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Ministre de lenseignement suprieur et de la rechercher scientifique

Universit Telidji Amar Laghouat


Facult des sciences et de lingnieur
Dpartement de biologie

Complment des cours de microbiologie industrielle destin aux


tudiants de la cinquime anne gnie biologique

Introduction la microbiologie industrielle

Par M. Y. Goudjal

2005 / 2006

Cours de Microbiologie industrielle ralis par Y. Goudjal

-1-

MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE.
Gnralits.
Les microorganismes au service de l'homme : Des ouvriers qualifis mis en
uvre selon des processus gnimicrobiologiques, en lchelle industrielle, afin
dassurer une biosynthse et/ou une bioconversion.

Domaines dactivit de la microbiologie industrielle


agro-alimentaire (agents de saveurs, mulsifiants, fermentations alcoolique,
lactique)
production d'nergie (thanol, mthane, hydrogne,)
production de solvants (actone, butanol,)
environnement (bioremdiation des sols pollus, puration biologique de
'eau, forage ptrolier, extraction de minerais ou biolixiviation,)
agriculture, horticulture(vecteur pour la production dOGM, herbicides,
insecticides, hormone vgtales - gibbrellines )
biologie molculaire (production d'enzymes de restriction,)

industrie pharmaceutique (antibiotiques, vitamines, acides amins,


insuline, hormone de croissance, hydrocortisone, interfron beta-1b,et de
nombreux autres produits du groupes des antitumoraux, immunosuppresseurs,
anti-inflammatoires,)
Intrts de lutilisation des microorganismes
Cot plus faible que les procds par voie chimique :
catalyse enzymatique,
Faisabilit
synthse et biotransformations (ex : prostaglandines, strodes) de
certaines molcules ne peuvent se faire que par voie microbienne
spcificit de la raction
strospcificit
Scurit accrue
absence de virus (sida, hpatite B) ou prion ex : cas de transmission de
la maladie de Creutzfeldt Jacob par hormones de croissance extraites
de lhypophyse de cadavres contamins.

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Cellule bactrienne : produits microbien dintrt industriel


Une fois le micro-organisme recherch obtenu, la formation des produits
dsirs dpend de la mise en culture du microorganisme.
L'utilisation des micro-organismes en biotechnologie moderne est donc base
sur les principes de la culture en masse. Implique alors :
la gestion des procds de culture microbienne
la connaissance des facteurs limitants la croissance microbienne.

Fig. 01 Reprsentation schmatique des produits microbiens dintrt


industriel.

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1 Croissance microbienne.
1.1 Modlisation de la croissance.
> croissance des populations microbiennes = augmentation de la population
microbienne.
> Accroissement du nombre de cellules selon une progression gomtrique
d'ordre 2

X = biomasse
G = temps de gnration moyen d'une population.
n = nombre de gnration
t= temps de culture
- Expression mathmatique de la croissance microbienne

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= 1/X
dX/dt
correspond donc la vitesse de croissance rapporte l'unit de
biomasse soit = rxt/Xt
rxt = vitesse de croissance au temps t. [unit de biomasse h-1 unit de
biomasse -1]
(h-1) est un paramtre de la culture, il est fonction de la souche
bactrienne et des conditions de culture.
En dehors de la phase exponentielle, la vitesse spcifique de croissance
varie, traduisant des tats physiologiques diffrents. Le phnomne de
croissance cellulaire comporte en effet plusieurs phases.
1.2 La courbe de croissance microbienne

Fig. 02 Courbe de croissance des microorganismes en milieu non renouvel.


Un milieu de culture est ensemenc par une suspension microbienne, la
variation de la biomasse (X) est suivie en fonction du temps.
1.3. Effet de la concentration en substrat
Au cours de la phase exponentielle de croissance, bien que la composition du
milieu de culture varie normment, le taux de croissance reste constant.

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Effet de la concentration en substrat sur la croissance ()


est fonction de la concentration en nutriment limitant seulement dans une
gamme de concentration trs faible.
S = substrat limitant (celui qui rgle la vitesse des synthses et le rythme
des divisions).

La connaissance de ces paramtres est indispensable pour mener


correctement une culture bactrienne
prdire les cintiques de production de biomasse (=masse de l'ensemble des
cellules bactriennes)
connatre les concentrations minimales en substrat ncessaires une
croissance maximale,
ncessiter parfois de faire travailler les cellules des spcifiques de la
molcule produire.

