\

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

FAa.JLTAD DE lVlEDICINA VETERINARIA Y

ZCXJI'ECNIA

"ANALISIS DEL USO SELECIT\U DE TECNICAS DESC'ALCIFICANI'ES

Y SUS INDICACICNES PARA EL ESWDIO DE IA CI'JDAIQJITECI!I
'

RA Y ACI'IVIDAD ENZIMA.TICA DE TEJIIO..'; MINERALIZAroS".

(Investigacin Bibliogrfica).

lVlEDICO

PARA CBI'ENER EL
VETERINARIO

TIWID DE:
Y

ZCXJI'ECNI STA

PRESENTA
MARIO

Asesores:

REAL

NAVARRO

M. en C. Joaqun Garcia Estrada

M~V.Z. Jorge Hernndez Gobora

1'

A G R A D E C I M I E N T O S

A MI S PADRES:

TEX:DUID REAL l.VDRALES

MARIA SOLEDAD NAVAROO DE REAL
IDR SU DEDIC'ACIOO, ESFUERW Y 0\RIJ

A MIS ABUELITAS:
MARIA 'l}INI'ERIA lVDRALES ENCISO
MAXIMILIANA HERRERA

A MI S HERVJAN)S:

BENI'ID
RAFAEL ENRIQJE

MARIA DE JESUS AIJll\

SILVIA ELENA
SERGIO

CARLOS ALRNSO
JAIME ALBEinU

EIDY RENE

CtJCBA

A MIS ASEOORES:

M. en C.

J~IN

GARCIA

ES~

M. V. Z. JORGE HERNANDEZ a:HJRA

aN AGRADECIMIENIO Y RESPEIO

A MI ESJlO:)A:

l.VIl'HC'A ALEJANDRA TMit\YO DE REAL

IOR SU PACIENCIA Y C'ARifO

A MIS <XlVJPAEOC>S Y AMI<DS.

A IA FAQJLTAD DE MEDICINA VETERINARIA

Y zaJIECNIA DE IA UNIVERSIDAD DE

GUADAIAJARA.

EL PRESENTE TRABAJO SE RFALI'IJJ EN EL DEPARrM'JENTO

DE INVESTIGACICN CIENI'IFICA DE IA FAaJ.LTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y Z<XJI'ECNIA DE IA UNIVERSIDAD
DE GUAD\LAJARA.

1986

"ANALISIS DEL USO SELECTIVO DE TECNICAS DESCALciFIC'ANrES Y SUS INDICACICNES PARA EL ESniDIO DE IA CI
'IOAIQJITECruRA Y ACTIVIDAD ENZIMATICA DE TEJIOOS MINERAL 1ZAlX)S"
(

INVESTIGACICN

BIBLIOORAFICA

R O

L O G O

Ante la necesidad de someter a diferentes procesos de descalcificacin

los tejidos que contienen calcio, para poder realizar estudios histol
gicos y patolgicos y por las alteraciones estructurales que resultan,
se realiz el presente trabajo que tiene como propsito poner al ale~
ce de profesores y alumnos la metodologa ms actualizada sobre el fenmeno de descalcificacin.
Para de esta manera tener elementos de decisin respecto a la naturale
za de los tejidos y la aplicacin de tcnicas especficas, esto es en
base al anlisis de los diferentes elementos que participan en la cali
dad final de la preparacin y las indicaciones particulares segn los
objetivos que se tratan de alcanzar.

CUCBA

INTRODUCCION
Para el estudio de tejidos con cierto grado de dureza_es necesario emplear
procedimientos especiales que nos pennitan conocer su estructura fina y composicin qumica, esto es importante cuando se tratan de detenninar alteraciones patolgicas tisulares, tal corno las que se presentan en fracturas, hemorragias periosteales y mineralizacin anormal de algunos tejidos,
entre las ms importantes.
Para poder conseguir lo anterior es necesario preservar la organizacin ci
tolgica individual adems de mantener las relaciones anatmicas precisas
entre las diferentes estructuras y de esta forma establecer las anonmalida
des que se presenten, para esto existen tcnicas especficas de prepara -cin y coloracin del material bajo estudio.
Por otra parte, tambin se utilizan procedimientos de descalcificacin para la comprensin de diversos fenmenos biolgicos corno desarrollo del si~
tema esqueltico y dientes, reduccin y reparacin de lesiones seas y modificaciones enzimticas que ocurren durante la maduracin celular entre otras.

En los ltimos aos se han conseguido mejoras importantes de las tcnicas

para preparar fragmentos de tejidos mediante descalcificacin, tanto para
exmenes a nivel de microscopa de luz, corno para anlisis con microscopa
electrnica de transmisin y barrido, sin embargo, es necesario que se re~
nan condiciones especiales para obtener preparaciones de buena calidad que
nos pennitan algn propsito particular, tal corno:
Preservar la actividad enzirntica.
Inmovilizar pigmentos que contengan hierro.
Aumentar la afinidad tintorial de las muestras.
Disminuir el tiempo delprocedimiento.
Preservar la integridad de algunos componentes como fibras de colgena, proteoglucanos y glucoprotenas.

Para poder conseguir lo anterior es necesario conocer la influencia de variables que intervienen en el proceso, entre las principales estn:
Duracin de la descalcificacin.
Eleccin de fijador as como de la concentracin ptima del mismo.
Tiempo de la fijacin.
Condiciones de pH de la solucin descalcificante.
Temperatura.
Utilizacin de vaco para especmenes especiales.
Preinclusin en medios de soporte antes de iniciar el pr~
ceso de descalcificacin.
La seleccin de las condiciones particulares ms apropiadas para el tratamiento de los diferentes tejidos depender adems del propsito que se pr~
tende alcanzar.
El perfeccionmniento de los procedimientos de descalcificacin se basa en
la comprensin de los principios tradicionales donde se emplean cidos minerales u orgnicos fuertes o dbiles, entre estos se encuentran el cido
clorhdrico, cido tricloroactico, cido sulfuroso, etc. que pueden util!
zarse en un bao electroltico donde se eleva la temperatura corno resultado del paso de una corriente elctrica entre dos electrodos.
Los cidos actan corno agentes que remueven el calcio de los tejidos y entre ms fuerte es el cido es ms intensa la desmineralizacin. Como re-sultado de lo anterior se producen distorsiones en la estructura de los t~
jidos, as como disminucin en la afinidad hacia colorantes. Esto no suce
de con el cido etilen-diamino tetractico (EDIA) que produce una desmineralizacin ms lenta, por esta propiedad se le considera uno de los mejo-res agentes descalcificantes en investigacin biomdica, razn por la cual
ocupa parte importante en el presente trabajo.

JUSTIFICACION
Debido a la dificultad que existe para extraer las substancias minerales
presentes en la matriz citoplasmtica celular sin alterar la naturaleza fsica y qumica de los tejidos con alto contenido mineral, y puesto que
las tcnicas actuales plantean la manipulacin de un gran nmero de vari~
tes en el tratamiento de las muestras, es necesario estudiar los princip~
les procedimientos, as como las indicaciones especiales para cada uno de
ellos con el objeto de poder utilizarlos para la obtencin de preparaciones de buena calidad para diferentes propsitos de estudio en el rea de
morfologa veterinaria.

OBJETIVOS
GENERAL:

Actualizar la infonnacin relacionada con procedimientos de descalcificacin

para procesruniento histolgico e histopatolgico.
P.ARI'I<XJLARES:
I.

Describir las variantes de aplicacin de las tcnicas de descalcifica

cin para estudios de:
a) Histoqumica y citoqumica.
b) Histopatologa.
e) Inmunocitoqumica.
d) Anatoma macro y microscpica.

II.

Seleccionar los procedimientos de preparacin de muestras ms convenientes en base a la disponibilidad de reactivos y equipo, as corno
por la facilidad y resolucin que se obtiene.

III.

Proporcionar infonnacin altamente especializada en el rea de morfa

logia que pennita la incorporacin de las tcnicas ms actuales para
estudiar tejidos que contengan minerales.

METODOLOGIA
El presente trabajo consisti en revisar la bibliografa relacionada con el
uso de agentes descalcificantes en tejidos mineralizados como dientes y hu~
sos, y en algunos tejidos blandos anonnalmente mineralizados. Se consultaron los "Index Medicus"de 10 aos anteriores a 1984 utilizando las siguientes combinaciones de palabras; tcnicas de descalcificacin, procedimientos
histolgicos, desmineralizacin.
De la consulta de hemerotecas especializadas se obtuvo una lista de referen
cias bibliogrficas de las cuales se seleccionaron las ms relacionadas con
el motivo del trabajo.
Se obtuvieron los artculos originales mediante el servicio del centro de Investigacin Cientfica y Humanstica de la ~. as como mediante la solicitud directa a los autores.
Una vez con los trabajos en el idioma original se procedi a clasificarlos
respecto al tipo de metodologa que se utiliz, se omitieron todos aquellos
procedimientos que por la instrumentacin necesaria estn fuera de alcance
de nuestro pas.
Despus de lo anterior se continu con el siguiente procedimiento:
Traduccin.
Anlisis de todos los artculos.
Discusin particular de cada tcnica y en su conjunto.
Sntesis; el producto de esta ltima etapa representa el contenido
principal del presente trabajo.
Para presentar la informacin se estructuraron los siguientes apartados;
Subdivisin en 4 captulos.
Cada captulo consta de:
a)
Introduccin
b)
Procedimiento metodolgico.
e) Resultados
d)
Conclusiones generales.
e)
Bibliografa del contenido del captulo.
5

El material completo abarca 13 tcnicas representativas de los procedimientos ms usuales, mismas que fueron agrupadas en base a su similitud metodolgica, asimismo, en la introduccin de cada captulo se hace referencia ~
neral al contenido de los diferentes trabajos, al final de cada uno de es-tos se presentan las conclusiones, y existe adems una discusin general p~
ra cada captulo, as como las referencias bibliogrficas referentes al tema descrito.
El presente trabajo servir como una fuente de consulta para la realizacin
de investigaciones en tejidos que poseen minerales, as como para la docu-mentacin de estudiantes en el rea de morfologa microscpica que se en -cuentran en etapas de fonnacin.

