946-1958) Sef de sectie in Institutul Cantacuzino din Bucuresti (1927-1945) Profesor de Fliziologie la Fac. de Medicina din Bucuresti (1945-1962) Profesor de Anatomie (1928-1942) si Decan (1938-1940) la Fac. de Medicind din lagi Profesor de Anatomie (1942-1947) al Fac. de Medicina din Bucuresti ‘A descoperit sistemul venos port al hipofizei A ceditat, impreuna cu M. Sadoveanu, M. Codreanu si G. Topirceanu, revista Jnsemeiri lesene (1936-1942) Sef de sectie in Institutul Cantacuzino din Bucuresti Poet Pictor, fost laborant al Profesorului Cantacuzino Profesoruii-a descoperit talentul si i-a incurajat studi in jar ila Paris. ‘A excelat in peisagi si naturi moarte. Pleiada de ,mici medici mari” care au ilustrat strilucit medicina roméneasca prin competent profesionali si inalta cultura: directori ai laboratoarelor de igien’, directori de spitale, efi de laboratoare clinice, sefi de sectii medicale sau chirurgi _istorici ai medicinii le; multi iubitori de arti sau eruditiIntroducere in microbiologie — Clasificarea bacteriilor cere cunostinte obtinute prin tehnici speciale de observare a morfologici si structurii (* Capitolul 2), fiziologiei si activitatii biochimice (‘*Capitolul 3), biologiei moleculare si geneticii (7 Capitolul 5), structurii antigenice etc. Caracterele folosite pentru clasificare trebuie si fie genetic stabile, Valoarea unui ctiteriu taxonomic variaz cu grupul biologic care trebuie comparat. Un caracter prezent sau absent la tofi membrii unui grup nu poate fi folosit pentru a diferentia membrii sai, dar poate defini grupul (c. g., tofi stafilococii au catalaza, tofi streptococii nu au catalazA). Caracterele instabile genetic nu sunt eriterii taxonomice (e.g., caracterele codificate plasmidic: plasmidele pot fi transmise interspecific sau pot fi pierdute,™ Capitolele 2 si 5). Perspectiva spre clasificarea natural a organismelor procariote este deschist prin tehnicile modeme de studiu: (1) Studiul confinutului relativ de guanina + citozina (G+C) al ADN purificat. Cu cat continutul G+C a doua bacterii este mai apropiat, cu atat acestea sunt maj inrudite. (2) Omologia secvenfelor nucleotidice ale ADN cantificata prin formarea moleculelor hibride pornind de la dows catene ADN cu origini diferite (#Capitolul 5). (3) Studiul secvenfelor oligonucleotidice ale ARN ribosomal. (4) Studiul structurii primare a enzimelor izofunctionale sau a citocromului c. (5) Studiul imunologic al proteinelor bacteriene omoloage (catalaze, aldolaze etc. (2) Numirea stiinfificd a microorganismelor este ficuti dupa caracterele lor observate si in acord cu norme internationale. Conform acestor norme specia este denumita, dupa sistemiil binominal al lui Linné, prin dou’ cuvinte latinizate, care caracterizeazi cat mai sintetic microorganismul in cauza. Primul cuvant, scris cu litera initial majusculA, indica genul si este un substantiv sau adjectiv la singular. El precizeaza particularititi morfologice (Staphylococcus = s. gr staphyle, ciorchine de strugure; s. gr. coccus, boab&, coci asezati in ciarchini), habitatul natural al organismului (Enterococcus = s. gr. enteron, intestin; s. gr. coccus, boaba; coci care traiesc in intestin); sau mumele unui savant cu merite deosebite in descoperirea microorganismului (Escherichia = Theodor Escherich, bacteriolog german). Latinizarea numelor de gen este flicutt prin sufixele: -um, -us, -as, -a respectiv Clostridium, Streptococcus, Pseudomonas, Treponema etc. Al doilea cuvant este un epitet specific descriptiv pentru specie gi scris cu litera mica. El poate fi un adjectiv acordat cu numele genului (Staphylococcus aureus, o specie de Staphylococcus care produce pigment auriu), un substantiv la genitiv (Mycobacterium chelonae, © specie de Mycobacterium gazduiti de broaste {estoase), un nume propriu la genitiv (Rickettsia prowazekii, 0 specie de Rickettsia numita in memoria bacteriofogului german Stanislas von Prowazek rapus de tifosul exantematic pe care il studia). Cand intr-un text numele genului se repetd, poate fi prescurtat prin initial, dact aceasta nu creeazA confuzii (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. capitis. a.). Identificarea unei bacterii numai pani fa nivel de gen este mentionata prin numele genului urmat de abrevierea spp., 0 specie a genului. Sufixe diferenfiate latinizeazi numele familiilor (-aceae, Enterobacteriaceae), ordinelor (-ales, Spirochaetales) sau clasele (-es, Mollicutes). Observati ci numele stiintifice ale taxonilor biologici sunt scrise cu caractere italice, iar numele taxonilor de rang superior, incepand cu genul, sunt scrise cu litera initiala majusculi. in activitatea curenté, nu in documente oficiale (¢.g., buletine de analizs microbiologic’) ori texte academice, putem folosi denumiri comune, acceptate prin consens: meningococ = Neisseria meningitidis, bacilul lui Koch = Mycobacterium tuberculosis, specie descoperit’ de Robert Koch. 18 -— Obiectivele microbiologiei medicate (3) Identificarea este, in esenfa, utilizarea practicd a schemei de clasificare, Cheile dihotomice de identificare nu sunt ,sisteme de clasificare”, ci instrumente de analiz§ antiteticd: pun intrebari la care raspunsul este DA sau NU. Aceasta usureazi mult compararea caracterelor vnei tufpini necunoscute cu cele ale unei specii tip conservata intr-o colectie. Cheile dihotomice sunt utile la identificarea preliminar’ a unei bacterii, cind examinim caractere foarte stabile genetic la grupe mari de bacterii, cum ar fi caractere microscopice, producerea de catalaza, de oxidazA etc. (e.g., un coc gram-pozitiv catalazo- pozitiv poate fi Staphylococcus, Micrococcus, dar niciodat Streptococcus). Identificarea speciilor prin chei dihotomice expune insa la erori: un singur caracter inconstant prezent sau 0 eroare analitici denatureaza toate etapele ulterioare ale algoritmului de identificare, Taxonomia numericd este metoda de identificare cel mai larg folosité in prezent. Schemele de clasificare numerica se bazeaz4 pe un mare numér de caractere taxonomice (in jur de 100), Computerul grupeaz tulpinile pe baza freevenfei cu care exprima caracterele fenotipice. Nivelul uzual prestabilit de similaritate globala este de cel pufin 80%, Cu aceste date este construité o matrice de frecven{a ca termen de comparafie pentru identificarea tulpinilor necunoscute. Deci, in locul speciei tip, reale, taxonomia numeric& oferé ca termen de comparafie o abstracjie numeric, matricea de frecvenfé. Sinonime sugestive pentru taxonomia numericd sunt: taxonomia computerizatd, taxometric’ sau fenetic’. Grupari infraspecifice (subtiparea) si aplicatiile lor. Freevent, in cadrul speciilor microbiene sunt delimitate grupari infraspecifice (variante) definite antigenic (serovar), prin activitatea biochimica (biovar), prin sensibilitatea la anumifi bacteriofagi (lizovar) 5.a.m.d. Ocazional folosim si denumirea formata prin sufixul tip: serotip, biotip, lizotip ete, Gruparile infraspecifice pot fi utili marcheri epidemiologici prin care urmérim filiatia cazurilor intr-o epidemic. Valoarea unui sistem de subtipare este masurati prin capacitatea discriminatorie gi fiabilitate. Discriminarea. Un marcher are putere de discriminare cu att mai mare cu-cat permite repartizarea microorganismufui studiat intr-un mare numar de tipuri dintre care nici unul nu este foarte réspandit. Capacitatea discriminatorie redusa a unui marcher epidemiologic expune {a rezultate fals pozitive. Fiabilitatea depinde de stabilitatea genetic& a caracterului marcher. Lipsa de fiabilitate are efect opus capacitatii discriminatorii reduse: rezultate fals negative. Probabil nici unu! sistemele clasice de subtipare nu este total fiabi Biologia molecular ne oferd acum sisteme de subtipare cu excelent’ capacitate discriminatorie si mare fiabilitate: e.g., analiza profilului plasmidic, digestia endonucleazic: de restrictie a ADN cromosomai sau plasmidic, electroforeza in camp pulsatil si electroforeza enzimaticd muliitoculara, ribotipia gi analiza prin amplificare genicd a fragmentelor rezultate dupa digestia ADN cu endonucleaze de restrictie, amplificarea ADN polimorf, secventierea ADN ete. (* Capitolul 5). 1.7. OBIECTIVELE INSTRUCTIONALE ALE MICROBIOLOGIEI MEDICALE Definitoriu, microorganismele pot ff vazute numai prin microscoape, dar microorganismele sunt ubicuitare in ambient, pe inveligurile si in cavit3file noastre, in fesuturi, umorile sau celulele bolnavilor, pe lenjerie, haine, asternut; pe instrumentarul gi dotirite folosite in spitale, ambulatori etc. Medicul nu poate purta continu un microscop, asa cum are un stetoscop. De aceea principalul obiectiv instructional al Microbiologiei Medicale - 19Introducere in microbiologie este de a invita viitorul medic sd vada microorganismele cu ,,ochii minii” si sd rationeze microbiologic: 1©Sa stie unde gi ce fel de microorganisme sunt prezente (pe si in propriul corp; pe si in corpul pacientilor, chiar da ambientului). acestia nu suferi de 0 boal infectioasa; pe si in elemente ale ‘*Care sunt caile prin care aceste microorganisme ajung dintr-un loc in altul si ce urmari poate avea asemenea contaminare, #Sa cunoascd riscurile contamina (condifiile de rise ale contaminatilor). microbiene practica medicala si chirurgicala Sa infeleaga rolul microorganismelor in conditionarea stirii de sinatate si boald. Sa infeleaga etiopatogenia bolilor infectioase. ©Sa-si insuseascd deprinderi pentru: =prevenirea contaminarii microbiene in raport cu diferitele condifii de rise intélnite in practica medicala si chirurgicala; ~ recoltarea corecti a produselor patologice in vederea diagnosticului etiologic si sf poatii aprecia semnificatia clinic& a unui microorganism observat sau izolat dintr-tn produs patologic in conditii clinico-epidemiologice definite; ~ inifierea si monitorizarea corecte a terapiei antimicrobiene. 20 ~ANATOMIA FUNCTIONALA A BACTERIILOR 2 DUMITRU T. BUIUC, MARIA DAN Functions must be understood in term of structures, ‘structures must be understood in term of chemistry.” GEORGE EMIL PALADE Cresterea si inmultirea bacteriilor sau supraviefuitea lor in variate condifii ambientale sunt controlate de structuri celulare bine determinate. Este ceea ce vom numi in acest capitol semnificatia biologicé a structurilor bacteriene. Structuri genetic stabile si usor de observat prin metode uzuale sunt importante pentru clasificarea si identificarea bacteriilor. Aceasta ar fi semnificatia taxonomicd a structurilor bacteriene. Organismul nostru poate fi mediu de viata pentru bacteriile inzestrate cu structuri care le permit si ne acapareze invelisurile, fesuturile, celulele si umorile, Deci anumite structuri bacteriene au semnificapii patogene (F Subcapitolul 6.3). Medicul trebuie si cunoasca diferenjele structurale si functional dintre bacteriile agresoare (celule procariote) gi celulele noastre (celule eucariote) nu numai pentru a descifra mecanismul agresiunii, ci si pentru c& anumite structuri bacteriene pot fi finte selective ale efectorilor imunitari saw ale medicamentelor antibacteriene (F Subcapitolul 7.3.) Celula bacteriand este un siculet citoplasmic, protoplastul, delimitat de membrana citoplasmatica si cuprins in diferite structuri de invelis. Citoplasma cuprinde nucleoplasma, dispusa central, ribosomi si, la unele speci bacteriene, incluziuni, O serie de bacterii au structuri filamentoase (flageli, pili) sau endospori Dimensiunile bacteriilor i ale structurilor le masurim in pm ~ citeste micrometti (10m) si respectiv in nm — citeste nanometri (10°m). Majoritatea bacteriilor au diametru mediu de L-2 jum. Numai unele bacterii particulare masoar 300 nm (chlamidiile) sau chiar 125-250 nm (formele cocoide ale molicutelor). Comparativ cu un macrofag, 0 bacterie de dimensiuni medii are suprafaja de 360 ori, iar volumul de 5000 ori mai mici. De aici decurg, avantajele selective pentru bacterii in raport cu celulele eucariote atat in mediul exten, cat gi in organismele superioare cu care se pot asocia: schimburi mai intense cu ambientul, rati metabolic mai mare, timp de generatie mai scurt, la care se adaugé varietatea mai mare a nutrientilor si surselor de energie pe care le pot utiliza (7° Capitolul 3). 2.1, PROTOPLASTUL BACTERIAN, Citoplasma, La microscopul optic, pe preparate colorate uzual vedem numai citoplasma intens bazofilé si, uneori, incluziuni citoplasmatice. Microscopia electronica pe 2Anatomia functional a bacteriilor — — secfiuni ultrafine oferd detalii structurale (planga 2.1,1). Formata in proportie de 80% din apa, confine intr-un sistem coloidal proteine, carbohidrati, lipide, metaboliti cu molecula mic’ si siruri anorganice. Aflata permanent in stare de gel, este lipsita de curentii generati la celulele eucariote prin altemanga stérii de gel si sol. Aceasta ii permite, in absenta membranelor intracelulare, s men{ina pozitia structurilor inteme. Nucleoplasma, Este un echivalent al nucleului celular. Constituita din ADN, are afinitate pentru coloranti bazici, dar este mascati de bazofilia intensd a citoplasmei bogaté in ARN. {n microscopia optica este observati, numai dupa hidroliza ARN, ca un corpuscul cromatic oval, alungit in halter sau V, in functie de stadiul diviziunii (planga 2.1,2). Pe electronomicrografii ale sectiunilor ultrafine nucleoptasma apare ca un ghem sau scul de fibre cu diametrul de 2-6 nm. Lipsesc membrana nuclear si nucleolul (planga 2.1,2). Eliberata dupa liza menajati a bacteriilor marcate cu timidina tritiatd se deruleaza si, prinsa pe un film proteic, di autoradiografii pe care apare format dintr-un cromosom unic, 0 molecula de ADN circulara, dublu-catenard, lungd de 1000-2000 ym (plansa 2.1,3). Jn situ cromosomul dacterian este helicat si superhelicat in jurul unui miez ARN care il menfine in forma compacta. Sarcinile electronegative ale ADN sunt neutralizate prin poliamine, joni de Mg” si proteine asemanatoare histonelor. Functiile nucleoptasmei sunt prezentate in Capitolul 5 Ribosomii bacterieni au diametrul de 10-20 nm si constanta de sedimentare numai 70 S, in contrast cu cea 80 S a celulelor eucariote. Sunt formati dintr-o unitate 30 $ si una 50 §, care se reunese intr-un complex stabilizat prin ionii de Mg” si poliamine. Sunt foarte numerosi si 2u 0 cineticd rapid’: 0 bacterie cu dimensiuni medii formeaza cca 500 ribosomi/minut pani la un total de 20.000 ribosomi/celuld. Acestea subliniazA intensitatea ‘metabolismului bacterian. Pe electronomicrografii ii observim dispusi ca pofisomi in Tungul moleculelor ARNm pe care le citese gi teaduc eficient si rapid (planga 2.14). Incluziunile citoplasmatice au caracter de specie. Pot fi observate gi la microscopul optic, ceea ce este important pentru identificarea preliminara a unei