Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Odontología
Lic. Julio Turcios
Bioquímica

Reporte del Laboratorio:

Identificación de Aminoácidos y
Proteínas

Integrantes Carné
Max Alejandro Carrillo200910847
María Fernanda Escobar 200910978
John Stephen Vernon 20092245
Yasmin Susana Orozco 200922263
Mayra Carlota Hernández 200922300

Nueva Guatemala de la Asunción, 26 de Abril de 2010

 Introducción:

Las sustancias química están en todo nuestro entorno, que con el

tiempo se ha aprendido a usarlas a nuestra conveniencia; en el cuerpo
se encuentran una infinidad de moléculas y compuestos bioquímicos,
que ayudan a realizar muchas funciones que nos mantienen vivos.
Sabes que hay una infinidad de posibles combinaciones entre
cualquieras que fueran sus distintos y elementos y dar inimaginables
combinaciones posibles. Lo que más nos interesa a nosotros, como
futuros profesionales de la salud, son las moléculas biológicas, y de
entre ellas los aminoácidos.

Con los avances tecnológicos del mundo se ha podido comprender

mejor que es lo que sucede en nuestro organismo y cuáles son las
sustancias que intervienen durante las vías metabólicas y el
mantenimiento de la homeostasis. En el pasado laboratorio de
bioquímica, se tuvo la oportunidad de poder comprender mejor ciertas
moléculas orgánicas que se encuentran en nuestro cuerpo y alimentos,
estas moléculas son denominadas aminoácidos y proteínas. Durante el
laboratorio se pudo identificar proteínas y aminoácidos, por medio de la
cromatografía en papel, así como con reacciones biuret y de ninhidrina.

A continuación se presenta un informe donde se explica más

ampliamente lo sucedido en dicho laboratorio, los resultados obtenidos,
la explicación para dichos resultados y una guía paso a paso de cómo
se realizo la cromatografía en papel, la reacción biruet y de ninhidrina
ya mencionadas.
 Resumen

Cromatografía en Papel
Instrumentos y materiales: Papel alto en celulosa, Cámara
cromatográfica, Tijeras, Lápiz, Regla, H20, Tubos capilares, Aminoácidos
(Cis, Gln), Secadora, Ninhidrina, Acido Acético (CH3COOH), N-Butanol,
Pipetas (10 y 5 ml), Engrapadora, Beacker.
Procedimiento:
1. Se recubrieron las paredes internas de la cámara cromatográfica
con papel alto en celulosa y se cortó otro pedazo de papel alto en
celulosa, con unas medidas de 16.1x19 cm. A este papel ya
cortado le trazamos los siguientes márgenes:

2. En la estación de sembrado se pusieron 3 gotas de aminoácidos

con los tubos capilares de la siguiente manera, siempre siguiendo
las instrucciones del folleto de laboratorio.

3. Se enrolló el mismo de modo que el sembrado quedó hacia el

exterior.
4. Luego, se colocó la cámara cromatografía en la estación
designada para la fase móvil. Aquí se le agregó, n-butanol y ácido
acético, además se añadió agua, así se hizo la fase móvil.
 5. Se introdujo la parte de la fase estacionaria a la cámara, aquí se
debe dejar por un tiempo mínimo de 30. (Durante este
experimento sólo se dejó por 5 minutos). Luego se procedió a
revelar con ninhidrina.

Identificación de Aminoácidos y Proteínas

Instrumentos y materiales:
10 tubos de ensayo, Reactivo Biuret, Ninhidrina, H20, Gelatina,
Caseína, Albúmina, Solución de Problema 1 y 2, Hidróxido de Sodio al
10% V/V, Papel Parafilm, Pipeta de 1ml, Masking Tape, Beacker,
Gradilla, Estufa, Sartén, Perlas de Ebullición, Tenazas.
-Reacción Biuret:
1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agregó 20 gotas de H20, al No. 2 se
le agregó 20 gotas de gelatina, al No. 3 de caseína, al No. 4 de
albúmina, al No. 5 de solución de problema 1, y al No. 6 solución
de problema 2.
2. A cada uno de los tubos de ensayo se le agregó 1 ml de hidróxido
de sodio al 10% v/v con un gotero, se anotaron los cambios en las
distintas soluciones (ver resultados). Se le agregó el hidróxido de
sodio para volver el pH de las soluciones más alcalino, ya que el
reactivo biuret funciona en pH muy elevados.
3. Se agregó al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 3 gotas de
biuret con un gotero, se cubrió el tubo con papel parafilm y se
agitó vigorosamente de arriba hacia abajo por 1 minuto. Este
procedimiento se hace con todos los tubos. Una vez terminado
con todos los tubos se dejan reposar por 15 en la gradilla.
-Reacción Ninhidrina:
1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agregó 20 gotas de H20, al No. 2 de
gelatina, al No. 3 de caseína y al No. 4 de albúmina.
2. Se agregó al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 5 gotas de
ninhidrina con un gotero, se cubrió el tubo con papel parafilm y se
agitó vigorosamente de arriba hacia abajo por 1 minuto. Este
procedimiento se hace con todos los tubos, una vez terminado
con todos los tubos se colocaron en un beacker.
3. Una vez que todos los tubos estén en el beacker, se colocan baño
maría por 10 minutos.
Resultados
Los resultados obtenidos durante la práctica coinciden con lo
esperado teóricamente, tanto para la cromatografía en papel como para
la identificación de proteínas. Además, se da una explicación coherente
sobre por qué suceden o no las tinciones respectivas durante en análisis
de proteínas, así como el porqué del uso de los distintos materiales en
la cromatografía (ver resultados y discusión de resultados).

