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TCNICAS DE ANLISIS DE LEGIONELLA

ANLISIS DE LEGIONELLA.
Fundamentos de la tcnicas analticas y aplicacin
al control rutinario
D. David Toms Forns
Jefe del Laboratorio de Bioensayos
ainia. Centro Tecnolgico

SEMINARIO PREVENCIN Y CONTROL DE LEGIONELLA

PATERNA, 6 ABRIL 2004

David Toms Forns

dtomas@ainia.es

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TCNICAS DE ANLISIS DE LEGIONELLA

CONTENIDO.
Descripcin de la bacteria.
Consideraciones sobre toma de muestra.
Mtodos de anlisis convencionales
Mtodos de anlisis genticos
Tendencias

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DESCRIPCIN DE LA BACTERIA.
Bacilos Gram negativos, 0.5-0.7 m x 2-20 m, aerbios,
mviles, requiere una fuente de aminocidos y hierro.
Resiste un amplio rango de temperaturas, multiplicndose
entre 20-45C. T ptima: 35-37C.
Crecimiento intracelular y habitualmente en sedimentos,
biofilms, materia orgnica.
Familia Legionellaceae, 40 especies, 60 serogrupos. L.
pneumophila sg 1 supone el 72% de infecciones

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ORIGEN:

RESERVORIOS
NATURALES

SISTEMAS
ABASTECIMIENTO
PBLICO

USO DOMSTICO

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SISTEMAS
ABASTECIMIENTO
INDUSTRIAL

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TOMA DE MUESTRA.
Muestrear puntos de riesgo (final recorrido, aguas
estancadas, presencia de materia orgnica)
Especial atencin a los biofilms (frotado de conducciones, uso
de torundas).
Neutralizacin del biocida.
Tomar al menos 2 litros de muestra.
Mantener en refrigeracin (<18C, >6C ISO 11737; 5+-3C
AFNOR T90-431) y transportar al laboratorio en 24 horas (no
ms de 2 das)

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PREPARACIN DE MUESTRA.
Proceder a la concentracin (habitualmente 1 litro) antes de
los 5 das de toma de muestras. (El concentrado puede
mantenerse un mximo de 14 das)
FILTRACIN
CENTRIFUGACIN

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MTODOS CONVENCIONALES DE ANLISIS

(CULTIVO EN PLACA)
ISO 11731:1998 (Detection and Enumeration of Legionella)
AFNOR NF T 90-431:2003 (Recherche et dnombrement de
Legionella et de Legionella pneumophila)
AS/NZ 3896:1998.
CCFR 13.1:1995

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ANLISIS MEDIANTE CULTIVO EN PLACA

FUNDAMENTOS

SIEMBRA DIRECTA

CONCENTRACIN

TRATAMIENTO TRMICO
(50C - 30 minutos)

TRATAMIENTO CIDO
(pH 2,0 - 5 minutos)

SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

(GVPC/BCYE)
CONFIRMACIN
(BCYE/AGAR NUTRITIVO/MICROSCOPA/SEROLOGA)

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ANLISIS MEDIANTE CULTIVO EN PLACA

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ANLISIS MEDIANTE TCNICAS GENTICAS (PCR)

FUNDAMENTOS

CONCENTRACIN

EXTRACCIN ADN
(LISIS TRMICA + TAMPN LISIS)

AMPLIFICACIN GEN DIANA (Iap)

( PCR ANIDADA)

ELECTROFORESIS

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ANLISIS MEDIANTE TCNICAS GENTICAS (PCR)

RESULTADOS

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COMPARACIN TCNICAS
CARACTERSTICA

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CULTIVO EN PLACA

PCR convencional

10 das

<1 da

Cuantitativa

Cualitativa (excp. PCR Real Time)

Estado celular

Viables no cultivables

No viables (excp. ARNm)

Interpretacin

Compleja y subjetiva

Simple y objetiva

Plazo resultados
Deteccin

(pleomorfismos, tinciones,
aglutinacin)

Interferencias

Flora acompaante (mohos)

Biocidas (Inhiben PCR)

25-50 ufc/L

1 ufc/L

Realizacin ensayo

Laborioso

Sencillo (especializado)

Infraestructura lab.

Mnima

Compleja

Lmite deteccin
terico

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INTERPRETACIN RESULTADOS

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La Legislacin indica la NECESIDAD de realizar los anlisis mediante

la Norma ISO11731:1998 y tomar medidas a tres niveles:
Entre 100-1000 ufc/l: revisar programa de muestreo
Entre 1000-10.000 ufc/l: Limpieza y confirmacin
>10.000 ufc/l: Parar instalacin
Incertidumbre tcnica analtica con LC95%(AFNOR T90-431)

No contar < 5 colonias:

Lmite de cuantificacin = 250 ufc/litro

250 ufc/l: recuento variable entre 30-480 ufc/l

1.000 ufc/l: recuento variable entre 550-1.450 ufc/l
25.000 ufc/l: recuento variable entre 3.000-47.000 ufc/l
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TENDENCIAS EN LAS TCNICAS DE CONTROL DE

AGUAS
Inmunoconcentracin
Tcnicas cuantitativas de inmunofluoresencia.
PCR cuantitativa de clulas viables.
Biosensores para monitorizar en linea.

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