Cinétique Enzymatique

C O L L E C T I O N G R E N O B L E S C I E N C E S
DIRIGE PAR JEAN BORNAREL
CINTIQUE
ENZYMATIQUE
Athel CORNISH-BOWDEN
Marc JAMIN
Valdur SAKS
C
Grenoble Sciences
Grenoble Sciences poursuit un triple objectif :
raliser des ouvrages correspondant un projet clairement dfini, sans contrainte de
mode ou de programme,
garantir les qualits scientifique et pdagogique des ouvrages retenus,
proposer des ouvrages un prix accessible au public le plus large possible.
Chaque projet est slectionn au niveau de Grenoble Sciences avec le concours de referees
anonymes. Puis les auteurs travaillent pendant une anne (en moyenne) avec les membres
dun comit de lecture interactif, dont les noms apparaissent au dbut de louvrage. Celui-ci
est ensuite publi chez lditeur le plus adapt.
(Contact : Tl. : (33)4 76 51 46 95 - E-mail : Grenoble.Sciences@ujf-grenoble.fr)
Deux collections existent chez EDP Sciences :
la Collection Grenoble Sciences, connue pour son originalit de projets et sa qualit
Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques, collection prsentant des thmes de
recherche dactualit, traits par des scientifiques de premier plan issus de disciplines
diffrentes.
Directeur scientifique de Grenoble Sciences

Jean BORNAREL, Professeur l'Universit Joseph Fourier, Grenoble 1
Comit de lecture pour Cintique enzymatique

Serge CHESNE, Matre de Confrences l'Universit de La Runion
Jean-Marie FRRE, Professeur l'Universit de Lige
Michel VAN DER REST, Professeur l'Ecole Nationale Suprieure de Lyon,
Directeur-adjoint de la Recherche
et
Julien BRVIER
Grenoble Sciences reoit le soutien du Ministre de l'ducation nationale,

du Ministre de la Recherche, et de la Rgion Rhne-Alpes.
Ralisation et mise en pages : Centre technique Grenoble Sciences

Illustration de couverture : Alice GIRAUD
partir dune image originale reprsentant la structure de la cratine kinase fournie par le
Professeur Theo WALLIMANN et le Docteur Uwe SCHLATTNER de ETH de Zurich (Suisse)
ISBN 2-86883-742-5
EDP Sciences, 2005
Portland Press, Ltd. London, 2004
This translation of portions of FUNDAMENTALS OF ENZYME KINETICS first
published in (1995, 2004) is published by arrangement with Portland Press, London
CINTIQUE ENZYMATIQUE
Marc JAMIN
Valdur SAKS
Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences
Collection Grenoble Sciences
Chimie. Le minimum savoir (J. Le Coarer) - Electrochimie des solides (C. Dportes
et al.) - Thermodynamique chimique (M. Oturan & M. Robert) - Chimie organomtallique
(D. Astruc) - De l'atome la raction chimique (sous la direction de R. Barlet)
Introduction la mcanique statistique (E. Belorizky & W. Gorecki) - Mcanique statistique.
Exercices et problmes corrigs (E. Belorizky & W. Gorecki) - La cavitation. Mcanismes
physiques et aspects industriels (J.P. Franc et al.) - La turbulence (M. Lesieur) - Magn-
tisme : I Fondements, II Matriaux et applications (sous la direction dE. du Trmolet de
Lacheisserie) - Du Soleil la Terre. Aronomie et mtorologie de lespace (J. Lilensten &
P.L. Blelly) - Sous les feux du Soleil. Vers une mtorologie de lespace (J. Lilensten &
J. Bornarel) - Mcanique. De la formulation lagrangienne au chaos hamiltonien (C. Gignoux
& B. Silvestre-Brac) - Problmes corrigs de mcanique et rsums de cours. De Lagrange
Hamilton (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) - La mcanique quantique. Problmes rsolus,
T. 1 et 2 (V.M. Galitsky, B.M. Karnakov & V.I. Kogan) - Analyse statistique des donnes
exprimentales (K. Protassov) - Description de la symtrie. Des groupes de symtrie aux
structures fractales (J. Sivardire) - Symtrie et proprits physiques. Du principe de Curie
aux brisures de symtrie (J. Sivardire)
Exercices corrigs d'analyse, T. 1 et 2 (D. Alibert) - Introduction aux varits diffrentielles
(J. Lafontaine) - Analyse numrique et quations diffrentielles (J.P. Demailly) - Mathma-
tiques pour les sciences de la vie, de la nature et de la sant (F. & J.P. Bertrandias) - Appro-
ximation hilbertienne. Splines, ondelettes, fractales (M. Attia & J. Gaches) - Mathma-
tiques pour ltudiant scientifique, T. 1 et 2 (Ph.J. Haug)
Bactries et environnement. Adaptations physiologiques (J. Pelmont) - Enzymes. Catalyseurs
du monde vivant (J. Pelmont) - La plonge sous-marine l'air. L'adaptation de l'organisme
et s e s limites (Ph. Foster) - Endocrinologie e t communications cellulaires (S. Idelman &
J. Verdetti) - Elments de biologie l'usage d'autres disciplines (P. Tracqui & J. Demongeot
Bionergtique (B. Gurin)
L'Asie, source de sciences et de techniques (M. Soutif) - La biologie, des origines nos
jours (P. Vignais) - Naissance de la physique. De la Sicile la Chine (M. Soutif) - Le rgime
omga 3. Le programme alimentaire pour sauver notre sant (A. Simopoulos, J. Robinson,
M. de Lorgeril & P. Salen) - Gestes et mouvements justes. Guide de l'ergomotricit pour
tous (M. Gendrier)
Listening Comprehension for Scientific English (J. Upjohn) - Speaking Skills in Scientific
English (J. Upjohn, M.H. Fries & D. Amadis) - Minimum Competence in Scientific English
(S. Blattes, V. Jans & J. Upjohn)
Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques

Radiopharmaceutiques. Chimie des radiotraceurs et applications biologiques (sous la direc-
tion de M. Comet & M. Vidal) - Turbulence et dterminisme (sous la direction de M. Lesieur)
Mthodes et techniques de la chimie organique (sous la direction de D. Astruc) - L'nergie
de demain. Techniques, environnement et conomie (sous la direction de H. Nifenecker)
PRFACE
Dans le contexte post-gnomique actuel, la recherche en biologie doit faire face

de nouveaux dfis et tendre ses domaines dinvestigation vers des niveaux de
complexit croissante. Il sagit notamment de dterminer la structure et la fonction
de toutes les protines encodes dans les gnomes tudis, de comprendre les
processus de contrle de lexpression diffrentielle de ces protines dans les diff-
rents types de cellules dun organisme vivant, de mettre en vidence les inter-
actions protine/protine en relation avec leur implication dans les phnomnes
biologiques (protomique) ou encore de dcrire de manire quantitative le fonc-
tionnement molculaire dun organisme dans ses tats normaux et physiopatho-
logiques. Ce dernier domaine dtude constitue, dans la mouvance scientifique
actuelle, ltude du physiome ou physiologie gnomique. Cette physiologie gno-
mique a pour objectif de dcrire le fonctionnement des organismes vivants en allant
du gnome vers le protome et le mtabolome jusqu la caractrisation du fonc-
tionnement intgr des cellules, des tissus et des organes. Cette tude de systmes
mtaboliques complexes repose sur le dveloppement de modles comprhensibles
des systmes biologiques par des mthodes de modlisation mathmatique, un
domaine aujourdhui en plein essor, et sur lutilisation de la cintique enzymatique
pour obtenir les donnes quantitatives ncessaires pour cette analyse. La cintique
enzymatique a pour objectif didentifier et de dcrire les mcanismes de raction en
tudiant leur vitesse et les flux mtaboliques. En partant des enzymes isols et en
allant vers des systmes mtaboliques organiss et intgrs, les mthodes de
cintique enzymatique permettent de dcrire de manire quantitative les proprits
catalytiques des enzymes et les mcanismes de leur rgulation.
Historiquement, les lois gouvernant la vitesse des processus chimiques ont t
dcouvertes empiriquement dans le courant du XIXe sicle et les explications tho-
riques rendant compte des observations phnomnologiques sont apparues au dbut
du XXe sicle, sur la base des dcouvertes de la physique molculaire, de la thermo-
dynamique chimique et statistique et de la mcanique quantique. La cintique
enzymatique utilise les thories et les dcouvertes de la cintique chimique pour la
description et ltude des mcanismes des ractions catalyses par des enzymes, les
catalyseurs biologiques, qui sont essentiellement des protines comportant des sites
actifs catalytiques. Dans les tudes biochimiques fondamentales, les mthodes
cintiques sont combines avec des tudes structurales et des mthodes de biologie
molculaire, telle la mutagense dirige, afin daboutir une description du
6 CINTIQUE ENZYMATIQUE
mcanisme ractionnel au niveau atomique. Ainsi, la cintique enzymatique est un

outil important et ncessaire dans de nombreuses tudes biochimiques mais sa
nature quantitative et sa capacit prvoir l'volution dun processus biochimique
au cours du temps, en font galement un lment de base de la biotechnologie.
La cintique enzymatique constitue donc une part importante de la culture et de la
connaissance biochimique que les tudiants en biologie, quelle que soit leur spcia-
lisation, devraient acqurir au cours de leur cursus. Il existe plusieurs ouvrages
classiques de cintique enzymatique en anglais (SEGEL, CORNISH-BOWDEN,
GUTFREUND) qui constituent une source de formation et dinformation suffisam-
ment dtaille et complte de ce type dapproche. Toutefois, la situation en langue
franaise est diffrente. Lexcellent ouvrage de J. PELMONT intitul Enzymes donne
une bonne description de lenzymologie, mais principalement de ses aspects
qualitatifs. Le but de notre ouvrage est de fournir un manuel de rfrence pour la
cintique enzymatique, complmentaire de celui de PELMONT. Dans ce but, nous
avons traduit et adapt le livre dAthel CORNISH-BOWDEN intitul Fundamentals
of Enzyme Kinetics en utilisant le matriel du cours denzymologie donn
lUniversit Joseph Fourier de Grenoble par Valdur SAKS et Marc JAMIN. Ce livre
commence par une description des principes simples de la cintique chimique et de
la thermodynamique et comprend une description dtaille de la cintique dans des
conditions dtat stationnaire pour les enzymes un ou plusieurs substrats, des
phnomnes dinhibition et dactivation, de la rgulation allostrique et de la
cooprativit dans les ractions enzymatiques. Il aborde les systmes multienzy-
matiques et lanalyse du contrle mtabolique en prsentant une analyse soigneuse
des applications pratiques de ces mthodes. Nous esprons que ce nouvel ouvrage
comblera le vide existant dans la littrature en langue franaise et sera utile aussi
bien pour les tudiants de licence et de master que pour les chercheurs dans tous les
domaines de la biologie.
Les auteurs remercient tout particulirement Lonard CHAVAS qui, au cours de sa
matrise de biochimie l'Universit Joseph Fourier de Grenoble, a contribu de
manire importante la traduction et l'adaptation des premiers chapitres de ce
livre, ainsi que Madame Simone JERME et Monsieur Philippe MOTTET de la
Bibliothque des Sciences de lUniversit Lige pour leur aide dans la consultation
de documents concernant Victor HENRI.
Marc JAMIN
Valdur SAKS
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE
1.1. INTRODUCTION
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un rle central dans le
monde vivant. Les ractions essentielles pour le fonctionnement d'un tre vivant
sont trop lentes et sans la prsence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la
connaissons aujourd'hui ne serait pas possible. Qu'il s'agisse de ractions simples
comme la formation de bicarbonate partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de
ractions complexes comme la rplication de l'ADN, chaque raction chimique se
droulant au sein d'un tre vivant est catalyse par un ou plusieurs enzymes
spcifiques. Les enzymes sont des macromolcules, des protines ou des ARN (les
ARN catalytiques sont plus correctement dnomms ribozymes), qui reconnaissent
spcifiquement certaines molcules et acclrent les ractions de transformation de
ces molcules suffisamment pour que leur vitesse devienne compatible avec le
fonctionnement de l'organisme. Un second rle essentiel jou par les enzymes est
d'assurer le couplage physique entre ractions endergoniques et ractions exer-
goniques et de permettre ainsi de maintenir les systmes biologiques dans des tats
hors d'quilibre, galement indispensables pour le maintien de la vie.
La comprhension du mcanisme molculaire des processus biologiques reste un
des objectifs majeurs de la biologie moderne. En particulier, l'tude des ractions
enzymatiques vise comprendre les mcanismes ractionnels mais aussi tablir
de manire quantitative comment un enzyme est capable d'acclrer spcifique-
ment une raction chimique. Puisque les enzymes agissent en modifiant la vitesse
des ractions, il est ncessaire d'tudier la cintique des ractions pour comprendre
leur mode d'action. Dans ce premier chapitre, nous allons commencer par rappeler
les conventions et les concepts de base de la cintique chimique, qui seront utiles
pour la comprhension de la cintique enzymatique : la vitesse de raction, les
notions de raction lmentaire, d'ordre et de molcularit d'une raction.
Les conventions d'criture des ractions chimiques
Une raction chimique est un processus au cours duquel une ou plusieurs substances
chimiques (molcules) se transforment en une ou plusieurs autres substances
chimiques, par un rarrangement des lectrons et des liaisons entre les atomes
constitutifs. Ce processus implique gnralement la rupture ou la formation de

nouvelles liaisons chimiques. Une raction chimique peut tre reprsente par une
quation telle que celle de la figure 1.1 en respectant les conventions tablies. Les
substrats (ractifs) sont les substances qui disparaissent au cours de la raction et
sont reprsentes dans la partie gauche de l'quation. Les produits sont les
substances qui apparaissent au cours de la raction et sont reprsentes dans la
partie droite de l'quation.
Constante
Sens de la d'quilibre Constante de vitesse
raction directe de la raction directe
Ractif K Coefficient
stchiomtrique
k1
Coefficient aA pP Produit
stchiomtrique
k1 Constante de vitesse
de la raction inverse
Sens de la [A]0 x x
raction inverse
Concentration Avancement
initiale de A de la raction
1.1 - Reprsentation schmatique d'une raction chimique et conventions d'criture
Dans ce livre nous suivons autant que possible les recommandations du

Nomenclature Committee de l'IUBMB (IUB, 1982). Nanmoins, comme ces
recommandations permettent une certaine latitude et qu'elles ne couvrent pas
toujours tous les cas dont nous aurons traiter, il est utile de commencer par noter
quelques points qui s'appliquent de manire gnrale ce manuel. Premirement, il
est essentiel de reconnatre qu'une substance chimique et sa concentration sont
deux entits diffrentes qui doivent tre reprsentes par des symboles diffrents.
Les recommandations permettent sans dfinition pralable, de reprsenter la
concentration d'une substance par le symbole de la substance entour de crochets,
ainsi [glucose] reprsente la concentration de glucose, [ A ] reprsente la concen-
tration de la substance A Dans ce livre, nous avons choisi d'utiliser cette
convention qui peut, dans le cas d'quations complexes, compliquer la notation en
raison de la multiplication des crochets et des parenthses mais qui a l'avantage
d'tre utilise couramment par les tudiants. Puisque l'un des objectifs de ce manuel
est de fournir aux tudiants une premire approche vers l'tude des systmes
enzymatiques, nous avons choisi d'utiliser cette notation courante. En cela, ce
manuel diverge de la version originale en anglais qui utilise une notation
simplifie. Nanmoins, afin d'viter toute confusion entre le texte et les symboles
utiliss pour les grandeurs exprimentales, ces dernires seront crites en italique.
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE 9
Pour reprsenter les ractifs, nous utiliserons les recommandations de l'IUBMB et

dsignerons les substrats par les lettres A, B, C et les produits par les lettres P, Q,
R Les coefficients stchiomtriques apparaissent comme des nombres qui
prcdent les ractifs et les produits respectifs. La raction est symbolise par une
flche qui peut tre simple ( ) ou double ( ) selon que la raction est ou non
rversible. Dans le cas d'une raction rversible, le sens direct de la raction est
dfini comme celui de la conversion des substrats en produits (il est reprsent par
la flche dirige vers la droite) alors que le sens inverse est dfini comme celui de
la conversion des produits en ractifs (il est reprsent par la flche dirige vers la
gauche). Dans le cas d'une raction rversible, la dfinition du sens de la raction
est arbitraire, puisque la raction peut galement tre dcrite par l'quilibre inverse.
Nanmoins, le sens de la raction est important pour la dfinition des grandeurs
thermodynamiques et doit tre dfini prcisment lors de l'analyse du systme.
Les constantes de vitesse et d'quilibre apparaissent en vis--vis des flches corres-
pondantes. Pour distinguer ces deux types de constantes, il est recommand de
suivre les conventions et de reprsenter les constantes d'quilibre par des lettres
majuscules et les constantes de vitesse par des lettres minuscules. De plus, comme
nous allons le voir, les ractions enzymatiques consistent presque toujours en deux
ou plusieurs tapes, et puisque nous aurons besoin de symboles pour faire rfrence
ces diffrentes tapes, il est ncessaire de disposer d'un systme adquat
d'indexation afin de prciser quel symbole fait rfrence une tape donne. Les
recommandations de l'IUBMB n'imposent aucun systme en particulier, mais au
contraire impose de dcrire le systme utilis. Parce que le mme symbole, par
exemple k2, peut tre utilis de diverses manires dans la littrature biochimique, il
est prudent de toujours dfinir clairement ce qu'il signifie. Le systme utilis dans
ce manuel est le suivant : pour une raction comportant n tapes, celles-ci sont
numrotes 1, 2 n ; un k minuscule et italique avec un indice positif dsigne la
constante de vitesse de la raction directe dont le numro correspond l'indice,
c'est--dire que, dans ce cas, k2 est la constante de vitesse pour la raction directe
de la seconde tape de la raction ; le mme symbole mais avec un indice ngatif
est utilis pour reprsenter la constante de vitesse de la raction inverse, par
exemple k2 pour la seconde tape ; un K majuscule et italique avec un indice est
utilis pour reprsenter la constante d'quilibre (thermodynamique) de l'tape,
dsigne par l'indice et typiquement quivalente au rapport des constantes de
vitesse, c'est--dire que K 2 = k 2 k 2 .
Lorsqu'elles sont ncessaires, des indications sur les concentrations des ractifs et
des produits, ainsi que sur la relation entre celles-ci et l'avancement de la raction,
peuvent tre indiques par des symboles ou des valeurs places en dessous des
ractifs et des produits correspondants. Les catalyseurs sont rgnrs la fin de la
raction ; ils peuvent tre incorpors dans l'quation la fois dans les ractifs et
dans les produits ou apparatre sous la forme d'une indication place en vis--vis
des flches.
1.2. LES PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE
1.2.1. Vitesse de raction et quation de vitesse
La vitesse d'une raction chimique est une mesure de la rapidit avec laquelle la
concentration des ractifs et des produits change au cours du temps. La vitesse de
la raction peut tre dfinie partir de la disparition des ractifs ou partir de
l'apparition du produit. Si la concentration d'un ractif, reprsente par [ A ] , varie
d'une quantit [ A ] pendant l'intervalle de temps D t, la vitesse est donne par
v = [ A ] t . En d'autres termes, la vitesse est la variation par unit de temps
de la concentration de l'une des substances initiales ou finales.
Si la variation est considre sur un temps infiniment court, nous obtenons la
vitesse instantane de la raction :
d[ A] d[ P ]
v = 1 = 1 [1.1]
a dt p dt
o a et p reprsentent les coefficients stchiomtriques de la raction limitant la
vitesse. Les deux variations de la concentration dfinissent la vitesse de la rac-
tion v, qui peut indiffremment tre dfinie en termes d'apparition des produits ou
de disparition des ractifs puisque chaque molcule de A consomme est convertie
en une molcule P. Si la raction implique plusieurs substrats ou plusieurs produits,
la vitesse de la raction peut tre dfinie vis--vis de chacun de ceux-ci.
L'objectif d'une tude cintique est de mesurer la vitesse de la raction considre,
et, pour cela, il est ncessaire de disposer d'une mthode qui permette de suivre
l'volution de la concentration au cours du temps d'au moins un des ractifs ou des
produits. Ces problmes pratiques seront discuts dans le chapitre 4. Malheureu-
sement, la mesure de la vitesse dans un seul ensemble de conditions exprimentales
n'est pas suffisante pour dterminer le mcanisme d'une raction. Pour mieux
comprendre les mcanismes ractionnels, il est ncessaire d'tablir les quations de
vitesse de la raction, c'est--dire d'tablir des quations qui rendent compte de la
dpendance de la vitesse vis--vis de la concentration des ractifs, [ A ] , et des
produits, [ P ] ou vis--vis de certains paramtres extrieurs comme la temp-
rature, T, la pression, p, ou le pH.
v = f [ A ] , [ P ] , T , p , pH K [1.2]
La condition ncessaire pour qu'une raction chimique se produise entre les ractifs
est que ces particules entrent en contact, c'est--dire qu'elles se rapprochent
suffisamment les unes des autres pour que la raction puisse se drouler. On
conoit aisment que la vitesse d'une raction soit proportionnelle au nombre de
collisions entre ces particules. Puisque le nombre de collisions est d'autant plus
lev que la concentration des ractifs est leve, la vitesse de la raction est
proportionnelle au produit des concentrations des ractifs. Ces considrations sont
synthtises dans la loi d'action de masses tablie par GULDBERG et WAAGE

(1867) : temprature constante, la vitesse d'une raction est proportionnelle au
produit des concentrations des ractifs o chacune des concentrations entrant dans
ce produit est leve une puissance gale au coefficient stchiomtrique de ce
ractif dans l'quation chimique de la raction.
Ainsi, pour la raction 2A + B P [1.3]
l'quation de vitesse est donne par
v = k [ A ]2 [ B ] [1.4]
o k est un coefficient de proportionnalit appel constante de vitesse de la
raction. La loi d'action des masses peut se vrifier simplement en mesurant l'effet
sur la vitesse de la raction de la variation de la concentration d'un des ractifs.
1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires
Le mcanisme d'une raction dcrit comment la raction se droule. Pour un grand

nombre de ractions, plusieurs mcanismes sont possibles. Le mcanisme retenu
doit tre en accord avec la loi de vitesse observe exprimentalement, mais plu-
sieurs mcanismes peuvent avoir la mme loi de vitesse. Les tudes cintiques
permettent d'carter certains mcanismes mais ne permettent pas d'affirmer qu'un
mcanisme est le mcanisme correct. Gnralement, le mcanisme ractionnel
retenu sera le mcanisme le plus simple qui soit en accord avec l'ensemble des
donnes exprimentales et toutes les donnes exprimentales indpendantes
doivent tre utilises pour dfinir le mcanisme le plus plausible.
Si la raction se droule en une seule tape, on parle de raction lmentaire. Dans
ce cas, l'ordre et la molcularit de la raction s'valuent facilement (voir 1.2.3).
Nanmoins, de nombreux mcanismes ractionnels sont constitus d'une combi-
naison de plusieurs tapes, qui s'additionnent pour donner la raction globale. C'est
notamment le cas des ractions faisant intervenir des catalyseurs.
1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction
Une raction chimique peut tre classe selon sa molcularit ou selon son ordre.
La molcularit fait rfrence au nombre de molcules altres au cours de la
raction. Une raction de type A P est unimolculaire (parfois appele mono-
molculaire), et une raction de type A + B P est bimolculaire. Les ractions
de molcularit suprieure deux sont extrmement rares, mais, si elle existait, une
raction de type A + B + C P serait dite trimolculaire (ou termolculaire).
L'ordre est une description de la cintique de la raction qui dcoule directement de
la loi d'action des masses ; il dfinit le nombre de termes de concentration qui
doivent tre multiplis pour obtenir l'quation de vitesse de la raction. Ainsi, dans
une raction de premier ordre, la vitesse est proportionnelle la concentration d'un
seul ractif, dans une raction de second ordre, elle est proportionnelle au produit
de deux concentrations ou au carr de la concentration d'un seul ractif, et ainsi de
suite.
Pour une raction simple qui consiste en une seule tape ou pour chaque tape l-
mentaire d'une raction complexe, l'ordre est gnralement identique la mol-
cularit. Toutefois, beaucoup de ractions impliquent une srie d'tapes unimol-
culaires ou bimolculaires, et la molcularit globale de la raction ne correspond
pas ncessairement l'ordre global de la raction. En fait, l'ordre d'une raction
complexe n'est gnralement pas significatif, puisque la vitesse ne peut pas
toujours tre exprime comme le produit de termes de concentrations. Comme nous
le verrons dans les prochains chapitres, cette situation est quasiment universelle
dans la cintique enzymatique, et mme la plus simple des ractions enzymatiques
ne possde pas d'ordre simple. Nanmoins, le concept d'ordre de raction est trs
important pour comprendre la cintique enzymatique, parce que les tapes
individuelles des ractions catalyses par des enzymes ont habituellement des
ordres simples ; elles sont de premier ou de second ordre. La fixation d'une
molcule de substrat sur une molcule d'enzyme est un exemple typique de raction
bimolculaire de second ordre, alors que la conversion du complexe enzyme-
substrat en produits ou en un intermdiaire est un exemple typique de raction
unimolculaire du premier ordre.
Pour une raction du premier ordre A P, la vitesse v est exprime par
l'quation suivante :
d[ P ]
v = = k [ A ] = k ([ A ]0 [ P ]) [1.5]
dt
dans laquelle [ A ] et [ P ] reprsentent respectivement les concentrations de A et P
n'importe quel temps t, et k reprsente la constante de vitesse de premier ordre.
Le second terme de l'quation spcifie que la raction est de premier ordre,
puisqu'il montre que la vitesse est directement proportionnelle la concentration du
ractif A leve la puissance 1. Finalement, si au temps initial de la raction, t = 0,
la concentration [ A ] = [ A ]0 , la stchiomtrie permet de relier les valeurs de [ A ]
et de [ P ] tout moment de la raction, en accord avec l'quation de conservation
[ A ] + [ P ] = [ A ]0 , et permet d'crire le dernier terme de l'quation.
L'quation [1.5] peut facilement tre intgre en isolant les deux variables [ P ] et t,
c'est--dire en plaant tous les termes en [ P ] dans la partie gauche de l'quation et
tous les termes en t dans la partie droite.
d[ P ]
= k dt [1.6]
[ A ]0 [ P ]
Aprs intgration, nous obtenons :
ln([ A ]0 [ P ]) = k t + a [1.7]
o a est une constante d'intgration.
Celle-ci peut tre value en considrant qu'il n'y a pas de produit P au dbut de la
raction, c'est--dire que [ P ] = 0 quand t = 0. Alors, a = ln([ A ]0 ) , et l'qua-
tion [1.7] peut tre rcrite :
[ A ]0 [ P ]
ln = kt [1.8]
[ A ]0
En prenant l'exponentielle des deux cts de l'quation, nous obtenons l'quation
[ A ]0 [ P ]
= e k t [1.9]
[ A ]0
qui peut tre rarrange pour donner :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t ) [1.10]
Il est important de noter que la constante d'intgration a est diffrente de zro et
qu'elle doit tre value et utilise pour obtenir les quations [1.8] [1.10]. Les
constantes d'intgration doivent toujours tre incluses et values lors de l'int-
gration des quations de cintique ; elles sont rarement nulles.
Le type le plus commun de raction bimolculaire est celui de la forme
A+B P + Q, dans lequel deux sortes de molcules, A et B, ragissent pour
donner des produits. Dans ce cas, il est commun que la vitesse soit donne par une
expression du second ordre de la forme :
d[ P ]
v = = k [ A ][ B ] = k ([ A ]0 [ P ])([ B ]0 [ P ]) [1.11]
dt
o k est la constante de vitesse de second ordre. Il faut noter que le symbolisme con-
ventionnel utilis pour les constantes de vitesse ne prvoit pas de distinguer l'ordre
de ces constantes. L'intgration est ralise en sparant les variables [ P ] et t :
d[ P ]
([ A ] [ P ])([ B ] [ P ]) = k dt [1.12]
0 0
Pour le lecteur ayant une exprience limite en mathmatiques, la manire la plus

simple et la plus fiable de rsoudre cette intgration est de consulter des tables
d'intgrales standards. Dans ce cas prcis, l'intgration peut galement tre ralise
en multipliant les deux cts de l'quation par ( [ B ]0 [ A ]0 ) et en sparant la
partie gauche de l'quation en deux intgrales simples :
d[ P ] d[ P ]
= ([ B ]0 [ A ]0 ) k dt [1.13]
[ A ]0 [ P ] [ B ]0 [ P ]
De l, nous obtenons :
ln ([ A ]0 [ P ]) + ln ([ B ]0 [ P ]) = ([ B ]0 [ A ]0 ) k t + a [1.14]
En considrant que [ P ] = 0 au temps t = 0, nous obtenons une valuation de la

constante d'intgration a = ln( [ B ]0 [ A ]0 ) et l'quation devient :
[ A ]0 ([ B ]0 [ P ])
ln = ([ B ]0 [ A ]0 ) k t [1.15]
[ B ]0 ([ A ]0 [ P ])
[ A ]0 ([ B ]0 [ P ])
ou = e ([ B ] 0 [ A ] 0 ) k t [1.16]
[ B ]0 ([ A ]0 [ P ])
Un cas particulier de cette quation est intressant : si [ A ]0 est trs petit par
rapport [ B ]0 , alors, tout moment de la raction, [ P ] doit galement tre trs
petit par rapport [ B ]0 car [ P ] ne peut jamais tre plus grand que [ A ]0 . De cette
manire, ( [ B ]0 [ A ]0 ) et ( [ B ]0 [ P ] ) peuvent tous les deux tre assimils
[ B ]0 et l'quation [1.16] peut tre simplifie comme suit :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k [ B ] 0 t ) [1.17]
Cette quation a exactement la mme forme que l'quation [1.10], qui est l'quation
d'une raction du premier ordre. Cette situation est connue comme une raction de
pseudo-premier ordre, et k [ B ]0 est une constante de pseudo-premier ordre. Cette
situation se prsente si l'un des ractifs est le solvant, comme dans la majorit des
ractions d'hydrolyse, mais il est parfois utile de se placer dlibrment dans des
conditions de pseudo-premier ordre de manire simplifier l'valuation de la
constante de vitesse comme nous en discuterons au 3.8.
Les ractions trimolculaires comme A + B + C P n'impliquent habituellement
pas une seule tape trimolculaire, et ne sont donc pas des ractions d'ordre trois.
Inversement, ces ractions se droulent en deux ou plusieurs tapes lmentaires,
comme A + B X, suivi par X + C P. Si une des tapes est plus lente que
les autres, la constante de vitesse de la raction est trs proche de la constante de
vitesse de l'tape la plus lente, qui est alors dnomme l'tape limitante de la
raction. Si aucune tape n'est clairement limitante, l'quation de vitesse sera
vraisemblablement complexe et l'ordre de la raction ne correspondra pas
obligatoirement un nombre entier. Quelques ractions trimolculaires donne lieu
une cintique d'ordre trois, avec v = k [ A ][ B ][ C ] , o k est une constante de
troisime ordre, sans toutefois impliquer des collisions entre les trois ractifs qui
sont des vnements fondamentalement improbables. Dans un mcanisme deux
tapes, comme celui prsent ci-dessus, si la premire tape est en quilibre rapide,
la concentration de l'intermdiaire X peut tre exprime partir de la constante
d'quilibre : [ X ] = K [ A ][ B ] , o K est la constante d'quilibre pour la raction
entre A B, c'est--dire la constante d'association de X. La vitesse de la raction
correspond la vitesse de la seconde tape qui est donne par l'quation :
v = k' [ X ][ C ] = k' K [ A ][ B ][ C ] [1.18]
o k' est la constante de vitesse de second ordre pour la seconde tape. Ds lors, la
constante apparente de vitesse de troisime ordre correspond en ralit au produit
d'une constante de vitesse de second ordre et d'une constante d'quilibre.
On observe aussi quelques ractions d'ordre zro, c'est--dire des ractions qui ont
une vitesse constante, indpendante de la concentration de substrat. Une raction
peut tre d'ordre zro par rapport l'un des substrats, signifiant simplement que ce
ractif intervient dans la raction en aval de l'tape limitante. Cependant, quelques
ractions sont globalement d'ordre zro, c'est--dire qu'elles ne dpendent de la
concentration d'aucun ractif. Ce sont invariablement des ractions catalyses et
sont observes uniquement si chaque ractif est prsent en large excs de telle sorte
que le catalyseur a atteint son efficacit maximum. Les cintiques d'ordre zro sont
communment rencontres dans les ractions enzymatiques, lorsque la vitesse
approche sa valeur limite pour des concentrations leves de substrat.
1.2.4. Dtermination de l'ordre d'une raction
La manire la plus simple de dterminer l'ordre d'une raction consiste mesurer la

vitesse v pour diffrentes concentrations de substrat [ A ] . Ensuite, en traant le
graphique de log v en fonction de log [ A ] , on obtient une droite dont la pente est
gale l'ordre de la raction. Si les concentrations de tous les ractifs sont varies
dans un rapport constant, la pente du graphique donne l'ordre global de la raction.
Toutefois, il est utile de connatre l'ordre respectif pour chacun des ractifs qui peut
tre obtenu en modifiant indpendamment la concentration de chaque ractif et en
maintenant constante la concentration des autres. Dans ce cas, la pente de la droite
est prcisment gale l'ordre partiel de la raction pour le ractif dont la
concentration est prise comme variable. Par exemple, si la raction est du second
ordre en A et du premier ordre en B, la vitesse est donne par l'quation :
v = k [ A ]2 [ B ] [1.19]
qui peut galement s'crire :
log v = log k + 2 log [ A ] + log [ B ] [1.20]
Le graphique de log v en fonction de log [ A ] (dans des conditions o [ B ] est
maintenue constante) a une pente de 2, alors que le graphique log v en fonction
de log [ B ] (en maintenant [ A ] constant) a une pente de 1. Ces graphiques sont
illustrs la figure 1.2. Les caractristiques et l'allure de diffrents graphiques
pour les trois ordres diffrents de raction les plus communment rencontrs,
l'ordre 0, 1 et 2, sont prsentes dans le tableau 1.1.
Il est important de raliser que si les vitesses sont dtermines partir des courbes
d'volution de la raction (correspondant aux courbes de la variation de la concen-
tration d'un ractif en fonction du temps), la concentration de chaque ractif varie.
En consquence, pour obtenir des rsultats corrects, il est ncessaire soit de
maintenir la concentration des ractifs dans un rapport stchiomtrique constant,
permettant la dtermination de l'ordre global de la raction, soit (et c'est le cas le
plus courant) d'avoir les ractifs constants prsents en large excs au dbut de
la raction de telle sorte que la variation de leur concentration soit ngligeable.
0,4 log v a 0,4 log v b
0,2 0,2
Pente = 2 Pente = 1
0 0
0 0,2 0,4 log [A] 0 0,2 0,4 log [B]
1.2 - Dtermination de l'ordre de raction
Les droites sont traces pour une raction du second ordre (a) et du premier ordre(b),
impliquant que les pentes de ces droites valent respectivement 2 et 1.
Si aucune de ces alternatives n'est possible, la vitesse doit tre dtermine partir
de la pente au temps initial, c'est--dire dans des conditions de vitesses initiales.
Pratiquement, cette mthode est prfrable pour raliser les mesures cintiques de
ractions enzymatiques, car les courbes d'volution des ractions catalyses par des
enzymes n'obissent gnralement pas des quations simples de vitesse pour de
longues priodes de temps. La modlisation de la courbe complte d'volution
d'une raction enzymatique requiert souvent d'utiliser une quation plus complexe
que celle de la forme de l'quation intgre de vitesse pour des vitesses initiales, du
fait de la perte progressive d'activit de l'enzyme, d'inhibition par des produits ou
d'autres phnomnes.
1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse
L'analyse des quations aux dimensions est l'une des techniques les plus simples et
les plus fiables pour dtecter des erreurs algbriques et pour vrifier les rsultats
obtenus. Cette analyse dpend de quelques rgles simples qui rgissent la manire
de combiner des quantits de dimensions diffrentes, et son application repose sur
le fait que les erreurs algbriques conduisent frquemment des expressions dont
les dimensions sont inhomognes. On dfinit ainsi la dimension de concentration,
exprime en molarit (symbole M ou mol L1 ) et la dimension des vitesses de
raction (symbole M s1) Par consquent, dans une expression telle que v = k [ A ] ,
la constante de vitesse k doit tre exprime en s1 afin que les termes de gauche et
de droite de l'quation aient les mmes dimensions. Toutes les constantes de vitesse
du premier ordre ont des dimensions de temps1 , et par des raisonnements
similaires, on dmontre aisment que les constantes de vitesse du second ordre ont
les dimensions de concentration1 temps1 , que les constantes de vitesse de troi-
sime ordre ont les dimensions de concentration2 temps1 , et que les constantes
d'ordre zro ont les dimensions de concentration temps1 (tableau 1.1).
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE
Ordre 0 Ordre 1 Ordre 2
Equation de vitesse v0 = k v0 = k.[A] v0 = k.[A]2
3.103 3.103
v (M1. s1)
v (M1. s1)
4
v (M1. s1)
2.10
Graphique v
en fonction de [A] 2,5.103 2,5.103
1,5.104 3
2.10 2.103
Tableau 1.1 - Caractristiques de ractions d'ordre 0, 1 et 2

3
1.104 1,5.10 1,5.103
1.103 1.103
5.105 4
5.10 5.104
0 0
0.10 0 0,00006 0,0012 0.10 0 0,00006 0,0012 0.1000 0,00006 0,0012
[A] (M) [A] (M) [A] (M)
Dtermination de log v0 = log k log v0 = 1.log [A] + log k log v0 = 2.log [A] + log k
l'ordre de la raction
1 1 1
log v
log v
log v
Graphique log v 2 2 2
en fonction de log [A] 3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
6,5 4,5 2,5 6,5 4,5 2,5 6,5 4,5 2,5
log [A] log [A] log [A]
Dtermination de [A]t = [A]0 k.t ln [A]t = ln [A]0 k.t 1/[A]t = 1/[A]0 + k.t
la constante de vitesse
1.103 6.10
0
1.103
[A] (M)
ln [A]
1/[A] (M1)
0
Linarisation 1.10
3 8.10 1.10
3
du graphique [A] 4 1.100 4

en fonction du temps 8.10 8.10
0
4
1.10 4
6.10 6.10
1.100
4 4
4.10 4.10
2.100
4 4
2.10 2.10
0 2.10
0 0 0
0.10 2.10 0.10
0 3 6 0 3 6 0 3 6
Temps (s) Temps (s) Temps (s)
Unit de la M.s1 s1 M1.s1
constante de vitesse
17
La connaissance des dimensions des constantes de vitesse permet de vrifier trs

facilement l'exactitude des quations : la partie gauche et la partie droite de toute
galit (ou ingalit) doivent avoir les mmes dimensions et tous les termes d'une
somme doivent avoir les mmes dimensions. Par exemple, si le terme (1 + t) fait
partie d'une quation, o t a la dimension du temps, alors, en toute rigueur, l'qua-
tion est incorrecte, mme si la valeur de 1 correspond un temps dont la valeur
numrique est 1. Plutt que de mlanger de cette manire des constantes et des
variables dimensionnelles dans une quation, il est prfrable d'crire l'unit aprs
le nombre, par exemple (1s + t), o d'attribuer un symbole la constante, par
exemple (t0 + t). Bien que chacune de ces alternatives paraisse plus lourde que
l'expression (1 + t), elles vitent toute possibilit de confusion. L'quation [7.17]
( 7.6.1) reprsente un cas dans lequel cette pratique est parfaitement justifie.
Des quantits de dimensions diffrentes peuvent tre multiplies ou divises mais
ne peuvent tre ni additionnes ni soustraites. Ainsi, si k1 est une constante de
vitesse du premier ordre et si k2 est une constante de vitesse du second ordre, une
affirmation telle que k1 >> k2 est aussi dpourvue de sens que l'affirmation
5 g >> 25C. Cependant, une constante de vitesse de pseudo-premier ordre comme
k 2 [ A ] a les dimensions de concentration1 temps1 concentration, c'est--dire de
temps1, et a ds lors les dimensions d'une constante de vitesse de premier ordre.
Dans ce cas, il est correct de comparer cette constante de pseudo-premier ordre
avec d'autres constantes de vitesse du premier ordre.
Un autre principe important de l'analyse aux dimensions est de ne jamais utiliser
une quantit ayant une dimension comme un exposant, ni d'en prendre le
logarithme. Par exemple, e k t est autoris, condition que k soit une constante de
premier ordre, mais e k t ne l'est pas. Une exception apparente la rgle est celle
qui, pour des raisons pratiques, consiste prendre le logarithme de ce qui apparat
tre une concentration. Par exemple, le pH est souvent dfini comme log [H +]
(bien qu'en toute rigueur, le pH est dfinit partir de l'activit du proton et non
partir de sa concentration molaire). Cette dfinition qui n'est pas strictement
correcte reprsente une simplification de la dfinition plus rigoureuse qui consiste
dfinir le pH comme le rapport log ([H +]/[H +]), o [H +] est la valeur de [H +]
dans l'tat standard, c'est--dire pH = 0. Comme [H +] a une valeur numrique de
1, ce terme est habituellement omis de la dfinition. Dans tous les cas o, comme
dans l'exemple prcdent, on prend le logarithme d'une quantit ayant une
dimension, un tat standard est toujours impliqu dans la dfinition, qu'il soit
prcis explicitement ou non (voir galement la dfinition des constantes
d'quilibre au chapitre 2).
L'analyse des dimensions est particulirement utile comme un moyen de se rappeler
les pentes et les ordonnes l'origine de graphiques communment utiliss : toute
intersection avec un axe doit avoir les mmes dimensions que la variable qui est
porte le long de cet axe, alors que la pente a toujours les dimensions de l'ordonne
(y) divises par celles de l'abscisse (x). Ces rgles sont illustres dans la figure 1.3.
y La pente = Dy/Dx
a les dimensions de y/x
Dy
Dx
L'intersection avec l'axe
des x a les dimensions de x
L'ordonne l'origine
a les dimensions de y
x
1.3 - Application de l'analyse aux dimensions dans un graphique
1.2.6. Les ractions rversibles
De nombreuses ractions sont rversibles et les deux sens de la raction doivent

tre introduits dans l'quation de vitesse :
k1
A P [1.21]
k 1
Ainsi, dans le cas o [ P ]0 = 0 , nous pouvons crire :
d[ P ]
v = = k1([ A ]0 [ P ]) k 1 [ P ] = k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] [1.22]
dt
Cette quation diffrentielle est exactement de la mme forme que l'quation [1.5],
et peut tre rsolue de la mme manire :
d[ P ]
k [ A ] ( k + k )[ P ] = dt [1.23]
1 0 1 1
ln ( k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] )
Donc = t +a [1.24]
( k1 + k 1 )
ln( k1 [ A ]0 )
Si nous posons que [ P ] = 0 quand t = 0, nous obtenons que a = ,
( k1 + k 1 )
et l'quation suivante :
k [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ]
ln 1 = ( k1 + k 1 )t [1.25]
k1 [ A ]0
En prenant l'exponentielle des deux cts, nous obtenons l'quation :
k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ]
= e ( k 1 +k 1 ) t [1.26]
k1 [ A ]0

k1 [ A ]0 ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t )
[P] = = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) [1.27]
k1 + k 1
o [ P ] = k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 ) est la valeur de [ P ] aprs un temps infini, c'est--
dire l'quilibre. Cette valeur dcoule du fait que le terme exponentiel tend vers
zro quand t devient grand.
1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre
De trs nombreuses ractions sont du premier ordre pour chacun des ractifs et,
dans ces cas, il est souvent possible de raliser les mesures dans des conditions de
pseudo-premier ordre en maintenant en large excs la concentration de tous les
ractifs sauf un. Ainsi, dans de nombreuses situations exprimentales, le problme
de la dtermination d'une constante de vitesse peut-il tre rduit au problme de la
dtermination d'une constante de vitesse de premier ordre. Nous avons vu dans
l'quation [1.10] que pour une raction simple de premier ordre :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t ) [1.28]
et dans l'quation [1.27], que dans le cas plus gnral d'une raction rversible :
[ P ] = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) [1.29]
De cette manire [ P ] [ P ] = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t [1.30]

et donc ln ([ P ] [ P ]) = ln [ P ] ( k1 + k 1 )t [1.31]
Un graphique de ln([ P ] [ P ]) en fonction de t donne une droite de pente
(k1 + k1). Avant l'avnement des calculatrices de poche, cette quation tait
couramment exprime en termes de logarithmes en base 10 :
( k1 + k 1 )t
log ([ P ] [ P ]) = log [ P ] [1.32]
2 , 303
Le graphique log([ P ] [ P ]) en fonction de t donne une droite dont la pente
vaut (k1 + k1)/2,303.
GUGGENHEIM (1926) a soulev une objection majeure l'utilisation de ce
graphique, savoir que la dtermination de la constante de vitesse dpend trs
fortement de la prcision de la mesure de [ P ] . Dans le cas gnral d'une raction
rversible, o [ P ] [ A ]0 , une valeur prcise de [ P ] est difficile obtenir, et
mme dans le cas particulier d'une raction irrversible o [ P ] = [ A ]0 , la
concentration instantane en A au temps zro peut tre difficile mesurer avec
prcision. GUGGENHEIM a suggr de mesurer deux ensembles de valeurs [ P ]i et
[ P ]i ' aux temps ti et ti', tel que ti' = ti + t o t est une constante. Ainsi, partir de
l'quation [1.30], nous pouvons crire les deux quations suivantes :
[ P ] [ P ]i = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t i [1.33]
( k 1 +k 1 )( t i +t )
[ P ] [ P ]i ' = [ P ] e [1.34]
Par soustraction, nous obtenons :
[ P ]i ' [ P ]i = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) e ( k 1 +k 1 ) t i [1.35]
et en prenant les logarithmes, nous obtenons :
ln ([ P ]i ' [ P ]i ) = ln [ P ] + ln ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) ( k1 + k 1 )ti [1.36]
que nous pouvons galement crire :
( k1 + k 1 )ti
log ([ P ]i ' [ P ]i ) = constante [1.37]
2 , 303
Ainsi, un graphique de log([ P ]i ' [ P ]i ) en fonction de t donne une droite dont la
pente vaut (k1 + k1)/2,303, comme illustr dans la figure 1.4. Ce graphique,
connu sous le nom de graphique de GUGGENHEIM, ne ncessite pas l'estimation de
[ P ] . Puisque le rapport k1/k1 est gal la constante d'quilibre, qui peut tre
estime indpendamment, les valeurs des constantes individuelles de vitesse k1 et
k1 peuvent tre calcules partir des deux combinaisons.
log ([P'i ] [Pi ])
1,6
Pente = (k1 + k1)/2,303
1,4
1,2
0,8
0,6
0,4
0 5 10 15 20 Temps (min)
1.4 - Le graphique de GUGGENHEIM
Ce graphique permet de dterminer la valeur d'une constante de vitesse de premier ordre
sans la ncessit de dterminer prcisment l'tat d'avancement de la raction l'quilibre
([ P ]). Les symboles sont dfinis comme suit : [ P ]i et [ P ]i', concentration du produit
respectivement, aux temps t et t + t, o t est une constante.
Le graphique de GUGGENHEIM est insensible aux dviations des cintiques par

rapport aux cintiques de premier ordre, c'est--dire qu'il peut avoir une apparence
linaire mme si les cintiques n'obissent pas une dpendance de premier ordre.
Le mme commentaire s'applique au graphique apparent de KZDY-SWINBOURNE,
qui est le sujet du problme [1.3].
A ct des mthodes de linarisation et de traitement graphique des rsultats qui
restent trs utiles aux points de vue conceptuel et pdagogique, l'avnement de la
micro-informatique a progressivement transform et amlior l'analyse des donnes

cintiques. L'utilisation notamment de la mthode des moindres carrs pour l'ajus-
tement paramtrique sur des quations linaires et non-linaires est aujourd'hui trs
largement rpandue (voir par exemple CORNISH-BOWDEN, 1995). De nombreux
logiciels commerciaux permettent de traiter un grand nombre de cas. La dtermi-
nation des paramtres d'une courbe d'apparition exponentielle du produit d'une
raction peut tre facilement ralise par ajustement d'une courbe de [ P ] en fonc-
tion du temps, t, l'aide de l'quation non-linaire [1.29] figure 1.5. De manire
gnrale, il est prfrable d'utiliser ces mthodes d'ajustement afin d'obtenir la
meilleure estimation des paramtres recherchs mais galement une indication de
la qualit de ces valeurs (dviation standard). Bien que des remarques de ce type
s'appliquent au traitement de nombreux cas abords dans la suite de ce manuel et
que nous mentionnions l'occasion l'importance d'utiliser les procdures d'ajus-
tement paramtriques non-linaires, nous prsenterons gnralement les mthodes
de reprsentation graphiques qui sont plus didactiques. Une discussion dtaille des
problmes d'estimation des meilleurs paramtres ne faisant pas partie des objectifs
de ce manuel, nous renvoyons les lecteurs intresss vers des ouvrage plus
spcialiss (CORNISH-BOWDEN, 1995).
[P] (M) 35
30
25
20
15
10
0
0 1 2 3 4 5 Temps (s)
1.5 - Ajustement paramtrique non-linaire d'une courbe de [ P ] en fonction du temps
Un programme d'ajustement paramtrique utilisant la mthode des moindres carrs a t
utilis pour modliser les points exprimentaux sur l'quation [1.29]. Cette procdure a
fourni les paramtres suivants : [ P ] = 25,6 0,7 mM et k = 0,95 0,09 s1 qui ont t
utiliss pour tracer la ligne continue qui reprsente donc la meilleure courbe passant par
les points exprimentaux.
PROBLMES
1.1 - Les donnes du tableau suivant ont t obtenues pour la vitesse d'une
raction de stchiomtrie A + B P diffrentes concentrations de A
et de B. Dterminez l'ordre de la raction par rapport A et B et
suggrez une explication pour l'ordre observ pour A.
[ A ] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100

[ B ] (mM) 10 10 10 10 20 20 20 20
v (mol1 s1) 0,6 1,0 1,4 1,9 1,3 2,0 2,9 3,9
[ A ] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100

[ B ] (mM) 50 50 50 50 100 100 100 100
v (mol1 s1) 3,2 4,4 7,3 9,8 6,3 8,9 14,4 20,3
1.2 - Vrifiez les affirmations suivantes concernant les dimensions en suppo-

sant que t reprsente le temps (s), v et V reprsentent des vitesses (M s1
ou mol L1 s1), et [ A ] , [ P ] et Km reprsentent des concentrations (M) :
a - Dans un graphique de v en fonction de V / [ A ] , la pente vaut 1/Km
et l'ordonne l'origine vaut Km /V.
b - Dans une raction bimolculaire 2 A P, caractrise par la
constante de vitesse k, la concentration de P au temps t est donne
2
par [ P ] = [ A ]0 k t / ( 1 + 2[ A ]0 k t ) .
t [ A ]0 [ A ]
c - Dans un graphique de en fonction de
ln([ A ]0 / [ A ]) ln ([ A ]0 / [ A ])
pour une raction catalyse par un enzyme donne une droite dont la
pente vaut 1/V et dont l'ordonne l'origine vaut V/Km.
1.3 - KZDY, JAZ et BRUYLANTS (1958) et S WINBOURNE (1960) suggrrent

indpendamment une alternative au graphique de GUGGENHEIM, drive
partir des quations [1.29] et [1.30] en divisant l'une par l'autre. Montrer
que l'expression rsultante pour ([ P ] [ Pi ]) ([ P ] [ Pi ' ]) peut tre
rarrange de telle sorte que le graphique de [ Pi ' ] en fonction de [ Pi ]
donne une droite. Quelle est la pente de cette droite ? Si plusieurs
graphiques sont tracs partir des mmes donnes mais pour diff-
rentes valeurs de t, quelles sont les coordonnes du point d'intersection
de ces droites ?
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA
THORIE DES VITESSES ABSOLUES
2.1. LA THERMODYNAMIQUE ET SES LIMITES
Dans le premier chapitre, nous avons discut de ltude de la cintique des

ractions, dans le second nous allons nous intresser aux relations qui existent entre
la cintique et la thermodynamique ; ces relations constituent la base de la thermo-
cintique. Lanalyse thermodynamique est une mthode extrmement puissante
pour obtenir des informations dtailles sur le fonctionnement des systmes bio-
logiques quil est souhaitable dexploiter dans ltude du mcanisme daction des
enzymes. Une premire connexion entre les mesures cintiques et les mesures
lquilibre repose sur le concept de potentiel chimique dvelopp par Josiah
Willard GIBBS (1878). Une seconde connexion rside dans la thorie de la vitesse
absolue dune raction. Lapplication de ces relations permet dtablir le profil
dnergie de GIBBS dune raction qui est un outil trs utile pour lanalyse du
mcanisme des ractions enzymatiques. Avant de dcrire plus en dtail ces
concepts, il est ncessaire de rappeler quelques principes fondamentaux de
thermodynamique qui nous seront utiles. Une prsentation dtaille de lanalyse
thermodynamique ne fait toutefois pas partie des objectifs de ce livre et nous
renvoyons plusieurs ouvrages de rfrence dans ce domaine (EISENBERG et
CROTHERS, 1979 ; OTURAN et ROBERT, 1997 ; ATKINS et DE PAULA, 2001), les
tudiants qui souhaitent sassurer de leurs connaissances ou les approfondir.
La thermodynamique est une branche de la chimie physique qui permet de dcrire,
un niveau macroscopique, la matire et les changements physiques et chimiques
quelle subit. Cette description repose sur une reprsentation simplifie de la ralit
(un modle) et sur un nombre restreint de lois. Un tre vivant est le sige de
modifications physiques et chimiques continuelles qui impliquent des changes
dnergie et de matire. Pour un biologiste, il est essentiel de comprendre les
mcanismes de ces changes. Comme nous allons en discuter, lanalyse thermo-
dynamique des systmes biologiques est principalement oriente vers ltude des
quilibres et la dfinition de relations entre les proprits dun systme, mais elle
permet galement de dterminer le sens des ractions dans des systmes qui ne sont
pas lquilibre et de caractriser des processus irrversibles. La thermodynamique
a nanmoins des limites ; elle ne nous informe ni sur la rapidit dune raction, ni
sur la manire dont une raction se droule (interactions molculaires). Pour
obtenir ces informations, il faut avoir recours des tudes cintiques dans
lesquelles on observe lvolution du systme au cours du temps. Les tudes
cintiques fournissent une mesure de la vitesse laquelle une raction sapproche
de son tat dquilibre ou sen carte si la raction est couple une seconde
raction. Les deux approches sont donc complmentaires et doivent tre exploites
conjointement dans ltude des ractions enzymatiques.
2.2. CONCEPTS GNRAUX DE LA THERMODYNAMIQUE
2.2.1. tats du systme
Dans toute tude, il est toujours ncessaire de dfinir lobjet qui est tudi.
En thermodynamique, la partie de lunivers qui est tudie est appele le systme,
alors que la partie restante est appele lenvironnement. Le systme est dfini en
fonction de ltude raliser et des objectifs recherchs. Un tre vivant ou une
cellule peuvent reprsenter un systme. Une cellule vivante renferme une grande
quantit denzymes diffrentes et donc, dans le cas de ltude de ractions
enzymatiques, la cellule constitue un systme dans lequel les ractions se droulent
dans un espace spar du reste du monde par la membrane plasmique de la cellule.
Le systme correspond lespace occup par les substrats, les enzymes et les
produits. Dans les tudes in vitro, le systme peut ainsi se rduire au tube essai ou
la cuve du spectromtre contenant la solution de substrat et denzyme.
La dfinition dun systme thermodynamique implique galement de dfinir les
proprits de ses frontires. La nature des changes entre le systme et son
environnement permet de distinguer diffrents types de systmes :
les systmes ouverts permettent des changes de matire et dnergie ;
les systmes ferms permettent des changes dnergie mais pas de matire ;
les systmes isols ne permettent aucun change.
Univers
Environnement
Systme
2.1 - Description thermodynamique de lunivers