bacterii — sunt caractere taxonomice primare (planga 2.2,1). Functional, sunt rezerve de nutrienti care se depun, cand bacteria dispune de acestia, in conditii de stres fizico-chimic sau nutritional (e.g., modificati de pH, limitarea altor nutrienti). Sunt constituite din: —Polimetafosfat, ca la Corynebacterium spp., mai ales la C. diphtheriae. Se coloreaz’ metacromatic (e.g., in rogu cur aibastru de metilen policrom) si sunt numite corpusculi Babes- Emst sau incluziuni de volutina. ~Polizaharide: amidon (e.g., Clostridium, Neisseria) sau glicogen (e.g., Bacillus). —Lipide, in special polimeri de B-hidroxiacizi grasi cu lant scurt (e.g., la speci de Bacillus, Clostridium, Pseudomonas). Membrana citoplasmaticd are structura si funcfiile unei membrane biologice, dar 51 particularitai proprii bacteriilor: —Este lipsita de sterofi pentru c& bacteriile nu fi sintetizeaza. Exceptie fac molicutele, bacterii fara perete, care incorporeaz colesterol preformat de organisme eucariote. —Cresterea bacteriilor este posibila numai cind cel putin 50% din membrana citoplasmaticd este semifuida, De aceea bacteriile care cultiva la temperaturi joase singetizeaz’ si incorporeaza in membrana cantit’i mari de acizi grasi nesaturat. =Este unicul sediu al citocromilor, enzimelor si componentelor lanfului respirator implicate in transportul de electroni si fosforilarea oxidativa. In celulele eucariote mitocondriile sunt anatogut functional al membranei citoplasmice bacteriene, aceste organite fiind descendentii unei bacterii devenita endosimbionta. Ro —-—————— Peretele bacterian —Excreta enzimele hidrolitice: in lipsa lizosomilor, la celulele procariote digestia este extracelulara. Membrana citoplasmica a bacteriilor confine seevenfe de cea. 20 aminoacizi, secvente semnal, care leagi: precoce polisomii pentru a asigura apoi excretia proenzimelor hidrolitice, care devin active extracelular dupa clivarea secvenfelor semnal. ~Transportul transmembranar, foarte eficient la bacterii, este asigurat de fosfotransferaza membranard, care, fosforilati in citoplasm®, leagé monozaharide pe suprafata extern’ a memibranei si le transport in citoplasma unde le elibereaz ca zahar fosforilat gata s& fie antrenat in reacfiile metabolice —Are functii particulare de biosinteza: (i) Sinteza fosfolipidelor. (ji) Autoreplicarea genomului bacterian, fiecare replicon fiind permanent in contact cu un situs membranar de replicare. (iii) Sinteza peretelui bacterian. Invaginafii anfractuoase ale membranei citoplasmice, mezosomii, ti maresc suprafaja functional. Enzimele implicate in autoreplicarea nucleoplasmei se concentreazi in mezosomi laterali, iar cele implicate in sinteza peretelui bacterian in mezosomi septali (plansa 2.1,1), Membrana citoplasmica poart receptori pentru semnale din mediul extern: atractani, repelenti si sistemul molecular de integrare a acestor informatii, feromoni (* Capitolu! 5). 2.2. PERETELE BACTERIAN Peretele inveleste protoplastul bacterian, Este format dintr-o structuré de baz si structuri speciale, care diferentiazé grupe mari de bacteri 2.2.1, Structura de bazi Peptidoglicanul este structura de baz particulari eubacteriilar, mare grup care cuprinde si bacteriile patogene, obiectul nostru de studiu. Lipseste din peretele arheobacteriilor, al molicutelor $i al oricarei celule eucariote. Arheobacteriile sunt onganisme primitive adaptate’ la conditii de viata extreme (temperatura, salinitate) niciodatd intilnite in corpul nostru, ca atare sunt bacterii nepatogens. Similitudini genomice si de sintezi proteici ar atesta filiatia organismelor eucariote din arheobacterii O clas a eubacteriilor, Mollicutes, este complet lipsita de perete bacterian, Peptidoglicanul este un heteromacropolimer de dizaharide aminate, N-acetilglucozamina si acid N-acetil muramic. {nlinfuite alternativ in structuri lineare, lanfuri de glican, solidarizate intre ele prin subunit§ti si punti peptidice (fig.2-1). Peptidoglicanul cuprinde protoplastul bacterian ca o plasa rigid’ si rezistenté. Poate fi comparat cu un corset sau Gitoschelet extern, Sinteza peptidoglicanului este controlata de enzime bifunctionale de pe fafa extema a membranei citoplasmatice. Aceste enzime functioneaza ca rransglicozilaze, care Jeaga intre ele cele doud aminozaharuri, si ca transpeptidaze, care catalizeazi formarea subunitatilor si puntilor peptidice, structuri in care dipeptidul D-alanina-D-alanina este esential. Prin lanfurile de glican in formare, peretele bacterian este ancorat la membrana citoplasmica. Enzimele care controleazi sinteza peptidoglicanului sunt numite generic proteine de legare a penicilinelor (PLP) pentru c& penicilina, un analog structural al ~~" D-ala-D-ala, se fixeaza pe ele gi inhiba sinteza peptidoglicanului. Rigiditatea peretelui bacterian este conditionat& de configuratia ste ochiurilor retelei de peptidoglican (fig.2-2). Numai §pirechetete SI bacteriilor au perete rigid care le confera anumite formé> ste ii), de Bastonas (bacilii), ori filamentoase si ramificate (actinomicetele). Formele de baz ale bacteriilor variaza intre anumite limite: e.g., coci sferici, ovali, reniformi; bacili drepti (cu extremititi rotunjite, —-- 23Anatomia funefionald a bacteriilor. retezate drept, efilate sau mAciucate), incurbafi in virguli ori helicoizi. Morfologia bacteriilor Lizozimn \ \ ee Lizozim ee fay 2 ons knead) 2 Kae) Anca. T 7 LALA [Transpeptidare LALA D-LGLI -N Lys D.ALA [GLY]; {GLY}, NAcGIc) \NAcMutr) 5 (NACGK \NAcMur) NAcGk toys (ois Fig, 2-1 Segment din reteaua de peptidoglican a Staphylococcus aureus (vezi textul). Sagetile marcheaza situsul de actiune al lizozimului si penicilinelor. Aminoacizii inlanpuiti ia subunitatile si puntile peptidice sunt importante caractere taxonomice, care diferentiaza speciile, dar studiul lor este accesibil numai chimistilor. NAcGle N-acetil glucozamind, NAcMur acid N-acetil muramic, LALA L-alanin, D-I-GLU-N D-isogiatamina, L-LYS L-lizing, D-ALA D-alanind, GLY glicina Atacul lizozimutut Atacul penicilinei © Acie W-N- acti muramic ooo Teapeptid O Neaceit ghueozamina wee Punte peniapeptsica Fig 2-2. Peptidoglicanul are stracturd tridimensionala cu ochiurile rejelei stranse la bacteriile ‘gram-pozitive (A) si bidimensionala cu ochiurile refelei largi la bacteriile gram-negative (B). 24, a—_——— Peretele bacterian mai este caracterizata si prin asezarea lor, care decurge din modul de inmulfire (diviziune, inmugurite, fragmentare), de pozitia planurilor suecesive de diviziune si numarul de generafii dupa care se separa celulele surori (fig.2-3). BAC el “7 COCL = 7 T Ne 4 é Kd S ¢ en - Mee ae 8 gs srgpoCaRI | Lance A OR ar Teale sai] ILI —_—_—_— ~—Z ~~ t Grog subpirt Tungr Fusiformi, [__ Polimorfi, f = BACILI Dp Z| fA “\A MLS Ze = fA 4s Of) F GREESCS | intone Raita Seema! | Seat | Sete - BACILT iRBATI SPIROCHETE (eG ww eek | N Sf. we EG a c ae as ~™/ ro aa jones ra} a Fig. 2-3 Reprezentare schematic a morfologiei bacteriilor Rezistenfa peptidoglicanului protejeazi protoplastul prin echilibrarea _presiunii cosmotice foarte mari (5-20 atmosfere) din citoplasma bacteriana. Sub actiunea unor agenti muralitici (lizozim, peniciline etc.) apar defecte in structura peretelui, care duc la hemieri ale protoplastului, sau daca sant mai mari la explozia acestuia. Cdnd agentul muralitic actioneazd fntr-un_mediu osmotic protector (e.g., solufie 20% zaharoza, uriné) protoplastul rimane integru, dar ia forma sferici: devine sferoplast, daci mai pastreazi urme de perete (planga 2.2,2), sau protoplast complet nud. Dacd agentul muralitic dispare din mediu,, sferoplastii revin la forma inifiald, caracteristicd bacteriei, dar protoplastii nuzi nu revin, Aceasta arati c resturile de perete bacterian autodeciangeazi sinteza si asamblarea peptidoglicanului Bact ctiv apdrute in medii « rotectoare sunt numiteAnatomia functionald a bacteriilor —— ———__-______-_____ (plansa 2.2,3) sigla Institutului Lister din Londra unde Klineberger Nobel le-a descris pentru prima dati. Peretele bacterian, acest corset rigid, trebuie si se adapteze permanent protoplastului in crestere. Enzime autolitice rup limitat refeaua de peptidoglican si permit inserfia de noi molecule in puncte diseminate aleator pe suprafaja bactesiilor gram-negative sau predominant in vecindtatea septului de diviziune la cele gram-pozitive. In rezumat, interesul medical al peptidoglicanului decurge din; sensibilitatea la lizozim, interferenfa sintezei de cétre unele antibiotice cum sunt penicilinele, antigenitate, proprietai de adjuvant imunologic. 2.2.2. Structurile speciale ale peretefui bacterian Ceea ce vedem colorat in microscopia optici este numai protoplastul, Peretele bacterian nu este colorabil, dar conditioneaz’ profund colorabilitatea protoplastului in coloratiife pe care le numim diferentiale: Gram sau Ziehl-Neelsen. Coloratia Gram diferentiaza bacteriile in gram-pozitive si gram-negative dup’ cum acestea refin coloranti violeti de anilina ori ii pierd sub actiunea decoloranta a alcoolului dupa mordanjare prealabild prin solutie iodo-iodurata. Bacteriile care refin colorantul violet le numim gram-pozitive, iar cele care se decoloreaz® si, pentru a le observa, trebuie si le recoloram (eg., in rosu cu solutie de fuesina bazica) — gram-negative (CD 2-1). Urmarifi in plansa 2.2,4 principalele diferente structurale intre peretii bacteriilor gram pozitive si gram- negative, 2.2.2.1, Peretele bacterian de tip gram-pozitiv are peptidoglicanul organizat in refea ou ochiuri strdnse, tridimensionala, groas4 si omogend (planga 2.2,4). Structuri speciale asociate peptidogticanului la bacteriile gram-pozitive sunt: acizii teichoici, teichuronici si lipoglicanii. Acizii teichoici reprezinta cca 50% din greutatea uscalA a peretelui gram-pozitiv si sunt polimeri hidrosolubili de ribitol sau glicerol fosfati. Se diferentiaza in acizi teichoici de perete, legati covalent la peptidoglican, si aciz! reichoici de membrana (lipoteichoici), legafi covalent de glicolipidele membranei citoplasmice, Functional, acizii teichoici + Stabilizeazi si intirese peretele bacterian. ‘*Leagi” ionii_Mg™ si creeaz’ micromediul ionic necesar functionarii enzimeior vente : — «Sunt gntigen’ majore-de(Suprafajs tite pentru subtiparea serologicé a bacteriilor gram- angens wv pozitive. “— huronie: contin acid uric si polizaharide neutre. Sunt antigene care permit subtiparea unor bacterii gram-pozitive ca lactobacilii si streptococii Lipoglicanii (glicolipide) sunt identificafi la un numar mare de bacterit gram-pozitive la care par a substitui acizii lipoteichoic. Peretele bacterian de tip gram-negativ este subfire, cu structur’ neomogend, complex, in care peptidoglicanul, dispus profund in retea bidimensionala laxd, reprezint& doar 15-20% din greutatea uscatd a peretelui si are asociate urmatoarele structuri speciale: 0 membrana externd, lipoproteine si lipopolizaharide (planga 2.1,4; fig.2-4). Membrana externa este o structuri asimetricd formata dint-un film intem fosfolipidic gi unul extern lipopolizaharidie ale ciror molecule se privese prin potul hidrofob. in acest sandwich fluid al membranei externe floteazA mai multe tipuri de molecule proteice: porine, proteine de transport si enzime. Porinele (Omp A, C, D, F, Lam B, Tsx) penetreaza ambele fete ale membranei si se 4% — —~—-—— -— a ——_—_———— Peretele bacterian_ oligomerizeaza formand pori prin care au acces c&tre protoplast moleculele mici hidrofile ale unor nutrienfi. Porinele Omp A,C,D siF formeazé pori putin specifici prin care difixzeazi _— Uniti oligezaharidioe (Antigen 0) —Croieint Oompa J Tipoprotel ee Fig. 2-4 Structura schematied a peretelui bacterian de tip gram-negativ (adaptat dupa B. Lugteberg si L-V. van Alphen, 1983) liber mici molecule a edror greutate variaza intre 600 daltoni la unele Enterobacteriaceae si 3.000 daltoni la Pseudomonas aeruginosa. Porina Tsx este receptor pentru bacteriofagul T6 si asigura difuziunea transmembranar a nucleozidelor si unor aminoacizi. Lam B este o porind inductibila care functioneazi ca receptor pentru bacteriofagul % si formeazi pori prin care difuzeaza cea mai mare parte din maltoza si maltodextrine. Omp A este o poring abundenta, cu molecule lungi care ancoreaz4 membrana externa la peptidoglican; este receptor pentru mai multi bacteriofagi si pentru pilii sexvali in conjugarea bacteriana (@"Capitolul 5). Proteine specifice mai putin numeroase, asigura transportul transmembranar energodependent al unor nutrienfi cum sunt vitamina By, Fe** ete. Lipoproteinele se leaga covalent, prin polul hidrofil, la peptidoglican si se inser’, prin polul hidrofob, in membrana externa solidarizand cele doug structuri Lipopolizaharidul (LPS) este un heteropolimer linear dispus in film pe suprafata distal a membranei externe. in structura LPS identifictim: —Un segment proximal, lipidul A, format din unititi dizaharidice fosforilate de glucozamina legate prin punfi pirofosfat de B-hidroxiacizi grasi cu 10-17 C, caracteristici oe aAnatomia functionala a bacteriilor — — pentru grupe mari de bacterii (acidul f-hidroximiristic pentru Enterobacteriaceae, acidul Behidroxidecanoic pentru Pseudomonadaceae etc.) Un miez polizaharidic a c&rui parte profunda, format din glucoz’-heptoza si 2-ceto-3- deoxioctonat (KDO), numita ,coloand vertebrala”, este comund tuturor bacteriilor gram- negative. Prin KDO miezul polizaharidic se leaga de glucozamina lipidului A, Miezul polizaharidic constituie antigenul R al bacteriilor gram-negative si este un important activator al complementului pe calea alternativa —Unitafi zaharidice repetaté (trizaharide lineare la cele mai multe bacterii, dar pot fi si tetra- sau pentazaharide ramificate) mascheaz miezul polizaharidic si constituie un important antigen al bacteriilor gram-negative, pe care il numim antigen O (fig.2-4). Antigenul O ‘imparte speciile in grupe serologice. Acest antigen asigura bacteriei o puternicd inc&rcatura clectronegativa si hidrofilie, ambele implicate in stabilitatea suspensiilor bacteriene, aspectul neted, umed, lucios al coloniilor (forma de cultura S, de la engl. smooth: neted) si efectul antifagocitar. Prin mascarea miezului polizaharidic. antigenul O previne activarea comple- mentului pe calea alternativa si priveazi gazda de o bariera antibacteriana cu eficienti ime~ diata, Lipopolizaharidul este codificat de mai multe gene, Mutafii pot determina pierderea capacitifii de sintezi a segmentelor distale ale LPS, dar niciodata a lipidului A si KDO (fig.2- 5). Mutantele R sunt favorizate prin subcultivarea pe medii artificiale si genereazd clone R (®Capitolul 5), care sunt autoaglutinabile, formeaza colonii rugoase (forma de cultura R, de fa engl. rough: rugos), sunt usor fagocitate gi sunt lizate de complementul pe care il activeazi pe calea alternativa, Regivnea ti Regiunea I Lipid A Miez: Antigen "R’ J ro 7 5 ACG => Gle—NAc—{KDO)}—Hep-—Gle —Gal—GleNAc > n225e Resa fo Nas AKDOI Hype Galea 225 ReGmache wae nef itby | ch ASC Ge— Nace] te | at ActM Po Fig, 2-5 Structura LPS si aparitia matantelor Ra-Re, functie de segmentul molecular distal care nu mai poate fi sintetizat Spatiul periplasmic se constituie intre membrana citoplasmica si membrana externa a bacteriilor gram-negative. Contine: peptidoglicanul, enzime implicate in digestia extracelular& ori inactivarea unor antibiotice, fibrele axiale ale spirochetelor. Dac& adaugim si permeabilitatea selectiva a membranei externe, infelegem cum spatiul periplasmic confera, mai ales bacililor gram-negativi, avantaje selective cum ar fi acapararea mediilor apoase minimale nuttitiv, chiar in prezenfa unor substante antibacteriene. Bacteriile gram-pozitive, ale ciror enzime se dilueaza in exterior, au nevoie de medii bogate in nutrienti si sunt natural mai sensibile la actiunea substantelor antibacteriene. 