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ASIGNATURA: BIOQUIMICA
ALUMNO(A):
GRUPO: 1
AO DE ESTUDIO: 3
PROMOCIN: LIII
ASESOR:
TRUJILLO PER
I UNIDAD
REUNION DE LABORATORIO N1
PRACTICA N01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I.
INTRODUCCION:
La vida depende de una serie ordenada de reacciones qumicas que son catalizadas por
enzimas formadas para este fin. Las enzimas, salvo los ribozimas, son protenas
relativamente frgiles con tendencia a sufrir desnaturalizacin e inactivacin, es decir
alteraciones en su conformacin, por efecto de diversos agentes fsicos y qumicos
como: temperatura, cidos y lcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc.
Las enzimas se encuentran en muy pequeas concentraciones en los materiales
biolgicos, resulta un trabajo arduo y complicado individualizarlas o purificarlas. Para
poder verificar directamente las propiedades comunes o similares a la naturaleza
proteica que las caracterizan , desde el punto de vista experimental se pueden utilizar
las propiedades de catalizadores especficos que tienen las enzimas, como indicador de
las alteraciones que pueden sufrir stas cuando son sometidas a la accin de diferentes
agentes fsicos y qumicos . De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar
una determinada enzima se pueden verificar cmo afectan los agentes fsicos y
qumicos la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad.
La finalidad de la presente prctica, es poner en evidencia las caractersticas proteicas
de las enzimas que gozan de propiedades comunes y que expuestas a la accin de
diversos agentes fsicos y qumicos hacen variar su comportamiento y actividad
cataltica.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR:
NaOH 1N
- Amilasa
salival 1.0%
SO4 Cu 20%
- Solucin iodada
-
NaCl 0.15M
III.
HCl 3N y 0.05N
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN
SISTEMA A
TUBOS
COMPONENTES
(en ml)
Amilasa al 1%
NaOH 1N
HCl 3N
cido
Tricloro
actico 20%
Sulfato de Cobre al
20%
Buffer
fosfato
0.1M / pH 6.6
II
III
IV
VI
1.0
-
1.0
2.4
-
1.0
2.4
1.0
-
1.0
-
1.0
-
2.4
2.4
2.4
2.4
El contenido
del tubo se
mantiene
transparente,
la
enzima
Observar e est en el
interpretar medio ptimo
para
reaccionar.
SISTEMA B:
La enzima es
desnaturaliza
da al agregar
el
NaOH
(base fuerte)
pues
esta
cambia el PH
del medio.
La enzima es
desnaturaliza
da al agregar
el HCl (cido
fuerte) pues
este cambia
el PH del
medio.
La enzima es
desnaturalizad
a al agregar el
cido Tricloro
actico
pues
este cambia el
PH del medio.
La enzima es
desnaturalizad
a al agregar el
Sulfato
de
Cobre
(sal
pesada)
El conten
del tubo
mantiene
transparen
la
enz
est en
medio pt
para
reaccionar
pero
enzima
desnatural
da
por
calor.
TUBOS
COMPONENTES I
(en ml)
Almidn al 1.0% 1.0
II
III
IV
VI
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
en solucin acuosa
Buffer fosfato 0.1 5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
M / pH 6.6
NaCl 0.15 M
Agua Destilada
1.4
2.0
1.4
2.0
1.4
2.0
1.4
2.0
1.4
2.0
1.4
2.0
Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su
correspondiente tubo del ltimo sistema (B), dejar en incubacin a 37 por 20 min.
Observar
e
interpreta
r
SISTEMA C:
Todos los tubos del sistema B contienen el sustrato(almidn), buffer fosfato/ PH 6.6 , NaCl y
agua destilada; este sistema constituye un medio ptimo para la accin de la enzima. Al
agregar la solucin del primer sistema que contiene amilasa a cada tubo correspondiente del al
segundo y luego dejarlo en incubacin a 37 por 20 min, se consigue que haya una reaccin
enzima(amilasa) sustrato(almidn) siendo la temperatura un factor que aumenta la actividad
de la enzima y el NaCl cofactor de esta.
TUBOS
II
III
IV
VI
HCl 0.05N
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Observar
e
interpreta
r
0.5
I.
CUESTIONARIO:
1
Las sales son compuestos qumicos que se forman tras reaccionar un cido y una base,
por ello constan de una parte catinica y otra aninica. Al encontrarse en solucin estos
dos componentes se separan en el caso del sulfato de cobre, se separa el ion sulfato y el
cobre (ambos en estado ionizado, es decir inestables) por lo que pueden reaccionar
fcilmente con otros grupos qumicos, en este caso con el grupo carboxilo de las
cadenas laterales de las protenas (coo-), razn por la cual cambia la configuracin
qumica de la enzima y afecta su actividad.