2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES 27
Ltat dun systme thermodynamique est dcrit par un nombre restreint de

proprits ou variables dtat qui sont caractristiques du systme au moment de la
mesure et sont indpendantes du chemin qua suivi le systme pour atteindre cet
tat. Certaines de ces proprits sont des grandeurs intensives comme la tempra-
ture ou la concentration, alors que dautres sont des grandeurs extensives comme le
volume, la masse ou lnergie. Un systme est dans un tat dfini lorsque toutes les
proprits qui le caractrisent ont des valeurs dfinies. Diffrents types dtat
peuvent tre dfinis. Selon que le systme est travers ou non par un flux de
matire ou dnergie, on distingue :
ltat dquilibre, si les proprits du systme sont indpendantes du temps et si
aucun flux de matire ou dnergie ne traverse le systme ;
ltat de non-quilibre stationnaire si le systme est travers par un flux de
matire ou dnergie mais que les proprits du systme ne changent pas au cours
du temps ;
ltat de non-quilibre non-stationnaire si les changes dnergie et de matire
sont importants et rapides (cest habituellement ltat du systme pr-stationnaire
rencontr dans les tudes de cintique rapide).
2.2.2. Un processus est un vnement au cours duquel

une proprit du systme change
Ltat dun systme macroscopique lquilibre peut tre dfini par un nombre
restreint de proprits. Si le systme change dtat, son nouvel tat est caractris par
un nouvel ensemble de proprits et le passage dun tat lautre implique quune ou
plusieurs des proprits du systme varient. En thermodynamique, un processus est
dfini comme la variation dune des proprits du systme. Quand de la chaleur, du
travail ou de la matire sont changs entre le systme et son environnement, le
systme volue de son tat dquilibre initial vers un nouvel tat dquilibre.
Il faut distinguer les changements rversibles et les changements irrversibles. Un
processus rversible se droule en passant par une succession dtats dquilibre,
chacun diffrant du prcdent par une modification infinitsimale dune des
proprits du systme. Par contre, si le changement est opr de manire brutale et
entrane une grande variation dune des proprits, le processus est irrversible.
Considrons deux processus, lun rversible et lautre irrversible, caractriss par
les mmes tats initiaux et finaux. Dune part, ces deux processus sont similaires
puisque les proprits initiales et finales de chacun de ces systmes sont identiques.
Par contre, ils sont diffrents parce que les quantits changes de chaleur et de
travail au cours des ces deux processus sont diffrentes. La chaleur et le travail
dpendent du chemin suivi par le systme au cours de sa transformation. Si le
processus est rversible, le systme est constamment lquilibre et toutes les
proprits restent uniformes pendant la raction. Si le processus est irrversible,
certaines proprits, comme la temprature ou la pression, ne sont pas uniformes
dans le systme et nont pas de valeur bien dfinie jusqu ce que le systme ait
atteint sont nouvel tat dquilibre. De nombreux processus naturels sont
irrversibles dans le sens o le systme ne peut tre ramen son tat de dpart
quen fournissant de lnergie partir dun autre systme. Il faut noter que
lirrversibilit au sens thermodynamique ne signifie pas que le systme ne puisse
pas retourner son tat initial, mais simplement que ce retour ncessite un apport
dnergie.
2.3. LES LOIS DE LA THERMODYNAMIQUE
2.3.1. Loi de conservation de lnergie
La conservation de lnergie est un principe universel. La premire loi de la

thermodynamique stipule que lnergie totale dun systme et de son environnement
est une constante ou en dautres termes que lnergie est conserve. Les variations
dnergie rsultent de la somme de lnergie ajoute sous forme de travail et sous
forme de chaleur. La premire loi peut donc tre exprime par lquation :
dE = E f E0 = dq + dw [2.1]
o E0 est lnergie du systme dans son tat initial, Ef est lnergie du systme dans
son tat final, dq est la quantit dnergie change sous la forme de chaleur et dw,
celle change sous la forme de travail. Lnergie est une proprit du systme qui
dpend uniquement de ltat initial et de ltat final du systme et qui est
indpendante du chemin suivi. Inversement, le travail et la chaleur sont des moyens
de transfrer lnergie et dpendent du chemin suivi lors de lvolution du systme.
La dfinition la plus simple de la chaleur est la capacit modifier la temprature
dun objet. Si nous considrons, par exemple, quun systme absorbe de la chaleur
partir de lenvironnement, cela se traduit par une augmentation de la temprature
du systme qui peut tre mesure trs prcisment. Si dT est laugmentation de
temprature, la chaleur absorbe par le systme est donne par :
dq = C dT [2.2]
o C est une constante caractristique du systme, appele la capacit de chaleur.
Par dfinition, la capacit de chaleur dune substance est la quantit de chaleur
ncessaire pour lever la temprature dune mole de substance de un degr. Elle est
gnralement dfinie volume constant (CV) ou pression constante (Cp),
E
CV = [2.3a]
T V
E
Cp = [2.3b]
T p
Pour un gaz parfait, ces deux paramtres sont relis par lquation suivante :
C p CV = n R [2.4]
o n est le nombre de moles et R est la constante des gaz parfaits.
Par convention, des valeurs positives sont attribues aux variations dq et dT lorsque
la chaleur est absorbe par le systme. Pour le travail, qui peut tre effectu par le
systme sur lenvironnement ou sur le systme par lenvironnement, dw est positif
lorsque le travail est effectu sur le systme par lenvironnement. Un travail positif
correspond ainsi un flux dnergie vers le systme. La diffrence majeure entre la
chaleur et le travail rside dans les chelles des mouvements travers la frontire
du systme. Le travail correspond des mouvements qui sont organiss lchelle
macroscopique alors que la chaleur correspond des mouvements lchelle
molculaire qui ne prsentent aucune organisation lchelle macroscopique.
Lquation [2.1] indique que lorsquil y a un dsquilibre entre travail et chaleur, le
systme volue dune faon mesurable. Par exemple, si le systme fournit plus de
travail quil ne reoit de chaleur, lnergie du systme est progressivement
consomme (E diminue). Inversement, si le systme reoit plus dnergie sous
forme de chaleur quil n'en dpense sous forme de travail, la temprature du
systme augmente. Une faon simple et courante dobtenir des informations sur les
variations dnergie dun systme consiste mesurer la variation de chaleur. Nous
avons vu que la variation dnergie dE est une diffrentielle exacte, cest--dire
quelle ne dpend que des tats initiaux et finaux du systme, alors que les
variations dq et d w sont des diffrentielles inexactes qui sont dpendantes de la
manire selon laquelle les modifications seffectuent. Dans des cas simples, il est
possible de montrer que la variation de chaleur dpend uniquement des tats
initiaux et finaux. Par exemple, si lon considre uniquement un travail mcanique
se droulant volume constant, la variation de chaleur est gale la variation
dnergie. Par contre, si la raction se droule pression constante, le travail est
donn par dw = pdV et lquation de conservation scrit :
dE = dq p dV [2.5]
Une nouvelle variable dtat, lenthalpie, est dfinie pour reprsenter la quantit de
chaleur change pression constante :
H = Q p = E + pV [2.6]
Le terme pdV na une grandeur significative que pour des ractions impliquant des
gaz ou pour des ractions seffectuant des pressions extrmement leves.
En biochimie, il est donc courant dassimiler dH dQp et puisquil est plus facile
de mesurer une variation de la quantit de chaleur pression constante plutt qu
volume constant, la variation denthalpie est une grandeur couramment utilise
pour suivre lvolution des systmes biologiques.
Dans lanalyse thermodynamique, il est particulirement important de considrer

les systmes cycliques puisquils permettent de reprsenter le fonctionnement des
machines, y compris des machines molculaires que sont les enzymes. Dans un
processus cyclique, une srie de ractions successives ramne le systme dans son
tat initial. Dans ce cas, toutes les proprits doivent retourner leur valeur initiale.
Par exemple, la somme des variations dnergie du systme pour toutes les tapes
dun cycle doit tre gale zro :
DE = 0 [2.7]
cycle
Par contre, la chaleur et le travail ntant pas des variables dtats, la somme de ces
grandeurs ne doit pas obligatoirement tre gale zro, ce que nous pouvons
exprimer par les deux quations suivantes :
w 0 [2.8a]
cycle
q 0 [2.8b]
cycle
2.3.2. La dfinition de lentropie et du critre de spontanit
Le premier principe de la thermodynamique tablit que lnergie est conserve lors

dune raction, cependant il ne dfinit pas le sens spontan de la raction. Certaines
ractions se droulent spontanment malgr un DE > 0, en absorbant de la chaleur
partir de lenvironnement. Un critre de spontanit est fourni par la deuxime loi
de la thermodynamique qui utilise une nouvelle proprit introduite par Rudolf
CLAUSIUS en 1850 : lentropie. Lentropie est souvent prsente comme une
mesure du dsordre dun systme, qui augmente lorsque le dsordre du systme
augmente. La deuxime loi de la thermodynamique stipule quun systme isol
volue jusqu atteindre un tat dquilibre caractris par un tat de dsordre
maximal et donc une valeur maximale dentropie. Dans un systme ouvert, un
processus a lieu spontanment, uniquement si lentropie de lunivers, donne par la
somme des entropies du systme et de lenvironnement, augmente au cours du
processus en accord avec lingalit suivante :
DS systme + DS environnement 0 [2.9]
Selon lquation [2.9], lentropie du systme peut diminuer au cours dun

processus spontan condition que lentropie de lenvironnement augmente de
sorte que la somme des variations soit positive. Par exemple, la formation dune
structure biologique hautement organise, implique une diminution de lentropie,
mais ce processus est possible uniquement sil saccompagne dune augmentation
de lentropie de lenvironnement.
Lentropie a t introduite sur la base de lanalyse du rendement d'un moteur
thermique. Dans un moteur thermique, une quantit de chaleur passe dun rservoir
chaud vers un rservoir froid. Au cours de ce processus, une partie de la chaleur est
convertie en travail. Il peut tre dmontr que le rendement maximum dun moteur
est atteint si le transfert de chaleur se fait dans des conditions rversibles dun point
de vue thermodynamique et la variation dentropie pour chaque tape est alors
dfinie comme :
dq rev
dS = [2.10]
T
o dqrev reprsente la variation de chaleur si le processus se droule de manire
rversible. Lentropie est une proprit du systme, et donc la variation dentropie
au cours dun processus, comme la variation dnergie (quation [2.1]), dpend
uniquement de ltat initial et de ltat final du systme :
dS = S f S0 [2.11]
o S0 et Sf reprsentent respectivement lentropie du systme dans son tat initial et
dans son tat final.
2.3.3. La dfinition statistique de lentropie
La relation quantitative entre lentropie et le dsordre a t tablie pour la premire

fois par BOLTZMANN. Les molcules dun mme chantillon peuvent stocker une
mme quantit dnergie de diffrentes manires. Le nombre de faons diffrentes
de rpartir une mme quantit dnergie dans un tat donn du systme est appel
la dgnrescence, . BOLTZMANN a dmontr que lentropie est relie la
dgnrescence par lquation :
S = kB logw [2.12]
o kB est la constante de BOLTZMANN, qui est relie la constante des gaz (R) et au
nombre dAVOGADRO (NA) par
kB = R [2.13]
NA
Un systme volue donc spontanment vers ltat pour lequel la dgnrescence est
maximale.
En accord avec la dfinition de BOLTZMANN, un systme dont la dgnrescence
vaut 1 a une entropie gale zro. Il devient alors possible de mesurer lentropie
sur une chelle absolue en posant que lentropie dun systme parfaitement
ordonn (par exemple, un cristal parfait) a une valeur se rapprochant de zro
lorsque la temprature se rapproche de zro :
lim S = 0 [2.14]
T 0K
Ce principe est souvent appel la troisime loi de la thermodynamique.

2.3.4. Lentropie dans les systmes vivants et les ractions couples
Conformment la deuxime loi de la thermodynamique, lentropie 1 est relie

lorganisation du systme et est donc directement lie lvolution du systme. Par
exemple un cristal est caractris par une entropie faible, quasiment nulle, parce
que les atomes sont organiss entre eux dans lespace. Lorsquil y a vaporation
partir du cristal, chaque atome acquiert la possibilit doccuper diffrentes posi-
tions dans lespace et donc lentropie du systme augmente. Pour quun processus
puisse se drouler spontanment, il faut que DS > 0.
Dans un systme biologique, une augmentation du dsordre, et donc de lentropie,
conduit la mort biologique, suggrant que toute cette thorie ne fonctionne pas.
En ralit, les systmes biologiques ne sont pas des systmes lquilibre, mais des
systmes ouverts o chaque processus est associ une augmentation globale de
lentropie de lunivers. Les enzymes nchappent pas ce principe sine qua non de
la vie cellulaire: ils utilisent lentropie de lunivers pour diminuer lentropie de la
cellule. Ce principe de base est galement central dans le fonctionnement des
systmes coupls, o une diminution dentropie associe une organisation
molculaire peut tre compense par laugmentation dentropie associe une
autre raction.
2.3.5. Lnergie de GIBBS
En pratique, lutilisation de lentropie comme critre de spontanit pose un

problme puisque cette proprit nest pas facilement mesurable et que son
utilisation ncessite de dterminer la fois la variation dentropie du systme et
celle de son environnement. Il est prfrable de dfinir le sens spontan dvolution
dun processus partir dune proprit intrinsque du systme. Ces difficults sont
vites en utilisant une proprit thermodynamique galement introduite par
J.W. GIBBS : lnergie libre ou nergie de GIBBS. Si nous combinons la premire et
la deuxime loi :
Premire loi : dq rel = dE + p dV [2.15]
Deuxime loi : dq rev = T dS [2.16]
et si nous tenons compte du fait quun processus spontan se caractrise par
dq rev dq rel , nous obtenons lquation suivante en substituant lquation [2.16]
dans lquation [2.15] :
dE + p dV T dS 0 [2.17]
1. Une relation peut galement tre tablie entre linformation contenue dans un
systme et son entropie. Linformation rduit lincertitude concernant la ralisation
dun vnement et donc constitue une forme dorganisation du systme. Par
exemple, linformation contenue dans un texte provient de la disposition prcise
des caractres. Linformation peut tre considre comme une forme dnergie que
lon appelle lentropie ngative ou ngentropie du systme (SCHRDINGER, 2000).
Comme nous lavons vu prcdemment, pression constante, dE + p dV = dH , et

donc nous pouvons dfinir une nouvelle proprit du systme, que est appele
lnergie de GIBBS :
G = H TS = E + pV TS [2.18]
La variation dnergie de GIBBS, dfinie comme la diffrence entre lnergie de
GIBBS des produits et lnergie de GIBBS des ractifs, est une proprit qui dpend
uniquement du systme et qui permet de dterminer le sens spontan dune raction.
dGT , p = dHT , p TdST , p = dE + p dV TdS 0 [2.19]
Le systme volue spontanment vers ltat pour lequel lnergie de GIBBS est la
plus basse ; si dans le sens dfini de la raction la variation du DG est ngative, la
raction sera spontane dans ce sens. Par exemple, si DG = GP GA < 0, la raction
de la figure 1.1 volue spontanment de la gauche vers la droite. La mesure de la
variation dnergie de GIBBS fournit donc un critre de spontanit de la raction
dans des conditions donnes.
2.3.6. Le potentiel chimique :

Lnergie de GIBBS dun solut dpend de sa concentration
Une caractristique essentielle de lnergie de GIBBS est que sa valeur pour un

composant donn du systme dpend de la quantit de ce compos qui est prsente
dans le systme. Pour rendre compte de cette dpendance J.W. GIBBS a introduit la
notion de potentiel chimique, qui, pour la substance i, correspond la drive
partielle de lnergie de GIBBS du systme par rapport au nombre de moles de ce
compos i (ni) :
G
= mi [2.20]
ni p ,T ,n
j
Cette quation montre que pour des valeurs constantes de pression p, de

temprature T et du nombre de moles de tout composant j, nj :
G = ni mi [2.21]
i
Ces quations [2.20] et [2.21] indiquent clairement que lnergie de GIBBS du

systme augmente lorsque la quantit de la substance i, prsente dans le systme,
augmente. Aprs avoir ajout la substance au systme, celle-ci va se distribuer dans
lensemble du systme de telle sorte quaucune partie du systme ne soit un
potentiel plus lev quune autre partie. En consquence, lquilibre, le potentiel
chimique dune substance doit tre le mme dans lensemble du systme.
Puisquun systme volue vers ltat caractris par une nergie de GIBBS
minimum, lhomognisation du potentiel chimique au sein du systme explique
que les molcules dun solut se dplacent dune rgion de haute concentration
vers une rgion de faible concentration. Lnergie de GIBBS telle que nous lavons
utilise jusqu prsent est une grandeur extensive, puisquelle dpend du nombre
de moles de la substance prsent dans lchantillon. Le potentiel chimique au
contraire est une grandeur intensive: il nous renseigne sur la faon dont lnergie
de GIBBS varie par mole de substance ajoute au systme.
En enzymologie, nous sommes principalement intresss par le comportement des
solutions. La thermodynamique des solutions est dtermine par la manire dont
lnergie totale de GIBBS ou les potentiels chimiques de chaque composant dpendent de
la composition. Il est habituel de dfinir une solution idale comme une solution pour
laquelle lnergie de GIBBS de chacun des soluts dpend de sa fraction molaire :

Gi = ni Gi + ni RT lnX i [2.22]

o Gi est lnergie de GIBBS molaire de la substance pure et Xi est sa fraction molaire.
Comme dans une solution suffisamment dilue, la fraction molaire est proportionnelle
la concentration, lnergie de GIBBS de chaque solut est donne par :
C
Gi = ni Gi + ni RT ln i [2.23]
C
o Gi est lnergie de GIBBS par mole dans ltat standard, cest--dire dans des
conditions dfinies de pression (1 atm), de temprature (298 K) et de concentration
(C = 1 mole par litre). Cette dernire quation indique que lnergie de GIBBS
dune substance dissoute dpend non seulement du nombre de moles n, mais
galement de la concentration C de la substance dissoute. Lquation [2.24],
obtenue en combinant les quations [2.20] et [2.23], montre que le potentiel
chimique dpend de la concentration :
C
mi = mi + RT ln i [2.24]
C
Dans cette quation, Ci est la concentration molaire du compos i et mi est son
potentiel chimique dans des conditions standard (Ci = 1 M).
Dans le cas de molcules portant des charges lectriques Z, on utilise le potentiel lectrique,
y, qui, combin avec le potentiel chimique, donne le potentiel lectrochimique, mi ,
C
m i = m i + RT ln i + ZFy [2.25]
C
o F est la constante de FARADAY dont la valeur est : 96 480 J mol1 V1.
2.3.7. Relation entre la constante dquilibre

et la variation dnergie de GIBBS
Pour une raction chimique limite par un quilibre, comme par exemple la
raction disomrisation simple de A en P,
k1
A P [2.26]
k1
le potentiel chimique de chacun des constituants du systme est donn par

lquation [2.24] et la variation dnergie de GIBBS est donne par la diffrence
entre les potentiels chimiques des produits et des ractifs :
DG = mP m A
[P] [ A]
= ( mP + RT ln ) ( m A + RT ln ) [2.27]
C C
[P]
= ( mP m A ) + RT ln
[ A]
o ( mP m A ) = DG reprsente la variation dnergie de GIBBS du systme dans
des conditions standards. Le rapport de concentration entre le produit et le substrat,
[ P ] / [ A ] est appel le rapport daction de masses et est dsign par la lettre
grecque G :
[P]
G = [2.28a]
[A]
qui pour une raction impliquant des coefficients stchiomtriques diffrents de un
scrit :
[P] p
G = [2.28b]
[A]a
et qui, de manire gnrale, scrit de faon suivante :
[Pi ]
G = i
[2.28c]
[Aj ]
j
Ainsi, la variation dnergie de GIBBS dpend du rapport daction de masses, en

accord avec lquation :
DG = DG + RT ln G [2.29]
qui tout moment de la raction permet dobtenir le DG de la raction partir des
concentrations instantanes de A et de P.
Puisque tout systme volue spontanment vers ltat dont lnergie de GIBBS est
la plus faible, le sens spontan dune raction correspond une variation ngative
dnergie de GIBBS, DG < 0. En consquence, une raction chimique temprature
et pression constantes est lquilibre lorsque lnergie de GIBBS est minimum.
Dans ces conditions, la variation dnergie de GIBBS cause par une petite variation
de la quantit de substrat est exactement compense par la variation dnergie de
GIBBS cause par lapparition dune petite quantit de produit. Donc, lorsque le
systme a atteint lquilibre, la variation dnergie de GIBBS est nulle :
DG = DG + RT ln G = 0 [2.30]
Puisque DG est une constante, il dcoule que dans des conditions dquilibre, le
rapport daction de masses G doit tre une constante quivalente la constante
dquilibre de la raction. Cette relation importante en biologie, qui relie la

constante dquilibre, K, et la variation dnergie de GIBBS dans les conditions
standard, fut tablie par Jacobus VAN'T HOFF dans les annes 1860 :
DG = mP m A = RT ln K [2.31]
Le systme est dcrit par la constante dquilibre, K, qui est donne par lquation
suivante :
[Pi ]eq
G eq = K = i
[2.32]
[Aj ]eq
j
Une relation gnrale entre la variation dnergie de GIBBS et le rapport daction de

masses du systme peut galement tre tablie :
DG = RT ln G [2.33]
K
Graphiquement, cette relation entre la variation dnergie de GIBBS et G est
illustre dans la figure 2.2 pour la raction disomrisation de A en P.
20 000
Contenu en nergie de GIBBS G (J)
19 000
A
18 000
17 000
G <K G >K
16 000
15 000
0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 G /K
2.2 - Evolution de lnergie de GIBBS en fonction du rapport daction de masse G
Comme nous lavons dj discut dans le premier chapitre au sujet du pH, il est
incorrect dattribuer une signification au logarithme dune quantit ayant une
dimension. Un second exemple est fourni par la dfinition des constantes
dquilibre. Pour toutes les ractions dans lesquelles le nombre de substrats est
diffrent du nombre de produits, il est habituel dcrire la constante dquilibre K
de la raction comme une grandeur qui a une dimension.
Par exemple, pour la raction

A P+Q [2.34]
la constante dquilibre est gnralement dfinie comme une grandeur qui a une
dimension apparente de concentration :
[ P ][ Q ]
K = [2.35]
[ A]
Dans de nombreux cas, il est commode dutiliser les constantes dquilibre dfinies
de cette manire. Nanmoins, le calcul de la variation dnergie de GIBBS standard
partir de la constante dquilibre (quation [2.31]) ncessite de prendre le
logarithme de K et donc de raliser une opration illicite. Il est, dans ce cas, utile de
se rappeler la dfinition complte de la constante dquilibre dans laquelle les
termes de concentration sont, en ralit, des rapports entre la concentration relle et
la concentration dans ltat standard :
[P ] [Aj ]
DG = DG + RT ln i [2.36]
i C j C
o C est la concentration standard. Ainsi, la constante dquilibre pour la raction

[2.34] est donne par :
[ B ][ C ]
K = [2.37]
[ A ]C
o la constante dquilibre est bien une grandeur sans dimension. Afin dviter les
erreurs de calcul, il est donc recommand de toujours exprimer les concentrations
en units molaires lorsque lon calcule des constantes dquilibre.
2.4. RELATIONS ENTRE LA THERMODYNAMIQUE ET LA CINTIQUE :

LES NOTIONS DQUILIBRE ET DTAT STATIONNAIRE
Un rsultat important des travaux de J.W. GIBBS est ltablissement de relations

entre la thermodynamique et la cintique, cest--dire entre la loi daction de
masses et la variation dnergie de GIBBS, DG. Nous allons discuter ces relations
dans deux situations particulires, la situation dquilibre et la situation dtat
stationnaire qui seront utiles pour ltude des ractions enzymatiques.
2.4.1. Distinction entre vitesse initiale et vitesse nette
Dans une raction limite par un quilibre, il est ncessaire de distinguer les
notions de vitesse initiale et de vitesse nette. Considrons le systme disomri-
sation simple de A en P prsent dans lquation [2.26]. La raction peut tre
divise en deux demi-ractions qui peuvent chacune tre dcrite par une quation
de vitesse. Ces deux quations de vitesse correspondent aux quations donnant la
vitesse initiale de chacune des demi-ractions. Si au temps zro, le systme ne

contient uniquement que le substrat A et ne contient pas de produit P, la vitesse de
la raction exprime selon la loi daction de masses (voir quation [1.4]), donne la
vitesse initiale de la raction :
v1 = k1 [ A ]0 [2.38]
Si par contre, au temps zro, le systme contient uniquement le produit P et ne
contient pas de substrat A, la vitesse de la raction est donne par :
v 1 = k 1 [ P ]0 [2.39]
Lorsque le systme contient la fois le substrat et le produit, les deux demi-
ractions se droulent simultanment et la vitesse nette de disparition du substrat
est donne, en accord avec la loi daction de masses, par la diffrence entre la
vitesse de la raction directe et la vitesse de la raction inverse :
d[ A]
v nette = = k1 [ A ] k 1 [ P ] [2.40]
dt
2.4.2. Ltat dquilibre
Par dfinition, dans un systme isol ou ferm, un quilibre chimique ou physique

est atteint lorsque les quantits des diffrentes substances prsentes dans le
mlange nvoluent plus au cours du temps. Cette situation dquilibre ne signifie
pas que la raction sarrte, mais elle correspond un tat dynamique du systme
dans lequel la vitesse de la raction directe est gale la vitesse de la raction
inverse. Dans lexemple choisi dune raction simple disomrisation, si la
conversion entre A et P (quation [2.26]) est lquilibre, les quantits de A et de P
ne varient pas au cours du temps ou, en dautres termes, la conversion de A en P
est exactement contrebalance par la conversion de P en A. Cette situation est
dfinie par lquation suivante o la vitesse nette de la raction est nulle :
d[ A]
v nette = = 0 = k1 [ A ]eq k 1 [ P ]eq [2.41]
dt
et o [ A ]eq et [ P ]eq reprsentent respectivement les concentrations de A et de P
lquilibre. Le tableau 2.1 et la figure 2.3 dcrivent les variations de concentration
des substances A et P pour une raction qui volue vers une situation dquilibre.
Tableau 2.1 - Variation des concentrations dune raction simple
disomrisation voluant vers une situation dquilibre
Temps [A] [P]

0 [A]0 0
t [A]0 [P]t [P]t
lquilibre [A]eq [P]eq
Ceq C 1,0
(units 0,9
arbitraires)t Produit
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Ractif
0,1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (s)
a - Reprsentation de lvolution au cours du temps des concentrations du ractif et du
produit. Aprs un temps infini, les concentrations ont atteint leur valeur dquilibre.
Ceq Ct 1,0
(units 0,8
arbitraires)
0,6
0,4
Produit
0,2
0,0
0,2
Ractif
0,4
0,6
0,8
1,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (s)
b - Reprsentation de lvolution au cours du temps de lcart des concentrations de
produit et de ractif par rapport aux concentrations lquilibre
2.3 - Evolution dune raction simple disomrisation vers son tat dquilibre
Alors que la constante dquilibre (quation [2.32]) dcrit la situation lquilibre,

lquation [2.41] donne une dfinition rigoureuse de ltat dquilibre. Elle peut
tre rarrange de manire dmontrer que la constante dquilibre K sexprime
indiffremment comme le rapport entre les concentrations de produit et de ractif
ou comme le rapport des constantes de vitesse de la raction inverse et de la

raction directe :
DG ( m P m A )
[ P ]eq k
G eq = K = = 1 = e RT = e RT [2.42a]
[ A ]eq k 1
Mais, comme le montrent les deux termes de droite de lquation [2.42a],
la constante dquilibre peut galement tre exprime en fonction du DG ou de
la diffrence entre les potentiels chimiques en utilisant lquation [2.31].
Ainsi, lquation [2.42a] dmontre lexistence dune relation entre les constantes
de vitesse, k1 et k 1, la variation dnergie de GIBBS dans des conditions standard,
DG, et les potentiels chimiques standards, mA et mP. Lquation peut tre
gnralise au cas dune raction dans laquelle les coefficients stchiomtriques
sont diffrents de un :
[ P ]eqp k
G eq = K = a
= 1 [2.42b]
[ A ]eq k 1
Dans une situation dquilibre, si la vitesse nette de la raction est nulle, par contre
les vitesses v1 et v 2 pour chaque demi-raction ne sont pas nulles. Si lon considre
la raction A P, alors lquation [2.24] peut scrire comme :
m A m A = RT ln [ A ] [2.43]
mA mA
Do nous obtenons : ln [ A ] = [2.44]
RT
En prenant les exponentielles de chaque ct de lgalit, lquation devient
mA mA
[ A] = e RT [2.45]
En associant cette quation la loi de vitesse, nous obtenons :
mA mA
v1 = k1 e RT [2.46]
Cette quation tablit une autre relation directe entre la vitesse initiale et le
potentiel chimique du substrat et reprsente une des quations fondamentales
reliant la thermodynamique la cintique.
Des relations similaires entre thermodynamique et cintique peuvent galement
tre obtenues pour des systmes plus complexes. Considrons par exemple, la
raction suivante :
K1 K2 K3
A X Y P [2.47]
o lintermdiaire X est le produit de la premire raction mais est galement
le substrat de la deuxime raction dans laquelle X est en quilibre avec Y,
qui a son tour est le substrat de la troisime raction o Y est en quilibre avec le
produit final P. Lorsque toutes les ractions atteignent lquilibre, chaque tape est
caractrise par une variation dnergie de GIBBS nulle, DG = 0. La situation

lquilibre est dcrite par des constantes dquilibre (K1, K2 et K3) qui dans ce cas
sont donnes respectivement par [ X ]eq [ A ]eq , [ Y ]eq [ X ]eq et [ P ]eq [ Y ]eq .
Puisque, lquilibre, la vitesse nette est nulle pour chaque tape de la raction,
nous obtenons facilement des relations entre les constantes dquilibre et les
constantes de vitesse. Par exemple, pour la premire tape :
v nette = k1 [ A ]eq k 1 [ X ]eq = 0 [2.48]
[ X ]eq k
do : K1 = = 1 [2.49]
[ A ]eq k 1
Dans un systme de ractions successives comme celui-ci, la concentration de P
lquilibre peut tre obtenue partir de la concentration de A, simplement en
utilisant les formules des constantes dquilibre :
[ P ]eq = Ki [ A ]eq [2.50]
i
Le principe de micro-rversibilit stipule que dans un systme lquilibre, la

conversion entre deux tats seffectue la mme vitesse dans les deux sens de la
raction. La conversion de A en P est donc exactement contrebalance par la
conversion de P en A. Une implication de ce principe est que la raction inverse se
droule en suivant le mme chemin que la raction directe et passe par le mme tat de
transition. Cette affirmation est galement valable pour un systme en tat stationnaire.
2.4.3. Ltat stationnaire
Ltude des systmes hors dquilibre est beaucoup plus difficile que celle des
systmes lquilibre, nanmoins la description de tels systmes est grandement
facilite si ceux-ci se trouvent dans un tat stationnaire ou au moins sils sen
approchent suffisamment pour tre correctement reprsents par lapproximation
de ltat stationnaire.
Une situation de non-quilibre se caractrise par une vitesse nette non-nulle et par
une variation dnergie de GIBBS du systme non-nulle :
vnette 0 [2.51a]
DG 0 [2.51b]
Dans une telle situation, il est plus difficile de dcrire quantitativement la manire
dont lapparition du produit dpend de la concentration de substrat : le systme
change au cours du temps. Une premire solution consiste utiliser une forme
intgre de lquation de vitesse. Cette dmarche est simple pour les ractions
simples comme celle dcrite dans lquation [2.26], mais pour des ractions
plus complexes impliquant la formation successive de plusieurs intermdiaires
(comme celle de lquation [2.47]), qui sont rgulirement observes dans les
processus enzymatiques, lquation de vitesse ne donne pas une intgrale dfinie.

Il est alors ncessaire dutiliser un systme dquations diffrentielles et de le
rsoudre numriquement par une mthode dintgration numrique approprie.
Habituellement une telle approche se heurte des difficults pratiques comme la
ncessit de dterminer les valeurs exactes des diffrentes constantes de vitesse en
utilisant des techniques de cintique rapide.
Une seconde solution ce problme a t propose par BODENSTEIN (1913) et
repose sur le principe dtat stationnaire. Ltat stationnaire est un tat du systme
dans lequel un flux de matire ou dnergie traverse le systme mais dans lequel les
proprits du systme ne varient pas au cours du temps. Des exemples dtat
stationnaire peuvent tre rencontrs dans la vie courante. Par exemple, lorsque
nous chauffons lintrieur dune maison, le mur se trouve dans un tat stationnaire.
Il est le sige dun passage de chaleur entre lintrieur et lextrieur mais sa
temprature reste stable au cours du temps. Un autre exemple, est celui dune
cellule ou dun organisme vivant qui respire. Ceux-ci se trouvent dans un tat
stationnaire, puisquils absorbent continuellement de loxygne (O2) et librent
continuellement de leau et du dioxyde de carbone (CO2). Il est important de bien
saisir la diffrence entre une situation dquilibre et une situation dtat
stationnaire 2. La figure 2.4 illustre cette diffrence dans le cas dun coulement de
fluide.
Dans une srie de ractions successives, ltat stationnaire peut sappliquer une
espce intermdiaire dont la concentration est faible par rapport au flux de matire
traversant le systme. Par exemple, si nous supposons que la formation de P passe
par la formation dun intermdiaire X, nous obtenons le mcanisme suivant :
k1 k2
A X P [2.52]
k1
Pour analyser la cintique dun tel mcanisme, BODENSTEIN a postul que dans un
intervalle de temps donn, le systme existe dans un tat tel que la vitesse de
formation de lintermdiaire est proche de la vitesse de sa dcomposition. En
consquence, la concentration de cet intermdiaire ne varie pas au cours du temps
et d [ X ] dt = 0 . Cette situation peut tre reprsente par lquation :
d[ X ] d[ X ]
+ = = 0 [2.53]
dt dt
2. Attention lutilisation du terme tat stationnaire . Trs souvent la situation

dtat stationnaire est considre comme celle dun quilibre dynamique , mais
cette dnomination est totalement errone et ne devrait jamais tre utilise pour
les raisons suivantes :
comme nous lavons expliqu ci-dessus, tous les quilibres correspondent des
situations dynamiques (voir quation [2.41]),
par dfinition un quilibre implique G = 0, alors quau contraire un tat station
naire implique G 0.
a - quilibre
b - tat stationnaire
2.4 - Illustration de la diffrence entre (a) une situation dquilibre et
(b) une situation dtat stationnaire dans le cas de lcoulement dun fluide
Cette dernire quation dcrit mathmatiquement ltat stationnaire du systme.

Pour un tat stationnaire donn, la vitesse nette, vnette, et le D G ont des valeurs
quasiment constantes mais diffrentes de zro. Pour des ractions conscutives
dans une situation de non-quilibre, la loi daction de masses reste nanmoins
valable et il est alors facile de montrer que la vitesse de formation du produit (en
premire approche, la dernire raction est considre comme irrversible) peut
tre obtenue en accord avec la loi daction de masses. Selon cette loi :
d[ P ]
v = = k2 [ X ] [2.54]
dt
Il est souvent prfrable dexprimer la vitesse en terme dune variation de la
concentration de substrat et puisque, en accord avec le principe de BODENSTEIN, les
vitesses nettes dans chacun des sens de la raction (formation et utilisation de X) sont
gales et il est possible dcrire :
d[ X ] d[ X ]
= k1 [ A ] = = ( k 1 + k 2 )[ X ] [2.55]
dt dt
do il est possible de dduire une expression pour la concentration de X qui
dpend de la concentration de substrat, [ A ] :
k1
[X] = [ A] [2.56]
k 1 + k 2
En combinant les quations [2.54] et [2.56], nous obtenons :

k1
v tat stationnaire = k 2 [ A] [2.57]
k 1 + k 2
De cette manire, la vitesse globale de la raction dapparition du produit P peut
tre facilement exprime en fonction de la concentration du substrat A, sans quil
soit ncessaire davoir recours une intgration numrique des quations diff-
rentielles. Notons simplement que dans lquation de vitesse [2.57], les constantes
dquilibre sont remplaces par des rapports de constantes de vitesse.
Au cours dune raction, ltat stationnaire nest pas permanent. Trois phases
peuvent tre distingues, qui sont reprsentes dans la figure 2.5. Au dbut de la
raction, lintermdiaire nest pas prsent et la raction dbute par une phase pr-
stationnaire, au cours de laquelle lintermdiaire saccumule. La deuxime phase
est la phase dtat stationnaire proprement dite, au cours de laquelle le substrat est
transform en produit sans que la concentration dintermdiaire ne varie au cours
du temps. Cest uniquement dans cet intervalle de temps que les quations dcrites
ci-dessus sont applicables. La troisime phase, post-stationnaire, dbute lorsque le
substrat est presque entirement consomm ou que la raction approche de sa
position dquilibre. La concentration de lintermdiaire diminue et la raction
ralentit.
Etat
Etat stationnaire Etat
pr-stationnaire post-stationnaire
0,0010
Concentration (u. a.)
0,0008
A
0,0006
0,0004 P
0,0002
X
0,0000
0,0002
0 0,03 200 400 600 800 1000
Temps (s)
2.5 - Variations de la concentration des diffrents ractifs
et intermdiaires au cours dune raction
En pratique, ltat stationnaire nest quasiment jamais atteint. Nanmoins, dans

un grand nombre de situations, le systme se trouve suffisamment proche de ltat
stationnaire pour quune approximation de ltat stationnaire soit faite. La
difficult est alors destimer jusquo cette approximation reste valable. En

pratique, cette approximation peut tre accepte aussi longtemps que la variation de
la concentration de lespce intermdiaire reste faible par rapport la variation de
la concentration des ractifs et des produits finaux.
En enzymologie, le principe dtat stationnaire a t utilis pour la premire fois
par BRIGGS et HALDANE (1925). Nous discuterons plus en dtails de lutilisation de
ltat stationnaire pour lanalyse de la cintique enzymatique dans les chapitres
suivants.
2.5. LINFLUENCE DE LA TEMPRATURE

SUR LES CONSTANTES DE VITESSE
Dans le premier chapitre, nous avons exprim la vitesse dune raction lmentaire
en terme de constante de vitesse, qui est un paramtre exprimental utilisable pour
dcrire quantitativement la vitesse dune raction chimique ou biochimique. Nous
allons maintenant essayer de comprendre ce qui dtermine la grandeur de la
constante de vitesse. Il est clair que la constante de vitesse dune raction dpend
des interactions molculaires qui ont lieu durant les rencontres entre molcules
individuelles et que la vitesse dune raction dpend avant tout de la frquence
avec laquelle les molcules se rencontrent dans la solution. La loi daction de
masses tablit clairement la relation entre la vitesse et la concentration des ractifs.
Toutefois, la vitesse des ractions ne dpend pas seulement de la frquence des
rencontres et toutes les rencontres ne donnent pas lieu une raction. Comme nous
allons le voir, la probabilit quune rencontre entre molcules conduise une
raction dpend de la variation dnergie de GIBBS qui se produit lorsque les
molcules se rencontrent. La premire tape de notre dmarche consiste donc
donner une reprsentation de la variation de lnergie du systme au cours de la
rencontre entre molcules ractionnelles.
2.5.1. Le profil ractionnel
La description dune raction en terme molculaire ncessite de prciser lvolution

de divers paramtres structuraux dcrivant les molcules au cours de leur rencontre.
Lnergie de GIBBS du systme peut tre reprsente comme une surface dans un
espace multidimensionnel. Si nous restreignons notre analyse deux variables
spatiales, cette surface peut tre visualise comme une carte o les courbes de niveau
reprsentent lnergie de GIBBS du systme. Une simplification supplmentaire de ce
problme consiste dcrire la raction en termes de coordonnes de la raction, qui
mesurent lvolution du systme le long du chemin ractionnel le plus probable. Une
analogie simple est la mesure du parcours quun promeneur suit pour traverser une
chane de montagne. En principe, plusieurs routes sont possibles mais il en existe une
qui est plus facilement accessible et qui suit gnralement un chemin tortueux
passant par un col. Le chemin suivi peut tre dcrit compltement sur une carte
deux dimensions, mais la progression du promeneur peut galement tre dcrite par
une seule variable correspondant la distance parcourue le long du chemin. La
variable quivalente utilise pour dcrire la progression dune raction chimique est
appele coordonnes de la raction. Le profil dnergie de GIBBS de la raction est
un graphique reprsentant lnergie de GIBBS du systme en fonction des
coordonnes de la raction.
Dans un tel profil, les substrats et les ractifs reprsentent des tats stables du
systme et correspondent donc des minima dnergie de GIBBS. Puisque le
passage des substrats aux produits ncessite de rompre ou de former de nouvelles
liaisons, le systme ractionnel passe travers un continuum dtats dnergie
lorsquil volue le long des coordonnes de la raction. A un certain stade de ce
processus, le systme doit passer par un tat dans lequel lnergie de GIBBS est
maximale, correspondant un point de selle de la surface dnergie de GIBBS. A ce
stade de la raction, lnergie de GIBBS est maximale le long des coordonnes
ractionnelles mais est minimale pour tout mouvement perpendiculaire ce
chemin. Les molcules au point de selle sont dites tre dans un tat activ, qui est
aussi appel ltat de transition. La variation dnergie entre les substrats et ltat
de transition est appele lnergie dactivation de GIBBS, qui peut, de la mme
faon, tre dfinie pour la raction inverse.
2.5.2. Lquation dARRHENIUS
Ds les premires tudes de la vitesse des ractions, il est apparu clairement que les
constantes de vitesse variaient fortement avec la temprature. De ces observations
il dcoule que, dune part il est ncessaire de contrler la temprature lors des
mesures cintiques, mais dautre part des informations essentielles sur le
mcanisme de raction peuvent tre obtenues en mesurant leffet de la temprature
sur la vitesse de la raction. Les tudes de VANT HOFF (1884) et dARRHENIUS
(1889) constituent le point de dpart de toutes les thories modernes qui visent
expliquer la dpendance des constantes de vitesse vis--vis de la temprature.
HARCOURT (1867) avait pralablement not que la vitesse de nombreuses ractions
doublait approximativement pour chaque augmentation de 10 C de la temprature,
mais VANT HOFF et ARRHENIUS ont tent dtablir une relation plus exacte en
comparant les observations cintiques avec les proprits dj connues des
constantes dquilibre. Toute constante dquilibre K varie avec la temprature
absolue T, en accord avec lquation de VANT HOFF :
d lnK DH
= [2.58]
dT RT 2
o R est la constante des gaz parfaits et DH est la variation denthalpie libre
standard associe la raction.
Puisque la constante dquilibre K est galement donne par le rapport k1/k1, nous
pouvons crire :
d ln ( k1 / k 1 ) d ln k1 d ln k 1 DH
= = [2.59]
dT dT dT RT 2
Sur base de cette galit, nous pouvons driver des expressions spares pour
chacune des constantes de vitesse, k 1 et k 1 :
d ln k1 DH1
= +l [2.60a]
dT RT 2
d ln k 1 DH 1
= +l [2.60b]
dT RT 2
o l est une grandeur au sujet de laquelle nous ne disposons daucune information,
si ce nest quelle a vraisemblablement la mme valeur dans les deux quations
[2.60a] et [2.60b]. Dans le cas contraire, elle ne disparatrait pas quand ces qua-
tions sont combines pour obtenir lquation [2.59]. Toutefois, il est impossible de
dmontrer exprimentalement lexistence du terme l dans ces quations et
ARRHENIUS a postul que l est gal zro. Ds lors, la dpendance la temprature
de toute constante de vitesse k peut tre exprime par une quation de la forme
d ln k EA
= [2.61]
dT RT 2
o EA est lnergie dactivation qui est relie lenthalpie standard de la raction,
DH, dans lquation de VANT HOFF. Lintgration de lquation [2.61] donne :
E
ln k = ln A A [2.62]
RT
o A est une constante dintgration. Cette forme de lquation de ARRHENIUS est
la plus approprie pour des reprsentations graphiques, puisquelle autorise de
tracer soit un graphique reprsentant ln k en fonction de 1/T caractris par une
droite dont la pente vaut EA /R, soit un graphique reprsentant log k en fonction de
1/T, caractris par une droite ayant une pente qui vaut EA /2,303R. Ce graphique
illustr dans la figure 2.6, est connu sous le nom de graphique dARRHENIUS, et
constitue une mthode simple dvaluation de EA.
2.5.3. Thorie de collision lmentaire
En prenant lexponentielle de chaque partie de lquation [2.62], nous obtenons

lquation :
k = A e E a RT [2.63]
Selon la thorie de BOLTZMANN pour la distribution de lnergie entre les mol-
cules, le nombre de molcules possdant lnergie Ea dans une solution est
proportionnel e E a RT .
Temprature (C)
70 60 50 40 30 20 10 0
log k 3,5
3
k/1000
2
3
1
Pente = EA / 2,303R
0
0 20 40 60
Temprature (C)
2,5
2
2,9 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7
1000 /T 1
(K )
2.6 - Graphique dARRHENIUS
Lnergie dactivation EA est calcule partir de la pente. Linsert montre les mmes
donnes avec une reprsentation linaire des coordonns.
Par consquent, lquation dARRHENIUS montre que les molcules ne peuvent

prendre part une raction que si leur nergie atteint une certaine valeur seuil,
correspondant lnergie dactivation. Dans cette interprtation, la constante A
devrait tre gale la force de collision, Z, au moins pour les ractions
bimolculaires, et il dcoule de lquation [2.61] que la limite de la constante de
vitesse est atteinte lorsque 1/T = 0, cest--dire pour une temprature infinie. Pour
quelques ractions simples en phase gazeuse, comme la dcomposition de liodure
dhydrogne par exemple, A est gale Z, mais en gnral, il est ncessaire
dintroduire un facteur P supplmentaire qui tienne compte de lorientation des
molcules au moment de la collision :
k = P Z e E a RT
[2.64]
En plus de possder une nergie suffisante, les molcules doivent galement tre
correctement orientes pour ragir. Le facteur P est une mesure de la probabilit
davoir les molcules dans une orientation favorable au moment de la collision ;
ainsi linterprtation ci-dessus se trouve modifie et temprature infinie, une
collision nest productive que si lorientation est correcte. Lquation [2.64] fournit
un accord raisonnable avec les thories modernes des vitesses de raction, mais
dans plusieurs cas, il est prfrable dutiliser une autre approche qui est connue
comme la thorie de ltat de transition et est discute dans le paragraphe suivant.
2.5.4. Thorie de ltat de transition - Thorie de la vitesse absolue
Lorsque le systme ractionnel volue le long des coordonnes de la raction, il

doit passer par un tat dans lequel lnergie de GIBBS est maximale, ltat de
transition. Cet tat est clairement diffrent dun intermdiaire, qui ne reprsente pas
un maximum dnergie de GIBBS mais un minimum mtastable dans le profil
ractionnel. La thorie de ltat de transition, qui a t propose par EYRING (1935)
et inclut dimportantes contributions par EVANS et POLYANI (1935) et par PELZER
et WIGNER (1932), est le concept le plus gnralement utilis aujourdhui pour
dcrire les vitesses de raction. Elle est appele ainsi car elle relie la vitesse des
ractions chimiques aux proprits thermodynamiques dun tat particulier des
molcules ractives, dnomm tat de transition ou complexe activ. Elle est aussi
connue sous le nom de thorie de la vitesse absolue car elle prdit la vitesse des
ractions partir de principes lmentaires, contrairement la loi dARRHENIUS
qui est une loi empirique. Lide centrale de la thorie dEYRING est qu une
temprature donne, la vitesse de la raction dpend uniquement de la concen-
tration du complexe activ de haute nergie qui est en quilibre avec les substrats.
G Etat de transition
X Etat de transition
DG intermdiaire
Energie de GIBBS
d'activation
A+B
Ractifs
Energie de GIBBS
de la raction DG P+Q
Produits
Coordonnes de la raction
2.7 - Profil ractionnel en accord avec la thorie de ltat de transition
Le diagramme le long de laxe des abscisses reprsente les coordonns de raction pour
une simple raction bimolculaire. L'insert montre le cas o la raction passe par un
intermdiaire.
Pour la raction de A avec B, les substrats sont en quilibre avec le complexe

activ
K
A+B X P+Q [2.65]
et lquilibre est dcrit par une constante dquilibre :
[X ]
K = [2.66]
[ A ][ B ]
A partir de cette quation, il est possible de dfinir la concentration du complexe
activ partir de la concentration des substrats :
[X ] = K [ A ][ B ] [2.67]
La vitesse de la raction peut tre obtenue en considrant les vnements qui se
droulent dans ltat de transition. Il est possible de schmatiser ce qui se passe
dans ltat de transition comme un mouvement de vibration dun ou de plusieurs
atomes du complexe activ selon la direction spcifie par les coordonnes de la
raction. Cependant, au lieu de suivre un mouvement oscillatoire continu, la
vibration se transforme en un mouvement de translation et le ou les atomes
continuent leur mouvement, donnant lieu la rupture de la liaison ou la formation
dune nouvelle liaison. La vitesse de la raction, d [ A ] dt , est alors donne par
le produit de la concentration du complexe activ et de la vitesse de passage qui
correspond la vitesse laquelle le complexe activ volue lorsquil a atteint le
point de selle dans le profil nergtique. Pour tre complet, il faudrait galement
considrer quau point de selle, seulement une fraction k des molcules va voluer
vers les produits de la raction, le reste des molcules retournant vers les substrats.
Les thories de la physique molculaire peuvent tre utilises pour dterminer la
vitesse de passage au point de selle. Dans la thorie de EYRING, la constante de
vitesse de passage au point de selle, k, est gale la frquence de vibration
productive et est exprime comme une frquence J en cycle par seconde (nous
utilisons ici le symbole J pour reprsenter la frquence afin de le distinguer du
symbole v, utilis pour la vitesse) : J = k. Ds lors la vitesse de la raction peut
tre dcrite par lquation suivante :
d[ A]
v = = k [X ] = J [X ] [2.68]
dt
Lnergie associe un mouvement de vibration est donne par :
Evib = h J [2.69]
o h est la constante de PLANCK. Ds lors, la frquence de passage peut tre
exprime par :
E
J = vib [2.70]
h
Lnergie moyenne dun atome se dplaant le long des coordonnes de la raction

peut tre remplace par lnergie moyenne dune particule vibrant dans une
dimension. La vibration sera productive si l'nergie de vibration est gale ou
suprieure l'nergie potentielle de la liaison covalente. La mcanique quantique
nous apprend que :
Epot = kB T [2.71]
o kB est la constante de BOLTZMANN et T est la temprature. Donc pour la
formation du complexe X :
Epot = Evib [2.72]
et h J = kB T [2.73]
Nous obtenons une expression pour la constante de vitesse de passage :
k T
J = B [2.74]
h
Dun autre ct, en accord avec les lois de la thermodynamique classique, la
constante dquilibre peut tre relie la variation dnergie de GIBBS pour la
formation de ltat de transition partir des ractifs :
DG = RT lnK [2.75]
Cette quation peut galement scrire sous la forme suivante :
DG
K = e RT [2.76]
En utilisant les quations [2.67] et [2.76], la concentration de ltat activ pour la
raction est donne par :
DG
[X ] = e RT [ A ][ B ] [2.77]
La vitesse de la raction peut alors scrire :
k T DG

v = B e RT [ A ][ B ] [2.78]
h
Dans le premier chapitre, nous avons vu que la loi empirique daction de masses
fournit lexpression suivante pour la vitesse dune raction de second ordre :
v = k [ A ][ B ] [2.79]
La comparaison des quations [2.78] et [2.79] montre que la constante de vitesse k
est donne par :
k T DG

k = B e RT [2.80]
h
Lquation [2.80] est lquation centrale de la thorie dEYRING de ltat de transition
et limine le mystre qui entoure la constante de vitesse : elle donne cette grandeur
une valeur qui dpend des constantes fondamentales de la mcanique quantique, kB et
h, de la temprature absolue, T, et de la variation dnergie de GIBBS entre les

substrats et ltat de transition. Cette quation est galement une quation centrale de
la thermocintique, reliant un paramtre cintique de la raction, la constante de
vitesse k, un paramtre thermodynamique, la variation dnergie de GIBBS pour la
formation de ltat de transition, DG.
Bien que cette quation ait t dveloppe pour reprsenter une raction simple en
phase gazeuse (un systme idal) en utilisant lhypothse de lexistence dun
quilibre entre ltat initial et ltat de transition, son application sest largie de
nombreux autres domaines, y compris lenzymologie. Dans ce cas, son application
est justifie puisque la thorie prdit une dpendance linaire entre ln(k/T) et 1/T
qui est vrifie pour les ractions enzymatiques :
k
ln k = ln B DG

[2.81]
T h RT
Puisque la variation dnergie de GIBBS est relie aux variations denthalpie et
dentropie, nous avons :
DG = DH TDS [2.82]
et lquation [2.81] peut scrire :
k
ln k = ln B + DS DH

