Astrocyte-Like Cells

Derived From Human

Oral Mucosa Stem Cells
Provide
Neuroprotection In
Vitro And In Vivo
Javier Ganz, Ina Arie, Tali Benzur, Michal Dadon-nachum,
Sammy Pour, Shareef Araidy,
Sandu Pitaru, Daniel Offen

ABSTRAK

Abstrak
Human oral mucosa stem cell
(hOMSC) akhir-akhir ini dijelaskan
sebagai sel puncak dari populasi
stem sel
Potensi terapetik HOMSC bisa
didapatkan dari biopsi kecil
Kondisi medium dari induksi sel,
menyelamatkan motor neuron dari
hipoksia atau stres oksidatif in vitro,
yang memacu menjadi efek

Abstrak
Subjek tikus dengan cedera saraf
panggul dan di transplantasi dengan
HOMSC menunjukkan kemajuan
perbaikan pada fungsi motorik
Pada tempat transplantasi,
didapatkan peningkatan level NTF
(neurotrophic factor) dan menjaga
secara signifikan fungsi
neuromuscular junction

Abstrak
HOMSC NS yang dihasilkan dari
mukosa mulut menunjukkan efek
neuroprotektif in vitro dan in vivo
sebagai terapi masa depan pada
gangguan neural

PENDAHULUAN

Pendahuluan
Terapi berbasis stem sel menjanjikan
sebagai pengobatan penyakit
neurodegenerative
Strategi yang digunakan dalam penelitian
ada 2:
Penggantian sel untuk menambahkan sel yang
hilang dengan sel yang baru (Parkinson
disease)
Menggunakan sel sebagai vector yang
memproduksi dan mensekresi neuroprotektif
atau trophic stimuli untuk mempertahankan
neuron.

Pendahuluan
Neurotrophic factor (NTF) menghasilkan
polypeptida alami yang mendukung
perkembangan, kelangsungan hidup, dan
membesarkan neuron.
NTF seperti Brain Derived Neurotrophic
Factor (BDNF) dan Vascular Endhotelial
Growth Factor (VEGF) mempunyai peranan
penting sebagai pertumbuhan,
pemeliharaan dan regenerasi sistem saraf.

Pendahuluan
Populasi HOMSC menunjukkan
sebuah primitive neural crest (NC)
stem cell dibuktikan dengan faktor
transkripsi pluripotent Oct4, Nanog
dan Sox2 dan sesuai ekspresi dari NC
marker.
Embrio NC memberi peningkatan
untuk diferensiasi populasi glial di
sistem saraf perifer.

Pendahuluan
Penulis berhipotesis bahwa sel ini
secara tepat memberi sinyal ke
faktor solubel yang dapat memberi
manfaat stem sel sebagai sumber
terapi sel autolog pd ggn neurologi

BAHAN DAN METODE

Kultur HOMSC
HOMSC didapatkan dari biopsi mucosa
mulut pada pembedahan mulut
HOMSC didapatkan dan dibiakkan di media
yg terdiri dari low glucose Dulbecco
dimodifikasi Eagle dan dilengkapi
100mg/ml streptomycin, 100U/ml penicilin,
1250 U/ml Nystatin (SPN), 2mM glutamine dan
10 % fetal calf serum

Kultur HOMSC
Hasil biopsi disimpan dalam suhu 40
C dalam semalam
Kemudian lapisan epitelial dipisah
dari lamina propia dan diinsisi
menjadi lembaran 0,5mm3
sel dipindah ke piringan cultur yang
dipanen dengan 0,25% trypsin dan
ditanam pada ketebalan 4x104
cell/cm2

Diferensiasi HOMSC
Ada 2 tahapan pada diferensiasi:
1. Sel yang disimpan pada serum murni dengan
ditambah suplement-seplement dengan
konsentrasi akhir 20ng/ml
2. 72 jam kemudian dilakukan tahapan
diferensiasi kedua diaktifkan. Sel disimpan
pada media serum bebas ditambah

1mM dibutyryl cyclic AMP, 0,5 Mm 3-isobutyl1methylxantlon, 50ng neurogulin, 1ng.ml PDGF
selama 72 jam

Immunodetection
Untuk analisis imunofloresin, sel difiksasi
pd posphate buffer saline (PBS) 4% selama
60 menit di dalam blok
Antibodi primer dilemahkan pd blok dan
disimpan semalaman pd suhu 40 C
Antibodi primer dideteksi dgn antibodi
sekunder Alexa 488 dan 568 yang dilabeli
dgn flouresin selama 1 jam pd suhu
ruangan.

Immunodetection
Foto diambil dgn floresin Olympus
IX70-S8F2 dengan sumber cahaya
flouresin.

Western Blot Analysis

Untuk Western Blot Analysis , sel yang
dilarutkan dlm buffer yg mengandung PBS
1% SDS dan complete protease inhibitor
ditambahkan 12 % SDS-Polyacrylamide gel
elektrophoresis.
3 kultur independent digunakan sebagai
replikasi biologi
Membran dianalisis dan dikumpulkan,
diukur dengan Odyssey IR imaging
system.

Real Time Polymerase Chain

Reaction
Total RNA diisolasi oleh TRI reagent
Jumlah dan kualitas RNA ditentukan
dengan ND-1000 spectrophometer
Real time semiquantitative
polymerase chain reaction (PCR) dari
gen berperan pada ABI Prism 7700
rangkaian sistem deteksi.

Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay Berdasar Pengukuran
Sekresi NTF

Konsentrasi human VEGF dan BDNF dalam

kultur sel supernatant diukur
menggunakan prosedur ELISA
Sampel yang diinkubasi semalaman pada
piring berlapis, diikuti paparan antibodi
sekunder dan streptavidin-horseradish
H2O2
Hasilnya dikalkulasi sebagai sekresi
protein oleh 1 juta sel/mm dri media

Pengujian Kemampuan
Hidup Sel
Peneliti telah menguji kemampuan
undiferensisasi dan diferensiasi
HOMSC pd media preparat untuk
melindungi motor neuron-like hybird
cell line (NSC-34) dari hipoksia dan
stres oksidatif

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Percobaan dgn kerusakan saraf
panggul digunakan pada tikus
Sprague-Dawley laki-laki usia 8
minggu dgn berat 230-250gr
HOMSC didapatkan dari donor yang
berbeda dan digunakan pd
eksperimen yg independent
Hasil dari 2 eksperimen disatukan
dan dipresentasikan sbg rata-rata +
SEM/binatang

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Tikus dibius dgn chloral hydrate pada
cedera saraf panggul dan sel
transplantasi, maintenance dgn
cyclosporine
Saraf panggul kanan dikeluarkan dan
di klem 10mm diatas cabang
pertama saraf selama 30 detik

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
20 jam setelah cedera, diferensiasi HOMSC
dan naif sel dipanen, dilabeli dgn
seperparamagnetic iron oxide,
disentrifugal dan diresuspensi pd
konsentrasi 1x106 sel/100L
dimaintenence dgn es sampai
transplantasi dilakukan
HOMSC diinjeksi melalui m. gastrocnemius
menuju saraf dan diatas cabang pertama
saraf panggul

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Semua hewan coba dikorbankan 10
hari setelah transplantasi untuk
dilakukan pengamatan histologi.