2.2.2.3. Peretele bacterian de tip acido-rezistent. Unele bacterii, ca micobacteriile, au asociate peptidoglicanalui glicolipide complexe care le confer particularititi de colorabilitate. Colorantii nu penetreazé in conditii uzuale prin peretele lor, incat aceste 28 - - =Peretele bacterian bacterii se coloreaza slab sau deloc prin coloratia Gram. Pot fi colorate insa la cald, in rosu, eu solufie de fuesina bazica concentrata si rezista 1a decolorarea cu acizi si alcool. De aceea le numim bacterii acido-alcoolo-rezistente. In aceste conditii restul bacteriilor sunt decolorate — le numim neacido-rezistente — gi pentru a fi observate le recolorim cu albastru de metilen (CD 2-2), Lipidele reprezinta 60% din greutatea uscati a peretelui micobacteriilor, proportie mult mai mare decat la alte bacterii. Structurile speciale ale peretilor acido-rezistenti sunt: arabinogalactanul, acizi micolici, lipoarabinomananii si micozidele (fig.2-6). Paige Sen — 000 ones SS ee ae Aion rpidsion O90 000CCO0OE sem BRR ARRRARREN “RUA Fig. 2-6 Structura schematicd a peretelui bacterian acido-rezistent Arabinogalactanul este un polizaharid care acoperi peptidoglicanul si are unele dintre proprietaile endotoxinelor (7 Capitolul 6). Acizii micoliei sunt B-hidroxiacizi grasi cu catend lung’ ramificata. Acido-rezistenta este in raport cu lungimea catenei carbonate a acizilor micolici: la micobacterii (puternic acido-rezistente) au 70-90 atomi de carbon, la nocardii (slab acido-rezistente) 40-60, iar la corinebacterii (neacido-rezistente) numai 22-38. Complexul arabinogalactan-acizi micolici confer rezistenta deosebiti a micobacteriilor in mediul extem (desicare, antiseptice si dezinfectante), la majoritatea chimioterapicelor si limiteaz posibilitatile de izolare a acizilor nucleici micobacterieni pentru studii de biologie moleculara. Complexul lipoarabinoglican si fosfolipidele micobacteriene influenteazi reactia tisulara a gazdei cu formarea de granuloame, metaplazierea macrofagelor in celule gigante multinucleate (celule Langhans) si celule epitelioide. Micozidele sunt peptidoglicolipide si glicolipide fenolice care formeazi in jurul micobacteriilor un invelis protector fafa de enzimele lizosomale din fagolizosomul macrofagelor. 2.3. STRATURILE S Straturile § sunt un inves distal peretelui bacterian intanit la arheobacteri gi la unele eubscteri care trBiesc in condi extreme (de temperatura, pH, potential redox) ori in nige metabolic restrictive (eg. restietit de fier). Au fox bine stuiate la Campylobacter, Helicobacter si Aeromonas, la care pot reprezenta pind la 20% din totalul proteinelor celulare, Apar ca structuri proteice sau glicoproteice paracristaine formate din multimeri eu forme pitrate, hexagonale ori cu dispozitie oblicd. Antigenul O si unele porine ancoreaza stratul S la peret. Acest invelis protejeaza bacterile de fagocite, de molecule nocive ale gazdei (e.g., proteaze, complement, anticorp), de infectia cu bacteriofagi. Poate lega Fe", porfirine, numeroase proteine extracelulare. a $$ 29Anatomia functional a baeteriilor ————____ 2.4. GLICOCALIXUL PROCARIOT Glicocalixul este un invelig, in general polizaharidic, dispus distal peretelui numai la unele tulpini bacteriene, deci nu este caracter taxonomic, Glicocalixul structurat dens nu poate fi separat de bacterie prin centrifugare si nu este penetrat de particule colorate incat este vizualizat, in coloratiile negative cu tus de India ori nigrozina, ca o capsula incolora. Glicocalixul structurat lax, numit substanf’ capsularé ori slime, poate fi separat de corpii bacterieni prin centrifugare si este penetrat de particule colorate incat a fost studiat numai la microscopul electronic dupa colorafie special cu rosu ruteniu (planga 2.3,1,2,3). Prin structura sa fibrilara, glicocalixul formezzii in jurul bacteriei o ‘matrice anionica protectoare fata de agenti chimici, de amoebe sau fagocite. Funefioneaza ca ligand la membranele mucoase (plana 2.3,1), la celulele eucariote si intre celulele procariote (plansa 2.3,2) ori la suprafefe inerte (planga 2.3,3,4). Ca ligand, glicocalixul are rol important in nutritia si virulenta bacteriilor: prin refeaua fibrilard a glicocalixurilor intrepatrunse citotoxinele si enzimele bacteriene difuzeazd direct c&tre celulele eucariote, iar nutrientii rezuitati din liza celulard direct cdtre bacterie fird a se dilua in mediu (fig.2-7). CELULA ANIMALA A Fostotipia O Proveina 3 lipid S Nateiengi % Citotoxina A Hidrolaze bacteriene [LF Polimeraca 3a Glicocalix eucariot ‘#4 Glicocalix procariot == Legituri covalente sade hidrogen Fig. 2-7 Funotiile glicocalixului bacterian: fibrele glicocalixutui procariot gi eucariot delimiteazd un micromediu in care citotoxinele gi enzimele bacteriene difuuzeaza, far a se dilua in medi, ataca gi digera structurile celulei animale pe care le canalizeaza ca nutrienti spre bacterie 2.5, ORGANITELE DE LOCOMOTIE ALE BACTERIILOR Mobilitatea bacteriilor este asigurata prin flageli sau prin fibre axiale. Flagelii sunt organite filamentoase, lungi de 6-20 jim, flexuoase, uniform calibrate si cu structura proteicl. Prin microscopia optica a preparatelor special colorate observam absen{a ori prezenfa, cu numarul si dispozitia flagelilor (fig.2-8). Mobilitatea bacteriilor poate fi urmérita gi indirect prin microscopia preparatului umed intre lama si lamela 30 - -= —_—— Organitele de locomotie ale bacteriilor (® Subcapitolul 2.8.2.) sau prin cultivarea bacteriei intr-o coloan’ de gelozi moale jinsimanfata prin infepare (fig.2-9). Prezenta, numarul si dispozitia flagelilor sunt importante caractere taxonomice primare, Proteina flagelilor este antigen, antigenul H, cu specificitate de tip. Fig. 2-8 Bacterile pot i Aatriche B monotice S C lofotriche Damfitriche 2 if E peritriche WN B c D S&S ‘De A Microscopia electronica ne arati structura fina a flagelilor bacterieni: filamentul lung si flexuos se articuleaza cu un carlig rigid terminat cu un complex bazal format la bacteriile gram- pozitive dint-un inel M, flotant in membrana citoplasmica, si unul S, supramembranar. La bacteriile gram-negative apar suplimentar un inel P, in stratul de peptidoglican, si unul L, flotant in membrana externa (planga 2.2,4), Fluxul de protoni dintre inelele M si S determina rotatia cArligului, care se transmite flagelului. Chemotaxia bacteriilor este controlata de receptori membranari specifici care fixeazi atractani (molecule utile bacteriei) sau repelenfi (molecule nocive) si genereazi un semnal transmis complexului bazal, Acest _semnal determin’ sensul rotatiei inelelor si prin aceasta miscarea bacteriei_ in gradientul chimic: apropierea de atractangi, indepirtarea de repelenti. Baie Bactcie Fibrele axiale, analogii flagelilor la imobila ——mobila spirochete, sunt cuprinse in spafiul periplasmic, unde, pornind de la inserja lor polar se ditjeaza Te ee ae eae ravetull cu extremitatea liberd spre porfiunea mijlocie a Ge insamantare si lad transparent medi (A), protoplastului. La treponeme gi borrelii fibrele una mobili invadeazA si pacified mediul (B) axiale, mai subtiri si mai multe, se inruleaz in jurul protoplastului (planga 2.3,5). La leptospire sunt numai doud, mai groase, constituind un axistil in jurul cdruia se inruleaz& protoplastul (plansa 2.3,6). He Fig. 2-9 Testul de mobilitate: o bacterie 2.6. PILIT BACTERIENI Pilii sunt organite filamentoase rigide, mai scurte decat flagelii si vizibile numai la microscopul electronic. Pot fi pili comuni gi pili sexuali. Ambele tipuri, codificate plasmidic (* Capitotul 5), sunt caractere de tulpina fara valoare taxonomica.functional a bacteribor — Pili receptori specifici de pe suprafata membranelor mucoase (planga 2.4,1), comuni sau fimbriile sunt dispusi peritrich si functioneazi ca adezine la Pili sexuali sunt structuri tubulare prezente in numar redus pe suprafata bacteriilor gram-negative care poarta plasmide numite conjugoni pentru ca acesti pili, fixati pe receptori bacterieni specifici, sunt implicafi in conjugarea bacteriand, una dintre modalitatil transferului genetic (7 Capitolul 5). 2.7. ENDOSPORII BACTERIENI Endosporii sunt forme de rezistenti prin care speciile de Bacillus si Clostridium supraviefuiesc desicate th conditii defavorabile de mediu. Sunt particularizati_printr-un complex de structuri codificate de gene represate in viata vegetativa a acestor bacterii si derepresate in conditii defavorabile de mediu, cand devin represate genele vegetative. in structura unui endospor distingem: ‘*Protoplastul deshidratat si cu confinut mare de dipicolinat de caleiu, care ii confera termorezisten{a. + Un sistem de invelisuri in care identificam: peretele sporal structurat din peptidoglican; un cortex gros format dintr-un peptidoglican foarte sensibil la enzimele autolitice; dou’ tunici proteice (interna si externa) bogate in cisteind i legaturi disulfidice, care asigur’ rezistenja endosporilor la agenti chimici si radiatii in stare deshidrataté supraviefuiesc multi ani. Endosporii recepteazi conditiile favorabile de mediu (prezenta apei si unor nutrienfi). Acest semnal declanseaz germinarea, care incepe prin activarea unei autolizine a cortexului. Apa si nutrientii difuzeazi spre protoplast, care, rehidratat, creste in volum si rupe inveligurile sporale eliberand bacteria in stare vegetativa (planga 2.4,2). Endosporii, usor observati in microscopia uzualé, cu forma lor sfericd ori ovals, dispusi central, subterminal sau terminal si cu diametrul mai mare sau mai mic decat al bacteriei, sunt importante caractere taxonomice primare. Dup’ coloratia Gram rman incolori. Pot fi mai bine observati prin coloratii speciale care permit colorantului s& treac& prin inveligurile sporale. Aga, in colorafia Ziehl-Neelsen endosporii se coloreaza in rogu, iar bacteriile care ii confin in albastru, 2.8. MICROSCOPIA UZUALA 2.8.1. Microscopul Microscopul asociaza doud sisteme de lentile: obiectivul, sistem de lentile cu distanta focala de ordinul mm, situat catre obiectul examinat, si oewiarul, sistem de lentile cu distanta focal de ordinul cm, situat catre ochiul examinatorului. Un sistem mecanie si un sistem de iluminare asigura focusarea si observarea optim’ a obiectului examinat. Functionarea cuplata a celor doua sisteme de lentile ofera observatorului imaginea virtual, mult maritd, rastumati si plasata la distanta minima vederii clare. (20-25 cm), care corespunde aproximativ nivelului mesei port-obiect a microscopului (fig.2-10). in functie de mare’, microscoapele difera detalii de amplasare si functionare a reperelor sistemului mecanic si de iluminare. De aceea, in acest capitol gisiti numai descrierea lor general, iar amanuntele le veti primi si respecta la lucrarile practice, functie de microscoapele cu care veti lucra, Partea mecanied a microscopul braful, tubul si masufa port-obiect.. cuprinde: piciorul, corpul ansamblului miscarilor, 32 ~————-—Microscopia uzuala Piciorul (1) asigura stabilitatea microscopului Corpul ansamblului miscarilor (3) include mecanismele si butoanele de focalizare grosiera si find a imaginii obiectului (2) i butonul de focalizare a imaginii diafragmei de aperturi a condensorului (5). Functie de microscop, butoanele migedrii grosiere gi fine sunt pozitionate independent sau sunt coaxiale. Indiferent de situafie, butonul migcarii fine este marcat in diviziuni care tree prin fafa unui reper de pe colierul butonului. Fiecare diviziune asigurio migcare pe vertical a tubului sau a mesei port-obiect (functie de modelul microscopului) de ordinul micrometrifor. Domeniul de lucru al migcéri fine este de cca 1,7 mm. Miscarea liber in ambele sensuri a tubului respectiv a mesei port-obiect o asigurim pozitiondnd butonul la jumdtatea cursei intre aceste extreme. Fig. 2-10 Reperele microscopului optic Nikon CF160 ( vezi textul ) Bragul (6) poarta tubul optic al microscopului. Masa port-obiect (12) are o deschidere central’ pentru iluminarea obiectului, suportii reglabili pentru fixarea lamei port-obiect si, la partea inferioar’, dowd butoane concentrice care fi controleazi migcarea antero-posterioar’ gi transversala (4). Doud sisteme vernier permit misurarea miscarilor in fiecare ax’. Sistemul optic, Tubul microscopului (9) poarta cele doua sisteme de lentile care formeazi imaginea obiectului examinat. Ocularele (8) sunt telescoape la partea superioar’ a tubului. Microscoapele moderne, mono- sau binoculare, asiguri examinarea comoda prin inclinarea la 45° a sistemului ocular. Aga masa port-obiect este mentinutdi permanent. orizontal’. — — 33Anatomia functional a bacteriilor —____— La aceste microscoape razele care formeazi imaginea obiectului sunt dirijate cdtre ochi printr- un sistem de lentile, oglinzi si prisme cuprins in angularea tubului (7). Objectivele (11), ingurubate in capul revolver (10) din partea inferioara a tubului, pot fi aduse pe rind in axul optic. La rotirea capului revolver, un declic semnaleaza pozitionarea corectii a obiectivului in ax. Puterea de médrire a microscopului este produsul dintre puterea de mirire a obiectivului cu cea a ocularului si capului binocular (valori gravate pe montura acestor piese).. Produsul arati de cate ori diametrul imaginii este mai mare decat diametrul obiectului examinat. Distanja de Jueru a objectivului este distanta dintre lentila frontala a obiectivului, cand acesta este focalizat pe un preparat subjire, si suprafaja lamelei de acoperire a preparatului (fig.2-11). Distanja de lucru este invers proportional cu puterea de mirire a obiectivului. De aceea, cénd focalizim imaginea, pentru a evita spargerea preparatului si degradarea lentilei frontale a