C O N T E N I D O
CAPITUDO l. Tcnicas de descalcificacin de tejidos para estudios con mi
croscopa de luz.
a) Descalcificacin con EDIA
b)
Descalcificacin con cidos fuertes.
e)
Descalcificacin con cidos dbiles.
d)
Variante de Bassolati.
e)
Bibliografa.
CAPITUDO 2. Procedimientos histoqumicos especficos para detenninacin
de actividad enzimtica en tejidos que contengan calcio.
a)
Identificacin de deshidrogenasa del cido lctico.
b)
Procedimientos de inmunohistoqumica.
e)
Bibliografa.
CAPITUDO 3. Utilizacin de agentes descalcificantes para microscopa elec
trnica de transmisin y barrido.
a)
Estudios de dentina y hueso coclear.
b)
Bibliografa
CAPITUDO 4. Control de descalcificacin.
a)
Mediante espectofotometra de absorcin atmica.
b)
Identificacin directa de descalcificacin mediante deter
minacin del punto final de descalcificacin.
e) ~ejo y control de tejidos durante la descalcificacin.
d)
Bibliografa.

CAPITULO

INl'RCIX.JCX::I CN:

Existe una gran dificultad metodolgica para obLener cortes de buena cali
dad cuando el material para estudio posee depsitos de minerales, ya que
se requiere de procedimientos especiales de inclusin, por lo anterior se
hace necesario remover los minerales presentes, esto produce una modific~
cin del arreglo estructural nonnal, sin embargo, es posible identificar
la organizacin primaria mediante el uso de coloraciones especficas que
muestran selectividad por los diferentes componentes celulares particulares.
Con el objeto de disminuir el efecto descrito se han aplicado recursos qu!
micos que reducen la extraccin de compuestos orgnicos, principalmente
proteoglucanos que estn presentes tanto en matriz mineralizada y no mineralizada.
Otra aplicacin de los agentes descalcificantes es para la coloracin esp~
cfica de rrwcobacterium tuberculosis, de tal manera que sea posible la ide~
tificacin positiva de estos cuando se realizan estudios de diagnstico en
"'
ndulos linfticos de pacientes sospechosos de tuberculosis,
este criterio
de preservacin debe aplicarse tambin para la identificacin de patologas
de origen steo-medular, para esto es necesario mantener la integridad de
los elementos intracelulares despus de someter los tejidos a tratrunientos
enrgicos para la extraccin de minerales.
Es posible utilizar tambin equipo especial que facilite el trabajo de pr~
paracin de la muestra, a continuacin se presentan diferentes procedimie~
tos que por su aplicacin resultan importantes para estudios histolgicos
nonnales, as como para la identificacin de patologas.

'l'ECNICA No. 1
PRCCEDIMIENIO PARA IA IDENI'IFICACICN DE l\llt\TRIZ 03'.IIDIDE EN HUESO DESCALC.!
FICAOO.

S. Yoshki (1973).

En este experimento se utilizaron huesos raquticos de rata debido a que

estos contienen una gran cantidad de matriz osteoide, para esto se alime~
taron ratas con raciones bajas en calcio y deficientes en vitamina D.
Posterionnente bajo condiciones de anestesia se obtuvieron rebanadas de 3-5 mm. de espesor del peron, la tibia y la mandbula con dientes con el
uso de una sierra. Este material se fij por inmersin en cloruro cianrico (Cl2Cn) al 0.5% en metano! con morgolona N-Metil al 1.0% durante 24
a 48 horas a temperatura ambiente, posterionnente se separaron dos grupos,
uno incluido en parafina sin descalcificar y el otro previamente descalci
ficado con EDrA al 10%.
El material proveniente de ambos grupos se seccion a 5J*n. de espesor en
un microtamo y se ti con hematoxilina de Mayers y Eosina acuosa al 1%,
se utiliz tambin el mtodo de Hedenhains Azan y el mtodo de Van Gieson
para la tincin de fibras de tejido conectivo.
De algunos cortes del material no descalcificado se obtuvieron radiogra--

fas con pelcula Kodak 949-0, otros cortes se montaron en portaobjetos para ser teidos con el mtodo Von Kossa y/o el mtodo rojo de Alizarina
para identificar la matriz mineralizada.

RESULTAOOS:

Con la tcnica de hematoxilina-eosina se observ consistentemente en mate

rial no desmineralizado una regin trabecular perifrica fuertemente eos!
noflica que se podra diferenciar claramente de las regiones centrales.
Esta correspondi a matriz osteoide cuando se le compar con las microradiografas y se confirm con las tcnicas de Von Kossa y rojo de alizarina. Esta propiedad eosinofilica provocada por la fijacin con cloruro
cianrico persisti an despus de la descalcificacin del tejido ya que
las regiones mineralizadas centrales menos eosinoflicas correspondieron
tambin a matriz mineralizada.
cuando los cortes descalcificados se volvieron a fijar nuevamente en cloruro cianrico y se tieron con hematoxilina-eosina se perdi la diferenciacin tintorial.
Otros tejidos no mineralizados con matrices colgenas presentes en prede~
tina, dientes y fibras de tejido conectivo alrededor de las trabculas
seas aparecieron fuertemente eosinoflicos tanto en tejidos fijados descalcificados como sin descalcificar, sin embargo con el mtodo de Heidenhain Azan y Van Gieson no se observ una coloracin diferencial entre matrices 111ineralizadas y no mineralizadas.
a:NCLUSIGJES:
En huesos fijados con cloruro cianrico la matriz osteoide se diferenci

de la matriz mineralizada por su eosinofilia intensa tanto en tejidos de~

calcificados y normales con la tcnica de H y E. El uso de esta mezcla fijadora no impide la aplicacin de otras tcnicas para fibras de tejido
conectivo (Heidenhain Azan y Van Gieson).
Al parecer la eosinofilia de la matriz osteoide est dada por la presen-cia de colgena en esta, tal como ocurre en tejidos blandos.
Se recomiendan las siguientes condiciones para la aplicacin ms adecuada
de este mtodo:
10

1.-

El material que se desea fijar debe ser del menor tamao

posible (3 a 5J&n de espesor) y realizar la fijacin por
24 a 48 horas en la solucin de cloruro cianrico debido
a la escasa velocidad de penetracin de ste. El mate-rial que haya sido previamente fijado en etanol se fijar nuevamente en esta solucin Cl2Cn.

2.-

La descalcificacin se realiza con~ amortiguado a un

pH de 7.0 a fin de evitar la descalcificacin cida que
impide la diferenciacin tintorial.

3.-

Deshidratar, incluir y cortar como se hace rutinariamente para otros tejidos blandos.

4.-

Teir con hematoxilina de Mayers 5 a 20 min., lavar y

luego teir con eosina acuosa al 1% (2 a 3 min.).

5.-

Diferenciar con alcohol al 70% (2 a 3 min.). Este paso

es importante ya que la eosina en exceso se extra fci!
mente de la matriz mineralizada pero no de la osteoide.

1
. 1;

'1

1'
.

;.
1'
1

11

TECNICA No. 2
EFECID DE Ia3 AGENrES DESC'ALCIFICANI'ES EN IA OOLORACIQ\1 DE MYCXEACIERIUVI
1lJBER(lJLQ3 1S.

G. Anderson and A.J. Coup (1975).

Con el objeto de estudiar la fonna como influyen los agentes descalcificantes sobre la afinidad tintorial de ~cobacterium tuberculosis se obt~
vieron ndulos linfticos de cobayos previamente inoculados con ~cobac
terium tuberculosis, se fijaron en formol amortiguado y se incluyeron en parafina para utilizarlos como control.
Otros ndulos linfticos que tambin fueron inoculados despus de la fijacin se trataron con las soluciones de Gooding y Stewart's y de Von Eb
ners. EDIA, descalcificador rpido y cido ntrico acuoso. Otros blo
ques se amortiguaron en sulfato de sodio 0.5 M. durante toda la noche y
se lavaron en agua corriente durante 6 horas antes de la inclusin en pa
rafina. Se realizaron 3 cortes de material proveniente de cada bloque,
mismos que se tieron con la tcnica de Ziehl-Neelsen para luego ser exa
minados independientemente en el microscopio de luz.
RESULTAIXlS:

Solamente en los cortes provenientes de material descalcificado con descalcificador rpido no se observaron bacilos, sin embargo, con la tincin
de contraste de azul de metilo stos si se observaron con lo que se de -muestra que no se perdi su basofilia.
El cido clorhdrico es un componente del fijador rpido, en este estudio
estaba a una concentracin de 4.06 M debido a que la solucin de Von Ebner
contiene HCl a una concentracin de 0.152 M y se observaron ~cobacterium
en el material tratado con sta, se continu el estudio con diferentes
concentraciones de HCl en el descalcificante rpido durante 4 horas a una
concentracin de 2.5 M o mayor y no se observaron bacilos.

12

Un corte del grupo control se ti6 con carbol-Fuschina caliente decolorada en descalcificador rpido y luego contrastada con azul de metileno y se
encontr6 que los bacilos se tieron lo que demuestra que el descalcificador rpido no altera la naturaleza de los bacilos despus de que stos se
han teido con carbol-fuschina.
CXNCLUSICNES:

El N.Wcobacterium tuberculosis es alterado irreversiblemente por el tratamiento con la soluci6n de HCl 2.5 M o mayor y posterionnente estos no se
observan con Ziehl Neelsen.
Se recomienda que los tejidos de pacientes sospechosos de tuberculosis no
deben ser preparados para el estudio histol6gico con descalcificador rpi
do.

13

'I'ECNI CA No 3
VARIANI'E DE DESCALCIFIC'ACICN DE R<\SSOIATI
A. &IDINI AND ET AL., (1981)

Para demostrar la efectividad de esta tcnica se prepararon 16 biopsias

osteo4Dedulares, el uso de aparatos en procedimientos de descalcifica-cin tiene por objeto preservar la organizacin celular que frecuente-mente se altera cuando se utilizan cidos fuertes corno agentes desmineralizantes, stos impiden tambin una coloracin adecuada de las preparaciones histolgicas de tal fonna que la interpretacin de las mismas
es incierta al encubrirse la apariencia de las lesiones. En el presente trabajo se trataron de reconocer los elementos presentes en la mdula hematopoytica de los tejidos seleccionados.
En el mtodo de descalcificacin propuesto por Bassolati el calcio de -

la matriz sea ser extrado por el efecto del cido pcrico y asctico
que estn presentes en una solucin de Bouin, bajo condiciones de inte!
cmnbio inico, el lquido se hace circular mediante una bamba peristltica.
Este procedimiento da buenos resultados y es adems menos costoso que el de inclusin de la biopsia steo4Dedular en metacrilato.
RESULTAL03:

Despus de haber descalcificado con este aparato las biopsias de tejido

steo4Dedular con tiempos variables entre 24 y 48 horas se observaron resultados comparables. La dificultad de mantener la solucin de Bouin
a una temperatura constante de 38 C se resolvi al sumergir el vaso de
precipitado en uu bao de flotacin una de las caractersticas de part..!_
cular importancia que se debe tener en cuenta es el espesor de la biopsia o material por descalcificar.

