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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCANTARA


FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI
GUSTAVO PASSOS MEDROS
LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS
THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1


EXPERIÊNCIA 1 – ESPECTROFOTOMETRIA

SANTO ANDRÉ
FEVEREIRO / 2010
Sumário

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................3
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................5
3. METODOLOGIA...............................................................................................................5
3.1. Materiais ......................................................................................................................5
3.2. Métodos .......................................................................................................................5
4. RESULTADOS ..................................................................................................................6
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................9
6. CONCLUSÃO..................................................................................................................11
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................11
8. ANEXOS ..........................................................................................................................13
8.1. Anexo 1 - Exercício ...................................................................................................13
8.2. Anexo 2 – Tabela de dados espectrofotômetro..........................................................13
3

1. INTRODUÇÃO
O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de
medida estão duas formas principais de verificação de misturas a espectroscopia e a
espectrofotometria.
Espectroscopia é a separação, detecção e registro de mudanças de energia
envolvendo núcleos, átomos, íons ou moléculas. Essas mudanças podem ser
decorrentes de emissão, absorção, dispersão da radiação eletromagnética ou
partículas. [1]
Já a espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos
de onda entre o ultravioleta e o infravermelho, seus valores estão especificados na
Tabela 1. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz monocromática
através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa
solução. Um prisma contido no aparelho separa a luz em feixes com diferentes
comprimentos de onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática
através da amostra. O equipamento permite saber que quantidade de luz é
absorvida a cada comprimento de onda. [2]
Tabela 1 – Divisão do espectro eletromagnético na região do infravermelho até o ultravioleta.

Região Denominação
>16 µm Infravermelho distante
16µ m até 2,5 µm Infravermelho no NaCl
2500nm até 780nm Infravernelho próximo
780nm até 380nm Visível
380nm até 200nm Ultravioleta próximo
200nm até 10nm Ultravioleta no vácuo

O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um


composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância.
Como diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a
espectrofotometria permite identificar e quantificar substâncias com base no seu
espectro. A quantificação é realizada com a relação entre quantidade de luz
absorvida e concentração da substância. [2]
4

A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da
amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –Beer (Eq. (1):
Aλ = ε λ cl (1)

Sendo: Aλ = absorbância a fixo


ελ = constante para um fixo
c = concentração da solução absorvente
l = distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra

Ou seja, a absorbância da luz a cada comprimento de onda é diretamente


proporcional à concentração da solução contida na cubeta, sendo essas
normalmente com 1 cm de comprimento. Esta linearidade deixa de ocorrer a
concentrações muito elevadas da substância, sendo necessário diluir a amostra
antes de medir. [2]
Outra característica da Lei de Beer é a aditividade das absorbâncias. É
possível determinar simultaneamente duas ou mais espécies diferentes presentes
em uma amostra através dessa mesma lei. Isto pode ser realizado desde que não
ocorra nenhuma interação entre as espécies e que o espectro de absorção
observado pela mistura seja a soma dos espectros individuais que seriam obtidos
caso cada uma das espécies estivesse presente sozinha na solução e sob as
mesmas condições experimentais. Na prática essas condições não ocorrem, mas
mesmo assim é possível essa determinação. Para cada comprimento de onda, a
absorbância total devido às espécies presentes na solução pode ser expressa como
a soma das absorbâncias de cada uma delas. [1]
A lei de Beer é eficaz ao medir o comportamento da absorção de meios
contendo concentrações de analito relativamente baixas, sendo limitante. Para altas
concentrações, geralmente maior de 0,01M, a distância média entre as moléculas
responsáveis pela absorção diminui a ponto de cada molécula afetar a distribuição
de carga de suas vizinhas. Essa interação pode alterar a capacidade das moléculas
de absorver um determinado comprimento de onda da radiação. Como a interação
depende da concentração, ocorre um desvio da relação linear entre absorbância e
concentração. [3]
5

Atualmente existem tecnologias tão avançadas que se torna possível descrever


com precisão a estrutura exata de uma molécula. Os equipamentos permitem
detectar os tipos de elementos presentes no composto, a quantidade de cada um
deles, a posição tridimensional de cada átomo e muito mais.

2. OBJETIVOS
Esta experiência tem por objetivo compreender os conceitos e aplicações da
espectrofotometria.
Também são objetivos determinar o espectro UV-visível do complexo formado
entre os íons Cu2+ e as proteínas, utilizar o comprimento de onda de máxima
absorbância para elaboração de curva-padrão e determinação de absortividade e
calcular a concentração de proteínas de uma solução de albumina.

3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
• Reagente de Biureto pré-preparados.
• Água destilada.
• Espectrofotômetro.
• Cubeta.
• Papel absorvente macio para limpeza das cubetas.
• 2 micropipetas volumétricas.
• Estante com 8 tubos de ensaio.
• Agitador tipo vórtex..
• Soluções-padrão de soro albumina bovina (BSA) com as concentrações
em %(m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,75.
• Amostra de concentração desconhecida.