[2.83]
T h R RT
qui implique une dpendance linaire entre ln(k/T) et 1/T avec une pente gale
DH/R 3. Lexprience montre quune telle dpendance linaire est couramment
observe dans de nombreuses situations, y compris des ractions enzymatiques.
3. En diffrentiant lquation [2.83], on obtient lquation suivante :

d lnk DH + RT
=
dT RT 2
En comparant cette quation avec lquation dARRHENIUS (quation [2.59]) on peut
voir que lnergie dactivation EA nest pas gale H, mais H + RT. Du reste,
EA nest pas strictement indpendant de la temprature, impliquant que le
graphique dARRHENIUS est non-linaire. Toutefois, la courbure attendue est
tellement faible quelle nest pas dtectable et que la variation de k rsultant du
facteur T est faible en comparaison de la variation due au terme exponentiel.
Comme A et EA dans lquation [2.61] peuvent tre dtermins exprimentalement
partir dun graphique d'ARRHENIUS, H et S pourront tre calculs partir des
relations suivantes
H = EA RT
AN A h
ou EA = H + RT et DS = R ln R
RT
Ces quations montrent quun catalyseur peut augmenter la vitesse dune raction
en diminuant S ou en diminuant H ou en affectant les deux proprits. Il est
probable que ces deux effets soient importants en catalyse enzymatique, bien que
dans la plupart des cas, il soit difficile de justifier ceci, du fait que les ractions non
catalyses sont trop lentes pour que les valeurs de S et de H puissent tre
mesures.
Lenthalpie et lentropie dactivation dune raction chimique fournissent une

information prcise sur la nature de ltat de transition et donc sur le mcanisme de
raction. Une enthalpie dactivation leve indique une augmentation de la tension
ou la rupture dune liaison chimique, qui est ncessaire pour la formation de ltat
de transition. Si DS est fortement ngatif, la formation de ltat de transition
ncessite que les molcules ractives adoptent des conformations prcises et
sapprochent les unes des autres avec un angle prcis. Comme les molcules
varient dans leur stabilit conformationnelle, cest--dire dans leur rigidit, et dans
leur complexit, on pourrait sattendre ce que les valeurs de DS varient beau-
coup entre diverses ractions, ce qui est le cas. Les molcules qui sont importantes
dans les processus mtaboliques sont nombreuses et flexibles, impliquant que des
ractions non catalyses entre les mmes molcules sont fortement improbables.
2.5.5. Les enzymes stabilisent ltat de transition de la raction
En plus de fournir une explication la dpendance de la vitesse de la raction sur la

temprature, lquation [2.80] fournit galement un moyen de mesurer lefficacit
catalytique des enzymes. Leffet de tout catalyseur, y compris celui des enzymes,
est dacclrer les ractions en augmentant les constantes de vitesse, sans affecter
lquilibre global de la raction. Le paramtre qui varie est K ou la variation
dnergie de GIBBS associe, DG. Lexistence dinteractions spcifiques entre les
substrats et les groupes du centre catalytique de raction (site actif des enzymes),
facilite la formation de ltat de transition ( stabilisation de ltat de transition)
et le DG diminue dune quantit DDG. Si DG est la variation dnergie de
GIBBS dactivation en absence denzyme, la variation dnergie de GIBBS en
prsence denzyme est donne par : DG DDG. Cette diminution de lnergie de
GIBBS dactivation se traduit par une variation dans lexpression de la constante de
vitesse, dans laquelle il devient possible de dfinir un facteur dacclration :
( DG DDG )
kB T RT
DG DDG

kB T
kcat = e RT = e e RT = k non cat f acc [2.84]
h h
DDG
o le facteur dacclration donn par e RT peut atteindre une valeur de 1014.
Parce que le DDG est identique dans les deux sens de la raction, le mme facteur
dacclration sapplique dans les deux sens de la raction. Le catalyseur augmente
donc la vitesse dans les deux sens mais ne modifie pas la position de lquilibre
entre les substrats et les produits.
Ce principe fondamental de la catalyse enzymatique a t propos par HALDANE en
1930 et dvelopp par PAULING en 1946 : les enzymes catalysent les ractions
chimiques en stabilisant spcifiquement ltat de transition de la raction. Pour
catalyser une raction, un enzyme doit tre complmentaire de ltat de transition
de la raction. Cela signifie que les interactions entre le substrat et lenzyme
doivent tre optimales dans ltat de transition. La difficult dans ltude de ltat
de transition est que sa structure ne peut pas tre dtermine directement. La
complmentarit entre lenzyme et ltat de transition de la raction ne peut tre
dmontre que de manire indirecte.
PROBLMES
2.1 - De nombreuses ractions se caractrisent par un doublement de la

vitesse quand la temprature est augmente de 25oC 35o C. Quelle
conclusion peut-on tirer au sujet de lenthalpie dactivation ?
(R = 8,31 J mol1 K1, 0oC = 273 K, ln 2 = 0,693)
2.2 - Dans le calcul de lquation dARRHENIUS ( 2.5.2), un terme l a t
introduit et subsquemment suppos gal zro. A la lumire de la
thorie de ltat de transition ( 2.5.4), quelle serait la valeur de l 300 K
(27oC) ?
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE
RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT
3.1. HISTORIQUE
3.1.1. La dcouverte des enzymes
Les premires dmonstrations dune activit enzymatique dans des extraits naturels
remontent au XVIIe sicle, quand RAUMUR dabord et SPALLANZANI ensuite
montrent que le suc gastrique des oiseaux est impliqu dans la digestion de la
viande. Dans une exprience simple, SPALLANZANI nourrit des aigles avec des
morceaux de viande entours dun treillis mtallique quil peut ensuite extraire de
lestomac des oiseaux pour suivre lvolution de la digestion. La mise en vidence
de lactivit dautres enzymes se poursuit au XIXe sicle. En 1833, PAYEN et
PERSOZ isolent partir du malt une substance qui est responsable de la fermenta-
tion et quils nomment diastase. Ce terme sera par la suite utilis pour dsigner de
manire gnrale toutes substances responsables de fermentation. Plus tard, le
suffixe -ase a t conserv pour dsigner la macromolcule responsable dune
activit enzymatique. Par exemple, lamylase est un enzyme responsable de la
dgradation de lamidon. En 1836, alors quil tudie les processus digestifs,
SCHWANN isole la pepsine, une substance responsable de la digestion dans lesto-
mac et le premier enzyme obtenu partir dun tissu animal. Les dcouvertes se
succdent ensuite : lmulsine (WOHLER et LIEBIG, 1837), la lipase du pancras
(BERNARD, 1840), linvertase de la levure (BERTHELOT, 1860) et la trypsine du
pancras (KUHNE, 1877).
A cette poque, la nature de ces agents actifs est inconnue et fait mme lobjet dune
controverse. Dun ct, il y a ceux qui, derrire Louis PASTEUR, pensent que les
fermentations sont provoques par des microorganismes et que les agents
responsables, les ferments, ne peuvent tre dissocis de la prsence de cellules
vivantes. De lautre ct, il y a ceux, qui derrire Julius LIEBIG, pensent que les
ferments sont des substances dissociables des tres vivants. Les ferments sont donc
diviss en deux catgories, les ferments figurs qui sont visibles et impliquent la
prsence de cellules vivantes et les ferments solubles . Pour dsigner ces derniers,
KUHNE invente le mot enzyme qui signifie littralement dans la levure , mais
en 1897, Eduard BUCHNER rsout le problme en montrant que les ferments

solubles sont les vritables principes actifs et quils sont contenus dans les
ferments figurs . A partir de levure de bire, il isole une substance quil nomme
zymase et avec laquelle il est capable de reproduire la fermentation in vitro.
Toutefois, la nature chimique des enzymes nest pas tablie. Certains comme Eduard
BUCHNER et Emil FISCHER considrent les enzymes comme des protines, mais
dautres pensent que le principe actif des enzymes est une petite molcule adsorbe
sur la protine. Il faudra attendre la purification et la cristallisation de lurase par
James B. SUMNER en 1926 pour que soit dfinitivement accepte la nature protique
des enzymes. La composition des protines sera tablie au dbut du XXe sicle et la
premire structure tridimensionnelle est dtermine par KENDREW en 1957. Fina-
lement, dans les annes 1980, Thomas CECH dcouvre les ARN catalytiques, une
autre classe de macromolcule galement dote dune activit catalytique.
R en A nto ine F E RC HAULT DE R AU MUR (1683-1757)

La premire mise en vidence exprimentale de lactivit des enzymes est attribue
RAUMUR, dont la carrire scientifique est un bel exemple de ces savants des sicles
passs qui taient capables de briller dans les disciplines les plus varies. Rn Antoine
FERCHAULT DE RAUMUR nat la Rochelle le 28 fvrier 1683 dune famille de petite noblesse.
Il commence ses tudes la Rochelle, les poursuit chez les Jsuites Poitiers et ensuite
tudie le droit Bourges. Il se passionne alors pour les sciences et lobservation de la
nature et entame des tudes de mathmatiques. A 25 ans, il est admis lAcadmie des
Sciences comme lve gomtre. Il sera directeur de cette institution douze reprises et
sous-directeur neuf reprises.
Il sintresse la mtallurgie et au dveloppement de cette industrie. En 1722, il publie le

Trait sur lart de convertir le fer en acier et dadoucir le fer fondu dans lequel il rapporte
de nombreuses expriences sur la mise au point de procds de fabrication de lacier. Il
se proccupe galement de la fabrication de la porcelaine et ce sont ses successeurs qui,
travaillant sur ses indications, tabliront lutilisation de largile blanche, notamment dans
la rgion de Limoges.
RAUMUR est surtout clbre pour la construction, sur la base des travaux de NEWTON, du
premier thermomtre alcool fiable et que nous utilisons toujours. Il publie ses travaux
dans un mmoire intitul Rgles pour construire des thermomtres. Il choisit comme
points extrmes de sa graduation les tempratures de fusion et dbullition de leau, mais
les fabricants divisent cette gamme en 80 degrs. Cest CELSIUS qui plus tard introduira la
division centsimale utilise jusqu nos jours.
Il fait de trs nombreuses dcouvertes dans le domaine des sciences naturelles. Il tudie
principalement les invertbrs qui, cette poque, sont gnralement dlaisss par les
autres naturalistes. Entre 1734 et 1742, RAUMUR publie six volumes de ses Mmoires pour
servir lHistoire des Insectes dans lesquels il prsente des observations rigoureuses
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT 57
de lanatomie et du comportement de ces arthropodes. Ces ouvrages sont crits dans un

style clair et vivant sans perdre la rigueur et la prcision ncessaires un expos
scientifique. Ces deux qualits seront reconnues et loues plus tard par Jean-Henri FABRE,
un entomologiste de renom de la fin du XIXe sicle.
En 1752, RAUMUR ralise des expriences dans lesquelles il dmontre que la digestion de
la viande par des oiseaux de proie rsulte de laction chimique du suc gastrique plutt que
dune action mcanique. Il fait avaler des rapaces des tubes contenant de la viande et
qui sont ferms leurs extrmits par un bouchon grillag. Lorsque les oiseaux
rgurgitent les tubes, il constate que la viande est partiellement digre. Dans son Second
mmoire sur la digestion (1752), il crit :
La digestion est opre par la seule action dun dissolvant

et par la fermentation quil fait natre.
RAUMUR ne sest jamais mari et a consacr sa vie sa carrire acadmique et scienti-

fique. Il meurt en 1757 dans sa proprit de La Bermondire, St-Julien-du-Terroux, des
suites dune chute de cheval.
3.1.2. Les premires tudes de la cintique enzymatique et le

dveloppement du concept du complexe enzyme-substrat
Ltude de la vitesse des ractions catalyses par des enzymes dbute dans la
seconde moiti du XIXe sicle, un moment o la cintique chimique est en plein
dveloppement. A cette poque la majorit des tudes taient ralises avec des
enzymes impliqus dans des processus de fermentation, en particulier linvertase 1,
qui catalyse lhydrolyse du saccharose figure 3.1.
Ltude de la cintique dhydrolyse du saccharose en prsence de diffrents acides
avait conduit au dveloppement des quations de vitesse et avait finalement amen
GULDBERG et WAAGE proposer en 1864 la loi daction de masses et ensuite
VANT HOFF dfinir la constante dquilibre dune raction rversible comme le
rapport des vitesses dans les directions directe et inverse. A la fin du XIXe sicle, les
fondements thoriques de la cintique chimique sont donc tablis et la question qui
intrigue les savants de lpoque est de savoir si la cintique des ractions catalyses
par les enzymes peut tre dcrite par les mmes lois. Les enzymes sont associs
des ractions du monde vivant et la dmonstration que ces composs obissent aux
mmes lois que les ractions chimiques a, lpoque, une porte beaucoup plus
profonde que la rsolution dun problme de cintique de raction.
1. Dans la nomenclature internationale, linvertase est aujourdhui connue sous le

nom de b-fructo-furanosidase.
CH2OH
H O H HOCH2 O H
H
HO
OH H o H HO CH OH
2
[a]D = + 66,5 H OH OH H
-D-fructofuranosyl--D-glucopyranoside
H2O + H2O Invertase
CH2OH
H O H HOCH2 O CH2OH
H
OH H H HO
HO OH H OH
[a]D = + 112,2 H OH OH H
-D-glucopyranose -D-fructofuranose
A l'quilibre Equilibre A l'quilibre

[a]D = + 52,6 global []D = 92,4
[]D = 22
CH2OH
H O OH HOCH2 O OH
H
OH H H HO
HO H H CH2OH
[a]D = + 18,7 H OH OH H
-D-glucopyranoside -D-fructofuranose
3.1 - Lhydrolyse et la mutarotation du saccharose
La majorit des tudes ralises au XIXe sicle et au dbut du XXe sicle portaient sur des
enzymes impliqus dans les phnomnes de fermentation, et en particulier sur linvertase
qui catalyse lhydrolyse du saccharose. Lhydrolyse du saccharose par les acides ou par
linvertase est un modle important qui a servi aux premiers dveloppements de la cin-
tique chimique et de la cintique enzymatique. Lhydrolyse du saccharose, qui saccom-
pagne de la mutarotation du glucose et du fructose, tait suivie par polarimtrie. Le
pouvoir rotatoire spcifique []D correspond langle de rotation du plan de polarisation de
la lumire mesur 589,6 nm (la longueur donde de la raie D du sodium) rapporte pour
une cuvette dont le trajet optique a une longueur de 1dm et pour un chantillon dont la
concentration est gale 1 g mL1.
3.1.3. Les travaux de Victor HENRI
En 1903, Victor HENRI publie sa thse de doctorat s Sciences intitule Lois

gnrales de laction des diastases dans laquelle il fait une synthse critique des
donnes cintiques disponibles lpoque, y compris des siennes, dans le but de
driver une quation de vitesse qui reprsente correctement la cintique enzy-
matique. Il obtient ainsi la premire quation de vitesse base sur un mcanisme
ractionnel dfini et prouve dfinitivement que la cintique enzymatique respecte
la loi daction de masses comme les ractions chimiques (voir ci-dessous).
En suivant la dmarche quil adopte dans lintroduction de sa thse, nous prsen-
tons ici brivement trois ensembles dides et de donnes exprimentales sur
lesquels repose le travail de thse de Victor HENRI :
Les enzymes sont des catalyseurs - Les premires tudes de la cintique enzy-
matique avaient permis de dmontrer que les enzymes taient des catalyseurs. En
1835, BERZELIUS avait introduit le terme daction catalytique pour expliquer
divers processus chimiques parmi lesquels il rangeait la dcomposition de lami-
don par un extrait de malt. Grce son sjour dans le laboratoire dOSTWALD,
HENRI est parfaitement bien inform sur les tudes ralises lpoque pour
comprendre les mcanismes catalytiques. Il prsente dans sa thse les proprits
des enzymes qui sont caractristiques de laction des catalyseurs : lexistence
dune grande disproportion entre la quantit de catalyseur utilise et la masse
transforme de substrat, la modification complte par lenzyme de la courbe
dvolution dune raction sans modification de la position des quilibres et la
dpendance de la constante de vitesse vis--vis de la concentration denzyme.
Finalement, il note limportance dtudier la loi de vitesse qui caractrise une
raction parce quelle permet de distinguer les diffrents types de mcanismes
catalytiques, et ventuellement de mettre en vidence la formation transitoire de
complexes entre le catalyseur et le substrat.
Les premires tudes de la cintique des ractions enzymatiques - Au moment
o HENRI entame son tude, de nombreux travaux ont dj t raliss par dautres
pour comprendre le mcanisme daction de divers enzymes. Dans la seconde partie
de son introduction, il discute de limportance de certains travaux et notamment de
ceux raliss sur laction de linvertase (quil appelle invertine). Divers rsultats
dmontrent laction catalytique des enzymes selon les critres dfinis par HENRI.
Par exemple, OSULLIVAN et TOMPSON (1890) qui ont tudi par polarimtrie la
raction dhydrolyse du saccharose par linvertase, ont montr que cette enzyme
nest ni altre, ni dtruite au cours de la raction (except aux tempratures
leves) et quun chantillon reste actif aprs avoir catalys lhydrolyse dune
masse de saccharose correspondant 100 000 fois la masse de lenzyme.
Concernant lquation de vitesse, diverses tudes ont t consacres la variation
de la vitesse avec la concentration denzyme. Les rsultats dOSULLIVAN et
TOMPSON (1890) et ceux de TAMMANN, montrent que lactivit de lenzyme est
directement proportionnelle la concentration denzyme utilise dans lessai et

donc que la cintique suit les prdictions de la loi daction de masses. Par contre,
lorsquil sagit dexpliquer la variation de la vitesse de la raction avec la concen-
tration de saccharose, c'est--dire avec la concentration de substrat, les choses sont
moins videntes. A une concentration fixe de substrat, les cintiques observes par
OSULLIVAN et TOMPSON suivent approximativement une courbe exponentielle
comme le prdisent les lois de la cintique chimique pour une raction
unimolculaire. Toutefois, bien que ces auteurs aient constat une lgre dviation
par rapport cette loi, ils nont pas tudi la variation de la vitesse avec la
concentration initiale de substrat. Cette tude a nanmoins t ralise par BARTH
(1878) et par DUCLAUX (1898), mais ceux-ci ont conclu que la vitesse de la
raction enzymatique tait indpendante de la concentration de substrat. DUCLAUX
propose un modle cintique o la diminution de la vitesse observe au cours de la
cintique est explique par une inhibition par le produit de la raction. BARTH a
remarqu que cette indpendance de la vitesse vis--vis de la concentration de
substrat nest plus vrifie pour des solutions suffisamment dilues de substrat, une
observation qui a ensuite t confirme par BROWN (1892).
Le concept du complexe enzyme-substrat - La formation dun complexe entre
lenzyme et son substrat constitue aujourdhui le concept central de la catalyse
enzymatique ; son importance dans les mcanismes de fonctionnement des
enzymes sera discute plus en dtails dans dautres chapitres. La notion selon
laquelle la formation dun complexe entre lenzyme et son substrat est ncessaire
pour lactivit enzymatique est apparue dans divers travaux la fin du XIXe et
au dbut du XXe sicle. Cette notion est dj implicite dans les travaux dEmil
FISCHER qui sintresse la spcificit de laction des enzymes. Il propose que la
complmentarit strique entre lenzyme et son substrat est lorigine de cette
spcificit et que les enzymes et les substrats se reconnaissent comme une cl
sadapte dans une serrure figure 3.2.
Groupe
catalytique 3
Site actif
Substrat (A)
Enzyme Groupe Groupe
catalytique 1 catalytique 2
Enzyme (E) Complexe (EA)
3.2 - Le concept cl-serrure propos par Emil FISCHER pour expliquer la spcificit
daction des enzymes suggrait lexistence dun complexe enzyme-substrat
Dans leurs tudes menes sur linvertase, OSULLIVAN et TOMPSON ont remarqu
que la stabilit thermique de lenzyme augmentait en prsence de son substrat et ils
ont voqu lide de la formation dun complexe enzyme-substrat pour expliquer
cette variation des proprits de la protine.
Linvertase, quand elle est mise en prsence de sucre de canne (saccharose)
supporte une temprature de 25oC suprieure celle quelle supporte en son
absence. Cest un fait trs marquant et, autant que nous pouvons en juger, il y a une
seule explication cela, nommment que linvertase se combine avec le sucre.
Adolphe WURTZ (1880) est arriv une conclusion similaire pour expliquer lap-
parition dun prcipit lors de lhydrolyse de la fibrine catalyse par la papane ; il
suggre que le prcipit est un compos papane-fibrine qui agit comme un inter-
mdiaire dans lhydrolyse. Nanmoins, cest BROWN qui dmontre dfinitivement
que la formation dun complexe entre lenzyme et son substrat explique les dpen-
dances exprimentales de la vitesse de raction vis--vis des concentrations
denzyme et de substrat. En parallle avec dautres chercheurs, BROWN observe
que les vitesses des ractions catalyses par des enzymes dvient des cintiques de
second ordre (1892). Initialement, il a montr que la vitesse dhydrolyse du saccha-
rose dans la raction de fermentation par des levures vivantes semble tre dpen-
dante de la concentration de saccharose. Le conflit entre les rsultats de BROWN et
ceux de OSULLIVAN et TOMPSON na pas t apprhend srieusement, parce que
la catalyse par des enzymes isols est considre comme un phnomne
fondamentalement diffrent de la fermentation par des organismes vivants. Mais la
dcouverte par Eduard BUCHNER (1897), quun extrait de levure dpourvu de
cellule vivante peut catalyser la fermentation alcoolique, pousse BROWN (1902)
rexaminer ses rsultats. Aprs avoir confirm leur vracit, il montre que des
rsultats similaires peuvent tre obtenus avec linvertase purifie. BROWN (1892)
dfend lide du complexe enzyme-substrat dans un contexte purement cintique. Il
propose quun mcanisme impliquant un complexe enzyme-substrat impose une
limite sur la vitesse de raction qui peut tre atteinte par le systme. Si un
complexe existe pendant un bref laps de temps avant la libration du produit, alors
une vitesse maximale devrait tre atteinte lorsque la concentration de substrat est
suffisante pour convertir tout lenzyme en complexe enzyme-substrat, en accord
avec la loi daction de masses. Inversement, de plus faibles concentrations de
substrat, la vitesse laquelle le complexe est form devient significative et, en
consquence, la vitesse de raction est dpendante de la concentration de substrat.
Selon HENRI (1903), diverses tudes menes au moment o il entame son travail
font apparatre des diffrences entre laction des enzymes et celle des acides et
suggrent que les enzymes oprent par un mcanisme diffrent de celui des acides.
HENRI propose dentreprendre une tude exprimentale systmatique de la
cintique enzymatique en faisant varier les conditions dune manire aussi
complte que possible et danalyser les rsultats en se plaant de nouveau au point
de vue des lois de la chimie gnrale afin de dfinir un mode daction gnral pour
les enzymes qui sappuie uniquement sur la loi de laction de masses, sans avoir
recours des proprits sui generis qui seraient dues seulement aux diastases.
Dans son travail de thse, Victor HENRI tudie la cintique daction de trois
enzymes quil purifie lui-mme ou quil obtient sous la forme de prparations
commerciales : linvertase, lmulsine et lamylase. Pour linvertase, il observe que
la vitesse diminue au cours de la raction mais il prouve dfinitivement que cette
diminution est beaucoup moins rapide que ne le prdit une loi de premier ordre.
Pour expliquer cette diffrence, il mesure la variation de la vitesse avec la
concentration de saccharose et observe une variation complexe de la vitesse avec la
concentration de substrat. Ainsi, dans la figure 3.3 qui reproduit les donnes de
HENRI, la vitesse double pour une augmentation dun facteur quatre de la concen-
tration de substrat entre 0,025 M 0,1 M, mais la vitesse est peine trois fois plus
grande pour une augmentation dun facteur dix de la concentration de substrat entre
0,025 M et 0,25 M. Il dmontre que lenzyme nest pas modifi au cours de la
raction et que la diminution de la vitesse observe aux fortes concentrations de
substrat (montre dans la figure 3.3) est due laction inhibitrice des produits,
principalement du fructose (quil appelle lvulose). Finalement, en tudiant la
variation de la vitesse de la raction avec la concentration denzyme, il confirme la
proportionnalit directe entre la vitesse de la raction et la concentration denzyme.
6
Vitesse initiale
(quantits de saccharose interverties par minute)
0
0 0,4 0,8
Concentration de saccharose (M)
3.3 - Cintique dhydrolyse du saccharose par linvertase
Donnes prsentes par HENRI dans sa thse de doctorat. La ligne en trait continu montre
la courbe thorique dessine en utilisant lquation [3.2] et les valeurs suivantes des
paramtres : k = 72,25 s1 et m = 12,1 M1.
Sur la base de ces rsultats, il cherche tablir une quation de vitesse qui permette
de dfinir une constante de vitesse indpendante des concentrations denzyme et de
substrat, qui soit drive partir dun mcanisme ractionnel dfini et qui soit en
accord avec la loi daction de masses. Ce travail lamne remettre en question le
modle daction enzymatique de BROWN qui impliquait un temps de vie fix pour
le complexe enzyme-substrat entre sa cration et sa dnaturation, et il propose pour
le remplacer un mcanisme qui, quoique conceptuellement similaire celui de
BROWN, est exprim en des termes mathmatiques et chimiques plus prcis. HENRI
propose que lenzyme interagisse de manire rversible avec le substrat et avec le
produit et que ce soit la rupture du complexe enzyme-substrat qui donne le produit.
Il conoit parfaitement que son modle repose sur deux hypothses et il en discute
les consquences :
des quilibres rapides stablissent entre lenzyme et le substrat et entre lenzyme
et le produit ;
il existe une grande diffrence de concentration entre le substrat et lenzyme.
A partir de ces considrations, il drive une quation de vitesse (quation [3.1]) qui
rend compte des dpendances de la vitesse aux concentrations de substrat, den-
zyme et de produit :
d[ P ] k ( [ A ]0 [ P ] )
v = = [3.1]
dt 1 + m ( [ A ]0 [ P ] ) + n[ P ]
Pour la vitesse initiale, cette quation se simplifie puisque [ P ] = 0 :
d [ P] k [ A ]0
v = = [3.2]
dt 1 + m[ A ]0
Dans ces quations, k, m et n sont des constantes caractristiques du systme
enzymatique tudi. Comme le note HENRI, cette quation prdit que pour une
concentration suffisamment leve de substrat la vitesse de la raction devient
indpendante de la concentration de substrat mais que, pour une concentration
faible de substrat, la vitesse est directement proportionnelle cette concentration.
3.1.4. Les problmes rencontrs par HENRI
A la fin du XIXe sicle, aucun enzyme ntait disponible sous une forme purifie et
les mthodes de mesure de lactivit de ces enzymes taient primitives. En dehors
de ces problmes, plusieurs critiques ont t faites au sujet du travail de HENRI.
Bien que lui et BROWN aient atteint des conclusions essentiellement correctes sur le
mode daction des enzymes, ils lont fait sur la base dexpriences qui ouvrent la
porte de srieuses objections. Premirement, la notion de pH qui est particu-
lirement importante pour ltude des ractions en solution na pas encore t
introduite, et HENRI nutilise pas de tampon pour contrler le pH de son chantillon.
Le concept de pH ne sera introduit par SRENSEN quen 1909. OSULLIVAN et
TOMPSON avaient ralis, sans pouvoir y apporter une solution, que la vitesse de la
raction dpendait fortement de lacidit du mlange ractionnel. Lorsque lacidit
est dans la proportion la plus favorable, ils obtiennent des rsultats reproductibles.
Pour contrler lacidit du milieu, OSULLIVAN et TOMPSON ajoutent de lacide dans

leur prparation denzyme jusqu atteindre un pH optimum aux environs de pH 4.
De son ct, BROWN prpare lenzyme dune manire diffrente et observe que
laddition dacide nest pas ncessaire (ses solutions sont vraisemblablement
suffisamment tamponnes par les composants naturels de la levure), alors que HENRI
ne mentionne pas ce problme. Deuximement, dans ses travaux sur linvertase,
HENRI utilise la mesure directe de polarimtrie pour calculer la quantit de sucre
qui a ragi et ne tient pas compte de la mutarotation du produit. A cette poque,
seuls OSULLIVAN et de TOMPSON prenaient en compte la mutarotation du glucose.
Selon SEGAL, il semble cependant que cette mauvaise pratique nait par affect
significativement les rsultats de HENRI.
Victor H ENR I (1872-1940)

Victor HENRI est lun des fondateurs de la physico-
chimie biologique en France. Sa carrire est un bel
exemple de pluridisciplinarit et de mobilit qui na
pas empch HENRI de briller par la nouveaut de ses
ides dans les diffrents domaines quil a abords.
Comme le mentionne Jean DUCHESNE, Victor HENRI tait
un penseur universel pour qui les grands problmes
industriels ne pouvaient tre rsolus quen se basant
sur la science fondamentale, une conception de la
recherche que nous avons peut tre trop tendance
oublier aujourdhui.
Victor HENRI est n Marseille le 6 juin 1872, de parents
issus de laristocratie russe. Il passe sa jeunesse en
France, puis entreprend, lcole allemande de
Saint-Ptersbourg, des tudes classiques quil termine
Paris o il vient sinstaller lage de 14 ans. Il tudie ensuite la Sorbonne o il obtient
un certificat de mathmatiques et un de sciences naturelles. Il travaille ensuite dans le
laboratoire de philosophie de lUniversit de Leipzig et acquiert en 1897 le grade de
docteur en philosophie lUniversit de Gttingen grce une thse intitule ber die
Raumwahrnehmungen des Tastsinnes (Localisation des sensations du got). Revenu
Paris, il sintresse la psychologie et en particulier au stress psychologique des
tudiants. En 1898, il publie avec Alfred BINET un ouvrage intitul La fatigue intellectuelle,
dans lequel ils prsentent de nombreuses donnes physiologiques rythmes cardiaques
et respiratoires, pression sanguine, temprature corporelle, sensibilit cutane
mesures lors dactivits intellectuelles et qui fut longtemps cit en rfrence.
Convaincu que la psychologie repose sur la physiologie et finalement sur la physique
et la chimie molculaire, il poursuit sa formation comme assistant la Sorbonne dans
le laboratoire du professeur Albert DASTRE qui a t un lve de Claude BERNARD et est
un fervent dfenseur de lapplication des tudes physico-chimiques des problmes
de physiologie. Il va se former ltude quantitative des ractions enzymatiques et

de la catalyse dans le laboratoire de Wilhelm OSWALD Leipzig. Le 20 fvrier 1903, il
obtient le titre de docteur s Sciences grce une thse intitule Lois gnrales de
laction des diastases dans laquelle il rduit lactivit des agents biologiques aux lois
fondamentales de la chimie-physique et introduit une quation fondamentale
rgissant la cintique des ractions enzymatiques. En 1907, HENRI devient matre de
confrence la Sorbonne o il enseigne la chimie physique.
Bien quil continue sintresser la matire dans son tat collodal, cest cette poque
quil commence sintresser aux interactions entre les radiations lectromagntiques
et la matire biologique, et la photochimie, un sujet de recherche quil poursuivra dans
la suite de sa carrire et qui lui vaudra une nouvelle reconnaissance internationale.
Avec Ren WURMSER, il montre que les molcules passent, sous laction de la lumire,
dans un tat activ qui est pralable la raction elle-mme. Cette notion importante
dtat activ sous linfluence de la lumire aura dimportantes applications dans ltude
de la photosynthse.
La premire guerre mondiale va cependant interrompre ses travaux. Durant cette priode,
il est envoy en Russie o, au titre dattach franais, il est charg dorganiser lindustrie
chimique en vue de la dfense nationale. Aprs la rvolution dOctobre, il obtient une
chaire de physiologie lUniversit CHONIAWSKI de Moscou. Il y poursuit ses travaux de
photochimie en analysant et publiant les rsultats quil avait obtenus Paris.
En 1920, son retour de Russie, il est nomm professeur de chimie physique lUniversit
de Zrich o il a pour collgue Hermann WEYL, Erwin SCHRDINGER et Peter DEBYE. Cest
pendant son sjour Zrich quil fait une importante dcouverte dans le domaine de la
physique molculaire en tudiant la largeur des bandes dabsorption de molcules
gazeuses, la pr-dissociation des molcules dans leur tat activ. Il publie ce concept
fondamental de la photochimie dans une monographie intitule Structures des molcules
(1925). En 1927, il publie avec Rn WURMSER une autre contribution importante pour la
photochimie. Ils comparent le nombre de quanta absorbs au nombre de molcules qui
ragissent et concluent que le principe dquivalence photochimique tabli par Einstein
(selon lequel le nombre de molcules ragissant avec la lumire est gal au nombre de
quanta absorbs) nest pas respect car dans la majorit des cas, les phnomnes
mesurs comprennent plusieurs ractions lmentaires successives et le rendement
quantique est diffrent de un.
En 1930, il quitte Zrich et sinstalle proximit de Marseille o il doit prendre la direction
dun institut de ptrochimie. Ce projet ne verra jamais le jour et en 1931, Victor HENRI est
nomm titulaire de la chaire de chimie physique lUniversit de Lige. A Lige, il poursuit
ses tudes de photochimie, dveloppant notamment la spectroscopie des molcules
polyatomiques et commence sintresser lactivation thermique. Il utilise galement la
spectroscopie pour caractriser la structure dhormones et de vitamines et pour doser
ces molcules. Il retrouve Peter DEBYE, invit Lige pour un an en tant que titulaire de la
chaire FRANCQUI. En 1933, HENRI publie son cours donn lUniversit de Lige sous le titre
Physique molculaire : Matire et nergie.
La guerre interrompt une seconde fois ses recherches. En 1940, il rentre en France pour
se mettre au service de la dfense nationale et rejoint LANGEVIN au Centre national de
recherche scientifique applique franaise. Il meurt cette anne-l La Rochelle des
suites dune congestion pulmonaire.
Rfrences
C. DEBRU - 1991 - Victor HENRI, dans Dictionary of Scientific Biography Supplement II,
vol. 1 : 410-413
C. DEBRU - La photosynthse : Victor HENRI, Otto WARBURG, Rn WURMSER
J. DUCHESNE - 1967 - dans Liber Memorialis de lUniversit de Lige, tome II : 471-478
3.1.5. La notion de site actif et le mcanisme daction des enzymes
Les progrs raliss au dbut du XXe sicle dans la connaissance de la nature et de

la structure des protines, ont progressivement conduit au dveloppement de la
notion de site actif. La premire reprsentation dun substrat se fixant la surface
dun enzyme a t propose par E.F. ARMSTRONG en 1904 pour expliquer la stro-
spcificit des enzymes (figure 3.4). Aujourdhui, on dfinit le site actif comme la
rgion particulire de lenzyme au sein de laquelle se droule la raction enzy-
matique proprement dite. De manire gnrale, le site actif a une taille restreinte
par rapport la taille globale de la protine, il est dfini dans les trois dimensions et
est souvent localis dans une crevasse caractrise par un micro-environnement
spcifique. Cest larrangement des atomes constituant le site actif qui va dterminer
la spcificit daction de lenzyme et la slection prcise du substrat, la molcul de
substrat devant sadapter la forme et aux proprits de fixation de ce site actif.
a b
OH H
H HO
H H OH OH
RO H
O H H
a - Reproduction de la premire reprsen-

tation schmatique dun substrat dans
son site actif due E.F. ARMSTRONG (1904)
A cette poque, le glucose tait reprsent
sous la forme dun cycle 5 pices et la
structure de lenzyme dont la nature ntait
pas tablie tait matrialise par un trait
gras. Malgr sa simplicit, cette reprsen-
tation mettait dj en vidence le contact
intime existant entre lenzyme et le substrat.
b - Reprsentation moderne du site actif de la chymotrypsine (code pdb : 1GG6)
occup par un inhibiteur laide du logiciel VMD (HUMPHREY, DALKE et SCHULTEN, 1996)
Lenzyme est reprsent sous la forme dune surface. Les parties ombres indiquent les
rsidus essentiels directement impliqus dans la catalyse chimique ou dans la fixation de
linhibiteur. Linhibiteur est reprsent de manire simplifie (Image prpare par H. VALADIE).
3.4 - Reprsentation du site actif des enzymes
La reprsentation de la structure du site actif des enzymes a volu avec les progrs
raliss la fois dans la dtermination exprimentale de la structure des protines et
dans le dveloppement des logiciels de visualisation de ces structures.
Les progrs dans ltude des mcanismes enzymatiques ont conduit au dveloppe-
ment dun second modle dcrivant linteraction entre le substrat et lenzyme. Le
premier, illustr dans la figure 3.2, a t introduit par FISCHER et repose sur
lexistence dune complmentarit entre le substrat et le site actif de lenzyme qui
peut tre compare celle existant entre une cl et une serrure. Le second modle,
propos ultrieurement par KOSHLAND, implique un changement de conformation
du site actif de lenzyme lors de la fixation du substrat.
Ce modle est connu sous le nom dajustement induit (induced-fit) et est illustr
dans la figure 3.5. Ce modle implique que lenzyme slectionne spcifiquement
son substrat, non sur la base dune complmentarit statique entre lenzyme et le
substrat, mais en agissant comme des pinces qui se renferment pour piger le
substrat. Lenzyme devient actif uniquement dans sa forme ferme impliquant une
rgulation de lactivit par la fixation du substrat.
Groupe
catalytique 3
Site actif
Substrat (A)
Enzyme
Groupe Groupe
catalytique 1 catalytique 2
Enzyme (E) Complexe (EA)
3.5 - Illustration du mcanisme dajustement induit propos par KOSHLAND
3.2. DESCRIPTION CINTIQUE DES RACTIONS ENZYMATIQUES

DANS DES CONDITIONS DQUILIBRE
3.2.1. La premire quation cintique : lquation de HENRI
Comme nous lavons vu ci-dessus, HENRI a driv la premire quation de vitesse

reprsentant correctement le mcanisme daction des enzymes. Le principe fonda-
mental du fonctionnement des enzymes, tel quHENRI lenvisage, est la formation
dun complexe enzyme-substrat, EA, en quilibre avec le substrat libre. Ce
mcanisme implique une premire tape de fixation du substrat sur lenzyme et une
seconde tape de conversion du substrat en produit, qui se droule au sein du
complexe enzyme-substrat (EA). La seconde tape se termine par la libration du
produit. Si nous considrons la cas simple o [ P ]0 = 0 et la vitesse initiale de la
raction est mesure ( 4.1.2), ce mcanisme est reprsent par le schma suivant :
Ka k2
E+A EA E+P [3.3]
o A et P reprsentent respectivement le substrat et le produit, E lenzyme libre,
EA le complexe enzyme-substrat, et o Ka est la constante de dissociation du
complexe enzyme-substrat EA :
[ E ][ A ]
Ka = [3.4]
[ EA ]
Comme nous lavons dit, HENRI suppose lexistence dun quilibre rapide pour la
formation du complexe EA partir de lenzyme libre et du substrat libre et cest
partir de ce modle quil a obtenu lquation de vitesse prsente dans lqua-
tion [3.1]. Il est utile de se rappeler quen enzymologie, la constante dquilibre est
gnralement dfinie dans le sens de la dissociation du complexe, ce qui conduit
une constante dquilibre Ka exprime en units apparentes de concentration. Dans
le cas de ractions enzymatiques complexes, cette convention simplifie considra-
blement lquation de vitesse par rapport lutilisation de constantes dassociation.
La formulation mathmatique dun mcanisme enzymatique et lcriture de lqua-
tion de vitesse correspondante sont gnralement des tapes difficiles raliser par
les tudiants. A cette difficult sajoute le fait que le problme peut tre rsolu de
diverses manires et que souvent les ouvrages de rfrence se limitent au traitement
dtaill des cas simples, ne prsentant que lquation finale de vitesse pour les
mcanismes plus complexes. Nous prsentons ici une mthode gnrale et simple
pour lcriture des quations de vitesse qui repose sur lapplication successive de
trois rgles. Nous lappliquerons dabord au cas simple dune raction un seul
substrat dans des conditions irrversibles (quation [3.3]), mais nous appliquerons
systmatiquement cette mthode dans la suite de ce livre pour driver les quations
de vitesse de ractions plus complexes. Une autre mthode, mieux adapte au traite-
ment de systmes complexes, sera prsente dans le chapitre 6.
La premire rgle consiste appliquer la loi daction de masses pour dfinir la
vitesse de formation du produit P :
d[ P ]
v = = k 2 [ EA ] [3.5]
dt
La mesure de la concentration instantane du complexe [ EA ] est gnralement
difficile, souvent peu commode, et voire mme impossible. En utilisant lqua-
tion [3.4] qui peut scrire de la manire suivante :
[ E ][ A ]
[ EA ] = [3.6]
Ka
[ E ][ A ]
nous obtenons : v = k2 [3.7]
Ka
Puisque la concentration instantane denzyme [ E ] est aussi difficile mesurer
que celle du complexe EA, il serait prfrable dexprimer la vitesse en terme de
concentration initiale denzyme [ E ]0 qui constitue gnralement un paramtre

contrlable dans une exprience de cintique enzymatique.
La deuxime rgle consiste utiliser lquation de conservation de lenzyme
pour exprimer lquation [3.7] en fonction de la concentration initiale denzyme
et non de concentration denzyme libre. Dans le mcanisme de lquation [3.3],
lenzyme existe soit sous forme libre, soit sous forme complexe avec le substrat
EA et nous pouvons donc crire :
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ] [3.8]
En combinant cette quation avec lquation [3.6], nous obtenons :
[ E ][ A ] [ A]
[ E ]0 = [ E ] + = [ E ]( 1 + ) [3.9]
Ka Ka
qui fournit une expression de la concentration denzyme libre partir de la
concentration initiale denzyme :
[ E ]0
[E] = [3.10]
D
o D = 1 + [ A ] Ka reprsente le dnominateur de lquation [3.10]. Une fois
cette expression obtenue, nous pouvons lintroduire dans lquation [3.7] :
v = k2
([ E ]0 D )[ A ] [3.11]
Ka
A ce stade, la vitesse de la raction nest dfinie que si la concentration instan-
tane de substrat libre, [ A ] , peut tre mesure, ce qui nous amne introduire
la troisime rgle.
La troisime rgle consiste imposer une contrainte sur le systme permettant de
connatre la concentration instantane de substrat libre partir de la concentration
initiale de substrat. En gnral, les enzymes sont tudis dans des conditions o la
concentration denzyme [ E ]0 est beaucoup plus faible que la concentration de
substrat [ A ]0 . Ainsi, lquation de conservation du substrat scrit comme suit :
[ A ]0 = [ A ] + [ EA ] [3.12]
o nous pouvons ngliger [ EA ] vis--vis de [ A ] . En se plaant dans des condi-
tions de vitesse initiale, nous pouvons donc assimiler la concentration instantane
de substrat la concentration initiale : [ A ]0 = [ A ] . Cette situation est valable
pour la majorit des tudes ralises in vitro, mais il est important de noter quin
vivo la situation o [ E ]0 [ A ] est trs courante. Dans ce cas, [ EA ] ne peut
plus tre nglig dans lquation [3.12], et lquation de vitesse prend une forme
plus complexe (voir ci-dessous).
En appliquant successivement ces trois rgles, nous obtenons lquation de vitesse
suivante :
[ E ]0 [ A ]0 [ A ]0 Ka
v = k2 = k 2 [ E ]0 [3.13]
D Ka 1 + ( [ A ]0 Ka )
Le terme de droite de lquation [3.13] est identique lquation de HENRI (qua-

tion [3.2]) pour une raction enzymatique simple nimpliquant pas dinhibition par
le produit o les paramtres de HENRI sont assimils ceux de lquation [3.13] :
k = k 2 Ka [ E ]0 et m = 1 Ka . En remplaant ces termes dans lquation [3.2],
nous pouvons donc rcrire lquation de HENRI de la manire suivante :
k 2 [ E ]0 ( [ A ]0 Ka )
v = [3.14]
1 + ( [ A ]0 Ka )
Dans la majorit des ouvrages traitant de la cintique enzymatique, lquation [3.14]

est obtenue plus simplement en extrayant une expression de [ E A] en fonction de la
concentration initiale denzyme partir lquation de conservation de lenzyme.
Nanmoins le passage par lcriture dune expression de [ E ], comme nous lavons
fait dans lquation [3.10], permet une application plus gnrale puisque la forme
libre de lenzyme est toujours prsente dans le mcanisme ractionnel quelle que soit
la complexit de ce mcanisme. Ainsi, la mthode de drivation de lquation de
vitesse prsente ici, peut sembler complexe mais comme nous le verrons dans les
chapitres suivants, son utilisation simplifiera la procdure de drivation pour des
mcanismes enzymatiques plus complexes.
3.2.2. Le traitement de MICHAELIS et MENTEN
MICHAELIS et MENTEN sintressaient galement la raction dhydrolyse du

saccharose catalyse par linvertase. En contrlant le pH de la solution laide
dun tampon actate, et en laissant voluer la raction de mutarotation du produit
jusqu lquilibre, MICHAELIS et MENTEN (1913) ont valid les rsultats obtenus
par HENRI. Ils ont ralis leurs mesures dans des conditions de vitesse initiale
vitant ainsi un certain nombre de complications comme le droulement de la rac-
tion inverse, linhibition par le produit ou la dnaturation progressive de lenzyme.
Sur la base de ces rsultats, MICHAELIS et MENTEN ont propos un mcanisme
similaire celui de HENRI et ont driv lquation de vitesse correspondante.
k [ E ]0 [ A ]
v = 2 [3.15]
Ka + [ A ]
o Ka est la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat et k2 la
constante de vitesse pour la conversion du complexe enzyme-substrat en enzyme
libre et en produit. La drivation de cette quation de vitesse reposait sur les
mmes hypothses que celles faites par HENRI, nommment que le premier
quilibre entre lenzyme et le substrat est tabli rapidement et que la concentration
de substrat est largement suprieure la concentration denzyme. Bien que, dans sa
thse de doctorat, Victor HENRI voque galement lutilit davoir recours la
mesure de vitesses initiales, MICHAELIS et MENTEN sont galement lorigine de
lutilisation systmatique de ce type de mesure dans la cintique enzymatique.
Dans leur publication, MICHAELIS et MENTEN reconnaissaient limportance des

travaux de HENRI : Les expriences de HENRI sont particulirement importantes,
parce quil est parvenu une conception rationnelle de la nature de laction
enzymatique qui a permis une formulation mathmatique de lvolution de laction
dun enzyme qui rende compte des observations sur de nombreux points.
Lquation [3.15] drive par MICHAELIS et MENTEN est une simple variante de
lquation de vitesse [3.14] propose par HENRI (1903) et peut tre obtenue
directement partir de lquation de HENRI en multipliant le numrateur et le
dnominateur par Ka :
[ A]
k 2 [ E ]0 Ka
Ka k [ E ]0 [ A ]
v = = 2 [3.16]
[ A] Ka + [ A ]
1 + Ka
Ka
Lquation [3.15] est parfois appele lquation de HENRI, MICHAELIS et MENTEN
mais parce que les expriences de MICHAELIS et MENTEN ont t ralises dans des
conditions mieux dfinies et mieux contrles, ces chercheurs sont gnralement
reconnus comme les fondateurs de lenzymologie moderne, et lquation de vitesse
dune raction enzymatique simple est gnralement connue comme lquation de
MICHAELIS et MENTEN. En plus du ct historique, lutilisation gnralise de la
forme de MICHAELIS et MENTEN, tient dans la simplicit de son criture et de son
analyse. Comme nous le verrons dans le 3.5, elle peut facilement tre crite sous
diffrentes formes linaires.
Maud M ENT EN (1879-1960) 2

Maud MENTEN est ne Port Lambton dans lOntario et est devenue en 1911 la premire
femme canadienne recevoir un doctorat en mdecine. Son travail avec MICHAELIS sur
linvertase ntait quun intermde dans sa carrire essentiellement dvolue la
pathologie et aux aspects mdicaux de la biochimie et de la physiologie. Elle a pass la
majeure partie de sa carrire lUniversit de Pittsburgh, mais elle est retourne au
Canada aprs sa retraire.
2. Pour la biographie de Leonor MICHAELIS, voir chapitre 8.