14

DESCRIPCICN DEL F.XJ]IIU:

El equipo se compone de dos bases de vidrio A y B, stas estn sobrepue~

tas en el mismo eje, y entre ella comunicadas por dos entubaciones T1 y
T2, sostenidas con soportes metlicos y una base (CB), y unidas por T3
a una bomba de agua para vaco (Fig. # 1), "A" de capacidad de 400 ce, el cual contiene lquido de Bouin dbil (segn la fnuula de Bassolati,
el nivel est indicado en la Fig. #2 introducidos los tejidos seos a
descalcificarse, a travs del tapn de vidrio esmerilado (A1): El vaso A
comunica al exterior por el tubito R por lo tanto el lquido se encuen-tra a presin atmosfrica.
El vaso B con capacidad de 600 ce contiene resina inica Arnberlite 120,
(el nivel est indicado en la figura # 2). Un filtro poroso (F) de ma-terial plstico impide la cada de la resina en A.
FmVIA DE OPERACICN:

1.- El lquido sale de A, donde tenernos presin atmosfrica, a B por el

efecto del vaco producido por la bomba de agua (PA) del tipo Karttel 1935 conectada a la entubacin T3 (Fig. # 3).
2.-

La afluencia en B se verifica inicialmente por los tubos T1 y T2 , colocados a diferentes profundidades en A (Fig. # 3).
3.- A la que el desflujo de A en B hace descender el nivel del lquido
al de abajo del tubo T1 de ste viene aspirado el aire y por lo tanto se restablece la presin atmosfrica en B (Fig. # 4).
4.- Desflujo del lquido de A en B a travs de T2.
5.- Aumento del nivel en A sobre el tubo de T1.
6.- Nueva fonnacin de vaco en B.

15

T3

PA

T1

T1

T2

A1

A1

T1

T1
A

G)

ce

ce

fa
T1

T1

A1

A1

T1

T1
A

(!)

CB

ca

TECNIQ\ No. 4
EFECIO DE VARIOS AGEm'ES DESCALCIFICANrES &ERE IDS PIUI'EIXXLl.JC'AIDS PRE-

SENTES EN CARTILA<D.
E. IPIQLIID, SHIRLEY lA VELLE AND V. PEDRINI (1981).

Para realizar el presente trabajo se utilizaron epfisis femorales de hu

manos recin nacidos sin anormalidades del esqueleto, stas se obtuvie-ron mediante autopsia que se realiz 5 horas despus de la muerte.
Se adquirieron septum nasales de bovinos inmediatamente despus del sa crificio de estos animales. Las epfisis distales se cortaron endos
mitades en planos sagitales a nivel del corte intercondilar, cada una de
las mitades contena metfisis del hueso, placa de crecimiento distal, cartlago epifisiario, y centro secundario de osificacin de la epfisis
distal. Cada muestra pes 2.5 grs. y midi 7 X 18 X 23 mm. aproximada-mente.
El septum nasal se cort en piezas de 5 X 15 X 2 mm. y pes de 2 g. Las
muestras se fijaron durante 46 horas en formaldehido al 10% amortiguado
en fosfatos 0.1 M pH 7.4 y se lavaron durante toda la noche en agua co-rriente. Las soluciones descalcificantes empleadas se describen en la tabla No. 1, todos los agentes qumicos fueron de grado analtico.
Las muestras se envolvieron en gasas y la descalcificacin se realiz a
temperatura ambiente bajo agitacin constante en 250 ml. de solucin, s
tas se cambiaron cada 24 horas.
Se tom una placa radiogrfica de la epfisis distal antes de comenzar
la descalcificacin y posterionnente cada 24 horas una vez iniciado el
proceso hasta completarlo.

16

Las soluciones descalcificantes que estuvieron en contacto con el tejido

seo fueron recolectadas y congeladas a 20 C. Las muestras de cada solucin se dializaron en grandes volmenes de agua destilada durante 48 horas a 4 C para eliminar cidos y sales de calcio.
El contenido de hexuronato de las soluciones dializadas se detennin de
acuerdo con el mtodo de Bitger y Mllrr (1962). Las muestras de tejidos
descalcificados se lavaron durante la noche en agua corriente, se deshidrataron en series crecientes de etanol para luego ser aclaradas en clorofonno y embebidas en parafina.
Cortes de 7 Jkn.
azul de alciano
sencia de MgCl2
Para la tincin

de espesor se tieron con hematoxilina-eosina y 0.14 de

en mnortiguador de acetatos de 0.01 M a pH de 5.8 en pr~
0.2 M para teir compuestos sulfatados selectivamente.nuclear se utiliz hematoxilina de Harris.

RESULTAIX>S:
Ti~o

de descalcificacin: Las epfisis femorales distales tratadas

con cido fnnico al 5% e~taban completamente descalcificadas despus de
3 das mientras que el DECAL, cido ntrico al 5% y cido sufosaliclico
al 6% se realiz la descalcificacin en 4 das. Los especmenes trata-dos con EDIA al 5% estaban completamente descalcificados en 10 das
mientras que la descalcificacin en EOIA neutro al 15% requiri de 28
das.
Resultados Histolgicos: Los cortes teidos con hematoxilina y eosina
no mostraron ninguna diferencia entre los agentes descalcificantes, los
tejidos estaban bien preservados y no se observaron artificios.
Resultados Histoqumicos: Una positividad fuerte y unifonne del azul de
alciano se observ en los cortes de la placa de crecimiento femoral distal descalcificada en cido fnnico al 5%. Se observ una ligera disminucin en la alcianofflia de la zona calcificada de la placa de crecimie~
to descalcificada en EOIA neutral al 15% los cortes de la placa de cree!
miento descalcificada con cido ntrico al 5% y cido sulfosaliclico al
6% tuvieron la misma disminucin moderada de la alcianoflia que fue pa!
ticulannente evidente en la zona de proliferacin.
17

Solamente una muy dbil alcianofflia pennaneci en los cortes de las pla
cas de crecimiento descalcificadas en DECAL o en EDIA al 15%.
La positividad al azul de alciano fue muy uniforme en los cortes del se2
tum nasal de bovinos cuando se trataron con cido fr.mico al 5% o EDrA
neutral al 15%. Tanto el cido sulfosaliclico al 6% y cido ntrico al
5% causaron una ligera dieninucin en la afinidad al azul de alciano en
la matriz extraterritorial mientras que se observ una considerable y uniforrne disminucin en la alcianofilia en los cortes tratados con EDrA
o DECAL al 15%.
Resultados Bioqumicos: La descalcificacin con cido frmico al 5% re-sult en la extraccin de solamente cantidades mnimas de molculas que
contenan hexuronatos de la epfisis distal humana.
El tratamiento con EDrA al 15% extrajo cantidades mayores pero todava aceptables de hexuronatos de la epfisis femoral distal con EDIA al 15%
neutral.
Cuando los tejidos fueLon descalcificados en cido ntrico al 5% o cido
sulfrico al 6% aumentaron los proteoglucanos perdidos. Las cantidades
mayores de hexuronato se extrajeron por DECAL y por EDrA no amortiguado
al 15%.
aNCLUSICNES:

El cido frmico al 5% es el ms rpido y seguro de los agentes descalci

ficantes que se probaron.
Al analizar la relacin que existe entre la determinacin de hexuronatos
solubilizados y la prdida de alcinofilia en los cortes de tejidos des-calcificados se comprueba que el cido frmico produce una prdida mnima de proteoglucanos de las preparaciones.

18

TABlA No. 1
CXl\IJOOSICICN Y pH DE LAS SOLU::ICNES DESCALCIFIC'ANI'ES.

SOLU::ICN

Acido fnnico
EDTA Neutral *
Acido ntrico
Acido sulfosaliclico
EDTA (Buffer) *
DECAL

*
**

**

pH

5 %
15 %
5 %
%
15 %
6

2.0
7.0
1.4
1.0
10.8
0.4

Sal tetrasodium de cido ethilenediruninotetractico.

omega Chemical Corporation, Cold Spring, NY. Su composicin es:
Acido hidroclrico, max. 9.5% por peso en agua; agente chela-ting in de calcio cataltico.

TABLA No. 2
GLUOOSAMJN)]LUCAN)S EXTRAIID IUR SOLOCICNES DESC'ALCIFICANI'ES.

SOLUCICN

Acido frmico
EIJ:rA neutral
Acido ntrico
Ac.sulfocaliclico
EIJ:rA

DECAL

EPIFASIS DISTAL
FBVDRAL HUVIANA *

5%
15%
5%
6%
15%

0.036
0.732
1.230
1.970
6.101
7.160

SEPnM NASAL
OOVIID

3.600
4.962
10.174
14.461

Los valores expresados equivalen a miligramos de hexuronato po~

gramo de tejido hmedo, obtenidos de dos especmenes comparados
debido a la presencia de hueso y cartlago calcificado en la epfisis distal femoral humana.

DISCUSION
Este captulo nos indica que en huesos fijados con cloruro cianrico la
matriz osteoide se dife~encia claramente de la matriz mineralizada por su
eosinofilia intensa, este aumento en la matriz osteoide parece ser debido
a la reaccin del componente colgeno no mineralizado con el cloruro cian
rico durante la fijacin.
No deben usarse agentes descalcificantes que contengan cidos fuertes, en
la preparacin de tejidos de pacientes sospechosos de tuberculosis, en los
cuales se trate de diagnosticar dicha enfennedad.
Las modificaciones realizadas por A. Badini y colaboradores al descalcificador de Bassolati son aceptables ya que se redujeron los costos con resul
tados semejantes a la tcnica original.

En los proteoglucanos, las cadenas glucosaminoglucan estn covalentemente

unidas al ncleo de protenas, portadoras de un gran nmero de cargas nega
tivas que se unen fuertemente al colorante catinico Azul de Alciano, ste
comunmente se usa para la demostracin histoqumica de estas molculas,
por lo tanto dicho tinte es el indicado para la identificacin de los proteoglucanos.

19

BIBLIOGRAFIA
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22

CAPITULO

11

1 N T R O D U C C 1 O N:

La necrosis del hueso es una importante entidad clnica que se presenta en

muchas situaciones patolgicas. Un osteocito muerto parece ser sinnimo de un hueso muerto, de lo que puede deducirse que la exruninacin histolgi
ca del material de biopsia podra ser definitiva.
La actividad del lactato dishidrogenasa (LDH) ha sido cuantificada post- rnortem para delinear un miocardio normal y diferenciarlo de un necrtico despus de un infarto al miocardio. Este captulo describe una tcnica p~
ra la demostracin de la viabilidad de osteocitos por medio de la identifi
cacin histoqumica de la actividad del LDH en cortes frescos de huesos y
descalcificados.
Los efectos de la descalcificacin en la inmunoactividad de tejidos fija-dos con fonmalina han recibido poca atencin aunque los componentes fijati
vos contienen cido actico parecen ser efectivos en preservar antgenos de tejidos en fonma detectable sin tratruniento de enzimas, mencionrunos un
estudio para detenminar la influencia del cido fnnico y el cido actico
dos agentes descalcificantes usados comnmente, sobre la inmunoreactividad
de tejidos incluidos en parafina y previrunente fijados en fonmalina.