2
PRACTICA N02
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOLCTRICO DE LAS PROTENAS
I. INTRODUCCION
Reactivos(e
n ml)
Contenido
anterior
TUBOS
I
II
III
IV
VI
VII
VIII
IX
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
el
EFECTO
INMEDIATO
EFECTO
CALCULO
DESPUES DE DEL
30 MINUTOS
pH
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
O
+
++
+++
++
+
O
O
O
O
+
XX
XXX
X
+
O
O
O
1.0
h
Anotar
1.0
3
4
4.25
4.5
4.75
5
6
6.5
7
CALCULO
BAJO
FORMUL
A
3.495
3.796
4.097
4.398
4.7
5.001
5.302
5.603
5.904
X= precipitado
Observar
e
interpreta
r
EL efecto inmediato al agregar casena a los tubos con la dilucin de cido actico a
diferentes concentraciones nos muestra que el tubo III se volvi ms opalescente; luego de
los 30 min de reposo la mayor formacin de precipitado, por lo tanto mayor insolubilidad
tambin la verificamos en el tubo III; esto ocurre debido a la diferencia de concentracin
inica y PH de cada tubo con dilucin. La formacin de precipitado responde a la
inexistencia de repulsin electrosttica lo que nos indica que la protena se encuentra en su
punto isoelctrico.
Conclusi
n
*La casena pierde solubilidad y forma mayor cantidad de precipitado a un PH de 4.5 lo que
indica el punto isoelctrico de esta protena.
IV.CUESTIONARIO
1 Seale el PI aproximado de la protena que encontr en su experimento.
El PI aproximado encontrado para la casina fue de 4.5
2 Cmo interpreta el resultado obtenido del punto isoelctrico?
Cuando el PH de la solucin es tal que la carga neta de la protena es cero, es decir
cuando el nmero total cargas negativas iguala al nmero total de cargas positivas
presentes en la molcula, se llama a este valor de punto isoelctrico, en este estado la
protena se encuentra como un zwitterion.
El indicador que nos permiti determinarlo fue la precipitacin de la protena dada por la
inexistencia de repulsin electrosttica.
3 Qu es el pK?
Es la descripcin del grado de acidez o basicidad en trminos de pH que tiene la enorme
ventaja de evitar operaciones con potencias decimales de exponentes negativos. Dado que
las constantes de equilibrio vienen dadas, por lo general, como potencias de diez, es
posible extender la idea recogida en la definicin de pH al caso de los valores de K. As,
se define el pK, para una reaccin en equilibrio, en la forma:
pK = -log K
El pK es la constante de disociacin (ionizacin) de un cido (pKa) o una base (pKb) y
mediante estos valores se puede obtener el valor del PI.
Por ejemplo:
Si consideramos un aa sencillo, este puede adoptar tres formas inicas diferentes:
El primer grupo que se disocia es el carboxilo (pK1 ) .Por la proximidad del grupo NH3+,
el COOH se comporta como un cido moderadamente fuerte y El segundo grupo en
disociarse es el NH3+. (pK2) .El pI es el pH en el que la molcula se disocia por igual en
ambos sentidos, y como equidista de los dos valores de pK, puede obtenerse por su
semisuma:
La importancia radica en que si se conoce el PI de una protena, esta puede ser identificada
y aislada de una solucin, por ejemplo mediante la tcnica electroforesis de soporte.Esta
tcnica, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que
contiene un anftero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su
punto isoelctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presin
hidrosttica y manteniendo el campo elctrico, se desplazan las especies separadas hacia el
detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar pptidos
con pI que apenas difieren entre s 0.02 unidades de pH.
PRCTICA N 3
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
I
INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores que tienen un alto grado de especificidad y
eficiencia haciendo posible que las reacciones qumicas ocurran rpidamente
dentro de la clula a travs de vas bien definidas. Su naturaleza es proteica en el
mayor nmero de casos, salvo los ribozimas.
Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente
fundamentalmente que cada reaccin qumica debe ser catalizada por una
enzima. El reactante o substancia qumica que reacciona para dar un producto en
un sistema enzimtico se llama sustrato.
En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada
de dos maneras
II
III
ETAPA A:
COMPONENTES
TUBOS
I
Solucin de almidn pH 5 ml
6.0 al 1 %
Solucin de cloruro de 1 ml
sodio 0.1 M
Agua destilada
4 ml
II
5ml
1 ml
3
ml
Observar
e
interpreta
r
Los tubos en bao mara adquieren una temperatura ideal para asegurar la actividad enzimtic
de la amilasa, la cual hidroliza los enlaces glucosdicos ( 1-4) del componente -Amilosa qu
unen residuos de glucosa en el almidn, forma maltosa , isomaltosa y glucosa.