3.3. DESCRIPTION CINTIQUE DES RACTIONS ENZYMATIQUES

DANS DES CONDITIONS DTAT STATIONNAIRE
3.3.1. Les premires utilisations de la notion dtat stationnaire
Au moment o MICHAELIS et MENTEN publiaient leurs rsultats sur linvertase,

VAN SLYKE et CULLEN (1914) obtinrent des rsultats similaires avec lurase et
proposrent un mcanisme identique, except quils supposrent une premire
tape irrversible :
k1 k2
E+A EA E+P [3.17]
Dans ce cas, la concentration du complexe, [ E A], ne peut tre obtenue partir de

la constante d'quilibre mais peut tre obtenue uniquement partir de lquation
diffrentielle dcrivant la variation de la concentration du complexe EA en
fonction du temps :
d [ EA ]
= k1 ([ E ]0 [ EA ])[ A ] k 2 [ EA ] [3.18]
dt
En faisant lhypothse que la concentration de lintermdiaire est constante, c'est--
dire que d [ EA ] dt = 0 , VAN SLIKE et CULLEN ont obtenu lquation suivante :
k1 ([ E ]0 [ EA ] )[ A ] k 2 [ EA ] = 0 [3.19]
k1 [ E ]0 [ A ]
[ EA ] = [3.20]
k1 [ A ] + k 2
En substituant lquation [3.20] dans lquation de vitesse v = k 2 [ EA ] , ils ont
finalement obtenu lquation de vitesse suivante :
k k [ E ]0 [ A ] k [ E ]0 [ A ]
v = k 2 [ EA ] = 1 2 = 2 [3.21]
k 2 + k1 [ A ] (k 2 k1 ) + [ A ]
La seule diffrence entre cette quation et lquation [3.15], rside dans le
remplacement de Ka par le rapport k2/k1 (la constante Ka est gale au rapport k1/k1),
une situation qui est en pratique indiscernable.
A la mme poque o ont lieu ces dveloppements dans la comprhension de la
cintique enzymatique, LANGMUIR (1916, 1918) dveloppe une formulation iden-
tique pour expliquer ladsorption de gaz sur des solides. Son traitement est
beaucoup plus gnral, mais le cas simple de ladsorption dune molcule sur une
surface correspond exactement au type de fixation propos par HENRI et par
MICHAELIS et MENTEN. LANGMUIR reconnat dailleurs la similarit entre les
surfaces solides et les enzymes, mais il imagine que la surface entire de lenzyme
est active , par opposition la surface limite qui correspond au site actif.
HITCHCOCK (1936) souligne galement la similarit entre les quations pour la

fixation de ligands sur des surfaces solides et sur des protines. Cette comparaison
est complte par celle de LINEWEAVER et BURK (1934), qui tendent les ides de
HITCHCOCK aux processus catalytiques.
3.3.2. Le traitement de BRIGGS et HALDANE
Comme nous lavons vu, la formulation de HENRI et celle de MICHAELIS et

MENTEN conduisent une forme identique de lquation de vitesse. Dans ces deux
cas, le fait de traiter la premire tape de la raction enzymatique comme un
quilibre impose des hypothses injustifies sur la dtermination des constantes de
vitesse. Il en va de mme pour le mcanisme propos par VAN SLYKE et CULLEN
qui repose sur lhypothse de deux tapes irrversibles. B RIGGS et HALDANE
(1925) ont propos un mcanisme plus gnral qui se rduit au mcanisme de
HENRI, MICHAELIS et MENTEN dans des cas particuliers. Le modle utilis par
BRIGGS et HALDANE est le suivant :
k1 k2
E+A EA E+P [3.22]
k1
o le premier quilibre est dcrit par des constantes individuelles de vitesse pour
les ractions directe et inverse. Dans ce cas, la variation de la concentration du
complexe EA est donne par la somme des vitesses de sa formation et de sa
dissociation :
d [ EA ]
= k1 ([ E ]0 [ EA ])[ A ] k 1 [ EA ] k 2 [ EA ] [3.23]
dt
BRIGGS et HALDANE ont argument quun tat stationnaire peut tre atteint pour
lequel la concentration de lintermdiaire est constante, c'est--dire d [ EA ] dt = 0 .
Pour obtenir lquation de vitesse, v = d [ P ] dt , les trois rgles dcrites pour le
cas dquilibre peuvent tre adaptes de la manire suivante.
La vitesse nette de la raction est obtenue en appliquant la loi daction de masses
ltape de conversion de EA en produit :
v = k 2 [ EA ] [3.24]
Lquation de conservation de lenzyme reste la mme que lquation [3.8] :
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ] [3.25
mais pour obtenir une expression de la concentration denzyme libre en fonction
de la concentration initiale denzyme, B RIGGS et HALDANE appliquent au
complexe EA le principe dtat stationnaire dvelopp par BODENSTEIN :
d [ EA ] d [ EA ]
= = 0 [3.26]
dt dt
A partir de lquation [3.23] qui exprime la variation de la concentration du com-

plexe EA en fonction du temps, lhypothse dun tat stationnaire impose que :
d [ EA ]
= k 2 [ E ][ A ] ( k 1 + k 2 )[ EA ] = 0 [3.27]
dt
do nous obtenons : k1 [ E ][ A ] = ( k 1 + k 2 )[ EA ] [3.28]
k1
et [ EA ] = [ E ][ A ] [3.29]
( k 1 + k 2 )
En introduisant lquation [3.29] dans lquation de conservation [3.25], on
obtient lquation suivante :
k1 k1
[ E ]0 = [ E ] + [ E ][ A ] = [ E ] 1 + [ A ] [3.30]
k 1 + k 2 k 1 + k 2
Cette quation relie la concentration denzyme libre la concentration initiale
denzyme et peut scrire sous une mme forme que lquation [3.10] :
[ E ]0
[E] = [3.31]
D
bien que lexpression de D soit diffrente :
k1
D = 1+ [ A] [3.32]
k 1 + k 2
Si lhypothse [ A ]0 >> [ E ]0 est respecte, lquation de conservation du
substrat se simplifie comme prcdemment et nous pouvons crire [ A ] [ A ]0 .
Concentration
Etat stationnaire
d[EA]
= 0 P
dt
EA E
Temps
3.6 - Variations de [ A ], [ EA ], [ E ] et [ P ]
pour une raction enzymatique ltat stationnaire
A partir de ces trois rgles, nous pouvons crire lquation de vitesse :

k1 [ E ]0
v = k2 [ A ]0 [3.33]
k 1 + k 2 D
Cette quation peut tre simplifie en multipliant le numrateur et le dnominateur
par ( k 1 + k 2 ) k1 , ce qui permet dobtenir lquation suivante :
k 2 [ E ]0 [ A ]0
v = [3.34]
k 1 + k 2
+ [ A ]0
k1
3.3.3. Lquation de MICHAELIS et MENTEN
Aujourdhui, les noms de MICHAELIS et de MENTEN sont couramment associs

une forme gnrale de lquation de vitesse qui utilise indiffremment lhypothse
de ltat stationnaire ou lhypothse de lquilibre. Cette forme gnrale de lqua-
tion de vitesse, dnomme quation de MICHAELIS et MENTEN, est donne par
lquation suivante :
k [ E ]0 [ A ]
v = 0 [3.35]
Km + [ A ]
dans laquelle la constante k2 est remplace par k0 et le rapport (k1+k2)/k1 de
lquation [3.34] est remplac par Km, la constante de MICHAELIS. Lquation [3.35]
est plus gnrale que lquation [3.15] et sapplique des mcanismes plus
complexes que le mcanisme simple considr par MICHAELIS et MENTEN. Dans de
nombreux mcanismes complexes, lquation [3.35] reste valable, mais la cons-
tante k0 ne fait pas obligatoirement rfrence la constante de vitesse dune tape
individuelle du mcanisme et la constante Km ne reste pas obligatoirement quiva-
lente la constante de dissociation du complexe EA ou au rapport (k1+k2)/k1.
La constante k0 conserve nanmoins les proprits dune constante de vitesse de
premier ordre et dfinit la capacit du complexe enzyme-substrat former le
produit de la raction. Pour cette raison, la constante k2 de lquation [3.34] peut
tre remplace par k0. Elle est aussi connue comme la constante catalytique et est
souvent symbolise par kcat plutt que par k0. Alternativement, elle reprsente le
nombre de cycles catalytiques (turnover), faisant allusion au fait quelle correspond
linverse dun temps et quelle dfinit le nombre de cycles que lenzyme ralise
par unit de temps.
Au dbut de ltude des mcanismes enzymatiques, la vritable molarit de
lenzyme, c'est--dire [ E ]0 , tait gnralement inconnue, ce qui compliquait
lutilisation de lquation de MICHAELIS et MENTEN dans la forme illustre par
lquation [3.35]. Cette difficult tait gnralement contourne en combinant k0 et
[ E ]0 en une constante unique V = k0 [ E ]0 , appele la vitesse limite qui, du fait de
sa dpendance la concentration de lenzyme, ne reprsente pas une proprit
fondamentale de lenzyme.
Ainsi, lquation de MICHAELIS et MENTEN est couramment crite comme suit :

V [ A]
v = [3.36]
Km + [ A ]
Afin dviter toute confusion avec la vitesse de la raction, v, la vitesse limite V est
habituellement dnomme la vitesse maximum, et est parfois crite Vmax ou Vm. Ces
termes et symboles sont drivs de la dnomination ancienne (et encore souvent
utilise, bien que son utilisation soit dcourage par le Comit de Nomenclature
IUBMB (IUB, 1982) parce quelle ne correspond pas un maximum au sens
mathmatique du terme, mais une limite). Lutilisation du symbole Vm est par-
ticulirement dconseille parce quil peut, de manire errone, suggrer une
correspondance avec lindice m de la constante K m . En ralit, lindice m de la
constante K m est pour MICHAELIS, un hommage qui tait plus clair avec lancien
usage du terme KM.
Dans certains cas, il est utile de normaliser la vitesse v par rapport la vitesse
limite V. Lquation de HENRI (quation [3.14]) scrit alors de la manire suivante :
v = [ A ]0 1 + [ A ]0 [3.37]
V Ka Ka
et lquation de MICHAELIS et MENTEN ((quations [3.15] et [3.35]) scrit :
v = [ A]
[3.38]
V Km + [ A ]
3.3.4. Analyse de la courbe dfinie par lquation de MICHAELIS et MENTEN
La courbe dfinie par lquation [3.36] et prsente dans la figure 3.7 a la forme
dune hyperbole rectangulaire passant par lorigine et ayant les asymptotes
suivantes : [ A ] = K m et v = V. En fonction de la concentration de substrat, trois
situations exprimentales peuvent tre distingues qui vont dfinir trois rgions
dans le graphique de v en fonction de [ A ] .
Situation o [ A ] << Km
Pour de faibles valeurs de [ A ] , largement infrieures Km , le dnominateur du terme
de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par Km ; en dautres termes, [ A ]
est ngligeable par rapport Km et la vitesse v est directement proportionnelle [ A ] :
k
v = 0 [ E ]0 [ A ] = V [ A ] [3.39]
Km Km
c'est--dire que la vitesse de la raction est approximativement dordre global deux,
mais dordre un par rapport au substrat. Il est instructif de raliser que k0 Km ne
reprsente pas uniquement le rsultat de la division de k0 par K m mais que ce
rapport correspond la constante de vitesse de second ordre pour la raction
E+A E + P mesure pour de faibles concentrations de substrat. Ce
paramtre est appel la constante de spcificit pour des raisons qui seront
dveloppes dans la section [3.5], et peut tre symbolise par kA, o lindice
indique quel substrat il fait rfrence.
v = k A [ E ]0 [ A ] [3.40]
Le paramtre Km V , linverse du paramtre V Km , a les dimensions du temps et
peut tre appel le temps spcifique de la raction. Ce temps correspond au temps
qui serait ncessaire lenzyme pour consommer tout le substrat sil fonctionnait
en permanence dans des conditions de premier ordre et maintenait indfiniment la
mme vitesse (CORNISH-BOWDEN, 1987). Bien que cette dfinition soit particuli-
rement abstraite pour les conditions exprimentales habituelles, elle est trs utile
pour dfinir lactivit dans la cellule o de nombreux enzymes oprent dans des
conditions de premier ordre et maintiennent la mme vitesse pendant une longue
priode (parce que leur substrat est continuellement gnr) ; dans ces circons-
tances, le temps spcifique correspond au temps ncessaire pour consommer tout le
substrat.
v
V
Pente initiale = V/Km
0,83 V
0,75 V
0,67 V
0,5 V
0 1 Km 2 Km 3 Km 4 Km 5 Km [A]
3.7 - Dpendance de la vitesse initiale v vis--vis de la concentration [A]
pour une raction obissant lquation de MICHAELIS et MENTEN
Puisquaucun graphique de ce type na t utilis ou mme voqu par MICHAELIS et MENTEN,
il est inappropri de le nommer le graphique de MICHAELIS et MENTEN . Ils ont en ralit,
utilis un graphique de v en fonction de log [ A ] et ont utilis le fait quil a une pente
maximale gale 0,577 V (c'est--dire 0,25 V ln 10) comme moyen destimer la valeur de V
et, partir de celle-ci, obtenir la valeur de Km.
Situation o [ A ] = Km
Si [ A ] est gal Km , lquation [3.36] se simplifie et donne :
V [ A] 1
v = = V [3.41]
2[ A ] 2
Cette quation fournit une dfinition oprationnelle de Km , qui sapplique quel que
soit le mcanisme cintique auquel lquation de MICHAELIS et MENTEN est
applique ; nommment, Km reprsente la concentration de substrat pour laquelle la
vitesse est gale la moiti de la vitesse limite.
Situation o [ A ] >> Km
Pour des valeurs leves de [ A ] , largement suprieures celle de Km , le dnomi-
nateur du terme de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par [ A ] , c'est-
-dire que Km est ngligeable par rapport [ A ] , et que lquation se simplifie :
v = k0 [ E ]0 = V [3.42]
Dans ce cas, la raction est approximativement dordre zro en [ A ] car lenzyme est
satur en substrat. Ce rsultat est lorigine de la dnomination de vitesse limite
pour V.
3.3.5. Autres formes de lquation de MICHAELIS et MENTEN
Comme nous venons de le voir, trois paramtres peuvent tre utiliss pour
caractriser lquation de MICHAELIS et MENTEN si la concentration denzyme est
connue : la constante catalytique k0, la constante de spcificit kA et la constante de
MICHAELIS Km. Puisquau minimum, deux de ces paramtres sont ncessaires pour
dcrire le systme et que ces trois paramtres sont relis entre eux par lidentit
k A k0 Km , lquation de MICHAELIS et MENTEN peut galement scrire en
fonction des paramtres kA et k0 :
k k [ E ]0 [ A ]
v = 0 A [3.43]
k0 + k A [ A ]
ou en fonction des paramtres kA et Km :
k A [ E ]0 [ A ]
v = [3.44]
1 + ( [ A ] Km )
La forme courante de lquation de MICHAELIS et MENTEN, crite en fonction de k0

et de K m , doit sa popularit plus lhistoire quau caractre fondamental de ces
paramtres. Lutilisation de lquation [3.43] simplifierait en effet la discussion de
nombreux aspects de ltude des enzymes, tels que la distinction entre les diffrents
types dinhibition ou lestimation des paramtres par des mthodes graphiques ou
statistiques. Dans ce livre, nous suivrons la pratique courante et continuerons
dcrire lquation de MICHAELIS et MENTEN sous la forme de lquation [3.35]. Il
est toutefois bon de se rappeler, quelle que soit la manire dont lquation est
crite, que les paramtres fondamentaux de lquation de MICHAELIS et MENTEN
sont k0 et kA, et que de nombreux aspects du comportement des enzymes sont plus
aisment apprhends en considrant les effets sur lun ou lautre de ces deux
paramtres. En consquence, il est prfrable de considrer kA comme un paramtre
fondamental plutt que comme un paramtre driv et inversement de considrer
Km comme le rapport k0 k A .
3.3.6. Lquilibre comme un cas particulier de ltat stationnaire
Lquation [3.35] indique que la constante K m est une combinaison de constantes

de vitesse. Il est intressant de noter que, si k1 >> k2, c'est--dire si la raction
chimique est lente par comparaison avec la dissociation du complexe EA, k2 est
ngligeable vis--vis de k1 et nous obtenons :
k
Km = 1 = Ka [3.45]
k1
Cette simplification suggre que la situation dquilibre est simplement un cas
extrme de ltat stationnaire et il est facile de se convaincre que le traitement
propos par BRIGGS et HALDANE est plus gnral que celui propos par MICHAELIS
et MENTEN. Un grand nombre douvrages de rfrence ont suggrs que le
traitement de BRIGGS-HALDANE est le seul valable , et quil a remplac celui de
MICHAELIS et MENTEN plus naf . En ralit, il existe deux objections srieuses
au fait que lquation [3.34] reprsente une amlioration par rapport aux quations
[3.14] et [3.15] et puisse tre considre comme une forme gnrale de lquation
de vitesse. Premirement, lquation [3.34] implique que la raction soit irrver-
sible, alors que toutes les ractions enzymatiques sont rversibles. Deuximement,
lquation [3.34] implique lexistence dun complexe entre lenzyme et le substrat
mais pas entre lenzyme et le produit. Le traitement du substrat et du produit est
conceptuellement diffrent mais nous reviendrons sur ces points dans le 3.7. En
attendant, la meilleure leon tirer de cette analyse est de considrer lquation
[3.34] comme la manire la plus approprie dcrire lquation de vitesse pour une
raction un substrat. A moins quil ny ait des raisons suffisantes pour suspecter
lexistence dun quilibre rapide, un mcanisme enzymatique devrait toujours tre
analys sur la base de lhypothse dun tat stationnaire.
3.3.7. Validit et limites de lhypothse de ltat stationnaire
Lobtention de lquation [3.34] repose sur lhypothse de lexistence dun tat

stationnaire au cours duquel d [ EA ] dt = 0 . En ralit, lquation [3.23] peut
facilement tre intgre si [ A ] est trait comme une constante, et il est instructif
de driver lquation de vitesse sans faire lhypothse de ltat stationnaire, parce
que cette dmarche permet de tester la validit de cette hypothse.
En sparant les deux variables, [ EA ] et t, nous obtenons :

d [ EA ]
k [ E ] [ A ] ( k [ A ] + k + k )[ EA ] = dt [3.46]
1 0 1 1 2
En dpit de son apparence plus complexe, le terme de gauche de cette quation a la

mme forme que la plupart des intgrales que nous avons dj rencontres ( 1.1)
et peut facilement tre intgr en utilisant la mme mthode. Nous obtenons ainsi
lquation suivante :
ln[ k1 [ E ]0 [ A ] ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ]]
= t +a [3.47]
( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )
Au dbut de la raction, aucun complexe EA nest prsent, c'est--dire que
[ EA ] = 0 quand t = 0, et donc nous obtenons une expression pour la constante a :
ln( k1 [ E ]0 [ A ])
a = [3.48]
( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )
et donc :
k [ E ]0 [ A ] ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ]
ln 1 = ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )t [3.49]
k1 [ E ]0 [ A ]
En prenant lexponentielle de chaque terme de cette quation, nous obtenons :
( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ]
1 = e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t [3.50]
k1 [ E ]0 [ A ]
et en rsolvant cette quation pour [ EA ], nous obtenons une expression de la
valeur instantane de [ EA ] :
k1 [ E ]0 [ A ]( 1 e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t )
[ EA ] = [3.51]
k1 [ A ] + k 1 + k 2
La vitesse est donne par v = k 2 [ EA ] et, en substituant V = k 2 [ E ]0 et
Km = ( k 1 + k 2 ) k1 , nous obtenons :
V [ A ]( 1 e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t )
v = [3.52]
Km + [ A ]
Pour de grandes valeurs de t, le terme exponentiel approche e , c'est--dire zro,
et ainsi lquation [3.52] devient identique lquation [3.36], c'est--dire lqua-
tion de MICHAELIS et MENTEN. La valeur de t pour laquelle cette simplification
sapplique dpend de la grandeur du terme ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 ) : si ce dernier terme
est de lordre de 1 000 s1 (une valeur raisonnable dans la pratique), le terme
exponentiel prend une valeur infrieure 0,01 pour des valeurs de t suprieures
5 ms. En dautres termes, lquation [3.52] nest plus distinguable de lquation
de MICHAELIS et MENTEN aprs seulement quelques millisecondes.
Quand nous avons driv lquation [3.52], nous avons trait [ A ] comme une
constante, une supposition qui nest pas strictement correcte puisque [ A ] change
au cours de la raction. Toutefois, condition que [ A ]0 soit beaucoup plus grand
que [ E ]0 , une condition gnralement satisfaite dans les expriences ralises
ltat stationnaire, la variation de [ A ] peut tre nglige. LAIDLER (1955) a driv
une quation similaire lquation [3.52] comme un cas particulier dun traitement
beaucoup plus gnral dans lequel il prend en compte une diminution de [ A ]
partir de sa valeur initiale [ A ]0 . Il a obtenu quun tat stationnaire est atteint pour
lequel :
V ([ A ]0 [ P ])
v = [3.53]
Km + [ A ]0 [ P ]
qui est similaire lquation [3.36] lexception du remplacement de [ A ] par
([ A ]0 [ P ]) . Il peut sembler contradictoire que nous parlions dun tat sta-
tionnaire dans lequel v doit dcrotre lorsque [ P ] augmente, mais cette diminution
de v est extrmement lente compare laugmentation rapide de v qui survient lors
la phase transitoire, c'est--dire la priode pour laquelle lquation [3.52] doit tre
utilise, avant que ltat stationnaire ne soit atteint. Largument de B RIGGS et de
HALDANE doit seulement tre lgrement modifi en remplaant lhypothse
d [ EA ] dt = 0 par lhypothse que d [ EA ] dt est trs petit : lquation [3.27] ne
peut alors plus tre considre comme une exactitude mais plutt comme une
bonne approximation. Comme WONG (1975) la fait remarquer, limportant nest
pas la grandeur absolue de d [ EA ] dt mais sa grandeur relative vis--vis de
k1 [ E ]0 [ A ] .
3.4. UNITS DE LACTIVIT ENZYMATIQUE
Lactivit dun enzyme est obtenue par une mesure de la vitesse de la raction quil
catalyse dans des conditions dfinies. Puisque la vitesse de la raction varie avec la
concentration denzyme, il est utile de dfinir une grandeur qui soit indpendante
de la concentration denzyme utilise. Lactivit spcifique est dfinie comme
lactivit de lenzyme rapporte un milligramme denzyme alors que lactivit
molculaire est dfinie comme lactivit rapporte une mole denzyme. Cette
dernire correspond donc au nombre de molcules de substrat transformes par
molcule denzyme et par unit de temps. Le passage de lactivit spcifique
lactivit molculaire ncessite de connatre la masse molculaire de lenzyme.
Pour des enzymes dont la concentration molaire ne peut tre dtermine, soit parce
que lenzyme na pas pu tre purifi, soit parce que sa masse molculaire est
inconnue, il est souvent utile de dfinir une unit dactivit catalytique. Diffrents
systmes dunits peuvent tre utiliss. Lunit internationale adopte actuellement
est le katal mais danciens systmes sont encore utiliss. Dans les premiers temps
de ltude des enzymes, il tait courant de dfinir une unit dactivit qui corres-
pondait une quantit de substrat transforme par unit de temps et qui pouvait
tre diffrente selon lenzyme tudi. En 1961, lUnion Internationale de Bio-
chimie a donn une dfinition standard de lunit dactivit enzymatique. Une unit
denzyme reprsente la quantit denzyme qui catalyse la transformation dune
micromole de substrat par minute dans des conditions standards. Dans ce cas, la
temprature devra tre mentionne et si possible tre de 25oC. Les autres condi-
tions, telles que le pH, la force ionique et la concentration de substrat devraient, si
cela est pratiquement possible, tre optimales. Lunit denzyme est aujourdhui
abandonne dans les publications scientifiques mais elle est encore parfois utilise
par certaines compagnies spcialises dans la production denzyme. Lunit
internationale (SI) accepte aujourdhui pour reprsenter lactivit enzymatique est
le katal qui est dfini comme la quantit denzyme suffisante pour catalyser la
conversion d1 mole de substrat en produit en 1 seconde dans des conditions
standards. Un argument gnralement voqu contre lutilisation de cette unit est
que 1 katal est une quantit excessivement grande : une activit enzymatique
typique dans un extrait cellulaire est de lordre de 1 unit mL1 ou de 20 kat L1.
Toutefois, des objections plus svres nont pas empch lutilisation du farad
comme unit de capacit bien que ses sous-multiples soient plus couramment
utiliss. Similairement, il existe des sous-multiples du katal, tout comme le kat,
gal 60 units ou le nkat, gal 0,06 units, qui pourraient tre aisment utiliss
au laboratoire.
3.5. MTHODES DANALYSE DES DONNES CINTIQUES
3.5.1. Le graphique de v en fonction de [A]
Quand une srie de vitesses initiales est mesure diffrentes concentrations de

substrat, il est souhaitable de reprsenter les rsultats sous une forme graphique, de
sorte que les valeurs des paramtres cintiques puissent tre estimes et que la
prcision de ces dterminations soit tablie. La manire la plus directe de porter ces
donnes en graphique consiste tracer le graphique de v en fonction de [ A ]
comme dans la figure 3.7. Comme nous en avons dj discut au 1.2.7, il est
vident que la dtermination prcise des paramtres cintiques peut tre obtenue
par ajustement paramtrique non-linaire de ce graphe sur lquation de MICHAELIS
et MENTEN [3.36]. Nanmoins, dun point de vue didactique, ce graphique nest
pas entirement satisfaisant pour diverses raisons :
il est difficile de dessiner avec prcision une hyperbole rectangulaire,
il est difficile de dterminer la position des asymptotes (en gnral, on est tent
de les placer trop prs de la courbe),
il est difficile de percevoir les relations qui existent entre diffrentes courbes et
il est difficile de dtecter des dviations de la courbe par rapport une courbe
thorique.
Le graphique de v en fonction de [ A ] est parfois illustr de manire trompeuse

dans certains ouvrages de biochimie et mme dans certains ouvrages spcialiss
denzymologie. Pour cette raison, les tudiants acquirent une conception errone
de la forme de cette courbe et supposent que V peut tre estime partir dun
graphique des donnes exprimentales en lassimilant la valeur mesure de v0 la
plus leve. Lerreur la plus courante consiste dessiner une courbe qui saplatit
trop rapidement et donne une asymptote trop proche de la courbe. En ralit, v0
natteint jamais la valeur limite V pour une concentration finie de substrat A,
comme le montre lexamen de lquation [3.36] ; mme quand [ A ] = 10 Km (une
concentration suprieure celles habituellement utilises dans la majorit des
expriences) la valeur de v0 est toujours infrieure 90% de la valeur de V.
Ce point peut tre apprhend plus facilement en examinant une portion plus
grande de la courbe dfinie par lquation [3.36] que celle examine dans la
figure 3.7 : une telle vue de la courbe est prsente dans la figure 3.8, qui stend
dans les deux directions bien au del des valeurs habituelles de [ A ] , allant de zro
jusqu plusieurs fois la valeur de K m . Linclusion de valeurs ngatives sans
signification physique permet de comprendre la relation qui existe entre cette
courbe et les hyperboles tudies en mathmatiques, et montre que la dtermination
des valeurs de K m et de V partir de mesures exprimentales revient localiser le
point dintersection des deux asymptotes limitant une courbe infinie partir
dobservations localises sur un arc court. Lestimation de K m et de V nest donc
pas un problme trivial, mais est un problme qui requiert une bonne expertise, et
sur lequel nous reviendrons dans le 3.8 et au chapitre 12.
v
v=V
[A]
[A] = Km
3.8 - Dpendance de la vitesse initiale v vis--vis de la concentration de [A]

pour une raction qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN
La partie de la courbe allant de [ A ] = 0 jusqu 5 Km, c'est--dire la partie ombre de la
figure, est la mme que celle prsente dans la figure 3.7, mais la gamme des valeurs
prsentes est beaucoup plus tendue et inclut des valeurs physiquement impossibles, afin
dillustrer la relation de la courbe avec les deux asymptotes qui se croisent au point ( Km, V).
Ces difficults inhrentes lanalyse des donnes exprimentales avaient dj t

soulignes par MICHAELIS et MENTEN (1913) qui ont propos comme alternative
de porter en graphique v en fonction de log [ A ] (figure 3.9). Cette forme gra-
phique, mis part son ct historique, offre certains intrts. Elle permet galement
de mettre en vidence que la vitesse limite nest approche que pour des concen-
trations de substrat largement suprieures la valeur de Km (figure 3.9a). En
particulier, elle est utile pour comparer les proprits de diffrents isoenzymes qui
catalysent la mme raction mais avec des valeurs diffrentes des paramtres Km et V,
parce quelle permet de visualiser simultanment des rsultats tals sur une large
gamme de concentrations de substrat (figure 3.9b). Malgr ces avantages, ce type de
graphique nest pas couramment utilis par les enzymologistes et ne sera pas discut
plus en dtails ici.
3.5.2. Diffrentes mthodes de transformation linaire
Le graphique en double inverse ou graphique de LINEWEAVER et BURK

Depuis LINEWEAVER et BURK (1934), les biochimistes prfrent rcrire lquation
de MICHAELIS et MENTEN sous des formes conduisant une reprsentation linaire
des rsultats. La manire la plus communment utilise est le graphique en double
inverse, obtenu partir de lquation [3.36] en prenant linverse de chacun des
cts de lquation :
1 = 1 + Km 1 [3.54]
v V V [ A]
ou en effectuant la mme opration partir de lquation [3.43] :
[ E ]0
= 1 + 1 1 [3.55]
v k0 k A [ A ]
Cette seconde quation [3.55] accentue la correspondance entre k0 et k A, qui nest
pas clairement visible dans lquation de MICHAELIS et MENTEN en raison de
lutilisation de V et de K m . Quoi quil en soit, un graphique de 1 v en fonction
de 1 [ A ] donne une droite dont la pente vaut 1 k A [ E ]0 ( = Km v ) , lordonne
lorigine 1 k0 [ E ]0 ( = 1 v ) et lintersection avec laxe des abscisses vaut
k A k0 ( = 1 Km ) . Ce graphique, illustr dans la figure 3.10, est connu sous le
nom de graphique de LINEWEAVER et BURK ou sous le nom de graphique en double
inverse. Bien quil soit de loin le plus largement utilis en cintique enzymatique, il
est peu recommandable, car il donne une mauvaise apprciation des erreurs
exprimentales : les erreurs commises sur les petites valeurs de v acquirent une
importance dmesure et inversement, les erreurs commises sur les grandes valeurs
en v sont fortement minimises. Ce problme peut tre apprci en analysant la
taille des barres derreur dans la figure 3.10, qui sont clairement non-symtriques
bien quelles soient calcules partir derreurs exprimentales encadrant de
manire symtrique les valeurs de v.
v 12
10 Vitesse limite, V
0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 [A]/Km
a - Graphique de v en fonction de [ A ]/Km

Lutilisation dune chelle logarithmique pour laxe des abscisses montre que la vitesse limite
nest approche que pour des concentrations leves de substrat, suprieures 100 Km.
Concentration de glucose (mM)

0,001 0,01 0,1 1 10 100
100
Activit (% du maximum)
Hexokinase :
A
80
B
C
D ("glucokinase")
60
40
Gamme normale
de concentration
de glucose dans
20 les hpatocytes
0
6 5 4 3 2 1
log [Glucose (M)]
b - Dpendance de lactivit de quatre isoenzymes de lhexokinase
obtenues partir de foie de rat en fonction de la concentration de glucose
Lutilisation dune chelle logarithmique pour laxe des abscisses permet de visualiser sur le
mme graphique le comportement disoenzymes dont les proprits sont trs diffrentes.
Dessin partir de la figure 6.2 de CRDENAs (1995).
3.9 - Echelles logarithmiques
DOWD et RIGGS (1965) ont montr que le graphique en double inverse mini-
misait la mauvaise qualit des donnes, c'est--dire quil minimisait la divergence
des points exprimentaux, et ils ont suggr que cette proprit avait contribu le
rendre populaire parmi les biochimistes.
En principe, les problmes lis lutilisation du graphique en double inverse sont
limins en appliquant une pondration adquate sur les donnes, bien que cette
solution ne soit pas toujours satisfaisante. En effet, une telle procdure conduit
gnralement une droite ajuste qui, visuellement, reprsente mal les donnes.
Malgr ces aspects critiquables, aucun reproche ne peut tre formul lencontre
de LINEWEAVER et de BURK pour lusage inadquat du graphique en double
inverse, puisquils avaient reconnu ses limitations et prconisaient lutilisation
dune pondration des donnes. (LINEWEAVER et BURK, 1934 ; LINEWEAVER,
BURK et DEMING, 1934.)
1/v 1/v
a - v faibles
0
0 1/[A]
Pente = Km/V
1/v
b - v leves
0
1/V 0 1/[A]
1/Km 0 1/[A]
3.10 - Graphique de 1/v en fonction de 1/[A]

Il faut noter la variation importante de la taille des barres derreur sur v calcules de
manire identique, chacune reprsentant 0,05 V. De nombreux auteurs font rfrence ce
graphique comme un graphique en double inverse ou le graphique de LINEWEAVER et BURK .
Les deux inserts illustrent comment un choix judicieux des chelles utilises pour les axes
peut camoufler un mauvais choix des conditions exprimentales (voir figure 3.12), soit (a)
parce que la gamme des valeurs de v est trop basse ou (b) parce quelle est trop leve.
Dans chaque insert, les trois points prsents correspondent aux extrmes du graphique
principal.
Le graphique de [ A ]/v en fonction de [ A ] ou graphique de HANES

Une seconde forme linaire de lquation de MICHAELIS et MENTEN peut tre
obtenue en multipliant les quations [3.54] et [3.55] par [ A ] :
[ A] K
= m + 1 [ A] [3.56]
v V V
[ E ]0 [ A ]
= 1 + 1 [ A] [3.57]
v k A k0
Ces deux quations indiquent quun graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] est
galement une droite dont la pente vaut 1 k0 [ E ]0 ( = 1 V ) , dont lordonne
lorigine vaut 1 k A [ E ]0 ( = Km V ) et dont lintersection avec laxe des abscisses
vaut k0 k A ( = Km ) (noter que les valeurs de la pente et de lordonne lorigine
sont inverses par rapport au graphique en double inverse). Ce graphique, que lon
appelle parfois graphique de HANES, est illustr dans la figure 3.11. Sur une large
gamme de concentrations de substrat, les erreurs sur [ A ] v refltent fidlement
les erreurs sur v, comme il est possible den juger par la taille des barres derreur
dans la figure 3.11 ; pour cette raison le graphique de [ A ] v en fonction de [ A ]
devrait tre prfr aux autres graphiques linaires.
[A]/v [A]/v
a - v faibles
0
0 [A]
Pente = 1/V
[A]/v
b - v leves
0
Km/V 0 [A]
Km 0 [A]
3.11 - Graphique de [A]/v en fonction de [A]
Les barres derreur sont gales 0,05 V, comme dans la figure 3.10. Ce graphique est
parfois appel le graphique de HANES ou le graphique de WOOLF. Les inserts ont la mme
signification que ceux de la figure 3.10.
Le graphique de v en fonction de v/[ A ] ou graphique de EADIE et HOFSTEE

Une troisime forme linaire peut tre obtenue en multipliant les deux cts de
lquation [3.54] par vV et en rorganisant lquation.
v = V Km v [3.58]
[ A]
Cette quation montre quun graphique de v en fonction de v [ A ] est une droite
dont la pente vaut Km , dont lordonne lorigine vaut V et dont lintersection
avec laxe des abscisses vaut V Km . Ce graphique est couramment appel gra-
phique de EADIE-HOFSTEE et est illustr dans la figure 3.12. Ce type de reprsen-
tation donne de bons rsultats dans la pratique, bien que la prsence de la grandeur
mesure, la vitesse v, dans chacune des coordonnes signifie que les erreurs
commises sur la mesure de v provoquent des dviations le long des deux axes.
v v v
a - v faibles b - v leves
V
0 0
0 v/[A] 0 v/[A]
Pente = Km
Les barres d'erreurs
se prolongent
dans des directions
passant par l'origine
0
0 V/Km v/[A]
3.12 - Graphique de v en fonction de v/[A]

Les barres derreur sont gales 0,05 V. Ce graphique est quelques fois appel graphique
dEADIE-HOFSTEE. Les inserts ont la mme signification que ceux de la figure 3.10, mais
dans ce cas, il est impossible de choisir les chelles de manire camoufler un mauvais
choix des conditions exprimentales.
Le graphique de v en fonction de v [ A ] a la proprit oppose celle du

graphique en double inverse ; plutt que damliorer lapparence de mauvaises
donnes, il donne une mauvaise apparence de bonnes donnes. Ainsi, par
exemple, ce graphique met en vidence toute dviation par rapport une ligne
droite, plus spcialement si les dviations sont spcifiques (DOWD et RIGGS, 1965.)
De ce fait, ce type de graphique est utile pour dtecter une dviation par rapport au
comportement prvu par lquation de MICHAELIS et MENTEN. De plus, laxe
allant de 0 V correspond la gamme entire des vitesses observables (c'est--dire
quil couvre toute la gamme de concentrations de substrat, de 0 linfini) et permet
de mettre en vidence un mauvais choix de conditions exprimentales qui ne
couvrirait quune gamme restreinte de concentrations de substrat. En terme de
marketing, lutilisation du graphique dEADIE-HOFSTEE constituerait une erreur,
mais pour les chercheurs dsireux de dcouvrir le comportement rel dun enzyme,
ce graphique possde des qualits indniables.
Dans un premier temps, les trois reprsentations linaires que nous venons de
dcrire ont t attribues WOOLF (1932), mais elles navaient pas t publies
par lui. Lquation [3.56] a t publie pour la premire fois par HANES (1932),
bien quil ne lait accompagne daucune reprsentation graphique des rsultats.
Les diffrents graphiques et leur utilisation ont t populariss par les travaux de
LINEWEAVER et BURK (1934), EADIE (1942) et HOFSTEE (1952), ce qui explique
pourquoi ces noms leurs sont associs.
Le graphique linaire direct

EISENTHAL et CORNISH-BOWDEN (1974) ont dcrit une mthode assez diffrente
de reprsentation graphique de lquation de MICHAELIS et MENTEN, qui est
connue sous le nom de graphique linaire direct. Lquation de MICHAELIS et
MENTEN peut tre facilement rarrange partir de lquation [3.58], pour
exprimer la dpendance de V sur Km.
V = v + v Km [3.59]
[ A]
Si V et K m sont traits comme des variables, et [ A ] et v comme des constantes,
cette quation dfinit une droite dont la pente vaut v [ A ] , dont lordonne
lorigine vaut v et dont lintersection avec laxe des abscisses vaut [ A ] . Traiter V
et Km comme des variables ou traiter v et [ A ] comme des constantes peut a priori
sembler pervers, mais une certaine logique ressort de ce traitement. Dune part, une
fois que v et [ A ] ont t mesures exprimentalement, elles peuvent tre
considres comme des constantes, puisque au cours de lanalyse, leurs valeurs
resteront inchanges. Dautre part, avant que les meilleures valeurs de V et de Km
naient t dtermines, nimporte quelle valeur peut leur tre attribue et donc,
dans ce sens, ces paramtres peuvent tre considrs comme des variables.
Pour chaque paire de valeurs de v et de [ A ] , il existe une infinit de paires de
valeurs de V et de K m qui satisfont exactement lquation de MICHAELIS et
MENTEN. Pour chaque valeur arbitrairement fixe de Km, lquation [3.59] dfinit
une valeur correspondante de V. En consquence, la droite trace sur la base de
cette quation relie toutes les paires de valeurs de K m et de V qui satisfont exac-
tement une observation. Si une seconde droite est trace pour une seconde
observation (c'est--dire pour un couple diffrent de valeurs de [ A ] et de v), elle
reliera les paires de valeur de K m et de V qui satisfont exactement cette obser-
vation. Cependant, les deux droites ne dfiniront pas les mme paires de valeurs de
K m et de V, except au point dintersection. Ce point dintersection dfinit une paire
unique de valeurs de Km et de V qui satisfait exactement aux deux observations.
Dans un systme idal dans lequel les erreurs exprimentales seraient inexistantes,
il serait possible de porter sur un graphique une srie de telles droites, chacune
correspondant une seule dtermination exprimentale de v obtenue pour une
valeur particulire de [ A ] , et de dterminer un point unique dintersection qui
correspondrait aux valeurs de K m et de V. Cette procdure est illustre dans la
figure 3.13. Dans la ralit, les observations ne sont jamais exactes, et en
consquence, toutes les droites ne se coupent pas prcisment au mme endroit.

Un graphique rel ressemble plus probablement celui prsent dans linsert de la
figure 3.13. Chaque point dintersection entre deux droites fournit une estimation
des valeurs de K m et de V, et pour chaque srie de points exprimentaux, on peut
choisir la valeur mdiane comme la meilleure valeur. Dans linsert, la ligne
verticale qui indique la meilleure valeur de K m est trace gauche de la moiti des
intersections individuelles et droite de lautre moiti ; de faon similaire, la ligne
horizontale qui indique la meilleure valeur de V est trace au-dessus de la moiti
des intersections individuelles et en dessous de lautre moiti.
V V
V*
V*
v5
v4
v3
0 K*m Km
v2
v1
[A]5 [A]4 [A]3 [A]2 [A]1 0 K*m Km
3.13 - Graphique linaire direct de V en fonction de Km

Chaque droite reprsente une observation et est trace avec une intersection avec laxe
des abscisses gale [ A ] et une intersection avec laxe des ordonne gale v. Dans un
cas idal (sans erreur exprimentale) prsent dans la partie centrale de la figure, toutes
les droites se croisent en un point unique dont les coordonnes correspondent aux valeurs
de Km et de V qui reprsentent au mieux les donnes. Dans un cas plus raliste, comme
celui prsent dans linsert, les erreurs exprimentales conduisent la dfinition dune
famille de points, chacun fournissant une estimation de Km et une estimation de V. La
meilleure estimation de ces valeurs peut tre obtenue en prenant les valeurs mdianes des
deux sries. Pour plus de dtails se reporter la figure 12.1 dans le 12.3.
Comme il existe trois faons de reprsenter sous forme linaire lquation de

MICHAELIS et MENTEN, il existe trois faons de tracer le graphique linaire direct.
Celle qui est prsente dans la figure 3.13 est la forme dcrite lorigine, mais une
seconde forme est reprsente dans la figure 3.14 dans laquelle les intersections
avec les axes valent [ A ] v et 1 v , plutt que [ A ] et v (CORNISH-BOWDEN et

EISENTHAL, 1978). Lutilisation de cette forme du graphique peut se justifier dans
la pratique, puisque les droites se coupent avec des angles mieux marqus et que
les points dintersection sont ainsi mieux dfinis. De plus, comme nous en
parlerons dans le 12.3, son utilisation ne ncessite pas lintroduction de rgles
particulires tenant compte des points dintersection qui tombent en dehors du
premier quadrant, c'est--dire de points qui dfinissent des valeurs ngatives de
lun ou de lautre paramtre.
1/V 1/V
1/v1
1/V*
0
0 K*m /V* Km /V
1/V*
0
0 K*m /V* [A]1/v1 Km /V
3.14 - Graphique linaire direct modifi prsentant 1 V en fonction de Km V

Chaque observation est reprsente sous la forme dune droite qui croisent laxe des
abscisses une valeur de [A] /v et laxe des ordonnes une valeur de 1/v. Les erreurs
exprimentales gnrent une famille de points dintersection, comme dans la figure 3.13, qui
peut tre analyse de la mme manire.
Le graphique linaire direct prsente divers avantages sur les autres mthodes gra-
phiques (fig. 3.13) dcrites dans ce paragraphe, dont la plus apparente est que, dans
sa forme originelle, il ne ncessite pas de calcul. Ceci permet de lutiliser trs faci-
lement au laboratoire pendant que lexprience se droule, de sorte que nous pou-
vons visualiser immdiatement les valeurs probables des paramtres et adapter les
conditions de mesure pour permettre une dtermination prcise de ces paramtres.
Analyse des expriences de fixation : le graphique de SCATCHARD
A ct des ractions enzymatiques, de nombreux processus biologiques reposent
sur la fixation dune petite molcule sur une macromolcule ou sur une surface,
sans que cette fixation ne soit suivie dune raction chimique. Comme nous allons
le voir, le phnomne de fixation dun ligand peut tre dcrit par une quation qui a
une forme similaire celle de lquation de MICHAELIS et MENTEN, alors que la
fixation sur plusieurs sites indpendants peut tre reprsente par une quation qui
a la mme forme que lquation cintique pour un mlange denzymes catalysant la
mme raction. Bien quun traitement exhaustif de la fixation de ligands ne fasse
pas partie des objectifs de cet ouvrage, nous prsentons brivement le traitement de
ces systmes parce que les expriences de fixation complmentent souvent les
mesures cintiques dans ltude de systmes enzymatiques. La ressemblance entre
les quations de fixation et les quations de vitesse des systmes enzymatiques,
nous amne galement discuter de lutilisation du graphique de SCATCHARD,
notamment en raison de labondance derreurs associes avec lutilisation de ce
type de graphique.
En pratique, la fixation dun ligand est souvent mesure par dialyse lquilibre,
une exprience qui consiste tablir un quilibre travers une membrane semi-per-
mable (permable au ligand mais pas la protine), et mesurer la concentration
de ligand de part et dautre de cette membrane. Une fois lquilibre atteint, si nous
supposons que la concentration de ligand libre, [ L ]libre , est identique de chaque
ct de la membrane et quelle peut tre mesure directement dans le compartiment
qui ne contient pas de protine, la concentration de ligand fix la protine peut
alors tre dtermine en soustrayant la valeur connue de [ L ]libre de la concentra-
tion totale de ligand mesure dans le compartiment contenant la protine. A ce
stade, il est essentiel de prendre conscience dune caractristique essentielle des
mesures de dialyse lquilibre. Dans une exprience de cintique ltat station-
naire, cest lactivit cintique de lenzyme qui est mesure, et condition que
lactivit spcifique de cette enzyme soit suffisamment leve, une concentration
faible denzyme peut tre utilise sans affecter la prcision de la mesure. Inver-
sement, dans une exprience de dialyse lquilibre, la quantit mesure, [ L ]fix ,
ne peut jamais dpasser la concentration totale des sites de fixation et est obtenue
par soustraction ; il est important ds lors de sassurer que la concentration de la
macromolcule est du mme ordre de grandeur que la concentration du ligand.
Puisque les expriences de dialyse lquilibre et celles de cintique dans des
conditions dtat stationnaire sont ralises dans des conditions diffrentes, elles
peuvent dans certains cas conduire des rsultats apparemment inconsistants, si
par exemple lenzyme sassocie de hautes concentrations.
Sil existe un seul type de site de fixation de L sur E, le phnomne de fixation peut
tre reprsent par le modle suivant :
K
E + nL ELn [3.60]
Dans ce modle, K reprsente la constante individuelle de dissociation du ligand L
pour chaque site de fixation et n reprsente le nombre de sites de fixation :
[ E ][ L ]libre
K = [3.61]
[ EL ]
La saturation du site de fixation peut tre dfinie par le rapport suivant :

[ EL ]
Y = [3.62]
[ E ] + [ EL ]
En introduisant lquation [3.61] dans lquation [3.62], nous pouvons exprimer Y
en terme de la concentration de ligand libre :
[ L ]libre K [ L ]libre
Y = = [3.63]
1 + ( [ L ]libre K ) K + [ L ]libre
Sil existe un seul site de fixation de L sur E, [ L ]fix correspond la fraction

sature de la protine, Y, multiplie par la concentration totale de la protine [ E ]0 :
[ L ]fix = Y [ E ]0 [3.64]
et lquilibre de fixation peut tre exprim en fonction des concentrations de ligand
sous forme libre et sous forme fixe :
[ L ]fix [ E ]0 [ L ]fix
= [3.65]
[ L ]libre K K
Sil existe n sites de fixation de L sur E qui sont indpendants et quivalents, nous
pouvons crire :
[ L ]libre
Y = n [3.66]
K + [ L ]libre
Si nous supposons que le nombre de sites de fixation est inconnu, la quan-
tit [ L ]fix doit tre traite comme une quantit observe dont la dpendance vis--
vis de [ L ]libre est donne par lquation suivante :
n [ E ]0 [ L ]libre
[ L ]fix = [3.67]
K + [ L ]libre
Les quations [3.66 ] et [3.67] peuvent tre crites sous les formes suivantes :
YK + Y [ L ]libre = n[ L ]libre [3.68a]
[ L ]fix K + [ L ]fix [ L ]libre = n[ E ]0 [ L ]libre [3.68b]
qui aprs division par K [ L ]libre et rarrangement donne des formes linaires de
lquation de fixation connue comme lquation de SCATCHARD :
Y = n Y [3.69a]
[ L ]libre K K
[ L ]fix n[ E ]0 [ L ]fix
= [3.69b]
[ L ]libre K K
Un graphique de Y [ L ]libre en fonction de Y a la forme dune droite dont la pente
vaut 1 K , dont lordonne lorigine vaut n K et dont lintersection avec laxe
des abscisses vaut n.
Lquation [3.67] est similaire lquation de MICHAELIS et MENTEN [3.35] et

peut tre obtenue facilement partir de celle-ci si nous nous souvenons que la
vitesse de la raction enzymatique est donne par le produit de la constante k0 et de
la concentration de complexe EA, v = k0 [ EA ] . Si cette dernire est assimile la
concentration de substrat fix, nous obtenons :
[ E ]0 [ A ]libre
[ EA ] = [ A ]fix = [3.70]
K + [ A ]libre
En principe, le cas cintique diffre par le fait qu saturation de lenzyme, la
vitesse limite doit toujours tre traite comme une quantit exprimentale mesu-
rable, alors que dans le cas de la fixation, il est clair a priori que la saturation
signifie quune molcule de ligand est fixe sur chaque site de fixation.
Nanmoins, cette diffrence est, en ralit, plus thorique que relle puisque dans
de nombreux cas, la molarit de la protine nest pas connue avec une prcision
suffisante pour que la limite exacte soit dtermine, et le nombre de sites de
fixation par molcule peut tre inconnu (et est gnralement inconnu, puisquil
sagit de linformation recherche dans les expriences de fixation).
La relation vidente entre lquation de fixation et lquation de MICHAELIS et
MENTEN permet de bien comprendre le phnomne de saturation qui intervient
dans la cintique enzymatique. La vitesse limite de la raction est atteinte lorsque
lenzyme est satur, c'est--dire lorsque la concentration de [ A ]libre est largement
suprieure K et donc, que tout lenzyme est sous forme de complexe enzyme-
substrat, [ EA ] = [ A ]fix = [ E ]0 . Lorsque la concentration de [ A ]libre est quiva-
lente K, lenzyme est moiti satur par le substrat (la moiti des molcules
denzyme est complexe une molcule de substrat) et donc la concentration de
[ EA ] = [ A ]fix = 0 ,5[ E ]0 et la vitesse initiale est gale la moiti de la vitesse
limite, v 0 = 0,5 V. La vitesse de la raction enzymatique est donc directement
proportionnelle au degr de saturation de lenzyme.
Dans les quations [3.69], n reprsente le nombre de sites de fixation et chacun de
ces sites est suppos fixer le ligand avec la mme constante de dissociation K.
Puisque cette quation a exactement la mme forme que lquation de MICHAELIS
et MENTEN, les donnes exprimentales peuvent en principe tre analyses par les
mmes mthodes. En pratique, le graphique universellement utilis pour reprsen-
ter les quilibres de fixation est un graphique de [ L ]fix [ L ]libre en fonction de
[ L ]fix qui est connu sous le nom de graphique de SCATCHARD (SCATCHARD,
1949). Lexamen de ce graphique indique quil est quivalent au graphique de v en
fonction de v [ A ] prsent prcdemment, except que les axes sont inverss.
Curieusement, les biochimistes qui utilisent couramment le graphique en double
inverse pour reprsenter leurs donnes cintiques utilisent exclusivement le
graphique de SCATCHARD pour reprsenter leurs donnes de fixation. Lquivalent
du graphique en double inverse pour les quilibres de fixation, parfois appel
graphique de KLOTZ (KLOTZ, WALKER et PIVAN, 1946) est trs rarement utilis
(voir cependant SU et ROBYT (1994) pour quelques exemples de son utilisation), et
nous navons aucune connaissance dexemple dutilisation dun graphique de

[ A ] v en fonction de [ A ] pour lanalyse de la cintique enzymatique. Nan-
moins, il est essentiel de noter que lutilisation de ces diffrentes reprsentations
graphiques nest dicte ni par les mrites de ces graphiques, ni par les ncessits
imposes par les mthodes de mesure, mais est plutt une question de mode.
Comme le graphique de SCATCHARD est frquemment utilis pour analyser des
donnes plus complexes que celles exprimes par lquation [3.69], il est important de
comprendre ses proprits dans le cas dun systme comportant des sites de fixation
non-quivalents. Le cas le plus simple est celui dune protine comportant deux classes
de sites : n1 sites caractriss par une constante de dissociation K1 et n2 sites caractriss
par une constante de dissociation K2. Lquation de fixation devient :
n1 [ E ]0 [ L ]libre n2 [ E ]0 [ L ]libre
[ L ]fix = + [3.71]
K1 + [ L ]libre K 2 + [ L ]libre
La question est de savoir si une mthode de reprsentation graphique permet destimer
rellement ces paramtres. La rponse correcte cette question est non, mais ce nest
pas la rponse que donnerait la majorit des personnes qui ralise des expriences de
fixation. Pour un ensemble donn de valeurs des diffrents paramtres, il est facile de
tracer la courbe attendue pour un graphique de SCATCHARD. Malheureusement, cette
dmarche est rarement suivie et en consquence, les paramtres estims partir de
graphiques de SCATCHARD ne saccordent presque jamais, mme approximativement,
avec les donnes partir desquelles ils sont drivs. Un exemple est prsent dans la
figure 3.15. Pour des sites indpendants et non-quivalents, la courbure est presque
toujours oriente dans le sens montr dans cette figure, bien que les dtails quantitatifs
puissent varier. Le point essentiel noter est que les deux asymptotes qui reprsentent
les graphiques pour chaque type de sites de fixation sont fortement loignes de la
courbe exprimentale (voir la courbe de MICHAELIS et MENTEN prsente dans la
figure 3.7 et la discussion du 3.5.1). Ceci signifie quil est impossible destimer la
position de lune ou de lautre de ces asymptotes (et donc destimer le couple de
paramtres la caractrisant) en traant une droite passant au travers de certains points.
Lerreur qui rsulterait dune telle procdure peut tre trs importante : par exemple,
dans la figure 3.15 une extrapolation nave de la partie de la courbe faibles valeurs de
[ A ]fix indiquerait la prsence de deux sites de fixation de haute affinit plutt quun
seul. En gnral, un seul paramtre dintrt peut tre estim de manire simple partir
dun graphique de SCATCHARD, il sagit du nombre total de sites de fixation, qui
correspond lintersection de lextrapolation de la courbe avec laxe des abscisses
( [ A ]fix ).
Il est, en ralit, trs simple de juger visuellement si les points sur un graphique de
SCATCHARD sont en accord avec les asymptotes supposes, parce que la courbe
peut tre obtenue en additionnant les valeurs des asymptotes le long de lignes
passant par lorigine. Cette addition est illustre dans la figure 3.15 pour une ligne
arbitraire passant par lorigine. Ce calcul sapplique mme sil y a plus de deux
classes de sites de fixation, c'est--dire que lon peut tracer des droites pour
diffrentes classes de sites et obtenir une courbe finale en calculant la somme le
long de droites passant par lorigine des contributions de chacune de ces classes.
v /[A] 1,5
ou
[A]fix /[A]libre
1 Les vitesses s'additionnent le long de

droites passant par l'origine : OA = BC,
c'est--dire : OC = OA + OB
v2
C
0,5
B
v1 + v2
A
v1
0,0
O
0 1 2 3
v ou [A]fix
3.15 - Interprtation dun graphique de SCATCHARD

courb par la mthode de ROSENTHAL (1967)
La courbe rsultante peut tre drive partir de deux ou plusieurs composantes linaires
par addition le long de droites passant par lorigine. Lanalyse sapplique de manire
similaire aux donnes cintiques (v /[A] en fonction v) et aux donnes de fixation
([A]fix /[A]libre en fonction de [A]fix).
3.6. LES RACTIONS RVERSIBLES
3.6.1. Lquation de vitesse du mcanisme rversible simple
En principe toutes les ractions catalyses par des enzymes sont rversibles, et dans
la ralit de nombreuses ractions importantes en biochimie sont rversibles dans
le sens o des quantits significatives de substrat et de produit coexistent lqui-
libre. Il est vident, ds lors, que le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN que nous
avons dcrit jusqu prsent est incomplet, et que la raction en sens inverse doit
apparatre dans le schma ractionnel. Le modle le plus simple consiste rendre
rversible la seconde raction comme indiqu dans le modle suivant :
k1 k2
E + A EA E + P [3.72]
k1 k2
[ E ]0 [ EA ] [ A] [ EA ] [P]
Pour ce mcanisme, lquation dtat stationnaire pour le complexe EA scrit :

d [ EA ]
= k1([ E ]0 [ EA ])[ A ] + k 2 ([ E ]0 [ EA ])[ P ] ( k 1 + k 2 )[ EA ]
dt [3.73]
= 0
En groupant tous les termes en [ EA ] et en rarrangeant lquation, nous obtenons
lquation :
k [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ]
[ EA ] = 1 [3.74]
k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
Puisque la raction est rversible, la vitesse nette de formation du produit P est obtenue
par la diffrence entre la vitesse laquelle il est form dans la raction EA E+P
et la vitesse laquelle il disparat dans la raction E + P EA. La concentration
denzyme libre disponible pour la raction inverse est donne par [ E ]0 [ EA ] .
v = k 2 [ EA ] k 2 ([ E ]0 [ EA ])[ P ] [3.75]
En combinant les quations [3.74] et [3.75], nous obtenons lexpression suivante :
k 2 ( k1 [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ])
v = k 2 [ E ]0 [ P ]
k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[3.76]
k ( k [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ]) [ P ]
+ 2 1
k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
La multiplication croise permettant dobtenir un dnominateur commun fournit un
numrateur apparemment complexe comprenant huit termes. Cependant, six de ces
termes sliminent mutuellement, laissant lquation suivante :
k1 k 2 [ E ]0 [ A ] k 1k 2 [ E ]0 [ P ]
v = [3.77]
k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
Dans le cas particulier o [ P ] = 0 , lquation [3.77] est quivalente lquation
[3.34], avec lexception que [ A ] doit tre remplac par [ A ]0 , puisque lhypothse
de [ P ] = 0 nest valable quau temps initial de la raction, quand t = 0. Il est
important de noter que cest la contrainte [ P ] = 0 qui permet de faire cette
simplification et non certaines hypothses sur la grandeur de k2. Si [ P ] = 0 , la
vitesse k 2 [ P ] est nulle, quelle que soit la valeur de k2.
Dans le cas complmentaire o [ A ] = 0 , lquation [3.77] se simplifie sous la
forme dune quation donnant la vitesse initiale de la raction inverse :
k 1k 2 [ E ]0 [ P ]
v = [3.78]
k 1 + k 2 + k 2 [ P ]
Un signe ngatif apparat dans cette quation parce que la vitesse de la raction est
dfinie comme la vitesse dapparition du produit P, c'est--dire v = d [ P ] dt ; si la
vitesse de la raction est dfinie comme d [ A ] dt lquation devient positive. A
lexception du signe, lquation [3.78] est identique lquation de MICHAELIS et
MENTEN, et en la comparant avec les quations [3.34] [3.44], nous pouvons

dfinir les paramtres caractristiques de la raction inverse :
k0 = k 1 [3.79a]
k 1k 2
kP = [3.79b]
k 1 + k 2
k 1 + k 2
Km P = [3.79c]
k 2
Lquation [3.79b] reprsente la constante de spcificit pour la raction inverse o
lindice P indique le substrat de la raction. Ces termes sont analogues ceux qui
ont t dfinis prcdemment pour la raction directe.
k0 = k 2 [3.80a]
k1k 2
kA = [3.80b]
k 1 + k 2
k 1 + k 2
Km A = [3.80c]
k1
En utilisant ces dfinitions, lquation [3.77] peut tre rcrite sous la forme
suivante :
k A [ E ]0 [ A ] kP [ E ]0 [ P ]
v = [3.81]
[ A] [ P ]
1+ +
Km A Km P
Cette dernire quation peut tre considre comme la forme gnrale de lqua-
tion de MICHAELIS et MENTEN. A linverse de lquation [3.77], celle-ci ne fait
rfrence aucun mcanisme particulier et elle peut tre considre comme une
quation empirique. Il existe de nombreux mcanismes plus complexes que celui
de lquation [3.72] qui conduisent une quation de vitesse de la forme de
lquation [3.81]. Parmi ceux-ci se trouve le mcanisme plus raliste de conversion
de A en P en trois tapes qui est envisag dans le suivant. Dans ce mcanisme, la
conversion chimique de A en P au site catalytique de lenzyme est traite comme
une tape spare des processus dassociation/dissociation du substrat A et du
produit P.
3.6.2. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes :

traitement lquilibre
Considrons maintenant un cas plus raliste o un substrat A est converti en

produit P dans le site actif dun enzyme. Cette raction est reprsente par une
tape distincte du mcanisme cintique qui prcde la dissociation de lenzyme et
du produit. Par simplicit, considrons que la formation de EA et celle de EP sont
lquilibre, par opposition avec la raction EA EP. Dans ce cas, nous pouvons
reprsenter le mcanisme ractionnel par lquation suivante :
k1 k2 k3
E + A EA EP E + P [3.82]
k1 k2 k3
[ E ]0 [ EA ] [ EP ] [ A ] [ EA ] [ EP ] [P]
Si, par souci de simplification, nous supposons que les tapes de fixation du
substrat et de libration du produit sont rapides par rapport la raction chimique
EA EP, nous pouvons dfinir les paramtres Km A = k 1 k1 et Km P = k3 k 3
comme les constantes de dissociation des complexe EA et EP. Dans ce cas,
lobtention de lquation de vitesse ncessite de trouver lquation pour la vitesse
nette :
vnette = v 2 v 2 [3.83]
d [ EP ]
o v 2 = vP = [3.84a]
dt
d [ EA ]
v 2 = vA = [3.84b]
dt
Lquation de vitesse peut aisment tre obtenue en appliquant les trois rgles
prcdemment tablies.
La loi daction de masses permet de dfinir la vitesse initiale pour chacun des
deux sens de la raction :
v 2 = k 2 [ EA ] [3.85a]
v 2 = k 2 [ EP ] [3.85b]
La vitesse nette est obtenue comme la diffrence :
vnette = k 2 [ EA ] k 2 [ EP ] [3.86]
En utilisant les deux quilibres :
[ A ][ E ]
Km A =
[ EA ]
[ E ][ A ]
[ EA ] =
Km A
[ P ][ E ]
Km P =
[ EP ]
[ P ][ E ]
[ EP ] = [3.87]
Km P
[ E ][ A ] [ E ][ P ]
nous obtenons : vnette = k 2 k 2 [3.88]
Km A Km P
Lquation de conservation de lenzyme scrit comme suit :

