3.6.

Metabolic pathway study for L-Lactic acid accumulation and optical purity
To reveal the mechanism of L-lactic acid accumulation and OA variation via temperature control,
Figure 6 illustrated the proposed metabolic pathway of converting fermentative substrate to
isomer lactic acid and VFA. Via the enzymes of protease and -glucosidase, sludge with
carbohydrate was first hydrolyzed to amino acid or monosaccharide and further to pyruvic acid.
L- and D-lactic acid was generated via pyruvic acid, which could be reversely replete via a
chemical equilibrium from both L- and D-lactic acid. Simultaneously, pyruvic acid could be
consumed and transferred to acetic and propionic acid (the majority composition of VFA), the
pathway of which was presumed to compete with the generation of both L- and D-lactic acid. By
metabolism study of temperature on both L- and D-Lactic acid consumption using lactic acidcontaining synthesis fermentative substrate, Table 2 explained that L-lactic acid was much easier
metabolized to VFA compared to D-lactic acid in all temperatures. Therefore, with the extension
of fermentation time, the consumed L-lactic acid was much higher than that of D-lactic acid,
which led to the decrease of OA of L-lactic acid (See Figure 1B). To obtain high OA of L-lactic
acid, the fermentation time should be controlled as short as possible. In Table 2, the lowest
consumption rate of both two isomers was observed at 50 C, and the corresponding enzymes
related to VFA production was relatively inhibited (as thered dotted line in Figure 6). This is in
good consistent with the findings in Figure 1A that L-lactic acid was accumulated and stabilized
even for 4 d. However, the maximal activity of VFA forming enzyme was observed at 37 C,
which was in good agreement with Figure 1 that both L- and D-lactic acid was consumed up in 1
d. Since Figure 5 implied the highest lactic acid producing enzyme was also occurred at
mesophilic condition, it is therefore interesting to employ 50 C to inhibit VFA and D-lactic acid
generation (the red dotted in Figure 6), and implement fermentation at 37 C to enhance both
hydrolysis and L-lactic acid generation (the green line in Figure 6).
3.7. Influence of thermophilic pretreatment time on L-lactic acid production with
high optical purity
Base on the above findings, Table 3 documented the influence of different thermophilic
pretreatment time on the maximal concentration of L-lactic acid and the corresponding OA. The
maximal concentration of L-lactic acid (15.3 1.8 g/L) was observed at 34 h mesophilic
fermentation when pretreated at thermophilic condition for 4 h. Meanwhile, the highest of OA
(98.3%) of L-lactic acid was also achieved at that condition. When thermophilic pretreatment
time was only 2 or 3 h, the maximal L-lactic acid was only 12.8 1.1 and 13.7 1.4 g/L after 32
and 33 h of fermentation. Whats worse, the OA of L-lactic acid decreased to 91.2 and 97.1%. At
that condition, L-lactic acid was not able to stabilize along with fermentation at mesophilic
condition (Figure S3, Supplementary Information), which implied that insufficient pretreatment
time at thermophilic condition failed to inhibit the production of VFA and D-lactic acid.
However, extension of thermophilic pretreatment for 5 and 6 h resulted in a slight decrease of the
maximal plateaus of L-lactic acid 14.5 1.6 and 13.9 1.4 g/L respectively at 53 and 54 h
(detail see Figure S3, Supplementary Information), which indicated that longer thermophilic
pretreatment time weakened the L-lactic acid producing activity. Meanwhile, the kinetic study
(Figure S4, Supplementary information) for linear regression of L-lactic acid accumulation was
studied before reaching the plateaus of L-lactic acid. The accumulation of lactic acid exhibited a
linear increase, and the highest specific efficiency of L-lactic acid accumulation (Sa of 0.6097d-1)
was achieved at thermophilic pretreatment time for 4 h. The decline of Sa at 5 h (0.3558d-1) and
6 h (0.3485d-1) indicated longer pretreatment time inhibited the lactic acid producing activity.