23

TE<NICA No. 5

ESTUDIO DE IA VIABILIDAD DEL HUESO MEDIANI'E IA DIITERVIINAeiCN HIS'!OJ]IMICA

DE IA ACTIVIDAD DE DESHIIHXlENASA LACI'ICA EN CDIUES FRESa>s DE OS'I'EXX:I'IOS
DE HUESO HUVJAN) CAICIFIC'Alll3 Y DESCAICIFIC'Alll3.
STANLEY AND ET AL

(1982)

Se utilizaron cabezas femorales de pacientes con artritis sea en la cade

ra, los huesos se mantuvieron en solucin salina fisiolgica a 4 e hasta
el momento de ser aserrados, el proceso dur 3 das y no se observ una prdida aparente de la actividad enzimtica. Se estudiaron cortes y mat~
rial molido, as corno fragmentos trabeculares.
a) Cortes aserrados y molidos.
Con un microrebanador se obtuvieron cortes verticales de las cabezas femo
rales de 200jtn. de espesor utilizando para esto una navaja de dirunante y
una velocidad de 150 rpm. Algunos cortes se molieron a 75J'n en un plato
moledor de vidrio. Para otros estudios adicionales se obtuvieron elementos de la mdula sea mediante un limpiador a presin con solucin salina.
b) Fragmentos trabeculares.
Del hueso sobrante de la cabeza femoral se cortaron fragmentos de 2-4 mm.
de espesor, se molieron a 50Jirn . los cortes molidos se descalcificarqnmediante inmersin en EDIA frio al 10% durante la noche disuelto en amortiguador frio 0.1 M pH 7.0.
OOIDRACICN:

Se utiliz la reaccin de reduccin de Tetrazolio-fonmazan para la demostracin de la actividad de deshidrogenasa, los mejores resultados se obt~
vieron con azul nitro-tetrazolium. El pH se ajust a 7.2 con hidrxidode sodio 0.1 mol/l. Las muestras de hueso se incubaron en un medio recin
preparado a 37 e por 4 horas, posterionnente se fijaron mediante inmer-sin en formol al 10% amortiguado en solucin salina por 10 min. y se de~
hidrataron en series crecientes de etanol para finalmente montarse en un
medio a base de etileno.

24

Variaciones de la tcnica:
1.- Uso de cortes calcificados (se omiti la etapa de descalcificacin).
2.- Sustratos:
Sodio-l. Malato para malato deshidrogenasa Succinato de sodio - deshi
drogenasa succinica.
Isocitrato trisdico - Isocitrato deshidrogenasa.
Estos fueron substituidos por lactato de litio.
Se usaron partes de los 4 sustratos en todas sus posibles combinaciones para detenminar la importancia de la actividad de una sola enzima
sobre el desarrollo de olor en la reaccin.
3.- Se emplearon sales de tetrazolium a diferentes concentraciones.
4.- Perodo de incubacin, adems del estandar de 4 h. se usaron otros
perodos de 1/2, 1, 2, 8 y 16 horas.
5.- Adicin de rnetasulfato de fenazina para facilitar el transporte de
electrones entre NADH y sales de tetrazolium.
6.- Prefijacin con acetona. Mediante inmersin durante 20 min. a 3 Can
tes de la tincin, de esta fonma se evita que se produzca una falsacoloracin al reconocer las grasas que reaccionan con fonmazan.
7.- Se us polivinilpirrolidona (79) ya que debido a su alto peso molecular (11000) reduce la difusin de enzimas y productos de reaccin.
8.- Dirnetilsulfoxido - acta aumentando la penmeabilidad celular a nivel
de membrana plasmtica y de organelos.
9.- Sustitucin del amortiguador frio en lugar del amortiguador de fosfatos.
Validacin:
Los cort~s se incubaron:
1.- ~spus del calentruniento (80C por una hora).
2.- En medio sin sustrato.
3.- Enrnedio sinNAD.
RESUL'TA.ln):

Cortes serrados:
El citoplasma de casi todos los osteocitos se ti
un color azul brillante.

25

de

Los canalculos en los osteocitos se tieron ligeramente, la mdula sease ti intensamente las lagunas seas solamente se pudieron observar en contraste de fases. La remocin de la mdula sea facilit el estudio de
los cortes, cuando se tieron restos celulares de color azul se oscureci
la superficie trabecular.
Fragmentos trabeculares.
Se logr una apariencia semejante a la de cortes serrados. Los osteocitos
se mantuvieron intactos. En el material calcificado se tieron solamente
los osteocitos localizados dentro de los 15JNn. de la superficie del corte.
Cuando se agreg metosulfonato de finazina al corte calcificado se tieron
los canalculos de los osteocitos, la adicin de esta substancia a mate
rial descalcificado produjo artificios de coloracin en osteocitos.
Los mejores resultados en tnninos de intensidad de la coloracin se consi
guieron con el uso de cloruro de ditetrazolio como colorante reactivo y lactato como sustrato que dio la coloracin ms intensa. Cuando se modifi
c la concentracin de substrato o sales de tetrazolio o se usaron sustratos combinados no se mejor la intensidad de la coloracin.
El cloruro de ditetrazolio confiri un color bastante fuerte, sin embargo
este fue negro por lo que no result adecuado, cuando se utiliz cloruro de tetrazolio fue necesario incluir sales de cobalto para quitar el formazan y evitar su difusin desde el sitio de la reaccin y adems se produjo
tincin artificial de lpidos con este reactivo.
El citoplasma de los osteocitos se ti en cortes descalcificados despus
de 30 min. de incubacin y la intensidad mxima se logr a las 4 horas el
tiempo tuvo que prolongarse hasta 10 horas con material calcificado, no hu
bo alteraciones significativas con la introduccin del resto de las variables.

26

aNCLUSIOOES:
La mayora de los osteocitos que se estudiaron fueron viables.
2.- Debe usarse tejido fresco para poder evidenciar la reaccin ya que el
fonnaldehido suprime las enzimas respiratorias.
3.- No es indispensable que se realice la descalcificacin, slo se requi~

1.-

4.-

re ms tiempo con el material calcificado.

La tcnica es sencilla y til para el diagnstico de patologas donde
est afectado el metabolismo seo mediante biopsia.

TECNI C'A No. 6

INFLUENCIA DE lA DESCALCIFIC'ACICN S03RE lA TINCICN IN.VllNEIS1UJJIMIC'A DE
TEJIOO FIJAOO EN FO!M\LINA E INCLUIOO EN PARAFINA.

J.B.

~TTHEWS

(1982).

Con frecuencia sucede que se tienen tejidos fijados y procesados sin haber
previrunente establecido la necesidad de realizar pruebas de tipo inmunohi~
toqumico, actualmente se sabe que la formalina y los procedimientos habituales de preparacin del tejido pueden encubrir la inmunoreactividad de una amplia variedad de antgenos por haber sucedido digestin del material
por proteasas antes de la inrnunotincin.
Algunos especmenes que poseen componentes duros deben descalcificarse con
soluciones diluidas de cidos orgnicos o minerales, los efectos de la de~
calcificacin sobre la inmunoreactividad de tejidos fijados con formalina
han sido poco estudiados, al parecer el cido actico parece ser til para
preservar antgenos tisulares sin tratruniento enzimtico.
En el presente trabajo se estudi la influencia del cido fnnico y acti-

co, (dos substancias comnmente empleadas corno agentes descalcificantes) sobre la inmunoreactividad de tejidos incluidos en parafina y fijados enformalina.

27

MATERIAL Y lVJE'IUX)S:

Se obtuvieron cortes de 2 a 3 mm. de espesor de runigdala palatina, se fij~

ron en forrnalina neutra runortiguada por 18 horas a temperatura ambiente, luego los tejidos se sometieron indistintamente a:
- Deshidratacin con etanol (8 horas) y xileno (8 horas) para luego ser incluidos en Ralwax (3 horas).
- Descalcificacin con cido fnmico acuoso al 10% (6-120 horas).
- Descalcificacin con cido actico acuoso al 10% (6-120 horas).
- O bien en soluciones descalcificantes de adquisicin comercial.
DECAL (18 y 42 horas).
Cal-Ex (18 y 42 horas) a temperatura ambiente con agitacin suave. Des
pus del lavado en a~a corriente por 6 horas los especmenes tratados se
incluyeron en parafina Ralwax.
Se obtuvieron cortes de 3Jkn. de espesor, stos fueron secados y desparaf!
nizados con xileno (3 x 3JRn.) y rehidratados en series decrecientes de
etanol antes de la inmunotincin, se mantuvieron en runortiguador Trishill
0.05 M con solucin s~lina a un pH de 7.6, este se utiliz para la tripsinizacin y dilucin de reactivos.
Se practic el mtodo de complejo anticuerpos no marcados peroxidasa-antiperoxidasa con tejidos intactos y tiempos para cada rrruestra: de antisuero,
fueron las siguientes.
IgG, IgA y IgM antihumana de conejo (111000).
Lisozima antihumana (1/400) lh.
Ig. anticonejo de cerdo (1/50) 30 mm.
Complejo peroxidasa-antiperoxidasa (1/50) 30 min.
Ocasionalmente se utiliz Diruninobencida para aumentar la intensidad de la
coloracin en el ltimo.

28

Los controles se fonnaron. por la omisin de los estratos primarios y sec~

darios, reemplazo de antisuero primario por suero nonnal de conejo y en al
gunos casos inhibicin especfica de IgG, IgA, IgMmediante preincubacin
del antisuero proteico antihumano con antgeno purificado. Para la identi
ficacin subjetiva de clulas positivas en folculos y reas extrafolicula
res adems de la preservacin de estructuras histolgicas se encubri la identidad del material.
RESULTAIOS:

El tejido tratado con cido fnnico revel un aumento variable en el nmero de clulas positivas cuando se ti sin previa tripsinizacin. Solarnen
te despus de la tripsinizacin se obtuvieron resultados adecuados en tejl
dos que no se trataron con cidos.
El material tratado con cido fnnico requiri perodos ms cortos de tri~
sinizacin (digestin) para lograr la inmunoreactividad mxima con preservacin de la citoarquitectura.
Todos los tejidos despus de una digestin adecuada presentaron resultados
semejantes en cuanto a:
Nmero de clulas positivas
Intensidad de la coloracin.
Deteccin de antgenos extracelulares.
Tincin de fondo de colgena y reticulina.
Y en caso de IgM la tincin aparente de la superficie celular de los linfo
citos fonnadores del "capping" de cada folculo 1infoide.
Cuando se utiliz diruninobencidina se consigui aumentar la intensidad de
la coloracin sin que aumentara la cantidad de clulas positivas.
El cido actico produjo esencialmente cambios semejantes en la inmunorea~
tividad del tejido, con una menor susceptibilidad a la digestin con tripsina.