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2 Besoins nutritifs.
2.1 Elments de constitution.
C, O, H, N, P et S lments majeurs
lments de constitution des molcules biologiques (protines, glucides,
acides nucliques, ) lis entre eux par des liaisons covalentes.
formule chimique de la biomasse bactrienne :
C5H7O2 NP0,03
ou encore (C5H7O2N0,75P0,05S0,025)
Besoins nutritifs essentiels en C, N et P = 3 lments essentiels et
ncessaire en grande quantit pour les cellules afin dassurer la formation de
nouvelles structures cellulaires
- Formes assimilables des lments majeurs : C, N, P, S
( Les besoins en O et H sont satisfaits en gnral avec la source de carbone
(ex : glucose = C6H12O6 ), par l eau ou la source d azote).
Carbone :
Le carbone = besoin fondamental, constituant de base de toute structure
organique
Environ 50% de la masse cellulaire sche = carbone.
Organismes htrotrophes: besoin en carbone organique : Glucose, Acides
amins, actate, fructose, lipides, protines, polysaccharides, glycrol,
(autotrophes: carbone inorganique : CO2, HCO3-)
Azote : Principalement incorpor sous trois formes:
NH4+ (ammonium) : Forme principale d assimilation de l azote. Peut aussi
ltre sous forme d acides amins. Toutes les bactries sont en principe
capables d assimiler lazote sous cette forme. Mais attention aux effets
rpresseurs des formes facilement assimilables sur la synthse
dantibiotiques, denzymes
NO3-, NO2- (nitrate, nitrite) : Concerne un nombre plus restreint de
microorganismes. Forme + oxyde donc plus coteuse assimiler ( ncessite
une dpense d lectrons pour rduire cette forme en ammonium). Toxicit
des nitrites.
NO3- + 8e- > NH4+
N2 (azote molculaire) : Assimilation exclusivement connue chez les
bactries. Source inpuisable d azote mais trs coteuse en nergie.
Concerne des groupes trs spcifiques de micro-organismes ( Rhizobium,).
1/2N2 + 4e- > NH4+
Demande une nergie d activation trs leve.

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- Besoins en N : environ 14% de la masse cellulaire sche = azote


Phosphore : essentiellement sous forme de phosphates (PO43-; HPO42 ;
H2PO4- ; H3PO4) ou polyphosphates.
Besoins en P : 1 - 3% de la masse cellulaire sche = phosphore.
Soufre :
Sous forme rduite, SH ou S apport par les AA soufrs (cystine et
mthionine) et les vitamines soufrs (biotine) = source prfrentielle
dassimilation du soufre.
H2S, dans les environnements rducteurs (milieux anarobies).
SO4-, sulfates. Forme coteuse en nergie mais la plus abondante.
Besoins en S : < 1% de la masse cellulaire sche = soufre
Elments mineurs et oligolments
Essentiellement des cations, ne sont pas lis aux autres molcules par des
liaisons covalentes (l. lectrostatiques,).
K+ (principal cation, cofacteur), Fe2+ (cytochromes), Ca2+ et Mg2+
(thermorsistance, cofacteurs, stabilit membranaire,), Mn2+, Co2+ (pour
vitamine B12), Zn2+, Cu2+, Mo2+, Ni+,
besoins:
classiquement du ng au mg / L mais les besoins peuvent tre spcifiques pour
la synthse dantibiotiques (10 100 fois les besoins en Fe et Mn et Zn requis
pour la croissance)
Facteurs de croissance
> Constituants indispensables la croissance en trs faible dose (0,1 - 1
mg/L). Souvent les microorganismes possdent les voies mtaboliques
permettant leur synthse = prototrophes ( ex : Escherichia coli).
Acides amins essentiels (Glu, Lys, Arg, Trp, Tyr)
Bases puriques et pyrimidiques
Vitamines (en gnral : cofacteur ou prcurseur de cofacteurs
enzymatiques).
> Leur prsence dans le milieu facilite la croissance des microorganismes
prototrophes, elles est indispensable pour les auxotrophes.