obiectivului prin apsarea excesiva pe lama, obiectivele cu matire putemica trebuie manipulate cu atentie. Marirea util oferi detalii ale obiectului real. Cand depiseste 0 anumita fimitd marirea nu mai ofera aceste detalii si 90x 40x 10x devine mdrire goalé, inutilizabila. Marirea util’ este functie de puterea de rezolutie a obiectivului definita prin ecuatia: 0,08 047 53 a — SS Oo ~~, ObiectiveuObiectiv useat _Obiectiv useat 2AN imersie putemic -cumrire redusi unde: d este puterea de rezolutie (adica Fig. 2-11 Relajia dintre puterea de marire si distanfa_ minima dintre dowa puncte distanfa de lucru a obiectivelor luminoase ale preparatului_ pentru care obiectivul mai ofera ochiului imagini distincte), A lungimea de und& a luminii utilizate, AN’ apertura numeric a obiectivului, Apertura numericd exprimi cantitatea de lumind utilizat pentru formarea imaginii. Ea rezulta din ecuatia: AN =n-sina, unde: n este indicele de refractie al mediului dintre obiect si lentila obiectivului, a semiunghiul de deschidere al lentilei aflat cu varful in focar (fig.2-12), Obiectivele uscate au apertura numeric& teoreticd maxima 1,0 pentru c& indicele de refractie al acrului este 1,0 iar sin 90° (valoarea maxima a unghiului a cénd lentila obiectivului este aplicata pe obiect) este de asemenea 1,0. Obiectivele cu imersie folosesc intre obiect si lentilé un mediu cu indicele de refractie mai mare decat al aerului si apropiat de cel al sticlei, ca uleiul de cedru cu n=1,515. Calitatea imaginii este functie si de capacitatea definitorie a obiectivului, capacitatea de a forma imagini cu contur net, precis. Capacitatea definitorie este asigurati prin corectia aberafiilor sfericd si cromatica a lentilelor. Obiectivele acromate, cu aberatia cromatica corectata prin suprapunerea focarukii a doua radiatii, le utilizim fn microscopia curenta si au apertura numericé de maximum 1,25. Obiectivele apocromate, cu aberatia cromatic’ corectaté prin suprapunerea focarului a trei radiagii au apertura numericd maximé de 1,30. Pe montura obiectivelor sunt gravati parametrii care ne ajut si alegem cel mai indicat obiectiv pentru un scop dat: puterea de marie, apertura numerici, Jungimea tubului si grosimea lamelei de acoperire a preparatului pentru care este corectat obiectivul (fig.2-13). Corectia aberatiilor este mentionati numai pe obiectivele apocromate. in microbiclogia clinic& utilizam curent obiective acromate (e.g, 10X/0, 30/1604; 90X sau 100X/1,35/160/0,17) la care asociem, dupa necesitatile de marire, oculare 5X, 7X, sau 10X. 34— -_ i Microscopia uzuali Sistemul de iluminare. Sursa de lumina este inclusa in talpa microscopului (15), iar lumina focusaté pe obiect printr-un condensor (13). La unele mieroscoape, pentru cazuri de fort major, o oglinda permite folosirea unei surse exterioare de lumina (e.g., lumina solara). Curent folosim condensorul de cémp luminos. Iluminarea adecvati a preparatului impune adaptarea aperturii numerice a condensorului, gravati pe montura lentilelor, la apertura numericd a obiectivuluj, Altiel, in microscop patrunde fie prea mult lumina (stralucire supirdtoare a imaginii), fie prea putina (pierderea unor detalii ale imaginii). Cele doua aperturi, a condensorului si obiectivului, sunt concordante Axoptic And, coborand sau urcind condensorul, objinem cea mai clara imagine a diafragmei de aperturi a condensorului. Cu cat ridicim mai sus condensorul,.cu atét apertura sa numeric& creste si atinge 0 valoare nominalé (maxima) cand lentila condensorului se aplica pe fafa inferioar’ a lamei port-obie Diafragma de apertura este o diafragma iris manipulat’ printr o parghie lateral (14). Deschiderea spre maximum a diafragmei de apertura creste puterea de rezolutie, dar scade contrastul imaginii; invers, micsorarea ei scade puterea de rezolutie, dar creste contrastul imaginii. Condensorul pentru cémp intunecat este un condensor cu oglinzi sferice concentrice (fig.2-14). Razele de lumina directe sunt oprite prin reflectie pe oglinda sfericd centrala, ceea ce creeazi campul intunecat. Obiectul este iluminat numai prin raze oblice, care, reflectate si difractate, patrund in obiectiv si formeazi imaginea luminoasi a obiectului pe fondul intunecat al cAmpului microscopic. Obiectiv Lentilé frontal’ ‘Surs de lumina 2-12 Unghiul de aperturd schematic 2.8.2. Preparate microscopice necolorate (umede) Citoplasma, incolora, are indice de refractie putin diferit de al mediului de suspensie. De aceea in preparatele umede microorganismele sunt vizibile numai in conditii speciale de iluminare: e.g., reducerea diaftagmei de aperturd, microscopie pe fond negru, Examinam preparate umede pentru a observa rapid mobilitatea bacteriilor sau prezenta spirochetelor, a fungilor ori protozoarelor. Pregitirea preparatului microscopic umed. Depune pe 0 lama curaté si degresatd 0 picdturi din uleoasa produsul_de “examinat folosind ansa sau o pipet. sapilani. Cu grija, pentru rinde bule de aer, acoperd picdtura cu o Jamel}ale cArei marginy le TT Aperturi rumericé uns in_prealabil cu ul a ntru a preveni Lungimea zgsimes rT lei de parafin’ pentru a py mecanica lametet uscarea preparatului in cursul examina. atubulut Examinarea: ajcaza preparatul pe masa port- . “tine obiect. Adu in axul microscopulurcel mai convenabil F¥8 2-13 Parametrit gravati pe montura “Diectiv uscat. Privind lateral apropie obiectivul cat uunut obicetiv ‘mai mult de preparat jindnd cont de distanfa de lucru a fiecirui obiectiv. Priveste prin ocular si, actionand cu atentie butonul miscarii grosiere, mareste progresiv distanta dintre obiectiv gi preparat pan prinzi imaginea, Coboara condensorul si inchide diaftagma de apertura pand obfii cel mai convenabil contrast. Focuseazé imaginea, daci mai este cazul, cu butonul _ — - 35Anatomia functionala a bacteriilor. migcarii fine (inoperant 1a examenul cu obiectivul 10X). © bacterie este mobila cand isi schimba pozitia in raport cu alte bacterii. Nu confunda migcarea browniand (oscilatii pe loc ale obiectului) sau mobilizarea printr-un curent de fluid (miscarea tuturor obiectelor in acelasi sens) cu mobilitatea reali, Dupd examinare, depune preparatal in recipientul cu solutie dezinfectanta. Microscopia cu fond intunecat este examenul de electie pentru observarea rapid’ a spirochetelor cu mobilitatea lor‘caracteristicd. Monteaza la microscop condensorul pentru iluminarea cu fond intunecat. Depune pe lentila superioara a condensorului o picdtur’ de ulei de cedru, Pune preparatul umed pe masa microscopului cu grij& si f& contactul intre lam& si condensor fird s& prinzi bule de aer. Lamele pentru microscopia pe fond negru trebuie s& aiba grosimea de 1,0-1,1 mm pentru a situa preparatul in focarul condensorului (distanta focal 1,2 mm). Examineazi preparatul cu obiectivul 20X. Dupa examinare, depune preparatu! in recipientul cu solutie dezinfectanta. Sterge cu grija uleiul de cedru de pe lentila condensorului. 2.8.3, Preparate microscopice colorate Obicetiv — Efectuarea frotiului. Frotiul este materialul mictobian (produs patologic, _-Lamela cultura microbiana) etalat in strat cat mai ‘Ulei de cedru Subtire si uniform pe suprafata unei lame de microscop. Foloseste lame de microscop curate (de preferinta noi) si bine degresate. Marcheaza lama, la una din extremitifi, cu indicativul materialului_ microbian ce urmeazi a fi etalat. Efectuarea frotiului |—Condensor presupune trei timpi: etalarea, uscarea $i fixarea, Etalarea 0 facem diferit in cazul suspensiilor bacteriene (prelevate pato- logice, culturi in medii lichide) si al culturilor pe medii agarizate (plansa 2.4,3) # Suspensii bacteriene. Preleva aseptic © ansi din suspensia bacterian’. Depune prelevatul in centrul Jamei. Etaleaz& in strat ct mai subire si uniform prin migcari cirewlare excentrice fir a mai reveni cu ansa pe aceeasi suprafata si Pari a atinge marginile amei. * Colonii bacteriene. Depune o picatura de apa distilata in centrul lamei. Preleva cu ansa 0 secfiune din colonie. Depune cultura langa picdtura si omogenizeaz-o intr-o cantitate mica de apa prelevata din pictur’. Uneste cele dou’ picdturi gi etaleaza ca in cazul suspensiilor. in cursul etalarii evita ruperea peliculei de fluid prin ridicarea bruscd a ansei de pe lama. Minimizezi astfel formarea de aerosoli contaminanti Din fragmente de fesuturi putem efectua amprente: aplicd lama pe suprafata de secfiune a piesei biopsice sau necropsice pentru a obfine in zona central amprenta tesutului. Formatiuni granulare din puroi pot fi etalate prin zdrobire intre dou lame. Usued frotiul in aet. Uscarea pe 0 suprafata incalzita (platina incalzitoare) este mai rapid’ gi eviti distorsiuni ale celulelor (e.g., din puroi, urina) prin hiperconcentrare salina lenta in centrul frotiului din prelevate patologice fluide. Fixarea prin cAldurd. Trece lama, {inut& cu frotiul in sus, prin flacira unui bec de gaz. de 2-3 ori, cca 5-10 secunde. Sursé de luming Fig. 2-14 Coadensorul cu oglinzi sferice concentrice ‘pentru iluminares obiectului pe fond intunecat 36 =Microscopia uzuali 2.8.4, Colorarea Prin colorare asigurim un contrast mai bun intre microorganisme, celule si fondul preparatului decdt cel realizat in preparatele umede necolorate, In bacteriologie folosim coloranti bazici (siruri ale unei baze colorate cu acid incolot) derivati de pararozanili (violet de metil, fuesin’ bazicd, etc.) sau thionina (albastru de metilen), care au afinitate pentru structurile acide atat de bogate in celula bacteriana. Curent folosim coloratia simpla cu albastru de metilen si coloratiile diferentiale Gram sau ZiehI-Neelsen, Colorafia simpli cu atbastru de metilen. Pune pe suportul de colorare lama cu frotiul in sus. Acoper’ frotiul cu solufia colorant de albastru de metilen (de preferat solutie poficroma). Mentine 30-60 secunde. Spal cu apa de robinet. Usuc& si examineazi frotiul la microscop. Toate elementele (bacterii, celule) apar colorate in albastru. Exceptie fac structurile care se coloreaza metacromatic in roz sau rogu. Coloratia diferential’ Gram presupune colorarea, mordanfarea, diferenierea si recolorarea (CD 2-1). (i) Colorarea: acopera frotiut cu solutie 0,2% violet de metil. Mengine un minut si spald cu api de robinet. (ii) Mordanjarea: spala frotiul cu cateva picdturi de solutie Lugol. Acoper’ frotiul eu ‘olutie Lugol si mentine dou’ minute, Varsa si, fara a spala, treci la timpul urmiitor. (iii)Diferengierea. Acoperd frotiul cu amestec alcool 96°-acetona (3/1 v/v). Da lamei ugoare miscari de inclinare pentru a favoriza decolorarea. Spal cu apa de robinet dupa 5-10 secunde frotiurile din culturi si dupa 10-15 secunde frotiurile din prelevate patologice. (iv)Recolorarea, Acopers frotiul cu solutie de fucsina fenicata Zieh! diluatd1/10. Menfine 30 secunde. Spat cu apa de robinet, usuca si examineazi microscopic. Rezultate. Bacteriile gram-pozitive apar violete, cele gram-negative rosi leucocitele cu citoplasma roz si nueleul rosu. Controlul de calitate. Diferentierea corecti a caracterului Gram este esentiald pentru identificarea bacteriilor. Pentru fiecare lot de reactivi gi zi de Iucru, coloreaza si examineaz un frotiu martor efectuat din amestecul suspensitlor de Escherichia coli (bacil gram-negativ) si Bacillus megaterium (bacil gram-pozitiv) omorate prin autoclavare. Pe frotiul martor diferenfa intre buciiii rosii si cei violefi trebuie sa fie neta (CD 2-2). Pe frotiurile din prelevate patologice, verifica in primul rand culoarea leucocitelor, elementul constant gram-negativ. Daca leucocitele sunt violete, diferenticrea a fost insuficienta. Caut& cAmpuri cu leucocite rosii. Prezenja bacteriilor violete printre leucocitele rosii garanteazi o bun’ diferentiere. Nu mai avem aceeasi siguranti daca bacteriile prezente in produs sunt exclusiv gram negative. Coloratia diferentiali Ziehl-Neelsen presupune: colorarea, diferentierea i recolorarea (CD 2-3), . (i) Colorarea: acoper’ frotiul cu solujie de fucsind fenicat& Ziehl. incdtzeste lama cu Jampa de spirt pana la emiterea de vapori. Menine 3-5 minute aceasta temperatura. Dupa Nicire, spald abundent lama cu apa de robinet. (ii) Diferenjierea: acopera frotiul cu solutie 3% de acid clothidric in alco! de 96°. Decoloreaza pana cand frotiul ramdne alburiu dupa spAlarea cu aps. (iii)Recolorarea: acopera frotiul cu soluie de albastru de metilen pentru 30 secunde. Spala cu api de robinet, usucd si examineazi microscopic. Rezultate. Bacilii acido-rezisten{i apar rosii, iar bacteriile neacido-rezistente $i Jeucocitele albastre. Controlul de calitare, Coloreaza $i examineazi doua frotiuri, Unul dintr-o suspensie de bacili acido-rezistenti, celalalt dintr-o suspensie de bacili neacido-rezistenfi. Pe primal frotiu trebuie s& vedem numai bacili rosii, pe al doilea numai albastri. iar —-—- -37Anatomia functionala a bacteriilor- 2.8.5. Microscopia cu imersie si deserierea unui frotiu Examinarea, Depune o pictur de ulei de cedru pe frotiu fara a-1 atinge cu bagheta. Fixeazi lama pe masufa microscopului. Adu in axul optic obiectivul cu imersie. Ridicd condensorul la maxim. Privind lateral, actioneazi butonul migcarii grosiere pentru a aduce in contact obiectivul cu uleiul de cedru cit mai aproape de lama. Priveste prin ocular si manipuleaz atent butonul miscdrii grosiere pentru a indeparta obiectivul de preparat pana prinzi imaginea. Focuseazi imaginea actionfind butonul miscarii fine. La terminarea examenului: distanfeaza obiectivul de preparat si ia lama de pe masa microscopului, indeparteazi complet uleiul de cedru de pe lentila obiectivului prin stergere cu © hartie special sau cu pulpa degetului (care trebuie sters imediat cu tifon) pentru a nu murdari prin atingere suprafefe ale microscopului. Scoate obiectivul din ax prin rotirea revolverului, Acoperd microscopul cu husa sau pune-| in cutie. Descrierea frotiului. Bacteriile observate trebuie descrise in termeni de categorie microscopica (forma, marime relativa, asezare, afinitate tinctoriald), numdir si raporturile cu celulele din prelevatul patologic (celule inflamatorii sau celule epiteliale scuamoase).Plange SAPITOLUL 2PLANSA 2.1 2.1 ANATOMIA FUNCTIONALA A BACTERIILOR 1. Sectiuni ultrafine prin bacterii, electronomicrografii: ¢ capsuld, g glicocalix, me membrana citoplasmic’, m mezosomi, n nucleoplasma, p perete, s sept de diviziune. 2. Nucleoplasma bacteriand, aspecte: sus microscopie opticd pe preparat colorat Feulgen dupa hidroliza acizilor nucleici, Nucleoplasma apare ca un corp cromatic. Feulgen pozitiv (functia aldehidicd a dezoxiribozei recoloreaza in rosu fucsina bazica decolorata in prealabil de acidul sulfuros), Observaji forma ovalé, alungita in bastonas, in haltera sau in V a nucleoplasmei, functie de stadiul diviziunii bacteriene. In cartus aspectul preparatului cu o marire mai redust; jos detaliu electronomicrografic: nucleoplasma la inceputul autoreplicarii (stinga) si spre sfargitul acesteia (dreapta). 