29

Los cortes que no se trataron con tripsina y que se descalcificaron con las
soluciones comerciales se tieron pobremente. Sin embargo la inmunoreactividad pudra desarrollarse de manera similar a la que se consigui con el cido fnnico, la desventaja de estos agentes fue la ausencia de tincin azul nuclear con hematoxilina de Mayer.
a:NCLUSIOOES:

La descalcificacin de tejidos con soluciones acuosas al 10% de cido acti

co y fnnico durante perodos de 5 das despus de la fijacin en fonnalina
amortiguada no altera la inmunoreactividad.
DISUJSICN:

los diferentes estudios presentados se mostr la realizacin de pruebas

histoqumicas para el establecimiento de diagnstico tal como la viabilidad
de osteocitos en rebanadas de hueso fresco, as como trabajos encmninados a
conocer los mtodos de fijacin y descalcificacin ms adecuados para poder
realizar inmunohistoqumica, entre las substancias que demostraron su util!
dad se identific al cido actico y fnnico, estos pueden actuar en combinacin con la fonnolina como agentes que preservan la actividad enzirntica
tisular.
En

30

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32

CAP 1 TUL O

111

INTRODUCCION
Con el objeto de aumentar la capacidad de resolucin de los estudios estructurales que se realizan en material seo y cartilaginoso se recurre al uso de equipo sofisticado tal corno el microscopio electrnico de trasmisin y b~
rrido, as como espectrofotometro de difraccin de rayos X, el microscopio
electrnico de barrido pennite precisar la ubicacin y arreglo tridimensio-nal de los depsitos de Fosfato de Calcio de tal manera que se puede obtener
mejor informacin sobre la ocurrencia de fenmenos fisiolgicos, sto se
aplica principalmente para estructuras que sufren modificaciones importantes
en relacin con la edad de los dientes, entre los materiales presentes en stos, de mayor interres se e~cuentra la dentina, glucoproteinas, proteoglucoanos, para su estudio se requiere de procedimientos especiales de fijacin
y tratruniento de las muestras que proporcionan en los tejidos caractersti-cas adecuadas para este tipo de estudios y su inclusin en resinas, condicin
necesaria para lograr cortes de 50-60J*n. de espesor en los cuales es posi-ble establecer las relaciones que guardan los componentes tisulares entre s,
por lo anterior descrito se deben considerar condiciones especiales para el
uso de agentes descalcificantes, lo cual es motivo de este captulo.

33

'IECNI CA No. 7
FENlVJEOO DE PRECIPITACICN (JJE SE ORIGINA DURANTE IA PREPARACICN DE OORI'ES
DES\11NERALIZAOOS.
Ta)

EXAMEN <IN MICOOSa>PIA ELECIB:NICA DE BARRIOO DE DEIOSI--

SECUNDARIOS DE FOSFA10 DE CALCIO.

R.S. IEARIWAL ANO ET AL (1976).

Se ha establecido que durante la desmineralizacin de dientes con cido frmico al 10% se produce la precipitacin de fosfato de calcio secundario.
El exrunen de estos depsitos en la dentina revel que la precipitacin se
presenta en el lmen de los tubuls dentinales, lo anterior no se poda de-mostrar a pesar del uso de tcnicas de difraccin de rayos X y microradiogr~
fas razn por la cual se recurri al uso de microscopia electrnica de ba-rrido lo cual fue el motivo del presente trabajo.
JVlt\.'IERIALES Y

lVJIIT(]l)S :

Se exruninaron en un microscopio electrnico de barrido cortes de 200J*n. de

espesor obtenidos a partir de dientes que fueron incompletamente desmineral!
zados en cido frmico al 10%, stos revelaron una endo-opacidad dentina! s~.
mejante a una pluma, se encontraron fracturados en una direccin estrictamen
te paralela a la que siguen los tubos dentinales. Uno de los fragmentos se
mont en una rejilla de orificios amplios, mediante evaporacin se cubri con paladio y oro y se exrunin en un microscopio electrnico de transmisin
antes y despus del grabado por 2 h. con un haz de 40~. con iones de argon
con un promedio de energa de 4 kev.
Se obtuvieron patrones comparativos de difraccin de rayos X reas seleccionadas cercanas al eje de la fractura empleando para sto un segundo fragmento complementario.

34

RESULTAOOS:

Se resumen en la tabla No. 3 en esta se correlacionan los hallazgos obte nidos con los tres tipos de diferentes tcnicas y en la Fig. No. 5 se presenta un diagrruna de las diferentes regiones observadas en la microradio--

..

\1

grafa.

'.

~ i

35

TABIA No. 3: SUVlt\RIO DE IA MICOORADIOORAFIA, EXAMINAOO EN EL MICIDS(X)PIO

ELEC!RNI(X) EXPLrnA1XJR Y RAYOS X. RESULTAOOS DE DIFRAOCICN A ID LARffi DE
IA FRACil.JRA, a:JRrAOO DE SEOCICNES DE DIENTES.

REGleN DEL

DIENTE

MICOORADIO
GRAFIA.

EXAMEN EN EL MICIDS
OOPIO ELECIRNIOO.

DIFRAOCICN DE RAYOS
X.

Pared pulpal

Radiopaco

Esferolitis en tubu
los pulpares vacos.

Hidroxiapatita
Brushita.

Circumpulpal

Radiopaco

Tubulos vacos

Hidroxiapatita

Pluma

Radiopaco

Tubulos llenos con

material resistente
al grabado con agua
fuerte.

Brushita. Mbnenita
y algo de Hidroxi~
pati ta.

Externa

Relativamen
te radio lu
cido.

Tubulos vacos.

Hidroxiapatita.

Se exruninaron las siguientes reas en las micrografas: superficie pulpal,

regin circumpulpar. regin con aspecto de pluma. regin externa y superficie de la raz.

36

FIGURA No. 5:

DIAGRM'JA DE lAS DIFERENTES REGIOOES EXM1INAil!\S EN EL MICOOSOOPIO ELECIIDNIOO.

SUPERFICIE
RAI Z SUPERFICIAL

PULPAL

REGleN

REGleN

REGleN

CIRO.M

PLUVJA.

EXTERNA.

PULPAL.

Sobre la superficie pulpal de la dentina en los cortes del fragmento se

encontraron depsitos de cristales esferolticos y parcialmente esferolticos, la dimensin ms pequea de estos cristales fue generalmente mucho mayor que el dimetro de los tubulos dentinales. Los tubulos en
la regin de la dentina circumpulpar estaban notablemente vacios, debido a que en esta regin de la dentina la microradiografa estaba radioopaca y el patrn dominante de difraccin de Rayos X corresponden al de
hidroxiapatita se concluy que esta capa est compuesta por tejido no mineralizado.

37 -

Dentro de la dentina, en la regin de radiopacidad semejante a una pluma los tbulos estaban frecuentemente llenos con un depsito aparentemente
sin estructura resistente al grabado ionico que tendi a fracturarse en d!
ferentes planos a partir de la matriz circundante. En esta regin en dos
de los dientes el patrn de difraccin de Rayos X indic la presencia de cristales de brunita arregladas en una orientacin casi paralela pero tarnr
bin con una orientacin dispersa, tambin estaba presente hidroxiapatita.

En el otro diente los cristales estaban compuestos de mononita arreglada casi enteramente al azar. En el rea de fractura a travs de la regin de
la pluma se hicieron evidentes tbulos fracturados tanto transversal como
longitudinalmente en el mismo campo. En la regin ms externa por debajo
de los depsitos en forma de pluma los tbulos estaban vacos, microradiogrficrunente la dentina estaba relativamente radiolucida pero todava contena algunos residuos minerales que estaban distribuidos irregularmente.
Principalmente en la dentina
neales en la racio opacidad,
mental, mientras que la raz
dio-opacidad aumentada en la
nal, sta se identific como

coronal se hicieron evidentes variaciones liparalelas a las lneas de crecimiento incre-estaba presente con frecuencia una capa de r~
dentina externa junto a la unin cementodenti
hidroxiapatita.

<XNCLUSICNES:
Se comprob la presencia de depsitos minerales dentro de los tbulos dentinales y estos eran compuestos de cristales de Fosfato de Calcio secundario. Debido a que no se encontr continuidad estructural entre los deps!
tos esferolticos pulpares y los tbulos dentales es posible afiftnar que los contenidos tubulares tienen una tendencia a favorecer la formacin de
depsitos intraluminares.
El material mineral presente en la dentina es un componente resistente
cido.

38

al

TECNIQ\ No. 8

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GIU>S DE UL'IRAESTROCilJRA.
SILVA AND ET AL (1977).

Se utilizaron 20 cocleas de caballos adultos de rumbos sexos despus de la

decapitacin, la extirpacin se realiz mediante incisin de la piel conexposicin de la bulla timpnica y despus de la ruptura de sta.
El procedimiento de decapitacin con guillotina facilit el estudio ya que
las piezas se encontraban desangradas, en promedio tres minutos despus de
haber sacrificado al animal el material estaba listo para su procesamiento
histolgico.
Para el estudio inicial con microscopia de luz mediante inclusin del mate
. rial en parafina las cocleas se lavaron con solucin salina fisiolgica al
5%, se fijaron con Ebuin durante 12 horas y en seguida se sometieron al
proceso de descalcificacin, despus de sto las cocleas se sumergieron en
alcohol al 20% por un da y luego se deshidrataron en series crecientes de
etanol hasta la inclusin en parafina. Se obtuvieron cortes de 7 J*n que
luego se tieron con feulgen, hematoxilina-eosina, fulgen y galocianina.
Para realizar estudios con microscopia electrnica se fij el material con
glutaraldehido al 2% runortiguado en fosfatos 0.02 M pH 7.2 Debido a quelas cocleas no pueden procesarse enteras por su tamao, se seleccion la regin del modiolo o ganglio espiral de Cbrti. Este se obtuvo despus de
retirar el envoltorio externo de la coclea y de separar la primera, segunda y tercera de las capas y dejar el modiolo con tres espirales.
Despus de la fijacin por 2 horas e glutaraldehido a temperatura rumbiente el proceso continu con la posfijacin en tfHrro.c.ido de osmio al 1% amor
tiguado en fosfatos con la adicin de 126 mg/ml. de sacarosa, una vez terminada esta posfijacin el material se lav en solucin glucosada para lue
go practicar la descalcificacin.
39