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2.2. Besoins nergtiques


Htroorganotrophes : composs organiques = source de carbone et dnergie

- Utilisation de l'nergie cellulaire


nergie ncessaire la croissance et aux divisions cellulaires
nergie d'entretien ou de maintenance : nergie utilise pour d'autres voies
que la production de biomasse. En principe, reprsente une constante.
mobilit cellulaire
assimilation, transport des nutriments
rparation

nergie ncessaire la synthse des protines recombinantes = nergie


dtourne, dissocie de la croissance.
- Conversions nergtiques
Principe des conversions nergtiques: dgradation des molcules haut
potentiel nergtique couple avec la production d'adnosine triphosphate
(ATP) = catabolisme.
Deux mcanismes de base de production de l'ATP :
phosphorylation au niveau du substrat> fermentation
phosphorylation oxydative> respiration

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2.2.1 phosphorylation au niveau du substrat et fermentation


- Schma des fermentations (cellule bactrienne)

Mtabolisme
cerevisiae)

anarobie

(ex :

fermentation

alcoolique

Saccharomyces.

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Mtabolisme anarobie (fermentation) et nergie de maintenance

2.2.2. Phosphorylation oxydative et respiration


Respiration = processus gnrant de l'ATP qui implique le transfert
d'lectrons au travers d'un systme de transport d'lectrons et de protons.

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Fig. Schma de la respiration cellulaire.

- Mtabolisme respiratoire (arobie)(ex : E. coli sur glucose)

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- Mtabolisme arobie.

- Respirations et fermentations
Rendement ATP: fermentations << respirations
A production gale dATP, plus de substrat est mtabolis lors des
fermentations que lors de la respiration.
Selon les conditions environnementales la respiration ou la fermentation est
emprunte.
Levures, E. coli,possdent les deux voies
Bacillus, uniquement fermentation
Pseudomonas : uniquement respiration
(NB : respiration peut tre arobie ou anarobie, ex. respiration des
nitrates)
2.3. Milieux de culture industriels
La bonne formulation du milieu repose sur le choix de la source de carbone,
d'azote, de vitamines ou d'oligolments, mais surtout leur quilibre.
L'accumulation des produits spcifiques de nombreuses fermentations est
contrle par des paramtres nutritifs : concentration en vitamines, la
disponibilit en nutriments azots ou carbons ou encore par l'tat de
croissance de la culture, ce qui impose donc une connaissance parfaite de ces
interactions pour optimiser le procd.
Contraintes lgales (interdiction dutiliser des produits animaux par principe
de prcaution, flux doxygne limits,)
La matire brute du milieu de culture, par son cot, influence la
comptitivit conomique du procd.

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- Matires brutes couramment utilises :


Sources de carbone et d'nergie:
mlasses
petit lait

grains de crales
dchets agricoles,

Sources d'azote
farine de soja
dchets d'abattoir

vinasses
ammoniaque et sels d'ammoniaque,

Vitamines
prparations brutes de produits vgtaux et animaux,
Fer et oligolments
drivs chimiques inorganiques bruts,
Antimousses
alcools suprieurs
silicones

esters naturels
saindoux et huiles vgtales,

Tampons de pH
craie, carbonates bruts
phosphates pour engrais
2.4. Environnement physique
Contrle prcis :
de l'agitation
de l'oxygnation
critique en culture arobie, tenir compte des coefficients de transferts
gaz, liquide, de la viscosit du milieu (milieu visqueux souvent observ en
croissance myclienne,)
croissance floconneuse des myctes qui modifie l'efficacit du transfert
de la temprature
du pH

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3. Production des mtabolites et molcules dintrt


3.1. Mtabolites primaires et mtabolites secondaires.
Les produits microbiens qui intressent l'industrie sont :
des mtabolites primaires : associs la synthse des cellules microbiennes.
Ils sont impliqus dans la phase de croissance (AA, nuclotides, produits de
fermentation, enzymes,). Les voies de biosynthse sont en gnral simples.
des mtabolites secondaires : ne sont pas indispensables au dveloppement
de lorganisme. Synthtiss dans des conditions particulires, s'accumulent
pendant la priode suivant la phase de croissance active et n'ont pas de
relation directe avec la synthse des matires cellulaires et la croissance
normale (antibiotiques et toxines). Voies de biosynthse complexes et longues.
Spcifique une espce voire une souche microbienne.
- Production des mtabolites primaires et secondaires au cours de la
croissance

Fig. production de mtabolites primaires et secondaires au cours de la


croissance.
Les phases de la croissance doivent donc tre parfaitement matrises pour
optimiser la production des mtabolites d'intrt.
3.2. Stratgie globale de production
Produits associs la production dnergie :
Conditions optimales : celles qui vont conduire la production maximale du
produit recherch associ une production faible de biomasse = conversion
optimale de la source de carbone en produit.
Ex : produits de fermentation.