[ A] [ P ]
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ] + [ EP ] = [ E ] 1 + + = [ E ]D [3.89]
Km A Km P
[ A] [ P ]
o D = 1+ + [3.90]
Km A Km P
[ E ]0
et [E] = [3.91]
D
Les quations de conservation du substrat et du produit scrivent :
[ E ]0 << [ A ]0 ; [ A ] = [ A ]0 [3.92a]
[ E ]0 << [ P ]0 ; [ P ] = [ P ]0 [3.92b]
En utilisant les quations suivantes comme dfinition des vitesses limites :
V2 = k 2 [ E ]0 [3.93a]
V2 = k 2 [ E ]0 [3.93b]
et les quations [3.88] [3.91], nous obtenons lquation de vitesse finale :
[ A] [P] [ A] [P]
V2 V2 V2 V2
Km A Km P Km A Km P
vnette = = [3.94]
D [ A] [ P ]
1+ +
Km A Km P
Comme dans le cas le plus simple ( 3.6.1), si [ P ]0 = 0 ou si [ A ]0 = 0 , cette
quation se simplifie et donne lquation de MICHAELIS et MENTEN [3.34]
respectivement pour la direction directe ou pour la raction inverse.
3.6.3. La relation de HALDANE
Quand une raction a atteint lquilibre, sa vitesse nette devient nulle. Si [ A ] et

[ P ] reprsentent les valeurs de [ A ] et de [ P ] lorsque lquilibre est atteint,
nous obtenons les quations suivantes partir de lquation [3.94] :
[ A ] [ P ]
V2 V2 = 0 [3.95]
Km A Km P
et donc k A [ E ]0 [ A ] kP [ E ]0 [ P ] = 0 [3.96]
Puisqu lquilibre, K = [ P ] [ A ] , nous pouvons rcrire respectivement les
quations [3.95] et [3.96] comme suit :
V2 Km P
K = [3.97]
V2 Km A
kA k2 K m P [ P ]
K = = = [3.98]
kP k 2 K m A [ A ]
o K est la constante dquilibre de la raction. Cette quation constitue un rsultat
important, connu sous le nom de relation de HALDANE (HALDANE, 1930). Ces ga-
lits sont vrifies pour nimporte quel mcanisme dcrit par lquation [3.81] et
pas seulement pour le mcanisme simple deux tapes de MICHAELIS et MENTEN.
Les quations de vitesse plus complexes, telles que celles qui seront dcrites pour
des ractions plusieurs substrats, conduisent des relations de HALDANE plus
complexes, mais parmi ces quations il en existe toujours au moins une qui relie les
paramtres cintiques et la constante dquilibre globale de la raction.
John Burdon Sanderson H ALD ANE (1892-1964)

HALDANE a laiss son nom associ au moins deux lments importants de lenzymologie.
Avec G.E. BRIGGS, il a dmontr que les ractions enzymatiques suivent les lois de la
thermodynamique et a introduit le concept dtat stationnaire dans le traitement des
cintiques enzymatiques. En utilisant des approches mathmatiques, il a calcul les
vitesses auxquelles les ractions enzymatiques se droulent et a laiss son nom associ
une quation encore largement utilise (quation [3.98]).
La carrire scientifique dHALDANE, peut-tre plus encore que celles de Victor HENRI et
de Leonor MICHAELIS, est un exemple frappant de multi-disciplinarit qui prouve que le
transfert de comptence entre disciplines est extrmement rentable. En plus de ses
qualits scientifiques, HALDANE avait galement de grandes qualits de vulgarisateur et
il a crit de nombreux articles afin de faire connatre lhomme de la rue les avances
scientifiques et techniques du dbut du XXe sicle.
HALDANE nat Oxford, dans une ancienne famille cossaise. Son pre est le clbre
physiologiste largement reconnu pour ses travaux de physiologie respiratoire, qui a mis
en vidence leffet ltal du monoxyde de carbone, qui a dmontr que le monoxyde de
carbone se fixe sur lhmoglobine et empche celle-ci de remplir pleinement son rle
de transporteur de loxygne et qui, avec J.G. PRIESTLEY, a promu lide selon laquelle la
ventilation pulmonaire est contrle par la pression partielle de dioxyde de carbone
dans le sang artriel. Cest lui qui va initier son fils la physiologie.
Aprs une ducation Eton, il tudie les mathmatiques et la biologie Oxford et quitte
luniversit sans qualification scientifique. En 1919, il commence enseigner la physiologie
au New College Oxford, marchant ainsi dans les traces de son pre, mais il commence,
ds cette poque, sintresser la liaison des gnes. En 1921, il accepte un poste sous
la direction de Frederick HOPKINS dans le dpartement de Biochimie Cambridge. L, il
se concentre sur ltude des enzymes et publie une prsentation globale du mcanisme
daction des enzymes dans son livre Enzymes (1932) mais il continue ses travaux de
gntique et commence galement publier ses premiers travaux sur les mathmatiques
de la slection naturelle. J.B.S. HALDANE doit en effet une grande partie de sa notorit
sa participation avec R.A. FISHER et S. WRIGHT la synthse des thories de DARWIN et
de MENDEL et au dveloppement de la thorie synthtique de lvolution aussi connue

comme la thorie no-darwinienne. Il crit une dizaine darticles influents sur le sujet
et publie en 1932 une synthse dans son livre The Causes of Evolution.
En 1933, HALDANE quitte Cambridge pour University College Londres o il est
successivement titulaire des chaires de gntique et de biomtrie. En 1935, il publie
une carte du chromosome X en localisant la position des gnes associs divers
phnotypes comme le daltonisme et le dficit de vision nocturne. En 1957, en protestation
contre linvasion franco-anglaise de Suez, il migre aux Indes. Il travaille dabord pour
lIndian Statistical Office Calcutta et plus tard il sinstalle Orissa o il dirige un
laboratoire de gntique et de biomtrie. Il steint Orissa en dcembre 1964 la
suite dun cancer dont il sest moqu auparavant dans un court pome qui sintitulait
Cancers a funny Thing.
Rfrence
R.W. CLARK - J.B.S. HALDANE, dans Dictionary of Scientific Biography, New-York, Scribners
3.6.4. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes :

cas ltat stationnaire
En principe, lquation de vitesse pour le mcanisme complet peut tre drive

de la mme manire pour la situation dtat stationnaire. Cependant, il existe
maintenant deux formes intermdiaires, EA et EP, et chacun des deux termes
d [ EA ] dt et d [ EP ] dt doit tre nul. La ncessit de rsoudre simultanment
deux quations, une en [ E A] et une en [ E P], complique la procdure de
drivation. Comme nous dcrirons une mthode plus versatile de drivation de ces
quations dans le chapitre 6, nous dirons simplement ici que le mcanisme en trois
tapes conduit galement lquation [3.77], mais avec des dfinitions quelque peu
diffrentes pour les paramtres de la raction directe :
k 2 k3
k0 = [3.99a]
k 2 + k 2 + k3
k1 k 2 k3
kA = [3.99b]
k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3
k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3
Km A = [3.99c]
k1( k 2 + k 2 + k3 )
k 1 k 2
et de la raction inverse : k 0 = [3.100a]
k 1 + k 2 + k 2
k 1 k 2 k 3
kP = [3.100b]
k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3
k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3
Km P = [3.100c]
( k 1 + k 2 + k 2 )k 3
En dpit de leur apparence complexe, les expressions pour Km A et Km P se simpli-

fient respectivement en constantes de dissociations relles pour les complexes EA
et EP, KA et KP, si la seconde tape dans la direction approprie est ltape limitante
de la vitesse :
k
Km A = 1 = K A si k 2 << ( k 2 + k3 ) [3.101]
k1
k3
et Km P = = KP si k 2 << ( k 1 + k 2 ) [3.102]
k 3
Les deux simplifications sappliquent simultanment si les deux conditions sont
satisfaites simultanment, c'est--dire si la conversion entre EA et EP est ltape
qui limite la vitesse dans les deux directions.
Dans les conditions ainsi dfinies, les constantes de MICHAELIS ont des valeurs
gales aux constantes de dissociation mais il est instructif, dans le but de com-
prendre les arguments dvelopps la fin du 3.3.2, de se poser la question
inverse : existe-t-il des conditions dans lesquelles les deux constantes de
MICHAELIS sont simultanment diffrentes des constantes dquilibre correspon-
dantes ? ATKINSON (1977) est un des rares stre pos la question et les rsultats
de son analyse sont surprenants. Clairement, partir des quations [3.101] et
[3.102], nous obtenons que k2 doit tre plus grand que k2 + k3, et que simul-
tanment, k2 doit tre plus grand que k1 + k2. Puisque ces deux affirmations ne
peuvent tre toutes deux correctes, il rsulte que dans au moins une des directions
(et souvent dans les deux) la constante de MICHAELIS a une valeur raisonnablement
proche de celle de la constante de dissociation correspondante.
ATKINSON a conclu que nous ne devons pas hsiter infrer des affinits des
enzymes pour leurs substrats partir des valeurs des constantes de MICHAELIS.
Cette conclusion va cependant trop loin parce quil existe de nombreuses ractions
en biochimie qui, dans des conditions physiologiques, se droulent uniquement
dans une seule direction, et dans lesquelles la constante dquilibre est en faveur de
la direction physiologique de la raction. Dans de tels cas, il est plus probable que
nous serons intresss par la constante de MICHAELIS de la raction directe et cest
cette constante de dissociation qui diffrera le plus probablement de la constante de
dissociation correspondante puisque les constantes de vitesse directes doivent tre
en moyenne plus grandes que les constantes de vitesse inverses pour des ractions
dans lesquelles la constante dquilibre favorise la direction directe.
Il est aussi possible que les deux constantes de MICHAELIS soient des constantes
dquilibre sans quaucune des tapes de fixation ne soit lquilibre : si k1 = k3
(c'est--dire si A et P se dissocient de leur complexe respectif avec la mme cons-
tante de vitesse), alors les deux expressions ont un facteur commun, (k2 + k2 + k3),
au numrateur et au dnominateur, qui slimine. Les deux simplifications
prsentes dans les quations [3.101] et [3.102] sappliquent alors sans aucune
hypothse sur les grandeurs de k2 et de k2 (CORNISH-BOWDEN, 1976).
En dpit de ces diffrents cas dans lesquels K m est quivalent une constante de
dissociation du substrat, en gnral il nest pas conseill de faire une telle
supposition, sauf si cette quivalence est confirme par une preuve vidente. Il est
plus raisonnable de considrer K m comme une quantit empirique qui dcrit la
dpendance de v vis--vis de [ A ] et non comme une mesure de la stabilit thermo-
dynamique du complexe enzyme-substrat.
3.6.5. Utilisation du profil dnergie de GIBBS
Il peut tre utile de reprsenter le profil dnergie de GIBBS pour la raction dans
des conditions dtat stationnaire.
[AP]
G E
D2 D2
[EP]
[EA]
D3
D1
D1 DGint
EP D3
E+A EA
DG ext
E+P
3.16 - Profil dnergie libre dune raction enzymatique
Chaque i reprsente le DGi pour ltape i de la raction et le DGext o reprsente la

variation globale dnergie libre de la raction A P. Puisque cette dernire ne
dpend pas de la prsence denzyme, elle peut tre appele variation dnergie
libre externe, par opposition avec la variation dnergie libre pour la raction se
droulant au sein du complexe avec lenzyme que nous appelerons variation
dnergie libre interne. Celle-ci est note DGint o dans la figure 3.16. Cette variation
dnergie libre interne est directement relie au mcanisme catalytique de lenzyme.
DG o = ( D D ) + ( D D ) + ( D D ) = RT ln K
ext 1 1 2 2 3 3 [3.103]
o = D D
DGint [3.104]
2 2
3.6.6. Les enzymes unidirectionnels
Un principe essentiel de la catalyse enzymatique est que la prsence dun enzyme

ne modifie pas la position de lquilibre chimique dune raction mais quelle
acclre simplement lvolution du systme vers cette position dquilibre. En

dautres termes, les lois de la thermodynamique prvoient quun enzyme catalyse
toujours une raction dans les deux directions. Dans un certain nombre de cas,
cependant, la catalyse apparat beaucoup plus efficace dans une des deux direc-
tions, en apparente contradiction avec les lois de la thermodynamique. Un exemple
frappant est celui de la mthionine adnosyltransfrase pour laquelle la vitesse
limite de la raction directe est environ 2 . 105 fois suprieure la vitesse limite de
la raction inverse, alors que la constante dquilibre est proche de lunit (MUDD
et MANN, 1963). Malgr une discussion approfondie de ce cas par JENCKS (1975),
beaucoup de biochimistes mconnaissent ce type de comportement et restent
convaincus que cette raction enzymatique ne respecte pas les lois de la thermo-
dynamique. Cependant, bien que lquation dHALDANE impose des limites sur le
comportement cintique possible dun enzyme, elle laisse la porte ouverte
lexistence dune large gamme de comportements.
Si nous considrons lquation [3.81] qui dcrit le comportement dune raction
rversible en fonction des constantes de spcificit et des constantes de MICHAELIS,
il est vident que lune ou lautre des constantes de spcificit peut prendre une
valeur quelconque condition que lautre saccorde aux exigences imposes par la
constante dquilibre, et quaucune contrainte nest impose sur les constantes de
MICHAELIS. Par exemple, si la catalyse de la direction directe est largement plus
efficace que celle de la raction inverse, la constante de dissociation Km A doit tre
beaucoup plus grande que Km P . Une petite valeur de Km P se manifeste gnra-
lement par une inhibition par le produit de la raction directe. Alternativement,
si lquation est crite en termes de constantes catalytiques et de constantes de
MICHAELIS, comme cest la pratique courante, lanalyse parat plus complexe parce
que ce type dcriture masque le fait que seules les constantes de spcificit sont
soumises une contrainte thermodynamique.
Si nous souhaitons examiner la gamme des comportements possibles, nous pou-
vons ignorer le rapport des constantes de spcificit parce que ce rapport est
impos par la thermodynamique et quil ne peut pas tre ajust au cours de
lvolution de lenzyme. De la mme manire, nous pouvons galement ignorer les
grandeurs relles de ces constantes puisque celles-ci refltent uniquement le niveau
gnral dactivit catalytique de lenzyme. Les seuls paramtres ajustables sont
donc les constantes de MICHAELIS. Comme nous pouvons le voir dans la
figure 3.17, si les valeurs de Km A et de Km P sont trs diffrentes, le graphique de v
en fonction de log( [ P ] [ A ] ) est fortement asymtrique : si Km P << Km A
(c'est--dire si le produit se fixe beaucoup plus fortement que le substrat, comme
cest le cas par exemple pour de nombreuses deshydrognases qui convertissent
NADox en NADred), la pente de la courbe est beaucoup plus accentue lorsque le
systme approche de lquilibre dans la direction directe de la raction que
lorsquil lapproche dans la direction inverse ; dans des conditions opposes cest
videmment linverse qui est observ. En conclusion, un enzyme peut tre un bien
meilleur catalyseur dans une direction que dans lautre sans pour autant dsobir
aux lois de la thermodynamique. Ltude de la figure 3.17 confirme que la vitesse
lquilibre est nulle et que, dans tout autre tat davancement, la raction procde
en direction de lquilibre : cest la seule contrainte impose par la thermodyna-
mique ; aucune contrainte nimpose que les courbes soient symtriques autour du
point dquilibre ni que lquilibre doive tre approch avec une pente similaire
dans les deux sens de la raction.
v 1 v 1
a - KmP = 0,01 KmA b - KmP = 100 KmA
0 0
Vitesse nulle Vitesse nulle

l'quilibre l'quilibre
1 1
0,01 0,1 1 10 100 0,01 0,1 1 10 100
[P]/[A] [P]/[A]
3.17 - Enzymes unidirectionnels
Les deux courbes sont calcules pour une constante dquilibre gale 1, c'est--dire pour
un quilibre o [P]/[A] = 1, mais o le rapport des constantes de MICHAELIS dans les
directions directe et inverse est diffrent dans les deux cas. Quand Km,P << Km A (a), la
courbe est trs pentue lorsque lquilibre est approch dans la direction directe, mais est
trs plate lorsquil est approch dans la direction inverse ; mais linverse est vrai quand
Km P >> Km A (b). Il faut noter que ces courbes nimpliquent aucune violation des principes de
la thermodynamique, parce que, quelles que soient les circonstances, la raction volue
toujours vers lquilibre.
Dun point de vue physiologique, lexistence denzymes unidirectionnels est

entirement justifie, puisque dans la nature un grand nombre de ractions ne
doivent pas tre catalyses dans la direction inverse et quil nexiste donc aucune
pression volutive pour amliorer la catalyse de la raction inverse. Labsence dun
dsavantage na pas le mme effet volutif que lexistence dun avantage, mme si
nous pouvons toujours nous demander pourquoi un tel comportement a t
slectionn. La rponse rside probablement dans la quantit limite dnergie de
fixation qui est disponible pour la catalyse enzymatique, comme la discut JENCKS
(1975). Un site actif strictement complmentaire de ltat de transition de la
raction optimiserait lactivit catalytique de lenzyme dans les deux sens de la
raction. Cependant, si seulement une des directions a une importance physio-
logique, lefficacit dans cette direction peut tre amliore aux dpends de celle
dans lautre direction en dveloppant un site actif ayant une meilleure affinit pour
les ractifs ou les produits que pour ltat de transition.
3.7. INHIBITION PAR LE PRODUIT
Linhibition par le produit est un cas spcial dinhibition qui sera discut en dtail
dans le chapitre 5, mais parce quelle dcoule naturellement du paragraphe pr-
cdent, il est utile de la mentionner brivement ici. Quand lquation [3.81]
sapplique, la vitesse doit diminuer lorsque le produit saccumule, mme si la
diminution de la concentration du substrat reste ngligeable, parce que le terme
ngatif du numrateur augmente de plus en plus lorsque la raction sapproche de
lquilibre et parce que le troisime terme du dnominateur augmente avec [ P ] .
Dans nimporte quelle raction, le terme ngatif du numrateur devient significatif
uniquement si la raction est significativement rversible. Cependant, linhibition
par le produit est manifeste dans de nombreuses ractions qui sont essentiellement
irrversibles, comme dans lexemple classique de lhydrolyse du sucrose catalyse
par linvertase. Ce phnomne indique que le produit doit tre capable de se fixer
sur lenzyme et est compatible avec le mcanisme le plus simple deux tapes
uniquement si la premire tape est irrversible et que la seconde ne lest pas. Cette
situation semble particulirement improbable, du moins comme un phnomne
gnral. Dun autre ct, le mcanisme trois tapes prdit que linhibition par le
produit peut avoir lieu dans une raction irrversible si la seconde tape, c'est--
dire la transformation chimique, est irrversible. Dans un tel cas, laccumulation du
produit provoque la squestration de lenzyme sous la forme du complexe EP qui
nest donc plus disponible pour ragir avec le substrat. Pour une raction
irrversible, lquation [3.81] peut scrire comme suit :
k A [ E ]0 [ A ] k0 [ E ]0 [ A ]
v = = [3.105]
[ A] [ P ] [ P ]
1+ + Km A 1 + + [ A]
Km A Km P KP
Si la raction est irrversible, Km P peut tre lgitimement remplac par K P , c'est-
-dire par une constante dquilibre, parce que si k2 a une valeur approximative-
ment gale zro, elle est ngligeable vis--vis du terme ( k 1 + k 2 ) . Comme nous
le verrons dans le 5.2.1, lquation [3.105] a exactement la forme du type le plus
commun dinhibition qui est appel inhibition comptitive.
Bien videmment leffet du produit ajout devrait tre exactement le mme que
celui du produit qui saccumule au cours de la raction, et donc il est possible de
mesurer des vitesses initiales en prsence de diffrentes concentrations de produit.
Pour chaque concentration de produit, la vitesse initiale pour diffrentes concen-
trations de substrat obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, mais avec des
[
valeurs apparentes k0 et Km ,A donnes par k0app = k0 et KmappA = Km A 1 + ( [ P ] KP ) ]
(comparer lquation [3.105] avec lquation [3.35]). Ainsi k0app est constant et gal
la valeur de k0 de la raction en absence dinhibition, mais KmappA est plus grand
que Km A et augmente linairement avec [ P ] .
Les premires tudes approfondies de linhibition par le produit ont t ralises

par MICHAELIS et RONA (1914) sur la maltase et par MICHAELIS et PECHSTEIN
(1914) sur linvertase, bien que celles-ci aient t prcdes par les tudes de
HENRI (1903) qui avait dj driv une quation quivalente lquation [3.105]
(quation [3.1]). Avec certains produits, tel que le fructose, ces auteurs ont observ
une inhibition comptitive de linvertase, mais avec dautres produits, tel que le
glucose, le comportement est plus complexe. Ainsi, puisquil existe de nombreuses
substances en plus du produit qui sont capables dinhiber lenzyme, il est clair
quune thorie plus complte est ncessaire. Celle-ci sera dveloppe dans les
chapitres suivants (en particulier dans le chapitre 5).
3.8. INTGRATION DES QUATIONS DE VITESSE

POUR LES RACTIONS ENZYMATIQUES
3.8.1. quation de MICHAELIS et MENTEN sans inhibition par le produit
Comme nous en avons discut au dbut de ce chapitre, les premiers chercheurs qui
ont tudi la cintique enzymatique se sont heurts plusieurs difficults parce
quils suivaient la raction sur des temps trop longs et analysaient leurs donnes en
utilisant des quations intgres de vitesse similaires celles communment uti-
lises en cintique chimique. Ces difficults ont t limines lorsque MICHAELIS
et MENTEN (1913) ont montr que les enzymes pouvaient tre tudis plus
simplement en mesurant des vitesses initiales, c'est--dire dans des conditions o
laccumulation du produit et la disparition du substrat nont aucun effet. Une
consquence malheureuse de ces premiers dveloppements est que les biochimistes
sont devenus rticents utiliser les quations intgres de vitesse, mme quand
elles pouvaient tre utilises de manire approprie. Il nest pas toujours possible
de raliser une exprience dans des conditions dtat stationnaire dans laquelle la
courbe davancement de la raction (c'est--dire le graphique de [ P ] en fonction
du temps, t) soit essentiellement linaire pendant une priode de temps apprciable,
et, dans ces cas, lestimation de la pente initiale et donc de la vitesse initiale, est
subjective et susceptible dtre errone. Une grande partie de cette subjectivit peut
tre limine en utilisant une forme intgre de lquation de vitesse, comme nous
allons le dcrire.
Si lquation de MICHAELIS et MENTEN est crite sous la forme suivante (voir
quation [3.36]),
d[ P ] V [ A]
= [3.106]
dt Km + [ A ]
nous avons une quation trois variables, [ P ] , t et [ A ] . Dans cette forme, elle ne
peut pas tre intgre directement, mais une des trois variables peut tre limine
en utilisant la relation stchiomtrique [ A ] + [ P ] = [ A ]0 . Nous obtenons alors

lquation suivante :
d[ P ] V ([ A ]0 [ P ])
= [3.107]
dt Km + ([ A ]0 [ P ])
qui peut tre intgre en sgrguant les deux variables dans les deux parties de
lquation :
( Km + [ A ]0 [ P ]) d [ P ]
= Vdt [3.108]
[ A ]0 [ P ]
La partie gauche de cette quation nest pas immdiatement assimilable une
intgrale simple, mais en la sparant en deux termes, nous obtenons :
Km d [ P ]
+ d[P] = Vdt [3.109]
[ A ]0 [ P ]
desquels le premier a une forme standard que nous avons dj utilise plusieurs
reprises dans ce manuel (par exemple dans le 1.2) :
Km d [ P ]
= Km ln([ A ]0 [ P ]) [3.110]
[ A ]0 [ P ]
et le second est trivial. Nous obtenons alors la forme intgre suivante :
Km ln ([ A ]0 [ P ]) + [ P ] = Vt + a [3.111]
o a est une constante dintgration qui peut tre value dans la condition limite
de [ P ] = 0 quand t = 0, c'est--dire que a = Km ln [ A ]0 . En substituant cette
valeur de a dans lquation [3.111] et en rarrangeant, nous obtenons :
[ A ]0
Vt = [ P ] + Km ln [3.112]
[ A ]0 - [ P ]
3.8.2. Inhibition par le produit
Bien que lquation [3.112] soit une forme intgre de lquation de MICHAELIS et
MENTEN (quation [3.106]), lutilisation pratique de cette quation peut gnrer
des erreurs importantes sur les valeurs des paramtres cintiques, si certaines
prcautions ne sont pas prises. En effet, puisquil ne sagit pas de mesures ralises
dans des conditions de vitesse initiale, linhibition par le produit ne peut plus tre
nglige, puisque, quelle que soit la concentration initiale du produit, celui-ci
saccumule au cours de la raction. Dans le cas le plus simple, nous devons
remplacer lquation [3.107] par lquation qui tient compte dune possible
inhibition comptitive par le produit P qui est caractrise par la constante
dinhibition KP :
d[ P ] V ([ A ]0 [ P ])
= [3.113]
dt [ P ]
Km 1 + + [ A ]0 [ P ]
KP
Cette quation a une forme algbrique similaire lquation [3.107], ce qui a deux
consquences importantes : premirement, il est impossible de dterminer partir
de donnes exprimentales en accord avec lquation [3.112] si lquation [3.107]
est le point de dpart correct plutt que lquation [3.113] ; deuximement, la
mme logique qui a permis dintgrer lquation [3.107] peut tre utilise pour
intgrer lquation [3.113]. Lquation obtenue de cette manire est la suivante :
Vt = [P ]+
[ ln
]
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) [ A ]0
[3.114]
1 ( Km KP ) 1 ( Km KP ) [ A ]0 [ P ]
Dans ses tudes de linvertase, HENRI (1903) avait obtenu une quation quivalente
(voir quation [3.1]). Lquation [3.114] a exactement la mme forme que
lquation [3.112] et peut aussi scrire de la manire suivante :
[ A ]0
V app t = [ P ] + Kmapp ln [3.115]
[ A ]0 [ P ]
avec V app = V [3.116]

1 ( Km KP )
Kmapp =
[
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) ] [3.117]
1 ( Km KP )
c'est--dire que lquation [3.112] a t crite en remplaant respectivement
V et K m par les valeurs apparentes V app et Kmapp . Notons que le dnominateur
1 ( Km KP ) est commun aux deux expressions [3.116] et [3.117] indiquant que
les valeurs apparentes peuvent diffrer de manire importante des valeurs relles
des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, sauf si la fixation du produit peut tre
nglige. Nanmoins, les valeurs des paramtres apparents peuvent tre ngatives
si le produit se fixe plus fermement que le substrat (c'est--dire si la valeur de KP
est infrieure la valeur de K m ). Pour apprcier ce que signifie de ngliger la
fixation du produit dans ce contexte, nous pouvons imaginer que nous souhaitons
analyser un dcours complet de raction en utilisant [ A ]0 = 2 Km et que nous
dsirons que la valeur de Kmapp ne diffre pas de celle de K m de plus de 5%. En
remplaant de manire adquate les termes de lquation [3.117] nous obtenons
que K m doit tre au maximum gale 0,03 KP, c'est--dire que le substrat doit se
fixer au moins 33 fois plus fermement sur lenzyme que le produit. Cette situation
nest pas impossible, nanmoins, elle est suffisamment improbable pour autoriser
lutilisation de lquation [3.112] sans aucune prcaution.
3.8.3. Mesures prcises des vitesses initiales
En dpit des complications discutes ci-dessus, les mesures de V app et de Kmapp

peuvent savrer trs utiles si nous considrons leur vritable valeur, non comme
des mesures directes de V et de Km mais comme moyen de calculer des valeurs trs
prcises de la vitesse initiale en les insrant dans lquation suivante :
V app [ A ]0
v0 = [3.118]
Kmapp + [ A ]0
Cette quation dcoule de lquation [3.115] par diffrenciation, sans gard pour la
signification de V app et de Kmapp .
En rarrangeant lquation [3.115], nous obtenons :
[P] Kmapp
t = 1app + [3.119]
[ A ]0 V [ A ]0 V app
ln ln
[ A ]0 [ P ] [ A ]0 [ P ]
qui montre quun graphique de t en fonction de

ln{ [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}
[P]
a la forme dune droite dont la pente est gale 1 V app et
ln { [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}
lordonne lorigine est gale Kmapp V app . Les paramtres V app et Kmapp peuvent
facilement tre dtermins partir de ce graphique et v0 peut tre calcul partir de
ces valeurs en utilisant lquation [3.118]. Nanmoins, la valeur de v0 peut
galement tre obtenue directement sans passer par la dtermination de Vapp et de
Kmapp , par une simple extrapolation de la droite : le rarrangement de lquation
[3.118], sous la forme de lquation [3.56], indique que le point ([ A ]0 , [ A ]0 v )
doit se trouver sur une droite de pente gale 1 V app et dont lordonne lorigine
est gale Kmapp V app , c'est--dire sur la mme droite que celle trace partir de
lquation [3.119]. Cela signifie que si cette droite est extrapole jusquau point o
[P]
= [ A ]0 la valeur de lordonne doit tre gale [ A ]0 v .
ln { [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}
Lensemble de ce processus est illustr dans la figure 3.18. Le point extrapol peut
tre trait comme un point ordinaire sur un graphique de [ A ]0 v0 en fonction de
[ A ]0 (voir figure 3.11), et si plusieurs points sont obtenus partir de plusieurs
dcours complets raliss diffrentes valeurs de [ A ]0 , les valeurs de V et de Km
peuvent tre dtermines comme nous lavons dcrit prcdemment ( 3.5.2). Cette
procdure, introduite par JENNINGS et NIEMANN (1955), peut apparatre comme
une faon laborieuse et inutile de gnrer un graphique de [ A ]0 v0 en fonction de
[ A ]0 , mais elle fournit en ralit des valeurs de [ A ]0 v0 beaucoup plus prcises
que nimporte quelle autre mthode, et donc en consquence permet dobtenir des
valeurs plus prcises des paramtres cintiques. Lextrapolation requise est trs
courte et elle peut tre ralise de manire plus prcise et moins subjective que
lestimation de la tangente une courbe extrapole au temps zro. Une tude de
variants de la subtilisine dans laquelle cette approche a t utilise de manire
satisfaisante est prsente par BRODE et al. (1996).
t Points provenant d'un dcours complet

ln{[A]0 /([A]0[P])} Points obtenus par extrapolation linaire des points
exprimentaux jusqu' une valeur d'abscisse gale [A]0
[A]0 /v0
Pente = 1/Vapp
Kmapp/Vapp
Pente = 1/V
Km /V
Km 0 [A]0
[P]

ln{[A]0 /([A]0[P])}
3.18 - Dtermination des paramtres cintiques
partir des dcours complets de raction
t
Les valeurs de sont portes en graphique pour plusieurs
ln { [A]0 ([A]0 [P])}
concentrations initiales de substrat [A]0 lorsque le temps augmente en fonction de
[P]
et chaque ensemble de tels points ( ) est extrapol vers une
ln { [A]0 ([A]0 [P])}
valeur dabscisse gale [A]0 pour donner des points () qui se localisent sur une droite
de pente 1/V avec des intersections avec laxe des abscisses et celui des ordonnes qui
donnent respectivement les valeurs de Km et de Km /V.
Une mthode plus simple, ncessitant seulement des calculs triviaux (sans loga-
rithme), peut tre obtenue en utilisant une approximation du terme logarithmique.
Pour introduire celle-ci, il est utile de dmarrer avec lquation intgre de vitesse
pour une raction simple dordre un (quation [1.8]) et de noter quelle peut
scrire de la manire suivante :
[ ]
ln 1 ( [ P ] [ A ]0 ) = k t (3.120)
o [ P ] reprsente la concentration du produit au temps t, k la constante de premier
ordre et [ A ]0 la concentration du ractif au dpart. Pour des petites valeurs dune
grandeur x, lexpression 2 x ( 2 + x ) est une excellente approximation de ln( 1 + x) ,
correspondant des erreurs infrieures 0,1% et 1% pour des valeurs de x res-
pectivement infrieures 0,1 et 0,41. Ainsi, jusqu 40% de la raction, lquation
[3.120] peut scrire de la manire suivante avec une prcision suprieure 1% :
( 2[ P ] [ A ]0 )
= kt [3.121]
2 ( [ P ] [ A ]0 )
Lquation peut tre rarrange comme suit :

[P] k[ P ]
= k [ A ]0 [3.122]
t 2
Lquation [3.122] montre quun graphique de [ P ] t en fonction de [ P ] donne
une droite dont lordonne lorigine vaut k [ A ]0 , qui correspond la vitesse
initiale. BOEKER (1982) a montr que lordonne lorigine fournit la valeur de la
vitesse initiale de manire plus gnrale que dans le cas des cintiques de premier
ordre, quand par exemple [ P ] au temps zro est diffrente de zro ou quand il y a
moins de 100% de conversion compltion de la raction, condition que
laugmentation de [ P ] soit porte en graphique, c'est--dire que ([ P ] [ P ]0 ) t
soit utilise comme la variable dpendante et non [ P ] t . Plus important encore
pour la cintique enzymatique, elle a ralis que bien que cette thorie ne
sapplique pas aussi simplement aux ractions enzymatiques, il nexiste pas de
diffrence dans la pratique parce que la dviation par rapport aux prdictions est
normalement trop faible pour tre dtecte.
En appliquant la mme approximation lquation [3.112], nous obtenons lqua-
tion suivante :
[P] V [ A ]0 V[P] [ P ]2
= + [3.123]
t Km + [ A ]0 2( Km + [ A ]0 ) 2( Km + [ A ]0 )t
A cause du troisime terme de la partie droite, cette quation ne dfinit plus une
droite, mais deux points importants doivent tre considrs. Premirement, ce
troisime terme est nul au dbut de la raction, de sorte quil na aucun effet sur
lordonne lorigine qui reprsente toujours la vitesse initiale de la raction.
Deuximement, il est en gnral suffisamment petit pour ne produire quune
dviation triviale de la linarit dans la premire partie de la raction, et en cons-
quence na quun effet limit sur lutilisation du graphique de [ P ] t en fonction
de [ P ] pour dterminer la vitesse initiale.
Un dcours complet publi par SCHNHEYDER (1952) fournit un excellent exemple
pour tester cette mthode (ou nimporte quelle autre) destimation de la vitesse
initiale, puisquil consiste en 25 mesures couvrant la gamme de 2,5% 98% de
compltion de la raction. Le graphique de BOEKER pour cet exemple est illustr
dans la figure 3.19, avec le dcours complet original prsent dans lencart. Notons
que dans lexemple de la figure 3.19, le graphique de BOEKER est linaire pendant
les 15 premires minutes, correspondant environ 40% de la raction. Notons
galement que bien que les erreurs systmatiques tendent vers zro lorsque le
temps tend vers zro, il nen est pas de mme pour les erreurs alatoires, parce que,
la limite de t = 0, la valeur de [ P ] t est gale 0 0 dont la valeur est indfinie.
La consquence pratique est que nous devons tracer la droite lil en attribuant peu
dimportance la dispersion des points correspondant aux temps les plus courts. Si
nous appliquons navement une rgression linaire de manire obtenir la
meilleure droite, il est probable que nous obtenions une droite qui est loin dtre la
meilleure parce quelle sera excessivement influence par les points les moins prcis.
[P]/t (% / min) 6 Les points proches 100
[P] (%)
de l'axe sont sujets
d'importantes 80
Vitesse initiale erreurs alatoires
5 60
40
4 20
0
0 20 40 60
3
t (min)
1 Les points aprs 40% d'avancement

de la raction sont sujets des erreurs
systmatiques plus importantes
0
0 20 40 60 t (min)
3.19 - Dtermination prcise des vitesses initiales par la mthode de BOEKER
La valeur de [P]/t extrapole [P] = 0 fournit une valeur de la vitesse initiale. Il est
important de noter que les erreurs alatoires deviennent trs importantes proximit des
axes, de sorte que lextrapolation doit tre ralise lil et non par une rgression
linaire. Linsert montre lensemble du dcours complet de la raction : notons que celui-ci
est courbe sur lensemble de la raction et ne prsente donc aucune indication de
lexistence dune phase linaire initiale.
3.8.4. Les dcours complets dans dautres cas
Dans le dveloppement initial des mthodes dintgration des quations de vitesse

et danalyse des dcours complets, chaque mcanisme tait trait comme un cas
spcial ; bien que de nombreux cas aient t analyss, incluant des ractions
sujettes une inhibition comptitive par le produit (HENRI, 1903 ; HUANG et
NIEMANN, 1951 ; SCHNHEYDER, 1952) et des ractions rversibles (LAIDLER et
BUNTING, 1973), ceux-ci ne sintgraient pas de manire vidente dans un schma
gnral. Plus tard, BOEKER (1984, 1985) a dvelopp une approche systmatique
dans laquelle de nombreux mcanismes importants pour ltude des enzymes
peuvent tre manipuls de la mme manire. A ce moment, cependant, les
mthodes moins efficaces de vitesse initiale pour lanalyse des mmes mcanismes
taient devenues tellement populaires que son travail na pas eu limpact quil
mritait. Un exemple dapplication peut tre trouv dans ltude de variants de
laspartate aminotransfrase (SCHILLER, HOLMES et BOEKER, 1996). Plus

rcemment, le principal travail danalyse des dcours complets de ractions
catalyses par des enzymes a t ralis par DUGGLEBY et ses collaborateurs
(DUGGLEBY, 1995 ; GOUDAR, SONNAD et DUGGELBY, 1999) et son rcent article
(DUGGLEBY, 2001) sur le sujet devrait tre consult pour plus dinformation.
PROBLMES
3.1 - Pour un enzyme obissant lquation de MICHAELIS et MENTEN, calculer

a - la concentration de substrat pour laquelle v = 0,1 V,
b - la concentration de substrat pour laquelle v = 0,9 V,
c - le rapport entre les deux.
3.2 - A lpoque de Victor HENRI, il ntait pas draisonnable de penser quun
enzyme agissait uniquement par sa simple prsence, c'est--dire sans
ncessairement se combiner avec le substrat. Driver une quation de
vitesse pour le mcanisme ci-dessous, dans laquelle EA est form mais
ne se trouve pas sur le chemin ractionnel allant de A P, et montrer
que ce mcanisme conduit une quation de vitesse qui a la mme
forme que lquation de MICHAELIS et MENTEN. Quelles sont les dfinitions
de V et de Km en termes de K et de k ?
EA
3.20 - Mcanisme de catalyse nimpliquant pas la
formation dun complexe enzyme-substrat, tel quil K
avait t suggr par Victor HENRI comme une
k
alternative au type habituel de mcanisme E+A E+P
3.3 - Un test dactivit pour un enzyme doit tre mis au point afin que la
vitesse initiale mesure soit insensible aux petites erreurs commises sur
la concentration de substrat. Quelle doit tre la grandeur de [ A ] Km
pour quune erreur de 10% sur la concentration de substrat, [ A ] , se
traduise par une erreur infrieure 1% sur la valeur de v ? (supposer que
lquation de MICHAELIS et MENTEN est respecte).
3.4 - Dans une tude de la fumarase du cur de porc, les paramtres cin-
tiques suivants ont t obtenus pour la raction directe : Vm = 1,7 mM,
V = 0,25 mM1 s1, et Vm = 3,8 mM, V = 0,11 mM1 s1 pour la raction in-
verse. Estimer la constante dquilibre pour la raction entre le fuma
rate et le malate. Pour un chantillon de fumarase provenant dune
autre source, les paramtres cintiques suivants ont t obtenus :
Km = 1,6 mM, V = 0,024 mM1 s1 pour la raction directe et Km = 1,2 mM,
V = 0,012 mM1 s1 pour la raction inverse. Commenter la plausibilit de
ces rsultats.
3.5 - Le tableau ci-dessous donne les valeurs des concentrations de produit,

[ P ] , (en mM) diffrents temps (en min) pour 5 valeurs diffrentes de la
concentration initiale de substrat, [ A ]0 (en mM). Estimer la vitesse
initiale pour chaque concentration de substrat partir des graphiques de
[ P ] en fonction de t. Ensuite, estimer K m et Vm , en supposant que la
vitesse initiale est donne par lquation de MICHAELIS et MENTEN.
T [ A ]0 = 1 [ A ]0 = 2 [ A ]0 = 5 [ A ]0 = 10 [ A ]0 = 20
1 0,095 0,18 0,37 0,56 0,76
2 0,185 0,34 0,71 1,08 1,50
3 0,260 0,49 1,01 1,57 2,20
4 0,330 0,62 1,29 2,04 2,88
5 0,395 0,74 1,56 2,57 3,50
6 0,450 0,85 1,80 2,87 4,12
7 0,505 0,95 2,02 3,23 4,66
8 0,555 1,04 2,22 3,59 5,24
9 0,595 1,12 2,40 3,92 5,74
10 0,630 1,20 2,58 4,22 6,24
3.6 - Si une raction est sujette une inhibition par le produit en accord avec
lquation [3.105], la courbe dvolution de la raction obit une
quation de la forme suivante :
K [ A ] [ A ]0
k0 [ E ]0 t = 1 mA ( [ A ]0 [ A ] ) + KmA 1 ln
KP KP [ A ]
o [ A ]0 est la valeur de [ A ] quand t = 0 et les autres symboles ont la
mme dfinition que dans l quation [3.105].
a - Montrer que lquation [3.105] est la forme diffrentielle de cette
quation.
b - Comparer lquation avec lquation [3.115] et crire les expressions
pour V app et K mapp (comme dfinies dans lquation [3.115]).
c - Dans quelles conditions V app et K mapp prendront-elles des valeurs
ngatives ?
3.7 - ATASSI et MANSHOURI (1993) ont rapport que des peptides synthtiques
(ou pepzymes ), symboliss par ChPepZ et TrPepZ, catalysaient
lhydrolyse du N-benzoyl-L-tyrosine thyle ester et du N-tosyl-L-arginine
mthyle ester avec des constantes cintiques comparables celles
respectivement de la chymotrypsine et de la trypsine, comme lindique
le tableau ci-aprs :
Substrat 3 Catalyseur Km (mM) k0 (s1)

N-benzoyl-L-tyrosine thyle ester ChPepZ 1,11 147
a-Chymotrypsine 1,07 185
N-tosyl-L-arginine mthyle ester TrPepZ 2,42 85
Trypsine 2,56 221
De quelle manire ces rsultats supportent-ils laffirmation que, claire-

ment, les pepzymes devraient avoir un impact norme en biologie, en
mdecine, dans lindustrie et pour dautres applications ?
3.8 - Trois isoenzymes catalysant la mme raction avec des valeurs de Km de
0,04, 0,2 et 5 mM ont t dcouverts dans un extrait cellulaire. Leurs
valeurs de V sont respectivement gales 0,7, 1,2 et 0,8 (units
arbitraires). Comment cette information peut-elle tre prsente dans un
graphique couvrant une gamme de substrat allant de 0,01 20 mM ?
3. Lexactitude factuelle de linformation prsente dans le tableau a t remise en

question (COREY et PHILIPS, 1994 ; WELLS et al., 1994). Nanmoins, bien que ces
publications poussent considrer les rsultats DATASSI et MANSHOURI avec un
scepticisme certain, elles naffectent pas la question pose dans lexercice,
laquelle il est possible de rpondre en supposant que les rsultats sont corrects.
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES
Avant dentamer ce chapitre dans lequel nous discutons de plusieurs aspects

pratiques considrer lors de la ralisation de mesures cintiques, il faut noter que
la gnralisation de lutilisation de micro-ordinateurs dans les laboratoires la fin
des annes 1980 a modifi considrablement les pratiques de ltude cintique.
Le calcul assist par ordinateur permet, entre autres, de traiter plus rapidement les
donnes brutes et permet de raliser des ajustements de paramtres avec des
quations linaires ou non-linaires. Alors que lajustement manuel du dcours
complet dune raction sur lquation intgre de MICHAELIS et MENTEN est
quasiment impossible, cette procdure peut tre ralise aussi facilement quune
rgression linaire avec laide dun ordinateur. Cette volution des mthodes
danalyse permet dutiliser des approches exprimentales qui avaient t ngliges
cause de leurs difficults dapplication.
4.1. MESURE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE
4.1.1. Mthodes continues et discontinues de mesure
La caractrisation des systmes enzymatiques repose sur la mesure de lactivit

enzymatique et donc sur lexistence dune mthode exprimentale permettant de
suivre lvolution de la raction au cours du temps. Quelle que soit la mthode
analytique choisie, elle doit permettre de distinguer les substrats des produits et de
mesurer leur concentration de manire quantitative. Parmi les mthodes de mesure
utilises, on distingue les mthodes continues et les mthodes discontinues. Dans
une mthode discontinue, des chantillons sont prlevs du mlange ractionnel
intervalles successifs et sont analyss indpendamment afin de suivre lavancement
de la raction. Lorsque cela est possible, il est toujours prfrable nanmoins duti-
liser une mthode continue de mesure dans laquelle lavancement de la raction
peut tre suivi en continu avec un appareil de mesure automatique. Par exemple,
pour les ractions qui saccompagnent dun changement dabsorbance une
longueur donde facilement mesurable, la cintique peut tre suivie laide dun
spectrophotomtre (JOHN, 2002). Ainsi, de nombreuses ractions biochimiques
impliquant la conversion entre le NADox et le NADred peuvent tre aisment suivies
en mesurant la variation dabsorbance 340 nm. Dans les cas o une mthode
spectroscopique nest pas utilisable, dautres alternatives existent qui permettent

galement de suivre la raction en continu. Par exemple, il est parfois possible de
coupler la raction tudie avec une raction facilement mesurable, comme nous en
discuterons au 4.1.4. On parlera dans ce cas de systmes coupls . Dautres
mthodes analytiques permettent galement une mesure en continu. Par exemple,
parmi les ractions qui nimpliquent aucune variation de proprits spectrosco-
piques aisment mesurable, nombreuses sont celles qui saccompagnent de la
libration ou de la fixation de protons. Ces ractions peuvent tre suivies dans des
solutions non-tamponnes laide dun pH-stat , un instrument qui ajoute
automatiquement une base ou un acide pour maintenir constant le pH de la solution
(BROCKLEHURST, 2002). Si la stchiomtrie de la raction est connue, un enre-
gistrement de la quantit ajoute de base ou dacide fournit galement une mesure
continue de lavancement de la raction.
4.1.2. Estimation de la vitesse initiale
La mesure de la vitesse initiale dune raction peut poser de srieux problmes

pratiques. Idalement, il est souhaitable de disposer de conditions dans lesquelles la
courbe davancement de la raction est quasiment linaire pendant la priode de
mesure, mais en thorie, une telle situation nexiste pas. Quel que soit le mca-
nisme de la raction, la vitesse de la raction varie au cours du temps (habituelle-
ment elle dcrot) pour diverses raisons, que ce soit parce que le substrat est
consomm, parce que les produits qui saccumulent inhibent la raction ou parce
que lenzyme perd progressivement son activit. Un exemple simple est prsent
dans le 3.6 et quelques cas plus complexes, mais aussi plus ralistes, sont
discuts dans larticle de CORNISH-BOWDEN (1975). En pratique, toutefois, si
lavancement de la raction est mesur pour une variation infrieure 1% de la
variation totale, la courbe davancement de la raction nest pas distinguable dune
droite. Cette situation est cependant moins courante que ne le laisse supposer la
littrature et de nombreux exprimentateurs refusent dadmettre les difficults
inhrentes la mesure prcise de la tangente une courbe. Nombreux sont ceux
qui prfrent se persuader que leur courbes davancement sont biphasiques, avec
une partie initiale linaire (quils utilisent pour leur mesure) suivie dune partie o
la vitesse est dcroissante. Cette pratique conduit presque toujours une sous-
estimation de la vritable vitesse initiale, pour des raisons qui apparaissent
clairement si lon examine la figure 4.1. Mme si la droite est contrainte passer
par lorigine, la mesure tendra sous-estimer la pente relle (bien que de manire
moins exagre que dans la figure 4.1) si les quelques premiers points sont traits
comme une droite.
Pour viter ce problme, il est essentiel de bien le connatre et de se rappeler que
lon essaie de mesurer la vitesse initiale et non la vitesse moyenne durant les
quelques premires minutes de la raction, parce que cest la vitesse initiale qui est
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES 121
utilise dans lquation de vitesse. Ds lors, il faut tracer la tangente la courbe au

temps zro et non la corde. Bien entendu, le recours ces raffinements dans la
mesure de la vitesse initiale dpend de la prcision souhaite pour la mesure. Dans
le cas o la mesure est utilise pour suivre les progrs de la purification dun
enzyme, il nest pas ncessaire dobtenir une valeur extrmement prcise de la
vitesse initiale. Par contre, lors de ltude cintique de lenzyme purifi, il est
souhaitable dobtenir une mesure plus prcise quen traant la main la tangente
au temps initial. Dans ces cas, une manire dobtenir une mesure prcise de la
vitesse initiale repose sur lutilisation de lquation intgre (voir 2.8).
Produit form 20
(units arbitraires)
Vraie tangente initiale
Pente = 5
15
Estimation partir
des cinq premiers points
10 Pente = 3,25
0
0 2 4 6 8
Temps (units arbitraires)
4.1 - Problmes lis lestimation de la vitesse initiale
La droite continue passant par lorigine montre la vraie tangente initiale, qui a une pente
suprieure de plus de 50% la droite en pointills qui a t dessine en traitant les cinq
premires valeurs exprimentales comme si elles faisaient partie dune phase linaire
hypothtique. En ralit, il ny a pas de phase linaire et lvolution de la raction est
courbe sur la totalit de la gamme de temps.
4.1.3. Amlioration de la linarit dun dcours de raction
Puisque la vitesse dune raction catalyse par un enzyme est directement propor-
tionnelle la concentration de cet enzyme, une proprit qui est facilement vri-
fiable exprimentalement, il est impossible de modifier la courbure dun graphique
davancement en modifiant la concentration de lenzyme : il est uniquement
possible de modifier lchelle de temps sur laquelle se droule la raction et tout
autre changement apparent de la courbure nest quillusion. En effet, cette proprit
est la base du test de linactivation de lenzyme dcrit dans le 4.2. En pratique, il
est parfois avantageux de diminuer la concentration denzyme afin de diminuer la
quantit de produit form durant la priode entre le mlange des ractifs et le
moment auquel dbute lobservation de la raction (temps mort de la mthode),

cest--dire de rduire la fraction de la raction qui nest pas directement
observable.
Par contre, il est possible damliorer la linarit de la courbe davancement de la
raction en augmentant la concentration de substrat, condition que les produits ne
se lient pas plus fortement que les substrats lenzyme (comme cest souvent le
cas, par exemple, avec les ractions dans lesquelles le NADox est converti en
NADred). Pour illustrer leffet de la concentration de substrat, nous considrerons le
cas le plus simple, celui dune raction qui obit lquation de MICHAELIS et
MENTEN et nest sensible ni une inhibition par le produit de la raction ni un
ralentissement caus par un phnomne autre que la disparition du substrat. Dans
ce cas, la forme intgre de lquation de MICHAELIS et MENTEN (cest--dire
lquation [2.56], avec V app = V et Kmapp = Km ) dcrit la courbe davancement de la
raction. Si la concentration initiale de substrat [ A ]0 est gale 5 K m, la vitesse
initiale v0 est gale 0,83 V et est largement insensible une lgre erreur dans la
concentration de substrat [ A ]0 . Mme si la valeur de [ A ]0 est augmente jusqu
10 K m, v0 augmente seulement de 9%, jusqu 0,92 V. A priori, ces considrations
suggrent que laugmentation de la concentration de substrat napporte aucune
amlioration apprciable la mesure, en dpit du fait quelle cote plus chre,
puisquelle ncessite une plus grande quantit de substrat. Cependant un calcul
simple utilisant lquation [2.56] montre que si [ A ]0 = 5 K m, le temps ncessaire
pour que la vitesse diminue de 1% est de 0,34 Km /V, alors que si [ A ]0 = 10 K m le
temps ncessaire pour obtenir le mme ralentissement est de 1,11 K m /V, cest--
dire un temps 3 fois plus long. Ainsi, une augmentation de la concentration initiale
de substrat tend la zone linaire . En pratique ce calcul est une simplification,
parce que quasiment toutes les ractions catalyses par des enzymes sont sujettes
une inhibition par le produit, mais le principe continue sappliquer qualitative-
ment mme si les produits se fixent plus fortement sur lenzyme que les substrats.
Une seconde raison dutiliser une concentration de substrat aussi leve que
possible dans un test enzymatique, dans les limites permises par le cot, la
solubilit et linhibition par le produit, est que cette pratique minimise la sensibilit
du test aux erreurs commises sur la concentration du substrat, non seulement au
cours de la raction comme nous venons den discuter, mais aussi dune exprience
lautre. Dans le cas o [ A ]0 = 0,1 K m, par exemple, les solutions devraient tre
prpares avec infiniment de prcision, car une erreur de 10% commise sur la
concentration de substrat ( [ A ]0 ) se traduit par une erreur denviron 10% sur la
valeur mesure de la vitesse ; inversement, dans le cas o [ A ]0 = 10 K m , une
prcision moindre serait exige dans la prparation des solutions, puisquune erreur
de 10% commise sur [ A ]0 se traduit par une erreur infrieure 1% sur la mesure
de la vitesse. Si des prcautions sont prises pour augmenter la linarit de la courbe
davancement de la raction, il est toujours recommand dobserver la raction
suffisamment longtemps pour que la courbure devienne visible. Mme si ces
derniers moments de la raction ne sont pas utiliss dans la dtermination de la

vitesse, leur prsence dans la courbe rduira la probabilit derreur due au
traitement dune partie de la courbe comme si elle tait linaire, cest--dire que
cela permettra de rduire la probabilit dune erreur similaire celle prsente dans
la figure 4.1.
4.1.4. Les systmes coupls
Lorsque la raction tudie ne donne pas lieu un signal spectroscopique facile-

ment mesurable, il est parfois possible de suivre la raction de manire indirecte en
la couplant une autre raction. Considrons, par exemple, la raction de
transfert dun groupe phosphate partir de lATP vers le glucose, catalyse par
lhexokinase :
Glucose + ATP Glucose 6-phosphate + ADP [4.1]
Cette raction ne saccompagne daucun changement spectral utilisable, mais elle
peut tre suivie par spectrophotomtrie, en la couplant la raction catalyse par la
glucose 6-phosphate dshydrognase :
Glucose 6-phosphate + NADPox 6-phosphogluconate + NADPred [4.2]
Si lactivit de lenzyme couple est suffisamment leve pour que le glucose
6-phosphate soit oxyd aussi vite quil se forme, la conversion du NADox en
NADred, enregistre laide dun spectrophotomtre, se droulera exactement la
mme vitesse que la premire raction. Les conditions ncessaires pour que le
systme coupl soit utilisable, peuvent tre exprimes dans des termes simples
mais gnraux en utilisant le schma suivant :
v1 v2
A B C [4.3]
[ A] [B] [C ]
dans lequel la conversion de A en B la vitesse v1 est la raction tudie, et la
conversion de B en C est la raction couple qui se droule la vitesse v2 et qui
peut facilement tre suivie exprimentalement. Evidement les mesures de v2 fourni-
ront une information prcise sur la valeur initiale de la vitesse v1 uniquement si un
tat stationnaire pour la concentration de B est atteint avant que v1 ne commence
diminuer perceptiblement par rapport sa valeur initiale. La plupart des traitements
de ce systme (par exemple celui de MC CLURE, 1969) supposent que v2 ait une
dpendance du premier ordre vis--vis de [ B ] , bien que cette condition soit
irraliste, ne soit pas ncessaire et puisse mme conduire un gaspillage de
matriel. Puisque la raction couple est gnralement catalyse par un enzyme, il
est plus appropri de supposer que v2 dpende de [ B ] en accord avec lquation de
MICHAELIS et MENTEN :
V2 [ B ]
v2 = [4.4]
Km 2 + [ B ]
dans laquelle lindice 2 indique que les valeurs de V2 et de Km2 sont les paramtres
cintiques de MICHAELIS et MENTEN pour la seconde raction (la raction
couple). Si v1 est une constante (comme cest approximativement le cas pendant la
priode initiale de la raction tudie), lquation [4.5] exprimant la vitesse de
variation de [ B ] avec le temps peut rapidement tre intgre (pour plus de dtails,
voir STORER et CORNISH-BOWDEN, 1974) :
d[ B ] V2 [ B ]
= v1 v 2 = v1 [4.5]
dt Km 2 + [ B ]
A partir de cette quation, nous pouvons conclure que le temps t requis pour que v2
atteigne une fraction spcifie de v1 est donne par une quation de la forme
suivante
f Km 2
t = [4.6]
v1
dans laquelle le paramtre f est un nombre sans dimension dpendant uniquement
des rapports v2/v1 et v1/V2. Les valeurs de f permettant la mise au point dun
systme coupl sont donnes dans le tableau 4.1. Le seul paramtre ajustable, V2,
(Km2 tant fix par le choix de lenzyme couple et des conditions de raction) doit
tre suffisamment grand pour que t reprsente une partie rduite du temps de
mesure. Les valeurs donnes dans le tableau ont t calcules en supposant que v2
devrait atteindre au moins 99% de v1, bien que pour certaines applications cette
condition ne soit pas rigoureusement ncessaire. Par exemple, si lon cherche dans
un processus de purification reprer les fractions actives au cours de llution
dune colonne de chromatographie, une valeur de 90% est largement suffisante.
Tableau 4.1 - Temps requis pour quun systme coupl atteigne un tat stationnaire
v1 /V2 f v1 /V2 f
0,0 0,00 0,5 6,86
0,1 0,54 0,6 11,7
0,2 1,31 0,7 21,4
0,3 2,42 0,8 45,5
0,4 4,12 0,9 141
Le tableau montre la valeur de f qui doit tre insre dans lquation [4.6] pour donner le
temps ncessaire pour que la vitesse v2 mesure avec un systme coupl atteigne 99% de
la vitesse cible v1. Par exemple, supposons que v1 soit de 0.1 mM min1, V2, la vitesse limite de
la raction couple, est de 0,5 mM min1 et Km2, la constante de MICHAELIS de lenzyme
coupl dans les conditions du test, est de 0,2 mM. Avec ces valeurs, le tableau donne
f = 1,31 ; ainsi, le temps ncessaire pour que la vitesse mesure atteigne 99% de
0,1 mM min1 est de 1,31 0,2/0,1 min ou 2,62 min. Le tableau est la version abrge de
celle prsente par STORER et CORNISH-BOWDEN (1974).
Larticle original de STORER et CORNISH-BOWDEN (1974) dcrit comment les

valeurs sont calcules et donne galement les rsultats pour v2/v1 = 0,90 et 0,95, en
plus de ceux pour v2/v1 = 0,99, ainsi que pour une plus large gamme de valeurs de
v1/V2 .
La validit de ce traitement peut tre vrifie en mesurant la raction de couplage
sur une certaine priode de temps et en dmontrant que la valeur v2 augmente
de manire attendue. Un exemple dun tel test est prsent dans la figure 4.2.
Dans cette exprience, la valeur de V2 a t dlibrment mal choisie (trop petite)
afin de rendre la priode dacclration clairement observable.
Produit form 0,10