Las fuerzas osmticas de las soluciones que se utilizaron fue la siguiente:

Solucin salina glucosada 333 Nbsm/1
Glutaraldehido 358 Nbsm/1
Uranil 312 Nbsm/1
Solucin de cido tricloractico 175 Nbsm/1
Despus de la descalcificacin el procedimiento de preparacin del material
para microscopia electrnica consisti en lavar las cocleas en solucin salina al 9% con la adicin de sacarosa, stas se contrastaron con solucin acuosa de acetato de uranilo al 0.5% con 126 mg. de sacarosa/mi. de solu -cin. La deshidratacin se realiz mediante el paso a travs de series ere
cientes de etanol y xido de propileno para luego incluir el material en
Araldita. El material fue estudiado tanto a nivel de microscopia de luz co
mo microscopia electrnica y en el primer caso el modiolo se orient paral~
lo al plano de corte con la coclea completa, para ultraestructura se incluy por separado el modiolo.
La descalcificacin se realiz durante 2, 3, 24, 48 y 72 horas utilizando para sto un descalcificador electroltico, se modific la tcnica inicial
(Goncalvez y Cols) al utilizar un agitador magntico que permite el movi
miento constante de las soluciones sin tener que reemplazarlas, con esto se
evita tambin la saturacin del medio por el material removido de las pie-zas.
Se us un voltaje de 25 V. y 50 mA con solucin de cido tricoroactico 0.1
M y un volumen proporcional al peso de la pieza con relacin 3:1.
RESULTALOS:

Con los diferentes tiempos empleados se obtuvieron grandes variaciones en

el proceso de descalcificacin, sto se hizo notable al verificar la resistencia del material seo. Desde las dos horas ya era posible procesar las
piezas para estudio a nivel de microscopia de luz, para microscopia electr~
nica se obtuvieron los mayores resultados despus de 4 horas de descalcificacin.

40

No se produjeron variaciones en la composicin de la solucin descalcifica

dora, tampoco se observaron agitaciones bruscas.
Los estudios se realizaron a temperatura ambiente entre 21 y 27 C.

En las micrografas electrnicas se observaron algunas mitocondrias edematizadas probablemente debido al contacto previo con medio hipotnico duran
te el proceso.
<INCLUS leNES:

Con la metodologa utilizada fue posible el estudio de cocleas bajo condiciones ptimas de preservacin estructural ya que se consigui reducir el
tiempo de descalcificacin y por lo tanto la produccin de artificios.
El uso del descalcificador electroltico no requiri de aparatos complicados.
Para esto el efecto osmtico observado se debe ajustar la solucin descalcificadora a 330 Mbsm/1 para esto se agregan 2.75 de glucosa/l.
El mtodo aqu utilizado puede aplicarse a otras estructuras del sistemanervioso que poseen reas de calcificacin, principalmente para valorar
efectos de frmacos desde un punto de vista estructural.

41

110-V

ELECilOX>S
DE GARVAO

0-100
0-llOV

mA
Ka

.
varia

FIG. No. 6 Esquema del montado del descalcificador con resistencia colo
cada en serie para voltaje de 25 V cuando la corriente era de 50 mA usando dos electrodos de garvao en solucin.

RECIPIENTE

DESCALCIFICAOOR

RECIPimr.E DE
VOLUVIEN

IMAN
ID.rAOOR

MAGNEI'IO)

~~Ov.

FIG. No. 7 MOntaje del recipiente de volumen, acoplado con el recipiente

descalci ficador por medio de 2 tubos de Gorracha, teniendo el recipiente
de volumen un agitador magntico en su interior que pennite debido a lacirculacin de agua que fueron hechos, cruribiar el volumen al recipiente descalcificador cada 5 minutos de acuerdo con el sentido indicado por las
flechas, no siendo necesario mudar de recipiente la solucin descalcifica
dora no interrupiendo el proceso.

42

TECNICA No. 9

IOS lVJIIT(]X)S DE DESVIINERALI ZACICN Y SUS EFECTOS EN IA PRESERVACICN DE GLUCDPIDTEINAS Y POOl'EX:GLtJCANlS EN IA DFNI'INA INrERCANALiaJLAR Y PERICANALIUJLAR
EN EL CABALID.
M. CDLDBERG. AND Rr AL (1980).

Con el uso de soluciones cidas corno el EOEA se consigue desmineralizar tejidos calcificados con un grado aceptable de preservacin estructural en el
material cortado y exmninado, aparecen trunbin componentes matriciales corno
la colgena, sin embargo desaparecen las glucoproteinas casi en su totali-dad, al igual que los proteoglucanos lo que imposibilita el estudio histo qumico de estas substancias. La asociacin simultnea del fijado , la solucin desmineralizante y los colorantes catinicos aumenta la retencin de
los compuestos sealados aunque no completmnente.
Por lo anterior se han propuesto recientemente dos mtodos de desmineraliza
cin que penniten una mayor preservacin del material orgnico labil. Es-tos se basan en el uso de material de inclusin (resinas Epon 812) antes de
la desmineralizacin del material con cido fnnico, EOEA y sal de alquilaroonio.
Se emplearon dientes en los cuales regulannente se observan dos tipos de
dentinas: Intercanalicular y Pericanalicular, esta ltima desaparece regu-lannente despus del proceso de desmineralizacin, bajo condiciones de preparacin rutinaria se observ en esta regin una rmna orgnica de aparien-cia labil, por esta razn este tipo de tejido penniti evaluar la efectividad de los mtodos de descalcificacin, rootivo del presente trabajo.

42

J.Vl.\TERIAL Y ME'RID:

De cadveres frescos se obtuvieron 20 molares e incisivos que fueron cortados con discos de dimnante a nivel de la corona y fracturados con pinzas, los fragmentos se deshidrataron en series crecientes de etanol y se evapor~
ron con una capa de oro-paladio de 300X de espesor, se hicieron las observa
ciones en un microscopio electrnico Jeol a 20 Kv.
Se observaron otras muestras de 2 a 3)*n. de espesor que se fijaron en una
solucin de glutaraldehido fonnaldehido amortiguada en cacodilato de sodio
0.1 M pH 7.2 y postfijadas en 0204 al 2% durante 30 min. a temperatura am-biente.
Se establecieron tres procedimientos:
Inclusin en resina Epon y cortes sin desmineralizacin.
Inclusin de Epon cpsulas para luego eliminar el exceso de la resina
que cubre el tejido y desmineralizar durante 24 hrs. en una mezcla de
cido frmico al 2% en solucin de Paraformaldehido al 4%.
--Desmineralizacin de cilindros de dentina en una solucin de EDrA y solu
cin etanoltica de sal de alquilamonio e inclusin en Epon.
De cada uno de los grupos se obtuvieron cortes ultra-finos para el anlisis
bajo las siguientes condiciones:
1.- Contraste con acetato de uranilio en solucin alcohlica saturada por 10 min.
2.- Coloracin con azul de alciano al 1% en cido actico al 3%.
3.- Despus de flotar en solucin de agua oxigenada a 10 volmenes durante
20 min. para eliminar el osmio, los cortes se trataron con una mezcla de cido fosfotungstico al 1% en cido crmico al 10%. Estas prepara-ciones trunbin se examinaron en un microscopio electrnico de transmi-sin de la misma marca.

43

RESULTALOS:

En el microscopio electrnico de barrido se hicieron evidentes los anillos

de dentina pericanalicular con un aspecto denso y homogneo que contrasta
con la dentina intercanalicular con apariencia ms fibrosa e irregular.
En la dentina pericanalicular se observaron numerosos canales secundarios
transversos.
Aspecto de la dentina con el microscopio electrnico de transmisin.- En
las preparaciones no desmineralizadas la dentina perinalicular apareci
densa y se observaron sub-unidades globulares de 30prn. La dentina intercanalicular mostr finos cristales en fonna de haces y dispuestos a lo lar
go de las estructuras fibrosas subyacentes, el espesor de estos cristales
vari de 3 a 4 pro. con una longitud superior a 60 J*n (Figura No. 8).
Con la mezcla PIA_CR se contrast una red de fibras de colgena en la dentina intercanalicular as como algunos restos de material orgnico en el lumen de los canalculos. La red parece estar fonnada por material amorfo
repartido de fonna homognea al parecer sin relacin con las fibras de colgena.
Con la tincin de azul de Alciano aparece una red fibrosa con algunos granulos, en la dentina intercanalicular el colorante catinico contrast estructuras granulares de 10 a 20 rrm. de dimetro.
Despus de la desmineralizacin de bloques previamente incluidos las prep~
raciones contrastadas con acetato de uranilo mostraron algunos cristales residuales en la dentina intercanalicular en esta apareci una red densa
bastante homognea a menera de una malla rodeando los espacios de 22 a 33
rrm. de dimetro. (Fig. No. 9).

44

Con el azul de alciano se contrastaron claramente granulos de 12 a 20 mm.

presentes en la dentina intercanalicular y asociados a las fibras de colgeno, se observ una red orgnica bien disimulada en la dentina pericanall
cular, esta estaba fonnada por estructuras fibrosas finas asociadas a granulos y fonnando una malla.
La mezcla PIA-CR contrast en la dentina pericanalicular un material orgnico con distribucin similar a la anteriormente descrita. En la dentina
intercanalicular resaltaron claramente las fibras de colgena. (Fig.No.10).
Despus de la desmineralizacin con una solucin alcohlica de EDrA las zo
nas totalmente desmineralizadas colindaban con otras que todava contenan
material inorgnico, por lo menos en los tiempos en que se realiz el est~
dio a las 24, 48 y 72 hrs. No se observ una transmisin entre los dos es
tados, contrariamente a lo que se observ con el mtodo anterior.
cortes donde se produjo una desmineralizacin completa se observ el m~
terial labil sin alteraciones aunque la preservacin fue de menor calidad
a la que se alcanz con el mtodo anterior.

En

la dentina intercanalicular aparecieron granulos residuales la substancia interfibrosa se observ muy bien contrastada a nivel pericanalicular se apreci una red fina contrastada parcialmente con azul de alciano como
con cido fosfotngstico.

En

CXNCLUS !mES:

1.- Los mtodos empleados en este estudio para mejorar la preservacin de

proteoglucanos y glucoproteinas demostraron ser de utilidad, rumbos se
basaron en la inclusin del material en resinas Epon 8 hrs. antes de
la desmineralizacin.
2.- Al preservar el material orgnico fue posible identificar claramente
el arreglo y la organizacin del material. orgnico y estructuras min~
ralizadas.