3.2. Métodos
Adicionou-se 0,5 mL das amostras de diferentes concentrações em cada tubo
com auxílio de uma das micropipetas e um tubo com apenas água – denominado
branco. Em seguida com o uso da outra micropipeta foram adicionados 1,0 mL de
água destilada para completar 1,5 mL de solução.
6

Todos os tubos foram agitados manualmente e em seguida adicionados 1,5 mL


do reagente de Biureto e tornou-se a agitar, mas desta vez com o uso do agitador de
vórtex. Após 5 minutos de espera, a absorbância de cada amostra foi determinada
com o uso do espectrofotômetro.
O espectrofotômetro foi ajustado para o comprimento de onda 550nm, pois
este comprimento era o comprimento esperado de máxima absorbância da solução.
Mesmo assim, este valor foi ratificado pela análise da amostra de concentração
0,25% comparada ao branco em outro espectrofotômetro que varia automaticamente
os comprimentos de onda e calcula a máxima absorbância agilizando o
procedimento. Esta análise foi feita dentro dos comprimentos e 400nm a 800nm com
incremento de +5nm a cada novo teste.
O cálculo da amostra desconhecida foi feito com base nos dados coletados das
outras amostras.

4. RESULTADOS
Pretende-se preparar 100mL da solução de biureto, as unidades de % (m/v)
representam x g de soluto para 100mL de solução, para o CuSO4 0,15 % (m/v) é
necessário 0,15g e para o tartarato de sódio e potássio 0,06% (m/v) é necessário
0,06g. Já para o NaOH (0,75 mol/L), temos:
0,75 mol - 1L 1 mol - 40g
X – 0,1 L 0,075 mol - Y
X = 0,075 mol Y= 3 g de NaOH

Para a preparação de cada solução padrão temos o mesmo procedimento


citado acima para a unidade de % (m/v), porém como se quer obter 1mL de solução
deve-se dividir todos os valores por 100, para obter as massas necessárias.
0,125% → 1,25. 10-3 g
0,25%→ 2,5. 10-3 g
0,5%→ 5. 10-3 g
0,75%→ 7,5. 10-3 g
1%→ 1. 10-2 g
1,25%→ 1,25. 10-2 g
1,75%→ 1,75. 10-2 g
7

De acordo com a Figura 1, cujos dados encontram-se na Tabela 3 no Anexo


8.2, o valor obtido para o comprimento de onda de máxima absorção foi de 550nm.

Figura 1 – Curva-padrão.
De posse do valor de comprimento de onda utilizou-se tal valor e mediu-se a
absorbância em cada amostra (Tabela 2).

Tabela 2 – Absorbância coletada de cada amostra.

Concentração % Absorbância
0,125 0,07
0,25 0,12
0,5 0,23
0,75 0,33
1 0,44
1,25 0,52
1,75 0,62
Desconhecida 0,19

Com tais valores montou-se o gráfico da Figura 2. Utilizando o método de


aproximação linear no gráfico e utilizando a equação da reta obtida.,
8

Figura 2 – Gráfico da absorbância em função da concentração.


De acordo com o gráfico a função linear da absorbância no comprimento de
onda de 550 nm é dada por (2):
y = 0,3528 x + 0, 0494 (2)
Sendo o índice R2 de ajuste deste gráfico é igual a 97,78%, portanto esta reta
descreve satisfatoriamente uma função para os pontos inseridos no gráfico.
Considerando Lei de Lambert –Beer (Eq. (1)):

Como b = 1cm,

Pela comparação com o gráfico obtido, observar-se-á que a absortividade é


numericamente igual ao coeficiente angular da reta, cujo valor é 0,3528 L.cm-¹mol-1.
Os cálculos para a análise da amostra desconhecida foram feitos a partir da
equação da na Figura 2. Sendo x a concentração correspondente da absorbância y
medida.
y = 0,3528 x + 0, 0494
y − 0, 0494 0,19 − 0, 0494 (3)
x= = = 0,3985 ≈ 0, 40
0,3528 0, 3528
Portanto a concentração da amostra desconhecida é de 0,40% (m/v).
Ambos os gráficos condizem com os exemplos da página 281 de [3] a respeito
dos gráficos obtidos em análises da Lei de Beer.
9