(mM)
V2 = 0,304 mM min1
0,08
0,06 V2 = 0,122 mM min1
0,04
0,02
V2 = 0,0313 mM min1
0
0 1 2 3 4 5
Temps (minutes)
4.2 - Phase dacclration dun test coupl
Les donnes sont celles de STORER et CORNISH-BOWDEN (1974) et correspondent au test de
lhexokinase en utilisant la glucose 6-phosphate dshydrognase comme enzyme coupl.
Les points exprimentaux prsentent (pour des duplica de dcours ractionnels chaque
valeur de V2) les concentrations de NADred, le produit de la raction couple, diffrents
temps aprs le dbut de la raction et pour 3 valeurs diffrentes de V2 comme indiqu. Les
trois courbes prsentes nont pas t ajustes sur les donnes mais elles ont t
calcules indpendamment partir des valeurs connues de V2, en accord avec la thorie
prsente dans le texte qui suit.
Dans certains cas, mme si la raction mesure peut tre suivie en direct, il est
parfois souhaitable de coupler la raction une seconde raction. Par exemple, si
un des produits de la premire raction est un puissant inhibiteur, ou si une raction
rversible est tudie dans le sens le moins favorable, de sorte que lquilibre est
atteint aprs quune faible partie du substrat ait ragit, la mesure prcise de la
vitesse initiale peut savrer difficile. Des problmes de ce genre peuvent tre
rsolus en couplant la raction une raction irrversible qui limine le produit
inhibiteur ou dplace lquilibre. Dans ces cas, les contraintes nonces
prcdemment sappliquent, mais en utilisant une dfinition plus stricte de ltat

stationnaire. A ltat stationnaire, la valeur de [ B ] dans le schma considr ci-
dessus est obtenue en fixant v1 = v2 et en rsolvant lquation [4.4] pour [ B ] . Cette
approche donne [ B ] = (Km2 v1)/(V2 v1) et permet de dterminer simplement
quelle doit tre la valeur de V2 pour que la valeur de [ B ] ltat stationnaire ne
soit pas suffisamment leve pour crer des problmes.
Quelquefois, il est ncessaire de coupler une raction avec deux ou plusieurs
enzymes. Par exemple, la mesure couple mentionne ci-dessus pour lhexokinase
ne pourrait pas servir pour ltude de linhibition de lhexokinase par le glucose
6-phosphate parce que le systme nlimine pas uniquement le glucose 6-phosphate
gnr par la raction, mais aussi celui ajout par lexprimentateur. Dans ce cas, il
est ncessaire de coupler la production dADP loxydation du NADred en utilisant
deux enzymes, la pyruvate kinase et la lactate dshydrognase :
ADP + Phosphonolpyruvate Pyruvate + ATP [4.7]
Pyruvate + NADred Lactate + NADox [4.8]
Une analyse rigoureuse des systmes coupls impliquant deux ou plusieurs
enzymes est difficile mais, qualitativement, ils ressemblent au cas simple que nous
venons de considrer : il est ncessaire de sassurer que lactivit des enzymes
couples est suffisamment leve pour que la vitesse mesure atteigne 99% de la
vitesse ncessaire pendant la priode durant laquelle la vitesse reste effectivement
constante. Ceci peut tre facilement vrifi par lexprience : si les concentrations
des systmes coupls sont suffisamment leves, il ne devrait y avoir aucun effet
sur la vitesse mesure quand ces concentrations sont doubles, et la vitesse
observe devrait tre proportionnelle la concentration de lenzyme tudi sur la
totalit de la gamme utilise. Comme la discut EASTERBY (1981), les temps
ncessaires pour que deux ou plusieurs enzymes coupls atteignent leur tat
stationnaire, sadditionnent et il est ainsi possible destimer raisonnablement le
temps total ncessaire pour ltablissement dun tat stationnaire global.
Dans tous les cas, il existe des raisons autres que celle du cot financier pour ne
pas dpasser la concentration denzyme coupl strictement ncessaire pour raliser
une mesure efficace. Sauf si lenzyme coupl a t purifi de manire aussi
extensive que lenzyme tudi, il y a toujours le risque que la prparation denzyme
coupl contienne des impurets qui pourraient perturber la mesure, et mme si
lenzyme est pur, il peut avoir des activits parasites quil est souhaitable de
minimiser. Par exemple, la glucose 6-phosphate dshydrognase catalyse la
raction prsente dans lquation [4.2], mais possde aussi une faible activit vis-
-vis du glucose. Des dangers potentiels du mme type sont possibles avec tous les
systmes coupls puisquun enzyme choisi de manire agir sur un substrat peut
toujours avoir la capacit de ragir avec le produit.
4.2. DTECTION DE LINACTIVATION DUN ENZYME
De nombreux enzymes sont plus stables fortes concentrations qu faibles

concentrations, de sorte quil est courant quun enzyme perde rapidement son
activit lorsquil est dilu partir dune solution stock. Ceci peut videmment
conduire des erreurs dans lestimation du niveau gnral dactivit, mais de
manire moins vidente, cela peut aussi conduire de mauvaises apprciations du
type de comportement de lenzyme. Il est courant quun complexe enzyme-substrat
soit plus stable que lenzyme libre, et en consquence les enzymes perdent souvent
plus lentement leur activit en prsence de fortes concentrations de substrat. Si un
tel comportement nest pas identifi, il peut tre confondu avec un effet coopratif
(chapitre 9), puisquil se caractrise par des dviations de la vitesse initiale par
rapport aux cintiques de MICHAELIS et MENTEN. Mme si leffet nest pas aussi
srieux, lutilisation de conditions qui minimisent linactivation de lenzyme sont
susceptibles de donner des rsultats plus reproductibles et dans de nombreux cas, il
est utile de savoir si la diminution dactivit observe est entirement ou
partiellement provoque par une perte dactivit enzymatique (plutt que par la
disparition du substrat ou par une inhibition par le produit). SELWYN (1965) a
dcrit un test simple permettant dviter ce problme.
Il a montr quaussi longtemps que la vitesse d [ P ] / dt reste proportionnelle la
concentration initiale denzyme [ E ]0 , cette vitesse peut tre exprime comme le
produit de la constante [ E ]0 et dune fonction dpendante des concentrations
instantanes de substrat, de produit, dinhibiteur et de toute autre espce (autre que
lenzyme) qui peut tre prsente dans le mlange. Ces concentrations peuvent tre
calcules partir de la stchiomtrie de la raction et de la concentration de [ P ]
nimporte quel temps. Ainsi lquation de vitesse peut tre crite sous une forme
simple :
d[ P ]
= [ E ]0 f ([ P ]) [4.9]
dt
o f est une fonction qui peut en principe tre drive partir de lquation de
vitesse. Le fait que f soit difficile driver ou que son expression soit complique
na pas dimportance, parce que la connaissance de la forme exacte de la fonction
nest pas ncessaire. Il est seulement ncessaire de savoir quelle est indpendante
de [ E ]0 et de t, et donc que la forme intgre de lquation [4.9] doit tre
[ E ]0 t = F ([ P ]) [4.10]
o F est une autre fonction. Limportance pratique de cette quation est quelle
montre que la valeur de [ E ]0 t , aprs quune quantit donne de produit se soit
forme, est indpendante de [ E ]0 . En consquence, si des courbes davancement
de raction sont mesures pour diverses valeurs de [ E ]0 mais en maintenant
identique le reste des conditions, les graphiques de [ P ] en fonction de [ E ]0 t
devraient tre superposables quelle que soit la valeur de [ E ]0 . Sils ne le sont pas,
lhypothse initiale selon laquelle la vitesse doit tre proportionnelle la concen-
tration initiale denzyme durant toute la raction, est incorrecte. La figure 4.3
montre deux exemples de ces graphiques, un dans lequel les rsultats sont ceux
attendus pour un test satisfaisant, lautre dans lequel les rsultats ne le sont pas.
5,6 g mL1
Avancement de la raction (%)
Glutamyl-ARN (pmol)
4 0,4 : 1 : 2 100
2,8 g mL1
2 50
a - Tous les points b - Les points se

1 se situent sur rpartissent sur deux
une seule courbe courbes distinctes
0 0
0 1 2 3 0 2 4 6 8 10
[E]0 t (units arbitraires) [E]0 t (units arbitraires)
4.3 - Test dinactivation de SELWYN
Dans une raction pour laquelle il ny a pas dinactivation apprciable de lenzyme pendant
la priode dobservation, des graphiques de ltendue de la raction en fonction de [E]0t
devraient tre superposables, comme dans le graphique (a), qui prsente les donnes de
MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) pour linvertase trois concentrations diffrentes denzyme
dans un rapport 0,4 : 1 : 2 comme indiqu. Si lenzyme sinactive au cours de la raction ou
si le rapport nest pas strictement proportionnel [E]0, les graphiques ne sont pas
superposables, comme dans le graphique (b), qui prsente les donnes de DEUTSCHER
(1967) pour la glutamyl-ARN synthtase des concentration de 5,6 et 2,8 mg mL1.
La raison la plus simple pour laquelle le test de SELWYN peut tre ngatif comme
dans la figure 4.3b, est que [ E ]0 varie au cours de la raction en raison dune
perte dactivit de lenzyme. SELWYN (1965) a cependant rpertori dautres
causes possibles, qui expliquent que le test est insatisfaisant ou quil est compliqu
de manire telle quune tude supplmentaire est ncessaire avant que son
utilisation routinire ne soit possible.
Le test de SELWYN nest pas couramment utilis. Pendant les annes 1970 et 1980,
cela pouvait tre justifi par le dveloppement des moyens et des conditions dans
lesquelles les enzymes devaient tre utiliss pour viter leur inactivation.
Aujourdhui, le dveloppement des techniques de biologie molculaire permet de
produire des protines recombinantes modifies, qui, dans certains cas, sont moins
stables que la protine originale. Cela cre un rel besoin de tester linactivation de
ces enzymes pendant la raction, afin dviter de comparer les cintiques de
raction catalyse par un enzyme stable avec les cintiques de raction catalyse
par des variants moins stables susceptibles dintroduire certains artfacts.
Le principe de base sur lequel repose le test de SELWYN tait dj bien connu aux
premiers temps de lenzymologie : les donnes prsentes dans la figure 4.3a sont
celles de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et des donnes similaires sont fournies
par HUDSON (1908) ; il est clair, de plus, selon la discussion donne par HALDANE
(1930) que de tels tests taient appliqus lpoque de nombreux enzymes. Ds
1890, OSULLIVAN et TOMPSON ont comment que le temps ncessaire pour
atteindre un pourcentage donn dinversion (cest--dire dhydrolyse du sucrose)
est inversement proportionnel la quantit prsente de matriel invers ; en
dautres termes, le temps est inversement proportionnel la quantit dagent
inversant. En dpit de cela, le test a t largement oubli jusqu ce que SELWYN
(1965) adapte le traitement donn par MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et discute
les diverses raisons possibles de son chec. On peut se demander combien de
techniques aussi utiles restent caches dans la littrature ancienne.
4.3. CHOIX DES CONDITIONS EXPRIMENTALES
4.3.1. Choix des concentrations de substrat
Un expos complet de la mise au point dexpriences de cintique enzymatique

serait trop long pour tre trait ici, et donc dans ce paragraphe nous prsenterons
uniquement un guide bref et simplifi. En gnral, les conditions optimales pour
tester lactivit dun enzyme, cest--dire pour dterminer la quantit dactivit
catalytique dans un chantillon, ne correspondent pas aux conditions idales
permettant de dterminer les paramtres cintiques. La raison est que dans un test
dactivit enzymatique, nous cherchons obtenir des conditions o la vitesse
mesure dpend uniquement de la concentration denzyme, de sorte que de faibles
variations des autres paramtres aient peu deffet ; par contre dans une tude des
proprits cintiques dun enzyme, il est ncessaire de dterminer comment celui-
ci rpond aux changements de conditions. Il est essentiel dans ce dernier cas de
travailler sur une large gamme de concentrations de substrat pour laquelle la vitesse
varie de manire apprciable. En pratique, pour un enzyme qui obit lquation
de MICHAELIS et MENTEN, cela signifie que les valeurs de [ A ] stendent bien en
dessous et bien au dessus de Km.
Si le systme tudi obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, il est seulement
ncessaire de dterminer quelle gamme de [ A ] est suffisante pour dfinir K m et V
prcisment. Il est facile de dcider comment on peut dfinir V prcisment, en
rappelant que v tend vers V lorsque [ A ] augmente ( 3.3) ; clairement, il est utile
de raliser des mesures de v des concentrations de [ A ] aussi leves que le cot,
la solubilit ou toute autre contrainte (comme une absorbance leve dans le cas
dune mesure utilisant un spectromtre) le permettent. En principe, plus la
concentration [ A ] utilise sera grande et meilleure sera la mesure, mais en ralit
il existe deux raisons pour lesquelles ceci nest pas toujours vrai. Premirement, le
respect de lquation de MICHAELIS et MENTEN peut ne pas tre absolu : beaucoup
denzymes se caractrisent par une inhibition par le substrat pour des valeurs
leves de [ A ] , et en consquence les valeurs de v mesures des concentrations
leves peuvent ne pas tre en accord avec les valeurs de Km et de V qui dfinissent
les cintiques des valeurs faibles et modres de [ A ] . Deuximement, mme si
lquation de MICHAELIS et MENTEN est prcisment respecte, lavantage
dinclure des valeurs de [ A ] suprieures 10 Km est faible et peut tre invalid par
le cot additionnel que ces mesures reprsentent. De plus, si le substrat est un ion,
il peut tre difficile dviter une variation de la force ionique lorsque des
concentrations excessives sont utilises.
Une limite sur la concentration maximale de substrat qui peut tre utilise est
souvent impose par labsorbance spcifique du substrat ou du produit utilis pour
la mesure dactivit. Par exemple, de nombreuses mesures dactivit enzymatique
sont bases sur labsorbance du NADred 340 nm, qui est denviron 0,9 dans une
cuve de 1 cm pour une solution de 0,15 mM. Ceci suggre que des mesures des
concentrations suprieures soient difficiles, bien que lutilisation dune cuve de
0,2 cm permette dtendre la gamme de concentration de substrat dun facteur 5.
Curieusement, les cuves de 1 cm de trajet optique sont devenues tellement
familires que certains utilisateurs semblent ignorer cette possibilit dutiliser
dautres longueurs de trajet optique. A loppos, des cuves de 5 ou 10 cm peuvent
tre utiles pour suivre des solutions qui absorbent trs peu, bien que celles-ci
puissent tre plus difficiles utiliser si leur utilisation ncessite la modification du
spectrophotomtre.
De la mme manire que la vitesse haute concentration de substrat est dtermine
par V, la vitesse faible concentration est dtermine par V/K m (voir 3.3). Ds
lors, pour que V/K m soit correctement dtermin, il est ncessaire de raliser des
mesures de v des valeurs de [ A ] infrieures K m . Il nest pas ncessaire de
chercher utiliser des valeurs de [ A ] aussi petites que possible, puisque la
condition v = 0 impose pour [ A ] = 0 fournit un point fixe par lequel le graphique
de v en fonction de [ A ] doit obligatoirement passer. Ds lors, il y a peu dintrt
mesurer des valeurs de v des valeurs de [ A ] infrieures 0,2 K m. Sil existe un
intrt quelconque, il dpend de la manire dont les erreurs sur v sont distribues :
si v a une dviation standard constante, une valeur optimale pour le bas de la
gamme des valeurs de [ A ] est environ 0,8 K m (la valeur exacte dpendant de la
valeur suprieure de la gamme), mais si v a un coefficient constant de variation, la
valeur optimale pour le bas de la gamme est zro (ENDRENYI, 1981). La valeur de
0,2 Km est un bon compromis, gnralement satisfaisant, entre ces deux situations.
La dtermination de Km ncessite des valeurs prcises aussi bien de V que de V/Km ;
donc la gamme de [ A ] devrait stendre de 0,2 K m jusqu 10 K m ou jusqu la
concentration de A la plus leve possible.
Il est difficile de ne pas souligner que les remarques faites ci-dessus sont inhrentes
au respect du mcanisme de MICHAELIS et MENTEN, ou du moins que lon ne se
soucie pas du respect de ce modle en dehors de la gamme de lexprience. Si nous
nous intressons une raction dans des conditions physiologiques, il ny a pas de
raisons de nous soucier des dviations par rapport un comportement simple qui
peuvent survenir dans des conditions non-physiologiques ; nanmoins, si nous nous
intressons au mcanisme cintique de la raction, il est souhaitable dtendre
autant que possible la gamme de conditions utilises, puisque des dviations dans
le comportement de lenzyme dans les conditions extrmes peuvent tre utiles pour
ltablissement du mcanisme. HILL, WAIGHT et BARDSLEY (1977) ont discut le
fait que trs peu denzymes (si du moins ils en existent certains) obissent
rellement lquation de MICHAELIS et MENTEN. Ils pensent que le nombre limit
de conditions exprimentales, associ au manque de volont de rendre compte de
lobservation de faibles dviations vis--vis du comportement attendu, ont conduit
une supposition injustifie que les cintiques enzymatiques obissaient de
manire presque universelle lquation de MICHAELIS et MENTEN. Pratiquement,
tous les exemples standards et traditionnels de cintiques simples se sont rvls,
selon eux, plus complexes lorsque des tudes soigneuses ont t ralises.
Lquation de MICHAELIS et MENTEN reste sans nul doute utile en premire
approximation dans les tudes cintiques, mme si quelques fois des mesures
prcises conduisent son rejet. Cependant, il est toujours conseill de vrifier
labsence des dviations les plus communes. La vitesse initiale est-elle nulle en
absence de substrat (et denzyme) ? Si ce nest pas le cas, la dviation est-elle
suffisamment petite pour tre explique par les erreurs exprimentales ? Sil y a
une variation rsiduelle du signal en absence de substrat ou denzyme, est-il
possible de lliminer par purification ? La vitesse tend-elle vers zro pour des
concentrations de substrat largement diffrentes de zro ? Dans ce cas, il sera utile
de vrifier la cooprativit de la raction (voir chapitre 9). Existe-t-il une indication
de linhibition par le substrat ou par le produit, par exemple, une diminution de v
lorsque [ A ] augmente ? Mme si la vitesse ne diminue pas, une augmentation de
v avec une concentration [ A ] plus faible que celle prvue par lquation de
MICHAELIS et MENTEN peut indiquer une inhibition par le substrat.
4.3.2. Choix du pH, de la temprature et des autres conditions
Mme sil nest pas dans votre intention dtudier les dpendances de la raction
enzymatique au pH ou la temprature, il est ncessaire de bien choisir les
conditions dans lesquelles la raction est tudie. Pour de nombreuses applications,
il est appropri de travailler dans des conditions proches des conditions
physiologiques par exemple pH 7,5 - 37C et une force ionique de 0,15 M pour la
plupart des enzymes produites par des mammifres mais il existe aussi de
nombreuses bonnes raisons dutiliser dautres conditions dans ltude des
mcanismes catalytiques. De nombreuses enzymes se dnaturent rapidement

37C et peuvent tre plus stables 25C (bien quil y ait des exceptions, de sorte
que cette proprit ne doit pas tre considre comme une rgle universelle). Il est
galement recommand de choisir un p H auquel la vitesse de la raction soit
relativement insensible de faibles variations. Ceci se traduit parfois par la
recommandation de travailler au pH optimum de lenzyme, mais nous verrons au
chapitre 8, que cette recommandation peut tre sans fondement sauf si la valeur de
Km est indpendante du pH. Si K m varie avec le pH, mme si le mcanisme obit
lquation de MICHAELIS et MENTEN, la valeur maximale de V/Km napparatra pas
au mme pH que la valeur maximale de V ; en consquence, le pH optimum varie
avec la concentration de substrat.
Dans ltude des ractions plusieurs substrats, la mise au point des conditions
exprimentales est encore plus complexe que celle ncessaire pour les ractions
un seul substrat, mais les principes restent les mmes. Chaque concentration de
substrat doit varier sur une gamme suffisamment large pour que son effet soit
manifeste sur la vitesse de la raction. Si la raction obit lquation de
MICHAELIS et MENTEN lorsque la concentration dun des substrats varie alors que
celle de tous les autres est maintenue constante, les valeurs mesures des
paramtres de MICHAELIS et MENTEN sont des valeurs apparentes et sont
susceptibles de changer lorsque les conditions changent. Pour obtenir un maximum
dinformation, il est ncessaire de choisir une gamme de concentrations de substrat
en relation avec le Km apparent et non avec la valeur limite de Km obtenue lorsque
les autres substrats sont des concentrations proches de la saturation, ce qui peut
tre sans intrt. Nous reviendrons sur ce point au chapitre 6 aprs avoir introduit
les quations de base pour les ractions deux substrats. Des conditions similaires
sappliquent aux tudes des inhibitions et seront discutes au chapitre 5.
4.3.3. Rplication des mesures
Dans une tude cintique, il nest pas rare que le meilleur modle qui puisse tre
obtenu ne reprsente pas parfaitement chaque observation. La question se pose
alors de savoir si les diffrences observes peuvent tre attribues aux erreurs
exprimentales ou si elles traduisent la ncessit de recourir un modle plus
complexe. Pour rpondre cette question, il est ncessaire destimer la grandeur
des erreurs commises sur les mesures exprimentales. La manire la plus simple
destimer la valeur des erreurs consiste rpliquer les observations. Si les
observations rpliques sont plus en accord les unes avec les autres quavec la
courbe ajuste, cela peut indiquer que la courbe ajuste est rejeter et quil faut
introduire plus de termes dans lquation. Si, au contraire, les points exprimentaux
montrent autant de variation entre eux quavec la courbe ajuste, lquation utilise
pour lajustement peut tre accepte jusqu ce que des mesures plus prcises
soient obtenues.
La thorie sur laquelle repose cette approche dpend du fait que cest uniquement
en rptant une exprience que nous pouvons dterminer si les donnes expri-
mentales sont en accord avec la courbe ajuste en l'absence derreurs alatoires.
Ds lors, une telle pratique mesure uniquement les erreurs alatoires, qui sont
galement appeles les erreurs pures pour, dans ce contexte, les distinguer du
mauvais ajustement qui peut rsulter de lutilisation dune quation inadapte dans
la procdure dajustement paramtrique. Nanmoins, le dsaccord entre les
observations et la courbe ajuste peut rsulter soit dune erreur de mesure, soit de
linadquation de la thorie et plus couramment encore dune combinaison des
deux ; cette procdure ne mesure donc pas des erreurs pures.
Lutilisation de rpliquas des mesures prsente galement certains inconvnients.
Pour donner un rsultat significatif, la diffrence entre deux rpliquas doit tre
rellement reprsentative de lerreur alatoire dans lensemble de lexprience.
Ceci sera vrai uniquement si les mesures rptes sont ralises exactement de la
mme manire que toutes les autres mesures et non de manire particulire. La
difficult peut tre mieux apprcie en examinant les trois cas prsents dans la
figure 4.4.
a - Dispersion alatoire b - Replicas trop proches c - Profil similaire

les uns des autres dans chaque groupe
y y y
x x x
4.4 - Utilisation dobservations rpliques
Quand des observations sont proprement reproduites, la dispersion des points autour de
la courbe ajuste devrait tre irrgulire, comme dans lexemple (a). Une distribution
rgulire, comme dans les exemples (b) et (c), suggre que lexprience na pas t
correctement ralise, comme nous en discutons dans le texte.
Dans la figure 4.4a, les points sont distribus dans chacun des rpliquas de la mme
manire que les points sont distribus autour de la droite ajuste ; cest la situation
qui est attendue si lajustement est correct et si les rpliquas ont t correctement
mesurs. Dans la figure 4.4b, la distribution des rpliquas apparat plus troite que
la distribution des mesures autour de la droite, mme si la distribution des points de
part et dautre de cette dernire semble plus alatoire que systmatique. Il existe
diffrentes causes possibles cette situation insatisfaisante : la plus courante est
certainement la mesure successive des diffrents rpliquas dun mme point, de
sorte que le temps moyen entre deux de ces mesures est court par rapport au temps
moyen de lexprience. Si les mesures sont faites de cette manire, toute variation
lente des conditions au cours de lexprience peut produire des erreurs qui ne sont
pas rpercutes de manire approprie dans les rpliquas, par exemple une
variation de linstrumentation, une dtrioration des solutions stocks, une

augmentation de la temprature ambiante ou la fatigue de lexprimentateur. La
figure 4.4c illustre le problme contraire. Dans ce cas, les points sont espacs
rgulirement de manire suspicieuse, avec une distribution plus large que la
distribution autour de la droite ajuste. Ceci suggre que les rptitions surestiment
lerreur alatoire relle, peut tre parce que la figure prsente les donnes
provenant de trois expriences ralises des moments diffrents et avec des
chantillons diffrents.
La question de savoir combien de fois une mesure doit tre rpte, na pas une seule et
unique rponse. Dans chaque cas individuel, la rponse dpend de la difficult
raliser la mesure, du temps pendant lequel les solutions denzyme et de substrat
peuvent tre conserves, de la grandeur des erreurs exprimentales et de la complexit
de lquation utilise pour lajustement. Le premier point essentiel est dinclure
suffisamment de concentrations de substrat (dinhibiteur) pour caractriser
correctement la forme de la courbe. Pour un enzyme qui obit lquation de
MICHAELIS et MENTEN, il est possible de nutiliser que 5 concentrations de substrat
condition quelles soient adquatement espaces entre 0,5 Km et 5 Km. Nanmoins avec
un enzyme deux substrats, qui suit un modle cintique simple, il est ncessaire
denregistrer un minimum de 25 combinaisons diffrentes de concentrations. Pour les
enzymes dont le comportement dvie de celui prvu par un modle simple, le nombre
de mesure doit encore tre augment.
Ces chiffres sont bass sur lhypothse que lanalyse complte des donnes
fournira des graphiques aussi bien que des analyses statistiques par un ordinateur.
De le cas de ces dernires, il nest pas ncessaire dorganiser les concentrations
dans une grille, puisque la validit de lanalyse nest pas affecte mme si le calcul
dune droite appartenant une famille de droites est bas sur un seul point ; ainsi
une exprience deux substrats pourrait en principe fournir des rsultats
satisfaisants en utilisant seulement huit combinaisons diffrentes de concentrations.
Le point important est de concentrer les observations dans les rgions qui
fournissent la meilleure information permettant de valider le modle propos.
Nanmoins, lil humain peut facilement reprer sur un graphique un comporte-
ment inattendu qui serait nglig par le meilleur des logiciels, et pour cette raison,
il nest pas raisonnable de se reposer entirement sur lanalyse faite par
lordinateur. Ces impratifs placent une contrainte sur la mise au point
dexprience puisque, pour obtenir un graphique satisfaisant, il est ncessaire de
disposer dun certain nombre de points pour tracer chaque droite.
Ce nest que lorsque le nombre de combinaisons diffrentes de concentrations
ncessaires pour lexprience a t dtermin, que le nombre de rptitions
raliser peut tre dcid. Supposons que 25 combinaisons de concentrations soient
ncessaires et quil soit possible de mesurer jusqu 60 cintiques sur le temps
imparti et en fonction de la stabilit de la solution denzyme. Dans un tel cas, il
serait appropri de raliser en triple une dizaine de mesures (tales sur toute
lexprience et non localises dans le temps) et de doubler le reste. Si, dun autre
ct, il nest pas possible de raliser plus de 30 mesures, il faudra rduire le
nombre de rptitions. Il est stupide de dfendre une rgle stipulant que chaque
mesure doit tre effectue 3 fois, non seulement parce que cela simplifie le
problme, mais aussi parce que cela peut conduire des expriences dans
lesquelles trop peu de conditions sont tudies pour obtenir linformation attendue.
4.4. TRAITEMENT DES QUILIBRES IONIQUES
Dans beaucoup de ractions biochimiques, le substrat nest pas un compos bien

caractris dont la concentration est directement mesurable, mais est un ion en
quilibre avec dautres ions ayant leurs propres interactions avec les enzymes
catalysant les ractions. Le plus notable de ces ions est le MgATP2, qui est le vrai
substrat de la majorit des enzymes regroups dans la catgorie des enzymes
dpendantes de lATP. Il est impossible de prparer une solution de MgATP2,
parce que toute solution contenant du MgATP2 contient aussi de nombreux autres
ions. Par exemple, un mlange quimolaire dATP et de MgCl2 pH 7 contient des
proportions apprciables de MgATP2, dATP4, de HATP3 , de Mg2+ et de Cl,
ainsi que des traces de MgHATP, de Mg2ATP et de MgCl+. De plus, leurs
proportions varient avec les concentrations totales dATP et de MgCl2, avec le pH,
la force ionique et les concentrations dautres espces molculaires ventuellement
prsentes (comme par exemple des composs de tampons).
Manifestement, si nous tudions leffet de la concentration de MgATP2 , par
exemple, sur un enzyme, nous devons nous assurer que les effets sont dus la
variation de la concentration de MgATP2 et non celles des concentrations de
Mg2+ ou dATP4 qui l'accompagnent. Il est donc ncessaire de disposer dune
mthode permettant de calculer la composition dun mlange dions et il est
souhaitable de disposer dun moyen permettant de modifier la concentration dune
des espces sans modifier substantiellement la concentration des autres espces.
Les constantes de dissociation de nombreux ions dintrt biochimique ont t
dtermines. Il est donc facile de dterminer la concentration des complexes
condition de connatre la concentration des divers composants sous forme libre.
Malheureusement, on est gnralement confront au problme inverse qui consiste
dterminer la concentration des formes libres en connaissant les concentrations
totales des diffrents composs. Par exemple, il peut tre ncessaire, connaissant
les concentrations totales dATP et de MgCl2, le pH et toutes les constantes dqui-
libre, de calculer la concentration de MgATP2. Une manire simple et efficace de
procder est la suivante :
1. Nous supposons initialement quaucun complexe nest form et que toutes les
espces ioniques sont compltement dissocies. Par exemple, nous supposons
que le mlange de 1 mM ATP, 2 mM MgCl2 et de 100 mM KCl contienne

1 mM ATP4, 2 mM Mg2+, 100 mM K+ et 104 mM Cl.
2. Nous utilisons ces concentrations et les constantes de dissociation pour calculer
les concentrations de tous les complexes qui contiennent du Mg2+. Quand ces
concentrations seront additionnes, la concentration totale en Mg2+ excdera
(trs certainement de manire importante dans le premier cycle de calcul) la
concentration totale relle de cet ion.
3. Nous corrigeons la concentration de Mg2+ libre en la multipliant par la
concentration relle en Mg2+ totale et en divisant par la concentration totale en
Mg2+ calcule.
4. Nous rptons cette opration pour chacun des composants du mlange, cest--
dire pour ATP4, K+ et Cl dans cet exemple. En principe la concentration de H+
peut tre traite de la mme manire mais dans la pratique, la concentration de
H+ libre est contrle et mesure directement de telle sorte que la concentration
de H+ ne devrait pas tre corrige durant les calculs mais maintenue constante
sa valeur relle.
5. Nous rptons lensemble du cycle, de ltape 2 ltape 4, jusqu ce que les
rsultats soient consistants avec eux-mmes, cest--dire jusqu ce que les
concentrations ne varient plus dun cycle lautre.
Cette procdure est celle, lgrement modifie, qui a t propose par PERRIN
(1965) et par PERRIN et SAYCE (1967). Bien que le nombre requis de cycles soit
certainement trop important pour permettre un calcul manuel, la mthode peut
facilement tre implmente dans un programme dordinateur (STORER et
CORNISH-BOWDEN, 1976), et peut tre utilise facilement et efficacement pour les
problmes couramment rencontrs dans les tudes de cintique enzymatique.
Lexprience de lutilisation dun tel programme a permis de mettre au point une
manire de varier la concentration de MgATP2 en conservant le contrle des
variations de la concentration des autres ions. Deux approches sont couramment
utilises, dont lune donne dexcellents rsultats et lautre de mauvais rsultats.
La bonne mthode consiste maintenir la concentration totale de MgCl2
constamment en excs par rapport la concentration totale dATP. Les meilleurs
rsultats sont obtenus avec une concentration en excs de 5 mM MgCl2, mais si
lenzyme est inhibe par le Mg2+ libre ou sil existe dautres raisons pour rduire
la concentration de Mg2+ libre, lexcs peut tre rduit jusqu 1 mM sans perte
defficacit. Si lexcs est suprieur 10 mM, des problmes peuvent apparatre
cause de la prsence dune concentration significative de Mg2ATP. Avec cette
mthode, la concentration dATP peut varier sur une large gamme (allant de 1 M
jusqu 0,1 M) avec une proportion importante et presque constante de lATP
existant sous la forme de MgATP2 et une concentration presque constante de Mg2+
libre. Donc les effets dus la variation de la concentration de MgATP2 peuvent
tre clairement spars de ceux dus la variation de Mg2+ libre.
La mauvaise mthode, qui est malheureusement tout aussi couramment

rencontre dans la littrature, consiste faire varier les concentrations totales dATP
et de MgCl2 en maintenant leur rapport constant. Si le rapport est 1 : 1 ou nimporte
quelle autre valeur, cette mthode conduit de grandes variations dans la
proportion dATP prsente dans lune ou lautre forme et ne peut pas tre
recommande. Bien que moins critiquable, mais nanmoins peu recommandable, il
existe galement une mthode qui consiste garder constante la concentration
totale de MgCl2 une valeur excdant de 2 5 mM la plus haute concentration
dATP. Bien que cette mthode assure que lATP existe largement sous la forme de
MgATP2, elle peut conduire de grandes variations dans les concentrations de
Mg2+ libre et de Mg2ATP.
Bien que les conclusions soulignes dans les paragraphes prcdents dpendent
dune certaine manire des valeurs numriques des constantes dquilibre pour les
complexes de Mg2+, dATP4 et de H+, les principes sont gnraux. Comme rgle
grossire, un compos A dun complexe binaire AB existe largement sous la forme
complexe si B est maintenu en excs par rapport A dune quantit correspondant
environ 100 fois la valeur de la constante de dissociation.
Dans cette discussion, nous avons simplifi le problme en ignorant le fait que les
constantes ioniques dfinissent des rapports dactivits plutt que de
concentrations. En pratique, pour viter les complications inhrentes lutilisation
des coefficients dactivit, il est recommand de travailler force ionique
constante. Une valeur de lordre de 0,15 M est approprie, la fois parce quelle
est proche de la force ionique de nombreuses cellules vivantes et parce que de
nombreux quilibres dintrt biochimique sont insensibles aux variations de la
force ionique dans cette gamme de valeur.
PROBLMES
4.1 - Lhexokinase A de cerveau de mammifre est fortement inhibe par le

glucose 6-phosphate des concentrations suprieures 0,1 mM. Quelle
devrait tre la vitesse limite V2 de la glucose 6-phosphate dshydrognase
(Km = 0,11 mM pour le glucose 6-phosphate) si cet enzyme tait utilis
comme enzyme coupl dans un test pour lequel des vitesses v1 nexc-
dant pas 0,1 mM min1 devraient tre mesures et si la concentration de
glucose 6-phosphate nexcdait jamais 0,1 mM ?
4.2 - Maintenir une concentration totale de MgCl2 de 5 mM en excs de la
concentration totale dATP assure que les effets dus au MgATP2 et au
Mg2+ peuvent tre clairement spars, parce que cette procdure permet
une variation de la concentration de MgATP2 qui saccompagne de
faibles variations concomitantes de la concentration de Mg2+ libre.
Cependant, cette approche ne permet pas une distinction sans

quivoque entre les effets de MgATP2 et ceux de ATP4, parce que leurs
concentrations respectives sont maintenues dans un rapport constant.
Suggrer une approche qui permettrait de faire varier la concentration
de MgATP2 avec de faibles variations de la concentration dATP4.
4.3 - Les valeurs suivantes des concentrations de produit, [ PA ] et [ PB ] (en
M) et de temps t (en min) se rapportent deux tests raliss avec le
mme enzyme, avec des mlanges ractionnels de composition
identique, except que deux fois plus denzyme a t ajout dans
l'exprience qui fournit les valeur de [ PA ] que dans celle qui fournit les
valeurs [ PB ] . Suggrer une cause possible au comportement observ.
t [ PA ] [ PB ]
0 0,0 0,0
2 10,5 4,3
4 18,0 8,3
6 23,7 11,7
8 27,9 14,5
10 31,3 16,8
12 34,0 19,0
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES
5.1. INHIBITION RVERSIBLE ET IRRVERSIBLE
5.1.1. Les poisons de la raction catalytique
Les substances qui, lorsquelles sont prsentes dans le mlange ractionnel, ralen-
tissent une raction catalyse par un enzyme sont appeles des inhibiteurs. Linhi-
bition peut intervenir de diverses manires et il existe donc divers types dinhibiteurs.
Notamment, deux grands types dinhibition sont distingus, les inhibitions rver-
sibles qui peuvent tre leves en liminant linhibiteur du milieu ractionnel et les
inhibitions irrversibles qui impliquent gnralement la modification covalente dun
groupe essentiel de lenzyme et qui ne peuvent tre leves par dialyse ou dilution.
Dans ce chapitre, nous discutons dabord brivement des inhibiteurs irrversibles ou
poisons catalytiques. Ceux-ci sont des substances qui, en se combinant avec len-
zyme, liminent compltement son activit. De nombreux enzymes sont empoi-
sonns par des traces de mtaux lourds, et pour cette raison, les tudes cintiques
sont couramment ralises en prsence dagents complexant comme lEDTA. Ceci
est particulirement important lors de la purification des enzymes : dans lextrait
brut, la concentration totale de protine est leve et les nombreuses protines
contaminantes squestrent la majorit des ions mtalliques qui sont prsents, mais
plus une prparation denzyme devient pure et moins ce dernier est protg par les
autres protines et donc plus il devient important dajouter des agents alternatifs de
complexation. Dans certains cas, ces inhibiteurs irrversibles peuvent aussi tre
utiliss de faon positive. Par exemple, lempoisonnement par les composs de
mercure (II) a souvent t utilis pour mettre en vidence limplication de groupes
sulfhydryles dans le site catalytique des enzymes.
5.1.2. Analyse de la vitesse dinactivation
Les mesures prcises de la vitesse laquelle la perte dactivit seffectue dans un

processus dinhibition irrversible, fournissent une information utile qui est plus
simple, et donc plus facile interprter, que celle fournie par les expriences
conventionnelles de cintique. La thorie communment applique dans ce type
dtude est celle dcrite par KITZ et WILSON (1962), qui sintressaient leffet de
divers composs sur lactivit de lactylcholinestrase. Ces auteurs ont fait

essentiellement les mmes hypothses que MICHAELIS et MENTEN (1913) pour le
processus catalytique, cest--dire quils ont suppos que linactivation de
lenzyme E par linhibiteur I se droule par lintermdiaire dun complexe EI qui
est en quilibre avec E et I pendant lensemble de la raction et qui se convertit
irrversiblement en une forme E' inactive :
K1 k2
E + I EI E' [5.1]
[ Eact ] [ x ] [I] [ x]
[ Eact ] reprsente la concentration totale de lenzyme actif, cest--dire incluant E,
EI mais pas E'. Avec ces hypothses, la concentration de EI chaque instant est
([ Eact ] [ x ])[ I ]
donne par et la vitesse dinactivation v est donne par :
Ki
V[ I ]
v = k2 [ x ] = [5.2]
Ki + [ I ]
dans laquelle V = k 2 [ Eact ] est la vitesse limite de linactivation obtenue pour des
concentrations saturantes dinhibiteur. Il faut noter cependant que V nest pas une
constante, puisque [ Eact ] diminue au cours de linhibition. Si linhibiteur est
suffisamment en excs de telle sorte que [ I ] puisse tre considr comme une
constante, la perte dactivit suit une loi de pseudo-premier ordre, et lanalyse par
la mthode dcrite dans le 1.2.7 donnera une constante apparente de premier
k2 [ I ]
ordre kapp = . Comme celle-ci a la forme dune quation de MICHAELIS
( Ki + [ I ])
et MENTEN, on peut utiliser nimporte quelle mthode dcrite dans le chapitre 3
pour estimer les valeurs de k2 et de Ki partir des valeurs de kapp mesures pour
diffrentes concentrations de I ( [ I ] ).
Une extension de la mthode de KITZ et WILSON au cas o le substrat dun enzyme
inhiberait son inactivation irrversible trouve dimportantes applications pour la
mesure de constants relles de dissociation. Cependant, nous reporterons cette
discussion jusquau 5.4.3, cest--dire jusqu ce que les cas principaux dinhi-
bition linaire rversible aient t dcrits.
5.1.3. Types dinhibition rversible
Le reste de ce chapitre est consacr aux inhibiteurs rversibles. Ce sont des

substances qui forment avec lenzyme des complexes dynamiques dont les
proprits catalytiques sont diffrentes de celles de lenzyme libre. Si lenzyme na
aucune activit catalytique lorsquil est compltement satur par linhibiteur,
linhibition peut tre qualifie de complte, mais elle est plus souvent dnomme
inhibition linaire, par rfrence lapparence linaire des graphiques des valeurs
apparentes de Km V et 1 V en fonction de la concentration dinhibiteur. Un cas
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES 141
plus rarement envisag (bien quil ne soit probablement pas aussi rare quil e s t
gnralement suppos) est celui o le complexe enzyme-inhibiteur conserve une
certaine activit catalytique : ce type dinhibition est dnomm inhibition partielle,
puisquune activit rsiduelle persiste quand lenzyme est entirement satur par
linhibiteur, ou il est dnomm inhibition hyperbolique par rfrence la forme des
courbes obtenues lorsque les paramtres apparents de MICHAELIS sont ports en
graphique en fonction de la concentration dinhibiteur.
Les cas dinhibition linaire aussi bien que ceux dinhibition hyperbolique peuvent
tre sous-classs en fonction des paramtres apparents de MICHAELIS qui sont
affects, mais en pratique ces dnominations font ordinairement rfrence aux cas
dinhibition linaire. Le type le plus commun est habituellement appel inhibition
comptitive bien que le terme inhibition spcifique soit plus appropri (parce quil
est neutre dun point de vue mcanique mais est descriptif dun point de vue
algbrique) ; il se caractrise par une diminution du paramtre apparent V Km sans
variation du paramtre apparent V. Parce que linhibition comptitive avait t
dcouverte avant quil nait t reconnu que les paramtres fondamentaux de
lquation de MICHAELIS et MENTEN sont V et V Km , ce type dinhibition est sou-
vent dcrit comme impliquant une augmentation de K m . Comme cela apparatra
plus clairement dans la suite du texte (voir tableau 5.1), la classification des
inhibiteurs est beaucoup plus simple et plus directe si elle est base sur les
paramtres V et V Km .
Les autres types dinhibition sont linhibition anti-comptitive ou inhibition cataly-
tique dans laquelle le paramtre apparent V diminue sans que le paramtre V Km
ne soit modifi, ce qui peut aussi tre exprim en disant que les paramtres appa-
rents V et Km diminuent par un facteur identique et linhibition mixte dans laquelle
les deux paramtres apparents, V et V Km , diminuent. Un dernier type, connu sous
le nom dinhibition non-comptitive pure dans laquelle le paramtre apparent V
diminue sans que K m ne soit modifi, a t considr par le pass comme un type
important dinhibition, mais il a ensuite t reconnu quil correspond simplement
un cas particulier de linhibition mixte. Tous ces types dinhibition sont dcrits plus
en dtails dans ce chapitre.
5.2. INHIBITIONS LINAIRES
5.2.1. Inhibition comptitive (ou inhibition spcifique)
Dans la raction catalyse par la succinate dshydrognase , le succinate est oxyd

en fumarate, comme illustr dans la figure 5.1.
Puisquil sagit dune raction du groupe dimthylne, elle ne peut avoir lieu avec le
malonate, qui ne possde pas de groupe dimthylne. Dun autre ct, le malonate a
une structure trs proche de celle du succinate et il nest ds lors pas surprenant quil
puisse se fixer sur lenzyme, dans le site de fixation du substrat pour former un
complexe abortif, incapable de ragir.
CO2 CO2 Bien que le succinate et le malonate