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Produits associs la biomasse : rechercher les conditions de production


maximale de cellules.
Produits inductibles (protines recombinantes) : leur production est
dpendante de linduction du gne correspondant (fusionn avec un promoteur
inductible : tac, Trp,).
3. Principales familles de produits en microbiologie industrielle.
3.1. Mtabolites primaires
3.1.1. Acides amines : laide de mutants drguls
Cas gnral : produits par perturbation des systmes de production :
accumulation intracellulaire. L'intrt de production par voie bactrienne est
la strospcificit de l'AA obtenu (on obtient uniquement des acides amins
L).
Acide glutamique : form par amination de lacide. ctoglutarique (KG) (du
cycle de Krebs) avec utilisation de C. glutamicum, fermentation en prsence
d'un excs de NH3, la souche a perdu la capacit former le succinate
partir de lKG ; en outre, carence en biotine et ajout d'AG permettent
d'augmenter la permabilit membranaire.
Synthse ou bioconversion dAA essentiels ou non : Asp, Ala, Arg, Citrulline,
Cys, DOPA (dihydrophnylalanine, par Erwinia herbocola), Gln, His, ornithine,
Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Val, Tyr, Ile, Leu.
3.1.2. Vitamines : Produits souvent intracellulaires.
Vitamine B12 (cyanocobalamine), seule source de production par culture
microbienne (Streptomyces olivaceus, Propionobacterium shermanii, P.
denitrificans).
Vitamine B2 (riboflavine) par Ashbya gossypii & Eremothecium ashbyi).
-carotne prcurseur vitamine A, par Blakeslea trispora,
Ergosterol, a-tocophrol (vit. A), acide ascorbique (vit. C)
3.1.3. Polysaccharides
Production spcifique par des microorganismes dont le polymre est extrait.
Peut ncessiter la culture en conditions spcifiques (induction de la synthse
par carence dun lment, par culture anarobie, en phase stationnaire,).
Xanthane, alginate, PHB polyhydroxybutyrate (dans les plastiques
biodgradables), caraghnanes et agar (algues rouges), cellulose, chitosane,
dextrane, gellane, pullulane,

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3.1.4.Divers
Acides organiques : ac. Acetiques (anaerobie, Clostridium thermoaceticum:
35 g/L, fed-batch), ac. Citrique ( Aspergillus niger,), ac. Lactique, ac.
Gluconique,
Alcools et solvants : actone (
dihydroxyactone, polyols, butanol, thanol,

Clostridium

acetobutylicum),

Carburant : thanol (80% de la production mondiale est produite par


fermentation, partir de cellulose, glucose, amidon), mthane (par
dcomposition anarobie de la matire organique) et dautres hydrocarbures.
Lipides (sphingolipides: cosmtologie,)
3.2. Mtabolites secondaires
3.2.1. Antibiotiques
Produits en particulier par les actinomyctes ( Streptomyces) et par des
myctes filamenteux.
Avec souvent des souches amliores par mutation ou gnie gntique
(transfert du gne de rsistance l'AB permettant une hyperproduction sans
inhibition).
La production a lieu au cours de la phase stationnaire de croissance, except
pour les ttracyclines.
+ concentrations en sels minraux (Fe, Mn, Zn) 10 100 X suprieures
celles requises pour la croissance.
point crucial : contrle du milieu.
Les conditions optimales requises pour la production des antibiotiques ne
sont pas ncessairement identiques celles permettant une bonne
croissance !
Exemple de la pnicilline : La production de pnicilline par Penicillum
chrysogenum ncessite un ajustement soigneux de la composition du milieu, de
lair et de lagitation. En prsence de lactose ou damidon et avec limitation en
azote, la pnicilline s'accumule.
Le maintien du pH proche de la neutralit assure plus de stabilit
l'antibiotique. Une source facilement assimilable de carbone exerce une action
ngative sur la biosynthse. Avec le glucose les rendements en antibiotiques
sont faibles. C'est nanmoins possible en racteur de type fed-batch avec un
contrle fin de la concentration en glucose.