3. Autoradiografia cromosomului de Escherichia coli. Pe schema: linia continua sugereazi catena parental iar linia intrerupta — catena progena. (J. Cairns, 1963) 4. Ribosomi bacterieni, electronomicrografii: A cele doud componente ale ribosomilor, reunite gi separate, fotografiate din mai multe unghiuri; B ARNm (sigeata) tradus de ribosomi alineati in polisom (in stinga segmentul de cromosom de unde a fost transcris mesajul genetic); C zona dintr-o celuli de E. coli, observati densitatea mare a ribosomilor alineati in polisomi.NUTRITIA, METABOLISMUL $I CRESTEREA 3 BACTERIILOR GABRIELA COMAN »Daci o bacterie functioneazd cu virtuitate, aceasta se atoreazit faptului c& sirdmosii sii si-au exerciat dibacia in aceasté chimie, timp de dowd miliande de ani, noténdu-si cu constinciozitate refets flecdrel reusite Ceea ce incearcd sd faci fiird intrerupere o bacterie sunt doud bacterit. lata, pare-se singurul sau fel, singura sa ambitie. Visul fiecarei celule: sd devind dowd celule.” FRANCOIS JACOB Celula bacteriand este capabila si-gi sintetizeze propriile macromolecule, structurale gi functionale, plecdnd de la compusi cu greutate moleculard pe care fi obfine prin degradarea compusilor macromoleculari prezenti in mediul de viata. 3.1. NUTRITIA BACTERIANA Nutritia este asimilarea de cdtre bacterii a substanfelor nutritive, organice si anorganice, din mediul exten, necesare metabolismufui. Nutrieptii sunt substanfe ale ciror solufiiGot\traversa membrana citoplasmatica, urmand sa participe apoi la reactiile metabolice care asigutd cresterea si inmulfirea celulei, In mediile naturale, bacteriile gasesc pentru nutritie compusi din care deriva nutrientii, unii prin simpl& solvire (siruri minerale, CO», O2), aljii dup’ o digestie extracelulard prealabild, cu intervenfia unor hidrolaze (proteaze, lipaze, amilaze, etc.). Produsele care iau nastere sunt scurte fragmente polipeptidice sau aminoacizi in cazul proteinelor, monozaharide in cazul polizaharidelor, acizi grasi si glicerol in cazul substanfelor lipidice, nucleozide si fosfati anorganici in cazul acizilor nucleici. Pentru a fi folositi in metabolism, acesti nutrienti trebuie 8 ajunga in citoplasma traversind membrana citoplasmaticd, —fie prin difuziune simpl& sau facilitat’ (cu participarea unor proteine carrier), dictate de diferente de concentratie, de o parte gi de alta a membranei citoplasmé —fie printr-un transport activ contragradient (majoritatea nutrienjilor), cu consum de energie obfinuta prin hidroliza ATP si cu participarea unor enzime numite permeaze; in aceste condifii, concentrafia intracelulard a compusilor respectivi poate si fie de pana la 1000 de ori mai mare decat in mediu. 3.1.1. Necesititi nutritive de baz Bacteriile difera inire ele in raport cu necesitatile nutritive. Principalele elemente, cu rol structural si functional, necesare pentru majoritatea bacteriitor sunt: C, N, O, diferite elemente minerale. Surse de carbon, Carbonul este elementu! cel mai bine reprezentat in structura celulei bacteriene, realizénd aproximativ jumatate din greutatea uscat& a acesteia, Sunt bacterii care - 39, metabolismul si eresterea bacteriilor traiese liber in natura si care sunt capabile s& foloseasc CO ca unic& sursi de C, numite autotrofe. Bacteriile de interes medical necesit’ compusi organici ca sursi de C, in special arbohidrati, dar si proteine si lipide, ce servesc in acelasi timp ca surse de energie; asemenea bacterii se numesc heterotrofe. Prezenta CO» poate fi importanta si la heterotrofe in sinteza unor metabolifi esentiali in care intervine o reactie de carboxilare, bacterii eapnofile sau carboxifile. Surse de azot, Pentru sinteza proteinelor, care reprezint& 10% din greutatea lor uscaté, bacteriile pot utiliza N dintr-o sursa organicd (peptide, aminoacizi) sau anorganica (saruri de amoniu). Bacterii care traiesc liber in natura pot folosi N din nitrafi sau direct din atmosfera. Surse de oxigen. Atomii de O sunt prezenfi in multe molecule biologice (aminoacizi, nucleotide, gliceride ete.) si ajung in celule prin nutrienti; in plus, sub forma de oxigen molecular (O2) este necesar pentru generarea energiei in cadrul respirajiei aerobe. Elementele minerale. Sulful este prezent in unii aminoacizi sub forma de grupari tiol (-SH), vitamine (tiamina, biotina), coenzima A, putind fi asimilat din compusi organici sau anorganici. Fosfarel este esential pentru sinteza acizilor nucleici, fosfolipidelor membranare, ATP, fiind asimilat sub forma de fosfaji anorganici. Alte elemente ca Na, K, Mg, CLintervin in asigurarea echilibrului fizico-chimic al celulei; Fe, Ni, Se intra in structura chimicd a unor enzime (citrocromi, peroxidaze, hidrogenaze), Ca formeaza cu acidul picolinic dipicolinatul de Ca care este prezent in cantitate mare in citoplasma endosporilor bacterieni. Acesti ioni sunt asimilati sub form de siruri minerale. Co, Cu, Mn, Mo intervin ca activatori enzimatici, fiind necesari in cantitati infime (oligoelemente), prezenti ca impurificatori ai unor nutrient. 3.1.2. Factori de crestere Unele bacterii, prin echipamentul enzimatic de care dispun, pot obtine toti compusii necesari metabolismului de sintez4 in condifiile cultivarii pe un mediu ce contine ap’, saruri minerale si un singur compus organic cum este glucoza. Majoritatea bacteriilor de interes medical sunt incapabile sa-si sintetizeze unii metabolifi esentiali, numiti factori de erestere, necesari a fi prezenfi in mediu: aminoacizi, baze purinice sau pirimidinice, vitamine. Bacteriile dependente de numerosi factori de crestere se numese fastidioase. Nevoia in factori de crestere ai unei speci bacteriene poate fi satisfticuta prin prezenta uunei alte specii care sintetizeaza factorul de crestere respectiv, fenomen cunoscut sub numele de sintrofie, De exemplu, necesitijile Haemophilus influenzae in factor V (NAD) pot fi satisficute de Staphylococcus aureus care sintetizeaz& acest factor, H. influenzae cultivand satelit in jurul coloniilor de S. aureus pe gelozi-singe (CD 3-1). Pierderea unei enzime prin mutajie poate bloca o secven{% metabolic oprind sinteza unuj metabolit esential. Rezulti un mutant auxotrof, tulpina parentali fiind numita prototrofi. Cresterea mutantului continu’ numai dac& acest metabolit apare preformat in mediu (mutante auxotrofe pentru metionin’, treonind etc.). Auxotrofia oferd avantaje selective: in prezenta factorului de crestere, o bacterie auxotrofa se multiplica mai rapid decat tulpina prototrof& de origine ~— —— ~ Bacteriile patogene, ca urmare a adaptarii la viata parazitara au devenit dependente de numerosi factoti de orestere, unele att de dependente de mediul lor natural incdt nu au putut fi cultivate in vitro (Treponema pallidum, Mycobacterium leprae). Cunoasterea necesitatilor nutritive ale diferitelor specii bacteriene permite utilizarea unor medii de cultura adecvate pentru izolarea acestora din produse patologice 40‘Nutritia bacteriand 3.1.3. Medii de cultura Un medi de cultur’ este © solutie apoasi a unor substanfe nutritive; satisfacerea in nutrienti $i factori de crestere ale speciei ce urmeaza a fi cultivata constituie una din condifiile de baz ale unui mediu de cultura. Numeroase tipuri de medii de cultura pot fi utilizate, acestea putind fi clasificate in raport cu diferite criterii, Dupa provenienta nutrientilor: *Medii empirice, a ciror compozitie in nutrienfi este dificil de controlat, acestia provenind din produse de origine animala sau vegetala (muschi de vita, cord, creier, ficat, ou, levuri, soia etc); ‘*Medii sintetice ce contin ingrediente pure, permifand studiul necesitafilor nutritive minime ale diferitelor specii bacteriene. An raport de valoarea nutritivi: * Medii simple ce contin numai ingrediente de baz: extract de came, peptonii (produs de hidrolizi enzimaticd din proteine animale sau vegetale), clorura de sodiu, permigand cultivarea bacteriilor nepretentioase nutritiv; *Medii imbogitite (cu adaos de singe, ser, ou, extract de levuri ete.) care asigura cultivarea unor bacterii exigente. Dupd consistenta: * Medii lichide, repartizate in eprubete sau baloane, sunt folosite pentru insimanfarea produselor monobacteriene si studiu! unor caractere biochimice; ‘© Medii solide, repartizate in cutii Petri sau eprubete (in pant& sau pant si coloand), pe suprafata c&rora celulele bacteriene, izolate sau in agregate mici, se fixeaz si se multiplica, determinand in final un conglomerat vizibil cu ochiul liber numit colonie, Consistenta acestora este obtinuta: —cel mai frecvent prin includerea unui fitocoloid obtinut din specii de alge marine (Gelidium, Gracilaria, Pterocladia) numit &gar)eare are urmitoarele calitafi: (a) se lichefiaza Ia temperatura de fierbere a apei, dar nu“S€ solidificd pan’ la aprox. 42°C, (b} permite menfinerea solid’ a mediilor de cultura in limite largi de temperatura, 0-80°C, (c) nu este utilizat ca nutrient de etre bacterii, nefiind astfel degradat in cursul cultivarii; ~prin coagularea termica a proteinelor din ser sau ou. *Medii semisolide, ce confin 0 concentratie mai redusi de agar, sunt repartizate in eprubete (in coloand), fiind folosite in studiul mobilitéfii bacteriilor, a unor caractere metabolice sau pentru conservarea tulpinilor bacteriene. Dupa scopul utilizar: * Medii de izolare: —medii uzuale (e.g., geloza-singe), care sat larga ecii_bacteriene cu interes medical. Servese monobacteriene sau a celor cu flori_asociat’, permifénd aprecieri atat calitative cat si cantitative ale bacteriilor dintr-un produs patologic; =medii selective sunt medii solide care conin ingrediente (antibiotice, colorant, struri biliare, azid de sodiu etc.) cu actiune_inhibitorie asupra unor bacterii, favorizénd izolarea preferential a anumitor specii dintr-un produs plurimicrobian; ADP+E?) pentru desfasurarea reactiilor anabolice sau pentru unele oe celulare cum sunt transportul activ transmembranar si mobilitatea flagelilor; aprox. 45% gin energie €fierd) sub forma de caldura (fig.3-1) Eliberare de-caldura Molecule simple ca alucoza.aminoaczi, Fig. 3-1 Rolul ATP in cuplarea shicerol, acizi grass reacfilor catabolice si anabolice (dupa Tortora G. J., Funke B. R. si Case C. L) Transferul de energie Ia ATP. in. cursul reactiilor catabolice Transferul de energie dela ATP in cursul reacjiilor_anabolice Molecule complexe ca zaharuri, proteine, lipide Eliberare de-caldura 42 ee_ Metabolismul bacterin 3.2.1. Catabolismul Studiul metabolismului bacterian presupune cunoasterea cailor prin care bacteriile obtin energia, 0 conserva gi 0 ulilizeaz’ in procesele de biosintez. Bacterile care obfin energia din reacfii chimice de cxido- reducere poarta numele de chimiotrofe, spre deosebire de bacteriile fototrofe care folosese energia radialilor luminoase. Reactiile de oxido-reducere sunt definite prin pierdere si cAstig de electroni, ceea ce presupune un donor si un acceptor de electroni. Donoral poate fio substangi anorganic’ la chimiolitotrofe, sau o substan organicd la chimioorganotrofe. Bacteriile de interes medical fac parte din ultima categorie (fig.3-2) Bacterii ! Sus de energie Reactii de oxido-reducere Lumina | | Chimiotsofe Fototrofe rc sue carbon r Sursa é ‘carbon 4 Compusi organici coz Compusi organici cor | I | Chimioheterotrofe —_Chimioautotrofe Fotoheterowofe Foroautotrofe [ | Acceptor final de elestroni On Respiratie aerobat [Nono2 — Compusi anorganici, Compusi organici Respiratie anaerobi_Fermentatajie Fig. 3-2 Clasificarea bacteriilor in rapott de particularitatile metabolice 3.2.1.1. Catabolismul hidratilor de carbon, Desi multe molecule organice pot fi uilzate ea surse de energie (aminoacizi, purine, pirimidine, acizi grasi), calabolismul carbohidafilr are o deosebita importan, flucoza fiind cea mai folosits. Pentru eliberarea de energie din glucoza, bactrille pot utiliza dou procese: respiratia si fermentatia, prin tespiratie carbohideaii find wtilizali mai ficient. Ambele incep ou glicoliza, dar ulterior urmatoarele seeven(e difera (1) Respiratia celulara. Este definité ca un proces generator oxidate, aceptorul final de electroni find 0 moleculA anorgaica: ~in respiratia aerobi acc: in respiratia anaeroba a cel mai freevent, 0 moleculé anorganicd, alta decét On: ionul nitrat (NO;), sulfat (SO,7) etc.; in absenja oxigenului, unele bacterii aerobe ca Pseudomonas aeruginosa pot objine energia nevesard prin respiayie anaeroba (e.g, respirafia nitriilor), in procesul da@piale, pare presupune muteromse sei de reel de. axide-reduere,calsalzmul glucozei urmeaza trei ‘Semaine glicoliza, ciclul acizilor tricarboxilici, lanful transportului de electroni (fig. os 7 . “Eticoliga corespunde oxide glucozei pana la acid piruvie, cu generarea in final a2 molecule ATP si 2 Senn (calea Embden-Meyerhof-Pamas). AGeSt proces nu necesiti oxigen gi poate avea loc atit in ATP in care 0 serie de molecule sunt molec — - - 43Nutritia, metabolismul si cresterea bacteriilor condiit. aerobe cét si anaerobe, Sunt bacteri care au cf alternative pentra oxidarea glucozei (glicolizk modificata) calea pentozi-fosfat si calea Entner-Doudoroff, Calea pentozi-fosfat opereazi simultan cu glicoliza; prin pentozele intermediare pe care le produce {joaca un rol important in sinteza unor molecule biologice: acizi nucfeici, unii aminoacizi. Aceasta cale este mai pufin eficientd, pentru fiecare molecula de glucoza oxidatd se cdstigé numai o molecula ATP. alea Eniner-Doudoroff este 0 altemativa pentru oxidaea glucozei la acid pinuvic, din cae rezulta 2 molecule NADPH gi 0 molectia ATP. Bacteriile gram-negative aerobe care au enzime pentru aceasti cale metabolic pot si nu recurgi la glicslzl sau calea pentozi-fostat. Ciclul acizlor triearboxiliei (ciclul Krebs) cuprinde 0 serie de react biochimice in care energia potenjiald este eiberalé pas cu pas, prin oxidarea completA a acidului pirwvie. Acest cicly include react de Aecarboxilare prin care are loc conversia in CQ} a celor 6 atom de carbon conginui in molecula de glucoz gi reacfi de oxido-reducere din care rezulti 6 molesule de NADH si 2 molecule de FADH si sunt generate 2 molecule de ATP Mulfi din compusii intermediari ai ciclului Krebs servese proceselor de biosintez4, acest ciclu fiind 0 ale amfiboticd folosita de bacterii atat in procesele catabolice edt si anabolice. Enzimele care participt la realizarea glicolizi si ciclului Krebs sunt localizate in citoplasmi Lantul transportului de electroni. Coenzimele reduse NADH si FADH (purtitori intermediari de elecironi) sunt cele mai importante produse ale cclului