Resultados:

Identificación de Proteínas:
Durante la identificación de proteínas con la reacción de
ninhidrina y la reacción biuret se anotaron los distintos cambios que se
observaron respectivamente durante el proceso, los cuales se describen
a continuación en los cuadros:

Reacción Biuret:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas)

Tubo de Ensayo 1 Agua
Tubo de Ensayo 2 Gelatina
Tubo de Ensayo 3 Caseína
Tubo de Ensayo 4 Albúmina
Tubo de Ensayo 5 Solución problema
1
Tubo de Ensayo 6 Solución problema
2
Resultados:
Inicialmente:
 Al agregarle Na2OH al 10% (1 ml):

Con 3 gotas de Biuret (después de 15 minutos):

Reacción Ninhidrina:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas)

Tubo de Ensayo 1 Agua
Tubo de Ensayo 2 Gelatina
Tubo de Ensayo 3 Caseína
Tubo de Ensayo 4 Albúmina
 Resultados:
Inicialmente:

Con Ninhidrina (5 gotas):

10 minutos después del baño maría:

Cromatografía en Papel:

Proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis

cualitativos que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de
ningún tipo de equipamiento extraordinario.
 Consta de dos fases: fase móvil y fase estacionaria. La fase
estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de
filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas
de la solución y evaporando el solventen (ver resumen). Luego
el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender
por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la
muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase
móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o
ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido
fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas
de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color
propio el papel se somete a procesos de revelado, en nuestro caso,
ninhidrina, sumamente útil para revelar aminoácidos.
Los resultados obtenidos en el experimento están expresados por
la ecuación:
Rf=D/Df
Siendo D la distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia
del frente de avance del eluente (fase móvil).
Los Rfs son una forma de expresar la cantidad de lo que avanzó el
aminoácido relativamente con lo que avanzó el eluente en el papel
(fase estacionaria). Los Rfs obtenidos empíricamente, durante 5
minutos de corrimiento para las siembras de aminoácidos son:

• Cis: 1.8/3 = 0.6 cm

• Gln: 1.4/2.5= 0.56cm
• Cis y Gln: 1.5/2.6= 0.58cm

Discusión de Resultados:
Identificación de Proteínas:

REACCIÓN BIURET:
 Biuret

Los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy

usada para la valoración de los mismos, llamada reacción del Biuret,
que contiene Cu2SO4 como disolvente. Las proteínas por sus uniones
peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio
alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2 ó más
uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. Esta
prueba sirve para la identificación de tripéptidos en adelante.
Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio
alcalino forman complejos con los electrones no saturados de los
átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las proteínas. La
cantidad de color producido es proporcional a la concentración de
proteínas. Sin embargo, el método es un poco insensible siendo el límite
menor de 0.25mg de proteínas.
Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos –CONH2
unidos directamente o por un carbono o nitrógeno. Los compuestos
que contienen –CH2NH2, -C(NH)NH2 y –CSNH2 en lugar de los grupos –
CONH2 también reaccionan. Las estructuras peptídicas en proteínas y
sus derivados que contengan enlaces peptídicos también dan positivo
para la prueba de Biuret.
De los aminoácidos, la histidina da positivo. Los dipéptidos dan
pruebas negativas. Las proteínas dan color morado o violeta mientras
que las proteosas o peptonas (enzimas que rompen los enlaces
peptídicos de las proteínas) dan un color rosado y los péptidos dan un
color rosado claro. Además, los aminoácidos dan un color amarillento [3].