5. DISCUSSÃO
Como pode ser observado no decorrer do relatório, os resultados obtidos
permitem que se possam fazer análises, as quais podem estabelecer elementos de
comparação com as teorias existentes, bem como obter subsídeos didáticos, que
constatados na prática fortalecem e retificam a base teórica.
No decorrer do experimento, depois que os 9 tubos de ensaio foram
preenchidos, foi possível fazer a comparação devido a coloração. Além das
constatações quantitativas a cerca da amostra desconhecida, que estabeleceu a
comparação com as demais, também foi possível fazê-la tomando como base as
colorações das amostras, as quais tiveram variação de seu gradiente, onde as
amostras com maior concentração apresentavam cores mais escuras. A título de
observação, já poderia se constatar o intervalo da concentração da amostra
desconhecida, pois sua coloração ficou entre aquelas dos tubos 2 e 3, ou seja,
0,25% e 0,5%, respectivamente. Entretanto, há a necessidade de se determinar com
maior precisão, a medida do possível, quanto ao valor da concentração, como a
função do gráfico Absorbância x Concentração aproxima-se de uma reta, pôde-se
estimar a concentração da amostra desconhecida.
Conforme observado graficamente, existe um comportamento da absorbância
em função da concentração, considerando uma mesma substância. Sendo esta a
mesma, ao serem utilizadas amostras com concentrações diferentes, a absorbância
varia na mesma proporção, pois é diretamente proporcional. Intuitivamente faz
sentido, seguindo a linha de raciocínio baseada no fato de que quanto maior é o
número de partículas, maior concentração, maior é a probabilidade de fótons serem
absorvidos e, consequentemente, maior será a absorbância. Entretanto, embora não
seja possível visualizar neste experimento, para altas concentrações, a curva
padrão, depois de um certo ponto, tende a ser uma curva. [5]
A absorbância seria, de maneira grosseira, uma medida quantitativa para se
obter a quantidade de luz absorvida. Em contrapartida, existe uma outra variável que
está relacionada a absorbância denominada transmitância, que seria o quanto foi
transmitido, sem absorção, de luz. Existe uma relação simples entre estas duas
variáveis, determinada como:
10

, onde A é a absorbância e T a transmitância. Todavia, tal relação não


foi utilizada neste experimento, mas é passível de ser representada a fim de
apresentar a variável transmitância e sua relação com a absorbância [5].
Para este experimento utilizou-se outro método para a determinação numérica
da absorbância, sendo esta a equação (1). Fazendo uso dessa fórmula e realizando
a demonstração encontrada nos Resultados, pode-se achar uma relação com outra
variável, chamada absortividade, que, conforme determina a demonstração, é igual,
numericamente, ao coeficiente angular da reta do gráfico Absorbância x
Concentração. Portanto, quanto maior for a absortividade maior será a variação da
absorbância em função da concentração.
O gráfico plotado foi gerado a partir de medições realizadas com o mesmo
comprimento de onde, 550 nm. Entretanto, tal valor não é arbitrário, ele é fixado
devido ao uso do espectrofotômetro. Este aparelho utiliza a amostra em branco e
uma amostra qualquer, no caso 0,25%, e a partir delas faz medições, variando de 5
nm em 5 nm, encontrando, assim, a absorbância em cada comprimento de onde no
intervalo 400-800 nm. É a mesma função do espectrofotômetro, entretanto, ele é
capaz de fazer as mudanças automaticamente. Estas têm por objetivo fazer com
que seja encontrado o comprimento de onde haja a maior absorbância, cujo valor foi
registrado, como pode ser observado na Figura 1, como sendo 550 nm. Portanto,
tudo acima citado foi medido para este comprimento de onde, e, então, os números
devem receber a observação de que são para a maior absorbância possível, mas
que de qualquer forma, se fosse mudado o comprimento para outro, as propriedades
e características não se alterariam.
É importante destacar a função da amostra branca para o experimento. Tal
amostra deve servir como base para o espectrofotômetro, a fim de que ela seja a
referência para as medições das outras amostras.
Existem muitos erros que podem exercer papel significativo na alteração dos
resultados obtidos.
Possíveis erros gerados pelo instrumento de medição podem ser considerados,
no que diz respeito, inclusive, as casas de precisão do resultado. Considerando
ainda como parte do instrumento, as cubetas utilizadas podem provocar certo erro,
pois podem conter marcas provocadas pelo manuseio, bem como riscos ou outras
imperfeições que alterem a medição. Ainda referindo-se à cubeta, por se fazer uso
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da mesma cubeta para mais de uma medição, pode acontecer de haver alguma
alteração de concentração, embora tenha ocorrido a medição na ordem crescente,
se existe uma concentração baixa no recipiente e nele é acrescido uma de
concentração maior, esta tende a ser diminuída. Embora as quantidades restantes
na cubeta sejam pequenas, não se pode descartar tal possibilidade.
Embora as micropipetas volumétricas tenham boa precisão, ainda existe um
certo erro aplicado a ela, mínimo, porém existente.
Os erros citados até então são previsíveis, porém existem outros que não são,
como o manuseio. Devido a se tratar de manuseio humano para a realização das
tarefas que não dependem da medição por instrumento, podem ocorrer
determinados erros, como, por exemplo, a colocação de maneira inadequada ou não
totalmente perfeita da substância no tubo de ensaio, o que faz com que possa haver
alguma pequena mudança.