CO2 aient une structure suffisamment
CH2 HC proche pour se fixer sur le mme site
CH2
CH2 CH de lenzyme, le malonate ne possde
CO2 pas le groupement dimthylne qui
CO2 CO2 lui permettrait de subir la raction
succinate fumarate malonate de dshydrognation.
5.1 - Raction catalyse par la succinate dshydrognase
Cest un exemple dinhibition comptitive, ainsi appele puisque le substrat et

linhibiteur sont en comptition pour le mme site de fixation. De manire gn-
rale, le mcanisme peut tre reprsent par le schma de la figure 5.2, dans lequel
EI reprsente un complexe en cul-de-sac . La seule raction que puisse subir EI
est sa dissociation pour redonner E et I. Selon largument qui sera dvelopp dans
le 6.3.6, la concentration de ce complexe est dfinie partir de la constante
dquilibre, Kic = ([ E ][ I ]) [ EI ] , qui est appele la constante dinhibition, ou
plus explicitement, la constante dinhibition spcifique. Elle est plus simplement
reprsente par le symbole Ki lorsque le caractre comptitif est hypothtique. Il est
cependant important de noter que le schma de la figure 5.2 nest pas le seul qui
puisse reprsenter une inhibition comptitive et que la constante dinhibition est
quivalente une constante dquilibre uniquement parce quelle drive du
mcanisme choisi et non parce quil sagit dune inhibition comptitive : il est
parfaitement possible davoir une inhibition comptitive sans que la constante
dinhibition ne soit une constante dquilibre. Dans de nombreux types dinhibition
plus complexe, incluant la majorit des cas dinhibition par le produit, la constante
dinhibition nest pas une constante dqui-
EI
libre relle parce que le complexe enzyme-
inhibiteur ne constitue pas un cul-de-sac .
Kic
A+E EA E+P
+
I 5.2 - Mcanisme dune inhibition comptitive
Lquation qui dfinit une inhibition linaire comptitive et qui sapplique non seu-
lement au mcanisme de la figure 5.2 mais tout autre mcanisme dinhibition
comptitive, est celle de lquation [5.3] :
V [ A]
v = [5.3]
[ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
dans laquelle [ I ] est la concentration dinhibiteur libre et V et K m ont leur

signification habituelle. Lquation a la forme de lquation de MICHAELIS et
MENTEN, cest--dire quelle peut scrire sous la forme suivante :
V app [ A ]
v = [5.4]
Kmapp + [ A ]
o V app et Kmapp sont les valeurs apparentes des paramtres V et K m qui sont
donnes par les quations suivantes :
V app = V [5.5]
[ I ]
Kmapp = Km 1 + [5.6]
Kic
V app = V Km
[5.7]
Kmapp
1 + ( [ I ] Kic )
En consquence, leffet de linhibiteur comptitif est de diminuer la valeur
apparente de V Km dun facteur 1+ ( [ I ] Kic ) tandis que la valeur de V reste
inchange.
Puisque les quations [5.5] [5.7] dfinissent linhibition comptitive sans gard
pour le mcanisme impliqu et quelles montrent que leffet essentiel de linhi-
biteur comptitif est de rduire la constante apparente de spcificit, il serait
prfrable dutiliser le terme inhibition spcifique. Dans le contexte o lactivation
est galement considre, cela reprsenterait une amlioration importante de la
terminologie, mais il nest pas raliste de demander aux biochimistes dabandonner
un terme utilis depuis plus de 80 ans pour viter une confusion avec un phno-
mne moins courant dactivation spcifique. Pour cette raison, nous continuerons
dutiliser le terme inhibition comptitive dans ce livre, bien que nous attirons
lattention sur le fait quil sagit dune dfinition oprationnelle1, et non pas dune
dfinition base sur un mcanisme, en accord avec les recommandations de
l'IUPAC (1981) et de lIUBMB (IUB, 1982) concernant la terminologie cintique.
5.2.2. Inhibition mixte
Les prsentations les plus lmentaires des phnomnes dinhibition de lactivit

enzymatique ne considrent que deux types : linhibition comptitive et linhibition
non-comptitive.
1. Une dfinition oprationnelle exprime une observation, sans aucun gard vis--vis
de la manire dont le phnomne est interprt, alors quune dfinition mcanique
repose sur une interprtation. Les dfinitions mcaniques de comportements
cintiques sont trs couramment utilises, mais leur dsavantage est que des
observations ne peuvent tre dcrites qu partir du moment o elles ont t
interprtes, alors quen recherche, on est souvent amen dcrire les obser-
vations avant quune interprtation satisfaisante ne soit obtenue.
Linhibition comptitive est un mcanisme authentique dinhibition, particulire-

ment important dans la nature, mais linhibition non-comptitive se rencontre
essentiellement dans les manuels denzymologie et nous nen discuterons pas de
manire dtaille dans ce livre. Cette situation est ne du fait que MICHAELIS et ses
collaborateurs, qui taient les premiers tudier les phnomnes dinhibition,
considraient que certains inhibiteurs pouvaient agir en diminuant la valeur appa-
rente de V sans modifier la valeur de K m. Un tel effet reprsentait une alternative
vidente linhibition comptitive et elle a t dnomme inhibition non-comp-
titive. Il est difficile dimaginer une explication raisonnable pour un tel comporte-
ment : il serait ncessaire de supposer que linhibiteur interfre avec les proprits
catalytiques de lenzyme sans avoir aucun effet sur la fixation du substrat ; en
dautres termes cela signifierait que deux molcules avec des proprits diffrentes
auraient des constantes identiques de fixation par lenzyme. Un tel comportement
est possible pour des inhibiteurs de trs petite taille, comme des protons ou des ions
mtalliques, mais semble hautement improbable dans les autres cas.
Linhibition ou lactivation non-comptitive par des protons est, en ralit, un
phnomne courant. Il existe plusieurs exemples dinhibition non-comptitive par
des mtaux lourds, bien que certains de ceux-ci (sinon tous), soient en ralit
des exemples dinhibition irrversible partielle, que nous dcrirons ci-dessous.
Linhibition non-comptitive par dautres espces molculaires est trs rare, et
les exemples les plus couramment cits, tel que linhibition de linvertase par
la-glucose (NELSON et ANDERSON, 1926) et linhibition de larginase par
diffrents composs (HUNTER et DOWNS, 1945) sont apparus, aprs examen des
donnes originales, comme des exemples dinhibition mixte ou rsultent de la
confusion entre une inhibition rversible non-comptitive et une inactivation
irrversible partielle. En gnral, il est prfrable de considrer linhibition non-
comptitive comme un cas particulier et peu intressant de linhibition mixte.
Dans le cas dune inactivation irrversible partielle, il nest pas particulirement
important de dterminer si leffet primaire de linactivation se marque sur V,
V Km ou K m , parce que, quoiquil en soit, le rsultat net est une disparition de
molcules denzyme du systme, les molcules non-affectes se comportant
normalement. Cependant, comme V = k0 [ E ]0 est le produit de la constante
catalytique k0 et de la concentration denzyme active [ E ]0 , la valeur de ce
paramtre diminuera, que ce soit la valeur de k0 qui diminue (inhibition non-
comptitive authentique) ou que ce soit la concentration denzyme actif qui
diminue (inactivation irrversible partielle).
Linhibition linaire mixte est un type dinhibition qui implique la fois des effets
catalytiques et des effets spcifiques, cest--dire quaussi bien V app Kmapp que
V app varient avec la concentration dinhibiteur en accord avec les quations
suivantes :
V app = V [5.8]
1 + ( [ I ] Kiu )
Kmapp =
[
Km 1 + ( [ I ] Kic ) ] [5.9]
1 + ( [ I ] Kiu )
V app = V Km
[5.10]
Kmapp
1 + ( [ I ] Kic )
Le mcanisme le plus simple qui puisse expliquer ce comportement est celui dans
lequel linhibiteur peut se fixer la fois sur lenzyme libre pour donner un
complexe EI avec une constante de dissociation K ic, et sur le complexe enzyme-
substrat pour donner le complexe EAI avec une constante de dissociation Kiu,
comme montr dans le schma de la figure 5.3. Dans ce schma, les deux ractions
de fixation de linhibiteur sont considres comme des voies en cul-de-sac et sont
donc des quilibres ( 6.3.6.3), mais comme EI et EAI existent, aucune raison
mcanique vidente ne permettrait dexpliquer que A ne puisse pas se fixer sur le
complexe EI pour former EAI. Si cette raction est incluse dans le mcanisme,
lquation de vitesse est plus complexe et implique des termes en [ A ] 2 et [ I ] 2 .
De tels termes sannulent uniquement si toutes les tapes de fixation ont atteint
lquilibre, cest--dire si toutes les tapes de dissociation des substrats et des
produits sont rapides par comparaison avec ltape de conversion de EA en
produits, et aucune raison ne justifie une telle situation. Cependant, la dviation
prdite par rapport des cintiques simples est difficile dtecter exprimen-
talement et lobissance une cintique
simple nest pas une preuve irrfutable A + EI EAI
dmontrant que K m , K ic et Kiu sont de vraies
constantes dquilibre de dissociation. Kic Kiu
A+E EA E+P
+ +
5.3 - Mcanisme produisant une inhibition mixte I I
Bien quil soit pratique de dfinir linhibition mixte partir de la figure 5.3, ce type
dinhibition est souvent rencontr dans le processus dinhibition par le produit.
Si un produit est libr dans une tape qui gnre une forme denzyme diffrente
de celle qui fixe le substrat, les prdictions indiquent que linhibition par le produit
obit aux quations [5.8] [5.10]. Cette conclusion ne dpend pas des hypothses
dquilibre, cest--dire quelle est une consquence ncessaire du traitement
ltat stationnaire, comme il est facile de le dmontrer partir des mthodes qui
seront dcrites dans le 6.3. Le plus simple parmi divers mcanismes de ce type
est celui dans lequel le produit est libr dans la deuxime tape dun mcanisme
en comportant trois, comme dcrit dans la figure 5.4.
k1 k2
Dans ce mcanisme aucune des deux A+E EA E' + P
constantes dinhibition nest une k1 k2
vritable constante dquilibre. k3
5.4 - Mcanisme dinhibition mixte par le produit
Des exemples plus complexes abondent dans les ractions impliquant plus dun
substrat ou dun produit, comme nous le verrons dans le chapitre 6. Dans ces cas,
lassimilation des constantes Kic et Kiu avec des constantes de dissociation nest pas
utile. Mme dans un exemple aussi simple que celui de la figure 5.4, dans lequel le
produit P agit comme un inhibiteur mixte plutt que comme un inhibiteur comptitif,
puisquil se lie une forme de lenzyme diffrente de celle qui fixe A, les constantes
( k + k )k (k +k )
dinhibition sont donnes par Kic = 1 2 3 et Kiu = 2 3 , dont aucune
k 1k 2 k 2
nest une vritable constante dquilibre sauf si k3 << k2.
La raret avec laquelle les authentiques inhibitions non-comptitives sont rencon-
tres a conduit quelques enzymologistes gnraliser ce terme pour englober tous
les cas dinhibition mixte. Il ne semble pas y avoir davantage procder de la
sorte : except quun terme court et non ambigu est remplac par un terme plus
long et ambigu, ne faisant quajouter de la confusion une nomenclature qui est
dj confuse. Pour viter toute ambigut, il est prfrable de rserver le terme
dinhibition non-comptitive pour les rares cas o lon souhaite faire rfrence
linhibition non-comptitive pure.
5.2.3. Linhibition anti-comptitive 2 (inhibition catalytique)

Linhibition anti-comptitive se manifeste par des effets opposs ceux de
linhibition comptitive ; il sagit du cas o linhibiteur diminue la valeur apparente
de V sans avoir deffet sur la valeur de V K m :
V app = V [5.11]
1 + ( [ I ] Kiu )
Km
Kmapp = [5.12]
1 + ( [ I ] Kiu )
V app = V [5.13]
Kmapp Km
La constante dinhibition anti-comptitive Kiu peut tre reprsente simplement par
Ki quand le caractre anti-comptitif est tabli, mais comme cela nest gnrale-
ment pas le cas, il est prfrable dutiliser le symbole le plus explicite. La compa-
raison des quations [5.11] [5.13] avec les quations [5.8] [5.10], montre que
linhibition anti-comptitive est un cas limite de linhibition mixte dans lequel Kic
2. Bien que le terme anti-comptitive soit galement utilis par les anglo-saxons,
ceux-ci prfrent gnralement utiliser le terme uncompetitive pour dnommer
ce type dinhibition. Cette dernire dnomination nayant pas de traduction
franaise simple et non-ambigu, nous avons choisi dutiliser ici le terme anti-
comptitive qui marque lopposition des effets sur V et V/Km vis--vis de
linhibition comptitive.
tend vers linfini ; cest--dire pour lequel [ I ] Kic est ngligeable quelle que soit
la valeur de [ I ] , et donc pour lequel ce terme disparat des quations [5.8]
[5.10]. Cest donc le contraire de linhibition comptitive qui reprsente lautre cas
limite de linhibition mixte o Kiu tend vers linfini.
Linhibition anti-comptitive est galement, du moins en principe, le pendant de linhi-
bition comptitive au point de vue du mcanisme ractionnel, puisque les mcanismes
prdits pour ce type dinhibition impliquent que linhibiteur se fixe sur le complexe
enzyme-substrat et non sur lenzyme libre. Un exemple dune grande importance
clinique est linhibition de la monophosphatase du myo-inositol par lion Li+. Cet ion
est utilis pour traiter certains cas de dpression et sa slectivit pour les cellules
prsentant une activit excessive de transduction du signal est consistante avec le
caractre anti-comptitif de linhibition (POLLACK et al., 1994). De tels mcanismes ne
sont cependant pas particulirement communs et linhibition anti-comptitive se
rencontre principalement comme un type dinhibition par le produit qui est commun
dans les ractions impliquant plusieurs substrats et plusieurs produits.
Le Comit de Nomenclature de lIUB (1982) a choisi dutiliser le terme uncompetitve
pour dnommer ce type dinhibition. Nanmoins, comme nous en avons discut
dans la note [2], ce terme na pas de traduction simple en franais. La dnomina-
tion anti-comptitive utilise ici, marque mieux le fait que ce type dinhibition
se trouve loppos de linhibition comptitive et de nombreux manuels en langue
anglaise, tel que celui de LAIDLER et BUNTING (1973), utilisent galement le terme
anti-comptitif . Toutefois, lappellation inhibition anti-comptitive nest
pas aussi fermement tablie que son oppose, et il y a de bonnes raisons de laban-
donner au profit du terme inhibition catalytique :
le terme anti-comptitif nest pas utilis dans le langage courant et en
pratique il est gnralement confondu avec le terme non-comptitif , lui-mme
utilis de diverses manires dans la littrature biochimique ;
linhibition anti-comptitive est beaucoup moins courante que linhibition com-
ptitive et donc le terme ne peut pas tre valid par un usage universel.
5.2.4. Rsum des types dinhibition linaire
Les proprits des diffrents types dinhibition linaire sont rsumes dans le
tableau 5.1. Elles sont faciles mmoriser pour peu que les points suivants soient
pris en compte :
Les deux cas limites sont linhibition comptitive (spcifique) et linhibition anti-
comptitive (catalytique) ; linhibition non-comptitive pure est simplement un
cas spcial dinhibition mixte dans lequel les deux constantes dinhibition K ic et
Kiu ont la mme valeur.
Les effets des inhibiteurs sur V app Kmapp et sur V app sont simples et rguliers ; si
les grandeurs de ces paramtres sont diminues par la prsence de linhibiteur,
elles le sont respectivement par des facteurs 1+ ( [ I ] Kic ) et 1+ ( [ I ] Kiu ) .
Les effets des inhibiteurs sur Kmapp sont confus ; ils sont le plus facilement
mmoriss en assimilant Kmapp V app ( V app Kmapp ) et non un paramtre part
entire.
Tableau 5.1 - Caractristiques des inhibitions linaires
Type dinhibition V app V app Kmapp Kmapp
V Km [ I ]
Comptitive V Km 1 +
1 + ( [ I ] K ic ) K ic
Mixte
V V Km [
K m 1 + ( [ I ] K ic ) ]
1 + ( [ I ] K iu ) 1 + ( [ I ] K ic ) 1 + ( [ I ] K iu )
V V Km
Non-comptitive pure 3 Km
1 + ( [ I ] K iu ) 1 + ( [ I ] K ic )
V V Km
Anti-comptitive
1 + ( [ I ] K iu ) Km 1 + ( [ I ] K iu )
5.3. PRSENTATIONS GRAPHIQUES

DES RSULTATS DES INHIBITIONS
Chaque graphique dcrit dans le 3.5 peut tre utilis pour diagnostiquer le type
dinhibition, puisque chacun fournit une estimation de la valeur apparente des
paramtres cintiques. Par exemple, si des graphiques de [ A ] v en fonction de
[ A ] sont tracs pour diffrentes concentrations dinhibiteur I, lordonne lori-
gine Kmapp V app varie avec [ I ] sil y a une composante spcifique dans linhibition,
alors que la pente 1 V app varie avec [ I ] sil y a une composante dinhibition
catalytique. Alternativement, si des reprsentations linaires directes de V app en
fonction de Kmapp sont ralises pour chaque valeur de [ I ] , le point dintersection
commun se dplace dans une direction qui est caractristique du type dinhibition :
pour linhibition comptitive, le dplacement sopre vers la droite ; pour linhibition
anti-comptitive, le dplacement sopre vers lorigine des axes ; pour linhibition
mixte, le dplacement est intermdiaire entre ces deux extrmes. Des exemples de
ces diffrentes possibilits sont prsents schmatiquement dans la figure 5.5, et un
exemple de rsultats exprimentaux est prsent dans la figure 5.6.
3. Puisque linhibition non-comptitive pure est simplement un cas spcial de

linhibition mixte dans lequel les deux constantes dinhibition sont identiques,
Kic = Kiu, il nest pas strictement ncessaire dutiliser ces deux symboles dans cette
ligne du tableau. Nous lavons fait, cependant, pour prserver la rgularit des
colonnes pour V app et V app K mapp .
a V app b V app
V
Comptitive Mixte
0 Kmapp 0 Kmapp
c V app d V app
Non-comptitive pure Anti-comptitive

app
0 Km Km 0 Kmapp
5.5 - Effets des diffrents types dinhibition sur la localisation du point dintersection
des droites dans le graphique linaire direct (voir figure 3.14)
V app (M min1) 16
12
non-inhib
8
inhib
0,8 0,4 0 0,4 0,8 Kmapp (mM)
5.6 - Graphiques linaires directs pour le cas dune inhibition comptitive

La figure provient de larticle dEISENTHAL et CORNISH-BOWDEN (1974) et montre des donnes
dinhibition par lactyl-L-phnylalanine D-phnylalanine de lhydrolyse catalyse par la
pepsine de la N-actyl-3,5-dinitro-L-tyrosyl-L-phnylalanine. Pour chaque concentration de
substrat, la vitesse la plus leve est observe en absence dinhibiteur et la plus faible en
prsence de 0,525 mM dinhibiteur.
Dautres graphiques sont ncessaires pour dterminer les valeurs relles des
constantes dinhibition. Lapproche la plus simple consiste estimer les constantes
cintiques apparentes pour plusieurs concentrations dinhibiteur en utilisant les

mthodes dcrites dans le 3.5, et ensuite de tracer les graphiques de Kmapp V app et
de 1 V app en fonction de [ I ]. Dans chaque cas, le rsultat devrait tre une droite,
qui croise laxe des [ I ] une valeur gale Kic dans le graphique o Kmapp V app
est reprsent et qui croise laxe des [ I ] une valeur gale Kiu dans le
graphique o 1 V app est reprsent. Il peut sembler plus naturel de dterminer la
valeur de K ic en portant en graphique Kmapp en fonction de [ I ] plutt que
Kmapp V app , mais cette pratique nest pas recommandable pour deux raisons. Elle
est seulement valable si linhibition est comptitive et elle donne une courbe plutt
quune droite si linhibition est mixte ; mme si linhibition est strictement com-
ptitive, cette reprsentation est beaucoup moins prcise puisque la valeur de Kmapp
ne peut jamais tre estime aussi prcisment que celle de Kmapp V app .
Une autre mthode permettant destimer Kic, introduite par DIXON (1953), est aussi
couramment utilise. Lquation complte pour linhibition mixte peut tre crite
de la manire suivante :
V [ A]
v = [5.14]
[ I ] [ I ]
Km 1 + + [ A ] 1 +
Kic Kiu
En prenant la rciproque des deux cts de lquation et en introduisant les indices
1 et 2 pour distinguer les mesures ralises deux concentrations diffrentes de
substrat, [ A ]1 et [ A ]2, nous obtenons les deux quations :
K [ A ]1
[ I ] m +
1 = Km + [ A ]1 + Kic Kiu
[5.15]
v1 V [ A ]1 V [ A ]1
K [ A ]2
[ I ] m +
1 = Km + [ A ]2 + Kic Kiu
[5.16]
v2 V [ A ]2 V [ A ]2
Ces deux quations indiquent que le graphique de 1 v en fonction de [ I ] une
valeur constante de [ A ] est une droite. Si deux de ces droites sont dessines,
partir de mesures ralises deux concentrations diffrentes de A, le point
dintersection peut tre dtermin en fixant 1 v1 =1 v 2 :
K [ A ]1 K [ A ]2
[ I ] m + [ I ] m +
Km + [ A ]1 Kic Kiu Km + [ A ]2 Kic Kiu
+ = + [5.17]
V [ A ]1 V [ A ]1 V [ A ]2 V [ A ]2
Km 1 [ I ]
ou 1 1 + = 0 [5.18]
V [ A ]1 [ A ]2 Kic
1 ( Kic Kiu )
et ainsi, [ I ] = Kic et 1 v = au point dintersection.
V
En principe, si plusieurs droites sont traces pour diffrentes valeurs de [ A ] , elles

devraient toutes se couper au mme point ; en pratique, les erreurs exprimentales
provoquent habituellement quelques variations.
Il faut noter que les termes renfermant Kiu sliminent dans lquation de [5.17] pour
donner lquation [5.18]. En consquence, le graphique de DIXON fournit une valeur
de Kic quelle que soit la valeur de Kiu, cest--dire quil donne une mesure de la
composante spcifique de linhibition que celle-ci soit comptitive, mixte ou pure-
ment non-comptitive. La coordonne horizontale du point dintersection ne permet
pas de distinguer parmi ces trois possibilits, mais puisque les deux constantes
dinhibition contribuent la dfinition de la coordonne verticale, la position de ce
point par rapport laxe des abscisses donne une information qualitative : linter-
section au-dessus de laxe indique que la composante comptitive de linhibition est
plus forte que la composante anti-comptitive et vice versa. Dans le cas dune
inhibition anti-comptitive, quand Kic est infini, le graphique de DIXON produit des
droites parallles.
Bien que le graphique de DIXON ne fournisse pas la valeur de la constante
dinhibition anti-comptitive Kiu, une drivation similaire montre que cette
constante peut tre obtenue en traant le graphique de [A] v en fonction de [ I ]
plusieurs concentrations de A (CORNISH-BOWDEN, 1974). Dans ce cas, un
ensemble diffrent de droites est obtenu, qui se croisent en un point o [ I ] = Kiu
et =
[
[ A ] Km 1 ( Kiu Kic )
.
]
v V
Les deux types de graphique sont reprsents schmatiquement pour les diffrents
types dinhibition dans la figure 5.7, et un exemple de rsultats exprimentaux est
prsent dans la figure 5.8.
5.4. RELATION ENTRE LES CONSTANTES DINHIBITION

ET LA CONCENTRATION DE DEMI-INHIBITION
En biochimie, il est habituel de rapporter les caractristiques dun inhibiteur en

termes du type dinhibition impliqu et des constantes dinhibition, comme nous
lavons fait jusqu prsent dans ce chapitre. Dun point de vue mcanique, il sagit
de lapproche approprie, puisquelle se rapporte directement au mcanisme
dinhibition qui est impliqu. Nanmoins, linhibition des enzymes est galement
dune importance cruciale en pharmacologie, et pour des raisons videntes, les
pharmacologistes sont beaucoup plus intresss par les effets de linhibition que
par le mcanisme cintique. En consquence, il est trs courant en pharmacologie
de caractriser un inhibiteur par la concentration [ I ] 0.5 qui rduit la vitesse de la
raction dans les conditions utilises 50% de la vitesse en absence dinhibiteur.
Cette concentration [ I ] 0.5 nest gale aucune des constantes habituelles dinhi-
bition, except dans le cas dune inhibition non-comptitive pure, qui est trs rare-
ment rencontre dans la pratique (voir 5.2.2) pour constituer un exemple utile : en
gnral, il est plus prudent de dire que [ I ] 0,5 nest pas une constante dinhibition
et quil est ncessaire de connatre le type dinhibition pour la convertir en lune de
ces constantes. CHENG et PRUSOFF (1973) et BRANDT, LAUX et YATES (1987) ont
prsent des analyses dtailles de ces relations qui dcoulent de lquation
habituelle pour une inhibition mixte (quation [5.12]).
a 1/v b [A]/v
Comptitive Comptitive
1/V
Kic 0 [I] 0 [I]
1/v [A]/v
Mixte Mixte
Kiu
1/(1 Kiu /Kic)V
0 [I] 0 Km(1 Kiu /Kic)V [I]
Kic
1/v [A]/v
Anti-comptitive Anti-comptitive
Km/V
0 [I] Kiu 0 [I]
5.7 - Dtermination des constantes dinhibition comptitive et anti-comptitive

a - La valeur de Kic est donn par les graphiques de 1/v en fonction de [ I ] pour diffrentes
valeurs de [A] (DIXON, 1953b). b - La valeur de Kiu est dtermine par les graphiques de [A] /v
en fonction de [ I ] pour diffrentes valeurs de [A ] (CORNISH-BOWDEN, 1974). Dans le cas
dune inhibition mixte, le point dintersection peut tre au-dessus de laxe dans le premier
graphique et en dessous dans le second ou vice et versa. Il peut galement se situer sur
laxe dans les deux graphiques si Kic = Kiu.
1/v (mM1min) [MgATP2]/v (min)
60
100
8,8
2,58
1,72 40
0,645
50 0,344
20
0
10 0 10 20 30 0 10 20 30
[Glucose 6-phosphate] (mM) [Glucose 6-phosphate] (mM)
5.8 - Inhibition de lhexokinase D par le glucose 6-phosphate
(STORER et CORNISH-BOWDEN, 1977) porte en graphique comme dans la figure 5.7
Les concentrations de MgATP2 sont 8,8 mM (), 2,58 mM (), 1,72 mM (), 0,645 () et
0,344 mM (). La combinaison des droites scantes dans le graphique (a) et des droites
parallles dans le graphique (b) indique une inhibition comptitive avec Kic = 11,5 mM.
Si nous rarrangeons celle-ci pour trouver la valeur de [ I ] pour laquelle 1 v (dans

un graphique de DIXON) ou [A] v (dans un graphique de [A] v en fonction de
[ I ] ) est gal zro, nous obtenons la valeur suivante (CORTS et al., 2001) :
Km + [ A ]
[I] = [5.19]
( K m K ic ) + ( [ A ] Kiu )
Ce rsultat nest pas par lui-mme dune importance immdiate, mais si nous
ignorons le signe ngatif et substituons la valeur positive rsultante dans lquation
[5.14], le rsultat est une vitesse gale la moiti de la vitesse v0 en absence
dinhibiteur :
V [ A]
v = = 0 ,5 v0 [5.20]
2( Km + [ A ])
Il dcoule de cette quation que lintersection avec laxe des abscisse, dans un
graphique de DIXON ou dans un graphique de [A] v en fonction de [ I ] , est gale
[ I ] 0,5, et que laisser tomber le signe ngatif de lquation [5.19] montre la
dpendance exacte de [ I ] 0,5 vis--vis de la concentration de substrat et des autres
paramtres :
Km + [ A ]
[ I ]0 ,5 = [5.21]
( K m K ic ) + ( [ A ] Kiu )
Ce rsultat peut galement tre obtenu en substituant vi = 0,5 v0 dans lquation

[5.18].
5.5. INHIBITION PAR COMPTITION AVEC UN SUBSTRAT
5.5.1. Spcificit de lenzyme
Les tudes exprimentales des enzymes sont gnralement ralises avec un seul
substrat prsent dans le mlange ractionnel, cest--dire en absence de substrat
alternatif capable de subir la mme raction 4. En effet, la prsence de substrats en
comptition complique lanalyse sans apporter dinformation supplmentaire
celle obtenue en tudiant les deux substrats sparment. Cependant, ceci implique
une diffrence majeure entre la pratique exprimentale et les conditions physiolo-
giques dans lesquelles lenzyme fonctionne habituellement : la plupart des enzymes
ne sont pas parfaitement spcifiques pour un seul substrat et doivent souvent
choisir parmi les quelques-uns (et mme parfois quelques millions, comme dans
lexemple [5.10]) qui sont disponibles simultanment. Pour tre significative dans
le contexte physiologique, la spcificit dun enzyme doit tre dfinie en terme de
lefficacit avec laquelle lenzyme est capable de discriminer entre plusieurs
substrats prsents dans le mme mlange ractionnel. Ceci ne signifie pas quelle
ne peut pas tre dtermine partir des paramtres cintiques de lenzyme pour les
diffrents substrats individuels, mais cela signifie que ces paramtres doivent tre
interprts correctement.
Le cas le plus simple considrer est celui dans lequel sont en comptition deux
substrats qui individuellement donnent des cintiques de MICHAELIS et MENTEN
quand ils sont tudis sparment (figure 5.9). Il sagit dune version lgrement
k1 k2 simplifie du mcanisme qui sera dcrit
E+A EA E+P dans le 6.3.4.
k1
k'1 k'2
E + A' EA' E + P' 5.9 - Comptition entre substrats
k'1 pour le mme enzyme
Il fournit la paire suivante dquations de vitesse :

V [ A]
d[ P ] V [ A] Km
v = = = [5.22]
dt [ A' ] [ A ] [ A' ]
Km 1 + + [ A ] 1 + K + K'
K'm m m
4. Cette situation doit tre soigneusement distingue de celle o lenzyme ncessite

deux ou plusieurs substrats pour que la raction puisse avoir lieu. Par exemple,
lhexokinase catalyse une raction entre le glucose et lATP, dans laquelle glucose
et ATP ne sont pas des substrats alternatifs mais sont tous les deux ncessaires
pour la raction. Par contre, lhexokinase accepte galement le fructose et dautres
hexoses la place du glucose et donc, si du glucose et du fructose sont prsents
simultanment dans le mlange ractionnel, ces deux substrats sont en
comptition lun avec lautre pour interagir avec lenzyme.
V ' [ A' ]
d [ P' ] V ' [ A' ] K'm
v = = = [5.23]
dt [ A] [ A ] [ A' ]
K'm 1 + + [ A' ] 1 + K + K'
Km m m
dans lesquelles V = k 2 [ E ]0 et V ' = k' 2 [ E ]0 sont les vitesses limites et

Km = ( k 1 + k 2 ) k1 et K'm = ( k' 1 + k' 2 ) k'1 sont les constantes de MICHAELIS
pour les deux ractions prises isolment. Chacune de ces quations a la forme de
lquation [5.3], lquation caractristique de linhibition comptitive ; ainsi, si
nous mesurons la constante dinhibition spcifique pour un substrat en comptition
en le traitant comme sil sagissait dun inhibiteur, la valeur qui est obtenue est
celle de la constante de MICHAELIS. Ceci est illustr dans le tableau 5.2 qui montre
les valeurs de K m pour les mauvais substrats de la fumarase dtermines direc-
tement ou par comptition. Dans chaque cas, les valeurs de K m mesures par les
deux mthodes sont en accord dans les limites des erreurs exprimentales.
Tableau 5.2 - Paramtres cintiques pour les substrats de la fumarase
k0 1
Substrat k0 (s1) Km (mM) Ki (mM) (s mM1)
Km
Fluorofumarate 2 700 0,027 100 000
Fumarate 800 0,005 160 000
Chlorofumarate 20 0,11 0,10 180
Bromofumarate 2,8 0,11 0,15 25
Iodofumarate 0,043 0,12 0,10 0,36
Mesaconate 0,023 0,51 0,49 0,047
L-Tartrate 0,93 1,3 1,0 0,72
Les donnes proviennent de mesures ralises 25C dans un tampon pH 7,3. Les
valeurs de la constante catalytique k0 (cest--dire V/E0, voir 3.3.3) et de Km ont t
mesures par des expriences cintiques conventionnelles. Les valeurs dans la colonne
intitule Ki sont des valeurs de Km, pour de mauvais substrats, mesures en traitant
ceux-ci comme des inhibiteurs comptitifs de la raction utilisant le fumarate comme
substrat. Le tableau est adapt daprs TEIPLE, HAAS et HILL (1968). La constante k0/Km
est aussi appele constante de spcificit (kA).
Un point plus important noter partir des quations [5.22] et [5.23], qui est
galement illustr par les donnes du tableau 5.2, est quelles fournissent les bases
pour une dfinition rigoureuse de la spcificit dun enzyme. Considrons les
paramtres pour le fluorofumarate et pour le fumarate. Si les deux ractions sont
considres isolment, la valeur de k0 pour le fluorofumarate est environ trois fois
plus leve que celle pour le fumarate. Cependant, la situation est inverse aux
faibles concentrations, parce que la valeur de k0 Km est environ 60% plus leve
pour le fumarate que pour le fluorofumarate. Lequel de ces rsultats est le plus fon-
damental, en dautres termes, quel est le substrat le plus spcifique ? La question
peut apparatre comme un simple problme de dfinition, mais une rponse claire
et satisfaisante ne peut tre apporte qui si nous ralisons quil est artificiel de
considrer les deux substrats isols lun de lautre. Afin de dterminer la spcificit
dans un contexte physiologique, nous devons considrer la proportion de la
raction impliquant chaque substrat lorsque ceux-ci sont mlangs, une information
qui peut tre dtermine en divisant lquation [5.22] par lquation [5.23] :
V k0
[ A] [ A]
v = d [ P ] = Km =
Km k [ A]
= A [5.24]
v' d [ P' ] V' k'0 k' A [ A' ]
[ A' ] [ A' ]
K'm K'm
Jusqu prsent lutilisation du nom constante de spcificit pour dsigner le
paramtre k A = k0 Km (introduit dans le 3.3.4) pouvait sembler arbitraire, mais
lquation [5.24] rvle que cest ce paramtre qui dfinit le rapport des vitesses
dans une situation o il y a une comptition entre substrats prsents simultanment
dans le mlange ractionnel, et que donc il exprime la capacit dun enzyme
discriminer les diffrents substrats. Ds lors, dans un mlange quimolaire de
fumarate et de fluorofumarate, quelle que soit leur concentration, la vitesse
dhydratation du fumarate catalyse par la fumarase est 60% plus rapide que celle
du fluorofumarate. Le fumarate est le substrat le plus spcifique.
5.5.2. Test du droulement simultan de deux ractions
A partir des quations [5.22] et [5.23], la vitesse globale vtot = v + v' pour les deux
ractions en comptition peut tre exprime de la manire suivante :
V V'
[ A]+ [ A' ]
Km K'm
vtot = v + v' = [5.25]
[ A ] [ A' ]
1+ +
Km K'm
Supposons maintenant que des concentrations de rfrence, [ A ] = [ A ]0 et
[ A' ] = [ A' ]0 , sont obtenues (exprimentalement) de telle sorte que :
V [ A ]0 V ' [ A' ]0
= = v [5.26]
Km + [ A ]0 K'm + [ A' ]0
cest--dire quil existe des concentrations de chacun des substrats qui donnent la
mme vitesse ( la mme concentration denzyme) lorsque lautre substrat est
absent. Si une srie de mlanges est prpare dans laquelle les concentrations sont
interpoles linairement entre zro et leur concentration de rfrence, cest--dire :
[ A ] = ( 1 r )[ A ]0
[5.27]
[ A' ] = r [ A' ]0
alors lquation [5.26] prend la forme suivante :

V V'
( 1 r )[ A ]0 + r [ A' ]0
Km K'm
vtot =
( 1 - r )[ A ]0 r [ A' ]0
1+ +
Km K'm
V V'
( 1 r )[ A ]0 + r [ A' ]0
Km K'm
vtot =
[ A ]0 [ A' ]0
( 1 r ) 1 + + r 1 +
Km K'm
[ A ]0 [ A' ]0
v0 ( 1 r ) 1 + + r 1 +
Km K'm
vtot = = v [5.28]
[ A ]0 [ A' ]0
( 1 r ) 1 + + r 1 +
Km K'm
La troisime forme de cette quation provient de la seconde en utilisant lquation
[ ]
[5.26] pour substituer V [ A ]0 Km par v0 1+ ( [ A ]0 Km ) , et V ' [ A' ]0 K'm de
manire similaire. En conclusion, si les quations [5.22] et [5.23] sont valables, la
vitesse totale pour les mlanges prpars en accord avec lquation [5.27] est ind-
pendante des proportions de chacun des substrats dans le mlange. Un graphique
de vtot en fonction de r, connu sous le nom de graphique de comptition, fournit
alors un test permettant de dterminer si les deux substrats sont en comptition
pour le mme site actif de lenzyme. Lexamen dune plus large gamme de
modles possibles que celui dcrit par les quations [5.21] et [5.22], montre quil
existe essentiellement trois possibilits (CHEVILLARD, CRDENAS et CORNISH-
BOWDEN, 1993) :
1. La comptition pour un seul site - Le graphique ne montre aucune dpendance
de vtot sur r, cest--dire quil donne une droite horizontale, comme illustr dans
la figure 5.10a dans le cas de la comptition entre le glucose et le fructose pour
le site actif de lhexokinase de levure.
2. Les ractions se droulent dans des sites spars - Si les deux ractions sont
compltement spares sans quil ny ait dinteraction entre un des enzymes et le
substrat de lautre enzyme, le graphique apparat comme une courbe passant par un
maximum. En ralit, il sagit l dun cas extrme, parce que si les deux substrats
partagent quelques similarits, on sattend ce que chacun inhibe lenzyme pour
lautre substrat. Cependant, tant donn que chaque substrat se fixe plus fortement
sur son propre enzyme que sur lautre, le comportement est qualitativement
identique, cest--dire que le graphique a la forme dune courbe passant par un
maximum, comme illustr dans la figure 5.10b pour la phosphorylation du glucose
et du galactose par un mlange dhexokinase et de galactokinase.
3. Les ractions sont antagonistes - Si les deux substrats ragissent sur des sites
diffrents mais que chacun se fixe plus fortement sur le mauvais site que sur le
bon, le graphique apparat comme une courbe passant par un minimum. Un tel
cas nest cependant pas trs couramment rencontr dans la pratique.
a [Glucose] (mM) b [Glucose] (mM)

1,5 1 0,5 0 1,5 1 0,5 0
0 0,5 1 0 1 2
[Fructose] (mM) [Galactose] (mM)
0,4 0,4
v (M/s)
v (M/s)
0,2 0,2
a - Le glucose et le fructose b - Le glucose et le galactose
ragissent sur le mme ragissent sur des sites
site : la vitesse est iden- diffrents : la vitesse est
tique pour des substrats plus leve avec un mlange
purs ou pour un mlange. qu'avec les substrats purs.
0 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
r r
5.10 - Graphiques de comptition
Les donnes de CHEVILLARD, CRDENAS et CORNISH-BOWDEN (1993) pour la phosphorylation
de mlanges glucose/fructose par lhexokinase de levure (a), et de mlanges glucose/galac-
tose pour un mlange dhexokinase et de galactokinase de levure (b). Dans les deux cas, les
mlanges sont construits de sorte que la vitesse mesure est la mme pour les substrats
purs (voir le texte pour plus de dtails). Si les deux substrats sont en comptition pour le
mme site, la vitesse est indpendante de la proportion des substrats, comme dans (a) ;
quand les ractions se droulent sur des sites distincts, avec peu ou pas dinhibition
croise, la vitesse pour les mlanges dintermdiaires devrait tre suprieure celle pour
les substrats purs comme dans (b).
5.5.3. Protection par le substrat
La prsence du substrat de lenzyme a souvent pour effet de protger lenzyme

contre linactivation par un inhibiteur irrversible ; en dautres termes, le substrat
agit comme un inhibiteur de la raction dinactivation. Si la raction normale du
substrat est capable de se drouler (soit quil sagisse dun systme un seul substrat
ou que les autres composants ncessaires, comme par exemple leau, soient gale-
ment prsents), le schma ractionnel prsent dans la figure 5.11 peut tre consi-
dr comme la combinaison dun schma reprsentant la comptition entre sub-
strats et d'un schma de KITZ-WILSON pour linactivation de lenzyme (q. [5.1]).
E+I EI E' (inactive)

5.11 - Protection dun enzyme
par son substrat E+A EA E-P
De la mme manire, lquation de vitesse correspondante est obtenue comme la

combinaison des quations [5.2] et [5.19] :
V[ I ]
v = [5.29]
[ A]
Ki 1 + +[ I ]
Km
La similitude entre cette quation et lquation [5.3] est manifeste, bien que pour
viter toute confusion il faille souligner que, dans lquation [5.29] les rles
habituels du substrat et de linhibiteur sont inverss, et que v reprsente la vitesse
de la perte dactivit et non la vitesse de la raction catalyse par lenzyme. En
consquence, il est possible de dterminer Km par les mthodes que lon utilise pour
mesurer K ic dans les cas ordinaires dinhibition comptitive, condition que nous
nous rappellions que V nest pas une constante, puisque la valeur de ce paramtre
diminue au cours de linactivation : ainsi il faut dabord obtenir une valeur
apparente de la constante dinhibition, Kiapp , par la mthode dcrite dans le 5.1.2
pour ensuite obtenir la valeur de Km partir de la dpendance linaire vis--vis de
[ ]
la concentration de substrat A, Kiapp = Ki 1 + ( [ A ] Km ) .
En tant que mthode permettant de dterminer la valeur de Km, celle-ci ne semble

pas possder davantage particulier sur les mthodes conventionnelles. Son impor-
tance rside dans la possibilit de ltendre au cas o A est le premier substrat
dune raction qui ne peut pas se drouler en absence des autres substrats (voir
6.5.1). Dans ce cas, la fixation du substrat dans lexprience dinactivation est un
simple quilibre, et lanalyse fournit une mesure de la vraie constante de disso-
ciation K, plutt que celle de Km. Cette approche ncessite seulement des quantits
catalytiques denzyme et a t applique ltude de plusieurs enzymes (voir, par
exemple, MALCOLM et RADDA, 1970 ; ANDERTON et RABIN, 1970) qui ntaient
pas disponibles en quantits suffisantes pour utiliser la dialyse lquilibre ou une
autres mthode de fixation lquilibre.
5.6. ACTIVATION DES ENZYMES
5.6.1. Diverses utilisations du terme activation
Toute discussion de lactivation des ractions catalyses par des enzymes est
complique par le fait que ce terme a t utilis en enzymologie avec diverses
significations. Nous lutilisons ici comme le contraire de linhibition rversible : un
activateur est une espce molculaire qui, en se combinant avec lenzyme, a pour
effet daugmenter son activit, sans que lui-mme ne subisse de raction. Dautres
processus qui sont couramment qualifis dactivation sont repris ci-dessous, mais
ne seront pas discuts davantage dans ce manuel :
1. Plusieurs enzymes, principalement des enzymes cataboliques extracellulaires
comme la pepsine, sont secrts sous la forme de prcurseurs inactifs, aussi
appels zymognes, le pepsinogne dans le cas de la pepsine. Ces derniers sont
convertis en enzyme actifs par protolyse partielle, un processus qui est quel-
quefois appel activation des zymognes .
2. Plusieurs enzymes importants dans les rgulations mtaboliques, comme les
phosphorylases, existent dans la cellule dans des tats actif et inactif (dans ce
cas, respectivement phosphorylase a et phosphorylase b). Ces tats diffrent
gnralement par la prsence ou labsence dun groupement phosphate (voir
10.9.2). La conversion entre ces deux tats ncessite deux ractions spares,
le transfert dun groupe phosphate partir de lATP dans une direction et
llimination dun groupe phosphate par hydrolyse dans lautre : ces processus
ne correspondent videmment pas lactivation et linhibition telles quelles
sont dfinies dans ce livre.
3. De nombreuses ractions sont dites actives par un ion mtallique quand en
ralit, lion mtallique fait partie du substrat. Par exemple, presque toutes les
kinases ATP-dpendantes sont actives par le Mg2 +, non pas cause de
leffet du Mg2+ sur lenzyme lui-mme, mais parce que le vrai substrat est lion
MgATP2 et non lATP4 qui est la forme sans mtal la plus abondante en solu-
tion pH physiologique. Par exemple, bien que lhexokinase D de foie de rat
utilise MgATP2 comme substrat, le Mg2+ libre est en ralit un inhibiteur et non
un activateur, tout comme lATP4 est un inhibiteur et non un substrat (STORER
et CORNISH-BOWDEN, 1977). Bien que ce type de confusion soit comprhen-
sible, si nous considrons lATP comme un ractif dans des ractions qui
normalement impliquent MgATP2 , il est prfrable dviter ce type de pro-
blme en exprimant les rsultats en termes des espces rellement impliques et
en rservant lutilisation du terme activation pour dcrire les effets sur
lenzyme. De part limportance du MgATP2 dans les ractions mtaboliques,
nous avons consacr le 4.4 de ce livre la discussion des mthodes assurant le
contrle de sa concentration.
5.6.2. Activation spcifique
Le type le plus simple dactivation vraie est lactivation spcifique (quelquefois

appele activation obligatoire) dans laquelle lenzyme libre, sans activateur fix,
na aucune activit et est incapable de fixer le substrat. Cette situation est repr-
sente dans la figure 5.12 o lactivateur est dsign par la lettre X. Les constantes
de vitesse sont notes avec des primes pour souligner quelles font rfrence
lenzyme ayant fix lactivateur.
Ce schma est similaire celui de linhibition spcifique (comptitive), et il donne

une quation de vitesse de forme similaire :
V' [ A ]
v = [5.30]
KX
K'm ( 1 + )+ [ A]
[X]
dans laquelle V ' = k' 2 [ E ]0 et K'm = ( k' 1 + k' 2 ) k'1 sont respectivement la vitesse
limite et la constante de MICHAELIS pour lenzyme activ EX, et [ X ] est la
concentration de lactivateur.
Cette quation diffre de celle de linhibition comptitive (Equation [5.3]) par le
remplacement de [ I ] Kic par KX [ X ] . Ainsi, la vitesse est nulle en absence
dactivateur, comme le mcanisme
k'1 k'2
le laisse prvoir. A + EX EAX EX + P
k'1
KX
E
5.12 Mcanisme produisant une +
activation spcifique X
En dpit de cette similitude de forme entre linhibition et lactivation spcifique, il

existe cependant une diffrence importante quant leur plausibilit. Parce quun
inhibiteur spcifique est conu pour se fixer la mme place que le substrat sur
lenzyme, il est facile dimaginer que linhibiteur et le substrat ne peuvent pas se
fixer simultanment sur lenzyme ; ds lors, on comprend aisment pourquoi
linhibition spcifique est un phnomne commun. Par contre, il est moins facile de
visualiser un enzyme qui ne puisse pas fixer son substrat en absence dactivateur.
Surtout lorsque lon sait quun des activateurs les plus courants est le proton, dont
lencombrement strique est trs faible. En consquence, lactivation spcifique
simple est beaucoup moins frquente que linhibition spcifique ; elle est essen-
tiellement utile comme introduction aux types plus complexes dactivation, qui
malheureusement ncessitent des quations de vitesse plus complexes.
Un point important noter dans cette discussion est quil ny a rien dans le modle
de la figure 5.12 qui suggre une quelconque forme de comptition et donc en dpit
de la similitude des quations, une dsignation telle qu activation comptitive
est injustifie et introduirait une vritable confusion dans de nombreuses situations.
Malheureusement, des expressions qui dnotent la relation algbrique sans intro-
duire dabsurdit quant au mcanisme, comme activation analogue de linhibition
comptitive ont tendance tre tellement incommodes que la tentation dutiliser
une forme plus courte devient irrsistible. Dans ce cas, le terme comptitive
appliqu lactivation devrait toujours tre plac entre guillemets, et son utilisation
dans n'importe quel contexte devrait toujours saccompagner dune explication sur
sa signification. Une meilleure solution consiste utiliser le terme spcifique
la fois pour lactivation et pour linhibition, quand les deux types deffets sont
considrs, mme si le terme plus familier dinhibition comptitive est conserv
lorsque lactivation nest pas considre.
Le type le plus simple dactivation qui soit plausible dun point de vue mcanique
est la contrepartie de linhibition mixte, comme prsent dans la figure 5.13. Dans
ce cas, lactivateur nest pas ncessaire
k'1 k'2 pour la fixation du substrat, mais seule-
A + EX EAX EX + P
k'1 ment pour la catalyse.
KX K'X
k1
A+E EA
+ k1 + 5.13 - Mcanisme produisant
X X une activation mixte
Lquation de vitesse est analogue celle de linhibition mixte :

V' [ A ]
v = [5.31]
K K'
K'm 1 + X + [ A ] 1 + X
[ X ] [ X ]
et fournit des expressions analogues pour les paramtres apparents (voir quations
[5.8] [5.10]) :
V app = V' [5.32]
K'X
1+
[X]
K
Km 1 + X
[ X ]
Kmapp = [5.33]
K'
1+ X
[X]
V'
V app K'm
= [5.34]
Kmapp 1+ X
K
[X]
Essentiellement les mmes graphiques et les mmes mthodes peuvent tre utiliss
pour tudier les phnomnes dactivation que ceux utiliss pour tudier les ph-
nomnes dinhibitions linaires ( 5.3), en remplaant partout [ I ] par 1 [ X ] , Kic
par 1 KX et K i u par 1 K'X . Par exemple KX peut tre dtermin partir dun
graphique analogue du graphique de DIXON dans lequel 1 v est port en graphique
en fonction de 1 [ X ] pour deux ou plusieurs concentrations de A ; labscisse du
point dintersection des droites rsultantes donne 1 KX .
5.6.3. Activation et inhibition hyperboliques
En pratique, les activateurs se comportent souvent dune manire plus complexe

que celle suggre par lquation [5.31], parce quune certaine activit peut
persister en absence dactivateur. Si cela est le cas, mais que les constantes de
vitesse des deux formes de lenzyme sont diffrentes, le mcanisme peut tre
reprsent par le modle de la figure 5.14.
k'1 k'2
Ce mcanisme peut produire une inhibition A + EX EAX EX + P
ou une activation hyperbolique ou une k'1
combinaison des deux. Tous les mca- KX K'X
nismes simples dinhibition et dactivation
(except pour linhibition par le produit) k1 k2
A+E EA E+P
sont des cas spciaux de ce type de + k1 +
mcanisme. X X
5.14 - Mcanisme gnral de modification de lactivit
Plusieurs points importants sont noter au sujet de ce mcanisme. Premirement,

les tapes de dissociation de lactivateur ne sont pas des culs-de-sac et donc ne sont
pas obligatoirement lquilibre. Cependant si cela est pris en compte, le
comportement cintique devient plus compliqu et donc pour la discussion qui suit,
nous considrerons des quations de vitesse dans le cas o les tapes de
dissociation du substrat et de lactivateur sont lquilibre. Deuximement, le
schma ne reprsente pas obligatoirement un mcanisme dactivation : il peut
galement reprsenter un mcanisme dinhibition si le complexe EX est moins
ractionnel que lenzyme libre. En ralit, la situation est mme plus complexe
puisque les conditions, qui dcident si X est un activateur ou un inhibiteur, peuvent
varier en fonction de la gamme considre de concentration du substrat : si
k 2 > k' 2 , alors X est inhibiteur aux concentrations leves de substrat ; si
k1 k 2 ( k 1 + k 2 ) > k'1 k' 2 ( k' 1 + k' 2 ) alors X est inhibiteur aux concentrations
faibles de substrat ; ce nest que si ces deux ingalits sont vrifies que le
comportement est consistant sur toute la gamme de concentration du substrat. Pour
tenir compte de cette dualit possible dans le comportement cintique, le modle de
la figure 5.12 peut tre qualifi de mcanisme gnral de modification, o
modification est un terme qui reprend la fois linhibition et lactivation.
Une analyse complte du mcanisme fait apparatre que les graphiques de 1 V app
et de Kmapp V app en fonction de la concentration dinhibiteur ( [ I ] ) ou de la rci-
proque de la concentration dactivateur ( 1 [ X ] ) ne sont pas des droites mais des
hyperboles rectangulaires, et pour cette raison, ces comportements sont appels
activation hyperbolique et inhibition hyperbolique 5. Tout ceci peut sembler trop
5. Les termes dactivation partielle ou dinhibition partielle sont quelquefois utiliss

pour souligner le fait quune certaine activit persiste mme en absence complte
dactivateur ou saturation dinhibiteur.
compliqu pour une prsentation lmentaire (mme sans se proccuper du fait que
ltape de fixation ne devrait pas tre strictement traite comme un quilibre).
Nanmoins les effets hyperboliques ne devraient pas tre oublis compltement et
la figure 5.14 reprsente un mcanisme trs plausible que nous devrions nous
attendre appliquer de nombreux cas rels. Le fait quextrmement peu
dexemples (spcialement dinhibition hyperbolique) aient t publis, reflte plus
probablement un manquement reconnatre ce type de comportement que
lauthentique raret de ce comportement. Les effets hyperboliques ne sont pas
difficiles reconnatre exprimentalement, mais les symptmes sont souvent
carts comme une complexit mal accueillie. Il est important dutiliser une
gamme suffisamment large de concentrations dinhibiteur ou dactivateur pour
dterminer si la vitesse de la raction tend vers zro aux concentrations leves
dinhibiteur ou aux concentrations faibles dactivateur. En particulier, il faut
vrifier que les graphiques linaires attendus sont en ralit des droites ; toute
courbure systmatique devrait tre vrifie et si elle est confirme, il est probable
quelle indique des effets hyperboliques.
5.7. PRPARATION DES EXPRIENCES DINHIBITION
Avant de nous embarquer dans une discussion de la prparation des expriences

dinhibition, nous devons commenter la raison pour laquelle cette section intervient
aprs celle expliquant comment les expriences sont analyses ( 5.2 et 5.3). Comme
la prparation doit obligatoirement prcder lanalyse dans la ralisation dune
exprience, il semblerait plus logique de discuter de ces deux aspects du problme
dans cet ordre. Cependant, lexprience montre que le moyen le plus efficace
dapprendre comment prparer une exprience est dtre confront aux problmes
poss par lanalyse de donnes provenant dexpriences mal prpares, qui ont t
ralises sans quaucune attention nait t apporte au type dinformation recher-
che. De plus, il est ncessaire dacqurir une certaine connaissance des mthodes
danalyse avant de matriser pleinement les principes de la prparation.
Deux buts principaux sont recherchs dans des expriences dinhibition : identifier
le type dinhibition et estimer les valeurs des constantes dinhibition. Si lexp-
rience est soigneusement prpare, il est souvent possible datteindre ces deux buts
simultanment. Nous supposerons initialement que linhibition est linaire et que
les relations donnes dans le tableau 5.1 sappliquent, puisque celles-ci sapplique-
ront trs certainement en premire approximation et quil est toujours prfrable de
caractriser le comportement simple avant dessayer de comprendre certaines
complexits du mcanisme.
Il est vident, partir du tableau 5.1, que toute composante comptitive de
linhibition se manifestera principalement aux faibles concentrations de substrat,
puisque les inhibiteurs comptitifs diminuent la valeur apparente de V Km , qui
caractrise les cintiques faibles concentrations de substrat ; inversement, toute

composante anti-comptitive se manifestera principalement aux concentrations
leves de substrat. Il est donc clair que linhibition ne peut tre compltement
caractrise que si elle est mesure la fois pour des concentrations faibles et
leves de substrat. En consquence, des conditions idales pour caractriser
lactivit dun enzyme peuvent se rvler insatisfaisantes pour tudier sa rponse
vis--vis dun inhibiteur. Par exemple, un calcul simple montre quun inhibiteur
comptitif prsent une concentration gale sa constante dinhibition diminue la
vitesse mesure par moins de 10% si [ A ] = 10 Km ; bien quun effet de cet ordre de
grandeur devrait tre facilement dtect dans une exprience, il pourrait tre
considr comme insignifiant sil nest pas ralis que cet effet est beaucoup plus
important aux faibles concentrations de substrat.
Tout comme dans une exprience simple ralise en absence dinhibiteur, il est
prudent dinclure des valeurs de [ A ] allant de 0,2 Km jusqu des concentrations
aussi leves que possible ( 4.3.1), il est souhaitable dans une exprience
dinhibition dutiliser des concentrations dinhibiteur qui stendent de 0,2 K ic ou
de 0,2 Kiu (dpendamment de celle dont la valeur est la plus faible) jusqu des
concentrations aussi leves que possible, pour autant que la vitesse ne soit pas trop
faible pour tre mesure prcisment. Pour chaque valeur de [ I ] , des valeurs de
[ A ] doivent tre choisies comme dcrit dans le 4.3.1, mais en utilisant comme
rfrence Kmapp et non K m. En effet, ce sont les valeurs apparentes des constantes
cintiques qui caractrisent le comportement cintique pour chaque concentration
dinhibiteur et non les valeurs relles. Un exemple simple du choix de conditions
exprimentales est prsent dans le tableau 5.3, qui montre quil nest pas nces-
saire dutiliser un mme ensemble de valeurs de [ A ] pour chaque concentration
dinhibiteur ou un mme ensemble de valeurs de [ I ] pour chaque concentration
de substrat. Une telle pratique signifierait trs certainement quune partie des
expriences ralises fournirait peu dinformation utile. Malgr cela, pour prsenter
les rsultats sous la forme dun des graphiques dcrits dans le 5.3, il est utile de
raliser des mesures pour des gammes communes de valeurs de [ A ] et de [ I ]
dans chaque exprience, de sorte quun nombre raisonnable de points apparaissent
sur chaque droite, que [ A ] soit utilis comme abscisse (par exemple pour
dterminer les paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN pour chaque valeur
de [ I ] ) ou que [ I ] soit utilis comme abscisse (par exemple, dans les graphiques
o 1 v ou [ A ] v est port en fonction de [ I ] ). Ainsi, le tableau 5.3 inclut
plusieurs combinaisons qui ne seraient certainement pas incluses si chaque range
du tableau tait considre sparment.
Si ces recommandations sont suivies (comme guide, bien sr, puisque les nombres
particuliers utiliss dans le tableau 5.3 ne sont vraisemblablement pas utilisables
dans un autre exemple), la prsence dune composante hyperbolique dans linhi-
bition devrait tre dcelable sans avoir recours des expriences supplmentaires.
En consquence, il nest pas ncessaire dajouter de commentaire supplmentaire
ceux faits la fin du paragraphe 5.6.3. Le point essentiel consiste inclure des
valeurs de [ I ] qui soient suffisamment leves et nombreuses pour dterminer si la
vitesse tend ou non vers zro lorsque la concentration dinhibiteur approche de la
saturation.
Tableau 5.3 - Prparation des expriences dinhibition
[I] [I]
[ I ] 1+ 1+ Kmapp Valeurs de [A]
Kic Kiu
0 1,0 1,0 1,0 0,2 0,5 1 2 5

