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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

OBJETIVOS:

Observar la influencia de la temperatura y el pH sobre una reaccin enzimtica

Constatar la especificidad de las enzimas
Examinar el efecto de los iones metlicos pesados sobre la actividad de la -amilasa
Determinar el valor de Vm y Km para la -amilasa

FUNDAMENTO:
Las enzimas son protenas cuya funcin es catalizar las muy diversas reacciones que se
llevan a cabo dentro de los organismos vivos. Su accin es especfica y se afecta por
factores tales como la temperatura y el pH del medio, la concentracin de enzima y de
sustrato, la presencia o ausencia de cofactores y/o inhibidores, etc. En esta prctica se va a
ensayar la accin de varios de los factores mencionados sobre la -amilasa, una enzima que
en los seres humanos se encuentra presente en la saliva y en el pncreas.
La -amilasa (nombre sistemtico: 1,4-glucano-glucanohidrolasa; cdigo: 3.2.1.1 de la
Unin Internacional de Bioqumica; peso molecular: 45000) hidroliza los enlaces
glucosricos 1- 4. Estos enlaces se encuentran presentes en el almidn.
El almidn es una mezcla de dos polisacridos: amilosa y amilopectina. La amilosa con el
yodo da una coloracin azul oscura que se comunica a todo el almidn. Esta propiedad
permite seguir la accin de la -amilasa sobre el almidn: a medida que ste se va
hidrolizando el color azul va desapareciendo hasta llegar a un color amarillo ocre,
caracterstico de la solucin de yodo cuando la hidrlisis ha sido total:
-amilasa

Almidn
+
R. Lugol

maltosa + otros productos

+
R. Lugol

Color azul oscuro

color amarillo ocre

MATERIALES Y REACTIVOS
1 probeta de 100 ml
2 vasos de precipitados de 100 ml
1 embudo de vidrio
algodn
gradilla con 12 tubos de ensayo
cinta de enmascarar
hielo
termmetro
pipeta de 1 ml
pipeta de 2 ml
agitador de vidrio
probeta de 100 ml
50 ml suspensin de almidn al 0.5%
10 ml reactivo de Lugol
50 ml solucin amortiguadora de pH 3.0, 0,2 M
50 ml solucin amortiguadora de pH 5.0, 0,2 M
50 ml solucin amortiguadora de pH 7.0, 0,2 M
50 ml solucin amortiguadora de pH 9.0, 0,2 M
5 ml cloruro mercrico al 1%
5 ml nitrato de plomo al 1%

METODOLOGA
Preparacin de la amilasa salival:
Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de alimentos. Se
miden en una probeta 60 ml de agua destilada y con ellos se enjuaga la boca, en varios
buches, por espacio de unos 2 o 3 minutos, cada buche. El liquido recogido se filtra a
travs de un algodn Esta solucin, que en adelante se denominara amilasa salival, ser la
que se utilice para la realizacin de las distintas partes de la prctica, la que debe estar en
fro.
Influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival
Se rotulan cuatro tubos de ensayo 0, 20, 40, 90. En cada uno se vierten 1 ml de suspensin
de almidn al 0.5%. El tubo 0 se coloca, durante 10 minutos, en un bao de hielo; el tubo
20 se deja a temperatura ambiente; el tubo 40 y el tubo 90 se colocan respectivamente en un
bao de agua a 40 C y en un bao de agua hirviente, durante 10 minutos, para que el
contenido de los tubos adquiera la temperatura correspondiente. Mientras tanto se colocan 2
gotas de lugol en varias concavidades de la placa de porcelana. Al cabo de los 10 minutos
se agrega a cada tubo sin retirarlo del bao, 0.5 ml de amilasa salival. Se agitan bien los
tubos y se dejan durante 30 segundos a las condiciones de temperatura anteriormente
sealadas. Al cabo de este tiempo se colocan cinco gotas del contenido cada tubo en una

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concavidad de una placa de porcelana a la que previamente se le haban adicionado dos
gotas del reactivo de Lugol, y se observa el color producido. La temperatura optima ser
aquella en la cual se observe mas rpidamente el color amarillo ocre. Si el color permanece
azul, se esperan 2 minutos y luego se repite el procedimiento en la placa de porcelana.
Influencia del pH en la actividad enzimtica
Rotule cinco tubos de ensayo 3, 5, 6, 7 y 8; depostelos en un bao de agua a la
temperatura ptima (obtenida en la parte anterior) y agregue, en su orden sin retirarlos del
bao las sustancias que se indican a continuacin:

Tubo

Almidn 0.5%

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Amortiguador pH 3.0

2 ml

Amortiguador pH 5.0

2 ml

Amortiguador pH 6.0

2 ml

Amortiguador pH 7.0

2 ml

Amortiguador pH 8.0

Amilasa salival

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

solucin

0.5 ml

1 ml

2 ml
0.5ml

Despus de 1 minuto deposite cinco gotas del tubo 3 en una concavidad de la placa de
porcelana en la que previamente haba depositado dos gotas del reactivo del Lugol y
observe el color producido. Repita el mismo procedimiento con los dems tubos. El pH
ptimo para la - amilasa corresponde a aquel tubo donde se obtenga mas rpidamente el
color amarillo ocre. En caso de que no se observe este color en ninguno de los ensayos
repita el procedimiento anterior, con todos los tubos, cada minuto hasta que en alguna
concavidad aparezca el color amarillo ocre. Este ser el pH ptimo.
Concentracin ptima de enzima
Rotule cuatro tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4, depostelos en un bao de agua a la temperatura
ptima y, sin sacarlos de all, agregue, en su orden:

Tubo

Almidn 0.5%

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

Amortiguador de pH ptimo

2.9 ml

2.7 ml

2.1 ml

1.2 ml

Amilasa salival

0.1 ml

0.3 ml

0.9 ml

1.8 ml

Solucin

Realice los mismos ensayos que para determinar la temperatura y el pH ptimos.

Encuentre la concentracin ptima de enzima.
Efecto de los iones metlicos pesados sobre la accin de la amilasa
Rotule tres tubos de ensayo amilasa, Hg++ y Pb++, depostelos en un bao de agua a la
temperatura ptima y agregue en su orden:
Tubo

Amilasa

Hg++

Pb++

solucin
Almidn 0.5%

2 ml

2 ml

2 ml

Amortiguador de pH ptimo

3 ml

2 ml

2 ml

HgCl2 1%

1 ml

Pb(NO3)2

1 ml

Amilasa salival

1 ml

1 ml

1 ml

Repita el procedimiento de los casos anteriores y determine el efecto de los iones metlicos
pesados sobre la amilasa.
Efecto de la concentracin de sustrato
Rotule cinco tubos de ensayo 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 y 4.0. depostelos en un bao de agua a la
temperatura optima y, agregue en su orden, almidn y amortiguador. Deje que estn a la
temperatura ptima y luego solamente al primer tubo agregue la amilasa sin sacarlo del
bao mara. Agite sin sacarlo del agua y al cabo de 30 segundos extraiga 3 gotas de la

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solucin y haga la prueba con el lugol. Si no hay cambio a rojo pardo, espere otros 30
segundos y realice el mismo procedimiento hasta que aparezca el rojo pardo. Debe tomar
el tiempo lo ms exacto posible. Realice el mismo procedimiento para los dems tubos, uno
por uno.
Tubo

0.25

0.5

1.0

2.0

4.0

0.25 ml

0.5 ml

1.0 ml

2.0 ml

4.0 ml

Amortiguador de pH optimo 4.25 ml

4.0 ml

3.5 ml

2.5 ml

0.5 ml

Amilasa salival

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

solucin
Almidn 0.5%

0.5 ml

RESULTADOS:
1. Cul fue la temperatura ptima de la amilasa? El pH ptimo? Con cual solucin
de amilasa salival fue ms rpida la digestin del almidn?
2. Qu efecto tuvieron el mercurio y el plomo sobre la actividad de la -amilasa?
3. Llene la siguiente tabla:
Volumen de
Sustrato, ml

Concentracin
del sustrato, [ S ]

tiempo,
t, min

velocidad
v = [ S ]/ t

1/[ S ]

1/v

0.25 ml
0.5 ml
1.0 ml
2.0 ml
4.0 ml

4. Con base en los datos de la tabla anterior, construya dos graficas:

Grfica 1: velocidad de reaccin, v, en funcin de la concentracin de sustrato, [ S ]
Grfica 2: 1/v en funcin de 1/[ S ]. Grfica de Linneaweaver-Burk.
De las dos graficas deduzca los valores de la velocidad mxima, Vm y de la constante de
Michaellis-Menten, Km