- . 45

3.- El uso de solucin de cido fnnico al 2% penniti una adecuada prese!

vacin de elementos lbiles que regulannente se defonnan o desaparecen
por efecto de otros tratrunientos.

46

FIG. # 8: Aspecto de los cristales de la dentina interca

nalicular, agrupados en jeres a lo largo de -las fibras colagenas o dispuestos en pares en

los espacios situados entre fibras.

Prepar~

cin no desmineralizada y no contrastada X

120 000.
FIG. # 9: Al mayor aumento se nota la persistencia de

a~

gunas estructuras de tipo mineral en la dentina intercanalicular (IC). En la dentina

peric~

nalicular (PC) se observa un fino material en-

47

.. tre los espacios vacos de aproximadamente 30 mm.

X 45000.

Acetato de uranio.

FIG. No. 10 Corte de material no desmineralizado, tratado con la mezcla

fosfotngstica crnica (PIA).
La dentina intercanalicular (IC) presenta fibras de colgeno bien contra~
tadas. La luz (Lu) contiene un material amorfo. En la dentina pericanalicular (PC) se observa un material cuyo aspecto de bandas resulta de la
vibracin en el momento del corte. Sin embargo, se nota la densidad de este material ms o menos fibroso y granular. X 9000.
DlsaJSIOO:
En este captulo (#III) en la primer tcnica mencionada se observaron las

diferencias en, trunao de cristal y composicin qumica, se consider para tales un promedio diferencial. Adems, ciertas estructuras parecen ser ms resistentes que otras; en particular esto se nota en la dentina
cerrada a la unin cemento dentina y relacionado a las lneas de incremen
to de la corona del diente.
Mientras tanto, en la segunda tcnica observarnos como Johnson discute la
necesidad de estudios a nivel de microscopa electrnica para certificar
al respecto la delicada morfologa y clasificacin de las arterias "Radia
ta y Sealavestibuli" pues teniendo clulas musculares lisas, regularizan
el flujo sangneo, no slo de "Strias vasculares" como tambin del ligamento espiral.
La tcnica de extraccin del modiolo interno no present alteracin en cuanto a la parte orgnica se refiere la tcnica de Johnson que deja una
base de cartlago sobre la vuelta basal corno soporte del odo interno, du
rante la diseccin.
Despus de la discusin se concluye en que es necesaria esta base de cart
lago para retirar la coclea de caballo.

48

En la ltima tcnica vernos que los dos mtodos ue desmineralizacin propue~

tos, tienden a una mayor preservacin del material lbil, por lo tanto las
tcnicas propuestas mejoran la retencin de la fraccin orgnicadesmineralizndola despus de haber sumergido los bloques en alguna resina (Araldita
o Epon), con la ayuda de una solucin de cido fnnico asociado o no a par~
fonnaldehido 2 y se observa que se puede limitar la propiedad de compuestos
hidrosolubles utilizando una solucin orgnica de EDIA sal de Alquimonio.

49

BIBLIOGRAFIA
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51

est~

CAP 1 TUL O

IV

INTRODUCCION
En la preparacin de material calificado se provocan alteraciones de los

componentes presentes por lo que para obtener trabajos de mayor calidad y

disminuir el porcentaje de error producto de los artificios metodolgicos deben de realizarse tcnicas que faciliten el manejo y preservacin estructural, esto es particularmente difcil cuando se procesan varias muestras simultneamente.
Por otra parte, en el establecimiento de diagnsticos en determinadas patologas que provocan solamente escasas alteracione~ morfolgicas debe defi-nirse con precisin el punto ptimo de descalcificacin en que se encuentra
la muestra para asi evitar el contacto innecesario entre la muestra y el l
quido descalcificante, esto puede conseguirse con el auxilio de exmenes es
pectrofotomtricos y qumicos a los cuales nos referinos en el presente captulo.

52

TECNICA No. 10
KRCENTAJE DE IDITRAOCICN DE CALCIO OORANrE lA DESCALCIFICACICN DE REBANADAS

DE HUEOO CXN EDTA, DliTERVIINACICN CXN ESPECIIDFUIUVlETRIA DE ABSORCICN A1UVIICA.

I.KIVIRANI'A ANO ET AL (1980.

Se sabe que cidos minerales y orgnicos fuertes y dbiles al igual que

amortiguadores cidos con descalcificantes rpidos entre ms fuerte es el cido es ms vigorosa la desmineralizacin, los agentes quelantes corno el
EIJrA provocan una remocin lenta del calcio.
Los desmineralizadores cidos distorsionan las fibras de colgena y dificul
tan la tincin, esto no sucede con el EDTA que parece ser de los mejores
agentes descalcificantes razn por la cual se emplea en trabajos de invest
gacin tanto a nivel de luz corno en ultraestructura.
Por lo anterior el presente trabajo tuvo por objeto registrar la velocidad
de extraccin del calcio en rebanadas de hueso de 300 .)1m a 2 .}'m de espesor
con la ayuda de un espectrofotmetro de absorcin atmica, se probaron dif~
rentes variables corno:
A).B).C).-

Concentracin del agente descalcificante.

Temperatura.
Espesor de las rebanadas.

D) .-

pH.

E).-

Agitacin y volumen de la solucin descalcificante.

MATERIAL Y

lVIDUX)S:

Se emplearon huesos femorales, tibia y humero de conejo Nueva Zelanda de 2

a 3 meses de edad.

53

Se anestesiaron los conejos y se les sacrific por introduccin de 30-50 ml.

de aire en el sistema venoso, se diseccionaron los huesos y se cortaron rebanadas de un microtomo. Los cortes se fijaron en formaldehido al 4% amortiguado en fosfatos 0.1 M durante 48 hrs. o en glutaraldehido al 2% en caco
dilato de sodio 0.1 M pH 7.4 durante 20 a 74 horas los huesos fijados en forrnaldehido pennanecieron de 7 a 14 das antes del corte.
Agentes descalcificantes:
El ROtA se us como sal disdica disuelta en amortiguadores cidos a pH 3.15
estos fueron formato y cido frmico, se us tambin una mezcla de lactato
y cido lctico a pH 3.70
EXPERIMENIO:

Las condiciones experimentales se muestran en la tabla No. 4 los cortes se

colocaron en el medio descalcificador en una rejilla de plstico, los me
dios descalcificadores con~ o los amortiguadores cidos se cambiaron a
las 12 horas, 24 horas, 3, 5 y 7 das el compuesto nuevo "DECAL" se cambia
a los 15, 30 y 60 min. 2, 4 hrs.
Al finalizar el tratamiento los cortes se lavaron en acetona en doo cambios
de 10 min. se secaron a 110 C de temperatura y se disolvieron en 0.5 ml. de H2S04 al 50% luego se agreg gota a gota agua oxigenada al 30% hasta obtener una solucin clara. El calcio presente en el lquido descalcificador,
restos de hueso y los lavados con acetona se determinaron en el espectrofotometro de absorcin atmica, no se encontr calcio en la acetona.
RESULTAJn):

La concentracin de ROtA en el medio desmineralizado se relaciona directa-mente con la velocidad de extraccin del Ca. de los tejidos, la extraccin
es rpida al principio, a las 12 hrs. se determin un 58, 75 y 85% de Ca de
las soluciones al 4.8 y 15% de EDrA la descalcificacin se complet en 5
das con un 4% en 3 das con un 8% y en 2 das con EDrA al 15%.
54

La elevacin de la temperatura aument la velocidad de extraccin y sta

fue de 37 C y 60 e con lo que se removi un 95 y 100% respectivrunente en
24 hrs. en comparacin con la cantidad que se obtuvo a 20 C y 4 C en run-bos casos el Ca estaba carnpletrunente extrado aJ tercer da.
Para la descalcificacin ae cortes gruesos se requiri un tiempo mayor por
el contrario los cortes ms delgados quedaron desprovistos de Ca en 24 hrs.
(300jkn.), los de 0.5 mm en 2 das, 2 das para los de 1 mm y 5 das paralos de 2 mn.
A un pH de 7.4 el promedio de descalcificacin fue ms lento que a pH de5.0
y 8.5, la velocidad de extraccin no mejor; por la agitacin del medio des
calcificador a 20 C trunpoco tuvo un efecto significativo el volumen del me
dio.
La relacin molar entre la cantidad de ~ disdico y Ca en las primeras 12 horas de pennanencia en el medio extractor se presenta en la tabla No.5,
no se consigui aumentar la velocidad de extraccin del Ca con el uso de al
tas concentraciones de ~. el efecto fue semejante al que se observ con
concentraciones habituales.
Los amortiguadores cidos extrajeron Ca ms vigorosamente que el

~.

CINCLUSICNES:

Mediante espectrofotometra de absorcin atmica es posible detenninar la velocidad de descalcificacin de fragmentos de hueso.

55

EJJI'A

TBVIPERATURA

PH

REBANADAS

\OL

GRUESAS

Concentracin
Temperatura
Agitacin b
pH

4, 8, 15%
8%
8%
8%

4 e.
4 e 20 e
37 e,60 e
2oo e
2oo e

500 )Jm

15 ml.

7.4a
7.4a
5.oc7.4

1 mn
1mn

30 ml.
30 ml.

8.5

1 mn

15 ml.

300 )ln
500 p:n
1.2 mn
1 mn

30 ml.

3,15,30
30

1 mn

15 ml.

3.70,
3.90
0.9

1 mn
1 mn

15 ml.
15 mi.

7.4a

Rebanadas gruesas
de hueso

8%

4 e

7.4

Vo 1umen de 1 medio

8%

20 e

7.4

descalcificador
K Formato/Acido
fnnico
Na Lactato/Acido
Lctico
Nuevo Decalc
~LA

20 e

20 e
20 e

5' 15,
50,.
100 ml

No. 4 Esquema general del experimento de desmineralizacin.

a.- La unidad del valor final del pH de cada perodo de tratamiento fue7.7
b.- En un disco giratorio modelo TC-4, New Bunswick Scientific Co. New Brunswi ck NJ. USA
c.- El valor final de pH en cada tratamiento fue 5.3, 7.7 y 8.75 respect!
vamente.

56

~LA

No. 5:

Valor de disociacin EDrA/Ca de la relacin molar durante las

primeras doce horas de descalcificacin.
EDrA/Ca

\OLUVIEN

2.2
4.7
21.8
68.7

5 ml
15 ml
50 ml
100 ml
(8% EDrA)
GOOSOR

300 .)Jm
500 Jlm
1 mn
2 mn
(8% ElJTA \OL. 30 ml)

19.5
19.5
11.9

15.4

TEMPERA'IURA

4 e
20 e
37 e
60 e
(8% EDrA \OL. 30 ml)

11.9
10.0
6.6
6.4

aNCENTRACIOO

5.3
9.0
27.5

4 %
8 %

15 %
(\OL. 15 ml).