Agua:
 El agua no cambió en ningún momento del procedimiento porque
no contiene ningún tipo de elemento orgánico y mucho menos
compuestos proteicos, por esta razón da negativo a la reacción de
biuret.
Gelatina
La geltaina es una mezcla coloide, incolora, translúcida,
quebradiza y casi insípida que se obtiene a partir del colágeno
procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con
agua. El colágeno es un compuesto proteico hecho sustancialmente de
prolina, hidroxiprolina y glicina. El reactivo biuret debería dar positivo,
debido a los componente peptídicos del colágeno presente en la
gelatina. El resultado del laboratorio fue un color morado claro, que
concuerda con lo que la teoría requiere, aunque se han hechos estudios
donde la gelatina da un color azul [1]. Por ende podemos decir que si se
hubiera dejado reaccionar por más tiempo o si se hubiera añadido más
gelatina, se hubiera obtenido el color azul.
Caseína:
La caseína es una fosfoproteína presente en la leche y en algunos
de sus derivados. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada
al calcio en un complejo que se ha denominado caseinógeno. El
resultado del laboratorio fue el cambio de coloración de levemente
blanco a un blanco opaco total. El resultado teórico esperado es un
cambio de coloración a un azul lechoso, que en nuestro caso no fue
azul, sólo lechoso. Deducimos que fue el hecho de solamente usar 20
gotas de caseína, el que produjo nuestro resultado: es posible que en la
solución de caseína no se alcanzó el límite mínimo (0.25 mg) de caseína
para que se llevara a cabo la reacción biuret [2].
Concordamos, también, en que posiblemente el factor tiempo
influyó en la manifestación de la reacción.
Albúmina:
La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción
en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su
vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. Lo
esperado en esta reacción es obtener un color violeta translucido. En la
práctica del laboratorio, después de 15 minutos de reacción, no se notó
ningún cambio convincente para afirmar que hay presencia de
proteínas. Sin embargo una observación efectuada 20 minutos después
de la primera observación, demostró un cambio de coloración
amarillento. Según la teoría, la reacción Biuret, un color amarillento
indica presencia de aminoácidos.
[1], [2] s.a. (2007). Prelab3: propiedades químicas de las proteínas. 05/05/2007. s.l.. Consultado el:
21/04/2010. Disponible en: http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.
[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el
23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO
%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.

Solución Problema 1:
Ésta era una solución desconocida en la cual se quería probar la
presencia o no de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración
nulo, lo que nos indica ausencia de proteínas. Esto no quiere decir que
no existiera aminoácidos en la solución, ya que la reacción biuret no
reacciona con aminoácidos sino que con enlaces peptídicos.

Solución Problema 2:
Al igual que en el problema 1, se quería probar la presencia o no
de proteínas. El resultado fue un cambio de coloración a púrpura
translucido, lo que nos demuestra presencia de proteínas en solución.

REACCIÓN CON NINHIDRINA:

Ninhidrina (2,2-Dihidroxindeno-1,3-diona)

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para

visualizar las bandas de separación de aminoácidos (y por ende
proteínas) por cromatografía o electroforesis. Ésta reacciona con los
aminoácidos (pH entre 4 y 8) y en caliente, produciendo amoniaco,
dióxido de carbono y un complejo de color púrpura azulado. Todos los
aminoácidos primarios forman el mismo complejo químico tras su
reacción con ninhidrina. Si la coloración es violeta o amarillo claro se
trata de una proteína, un polipéptido o un aminoácido. Además, si el
color es rojo o amarillo fuerte se trata del aminoácido prolina, o la
hidroxiprolina.
Agua:
El agua no cambió en ningún momento del procedimiento, ni al
agregar ninhidrina ni al momento de aplicarle calor, porque no contiene
ningún tipo de elemento orgánico y mucho menos compuestos
proteicos, por ende la ninhidrina no tiene con quién reaccionar.

Gelatina:
Como ya se mencionó anteriormente la gelatina es un compuesto
proteico, que en la reacción de biuret cambió de color por la presencia
de colágeno; sin embargo, en el procedimiento con ninhidrina la
muestra de gelatina no cambió de color, aunque la teoría dice que por
la presencia de prolina e hidroxiprolina, debería cambiar a una
tonalidad amarillenta o roja. Suponemos que esto sucedió debido a
problemas durante el goteo. Esto lo notamos porque el tubo de ensayo
de la gelatina presentaba un notorio volumen mayor que el de los otros
tubos de ensayo. Al ser una gran cantidad de gelatina y una cantidad
relativamente menor de ninhidrina, ésta última tuvo una saturación más
lenta para su reacción, dejando poco producto visible (lo que proveería
su notorio color positivo).
Caseína:
Como ya se sabe la caseína es un compuesto proteico presente
en la leche y sus derivados. En la práctica del laboratorio, la caseína
actuó tal y como lo dice la teoría; cambio de color a un azul-morado,
debido a la presencia de proteínas; y también cambió de estado
(debido al aumento de termperatura): se coaguló, esto indica presencia
de globulinas [3].
Albúmina:
Al hacerse la reacción con ninhidrina, la albumina cambió de un
color transparente a rojo sangre y además se coaguló. El cambio de
color indica la presencia de prolina e hidroxiprolina. La albúmina se
coagula por el calor, lo que confirma su identidad [3].
[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificación de aminoácidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el
23/04/2010. Disponible en: http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO
%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp. 34.