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3.2.2. Produits pharmacologiquement actifs, pesticides,


Alcalodes
Analgsiques
Anti-inflammatoires
Antitumoraux
Immunodpresseurs
Toxines (toxine botulique,)

Pesticides : nmaticides, fongicides, insecticides (protoxine par Bacillus


thuringiensis),
3.3. Enzymes
Endo ou exocellulaires. Les exoenzymes seront plus faciles extraire
Leur synthse est souvent inductible par le substrat, sensible au pH, les
sources de carbone et/ou dazote peuvent influer sur leur synthse.
Une bonne connaissance des conditions de production est donc ncessaire
pour une production optimale.
Recherche des souches ou production de mutants permettant une production
maximale de lenzyme recherche (absence de rpression dans leur
synthse,), associe une production minimale de sous produits (toxines,
antibiotiques, pigments, protases,).
Applications : analyses, agro-alimentaire, synthses, gnie gntique,
industries diverses, domaine de la sant
Ex : catalase
3.4. Biotransformations
= raction chimique catalyse par une enzyme (la raction correspondante
par voie abiotique est souvent impossible ou difficile).
Concerne la synthse dacides amins, dantibiotiques, de vitamines,
dhormones (strodes), de prostaglandines.
Trs souvent il s'agit de simple bioconversion partir d'un compos naturel
ou obtenu par synthse chimique.
Ex: biotransformation de bases purique et de thymidine en ribothymine (5mthyluridine), procd lorigine de lAZT (3azido-3 dsoxythimidine) par
Erwinia carotovora.
4. Production de molcules trangres par des cellules transformes
Lutilisation de micro-organismes transforms permet de produire des
substances thrapeutiques jusqualors impossibles synthtiser :
hormone de croissance humaine ou bovine par E. coli

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Insuline humaine par E. coli


Interfrons humains par E. coliet B. subtilis
Stroides : hydrocortisone rcemment obtenu par utilisation d'un panel de
souches de levures transformes (Mnard Szczebara, Chandelier et al. , 2003,
Nature Biotechnol.) et partir de glucose.
Leptine (hormone protique associe lobsit) par E. coli

4.1. Cellules transformes


Principe gnral : clonage dun gne dune protine dsire dans un plasmide
multicopies sous contrle dun promoteur fortement inductible (ex promoteur
de lopron lactose, trp,).
Objectifs :
Produire une grande quantit de protines,
Pouvoir dclencher la synthse au moment voulu (ex. : selon la phase de
croissance, temprature donne,).

Fig. Etapes dobtention de cellules transformes

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Contraintes:
- Extraction/Scrtion : les protines se trouvent gnralement sous forme
de corps dinclusion (agrgat de protines). Forcer la scrtion en greffant
une squence signale spcifique de protine extracellulaire.
- Protolyse : greffer une squence protique reconnue par la cellule pour
viter la protolyse par le systme de reconnaissance de la cellule.
- Purification
- Pas de modification post-traductionnelles (pas de maturation de l'ARNm),
- Solubilisation, renaturation.

La production dune grande quantit de protines est possible. Mais elle est
gnralement associe une faible croissance, le stress provoqu conduit
trs rapidement un arrt de la croissance
Une croissance sous forme filamenteuse des cellules peut alors se produire,
traduisant une inhibition de la segmentation. Cette absence de segmentation
est lie une sous-expression des gnes impliqus dans la division cellulaire.
Exemple : E. coli transforme pour produire lIGF-I (insuline like)

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5 Conduite des bioracteurs


5.1. Bioracteurs - Dfinition : un bioracteur est une enceintes
permettant la culture de tout type de cellules (animale, vgtale, levures,
moisissure, bactries) et rpondant des critres de conception permettant
d'influer efficacement sur la culture, de contrler et piloter les paramtres
physiques et chimiques (TC, aration, pH, substrats,). Ils doivent
permettrent une strilisation facile et un maintien de l'asepsie pendant toute
la dure de la culture. Et tre caractriss par une rsistance mcanique et
chimique aux contraintes lies la culture de microorganismes : surpression,
corrosion,
Matriel en verre (vol. <10 L).
matriel en inox (Vol. de 2L 100 000 L).