57

TECNICA No. 11

EXAMEN ~!Miro PARA DE'l'ERVIINACICN DEL PUNID FINAL DE DESCALCIFICACICN a:N - .

EIJTA.
D.J. SEILLY (1972).

El EDIA se introduj como un agente descalcificante para histopatologa de~

de hace 30 aos, con la disminucin del pH por la adicin de hidrxido de sodio se obtuvieron resultados superiores a los de descalcificantes convencionales, sto evit la hidrlisis tisular, los efectos de este agente se
valoraron mediante rayos X, las pruebas qumicas se basan en la presencia de iones de Ca libres en solucin, existe un procedimiento con el uso de
oxalato de amonio para detenninar el punto final de descalcificacin con EDrA, esta tcnica consiste en la disminucin del pH de la solucin de pru~
ba por debajo de 5.0 con el uso de un amortiguador, bajo estas condiciones
del Ca, al agregar un exceso de oxalato.
El principio de esta tcnica consiste en desplazar al Ca. del complejo por
la adicin de iones frricos presentes en el amortiguador, la turbidad que
resulta por el exceso de oxalato indica la cantidad de Ca presente.
Sol.- No. 1.- EDrA neutral: (0.48 mol/1).
Este agente se prepara con EDrA.(Sol. disdica) o alternativrunente EDrA
(cido). A) EDrA (Sol. disdica 161 g. disueltos en 800 ml. de agua destilada. La solucin se exmnina dentro de un rango estrecho de pH y se ajusta
a pH 7.o 0.5, por la adicin de Hidrxido de sodio. B).- EDrA (cido)
140 g. Hidrxido de Sodio 38 g.
El mtodo de preparacin es el mismo antes mencionado excepto que el hidrxido de sodio es primero disuelto en 800 mi. de agua destilada y el EDrA es
disuelto y aadido.
Puede usarse cualquier concentracin de EDrA con molaridad conocida.

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Sol.- No. 2.- Cloruro Frrico: (0.48 rnol/I).

7.8 g. es disuelto en agua destilada 100 ml.

Cloruro Frrico (Anhidro)

La solucin de Cloruro Frrico acuoso preparado puede ser de la misma molaridad que la de EDrA.
Col.- No. 3.- Control positivo; Cloruro de Ca (0.005 mol/g) en EDrA neutral:
Cloruro de calcio (Anhidro) 0.1 g. es disuelto en la solucin No. 1 en 200
ml.
Sol.- No. 4.- OOCalato de runonio acuoso saturado.
Todas las soluciones (excepto la de oxolato de runonio) deben filtrarse para
la preparacin. Aunque la solucin de cloruro frrico es inestable, debe ser filtrada antes de usarse, esta tiene una vida media de por lo menos 3 meses.
PKXE)IMIENID DEL EXAMEN.
1) Tomar 2 ml. del lquido descalcificante para ser exruninado en un tubo de ensayo.
El pH debe ser de 7.0 0.5, si es necesario ajustar cido clorhdrico
o hidrxido de sodio.
2)

3)

Aadir 2 ml. de solucin de cloruro frrico y mezclarlo.

4) Aadir 6 ml. de oxalato de runonio acuoso saturado, mezclar bien y dejar

en reposo.
5)

Exruninar el tubo despus de 20 min.

Si el punto final de la descalcificacin ha sido alcanzado la solucin volver clara.

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La presencia de alguna turbiedad en la solucin muestra que la descalcific~

cin es incompleta. Los controles positivos y negativos pueden acompaar a
cada serie de exmenes: estos se preparan por sustitucin de 2 ml. de sol~
cin No. 1 y solucin No. 3 para el liquido descalcificante usado precedente en el paso l.
El calcio en la solucin de control positivo ser suficiente para formar
una turbidez o precipitacin detectable.
Estudios experimentales indican lo siguiente:
(A} El examen es confiable para detectar calcio en ~ neutral bajo con-centracin de 0.005 rnol/G (B) La sensibilidad del examen no est afectada
por la concentracin de EDrA usado en la descalcificacin puesto que la solucin de cloruro frrico usada es de igual rnolaridad.
EVALUACICN PRACTICA.

Despus de haber realizado la prueba se puede comprobar la efectividad de la misma mediante el estudio histopatolgico, as miffinD puede establecerse
una correlacin mediante el uso de rayos X.
UNCLUSICN:

La prueba qumica para detenninar el punto final de descalcificacin con oxalato de amonio pennite asegurarse fcilmente que se ha alcanzado el punto final de descalcificacin en diversos tejidos.

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'IECNICA. No. 12
DETER\1INACICN DEL PVNIO FINAL EN IA DESQ\LCIFICA.CION CIN EI1fA USANOO OXAIA'10 DE .AM:NIO.
ALLEN D. OOSEN (1981).

En este experimento se utilizaron muestras de hueso trabecular o cortical los cuales para ser descalcificados deben ser cortados cerca de 1 X 1 X 0.5
am. ordenados y fijados en fonnalina al 10%, runortiguados en fosfato, pH 7.0, por 24 horas. La muestra se coloca en un frasco con 5 ml. de EI1fA al
10%, pH 7.0 con NaOH. Despus de 24 horas 0.5 ml. de solucin de EI1fA descalcificante debe retirarse del frasco para exmninarla y colocarla en un t~
bode ensayo; despus se aade 1.0 ml. de amortiguador fosfato citrato
(0.20 cido ctrico, 0.16 M Fosfato Potsico Dibsico, pH 3.2 - 3.6) y 2.5
mi. de Oxalato de runonio acuoso saturado en el tubo de ensayo.
Si el Ca est presente en el tubo de ensayo, se formar un precipitado bl~
co turbio. (Un exmnen positivo para calcio, un examen negativo para el p~
to final). Una solucin clara despus de 20 .min. indica la ausencia de cal
cio detectable en el liquido descalcificante.
Si el exarneL de la muestra es positivo para Ca, el hueso debe ser lavado
con agua destilada y la solucin en el frasco debe ser reemplazada con sol~
cin de EI1fA fresca. Despus de 24 horas. otros 0.5 mi. del liquido del
frasco deben retirarse y exmninarse como se indica arriba. Este procedimie~
to debe ser repetido diariamente. Si se obtienen un resultado negativo p~
ra Ca, el hueso no debe lavarse y el lquido del frasco no debe ser cmllbiado, este debe ser exmninado al da siguiente. Dos exmenes negativos sucesivos para Ca, son considerados un exarnen positivo para el punto final.
El efecto que ejerce el EI1fA durante el proceso de descalcificacin es me-diante quelacin, es necesario asegurarse de que se ha completado la desea!
cificacin, para esto se ha utilizado el anlisis con rayos X as como por
la detenninacin de la dureza al tacto.

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Una prueba sencilla que pennite definir el punto final de descalcificacin

se realiza con el uso de Oxalato de Amonio, el procedimiento es de valor por su simplicidad y precisin.
CXNCLUSI<N:

El ~xalato de amonio precipita iones de Ca libres en la solucin para as

poder provocar la reaccin.

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TECNICA No. 13:

TECNICA PARA EL M\NEJO DE TEJIIXlS DURAN.I'E IA DESCALCIFICACICN.

OIRISTOPHER JAMES PIRIE AND GLENN FRANCIS VALLINr (1978).

La descalcificacin puede tomar das o semanas de acuerdo a la naturaleza

de la muestra o el lquido usado. Esto implica frecuentes cambios de los
lquidos descalcificantes y la radiografa regular o el examen para dete~
minar el punto final de descalcificacin. cuando se procesa un gran nme
ro de muestras se emplea mucho tiempo en las labores rutinarias y si las
muestras son de una naturaleza similar, el peligro de mala identificacin
aumenta.
Se busc una manera para reducir el tiempo de manejo y asegurar la ident!
ficacin durante la descalcificacin, las muestras se ordenaron y una ca~
ta identifica la etiqueta encerada preparada para cada una. Una venda tu
bular hospitalaria Tubinette trunao 01, anudada en un extremo, y un tubo
de polietileno rgido de 3 cm. de dimetro interno son utilizados en esta
tcnica. La primera muestra, con su etiqueta, es puesta en el vendaje
usando el tubo como alimentador. Aunque bsicamente rgido el tubo pudo
ser comprimido para pennitir el paso de muestras considerablemente gran-des. El tubo fue retirado de la venda y sellado cerca de la muestra con
otro nudo. Otras muestras fueron puestas dentro del vendaje hasta un nmero conveniente (18-20), fonnando un cordn manejable.
La identificacin de la etiqueta, corresponde a un !egistro escrito que fue agregado al cordn. Existe la venda radio-lucida que pennite radio-grafas. 18 MUestras pueden ser manejadas como una con la consecuente se
guridaden el manejo. Como cada muestra es encerrada con su etiqueta, la
confusin de identificacin durante la descalcificacin es nula.
La venda puede ser partida y la muestra pasar a otro proceso. Frecuentemente, cuando las muestras son similares (Ejem. 18 rtulas de conejo), se
descalcifican virtualmente al mismo tiempo.

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Todos los cordones pueden ser procesados, los tejidos solamente se removieron para fijarse. A la venda se le ha encontrado tambin utilidad p~
ra almacenar pequeas muestras que necesitan ser mantenidas en secuencia.

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 DISCUSION

A travs de los diferentes artculos se pudo establecer que el tiempo necesario para la descalcificacin de huesos depende de varios factores como el:
Trunao en el fragmento de tejido, este influye sobre la velocidad de difu-sin de las substancias descalcificantes que al inicio es rpido y poste -riorrnente se vuelve ms lento al final de la desmineralizacin. Estos da-tos fueron confirmados mediante el uso de tcnicas de rayos X y detennina-cin qumica de los niveles de Ca, as corno mediante estudios de alta resolucin como la espectofotametra de absorcin atmica.
Asimismo se demostr que la mayora de las tcnicas que se reportan en este
estudio fueron de utilidad para establecer la velocidad y punto final de
descalcificacin que aseguran la preservacin ms adecuadas de las estructu
ras.
Por otra parte, se comunican procedimientos sencillos que facilitan el roan~
jo simultneo de muestras diferentes que evitan confusiones. Entre las sus
tancias que resultaron ser de mayor utilidad se puede identificar al EDIAque a pesar de que acta lentamente produce los mayores resultados cuando
se le campara con los descalcificadores cidos, entre las variables principales que influyen para modificar la velocidad de descalcificacin est el
espesor del material por lo que se debe trabajar con cortes muy delgados, las otras circunstancias importantes son el pH y la temperatura que revelar los mejores resultados a concentraciones de 7.2 y 4 C respectivamente.

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