FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA

EDUCACION
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
BIOQUIMICA GENERAL
ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL
Correa,X.Hoyos,J.Pea,J.
Objetivo: Determinacin cualitativa de la afectacin de la actividad enzimtica de la Amilasa
salival por diferentes factores como Temperatura, pH, especificidad e influencia de inhibidores
y activadores.
Resultados:
Se reportan los Resultados de la actividad enzimtica en cada una de las pruebas.
Tabla N1: Labilidad trmica de la enzima Amilasa utilizando como sustrato el Almidn.
Tubo N

Condiciones experimentales

Incubacin

Coloracin con yodo

1
2

Enz. Calentada previamente

enzima nativa

10 min, 37C
10 min, 37C

++

enzima nativa

10 min, 0C

Tabla N 2: Influencia del pH en la actividad de una enzima:

Tubo N

pH del medio

incubacin

Coloracin con yodo

5,0

10 min, 37C

6,8

10 min, 37C

++

8,0

10 min, 37C

Tabla N3 de especificidad de las Enzimas (Amilasa y sacarasa):

Tubo N

sustrato

Enzima

1
2
3
4

Almidn
Almidn
Sacarosa
Sacarosa

Amilasa
Sacarasa
Amilasa
Sacarasa

Incubacin

10
10
10
10

min,
min,
min,
min,

37C
37C
37C
37C

Coloracin
con yodo

Reaccin de
fehling

Tabla N 4 Influencia de los activadores e inhibidores en la Amilasa:

Tubo N

sustrato

Enzima

Incubacin

Coloracin con Yodo

1 NaCl

Almidn

Amilasa

10 min, 37C

2 CuSO4

Almidn

Amilasa

10 min, 37C

Anlisis de resultados:
Las enzimas son protenas que aceleran la velocidad de las reacciones qumicas en nuestro
organismo. La actividad enzimtica est definida como la cantidad de producto formado o
cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo, y es afectada por una serie de factores
entre ellos la temperatura, y el pH entre otros. [1].
La saliva est constituida entre otras cosas por una enzima llamada ptialina, que es una alfa
amilasa, cuya accin digestiva es ejercida sobre los almidones.
1. Labilidad trmica para la amilasa salival.
Esta prueba se llev a cabo en 3 tubos de ensayo cada uno con la muestra de ptialina, de los
cuales, el tubo 1 fue sumergido en un bao de agua hirviendo por 2 minutos, seguidamente al
tubo 1 y 2, se les aadi la solucin de almidn, para ser dispuestos en un bao termostatado
a 37C aproximadamente, esto por un periodo de 10 minutos; para el tubo 3 se le agrego la
solucin de ptialina y se procedi a enfriar a 0C por 10 minutos y finalmente a cada tubo se le
aplic una gota de Lugol.

Imagen N 1. Prueba de labilidad trmica, de izquierda a derecha tubos 1, 2 y 3.

Segn los resultados de la tabla N1 y de la fotografa N1, para el primer tubo se present
una coloracin azul oscura, hay que resaltar que el reactivo de Lugol es empleado para
determinar la presencia del almidn en el sustrato sobre el cual acta la enzima. El color que
dan los polisacridos con el Lugol (solucin de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios
vacos en las hlices de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de

inclusin que altera las propiedades fsicas del polisacrido, especialmente la absorcin
lumnica. Esta unin del I2 a la cadena es reversible, y por calentamiento desaparece el color,
que al enfriarse reaparece. El Lugol da con el almidn color azul y con el glucgeno color rojo
caoba.[1]
Podemos analizar que cuando el tubo con la enzima es calentado en un bao con agua
hirviendo previamente esta pierde su actividad enzimtica, ya que al ser hervida esta se
desnaturaliza por lo cual no puede actuar sobre el almidn para hidrolizarlo, lo que quiere
decir que la enzima no degrad el almidn por lo tanto est inactiva, as esta ha perdido su
estructura inicial y pierde sus propiedades como catalizador. Finalmente este ensayo no es
una reaccin qumica, lo que hay es una formacin de un compuesto el cual modifica las
propiedades fsicas de la molcula de almidn.
En el tubo 2 la coloracin fue amarilla muy clara, esto prueba que la enzima estaba activa en
condiciones normales, ya que no se someti el tubo a grandes variaciones de temperatura,
preservndola en un rango de temperatura ptima para la accin de enzimas, que oscila entre
36 - 41C.
El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos
polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas
por enlaces - C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces,
uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto
en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas
(oligosacridos) como productos.[2] Por tal razn cuando la -amilasa acta, degrada la
amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de I 2/IK ya no dar una coloracin
azul, como se evidencia en la fotografa.
Para el tubo 3 se presenta una cloracin rojiza, lo cual da positivo para la presencia de amilo
pectina componente del almidn de cadena ramificada, forma hlices mucho ms cortas, y
las molculas de yodo son incapaces de juntarse, obtenindose un color entre naranja y
amarillo [3]. En este caso la ptialina puede revertir su inactividad debido a que a temperaturas
bajas se mantiene en estado nativo pero sin ejercer su funcin, al elevar la temperatura sin
exceder su punto ptimo, se activa nuevamente

2. Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas:

Para esta prueba se tomaron tres tubos de ensayos a los que se les vertieron 2 mL de
soluciones amortiguadoras a pH diferentes (tabla N 2), a todos los tubos se les aadi 1.0 mL
de la muestra de saliva y 2 mL de solucin de almidn. Se pusieron a incubar (tabla N2), y
luego se les aadi 1 gota de reactivo de Lugol.
La ptialina de la saliva acta de manera ptima en un pH entre 6 y 7.4, siendo inactivada tanto
en medio acido como alcalino [4].

Imagen N2

Como podemos evidenciar en la fotografa N2 vemos en el tubo N1, se presenta una

tonalidad azul intensa, lo que nos indica que no hubo ninguna actividad de la enzima sobre el
sustrato, la coloracin se debe a que el yodo entra a la estructura helicoidal del almidn, es
decir que los tomos de yodo se introducen entre las espirales provocando la fijacin de yodo
en las molculas de almidn. [5]
En el tubo N2, a un pH de 6.8 se evidencia un cambio de color a transparente, lo que nos
indica que a este pH, la enzima presenta una actividad ptima. La actividad enzimtica guarda
una estrecha relacin con el estado inico de la molcula, especialmente en la parte proteica,
puesto que las cadenas poli peptdicas contienen los grupos carboxilos y aminos que se
pueden ionizar, como regla, se tiene que el punto isoelctrico de la enzima no corresponde
con el pH al cual la enzima tiene su mayor actividad.

En el tubo N3, vemos un cambio de coloracin a amarillo claro, lo que nos indica que la
enzima no est totalmente inactiva, pero que si disminuy mucho su actividad, se esperara
que a pH mucho ms altos, quede completamente inactiva. Con este ensayo podemos ver
como el pH tiene una gran influencia sobre la velocidad de la reaccin entre la enzima y el
sustrato, y que esta dependencia se puede llegar a explicar por una alteracin de la carga
elctrica neta de la protena que hace que haya una repercusin en su solubilidad. Los
cambios de pH afectan profundamente el carcter inico de los grupos funcionales de la
enzima y por tanto alteran la conformacin de la protena, y con ello el sitio cataltico
[6].Tambin simplemente puede pasar que haya un efecto del pH sobre el sustrato,
ocasionando as un efecto sobre la reaccin enzima+ sustrato
3. Especificidad enzimtica.
Ciertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actan sobre muchos compuestos
que poseen un rasgo estructural comn, como es el caso de la amilasa.
Imagen 3. Resultados
especificidad enzimtica.

de

las

pruebas

de

La prueba de Lugol se da como consecuencia de la

formacin de cadenas de poliyoduro a partir de la
reaccin entre el almidn y el yodo presente en el
reactivo de lugol.
La amilosa y la amilopectina son componentes del
almidn pero la amilosa es de estructura lineal, con
enlaces (1-4), que forma hlices en donde se juntan
las molculas de yodo formando un color azul oscuro;
mientras que la amilopectina es de estructura
ramificada, con con enlaces (1-4) (1-6), que forma
hlices mucho ms cortas y las molculas de yodo son incapaces de juntarse presentando un
color intermedio entre anaranjado o amarillo. [7]. Observemos al tubo 1 que contiene solucin
de almidn y amilasa salival al que se le realiz la prueba de Lugol y no se obtuvo coloracin
alguna lo que quiere decir que la prueba dio negativa, esto quiere decir que existe una
reaccin entre la ptialina (amilasa) y el almidn por ello no se observ presencia de
coloracin. La amilasa hidroliza el almidn para formar maltosa y dextrina.(reaccin N3,1) [8]

Reaccin 3,1. Accin de la amilasa sobre el almidn.