6. CONCLUSÃO
Pode-se concluir, a partir da análise dos resultados e da teoria aplicada, que a
espectrofotometria, apesar das limitações, enunciadas no anexo deste relatório, é
um método que permite analisar compostos sensíveis à luz (em destaque a
albumina, utilizada neste experimento).
Tal método permite, além da medição da concentração, a identificação dos
compostos de determinada substância, através de comparação de resultados
obtidos por outros métodos, previamente calibrados.
A absortividade obtida, que é numericamente igual ao coeficiente angular da
reta obtida na Figura 2, vale 0,3528 Lcm-¹mol-1 e a concetração 0,40% (m/v).

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ. Base teórica da Espectrofotometria e


da Colorimetria. Disponível em <http://www.ufpa.br/ccen/quimica/base%20teorica%
20da%20espectrofotometria.htm>. Acesso em 23 de fev. 2010.
[2] SECA, Ana Maria L. da. Espectrofometria. Universidade dos Açores. Disponível
em <http://www.uac.pt/~anaseca/pdf_bioquimica/introd_espectrof.pdf>. Acesso em
27 de fev. 2010.
[3] SKOOG, Douglas A., HOLLER, F. J.; NIEMAN, Timothy A. Princípios de Análise
Instrumental. 5.ed. Porto Alegre, Bookman, 2002. p.278-282.
12

[4] PROTEÍNAS. Disponível em <http://sitebiomedico.br.tripod.com/proteinas.htm>.


Acesso em 23 de fev. 2010.
[5] Universidade de São Paulo. Lei de Beer. Disponível em http://plato.if.usp.br/1-
2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer.htm. Acessado em 03 de março de 2010.
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8. ANEXOS
8.1. Anexo 1 - Exercício
Descreva o princípio do método de Biureto para a dosagem de proteínas,
relacionando suas vantagens e desvantagens em relação a outros métodos para
dosagem de proteínas.
Resp.:

O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914, baseado na


observação de que substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam
um complexo de cor roxa com sai de cobre em soluções alcalinas. A intensidade da
cor formada é proporcional à quantidade de proteína, e a medida é feita num
colorímetro. [4]
Este método tem como vantagens ser bastante específico por não apresentar
problemas interferentes e também ser simples, rápido e barato. Também é vantajoso
por envolver uma reação com a ligação peptídica, assim o método determina
número de proteínas, ao contrário dos métodos de Kjeldahl e de Dumas que
determinam o Nitrogênio total. [4]
Porém ele tem duas desvantagens que são a necessidade de uma curva de
calibração tomada com um padrão conhecido de proteína, por exemplo, uma
proteína determinada por Kjeldahl. A cor formada no complexo não é idêntica para
todas as proteínas, porém os desvios causados são menores do que em outros
métodos colorimétricos. [4]

8.2. Anexo 2 – Tabela de dados espectrofotômetro

Tabela 3 – Dados do espectrofotômetro.


Nm Abs 445.0 0.038
400.0 0.088 450.0 0.039
405.0 0.076 455.0 0.042
410.0 0.065 460.0 0.045
415.0 0.056 465.0 0.049
420.0 0.049 470.0 0.053
425.0 0.044 475.0 0.059
430.0 0.041 480.0 0.064
435.0 0.039 485.0 0.069
440.0 0.038 490.0 0.076
14

495.0 0.083 650.0 0.035


500.0 0.089 655.0 0.030
505.0 0.095 660.0 0.026
510.0 0.101 665.0 0.022
515.0 0.107 670.0 0.018
520.0 0.112 675.0 0.015
525.0 0.116 680.0 0.012
530.0 0.119 685.0 0.009
535.0 0.122 690.0 0.007
540.0 0.123 695.0 0.005
545.0 0.124 700.0 0.003
550.0 0.124 705.0 0.001
555.0 0.123 710.0 -0.001
560.0 0.121 715.0 -0.002
565.0 0.119 720.0 -0.003
570.0 0.116 725.0 -0.004
575.0 0.113 730.0 -0.004
580.0 0.110 735.0 -0.005
585.0 0.106 740.0 -0.005
590.0 0.101 745.0 -0.006
595.0 0.096 750.0 -0.006
600.0 0.091 755.0 -0.006
605.0 0.086 760.0 -0.006
610.0 0.079 765.0 -0.006
615.0 0.073 770.0 -0.006
620.0 0.068 775.0 -0.006
625.0 0.062 780.0 -0.006
630.0 0.056 785.0 -0.006
635.0 0.050 790.0 -0.005
640.0 0.045 795.0 -0.005
645.0 0.040 800.0 -0.005