Fig. Reprsentation schmatique dun bioracteur.

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5.2.Culture discontinue ("batch") ou ferm


Inoculum + milieu et on laisse se drouler la culture dans un fermenteur
parfaitement mlang.
Le volume reste donc constant.
La biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne.
Le substrat S est consomm et le produit P attendu apparat.
Tous les composs se trouvent dans le milieu de culture au dpart, on
n'intervient plus sur la composition du milieu.

Fig. Paramtres dun bioracteur


.

- Fermentation discontinue ("batch")


L'volution de la biomasse suit la relation :

Rx= vitesse de croissance cellulaire


Productivit souvent faible (quantit de produit L-1 h-1), elle dpend surtout
de la taille de l'inoculum, qui souvent est faible, et conduit des phases de
latence longues. Le dmarrage de la culture, associ au temps ncessaire la
remise en service du racteur (lavage, strilisation,) est donc souvent le
facteur limitant.

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5.3. Fermentation discontinue alimente ("fed batch")


La fermentation est initie dans un plus faible volume (pied de cuve). Donc
pour une mme taille d'inoculum, la fermentation va dmarrer plus vite.
Lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance, le milieu strile
est introduit dans la cuve. Le dbit est rgl de sorte ce que, par exemple,
[X] ou [S] soit constant dans la cuve

Fig. Reprsentation schmatique dun fermenteur aliment discontinu (fed


batch)
Lorsque la cuve est remplie, on coupe l'alimentation, la culture volue alors
conformment la courbe de croissance discontinue.
Technique trs utilise en pratique:
gain de temps et de productivit
possibilit de travailler max.
possibilit de modifier la composition du milieu durant l'opration.
- Permet d'orienter si ncessaire le mtabolisme de la souche et de
stimuler la production de mtabolites aprs avoir favoris la croissance.
possibilit d'augmenter la concentration en substrat des valeurs qui
seraient inhibitrices si on devait les appliquer en batch en dbut de
croissance.
ex; utilisation de glucose pour la production de pnicilline thoriquement
inhibiteur de fortes concentrations).

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5.4. Fermentation continue (en racteur parfaitement mlang)


La suspension microbienne est homogne en tout point de la cuve.
Initiation par une phase de croissance discontinue.
Ouverture des pompes,
Lorsque le systme est l'quilibre, tous les paramtres sont constants.
Le dbit Q, dont dpend D, dtermine et X (densit bactrienne) selon les
relations qui relient S et X.

Fig. Reprsentation schmatique dun fermenteur en continu.


D = taux de dilution, soit le taux auquel est ajout le milieu par unit de temps
= Q/V (t-1).

- Modlisation mathmatique de la croissance en chmostat (racteur


continu) :

A l'tat stable (quilibre), dX/dt = 0 et donc = D.


Qt de cellules produites = qt de cellules perdues
Si > D > X
Si < D > X
Le chmostat ne peut pas fonctionner pour D > max.

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A l'quilibre, quel est l'effet d'une augmentation du dbit (Q) sur et sur la
biomasse [X] ?

Fig. Effet de laugmentation du dbit sur la biomasse.


Le taux de perte en biomasse entrane un ajustement du taux de croissance
pour retourner un quilibre.
- Variations de S et X en fonction de D

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5.4. Fermentation continue


Productivit en biomasse est plus leve qu'en discontinue ou semidiscontinu
(volume utile de la cuve mieux utilis, cuve n'est pas vide, nettoye,
strilis)
Problmes de contamination d'un tel systme difficile maintenir, biofilms,
mutations,
Outil intressant pour l'tude des cintiques microbiennes
calcul de max et des Ks.
effet de la modification du milieu sur la physiologie et sur la suspension
bactrienne.
possibilit de maintenir la culture un donn
le dbit et la concentration en nutriments fixent la vitesse spcifique
de croissance.
5.5. Autres systmes :
Racteur flux piston
Culture avec recyclage
Systmes immobiliss,