Anlisis de Camellia

sinensis (t verde y
negro)
Giorgis Estefana
Quattrocchio Cecilia
Illarraga Jesica

Objetivo:
Estudiar la complejidad de un extracto
hidroalcoholico de Camellia sinensis, de azcares
hasta lpidos, incluyendo todos los productos
conocidos del metabolismo secundario.
Se usaron dos metodologas:
UHPLC-MS
2D-LC (SEC y BEH-C18)

Tratamiento de muestra:
Muestra: T verde y T negro
Origen: estado de Paran, Brasil

15 gramos de hojas procesadas

comercialmente
Por reflujo con 300ml de solucin
hidroalcoholica (Etanol 70%)
Durante 1 hora 3 veces
Evaporacin a presin reducida, se liofiliz y
guardo a -20C

G70

400 mg liofilizado + 10 ml Agua

Particin L/L
CHCl3 (10ml)
FA

FO
AcoEt (10ml)

FA

G70
C

FO
BOH (10 ml)

FA
G70A
q

G70EAc

FO
G70
B

Instrumentacin:
UHPLC Unidimensional-MS
UPLVTM ACQUITY Aguas (Waters, Milford, MA)
Deteccin: matriz de fotodiodos (PDA) y
dispersin de luz evaporativa (ELSD) y
espectrometra de masas (m/z 100-1600)
Columna: BEH-C18TM (50x2,1)mm 1,7m
Temperatura: 60C
Vol. iny: 10l
FM: Acido frmico 0,1%(solvente A) y MeOH
(solvente B) GRADIENTE
Flujo:0,4ml/min
Muestra: las fracciones de la particion lL/L se
prepararon en MeOH-Agua (1:1) a 1mg/ml

Instrumentacin:
2D-LC mtodo SEC x LC
Primera dimensin
HPLC LC10A (Shimadzu)
Columna: Ultrahydrogel-SEC-120 (300x7,8)mm
5x103Da de exclusin de tamao.
FM: Agua (solucin A) y MeOH (solucin B)
GRADIENTE
Flujo:1ml/min
Temperatura: 60C
Vol. Iny: 200l
Muestras: 50 mg/ml se prepararon con MeOH-Agua
(1:1)
Fracciones: alcuotas de 1 ml, se secaron bajo
corriente de N2 y se transfirieron a viales de UHPLC
con 0,2ml de MeOH-Agua (1:1)

Instrumentacin:
2D-LC mtodo SEC x LC
Segunda dimensin
Mismo sistema UHPLC descripto anteriormente
Columna: BEH-C18TM (50x2,1)mm 1,7m
FM: Agua (solucin A) y MeOH (solucin B) OTRO
GRADIENTE
Flujo:1ml/min
Temperatura: 80C
Deteccin: PDA y ELSD

Instrumentacin:
ESI-MS
Positivo y Negativo
Ionizacin a presin atmosfrica (API) con un
triple cuadrupolo Quattro LC espectrmetro
(Waters)
Nebulizador y gas de solvatacin: N2
Caudal: 100l/min
Anlisis: Modo de corrientes de iones totales
(TIC) y luego fragmentados usando disociacin
inducida por colisin (CID) con argn como gas
de colisin.

(A) Cromatograma UHPLC G70Aq (325nm)

(B) Cromatograma UHPLC G70B (325nm)

(C) ESI-MS G70B

G70ACE

Se encuentran los principales flavonoles

reportados de T verde Catequinas (flavan3-ols)
Se detectan como derivados de estere galato
Los principales encontrados fueron:

Pico 18: epigalocatequina (TR:2,80; m/z:457)

Pico 27 galato de epicatequina (TR:3,75

Tambin se encontraron otros componentes en

menos cantidad:

Galocatequina, epigalocatequina, galato de catequina,

epicatequina y galocatequina (picos 5,10,16,21 y 22)

(E) Cromatograma UHPLC G70AcE (325nm)

(F)Cromatograma UHPLC G70AcE (275nm)

G70C

Se encuentran los Alcaloides de purina

(Xantinas) mas comunes:

Pico 6: teobromina (TR:1,78)

Pico 20: cafeina(TR:2,95)

(F1 )ESI-MS G70AcE (iones positivos)

(F2 )ESI-MS G70AcE (iones negativos)

G70C

2D-LC mtodo SEC x LC

Conclusion
La superposicion de picos es un problema muy comun
en las muestras de fitoquimicos. La capiacidad de
resolver una matriz mas completa es el principal
beneficio de la LC en dos dimensiones.
Por lo tanto los compuestos que no se distinguen en
una sola dimension
La combinacion de HPLC (SEC) y UHPLC es la requerida
para un sistema bidimensional. UHPLC permite tiempos
de analisis mas cortos , sin embargo en este trabajo la
separacion de compuestos de quimica muy diferente
dio un tiempo de analisis mayor a los informados
anteriormente. Pero se cree que este es el primer
estudio que cubre toda la complejidad de un extracto
de la plantaa partir de azucares a lipidos incluyendo
metabolitos secundarios.