Contrariamente en el Tubo 2, que esta compuesto por almidon (sustrato) y sacarasa, a la que
se le realizo de igual forma la prueba de Lugol presento una coloracion azul oscura,
determinando con esto que la brueba dio positiva por la presencia de almidon en la solucion,
pues bien la sacarasa es una enzima que convierte la sacarosa (azcar comn) en glucosa y
fructosa, y no cumple la misma funcion que la ptialina. Se hace evidente que la enzima
amilasa es especifica para la hidrolisis del almidon ya que utilizando otra enzima la prueba de
lugol dio positiva. [8]
En el tubo 3 (solucion de sacarosa y amilasa) se adiciono reactivo de Fehling que se utiliza
como reactivo para la determinacin de azcares reductores. El poder reductor que pueden
presentar los azcares proviene de su grupo carbonilo, que puede ser oxidado a grupo
carboxilo con agentes oxidantes suaves. Si el grupo carbonilo se encuentra combinado no
puede presentar este poder reductor. [6]En esta prueba cuando se obtiene una coloracion azul
nos indica que da negativa, y positiva cuando la coloracion es naranaja o marron. Por ende en
el tubo tres se observo que la prueba es negativa, pues bien la amilasa no es una enzima que
tenga algun efecto sobre la sacarosa, sin embargo observemos que en el tubo 4 que contiene
sacarosa y sacarasa dio positivo para la prueba de Fehling. La reaccion de Fehling de usa
para la determinacion de azucares reductoras, sin embargo la sacarosa no tiene poder
reductor sobre el reactivo de Fehling, mas sin embargo la sacarasa tambien conocida como
invertasa es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa, siendo entonces la
glucosa un azucar reductor y la fructuosa no lo es [9].

Reaccion 3,2. Accion de la sacarasa (invertasa) sobre la sacarosa.

Influencia de los activadores e inhibidores en la actividad enzimtica de la amilasa:

Figura N4
Sabemos que la labor de los inhibidores sobre un enzima es disminuir la velocidad de
reaccin o la de detener completamente la actividad. En el tubo N1 (tabla N1, figura N4) al
cual se le adicion Cloruro de sodio podemos ver que la solucin se torn transparente,
mostrando claramente una reaccin rpida, evidenciando as una aceleracin en la actividad
cataltica de la reaccin. La ptialina requiere cloruro como cofactor inorgnico para que la
catlisis ocurra de manera ptima [10].

Al incubar con NaCl y amilasa lo que pasa es que se rompen los o sea, se digiere el almidn y
quedan las glucosas libres. Entonces el Lugol no se puede intercalar en el polisacrido y no
habra deteccin del mismo, por lo que se pierde totalmente la coloracin.
En el tubo N 2 al que se le adicion Sulfato de cobre, se present un efecto inhibidor (Tabla
N 4) que provoc que la hidrolisis del almidn no se llevara a cabo, y por ello observamos
(figura N4) el color que es caracterstico para reconocimiento del almidn, que es azul
oscuro. El sulfato de Cobre, es una sal que desnaturaliza las enzimas por efecto del
desprendimiento del ion cprico, el cual hace que el COO - de la enzima, se una a los grupos
de las cadenas laterales originando la ruptura de los puentes de hidrogeno.[11]
Preguntas complementarias:
1. Qu se espera con la tincin con el Lugol y cul es el fundamento de la reaccin general?
El reactivo de lugol (solucin de iodo), utilizado para la determinacin de polisacridos, tiene
efecto sobre el almidn (polisacrido de la glucosa) , dando un color violeta a negro, pero al
aadir la saliva, la amilasa de sta acta sobre el almidn rompiendo sus cadenas dando
lugar a polisacridos ms pequeos llamados dextrinas con los que el reactivo de Lugol da un
color ms claro y finalmente se rompen las dextrinas dando lugar a disacridos de glucosa y
glucosa con los que el reactivo de lugol no reacciona por lo que la solucin va perdiendo color.
2. Cul es el sustrato especfico de la sacarasa, sobre cuales sustratos no especficos esta
podra actuar y por qu?
La enzima sacarasa es muy especfica: rompe el enlace b-glucosdico de la sacarosa o de
compuestos muy similares. As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural,
mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos anlogos. El enzima acta con mxima
eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos anlogos. Podran
dar positivos los ismeros de la sacarosa como maltosa y la isomaltosa ya que estos son
sustratos anlogos a la sacarosa por lo tanto tambin rompera en estas el enlace bglucosdico.
3. Cul es la clasificacin de las enzimas, teniendo en cuenta su papel o funcin?
Oxido - reductasas: catalizan xido - reducciones de los sustratos encaminadas generalmente
a obtener energa de los carburantes metablicos. Los ms caractersticos son las
deshidrogenasas, que tienen como coenzimas a los nucletidos FAD, FMN, NAD y NADP.
Transferasas: catalizan la transferencia de grupos funcionales de un sustrato a otro. Ej.:
transaminasas.