Krebs, deoarese confin cea mai mare cantitate din energia prezenta in glucozA. In lantultransportor de electron, printr-o sere de recfi de oxido-reducere,energia stocati in aceste coenzime este transferati in molecula ATP, proces care se desftigoard la bacterii la nivelul membrane’ ctoplasmatice. In acest lanf sunt inluse 3 clase de molecule carrier: Ravoproteine (proeine care confin flavina, 0 coenzima derivata din vitamina B,), citocromi (proteine care confin Fe), ubiquinone sau coenzima Q (mici molecule carrier neproteice). Ultimul acceptor de electroni in respiratia zeroba este O;, find generate 34 molecule ATP. {in intregul proces de respiratie aeroba 1a procariote, dintt-o moleculA de glucoz& rezulta 38 molecule ATP: la cele 34 molecule care provin din lanful transportului de electroni se adauga cele 4 molecule generate in cursu glicoize i ciluli Krebs Glucozi Canttatea de ATP objint prin respratia anaeroba vaiaza; din cauza ef numai o parte Gin ciel Krebs opereazA in condift anaerobe si numai unele din moleculele carrier parieipS la lanful tansportului de electron, cantitatea de. ATP fh va fniciodaté mai mare decdt tn respiaiaaeroba. (2) Fermentatia permite objinerea energiei prin react de oxido-reducere tn care att donatorit dt si acceptoril de electoni sunt compusi organici, compusi infermediari de metabolism find acceptor finali de cletton. Prin acest proces acidul piruvic poste convert, in absenga oxigenulu, la unul sau mai mulfi produsi care variaza in raport de specie: acid lactic, acid acti, etanol, aid propionic, acid bute, acetoind etc (fig3-4). Canttatea de ATP general este. micé (numai dou molecule), 0 mare parte din energiaconfinuta in glucozA fiind prezentA in legiturile chimice ale produsilor Gali de fermentafe Bacteriile care folosese exclusiv respirajia aeroba se numese bacterii strict aerobe. Bacteriile care folosese exclusiv procesele fermentative pentru a obfine energia se numese bacterii striet anaerobe; pentru acestea Op este toxic prin lipsa enzimelor care elimina radicali toxici de oxigen (superoxid- 10 QP dismutaz’, catalaza, peroxidaza). Bacteriile aero- - . tolerante au un metabolism de tip fermentativ dar Fig. 3-3. Schema simplificata oleramfe au ur Pe rabolismuler zlocoeel ora man viabile in prezenta Oz. Majoritatea bacteriilor procesul de respiratie (Glicoliza, sunt facultativ anaerobe, avand posibilitatea de a ciclul Krebs si lantul transferului bine energia atat pe cale oxidativa ct si prin de electroni-LTE) fermentatii, Bacteriile microaerofile cultiva numai (dupa Cono R, J. si Colomé J. S.) in prezenta unor concentrafii redvse de O2 (aprox. 5- 44— Metabolismul bacterian 6%); aceasta toleranfai limitata este posibil determinata de radicalii superoxizi si peroxizi sunt produsi in concentrafi letale in atmosfera aeroba (fig. 3.5). re Glucozi Glicoliza ‘Acid piravie Fermentatie oe ore suendich = itlus ‘mre ‘Acid butirie Bianol Etanol ‘Acid lactic | [Acid propionic z z 2 ae | Acid ppp Butanoi | Acid lactic Acid lactic | Acid acer e zy zy ie teoprapanol || Acid formic || Acid acetic 06; v £ - ° ‘Acetona Butandiol | | Acid succinic fh ‘f . Bs cos || acon |) Gos Or Hy tip ig. 3-4 Schema simplificaté a catabolismului glucidie prin fermentagie la diferite genuri bacteriene (dup Cano R. J. si Colomé J. S.) 3.2.1.2. Catabolismul lipidic si proteic. Producerea de energie poate sé rezulte si din oxidarea acizilr grasi si slicerolului, ca si a acizilor amins{i tot prin ciclul Krebs (fig.3-6); in prealabil, acizii aminafi necesita a fi Convertiti in alti compusi prin dezaminare, decarboxilare sau dehidrogenare. Profilul unor activititi enzimatice din cadrul catabolismului glucidic, proteie sau lipidic este caracteristic pentru anumite unitii taxonomice (gen, specie), studierea acestora avnd o deosebita importana in identificarea bacteriang. Veti efectua si interpreta asemenea reacti in cadrul lucrarilor practice de bacteriologie. 3.2.2. Anabolismul Anabolismul bacterian corespunde reacfiilor de biosinteza a unor componente celulare cu consum de energie; spre deosebire de reactiile catabotice, sunt similare la diferitele specii bacteriene. (1) Biosintezapolizaharidelor. Pentru sinteza glucozei (sau a unui alt carbohidrat simplu) servese compusi intermediari care rezulta din glicoliza gi ciclul Krebs, urmand asamblarea in compusi polizaharidici Polimeri de glucozi cum sunt glicogen, amidon, polihidroxibutirat servese pentru stocarea energie pe termen lung (2) Biosinteza lipidelor. Bacteriile sinte- Swictaerobi Facultativ St tizeazi grasimi (ce servese la sinteza fosfo- anacrobi__anserobi lipidelor membranare, a unor componente din Fig: 3-5 Categorii de bacterii in raport cu efectul structura peretelui celular la bacterii_gram- Op asupra cultivarii negative sau acido-alcoolo-rezistente) din glicerol si ac Microaerofili i grasi. Glicerolul provine dintr-un - ——45‘Nutrifia, metabolismul si eresterea bacteriilor —______ compus intermediar rezultat in cursul glicolizei; acizii grasi, care contin lanfuri lungi de hidrocarbon (hidrogen legat de carbon) sunt sintetizati cand dou’ fragmente de acetil CoA. sunt succesiv adaugate. (3) Biosinteza acizilor aminafi si a proteinelor. Pentru biosinteza proteinelor (proteine structurale, enzime, toxine) sunt necesari aminoacizi. Unele bacterii (e.g., E. coli) posed’ enzime ce le permit sinteza tuturor aminoacizilor din compusi intermediari ai catabolismului glucozei, uneori dupa procese de aminare si transaminare. Alte bacterii necesita prezenfa in mediu a unor aminoacizi preformati (factori de crestere). (4) Biosinteza purinelor si pirimidinelor. Produsi intermediari rezultati din glicoliz& si ciclul Krebs participa la biosinteza purinelor si pirimidinelor care servese Ia sinteza acizilor nucleici aledtuiti din nucleotide la care particip’ o pentozi derivata din calea pentozi-fosfat sau Entner-Doudoroff. 3.2.3. Factori de mediu care influenteazi metabolismul bacterian Bacteriile necesita nu numai prezenfa nutrienfilor in mediul de cultura, Patru factori de mediu influenfeaza desfigurarea reacjiilor metabolice normale ia bacterii, fiind necesar sé oferim cand acestea sunt cultivate in laborator: pH, presiune osmotica, temperatura. gi compozitia in gaze a atmosferei de incubare. Primii doi factori sunt satisfacuti de mediile de cultura; ineubarea este procedeul prin care asigurm temperatura optima, intervalul de timp necesar menfinerii la temperatura respectiva gi atmosfera de cultivare. Acia|grasi Zahiaruri— Aminoacizi ‘Temperatura influenfeaz profund meta- “fe opie bolismul si multiplicarea bacteriilor. Bacteriile au enzime si membrane celulare (confinut in acizi grasi nesaturafi sau saturafi) care funcfioneaza cel mai bine la temperaturi optime de dezvoltare cuprinse intre anumite limite. In raport de acest criteriu clasificam bacteriile in trei grupe princi- pale: psihrofile (0-20°C); mezofile (25-45°C) gi On termofile (50-70°C). Temperatura optima la majo- ‘Acetit CoA ritatea bacteriilor patogene pentru om este de 37°C; termostatele din laborator in care sunt incu- bate mediile de cultur’ dup’ instmantare sunt reglate la aceasté temperatura. Bacteriile psihro- trofe se multiplica mai rapid la temperaturi de 20- 30°C, dar sunt capabile sa cultive lent la tempe- ratura frigiderului, de exemplu in alimente con- iaminate conservate prin frig, putind determina toxiinfectii alimentare. Endospotii bacteriilor ter- mofile sunt deosebit de termorezistenti, de exemplu Bacillus stearothermophilus, folosit in controlul microbiolegic al metodelor de sterilizare prin Lipide Polizabaride —Proteine Gligerol Piryvat 3-6 Etapele de baza ale catabolismului compusilor macromoleculr|(lipide,glucide, calducd umeda. . proteine) in cadrul respiratie aerobe Valorile pH-ului pot influenta structura (dupa Cano R, 5. si Colomé J. S.) tridimensional a proteinelor, inclusiv a enzimelor ipa la metabolismul celular, transportul nutrientiior gi transferul de electroni. Majoritatea bacteriilor necesita un pH optim in jur de neutralitate (7-7,5). Pentru a tampona compusii acizi rezultati din metabolismul bacterian se includ fosfaji in medii; peptone si 46.——_________— Metabolismul bacterian aminoacizi, in unele medii, au de asemenea efect de tampon. Existi insk bacterii acidofile care prefer un pH sciizut, $-5,5 sau mai jos, cum sunt lactobacilii-Altele tolereazA sau se dezvolta la un pH crescut, ‘numite bacterii bazofile sau alcalinofile cum sunt cele din genul Vibrio care se inmultesc la an pH optim de 8,5-9, medii cu acest pH find folosite in izolarea acestora din produse polimicrobiene. Presiunea osmoticd. Bacteriile patogene cresc preferential in medii izotone cu mediul intern al organismului gazd&. in medii hipotone peretele celular reuseste sa limiteze cantitatea de api ce patrunde in celula, dar micoplasmele si bacteriile cu perete modificat (protoplasti, sferoplasti, forme ,.L”) sunt profund afectate. in medi hipertone bacteriile sufera fenomenul de alas pe care se bazeazi conservarea alimentelor prin saramurare. Sunt bacterii, numite halofile, care cultiva'in medii cu concentrafii crescute de NaCl (peste 2%), acestea fiind intalnite in apele marine; putine specii patogene pentru om sunt halofile (¢.g., Vibrio parahaemolyticus). Atmosfera de incubare. Bacteriile aerobe sau aerob-facultativ anaerobe sunt incubate in conditii obisnuite, in prezenta aerului atmosferic. in laboratoare de diagnostic, cutiile Petri cu medii insiméntate pentru cultivarea bacteriifor anaerobe sunt plasate in recipiente transparente, ermetic inchise, in care concentratia O2 scade sub 1% (v/v), fiind inlocuit cu un amestec de Hz sau un gaz inert si CO, (10%) utilizind un generator chimic; atmosfera anaeroba este verificati cv ajutorul unei benzi din hartie de filtru impregnata cu 0 solutie de albastru de metil care devine incolora (fig.3-7). Pentru bacteriile microaerofile se procedeazi {ntr-un mod aseménator, dar in atmosfera de incubare este asigurati 0 concentratie de O2 de aprox. 5%. Pentru bacteriile carboxifile, o metoda simpli o constituie plasarea in recipient a lunei lumanari aprinse din ceara de albine care se va stinge cand in aerul din incint& CO; atinge © concentratie de 3-5% (fig.3-8). Catalizor de paladiu Generator chimie de Hs C02 ultur fn lacs Pett Tuburi cu medit lichide Indicator de. shacrobioz’ Placi Petci cu_f ‘medi solide Fig. 3-7 Recipient pentru incubarea in anaerobioza a bacteriilor insimantate Fig. 3-8 Metoda simpla de incubare in suprafats in atmosfera CO> a culturilor bacterieneNutritia, metzbolismul i eresterea bacteriilor — 3.3. CRESTEREA BACTERIILOR Consecutiv activitatilor metabolice are loc cresterea volumului celulei bacteriene dup’ © rafie cubicd si a suprafefei bacteriene dupa o ratie pitratd. Se ajunge la un punct critic ce impune restabilirea raportului optim dintre suprafata gi volum care se realizeaza prin diviziune binara, modalitatea de inmultire la majoritatea bacterilor. in general, prin cresterea celulelor infelegem sporirea marimii si masei acestora. Spre deosebire de organismele pluricelulare, bacteriile sunt prea mici pentru 2 fi studiate individual. Cresterea la bacterii este urmariti la nivel populafional, aceasta referindu-se la cresterea numarului celulelor intr-o populatie prin diviziune, care se realizeazi in progresie geometrica cu ratia 2: 1', 2°, 2°, 2°.....2", in care 1...n este numarul de generafii. Prin urmare, cand vorbim de cresterea bacteriand ne referim de fapt la umarul de celule si nu la marimea celulei. Timpul necesar pentru dublarea populatiei poart’ numele de timp de generatie iar numarul de generatii in unitatea de timp poarta numele de rata de crestere. Cresterea bacteriilor poate fi studiat& pe medii de cultura, solutii fluide sau gelificate care asigura necesitajile nutritive si fizico-chimice pentru cultivarea bacteriilor. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare o numim cultura. O cultura pura este constituita din bacterii de acelasi fel si reprezint& etapa indispensabila identificarii gi testrii sensibilitayii in vitro a acestora fat& de agenti terapeutici antibacterieni. 3.: . Cultivarea si izolarea bacteriilor in cultura pura insimantarea unui produs pluribacterian se realizeazd prin depunerea unei cantititi reduse (inocul) pe suprafafa mediului repartizat in placi Petri, intr-un sector limitat; cu ajutorul ansei sterile dispersim bacteriile prezente in inocul prin realizarea de striuri paralele in 3-4 cadrane (fig.3-9). in primul_sector coloniile bacteriene sunt confluente sau semiconfluente, in urmatoarele ‘cadrane ele apar izglate, din ce in ce mai mult spafiate. Bacierii aparfinand ufior specii distincte cultiva sub forma unor colonii cu aspect diferit. Din fiecare tip de colonie se realizeaz& un repicaj pe un nou mediu pentru obfinerea unei culturi pure. Alte métode de izolare: Izolarea pe medii lichide, indicat numai pentru produsele monobacteriene si in mod deosebit a celor cu un numar redus de bacterii, find posibila izolarea acestora prin cresterea volumului inoculului (insémantarea cétorva picaturi pani la cativa ml produs, cu pipeta sau cu seringa). Cand urmarim izolarea unor bacterii anaerobe putem folosi medii lichide care contin substanfe reducitoare (tioglicolat de sodiu, cisteini etc.) repartizate in coloand inaltd, regenerate (prin menfinere {5 min in baia de apa la fierbere gi apoi racite brusc) inainte de utilizare; =Izolarea bacteriilor sporulate dintr-un produs care confine concomitent bacterii nesporulate, bazati pe termorezistenta sporilor: suspensia produsului in solutie salina izotona este incdilzité 10 min la 80°C, apoi instimangaté prin epuizare 3.3.2. Aprecierea cultivarii bacteriilor se poate realiza in douti moduri: calitativ si cantitativ, Apreciere calitativa: ‘*Pe medii lichide, in care se realizeaz 0 buna dispersie a celulelor bacteriene, cresterea determina cel mai freevent 0 opacifiere a mediului, eventual cu formare de val sau depozit Este posibili de asemenea aprecierea mai rapid a cultivarii prin evaluarea activitatilor 48 —_____- CeCrestron bacteritor metabolice, evidentiind modificarea de pH sau cantificdnd CO, (principiu de functionare a sistemelor automate pentru hemoculturi); Fig. 3-9 Obtinerea de colonii izolate prin metoda epuizarii «Pe medii solide maltiplicarea unei cetule bacteriene da nastere unei colonii, vizibilé cu ochiul liber la majoritatea bacteriilor dup’ un interval de 18-24 ore; 0 colonie provine dintr-o celula bacterian& sau din bacterii atasate in diplo, lanjuri saw grmezi, respectiv unitati formatoare de colonii (UFC). Bacteriile cu inc&rcatura puternic electronegativa si suprafata hidrofila (asigurate de structuri de