Cromatografía
Se recurrió al uso de Cromatografía en papel ya que es más fácil,
y rápido en su aplicación además de observación de las reacciones.
La preferencia en el uso del papel Whatman 1, se debe a su
característica de polaridad, ésta impide el rompimiento del papel.
La línea trazada más importante fue la inferior que media 2cm
(ver resumen), ésta nos daba la pauta de inicio de los aminoácidos.
Todos los trazos se hicieron a lápiz porque si se usaba lapiceros, debido
a su tinta orgánica, se hubiera reaccionado con los aminoácidos,
impidiendo la observación de ellos.
Las paredes internas de la cámara cromatográfica se revistieron
con papel alto en celulosa. Esto previene que la presión externa de la
cámara interviniera en el proceso cromatogáfico.
La fase estacionaria no toca la cámara cromatográfica porque
está saturada de agua (para la adhrencia) en sus paredes; si el papel de
la fase estacionarioa toca las paredes, o el papel que las recubre,
absorbe fácilmente agua y ya no se puede observar con claridad el
avance de los aminoácidos.
Al momento de sembrar la muestra se requirió el uso de capilares
para tener una muestra más exacta, pero su uso no era necesario ya
que podríamos utilizar un gotero.
El orden de las siembras de las muestras no afectaba nuestros
resultados, lo único importante era colocar la misma cantidad de
aminoácidos en cada punto, y no contaminar el papel de la fase
estacionaria.
La fase estacionaria se dobló hacia afuera para que las muestras
de los aminoácidos no entraran en contacto entre ellos (y así fuera más
fácil la absorción de la fase móvil) colocándole grapas en los extremos
para unirlos, porque si hubiéramos utilizado masking tape, se hubiera
despegado, rompiendo la estructura requerida de la fase estacionaria.
 Al momento de realizar la fase móvil procuramos que la cámara
estuviera tapada para que no se contamine y no reaccionara con otro
compuesto.
Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase móvil, era
necesario colocarse guantes debido a los componentes químicos que
podrían afectar la mano. Era importante secar la fase estacionaria
porque se tenía que revelar con ninhidrina, disminuyendo así la
cantidad de los eluentes para evitar la reacción de los mismos.
Obteniendo así la coloración de los aminoácidos.
La Cisteína corrió mas debido a su bajo peso molecular, y la
Gluteína corrió menos debido a su alto peso molecular.
En la combinación de los aminoácidos se puede observar que su
recorrido es el promedio de los recorridos de la Cisteína y la Gluteína.
La Cisteína hizo que la mezcla de ambos aminoácidos corriera más pero
al mismo tiempo la Gluteína impidió que siguiera avanzando, esto
debido a las diferencias entre pesos moleculares.

Conclusiones:
• Para que se lleve a cabo una reacción como la de biuret revela
únicamente la presencia de proteínas y péptidos pequeños.
• La reacción de ninhidrina es más genérica que la de biuret.
Identifica aminoácidos y proteínas no por sus enlaces, sino por su
constitución química, lo cual le otorga un mayor poder de
identificación ante el biuret.
• Otros factores como el tiempo, temperatura y cantidad de
sustrato afectan la calidad de la reacción y resultados para la
identificación de proteínas.
• Dependiendo de la estructura primaria de cada proteína, la
manifestación en las reacciones puede tener ciertas variaciones
específicas.
• El tiempo es indispensable en la cromatografía ya que con
tiempos de corrida cortos no se aprecian claramente los cambios
relevantes.
• El método de identificación por cromatografía en papel es efectivo
ya que los elementos utilizados como eluentes eran ideales para
correr en el papel alto en celulosa y disolver los aminoácidos;
además.
• Conforme avanza el tiempo, la corrida del aminoácido variará
dependiendo de su peso; a mayor peso, más lento el corrimiento,
a menor peso, más veloz.
• Las interacciones entre el solvente y soluto dieron a mostrar las
características de cada aminoácido.

Bibliografía:

• Mathews, C.K.(1996). Bioquímica. Segunda edición: España.

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• Usuario: denis_qca. (2008). Proteínas y sus reacciones.
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http://www.scribd.com/doc/2309987/Proteinas-y-sus-reacciones.
• s.a. (©2009). Precipitación de proteínas. s.f.ed.. Salamanca,
España. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en:
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http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales
%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp
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