TUBOS
I
clorhdrico 5 ml
cido
0.05 N
De los tubos I y II 0.5 ml
de Etapa A
Solucin yodada
0.5 ml
II
5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Conclusi
n
*El mtodo de control de la actividad enzimtica por productos residuales permite verificar,
valorar y determinar la catlisis de una enzima teniendo como indicador el cambio de color
de la solucin.
TUBOS
I
II
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
2 ml
2 ml
Hervir 8 minutos
Enfriar
Solucin fosfomolbdica
Agua destilada
Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color
resultante
*En el tubo I se agreg el producto I mas solucin cprico alcalina, esto se puso hervir y
a enfriar y nos dio un producto V de color celeste, luego se le aadi solucin
fosfomolibdica +H2O y nos dio un producto VI de color claro
*En el tubo II de le agrego el producto II ms solucin cprica alcalina, esto se puso hervir
y a enfriar y nos dio un producto VII de color naranja, luego se le aadi solucin
fosfomolibdica +H2O y nos dio un producto VIII de color azul.
*La presencia de azucares reductores como la glucosa y la maltosa reducirn al ion
cprico a cuproso el cual da una coloracin naranja; y la solucin fosfomolibdica es un
indicador de la presencia de este ion cuproso al tornar el producto a una coloracin azulada
la cual puede cuantificarse para el anlisis de glucosa.
Observar
e
interpreta
r
En el tubo I no hubo reaccin, debido a que el almidn no fue degradado hasta azucares
reductores por la nula cantidad de enzima, por ende, no hubo una reduccin del ion cprico
a cuproso siendo esto indicado por el mantenimiento del color turquesa de la solucin
cprico alcalina.
En el tubo II si hubo reaccin debido que se le aadi el producto I, el cual posee glucosa
y maltosa(degradacin del almidn por la enzima amilasa); estos reducirn el ion cprico a
cuproso tornando a la solucin a una coloracin naranja.
Conclusin
IV
*El control de la actividad enzimtica por los productos finales permite determinar el
final de una hidrlisis teniendo como indicador el color que adopta la solucin.
CUESTIONARIO
a varios minutos. En los productos comerciales nos indican el tiempo que dura este
perodo de retardo.
Al finalizar esta fase, comienza la fase lineal, donde la velocidad de formacin del
producto permanece constante y es en esta etapa donde se determina la actividad
enzimtica.
A medida que va transcurriendo la reaccin, llega un momento en que la velocidad
comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio
entre sustrato y producto y / o variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas
por el tampn, a efectos de inhibicin del enzima, etc.
ALMIDON
AZUCARES REDUCTORES
SUSTRATO:
Es cualquier compuesto qumico sobre la cual acta una enzima, se une al sitio
activo de la enzima, y se forma un complejo enzima-sustrato,dicho de otra forma, las
enzimas se encargan de catalizar las reacciones qumicas que involucran a su sustrato.
PRODUCTO:
Es la molcula o molculas finales de una ruta metablica, se forman tras la accin
cataltica de la enzima sobre el sustrato.
APOENZIMA:
Parte proteica de una enzima sin ninguno de los cofactores o grupos prostticos
orgnicos o inorgnicos que puede modificar la actividad cataltica
ENZIMAS:
Son protenas complejas que producen cambios qumicos especficos en algunas
sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas. Como por ejemplo: las enzimas
pueden convertir los almidones y azucares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar.
COFACTORES:
COENZIMA:
Son cofactores orgnicos no proteicos, termoestables, que unidos a una apoenzima
constituyen la holoenzima o forma catalticamente activa de la enzima.
GRUPO PROSTETICO:
Molcula que se une de manera estable a una enzima mediante fuerzas covalentes, los
ms comunes son los metales.
COFACTORES:
Molcula que se une de manera transitoria y disociable a la enzima, los ms comunes
son los iones metlicos.
5.- Cul es la importancia clnica de la medicin de la actividad enzimtica? De
ejemplo
En el laboratorio es mucho ms prctico medir la actividad de una enzima que medir su
cantidad en el suero. Revela mucho mejor la presencia y el accionar de esta. Por este
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
2012
Murray R. ;Bender D; Botham K. HARPER. BIOQUIMICA ILUSTRADA
Disponible
en:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0864-03002012000200009&lng=es.
Domnguez Jos Luis, Fernndez Antonio, Ruiz Sara, Puente Juan Jess,
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106(6): 381-385.