And the slightly decrease of Sa at 2 h (0.5160 d-1) and 3 h (0.5466 d-1) were attributed to the
insufficient suppression of lactic acid consuming. Therefore, to improve the high optical purity
L-lactic acid production from waste activated sludge by supplementary of carbohydrate, the
optimal thermophilic pretreatment time was 4 h and followed by mesophilic fermentation for 34
h.
Kesimpulan
In this study, L-lactic acid dominated from the fermentation of WAS with carbohydrate addition.
Furthermore, mesophilic fermentation sped up both production and consumption of L- and Dlactic acid, while thermophilic fermentation inhibited VFA and D-lactic acid forming enzymes
severely, but time-consuming. Therefore, this study successfully developed a new fermentation
method by two stage temperature control strategy: i.e., thermophilic pretreatment at 50 C
initially for 4 hand subsequently mesophilic fermentation at 37 C for 34 h, an improved
production of L-lactic acid with high OA (98.3%) was finally achieved at 15.3 g/L.
3.6. Analisis jalur metabolisme untuk akumulasi asam L-laktat dan Optical Purity
Mekanisme akumulasi asam L-laktat dan variasi OA melalui kontrol suhu, Gambar 6
diilustrasikan jalur metabolisme yang mengkonversi substrat fermentasi untuk isomer asam
laktat dan VFA. Melalui enzim protease dan -glukosidase, lumpur dan karbohidrat pertama
dihidrolisis asam amino atau monosakarida yang selanjutnya menjadi asam piruvat. L- dan Dasam laktat dihasilkan melalui asam piruvat. Secara bersamaan, asam piruvat dapat dikonsumsi
dan dipindahkan ke asam asetat dan propionat (komposisi mayoritas VFA). Tabel 2 menjelaskan
bahwa asam L-laktat jauh lebih mudah dimetabolisme untuk VFA dibandingkan dengan asam Dlaktat dalam semua suhu. Oleh karena itu, dengan perpanjangan waktu fermentasi, asam L-laktat
yang dikonsumsi jauh lebih tinggi dari asam D-laktat, yang menyebabkan penurunan OA asam
L-laktat (Lihat Gambar 1B). Untuk mendapatkan OA tinggi asam L-laktat, waktu fermentasi
harus dikontrol sesingkat mungkin. Pada Tabel 2, tingkat konsumsi terendah kedua isomer
diamati pada 50 C, dan sesuai enzim yang berperan dengan produksi VFA relatif terhambat
(pada Gambar 6). Hal ini sama dengan hasil pada Gambar 1A bahwa asam L-laktat terakumulasi
dan stabil bahkan untuk waktu hingga 4 hari. Namun, aktivitas maksimal VFA membentuk enzim
diamati pada 37 C, yang dalam hasil pada Gambar 1 bahwa kedua L- dan asam D-laktat
dikonsumsi dalam 1 hari. Pada Gambar 5 menunjukkan hasil tertinggi laktat memproduksi enzim
terjadi pada kondisi mesofilik asam, karena itu baik dilakukan pada suhu 50 C untuk
menghambat VFA dan D-laktat pembentukan asam (titik-titik merah pada Gambar 6), dan
melakukan fermentasi pada suhu 37 C untuk meningkatkan baik hidrolisis dan pembentukan
asam L-laktat (jalur hijau pada Gambar 6).
3.7. Pengaruh waktu pretreatment termofilik pada produksi asam L-laktat dengan
Optical Purity tinggi
Berdasarkan data Tabel 3 hasil menunjukakn pengaruh waktu termofilik pretreatment yang
berbeda pada konsentrasi maksimal asam L-laktat dan sesuai OA. Konsentrasi maksimal asam Llaktat (15,3 1,8 g / L) diamati pada waktu jam ke 34 fermentasi mesofilik saat pra-perawatan
pada kondisi termofilik selama 4 jam. Sementara itu, tertinggi OA (98,3%) dari asam L-laktat
juga dicapai pada kondisi itu. Ketika waktu pretreatment termofilik hanya 2 atau 3 jam, asam Llaktat yang dihasilkan hanya 12,8 1,1 dan 13,7 1,4 g / L setelah 32 dan 33 jam fermentasi,
dan OA asam L-laktat menurun menjadi 91,2 dan 97,1%. Pada kondisi itu, asam L-laktat tidak

mampu menstabilkan bersama dengan fermentasi pada kondisi mesofilik (Gambar S3, Informasi
Tambahan), yang menunjukkan bahwa waktu pretreatment pada kondisi termofilik gagal
menghambat produksi VFA dan D-asam laktat. Namun, perpanjangan pretreatment termofilik
selama 5 dan 6 jam mengakibatkan sedikit penurunan dari hasil maksimal asam L-laktat 14,5
1,6 dan 13,9 1,4 g / L masing-masing di 53 dan 54 jam (rinci lihat Gambar S3, Informasi
Tambahan) , yang menunjukkan bahwa lama waktu pretreatment termofilik melemah aktivitas
asam memproduksi L-laktat. Sementara itu, studi kinetik (Gambar S4, informasi Tambahan)
untuk regresi linear dari akumulasi asam L-laktat dipelajari sebelum mencapai hasil maksimal
asam L-laktat. Akumulasi asam laktat ditunjukkan pada peningkatan linear, dan efisiensi
tertinggi spesifik akumulasi asam L-laktat (Sa dari 0,6097 d-1) dicapai pada waktu
pretreatment termofilik selama 4 jam. Penurunan Sa di 5 h (0,3558 d-1) dan 6 jam (0,3485 d1) menunjukkan waktu pretreatment yang menghambat aktivitas asam laktat. Dan sedikit
menurun dari Sa di 2 h (0,5160 d-1) dan 3 h (0,5466 d-1) yang tidak cukup mengkonsumsi asam
laktat. Oleh karena itu, untuk meningkatkan kemurnian produksi OA tinggi L-asam laktat dari
limbah lumpur aktif dengan tambahan karbohidrat, optimal waktu pretreatment termofilik adalah
4 jam dan diikuti oleh fermentasi mesofilik selama 34 jam.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa asam L-laktat didominasi dari fermentasi WS dengan
penambahan karbohidrat. Selanjutnya, fermentasi mesofilik mempercepat produksi dan
konsumsi L- dan D-asam laktat, sedangkan fermentasi termofilik menghambat enzim VFA dan
D-asam laktat terbentuk, tetapi membutuhkan waktu yang lama. Oleh karena itu, penelitian ini
berhasil mengembangkan metode fermentasi baru dengan dua tahap strategi kontrol suhu: yaitu,
termofilik pretreatment pada suhu 50 C dan fermentasi selanjutnya mesofilik pada suhu 37 C
selama 34 jam, produksi ditingkatkan asam L-laktat dengan tinggi OA (98,3%) akhirnya tercapai
pada 15,3 g / L.