suprafayi) cultiv’ sub form& de colonii S, cu suprafata neteda, lucioasa si contur circular; cele cu incareaturd electronegativa si hidrofilie mai reduse formeaza colonii R, cu suprafata uscat’, rugoasa gi margini neregulate, Coloniile bacteriene difera dupa dimensiuni (mari, mijlocii sau mici), contur (circulare, cu margini lobate, zimfate, dendritice), suprafata (lucioas’ sau granulara), transparent (pace, translucide sau transparente), relief (plat, bombat, acuminat, ombilicat), culoare (pigmentate sau nepigmentate), consistent (untoasa, mucoasi, friabilA), aderenta la mediu (aderente sau neaderente), Aprecierea cantitativi, realizat’ in special pentru bacterii prezente in medii lichide, se bazeazi pe evaluarea: ‘fie a masei bacteriene (celule viabile si celule moarte), masurdnd densitatea optic’ cu ajutorul fotocolorimetrului sau spectrofotometrului, valorile optice citite fiind convertite in concentrafii de bacterii cu ajutorul unei curbe de referint&; efie a numérului de celule bacteriene viabile exprimate in UFC/mL, consecutiv insAmanférii pe suprafaja unui mediut agarizat a unui volum dintr-o anumit& dilutie care si permit, pentru o apreciere corecti, dezvoltarea unui numér intre 25-250 colonii; rezultatul provine din produsul intre numarul de colonii dezvoltate, inversul dilutiei foiosite pentru citire si raportul 1/volumul insdmantat (fig.3-10)Nutritia, metabolismul si cresterea bacteriilor Lml Imi Limi Lmt Lal 110000 | f1:100000 Torm Jott Jorm ott Jota @BBOO Calcul: 32 x10000 x 1/ 0,1=3,2 x 10° UFC/mt Fig. 3-10 Aprecierea cantitativa a numarului de unitati formatoare de colonii ml (UFC/m!) prin metoda dilutiilor seriate 3.3.3. Dinamica multiplicarii bacteriilor Curba de crestere a unei culturi bacteriene rezulta din evolutia concentratiei bacteriene sau a biomasei in raport de timp. Teoretic, dinamica unei populatii bacteriene ar trebui si evolueze exponential; in culturi discontinue in medii lichide (in volum limitat de mediu), dinamica reali a populatiei bacteriene se deruleaz in 4 faze caracteristice: faza de latent, faza exponential, faza stationara si faza de declin (fig.3-11), Faza de latent. Dupi insiman{area unei bacterii pe un mediu de cultura, aceasta nu incepe imediat sé se multiplice; numérul bacteriilor ramane stafionar sau scade, in schimb celulele bacteriene cresc in dimensiuni, avand un metabolism activ de sintezi a enzimelor adaptate noilor conditii. In aceasta faz, sensibilitatea la agenti antibacterieni este crescuti. Durata latenfei este in funcjie de varsta bacteriilor insimanfate (mai scurti pentru bacteriile in pln activitate metabolic, mai lunga in cazul bacteriilor ce provin dintr-o cultura in faz stationara) sau compozitia noului mediu (cénd este identic sau asemanator cu mediul din care provin bacteriile, faza de latent poate fi foarte scurti sau absent), Faza exponential sau logaritmic, Celulele bacteriene incep s& se divida cu scurtarea progresiva a timpului de generatie, existand o relatie liniar& intre timp si logaritmul numirului de celule. Timpul de generatie in faza exponential, in conditii optime de cultivare este caracteristic pentru o anumita specie bacteriand (e.g., timpul de generatie este de 10 min pentru V. cholerae, 20 min pentru E, coli $i de 18-24 ore pentru M. tuberculosis). Bacteriile in faz exponential au citoplasma intens bazofila, fra incluzii, si au o important& sensibilitate la actiunea agenfilor antibacterieni. Faza stationara. Faza exponential dureazA numai cateva ore; mediul de viaté devine din ce in ce mai putin favorabil, ceea ce determina trecerea in faz stationara; numarul bacteriilor vii riméne constant: fie prin persistenfa bacteriilor vii, in absenja multiplicarii, consecutiv epuizarii unui nutrient (factor limitant al cresterii), fie prin stabilirea unui echilibru intre numarul de bacterii provenite din multiplicare si numarul celor care mor, consecutiv acumularii de catabolifi toxici sau modificari de pH. In faza stationara bacteriile au 50. a ~-Cresterea bacteriilor morfologia specifica speciei (dimensiuni, incfuzii, endospori), scade in schimb sensibi la agenti antibacterieni. Logaritmul concentratiei bacterilor v Fig. 3411 Curba multiplicarii bacteriilor in cultura discontinu pe mediu lichid de latenté; 2=faza exponential, 3=faza stationard, 4=faza de declin) Faza de declin, Dupi o perioada variabila in faza stationara (pentru unele bacterii poate dura zile sau siptiméni), bacteriile moarte depasese progresiv numarul celor vii, pana la autosterilizarea culturii; uneori scade numarul total de bacterii datorité unui proces de autoliza. in aceasta faz apar forme aberante, de involutie. Pe medii solide, coloniile sunt constituite din bacterii in diferite faze de crestere. in laborator, testarea sensibilicsti la antibiotice 0 facem pe culturi in faz’ logaritmica (culturi in medii lichide, dup2 4-6 ore de incubare), iar pentru identificarea bacteriilor folosim cultura in fazi stationard (in varsta de 18-24 ore pentru bacteriile cu crestere rapida). 3.3.4. Utilizarea practic’ a cultivarii bacteriilor Cultivarea bacteriilor pe medii adecvate o facem: -in scop de productie, pentru obtinerea unor produse de metabolism bacterian (antibiotice, vitamine etc.) sau vaccinuri; apelim la metode cu randament mare, utilizand cultivarea continu’ (menfinerea culturii numai in faz exponentiala) in vase speciale, turbidistat sau chemostat; ~In scop de diagnostic etiologic al infectiilor bacteriene, folosind diverse medii repartizate in cantitati mici, in eprubete sau plici Petri; —Pentru monitorizarea antibioterapiei, prin testarea sensibilitijii in vitro la diversi agenti terapeutici antibacterieni a bacteriilor cu semnificatie clinica, folosind medii nutritive care s& nu interfereze cu activitatea acestor compusi. 514 VIRUSURI DUMITRU T. BUIUC, DRAGO$ FLOREA Unele lichide virulente, prin care transmitem 0 boald contagioasd, contin microbi vizibili, alrele ‘mu ne aratdé nimic. Microscopul nu ne arata tot ce este vit.” EMILE DUCLAUX, 1886 Virusurile sunt particule infectioase, virioni, cu diametrul cuprins intre 18 si 300 nm. Au un singur acid aucleic (ADN sau ARN), care constituie genomul lor. Acidul nucleic este cuprins intr-un invelig proteic, capsida, cu care impreun’ formeazi nucleocapsida Inconjurat, la unele virusuri, de 0 anvelopd cu continut lipoproteic. Lipsite de orice sistem enzimatic producator de energie si de orice capacitati de biosinteza, virusurile nu eresc si nu se divid, ci sunt replicate de citre o celuli gazdi pe care 0 programeazA s& sintetizeze moleculele necesare producerii de virus progen. Virusurile sunt deci paraziti genetici ai celulelor animale, vegetale, fungilor, protozoarelor sau bacteriilor. Dimensiunea virusurilor poate fi apreciat’ prin trei metode: electronomicrografie, ultrafiltrare si ultracentrifugare. Observarea pe electronomicrografii a extractelor tisulare si secfiunilor ultrafine prin celule infectate este metoda cea mai precisd i mai frecvent folosita Virionii sunt masurati prin comparatie cu diametrul stafilococilor (1.000 nm) sau al unor molecule de serumalbumin’ (5 nm), serumglobulin (7 nm), hemocianine (23 nm). Ultrafiltrarea prin membrane cu porozitate cunoscut $i ultracentrifugarea la forte mai mari decat 100.000 x g sunt metode aproximative pentru ca trecerea prin porii filtrului sau rata sedimentarii depind nu numai de marimea virionilor, ci si de alte proprietafi fizice. 4.1, ANATOMIA FUNCTIONALA A VIRUSURILOR Morfologia si structura virusurilor este studiaté prin microscopia electronicé a iunilor ultrafine sau crioelectronomicroscopie (cu contrastul structurilor accentuat prin coloratie negativa sau umbrire cu metale grele) gi prin diftactia razelor X. Cunoasterea structurii virale este necesara pentru a infelege: « interactiunile virionului cu celula gazda; « reactia virionului cu anticorpii neutralizanti; « actiunea chimioterapicelor antivirale utilizate in prezent sau testate in speranta posibilei utilizari Nucleocapsida, Genomul viral are dimensiuni reduse: parvovirusurile, cu diametrul lor de 18-26 nm, aw genomul format din 5600 nucleotide, practic echivalentul unei singure gene, Economia genetic’ impune ca virionii s& fie formati din molecule identice ale unui numdr redus de proteine, posibil chiar una singura. Un minim de unit&ti structurale trebuie si asigure capsidei un volum maxim pentru a cuprinde genomul. fn raport cu gruparea unitatilor 52 - -Anatomia functionald a virusurilor structurale, nucleocapsidele sunt de trei tipuri: cu simetrie cubic3, cu simetrie helicala si cu structuri complexa. (® Simetria cubied. Aceste nucleocapside sunt icosaedre. Icosaedrul — prin cele 20 de fete in forma de triunghiuri echilaterale, 12 varfuri, 30 de muchii si cinci axe de simetrie rotational (fig.4-1) — este cea mai eficienta aranjare a subunitafilor unui invelis inchis: minimul de material pentru maximum de volum, Pe electronomicrografii capsidele icosaedrice apar formate din capsomere, rezultate prin asociere polipeptidic’. Numérul capsomerelor variaz in functie de virus, de la 32 la parvovirusuri sau picomavirusuri pana la 252 la adenovirusuri. Capsomerele varfurilor, inconjurate de 5 capsomere identice, sunt numite pentone iar capsomerele fetelor si muchiilor, inconjurate de 6 capsomere identice, hexone (planga 4.1,1,2,3). Virusurile cu simetrie cubicd apar cu forma sfericd. Unele sunt nude, altele au anvelop’. Genomul unora este ADN, al altora ARN. Fig, 41 Axe de simetrie rotationala. SUS: elice cu 2, 3 si 5 palete; prin rotatie completa in jurul axului fiecare va avea 2, 3 respectiv 5 pozitii identice JOS: axele de simetrie rotationala ale icosaedrului sunt corespunzitoare: A la dowd pozitii, B la trei pozitii, C la cinci pozitii identice ale varfurilor, ‘muchilor §i suprafetelor (ii) Simetria helicald. Subunititile proteice, dispuse regulat, imbracd molecula de acid nucleic intr-o teacd helicalé. Toate virusurile animale cu simetrie helicala sunt virusuri ARN cu nucleocapsida flexibita inchisd intr-o anvelopa care le moduleazé forma in general sfericd, dar poate fi si filamentoasa sau de obuz (fig, 4-2; plansa 4. 1,4). (iii)Structura complexd au poxvirusurile, la care, pe electronomicrografii, identificam un nucleoid inconjurat cu o membrana fini, flancat de doi corpi laterali, totul inconjurat de o anvelopa lipoproteicd format din tubuli. Poxvirusurile au forméi de cfrdmida si sunt cele mai ‘mari virusuri animale (plana 4.1,5,6). Capsida protejeazi genomul viral. Capsomere, diferentiate sau nu, funcfioneazi ca liganzi si fixeazA virionii nuzi pe receptori celulari specifici. Subunitajile structurale ale acestor capsomere sunt antigene care reactioneaza cu anticorpii neutralizanti. Anvelopa, prezenta la unele virusuri, deriva din membrana celulei gazda. in cursul maturarii virionii inmugurese prin membrana in prealabil pregitité prin inserfia de Blicoproteine virus codificate, care vor proemina ca spiculi pe suprafaja anvelopei si au, dup’ az, functic de liganzi (e.g., hemaglutinine), mai rar enzime (e.g., neuraminidaza) ori factori - nl ~ 53Virusuri — de fuziune ai membranelor citoplasmice. Reacfia glicoproteinelor virale cu efectori imunitari neutralizeazi infectiozitatea acestor virusuri sau lizeaza celulele care le replica, Genomul viral, format dintr-un singur acid nucleic, codific& informatia necesari replicétii virusurilor. Acidul ducleic este ARN sau ADN monocatenar (m.c.) sau dublucatenar (d.c.), linear, circular cu greutate care variazi intre },2-1,8-10° daltoni la parvovirusuri, 1-3 gene, si 200-10° daltoni la poxvirusuri, 200-300 gene. Genomul virusurilor ADN apare ca 0 molecula unica; cel al unor virusuri ARN este divizat in segmente separate: e.g. 10 la reovirusuri, 8 la orthomyxovirusuri. La virusuri cum sunt picornavirusurile, flavivirusurile etc. ARN purificat este infectios pentru ca funcfioneaz4 direct ca ARNm de unde $i denumirea de ARN cu sens pozitiv, abreviat ,,+”, La altele, ca orthomyxovirusuri, rhabdovirusuri s.a., ARN purificat nu Fig. 4-2 Virus cu simetrie helicala: este infectios pentru ca este complementar ARNm, are sens modelul virusului mozaicului pegatiy, abreviat ,~”. Virusurile ARN cu genom ,—” contin tutunului (dupa D.L.D. Caspar, 4 . : : 1963; modifist) fn nucleocapsid’ o ARN polimeraza care initi i replicarea. 4.2. CULTIVAREA VIRUSURILOR $I TESTAREA CULTIVARIL Virusurile cultiva numai in gazde vii: culturi de celule, embrioni de pasire, animale de laborator. Conditia este prezenta celulelor receptive capabile si replice un anumit virus. 4.2.1. Culturile de celule Culturile de celule pot fi primare, linii de celule diploide sau permanente. Culturile primare le obtinem prin dispersia, uzual cu tripsind, a celulelor din fesuturi sau organe proaspat prelevate, Supraviefuiesc numai 5-6 cicluri de subcultivare. Liniile de celule diploide sunt obfinute din fesuturi embrionare. Au cariotipul normal si pot fi subeultivate 40— 50 de generajii, Liniile permanente de celule provin din tumori canceroase sau din mutante aparute in linji celulare diploide si pot fi subcultivate probabil indefinit. Celulele mentinute intr-un anumit mediu de crestere aderd la suprafata recipientului si formeaza un film continuu de cultura (plansa 4,2,1). Cultivarea unui virus presupune urmatoarele operafiuni: pregitirea suspensiei virale, inocularea filmului celular, incubarea, depistarea si cantificarea virusului replicat. Pregatirea suspensiei virale: prelevatul patologic este omogenizat pentru eliberarea virionilor; centrifugat diferentiat pentru indepartarea resturilor celulare si bacteriilor; tratat cu antibiotice pentru a preveni cresterea bacteriilor si fungilor contaminanti, Inocalarea filmului celular: pe filmul celular spalat, dupa indepairtarea mediului de cultivare, este depus inoculul si lasat un timp pentru adsorbfia virionilor, apoi este indepartat iar filmul celular este acoperit cu mediu de intretinere si ineubat pentru replicarea vicusului. Depistarea si cantificarea virusului replicat o facem, dupa caz, prin: (1) Efectul citopatic. Unele virusuri determina rotunjirea, reftingenta si desprinderea celulelor de pe suport, ca enterovirusurile (plansa 4.2,2); altele aparitia de sincitii, ca herpesvirusurile, paramixovirusurile (plansa 4.3,1). Efectul citopatic permite cantificarea virusurilor prin metoda plajelor: Filme ale unei culturi de celule sunt inoculate cu dilufii ale suspensiei virale. Dup8 adsorbjia virusului si indepartarea resturilor de inocul, filmul celular 54 —________ —__—_- ooCultivarea virusurilor este acoperit cu mediu de intrefinere agarizat pentru a preveni raspandirea virusului intre celule. Aga apar arii restrénse de infectie, plaje cu efect citopatic, care pot fi urmarite cu ochiul liber find distincte de nesta! filmufui celular normal. Corespondenfa dintre o plaja si o particula virala infectanta survine cand suspensionarea este ideal’. Dar aceasta nu este atins’, de aceea cantitatea de virus infectant o masuram in unitai formatoare de plaje (plana 4.3,2) analoage unitatilor formatoare de colonii bacteriene. (2) Aparifia in supernatantul si omogenatul culturii a unor proteine virus codificate, care sunt antigene si pot fi identificate gi cantificate prin reacfii cu seruri imune de refering. Unele dintre aceste proteine au efect biologic definit, ca hemsglutininele virusurilor gripale, arbovirusurilor $.a., pe baza caruia pot fi cantificate prin dilutii succesive pind cand acest efect dispare, (3) Adsorbfia eritrocitelor pe membrana modificati a celulelor care au replicat virus (plansa 4.4,3) poate fi mai precoce decat efectul citopatic iar uneori apare in absenja unui efect citopatic. (4) Incluziunile virale sunt acumutiri paracristaline de virioni ori componente virafe in aria celulara de replicare si asamblare a unor virusuri (citoplasma, nucleu), Le urmérim prin coloratii cu hematoxilin-eozin’, Giemsa ori coloratii speciale (planga 4.4,1,2). (5) Interferensa viral. Virusul rubeolei, unele adenovirusuri cultiva fara efect citopatic. Replicarea lor o depistam indirect prin incapacitatea celuletor infectate de a replica un virus cunoscut citopatogen (eg., virus Echo). (6) Transformarea celulelor normale in celule canceroase printr-un virus oncogen (e.g., virusul sarcomului Rous), Celulele transformate pierd inhibifia de contact gi se aglomereazi in focare distinete. Uneori apar anomalii cromosomale (e.g., translocari, inversii, delefii) ca in infeetiile cu virusuri ale leucemiei umane. 