Hidrolasas: catalizan reacciones de hidrlisis de enlaces ster (lipasas, fosfatasas); de

enlaces glucosdicos (sacarasas, amilasas) y de enlaces peptdicos (tripsina, pepsina, etc)
Isomerasas: catalizan reacciones de isomerizacin que producenreordenaciones dentro de la
molcula o transferencia de radicales de una parte a otra de la molcula.
Ligasas o sintetasas: catalizan la sntesis de nuevas molculas al formar enlaces entre dos o
ms molculas o grupos funcionales. La energa necesaria para la sntesis del enlace la
obtienen de la hidrlisis del ATP, ambas reacciones se encuentran acopladas.
4. En que consiste la nomenclatura internacional para estas? De por lo menos dos ejemplos.
Se utiliza un cdigo numrico, encabezado por las letras EC que significa, abreviadamente,
Comisin de Enzimas, seguida de cuatro nmeros separados por puntos.La primera cifra
representa el nombre de la clase, la segunda la subclase, la tercera la sub-subclase y la
cuarta es propia de cada enzima.
Ejemplos:
Creatin-fosfotransferasa. Su nmero de clasificacin es EC 2.7.3.2, en donde el (2) representa
la clase (transferasas), el (7) la subclase (fosfotransferasas), el (3) la sub-subclase
(fosfotransferasas con un grupo nitrgeno como aceptor) y la cuarta (2) designa a la creatnquinasa.
Glucosa
fosfotransferasa
(glucoquinasa):
EC
2.7.1.2

Conclusiones:

Se logr determinar que la actividad ptima de la ptialina presente en la saliva, es la

temperatura corporal (37C), por lo que las incubaciones se hicieron a dichas
temperaturas.
Se logr determinar que existen factores muy determinantes en la actividad enzimtica
en este caso especfico la Amilasa Salival, tales como el pH, y la temperatura.
Se logra determinar que la amilasa es una enzima especfica para la hidrolisis de
almidones, ya que no se observaron resultados que demostraran lo contrario con el
otro sustrato (sacarosa), y sin embargo tambin se evidencia la accin de la sacarasa
en la sacarosa.
Existen compuestos que pueden actuar como activadores e inhibidores de las
reacciones llevadas a cabo por las enzimas. En trminos generales, la accin
enzimtica se llevan a cabo bajo condiciones muy bien establecidas, y controladas,
para asegurar as el buen funcionamiento de cada una de las enzimas.

Bibliografia:

[1]
Academia.https://www.academia.edu/6347596/Identificaci%C3%B3n_de_Car
bohidratos_a_trav%C3%A9s_de_reactivos (ltimo acceso: 03 de 04 de 2016)

[2] Monografias. http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividadenzimaticaamilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf (ltimo acceso: 03 de 04 de 2016).

[3]
Manuel
de
practicas
Universidad
del
Santa,
Peru.
http://es.slideshare.net/vegabner/almidn-35325388 (ltimo acceso: 03 de 04 de 2016)

[4]Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica pg. 35.

[5] Estrada, M. Prcticas de fisiologa II. Instituto tecnolgico de Santo Domingo, 1984,
pg. 29.

[6] Pacheco, L. Bioqumica mdica. Ed Limusa.Mxico 2004, pg 347.

[7]. enzimaszagan.blogspot.com.co/2011/04/especificidad-enzimatica.html
[8]. es.slideshare.net/lizbethdamazogalvez/hidrlisis-del-almidn-por-la-amilasa-salival
[9]. almez.pntic.mec.es/~mbam0000/paginas/LABORATORIOs/azucares.htm
[10]http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/vargas_as/antec_fund_cientif.p
df
[11] http://es.slideshare.net/michael24k/practica-n1-11980137