4.2.2, Embrionii de gainad Cetulele embrionilor si membranelor embrionare teplic& virusuri sau permit cultivarea rickettsiilor si chlamidiilor. Inoculam embrioni in varsti de 6-14 zile pe membrana chorioalantoida (virusuri herpetice, poxvirusuri), in cavitatea amniotic’ sau alantoidiand (orthomyxo- si paramyxovirwsuri) ori in sacul vitelin (rickettsii, chlamidii) (fig.4-3) Embrionii inoculati sunt incubati la 35°C timp de 3-5 zile. Viabilitatea embrionilor este verificati la ovoscop, in camera obscura, inainte de inoculare si pe parcursul incubarii. Umorile si fesuturile embrionilor infectati trebuie prefevate dupa reftigerare peste noapte la 4°C (fig.4-3). Refrigerarea evité hemoragia in cursul prelevarii. Hematiile adsorb virus, se aglutineazd si denatureazd rezultatele (¢.g., la izolarea si cantificarea virusului gripal) Cresterea virusurilor poate determina moartea embrionului, aparitia de pustule (packs) pe membrana chorioalantoid’ sau acumutare de hemaglutinine in lichidul amniotic ori alantoidian. Cantificarea virusului replicat in embrionii de gainé 0 facem prin titrarea hemaglutininei in fluidul amniotic sau alantoidian 4.2.3, Animalele de laborator Folosim animalele de laborator numai cAnd receptivitatea celorlalte gazde este nesatisfticatoare (e.g., cazul arbovirusurilor), Replicarea virusului o urmarim prin: « Aparitia bolii cu semne patticulare si eventual deces; » Aparifia virusului in organele finta (organe bogate in celule receptive la virusul inoculat) atestati de activitatea hemaghatinantd ori —— a 85Virusuri - infectiozitatea omogenatelor sau de examene histopatologice care pot depista leziuni inflamatorii, degenerative ori, mai ales, incluziuni virale, uneori caracteristice cum sunt corpusculii Babes-Negri din neuronii infectati cu virus rabic. Camera eu aer vA oa Cavitatea alantoict ‘Membrana cojii Cavitatea amniotica Sacul vitelin Membrana _Cavitare chorioalantoies virtuala — Albus Fig. 4-3 Cultivatea virusurilor in oul embrionat. A cdi de inoculare, Varsta optima de inoculare este de 5 zile in Sacul vitelin, 10 zile in cavitatea amniotica sau alantoicd, 11-12 zile pe membrana chorioalantoica. B prelevarea lichidului alantoie. 4.3. REPLICAREA VIRUSURILOR ANIMALE Ce sameni tu, mu inviazd, dacd nu moare ma ini Si cdind sameni, sameni mu trupul care va fi, ci doar un grdunte, cum se inémpla: fie de gréu, fie de alté ‘sdményi.” Corinteni f (15:36-37) Virusurile sunt replicate de celule vii. Gazda celulard asigura aparatul energogen si de biosintez ca si precursorii cu greutate molecular mica necesari sintezei acidului nucleic si proteinelor virale. Genomul viral codifica toate macromoleculele virusului, structurale sau ‘numai cu rol functional in etape ale replicarii. Caracteristicd virusurilor este disparitia infectiozitatii din momentul decapsidarii ‘virionului patruns in celulé pana in momentul aparitiei virionilor progeni. Acest interval din replicarea virusutilor il numim perioadi de eclipsa. Genomul viral ,.pirat” redirectioneazi ‘otal sau numai partial biosinteza celulara cdtre necesitatile replicative ale virusului. Etapele generale ale replicarii virale sunt: adsorbtia gi penetrarea virionilor in celula, decapsidarea cu eliberarea intracelular’ a genomului viral, sinteza componentelor virale, replicarea genomului, morfogeneza si eliberarea virusului progen infectios (fig.4-4). (1) Adsorbfia rezulté din interactiunea liganzilor cu receptori celulari specific. Specificitatea de receptor explica tropismul celular, tisular si de organ al unor virusuri: virusul 56———————- Replicarea virusurilor poliomielitei se fixeaz pe receptori de pe enterocite si neuronii sistemului nervos central, virusul rabie pe receptorii pentru acetilcolind, virusul mononucleozei infectioase pe receptorii limfocitelor B pentru Cs, virusul gripal pe glicoproteine care contin acid sialic (plansa 4.4,4) (2) Penetrarea virionilor in celula gazda este diferita *Virusurife nude, si numai uneori cele cu anvelopa, penetreazi prin pinocitozi receptor dependenti cu includerea virionilor in endosomi. ‘La virusurile invelite fuziunea anvelopei cu membrana citoplasmica elibereaza nucleocapsida direct in citoplasma. (3) Decapsidarea are loc sub actiunea enzimelor lizosomale sau direct in citoplasma. Genomul viral, antrenat spre locul de replicare, devine accesibil enzimelor care executi transcrierea mesajului genetic in ARNm si replicarea genomului, Virusurile ARN sunt replicate in citoplasma cu exceptia virusului gripal, care are o parte din ciclul replicativ in nucleu, Virusurile ADN sunt replicate fn nucleu cu excepfia poxvirusurilor al c&ror genom functioneaza si este replicat in citoplasma. Disolusia elementului infectios ca etapa preliminard a inmulfirit singularizeazd virusurile intre agentii infectiosi Desi celulele receptive exprim’ pe membrana citoplasmica cel putin 100,000 receptori pentru virus, primele trei etape ale ciclului replicativ sunt relativ ineficiente pentru c&: vitionii se pot adsorbi pe suprafefe prin care penetrarea este imposibilé, nucleocapsidele nu pot pardsi uneori endosomii, genome virale sunt atacate de nucleaze. De aceea raportul intre numarul vicionilor adsorbiti si al celor efectiv replicafi este subunitar. (4) Sinteza componentelor virale include replicarea genomului viral, sinteza ARNm si sintezele proteice. Replicarea genomului §i transcrierea informatiei genetice in ARNa sunt controlate de polimeraze ale cehilei gazda sau de polimeraze incluse in nucleocapsid. Strategia transcrierii difera cu tipul genomului viral. Traducerea ARNm 0 executa celula gazdi cu propriile sisteme de sintezi protei La Picornaviridae si Flaviviridae genomu! ARN m.c. are polaritate pozitiva gi este bifunctional: ARNm i matrit& pentru sinteza catenei complementare negative, care, la randul {A pentru sinteza catenelor progene cu sens pozitiv (fig.4-5). Din acest grup numai familia Togaviridae sintetizeazi doua forme de ARNm: unul cu lungime egal’ cu ARN genomic, care codific& proteine structurale si nonstructurale, altul corespunzator treimii 3” a genomului, care codifica numai proteine structurale. *Virusurile cu ARN m.c, si polaritate negativa av asociaté genomului o ARN polimeraza care asigura, direct in citoplasma, replicarea ARN genomic asociat cu 0 nucleo proteina si sinteza ARNm complet liber (fig4-6). intre aceste virusuri unele au genomul format dintr-o singuri molecul (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Fitoviridae), altele au genom segmentat (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae). Replicarea si transcrierea ARN la toate virusurile cu genom segmentat si polaritate negativa are loc in nucleul celulei gazda pentru c& reactiile sunt initiate de primeri proveniti din extremitatea 5’ » ARNm celular ori precursori ai acestuia si legati la extremitatea 5° a ARNm viral ¢Virusurile cu ARN d.c. (Reoviridae) au si ele asociat genomului o ARN polimeraza care transcrie catena cu polaritate negativa in ARNm (fig.4-7) La Retroviridae genomul ARN mac. cu polaritate pozitiva are asociati o reverstranscriptaza (transcriptazd inversa), care transcrie ARN viral in ADN intermediar m.e. cu polaritate negativa. Pe aceasti matri{é o ADN polimerazi celular’ formeaz& ADN dw. proviral care se inscrie in genomul celulei gazda. in fine, o ARN polimeraza celulara transcrie — 37Virusuri - catena ADN cu polaritate negativa in ARN m.c. cu polaritate pozitiva care functioneaz.atat ca ARNm, cat gica genom viral (fig4-8). Deci retrovirusurile au dow’ genoame: unul ARN m.c. cu polaritate pozitiva al virusului infectios si altul ADN d.c, al provirusului. Adsorblie, penetrare ecapsidare Sinteza,proteicd Asamblare Eliberare Virion —p Acid nucleic ——> ARNm——pProteine ——> cee y . ey, late Sa mi extra intra- extra. celular celular celular’ Fig. 4-4 Replicarea virala, schema Polimeraza Polimeraza celulara i NAAN) Fig. 4-5 Replicarea unui virus ARN m.c. cu polaritate pozitiva, schema Polimeraz Polimeraza Maturare J viral celulara Y ne 02 ct, NINE NNN en om “y Cory ‘Nucleocapsida ig- 4-6 Replicarea unui virus ARN m.c. cu polaritate negativa, schema La majoritatea virusurilor cu ADN dic. (Adenoviridae, Herpesviridae, Papovaviridae) replicarea genomului si transcrierea in ARNm este realizati intranuclear de 58Replicarea virusurilor catre enzimele celulare. Numai la Poxviridae aceste etape se desftisoari in citoplasma sub controlul ADN si ARN polimerazelor virale. Polimeraza Polimeraza virala celuian’ Nucleocapsida @, so ERT hee nO es Fig. 4-7 Replicarea unui virus ARN d.c., schema Revers: Integrare in Transcriptazd transcriptaza genomiul celular celulara @ ~ An Oe Ar. ES NN@ NNO] \ / Nucleocapsida —— “Anvelopa Fig 4-8 Replicarea unui retrovirus, schema *La Hepadnaviridae ADN este partial dublu catenar. O ADN polimerazi asociata virionului completeaz dublul helix molecular ined in citoplasma inainte ca genomul si ajunga in nucleu unde este transcris de o transcriptaz celulara *Genomul ADN m.. al parvovirusurilor trece direct in nucleu unde este convertit in molecule d.c. sitranscris in ARNm de enzime celulare Sinteza proteicd are dowd etape: una incepe imediat dupa infectarea celulei si este numita, ca atare, sintezd rimpurie. Cealalt incepe dupa replicarea genomului viral si este numita sintezd tardiva. 59Virusuri SS — Proteinele timpurii func{ioneazi ca enzime implicate in sinteza ADN sau ARN viral, inhiba sintezele proprii cetufei gazd8, participa la formarea incluziunilor virale, Sunt deci proteine nonstructurale de control al replica Proteinele tardive sunt proteine structurale. in cursul sintezei tardive genele precoce pot fi represate, Posibil, la toate virusurile ARN intreaga informatie genetic’ este tradusi simultan Etapizarea sintezei proteice, intalnita la multe virusuri, este mai important la virusurile cu ADN de. Economia genetica impune ca proteinele unor virusuri (Picornaviridae, Parvoviridae, Retroviridae) si fie sintetizate ca precursori poliproteici ulterior clivati in proteine structurale. Marile virusuri ADN (Herpesviridae, Poxviridae) au un echipament enzimatic propriu de control al replicarii, independent de cel al celulei gazda. De aceea contra acestor virusuri avem chimioterapice cu actiune mai selectivi (@”Subcapitolul 7.3). (5) Morfogeneza. Genomele virale ptogene, polipeptidele capsidale oti subunitatile structurale se asociaz printr-un proces fizico-chimic pentru a forma virus progen. In cursul morfogenezei se pot asambla capside icosaedrice goale, lipsite de acid nucleic (exces de proteine structurale). Morfogeneza virusurilor cu simetrie helicalé nu genereaza niciodata teci lipsite de acid nucleic. Componentele virale acumulate in exces pot genera incluziuni celulare virale (planga 4.4,1,2). (6) Eliberarea virionilor nuzi se face prin liza celulei gazda. Virusurile invelite se matureaz& inmugurind prin membranele celulare in zone unde s-au inserat glicoproteine virale: membrana citoplasmict la majoritatea virusurilor cu anvelop8, (planga 4.4,5), membrana nuclear’ la Herpesviridae (plansa 4.4,6), membrana reticulului endoplasmic sau cea golgiana la Coronaviridae. 4.4, RELATIILE VIRUS ~ CELULA GAZDA Studiul relatiilor virus~celula gazda in vitro (in culturi de celule) explic# muite aspecte ale relatiilor virus-gazd& in vivo (In organismul gazda). Capacitatea de a replica virus imparte celulele intr-un spectru larg care merge de la cefulele permisive la cele total nepermisive. Celula permisivé realizeazd integral toate etapele ciclului replicativ viral de la adsorbyia pan la eliberarea de virioni progeni infectanti in zeci si sute de c6pii. Celulele semipermisive replic’ numai cantititi mici de virus. Infectia virala a celulelor permisive $i semipermisive este o infectie productiva. Infectia celulelor nonpermisive, cele care adsorb, endociteaz’ gi replica genomul viral numai pan& la un anumit stadiu fra maturare gi eliberare de virioni progeni, este o infectie nonpraductiva. Caracterul permisiv versus nepermisiv al celulelor este condifionat prin prezenta factorilor celulari de initiere a replicarii genomului viral, care recunose secvente nucleotidice specifice din promotorii virali, Factorii de inifiere a replicarii unui virus sunt genetic determinati sau apar in cursul diferentierii celuleior. Controlul genetic al permisivitatii. (1) Factorul gazda: celulele epiteliale umane sunt permisive pentru mai multe tipuri de adenovirusuri umane. Fibroblastii umani sunt numai semipermisivi, Celulele multor animale (e.g., hamsteri nou-nasculi) sunt nepermisive si sunt infectate nonproductiv de tipurile 12, 18, 31 ale acestor adenovirusuri. (2) Factorul virus: 0 celuld devine nonpermisiva faf& de mutante defective ale unui virus. Evolutia permisivititii in cursul diferentierii celulare, Epiteliile pavimentoase stratificate sunt receptive la infectia cu papilomavirus. Celulele bazale sunt nepermisive. Ele oo - —- -