0,5 1,25 1,05 1,2 0,2 0,5 1 2 5
1 1,5 1,1 1,4 0,2 0,5 1 2 5 10
2 2,0 1,2 1,7 0,5 1 2 5 10 20
5 3,5 1,5 2,3 0,5 1 2 5 10 20
10 6,0 2,0 3,0 0,5 1 2 5 10 20
20 11,0 3,0 3,7 1 2 5 10 20 50
Le tableau reprsente le choix de concentrations de substrat [A] ncessaire pour

dterminer les constantes dinhibition Kic et Kiu dans une exprience o les valeurs
approximatives sont les suivantes : Km = 1, Kic = 2 et Kiu = 10, en units arbitraires (bien que
les units pour Kiu et Kic sont les mmes). Les valeurs suggres pour [A] sont exprimes
dans les mmes units que Km, et sont choisies pour staler denviron 0,2 Kmapp jusqu
environ 10 Kmapp pour chaque valeur de la concentration dinhibiteur [ I ].
5.8. EFFETS INHIBITEURS DES SUBSTRATS
5.8.1. Fixation non-productive
La majorit des informations dont nous disposons sur les proprits gnrales des
enzymes a t obtenue par ltude dun petit groupe denzymes, les enzymes
extracellulaires catalysant des ractions dhydrolyse, qui comprend la pepsine, le
lysozyme, la ribonuclase, et peut tre le plus notable, la-chymotrypsine. Bien que
cette situation soit moins manifeste quil y a 30 ans, la frquence avec laquelle
la-chymotrypsine est rencontre dans la littrature doit plus au fait que cet
enzyme est considr comme un enzyme typique , que par limportance biolo-
gique quil peut avoir. Ces enzymes partagent certaines proprits qui justifient
pleinement leur utilisation pour des tudes dtailles : ils sont trs abondants,
facilement cristallisables, ils sont stables, monomriques, non-spcifiques et
peuvent tre traits comme des enzymes un seul substrat, puisque le second
substrat est leau. Nanmoins, toutes ces qualits les disqualifient en tant que
reprsentant un enzyme typique , puisque les enzymes sont gnralement
prsents en faible quantit, sont difficiles purifier et cristalliser, sont instables,

souvent oligomriques, hautement spcifiques et catalysent des ractions
plusieurs substrats (hormis leau).
Tous ces enzymes protolytiques partagent une autre caractristique, qui leur
confre indubitablement un dsavantage : leurs substrats naturels sont des
polymres mal dfinis, et en consquence, ils sont presque toujours tudis avec
des substrats artificiels qui sont plus ou moins encombrants que les substrats
naturels. Un problme important est quun enzyme qui est capable de fixer une
macromolcule, est trs certainement capable de fixer une petite molcule de
diffrentes manires. Donc plutt que de former un complexe unique enzyme-
substrat qui se dissocie pour donner des produits, ces enzymes peuvent former
diffrents complexes non-productifs additionnels qui ne donnent pas de produits.
Cette situation est illustre dans la figure 5.15, dans lequel AE reprsente tous les
complexes non-productifs qui peuvent tre produits.
AE
A est un substrat de la raction, mais en
plus de son mode correct de fixation qui Ki
produit le complexe EA dans lequel A subit
la raction de conversion en P, il peut gale- k1 k2
A+E EA E+P
ment se fixer incorrectement pour donner le + k1
complexe AE dans lequel A ne peut ragir. A
5.15 - Fixation non-productive
Ce schma est le mme que celui de linhibition linaire comptitive (figure 5.2)
dans lequel linhibiteur est remplac par le substrat, et lquation de vitesse est
analogue lquation [5.3] :
k 2 [ E ]0 [ A ]
v = [5.35]
k 1 + k 2 [ A ]
1 + + [ A]
k1 Ki
Si les valeurs recherches des paramtres cintiques sont dfinies comme les
valeurs que ceux-ci auraient si aucun complexe non-productif ntait form, cest-
-dire que V exp = k 2 [ E ]0 et Kmexp = ( k 1 + k 2 ) k1 (voir les constantes pH-
indpendantes dans le 8.3.3), alors lquation [5.35] peut tre arrange sous la
forme dune quation de MICHAELIS et MENTEN :
V [ A]
v = [5.36]
Km + [ A ]
avec les paramtres dfinis de la manire suivante :
V = V exp [5.37]
K exp
1+ m
Ki
Kmexp
Km = [5.38]
K exp
1+ m
Ki
exp
V = V exp [5.39]
Km Km
Ainsi ce mcanisme obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, et les cintiques
observes ne fournissent aucune indication sur limportance de la fixation non-
productive. Malheureusement, les valeurs qui ont un intrt pour lexprience, sont
gnralement celles qui concernent le chemin productif. Les valeurs mesures, V et
K m , peuvent tre plus petites, dune quantit inconnue et non-mesurable, que les
grandeurs recherches. Seul le paramtre V Km donne une mesure correcte des
proprits catalytiques de lenzyme.
Pour les enzymes hautement spcifiques, une fixation non-spcifique savre peu
plausible et peut donc tre exclue, mais pour les enzymes non-spcifiques, comme la
chymotrypsine, la comparaison des rsultats obtenus avec plusieurs substrats peut
parfois fournir une preuve de lexistence dun tel phnomne. Ainsi par exemple,
INGLES et KNOWLES (1967) ont mesur les vitesses dhydrolyse dune srie dacyl-
chymotrypsines, en mesurant des valeurs de k0 pour lhydrolyse catalyse par la
chymotrypsine des esters de p-nitrophnol correspondants, dans laquelle ltape de
dacylation, cest--dire dhydrolyse de lintermdiaire acyl-chymotrypsine, est ltape
qui limite la vitesse.
Tableau 5.4 - Complexes non-productifs dans la catalyse par la chymotrypsine
k0
Groupe acyle k0 (s1) kOH (M1 s1) (M)
kOH
Actyl-L-tryptophanyl- 52 0,16 330

Actyl-L-phnylalanyl- 95 0,54 150
Actyl-L-leucyl- 5,0 0,35 14
Actylglycyl- 0,30 0,51 0,58
Actyl-D-leucyl- 0,034 0,35 0,097
Actyl-D-phnylalnyl- 0,015 0,54 0,027
Actyl-D-tryptophanyl- 0,0028 0,16 0,018
Le tableau montre des donnes dINGLES et de KNOWLES (1967) pour lhydrolyse catalyse
par la chymotrypsine desters de p-nitrophnol de divers acides amins actyls. Pour
ces substrats, lhydrolyse des actyl-amino-acyl-chymotrypsines correspondantes limite
la vitesse, et donc les valeurs mesures de la constante catalytique k0 sont en ralit
des constantes de premier ordre pour cette raction dhydrolyse. Les valeurs sont
compares avec les constantes de vitesse de second ordre kOH pour lhydrolyse catalyse
par la base des esters de p-nitrophnol des drivs benzyloxycarbonyles des acides amins
correspondants.
Lanalyse des rsultats (tableau 5.4) est complique par le fait que les divers groupes
acyles nont pas la mme ractivit vis--vis des nuclophiles. INGLES et KNOWLES ont
donc mesur les constantes de vitesse pour lhydrolyse de ces diffrents esters,
catalyse par lion hydroxyde. En divisant la constante de vitesse pour la raction
catalyse par la chymotrypsine par la constante de vitesse pour la raction catalyse par
la base, un profile plus intressant est apparu : lordre de ractivit des substrats
spcifiques de type L tait exactement linverse de celui des plus mauvais substrats de
type D cest--dire : Ac-L-Trp > Ac-L-Phe >> Ac-L-Leu >> Ac-Gly >> Ac-D-Leu >>
Ac-D-Phe > Ac-D-Trp. Lexplication la plus simple est lexistence dune fixation non-
productive : pour les groupes acyles ayant la configuration correcte L, les chanes
latrales volumineuses et hydrophobes assurent une fixation ferme et rigide dans le
mode correct, liminant la possibilit de former des complexes non-productifs, mais
pour les groupes acyles de configuration D, les mmes chanes latrales favorisent une
fixation ferme et rigide dans des modes non-productifs.
La fixation non-productive nest habituellement pas voque dans le contexte de
linhibition des enzymes et nest mme gnralement jamais considre, mais elle
suit exactement le mme mcanisme que celui qui est le plus couramment
considr pour reprsenter linhibition comptitive. Il est donc important de tenir
compte de cette possibilit lorsque les rsultats obtenus avec diffrents substrats
sont compars dans le cas dun enzyme non-spcifique. Le terme inhibition par le
substrat est gnralement rserv pour lanalogue anti-comptitif de la fixation
non-productive dont nous allons discuter dans la section suivante.
5.8.2. Inhibition par le substrat
Pour certains enzymes, il est possible quune seconde molcule de substrat se fixe
sur le complexe enzyme-substrat, EA, pour
donner un complexe inactif, AEA, comme AEA
prsent dans la figure 5.16.
Ksi
5.16 - Mcanisme produisant une k1 k2

A+E EA E+P
inhibition par le substrat, cest--dire k1 +
une inhibition par excs de substrat A
Le mcanisme est analogue celui qui est habituellement envisag pour expliquer
linhibition anti-comptitive ( 5.2.3), et lquation de vitesse a la forme suivante :
k 2 [ E ]0 [ A ] V' [ A ]
v = = [5.40]
k 1 + k 2 [ A] [ A ]2
+ [ A ] 1 + K'm + [ A ] +
k1 Ksi Ksi
o V ' et K'm sont dfinis respectivement comme k 2 [ E ]0 [ A ] et ( k 1 + k 2 ) k1 ,
cest--dire quils satisfont aux dfinitions habituelles des paramtres de MICHAELIS
et MENTEN pour le mcanisme simple deux tapes ( 3.3) ; nanmoins, ces
paramtres sont dsigns avec un prime parce quils ne sont pas des paramtres de
MICHAELIS et MENTEN, puisque lquation [5.40] nest pas une quation de
MICHAELIS et MENTEN. La prsence du terme en [ A ] 2 implique que la vitesse
tend vers zro et non vers V ' pour des valeurs leves de [ A ] , et que K'm nest
pas gal la concentration de A pour laquelle v = V ' 2 . La courbe de v en fonction
de [ A ] est reprsente dans la figure 5.17, avec les graphiques correspondants de
[ A ] v en fonction de [ A ] et de 1 v en fonction de 1 [ A ] ; ces deux derniers
graphiques ne sont pas des droites mais adoptent lallure respectivement dune
parabole et dune hyperbole. Toutefois, si K si est beaucoup plus grand que K'm
(comme cest habituellement le cas), ils sont suffisamment linaires aux faibles
valeurs de [ A ] pour que V ' et K'm soient estims partir de ceux-ci de la faon
habituelle.
v a 1/v b
1,0 Aucune inhibition 3
par le substrat
2
0,8
1
Effet de l'inhibition
0,6 par le substrat
1 0 1 2 1/[A]
0,4
[A]/v c
6
Maximun pour [A] = (K'mKsi )1/2
4
0,2
2
0
0 2 4 6 8 [A] 2 0 2 4 [A]
5.17 - Inhibition par le substrat
Les courbes en trait continu ont t calcules partir de lquation [5.40] en utilisant les
valeurs suivantes : K'm = 1, V' = 1 ; Ksi = 30. Les pointills ont t calculs partir de
lquation de MICHAELIS et MENTEN en utilisant les valeurs suivantes : Km = 1, V = 1, sans
inhibition par le substrat. (a) Dans le graphique direct de v en fonction de [A], le maximum
est obtenu quand [A] 2 = K'm Ksi. Les petits graphiques en insert montrent lapparence des
graphiques (b) de 1/v en fonction de 1/[A] et (c) de [A]/v en fonction de [A]. Limpression
selon laquelle le graphique (b) prsente linhibition plus clairement que le graphique (c) est
une illusion, provenant du fait que la courbe (b) se prolonge jusque 1/[A] = 0,167, cest--
dire une valeur de [A] = 60, alors que dans (c), elle sarrte une valeur de [A] = 5.
En gnral, la probabilit de reconnatre lexistence dune inhibition par le substrat dpend
plus de la gamme des donnes qui sont portes en graphique que du type de graphique
utilis.
Pour raliser une analyse de lensemble du phnomne et dterminer les para-

mtres cintiques des diffrentes tapes, il est toutefois recommand dutiliser un
ajustement paramtrique non-linaire en utilisant lquation [5.40]. Linhibition par
le substrat nest gnralement pas importante si les concentrations de substrat sont
maintenues infrieures ou gales aux concentrations physiologiques (bien quil existe
dimportantes exceptions, comme par exemple avec la phospho-fructokinase), mais
elle peut devenir prpondrante aux concentrations leves de substrat et fournir ainsi
un lment diagnostique utile pour distinguer entre les chemins possibles de raction,
comme nous en discuterons dans le 6.6.
5.9. LA MODIFICATION DUN GROUPE DE LENZYME COMME UN

MOYEN DIDENTIFIER LES GROUPES ESSENTIELS
Lidentification des groupes essentiels dun enzyme constitue une tape importante
dans la caractrisation du mcanisme catalytique et une pratique courante consiste
dduire la nature des groupes impliqus dans la catalyse enzymatique en dter-
minant si lactivit de lenzyme est affecte lorsque certains rsidus sont modifis.
Malheureusement, le fait quun rsidu particulier soit essentiel pour lactivit cata-
lytique ne garantit pas quil joue un rle quelconque dans le processus catalytique ;
il peut, par exemple, tre essentiel pour maintenir la structure active de lenzyme.
Il existe aujourdhui, deux manires de modifier spcifiquement certains rsidus.
La plus ancienne consiste le modifier chimiquement par raction avec un ractif
spcifique. Cette mthode a rendu de trs grands services dans lidentification des
rsidus essentiels des sites actifs et peut encore tre trs utile. De nombreux ractifs
sont disponibles pour modifier spcifiquement certains rsidus dacide amin
(MEANS et FEENEY, 1971), ainsi par exemple, de nombreuses protases extracellu-
laires comme la chymotrypsine ont un rsidu srine essentiel dans leur site actif qui
peut tre mis en vidence par raction avec le diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP).
Aujourdhui cependant, grce aux dveloppements de lingnierie gntique, cette
approche a t largement supplante par la mutagense dirige qui permet de rem-
placer spcifiquement un acide amin par nimporte quel autre acide amin. De
nouvelles approches ont galement t dveloppes qui permettent lintroduction
dacides amins non-naturels dans les protines (LIU et SCHULTZ, 1999 ; CHIN
et al., 2003) et nous pouvons penser que le dveloppement commercial de ces
techniques ne devrait pas tarder, ce qui donnera encore plus de libert dans ce type
dexpriences.
TSOU (1962) a tabli les bases thoriques pour interprter les rsultats dexp-
riences de modifications chimiques, mais cet article nest pas suffisamment connu
et en pratique la logique utilise pour interprter ces expriences est souvent floue
ou inexistante. Le cas le plus simple qui puisse tre considr est celui dans lequel
l groupes sur chaque monomre denzyme ragissent la mme vitesse avec

lagent de modification et o m de ces l groupes sont essentiels pour lactivit
catalytique. Aprs modification dun nombre moyen de g groupes par molcule, la
probabilit que chaque groupe particulier ait t modifi est de g l , et la proba-
bilit quil ne soit pas affect est de 1 ( g l ) . Pour que la molcule denzyme
conserve son activit, aucun des m groupes essentiels ne doit tre modifi, une
[ ]
m
situation dont la probabilit est donne par 1 ( g l ) . Donc la fraction a de
lactivit qui persiste aprs la modification de g groupes par molcule denzyme est
donne par :
m

= 1 [5.38]

Ds lors, 1 m = 1 [5.39]

et un graphique de a1/m en fonction de g devrait tre linaire. Initialement, nous ne
connaissons pas la valeur de m qui doit tre utilise pour tracer ce graphique, mais
en traant les graphiques de a , a1/2, a1/3 en fonction de g il est possible de
dterminer la valeur pour laquelle le graphique est le plus linaire.
Une objection ce traitement est que toute les ractions de modification ne se
droulent pas ncessairement la mme vitesse et quelles ne sont pas ncessai-
rement indpendantes les unes des autres, cest--dire que la modification dun
groupe peut affecter les vitesses auxquelles les groupes voisins sont modifis.
Larticle de TSOU devrait tre consult pour une discussion complte des compli-
cations possibles, mais deux classes supplmentaires de groupes peuvent tre
incorpores dans lanalyse sans quelle ne perde sa simplicit. Sil y a x groupes
non-essentiels qui ragissent rapidement en comparaison des groupes essentiels,
ceux-ci contribueront substantiellement dans la partie initiale du graphique (quelle
que soit la valeur de m) dans laquelle la valeur de a1/m ne varie pas lorsque g
augmente. De plus, des groupes, essentiels ou non, qui ragiraient beaucoup plus
lentement que les autres groupes essentiels, ne seraient pas modifis de faon
apprciable jusqu ce que la plus grande partie de lactivit ne soit perdue ; ceux-
ci sont difficiles ou impossibles dtecter. En pratique, un graphique de TSOU
ressemblera probablement celui prsent dans la figure 5.18, qui a t utilis par
PATERSON et KNOWLES (1972) afin de dmonter que deux groupes carboxyliques
taient essentiels pour lactivit de la pepsine, que trois groupes non-essentiels
taient modifis trs rapidement dans leurs expriences et que les deux groupes
essentiels appartenaient une classe contenant 10 groupes qui taient modifis
des vitesses similaires.
La pepsine est un enzyme monomrique, mais lanalyse de TSOU peut tre facile-
ment tendue ltude denzymes multimriques condition que les sous-units
ragissent indpendamment avec lagent chimique et que linactivation dune sous-
unit naffecte pas lactivit des autres. En faisant ces hypothses, les enzymes
multimriques peuvent tre traits de la mme manire que les enzymes
monomriques, except que m reprsente alors le nombre de groupes essentiels par
sous-unit, mme si l, g et x sont toujours dfinis par monomre (NORRIS et
BROCKELHURST, 1976).
f 1/nessentiel
3 groupes non-essentiels nessentiel = 3
rapidement modifis
nessentiel = 2
nessentiel = 1
1
0,5
13 groupes
modifis
0
0 3 6 9 12 15
Nombres de groupes modifis
5.18 - Le graphique de TSOU pour la dtermination du nombre
de groupes essentiels dans un enzyme
Le graphique prsente les donnes de PATERSON et KNOWLES (1972) pour linactivation de la
pepsine par le trimethyloxonium fluoroborate, un ractif qui ragit spcifiquement avec les
groupes carboxyliques. La variable F reprsente la fraction de lactivit persistant aprs la
modification du nombre de groupes montrs, et est augmente une puissance 1/m, o
m = 1, 2 ou 3. La droite observe avec m = 2 indique quau moins 2 groupes carboxyliques
sont essentiels pour lactivit de la pepsine, parmi un total de 13 groupes modifis. La
droite horizontale au dbut du graphique indique quil y a trois groupes ragissant
rapidement qui ne sont pas ncessaires pour lactivit catalytique.
Les groupes importants du site actif peuvent galement tre mis en vidence dans
des expriences de protection par un substrat ou par un inhibiteur comptitif. En
effet, en prsence dun substrat ou dun inhibiteur comptitif une concentration
suffisamment leve pour que lenzyme existe essentiellement sous la forme de
complexe enzyme-substrat ou enzyme-inhibiteur, les rsidus du site actif sont pro-
tgs et la raction de modification par un agent chimique ne peut pas se drouler.
Dans le pass, la tentative didentification dun groupe modifi tait souvent suivie
par lhydrolyse partielle de la protine et le squenage du fragment peptidique
contenant le rsidu modifi, dans lespoir dobtenir des informations sur la
structure du site catalytique. Les techniques modernes dingnierie gntique ont
largement supplant cette approche chimique, mais il reste profitable de les

complmenter par une analyse cintique des proprits des mutants artificiels qui
sont produits. Avec des mutants de structure connue, il est possible de prdire
exactement comment le graphique de TSOU devrait tre modifi par une mutation
particulire et la vrification exprimentale quil est modifi de cette manire est
une faon de confirmer lexactitude de linterprtation.
PROBLMES
5.1 - Les paramtres pour linactivation la plus rapide mesure dans les
expriences de KITZ et WILSON (1962) taient k2 = 5 103 s1 , Ki = 0,1 mM,
pour le mcanisme prsent dans lquation [5.1]. En supposant que K i
peut tre exprim comme ( k 1 + k 2 ) k1 , quelle grandeur devrait avoir k2
pour que cette expression soit suffisamment diffrente de la constante
dquilibre ( k 1 k1 ) suppos par KITZ et WILSON ? Quelle lumire est
apporte par le fait que les constantes de vitesse de second ordre pour la
fixation spcifique de petites molcules sur des protines ont typique-
ment des valeurs de lordre de 106 M1 s1 ou suprieures ?
5.2 - Les tudes initiales dune estrase utilisant un mlange racmique du
substrat ont rvl que lnantiomre L est le rel substrat, puisquil tait
entirement converti en produit alors que lnantiomre D pouvait tre
rcupr la fin de la raction. Sur la base de ce rsultat, les cintiques
de ractions ont t analyses en supposant que lnantiomre D na
aucun effet sur lenzyme, et une valeur de 2 mM a t estime pour la
constante de MICHAELIS de lnantiomre L. La suite du travail a tabli
quil aurait t plus raisonnable de considrer lnantiomre D comme
un inhibiteur comptitif avec K ic gal au K m pour lnantiomre L.
Comment lestimation originale de K m peut-elle tre rvise pour tenir
compte de cette information ?
5.3 - Les donnes suivantes montrent que les vitesses initiales (exprimes en
units arbitraires) mesures pour une raction catalyse par un enzyme
diffrentes concentrations respectivement dinhibiteur, [ I ] , et de
substrat, [ A ] .
[ I ] (mM) [ A ] = 1 mM [ A ] = 2 mM [ A ] = 3 mM
0 2,36 3,90 5,30
1 1,99 3,35 4,40
2 1,75 2,96 3,98
3 1,60 2,66 3,58
4 1,37 2,35 3,33
Quelle information peut tre dduite sur le type dinhibition implique ?

Comment pourrions-nous raliser une exprience afin de mettre ceci
plus clairement en vidence ?
5.4 - Le tableau suivant prsente les donnes de NORRIS et BROCKLEHURST
(1976) pour leffet sur lactivit de lurase de la modification par le
2,2-dipyridyl-disulphide, un compos qui ragit spcifiquement avec les
groupes thiols. Le nombre de groupes modifis par molcule et lactivit
relative vis--vis de lenzyme non-trait sont respectivement donns par
g et a. En supposant que lurase a six sous-units par molcule qui
agissent indpendamment la fois pour la raction catalytique et pour la
raction de modification, estimer
a - le nombre de groupes thiols essentiels par sous-unit et
b - le nombre de groupes thiols non-essentiels qui sont modifis rapide-
ment par comparaison avec les groupes essentiels.
g a g a g a
0,0 1,000 23,0 0,957 27,0 0,547
2,0 1,000 24,0 0,896 27,5 0,442
4,0 1,000 25,0 0,853 28,0 0,353
18,0 1,000 25,5 0,799 28,5 0,198
20,0 1,000 26,0 0,694 29,5 0,104
22,0 0,982 26,5 0,597 30,0 0,011
5.5 - Les symboles Kis et Kii sont parfois utiliss pour reprsenter les constantes
dinhibition qui sont symbolises dans ce chapitre respectivement par Kic
et Kiu. Dans ce cas, les seconds indices s et i font respectivement rfrence
la pente (slope en anglais) et lintersection avec laxe (intercept en
anglais) puisque leur valeur sont obtenues en portant en graphique les
pentes ou les ordonnes lorigine obtenues dans lun des graphiques
dcrits dans le 3.5 en fonction de la concentration dinhibiteur.
a - A quel graphique primaire ceci fait-il rfrence ?
b - Quelle intersection (avec laxe des abscisses ou celui des ordonnes)
doit tre utilise ?
c - Sous quelle forme la constante dinhibition apparat-elle dans le
graphique secondaire ?
5.6 - Le potage traditionnel japonais Katsuobushi doit sont parfum caractris-
tique lacide 5-inosinique, un produit de dgradation de lARN qui
rsulte de la fermentation dun poisson par un champignon. Les tudes
dune nuclase provenant dune espce dAspergillus (ITO, MATSUURA et
MINAMIURA, 1994) ont fourni les paramtres cintiques suivants pour
lhydrolyse de diffrents monophosphates de dinuclotide :
C-A U-A G-A A-A A-G A-C A-U

Km (mM) 1,00 1,03 1,10 0,803 0,437 0,495 2,61
V (M min )1
11,5 10,4 8,78 13,2 9,81 11,6 11,8
En supposant que le comportement des liaisons dans les monophos-

phates de dinuclotide est reprsentatif de celui des mmes types de
liaisons dans lARN, quel type de liaison (des sept prsents) serait
hydrolys le plus rapidement durant la digestion de lARN par lenzyme ?
5.7 - Les donnes suivantes se rapportent lhydrolyse de diffrents tripeptides
librant lacide amin N-terminal et le dipeptide C-terminal, catalyse par
laminotripeptidase de lintestin pH 7,0 et 37C (donnes de DOUMENG et
MAROUX, 1979) :
Substrat k0 (s1) Km (mM)

L-Pro-Gly-Gly 385 1,3
L-Leu-Gly-Gly 190 0,55
L-Ala-Gly-Gly 365 1,4
L-Ala-L-Ala-L-Ala 298 0,52
a - Quel substrat serait hydrolys le plus rapidement dans les premiers

instants de la raction si un chantillon denzyme est ajout un
mlange des quatre substrats des concentrations quimolaires ?
b - Quand L-Ala-Gly-Gly est tudi en tant quinhibiteur de lhydrolyse de
L-Pro-Gly-Gly, une constante dinhibition comptitive de 1,4 mM est
mesure. Cette valeur est-elle en accord avec lide que lenzyme
comporte un seul site actif o les deux substrats sont hydrolyss ?
5.8 - Pour un rapport donn de concentration dinhibiteur sur la constante
dinhibition approprie, une inhibition comptitive rduit plus fortement
la vitesse quune inhibition anti-comptitive si la concentration de sub-
strat est infrieure au Km ; linverse est vrai si la concentration de substrat
est suprieure au Km. Dmontrer cette relation de manire algbrique et
l'expliquer conceptuellement, cest--dire sans faire rfrence lalgbre.
5.9 - Si deux inhibiteurs I et J agissent comme des inhibiteurs comptitifs
avec des constantes dinhibition donnes respectivement par Ki et Kj
quand ils sont tudis sparment, leur effet combin lorsquils sont
prsents simultanment peut tre exprim par une quation du type de
celle-ci :
V [ A]
v =
[ I ] [ J ] [ J ]
Km 1 + 1+ + + [ A]
Ki K' j K' j
dans laquelle K'j est la constante de dissociation pour la libration de J

partir dun complexe hypothtique EIJ. Si les graphiques de 1 v en
fonction de [ I ] sont tracs pour plusieurs valeurs de [ J ] , quelle est la
valeur de labscisse correspondant lintersection des diffrentes
courbes ?
Dans ltude de lhexokinase D dans laquelle I etait la N-actylglucosamine,
VANDERCAMMEN et VAN SCHAFTINGEN (1991)ont obtenus des droites parallles
dans de tels graphiques lorsque J tait la glucosamine, et des droites se
croisant sur laxe des abscisses lorsque J tait une protine rgulatrice
spcifique. Quimpliquent ces rsultats au sujet de la valeur de K'j dans ces
cas et au sujet des sites de fixation des trois inhibiteurs ?
5.10- Les tyrosine kinases catalysent la phosphorylation de rsidus tyrosine
particuliers dans les protines. SONGYANG et al. (1995) ont tudis leur
slectivit pour des squences particulires autour du rsidu cible au
moyen dune bibliothque de peptides Met-Ala-Xaa4-Ala-Lys3, dans
laquelle Xaa reprsente nimporte quel acide amin lexception de Trp,
Cys et Tyr. En considrant que les peptides dans la bibliothque ont une
masse molculaire moyenne de 1,6 kDa et un chantillon de 1 mg dans
un volume de 300 L, calculer
a - le nombre de types diffrents de peptide contenu dans lchantillon ;
b - le nombre moyen de molcules contenu dans celui-ci ;
c - la concentration moyenne de chacun.
En comparant cette concentration avec une valeur typique de K m de
5 M pour une tyrosine kinase agissant sur un bon substrat, discuter si
lexprience fournit une indication utile sur la spcificit des enzymes.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS
6.1. INTRODUCTION
La premire partie de ce livre est principalement consacre aux ractions enzyma-

tiques simples n'impliquant qu'un substrat et qu'un produit. En ralit, de telles
ractions sont rares et restent limites quelques ractions d'isomrisation, comme
la conversion du glucose 1-phosphate en glucose 6-phosphate catalyse par la
phosphoglucomutase. La majorit des ractions implique plusieurs substrats et
libre plusieurs produits, mais le dveloppement de la cintique enzymatique de
ces systmes est largement simplifi sur la base de deux constatations :
premirement, de nombreux enzymes hydrolytiques peuvent tre traits comme
des enzymes un seul substrat, parce que le second substrat, l'eau, est toujours
prsent en large excs de sorte que sa concentration peut tre considre comme
une constante ;
deuximement, la majorit des enzymes se comporte comme des enzymes un
seul substrat si la concentration d'un seul substrat varie, comme nous le mon-
trerons partir des quations prsentes dans le 6.5.2.
Une des raisons majeures pour entreprendre une tude de la cintique enzymatique
est de dterminer le mcanisme ractionnel, qui, lorsqu'il s'agit d'tudes ralises
dans des conditions d'tat stationnaire, fait gnralement rfrence l'ordre de
fixation des substrats et de libration des produits. Il existe trois mthodes prin-
cipales d'analyse des cintiques dans ces conditions qui permettent de dterminer
l'ordre dans lequel les substrats sont fixs et l'ordre dans lequel les produits sont
librs : la mesure des vitesses initiales en absence de produit, la caractrisation de
la nature de l'inhibition par le produit et l'utilisation de substrats marqus. Nous
traiterons les deux premires mthodes dans ce chapitre en utilisant une raction
type deux substrats et deux produits :
A + B P + Q [6.1]
Ce type de raction est particulirement commun en biochimie : dans une com-
pilation de toutes les ractions enzymatiques connues, prsente dans Enzyme
Nomenclature (IUBMB, 1992), environ 60% des ractions appartiennent aux trois
premires classes d'enzymes (ractions d'oxydorduction, de transfert de groupe
et d'hydrolyse), qui sont toutes dcrites par le mcanisme de l'quation [6.1].
Des ractions plus complexes ont galement t identifies dans lesquelles quatre
ou cinq substrats peuvent tre impliqus, mais celles-ci peuvent tre la plupart du
temps tudies en gnralisant les principes tablis pour les ractions deux
substrats et deux produits. De plus, mme pour la raction apparemment simple de
l'quation [6.1], de nombreux mcanismes sont possibles et nous nous limiterons
au traitement de quelques cas importants plutt que de traiter exhaustivement ce
problme. Un traitement exhaustif des mcanismes enzymatiques plusieurs
substrats est impensable cause de l'invraisemblable multiplicit des cas rencontrs
dans la nature, mais il est galement inutile puisque le lecteur qui aura acquis les
mthodes de base permettant de traiter les cas simples pourra aisment les adapter
au mcanisme spcifique qu'il tudie.
6.2. CLASSIFICATION DES MCANISMES
6.2.1. Les mcanismes complexe ternaire
Un grand nombre de ractions deux substrats et deux produits sont des ractions de
transfert de groupes et pour discuter des mcanismes possibles de cette raction, il est
prfrable de reprsenter la raction de faon plus explicite que dans l'quation [6.1] :
GX + Y X + GY [6.2]
Ainsi, en remplaant A par GX et B par Y, il apparat clairement que la raction
correspond au transfert du groupe G d'un donneur, GX, vers un accepteur, Y. Dans
la majorit des cas, la ncessit de satisfaire la valence des atomes implique qu'un
autre groupe soit transfr simultanment dans la direction oppose ; par exemple,
lorsque l'hexokinase catalyse le transfert d'un groupe phosphate de l'ATP vers le
glucose, un proton est transfr en sens inverse pour tre directement libr dans la
solution. Gnralement, ce second transfert n'est pas explicitement indiqu dans
l'quation reprsentant la raction. Le formalisme utilis dans l'quation [6.2] a t
introduit par WONG et HANES (1962) dans un article important qui a tabli les
fondements de la classification moderne des mcanismes cintiques. Bien que ce
formalisme soit plus commode pour dcrire les mcanismes, l'criture des ractions
peut devenir trs complexe et, dans la suite de ce manuel, nous continuerons de
reprsenter les substrats et les produits par une seule lettre.
En 1962, WONG et HANES ont montr que tous les mcanismes des ractions de
transfert pouvaient tre considrs comme des cas particuliers d'un mcanisme
gnral. Nanmoins, les enzymes qui ncessitent un mcanisme complet semblent
tre trs rares et, dans les quelques cas o cette situation t rencontre, comme
pour la pyruvate dcarboxylase, il est possible que les donnes aient t mal inter-
prtes (voir WARREN et TIPTON, 1974). En consquence, nous discuterons les
trois mcanismes les plus simples de transfert de groupe comme des cas spars.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS 181
La division principale est faire entre les mcanismes qui impliquent la formation
d'un complexe ternaire, EGXY, ainsi dnomm parce qu'il rassemble l'enzyme et
les deux substrats en un seul complexe, et ceux qui procdent en passant par une
forme substitue de l'enzyme, EG, qui est constitue par l'enzyme et le groupe
transfrer mais aucun des substrats complets. Les premiers chercheurs, comme
WOOLF (1929, 1931) et HALDANE (1930) ont suppos que la raction passait par
un complexe ternaire, et que ce dernier pouvait se former partir de l'un ou l'autre
des complexes binaires EGX et EY. En d'autres termes, les substrats peuvent se lier
l'enzyme dans un ordre alatoire, comme illustr dans la figure 6.1. L'quation
d'tat stationnaire pour ce mcanisme est complexe, et inclut des termes en [ GX ] 2
et [ Y ] , mais GULBINSKY et CLELAND (1968) ont montr que la contribution de
ces termes dans la dfinition de la vitesse est souvent si faible que l'quation de
vitesse exprimentale ne peut tre distingue de celle drive en faisant l'hypothse
que toutes les tapes du mcanisme sont l'quilibre l'exception de la raction de
conversion de EXG-Y en EX-GY. Si cette hypothse est utilise, aucun terme de
concentration n'apparat au carr dans l'quation de vitesse. Par souci de simplicit,
nous adopterons cette hypothse de l'existence d'quilibres rapides pour discuter le
mcanisme de cette raction, bien qu'il soit important de souligner que cette
hypothse est habituellement incorrecte, mme si les observations exprimentales
ne permettent en gnral pas de la rfuter. L'tape de conversion entre EXG-Y et
EX-GY ne peut pas tre dtecte par des mesures l'tat stationnaire, mais il est
logique de la faire apparatre explicitement dans un mcanisme alatoire parce que,
dans la drivation de l'quation de vitesse, cette tape est traite comme l'tape
limitante.
EXG EGY
GX Y X GY
E EXG-Y EX-GY E
GX Complexes ternaires productifs
GY X
Y
EY Complexe ternaire EX
non-productif
X EXY Y
6.1 - Mcanisme complexe ternaire alatoire

La partie prsente en gris au bas de la figure reprsente la voie non-productive qui ne fait
pas partie intgrante du mcanisme mais est souvent implique puisque rien ne l'empche.
Le complexe non-productif EXY n'intervient pas ncessairement dans un mcanisme

alatoire, mais son existence peut tre suppose, parce que si EX et EY sont des
intermdiaires significatifs, il n'y a aucune raison d'exclure la formation d'un com-
plexe EXY. La formation d'un autre complexe non-productif (qui n'est pas montr
dans la figure 6.1) est possible si le groupe transfr G n'est pas trop volumineux :
EXG-GY peut rsulter de la fixation de GY sur EGX ou de GX sur EGY.
Nanmoins, ceci est moins probable que la formation de EXY.
Aujourd'hui, il est gnralement accept que de nombreux enzymes ne se compor-
tent pas comme des matrices rigides, comme le schma de la figure 6.1 l'implique,
mais qu'au contraire les conformations la fois de l'enzyme et du substrat sont
modifies lors de la fixation, en accord avec l'hypothse de l'ajustement induit de
KOSHLAND (1958, 1959 ; voir aussi 3.1.5 et 9.4). Il est ds lors possible que le
site de fixation de l'un des deux substrats n'existe pas sur l'enzyme avant que l'autre
substrat ne soit fix. Dans un tel cas, il y a un ordre obligatoire de fixation, comme
l'illustre la figure 6.2. Si la fois les substrats et les produits sont pris en compte, il
existe quatre ordres possibles, bien que les mcanismes obligatoires impliquant un
ajustement induit suggrent que le second produit doive tre un analogue structural
du premier substrat et que donc seulement deux des quatre possibilits soient vrai-
semblables. Pour les dshydrognases dpendant du NAD, par exemple, les formes
du coenzyme correspondent souvent au premier substrat et au second produit. Pour
les mmes raisons que dans le cas des mcanismes alatoires, le complexe non-
productif EXY a des chances de se former dans les mcanismes obligatoires.
EXG
GX Y
E EXG-Y EX-GY E
Complexes ternaires productifs
GY
X
Complexe ternaire EX
non-productif
EXY Y
6.2 - Mcanisme complexe ternaire ordonn

Formellement, il s'agit du mme mcanisme que le mcanisme alatoire de la figure 6.1 o
des tapes sont supprimes. Pour expliquer pourquoi ces tapes n'ont pas lieu, c'est--dire
pourquoi les substrats doivent se fixer dans un ordre particulier, nous pouvons supposer
que la fixation du premier substrat GX induit un changement de conformation de la
protine qui rend possible l'accs au site de fixation du second substrat Y.
6.2.2. Mcanismes enzyme modifi
Au dbut du dveloppement des cintiques plusieurs substrats, DOUDOROFF,

BARKER et HASSID (1947) ont montr par des tudes d'change isotopique que les
ractions catalyses par la saccharose glucosyltransfrase procdent par l'inter-
mdiaire d'un enzyme substitu plutt que par un complexe ternaire. Depuis lors,
des tudes ralises avec divers enzymes, incluant l'a-chymotrypsine, des trans-
aminases et des flavo-enzymes, ont montr que le mcanisme enzyme modifi,
illustr dans la figure 6.3, est largement rpandu. Dans la forme ordinaire de ce
mcanisme, l'existence d'un complexe ternaire est structurellement impossible
parce que les sites de fixation de X et de Y sont soit identiques, soit superposs.
E-GX EG-X
X
EX GX X
Complexes binaires
non-productifs E EG
GY Y
EY Y
E-GY EG-Y
6.3 - Mcanisme enzyme modifi

Comme dans la figure 6.1, le chemin non-productif, prsent en gris gauche, ne fait pas
partie intgrante du mcanisme.
Par exemple, l'aspartate transaminase catalyse une raction impliquant quatre

anions dicarboxyliques de taille similaire :
glutamate + E-pyridoxal 2-oxoglutarate + E-pyridoxamine
[6.3]
oxaloactate + E-pyridoxamine asparate + E-pyridoxal
Le complexe E-pyridoxal reprsente l'enzyme avec son coenzyme sous la forme de
phosphate de pyridoxal (stricto sensu ce n'est pas un aldhyde mais une aldimine
interne forme par la condensation entre un aldhyde et la fonction amine d'un
rsidu lysine, mais ce dtail n'est pas important dans le cadre de notre discussion)
et le complexe E-pyridoxamine reprsente l'enzyme avec le coenzyme sous la
forme de phosphate de pyridoxamine. Puisque les quatre ractifs ont une structure
similaire, il est raisonnable d'imaginer que les sites de fixation du 2-oxoglutarate et
de l'oxaloactate (X et Y dans le cas gnral) sont virtuellement identiques et que la
seconde moiti de la raction est essentiellement l'inverse de la premire moiti.
Dans ce type de mcanisme, il est habituel que les substrats se fixent la mau-
vaise forme de l'enzyme ; ainsi, par exemple, dans l'quation [6.3] il est difficile
d'imaginer pour le complexe E-pyridoxal une structure qui permette la fixation du

glutamate et exclue celle du 2-oxaloactate. Nous pouvons donc prvoir l'existence
de phnomnes d'inhibition par le substrat en prsence de concentrations leves de
substrat (voir 6.6.4). Ceci est presque toujours vrai pour E, X et Y, comme prsent
dans la figure 6.3, mais peut tre vit par des interfrences d'ordre strique entre les
deux groupes G dans les cas de EG, GX et GY.
Le mcanisme enzyme modifi prsent dans la figure 6.3 est un mcanisme
ordonn, mais cette caractristique est moins notable qu'avec les enzymes com-
plexe ternaire puisqu'il existe un seul ordre possible en accord avec le mcanisme
et qu'il n'existe pas d'alternative o la fixation soit alatoire : mme si X et Y se
fixent sur E, il n'est pas possible que les complexes rsultants se dissocient en GX
ou GY. Les proprits cintiques d'un mcanisme alatoire enzyme modifi ont
nanmoins t analyses tout comme un ensemble d'autres mcanismes qui sont
difficilement conciliables avec la raction chimique (FISHER et HOAGLAND, 1968 ;
SWEENY et FISHER, 1968). La mthode de KING et ALTMAN (1956) pour la driva-
tion des quations cintiques, que nous allons dcrire ci-dessous, peut tre
applique aussi bien des mcanismes raisonnables qu' des mcanismes fantai-
sistes et si nous considrons la cintique comme une branche de l'algbre, essen-
tiellement dconnecte de la chimie, il est probable que nous soyons confronts
un grand nombre de possibilits. Pour cette raison, il est souhaitable de considrer
l'algbre comme un outil au service de la cintique enzymatique et non l'inverse.
Il est galement ncessaire de prciser que les mcanismes cintiques prsents
ci-dessus sont parfois dnomms diffremment. Dans la nomenclature introduite
par CLELAND, les mcanismes ractionnels sont diviss en deux groupes : les
mcanismes squentiels et les mcanismes ping-pong. Dans les mcanismes
squentiels, qui correspondent aux mcanismes complexe ternaire prsents dans
les figures 6.1 et 6.2, l'tape de raction chimique n'intervient qu'aprs formation
d'un complexe entre l'enzyme et l'ensemble des substrats. Dans les mcanismes
ping-pong, qui correspondent au mcanisme enzyme modifi prsent dans la
figure 6.3, la raction chimique se droule aprs la fixation du premier substrat. Le
premier produit ainsi form est libr avant que le second substrat ne se fixe.
6.2.3. Comparaison entre la classification chimique

et la classification cintique
Une fois qu'un mcanisme cintique a t dtermin, il est tentant de le convertir en

un mcanisme chimique, en assimilant les diffrentes tapes cintiques aux diff-
rentes tapes de la raction. Cette pratique, si elle permet parfois d'expliquer
simplement le droulement de la raction chimique, doit cependant tre applique
avec prudence. Ainsi, dans les mcanismes enzyme modifi, le groupe G est
transfr deux fois, premirement du substrat GX vers l'enzyme libre E et ensuite
de l'enzyme substitu vers le second substrat Y. Pour cette raison KOSHLAND
(1954) a introduit le terme de raction double dplacement pour caractriser ce

type de mcanisme. Par analogie, les mcanismes impliquant un complexe ternaire,
dans lesquels le groupe G est transfr une seule fois, sont galement appels
ractions dplacement unique. Cette terminologie est encore parfois utilise,
particulirement dans des contextes autres que cintiques. Cela conduit natu-
rellement considrer la strochimie des ractions de transfert de groupe, qui a
t discute en dtails par KOSHLAND (1954) et qui constitue le sujet du
problme [6.1] la fin de ce chapitre.
L'ide centrale, illustre dans la figure 6.4, est que chaque substitution d'un centre
chiral (habituellement un atome de carbone ou de phosphore) entrane une inver-
sion de configuration de ce centre.
X Y X:
Y:
Y + EGX EGY + X
a - Raction dplacement unique : une seule inversion de configuration
X X:
B: B
E + GX EG + X
Y
B: B
:Y
E + GY EG + Y
b - Raction double dplacement : deux inversions de configuration
6.4 - Aspects strochimiques de la raction de transfert de groupe
Normalement chaque substitution entrane l'inversion de la configuration, et donc un
double dplacement se traduit par la restauration de la configuration originale : exprimen-
talement cela se traduit par la conservation de la configuration.
Donc, les mcanismes impliquant un complexe ternaire devraient s'accompagner

d'une inversion de configuration, alors que les mcanismes enzyme modifi
devraient s'accompagner de la conservation de la configuration (puisque deux
inversions successives restaurent la configuration initiale). Par exemple, les tudes

de l'hexokinase D du foie par rsonance magntique nuclaire (POLLARD-KNIGHT
et al., 1982) ont montr que la catalyse du transfert d'un groupe phosphoryle par cet
enzyme s'accompagne d'une inversion de configuration en accord avec les argu-
ments cintiques impliquant un mcanisme complexe ternaire. Une strochimie
similaire a t dmontre pour d'autres kinases qui sont supposes suivre des
mcanismes impliquant un complexe ternaire, mais certaines kinases, comme la
kinase des nuclosides phosphate, constituent une exception significative : non
seulement la raction se droule avec une rtention de la configuration de dpart
(SHEU, RICHARD et FREY, 1979), mais elle se caractrise par un comportement
cintique typique d'un mcanisme enzyme modifi (GARCS et CLELAND, 1969).
Ainsi, le fait qu'un mcanisme complexe ternaire produise une inversion de
configuration ne signifie pas qu'une inversion de conformation ne puisse tre
explique qu'en terme de mcanisme complexe ternaire : comme SPECTOR (1982)
l'a crit, un n'est pas le seul nombre impair, et tous les arguments strochimiques
gnralement proposs pour valider un mcanisme un seul dplacement sont aussi
bien expliqus par un mcanisme impliquant trois dplacements (ou cinq, ou sept).
Dans le cas de l'actate kinase, l'existence d'un mcanisme impliquant un triple
dplacement a t prouv de faon indubitable (SPECTOR, 1980).
Au cours de l'histoire de l'tude de ces ractions plusieurs substrats et produits, il
a pu sembler qu'il serait possible d'exprimer les rsultats exprimentaux en termes
de quelques gnralisations, par exemple que les kinases suivent systmatiquement
un mcanisme ordre alatoire impliquant un complexe ternaire, alors que les
dshydrognases dpendant du NAD suivent un mcanisme ordre obligatoire
impliquant un complexe ternaire (avec le NADox comme premier substrat et le
NADred comme second produit) et que les transaminases suivent un mcanisme
enzyme modifi. Ce type de classification n'est pas totalement incorrect et il peut
servir de guide lors de la caractrisation d'un nouvel enzyme, mais il est
certainement trop simpliste. Par exemple, l'alcool dshydrognase, obtenue partir
du foie de cheval, a t considre comme l'archtype d'un enzyme suivant un
mcanisme ordre obligatoire impliquant un complexe ternaire ; cependant, on
considre aujourd'hui que cet enzyme fixe ses substrats de manire alatoire mais
qu'il libre ses produits de manire ordonne (HANES et al., 1972). Dans le sens le
plus strict du terme, les mcanismes ordonns complexe ternaire n'existent pas,
mais ils restent utiles pour la discussion.
Il est important de raliser que la squence des vnements suggre par la cin-
tique, comme nous en discutons dans la suite de ce chapitre, ne s'accorde pas
ncessairement avec le mcanisme chimique, c'est--dire avec la squence relle
des vnements molculaires qui se droulent dans le site actif de l'enzyme. D'un
point de vue cintique, un mcanisme complexe ternaire signifie que les deux
substrats doivent tre fixs sur l'enzyme avant que le premier produit ne puisse tre
libr, mais il est parfaitement plausible que le premier produit ne soit libr
qu'aprs que le second substrat se soit fix mme si l'enzyme suit un mcanisme
enzyme modifi. Bien que ce genre de mcanisme semble improbable avec une
raction du type de celle catalyse par une transaminase telle qu'elle est montre
dans l'quation [6.3], o les quatre ractifs sont tellement similaires que l'on
s'attend ce qu'ils se fixent tous sur le mme site, il est moins facile de l'exclure
quand le groupe transfr est volumineux et que les quatre ractifs sont fortement
diffrents les uns des autres.
Bien que l'opration d'un mcanisme enzyme modifi puisse gnralement tre
dmontre par des arguments positifs, comme par l'isolement d'un intermdiaire o
l'enzyme est substitu (une procdure qui est facilement ralisable avec une trans-
aminase), l'opration d'un mcanisme impliquant un complexe ternaire est gnrale-
ment dduite partir d'arguments ngatifs, comme l'impossibilit d'isoler un com-
plexe o l'enzyme est substitu. SPECTOR (1982) suggre que cette conclusion est
toujours vraie (et pas seulement courante). Comme not ci-dessus, il fait remarquer
que les arguments strochimiques pour l'existence d'un mcanisme complexe
ternaire peuvent s'expliquer par un mcanisme impliquant un triple-dplacement, et
il considre comme nave la conclusion selon laquelle un mcanisme impliquant un
seul dplacement est plus simple que celle en impliquant trois ou cinq. De nom-
breuses tches, dans la vie de tous les jours, sont simplifies en les divisant en plu-
sieurs tapes et il est probable que cet argument s'applique galement la chimie
des enzymes (cela est certainement vrai pour les ractions mtaboliques, ou des
ractions difficiles comme le couplage de l'oxydation du palmitate avec la synthse
d'ATP, sont toujours dcomposes en une squence de ractions plus simples).
Conceptuellement, et chimiquement, le problme rencontr avec le mcanisme
complexe ternaire est que l'enzyme n'est pas qu'un simple spectateur. Dans la
figure 6.2, il a au minimum un travail de changement de conformation raliser,
alors que dans le mcanisme de la figure 6.1, l'enzyme ne fait rien de plus que
d'apporter quelques encouragements moraux aux ractifs. Inversement, dans un
mcanisme enzyme modifi (figure 6.3), l'enzyme apparat comme un participant
essentiel dans chaque tape de la raction et, sans l'enzyme, la raction ne serait pas
possible. Il serait erron de penser que la thse de SPECTOR a t gnralement
accepte ; en ralit elle a t reue essentiellement avec indiffrence et mme avec
hostilit. Cependant, nous n'avons pas connaissance de l'existence d'une analyse
srieuse de ses propositions qui justifierait de les carter, et nous pensons qu'elles
doivent recevoir plus d'attention qu'elles n'en ont eu jusqu' prsent. Bien
videmment, il n'est pas possible de rsumer un livre entier en quelques lignes et sa
discussion est bien plus dtaille que nous n'avons pu le mentionner ici.
6.2.4. Reprsentation schmatique des mcanismes
Comme nous l'avons dj mentionn, la manire d'crire les ractions de transfert de

groupe sous la forme GX et Y pour les substrats et X et GY pour les produits est
adquate pour prsenter explicitement le transfert du groupe et pour discuter les

aspects chimiques des mcanismes, mais elle est moins pratique pour l'criture des
quations de vitesse. Dans la suite de ce chapitre, nous reviendrons un systme plus
courant qui consiste reprsenter les substrats par A et B et les produits par P et Q.
Il est galement appropri de mentionner ce stade la manire schmatique de
reprsenter les mcanismes des ractions deux ou plusieurs substrats qui a t
introduite par CLELAND (1963). Dans ce systme, les diffrentes formes de l'en-
zyme sont crites sous une ligne horizontale et des flches verticales sont utilises
pour reprsenter la fixation des substrats et la libration des produits (figure 6.5).
Ce systme permet de reprsenter de manire simple et claire les mcanismes
ordonns et il est largement utilis pour cette raison.
A B P Q
k1 k1 k2 k2 k4 k4 k5 k5
k3
E E
EA EAB k3 EPQ EQ
a - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire)
ordonn dans des conditions d'tat stationnaire
A B P Q
k1 k1 k2 k2 k6 k6 k7 k7
EA k5 EP
E E
EAB k5 EPQ
EB EQ
k3 k3 k4 k4 k8 k8 k9 k9
B A Q P
b - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire)
alatoire dans des conditions d'tat stationnaire
A P B Q
k1 k1 k3 k3 k4 k4 k6 k6
k2 k5
E E
EA k2 FP F FB k5 EQ
c - Mcanisme ping-pong ( enzyme modifi) dans des conditions d'tat stationnaire
6.5 - Reprsentation schmatique des mcanismes enzymatiques selon CLELAND
Cependant, il devient incommode s'il est ncessaire d'incorporer des branchements

ou d'autres complications. Le systme propos par CLELAND utilise galement une
nomenclature particulire qui permet de dfinir le nombre de substrats et de pro-
duits impliqus dans la raction. Pour une raction impliquant un ractif, le terme
uni- est utilis. De la mme manire pour une raction impliquant deux ou trois
ractifs les termes bi- et ter- sont utiliss. Ainsi si une raction deux substrats et
trois produits cette raction est dfinie comme une raction bi-ter. CLELAND utilise
galement des termes diffrents pour dfinir les diffrents types de mcanismes.
Les mcanismes complexe ternaire sont appels mcanismes squentiels et les
mcanismes enzymes modifis sont appels mcanismes ping-pong (figure 6.5).
6.3. DRIVATION DES QUATIONS DE VITESSE

L'TAT STATIONNAIRE
6.3.1. Introduction
En principe, quel que soit le mcanisme, l'quation de vitesse dans des conditions
d'tat stationnaire peut tre drive de la mme manire que pour le mcanisme
deux tapes de MICHAELIS et MENTEN. En pratique cette mthode peut devenir
extrmement fastidieuse et, sauf pour les mcanismes les plus simples, est sus-
ceptible de conduire des erreurs. KING et ALTMAN (1956) ont dcrit une mthode
schmatique, simple et s'appliquant n'importe quel mcanisme, qui consiste en
une srie de ractions entre diffrentes formes d'un enzyme. Elle n'est par contre
applicable ni aux ractions non-enzymatiques, ni aux mlanges d'enzymes, ni aux
mcanismes qui renferment des tapes non-enzymatiques. Nanmoins, elle est
applicable la majorit des situations rencontres dans la catalyse enzymatique et
est trs utile dans la pratique. Nous dcrivons et discutons brivement cette
mthode dans les paragraphes suivants.
La thorie sur laquelle repose la mthode de KING et ALTMAN, est beaucoup plus
complexe que son application pratique et puisqu'il n'est pas ncessaire de com-
prendre la thorie pour l'appliquer, nous nous contenterons ici de donner une
description de l'utilisation de cette mthode et nous renvoyons les lecteurs qui
seraient intresss par la thorie d'autres ouvrages (ENGEL, 1981).
6.3.2. La mthode de KING et ALTMAN
La mthode de KING et ALTMAN est plus simplement expose en considrant un

exemple. Nous avons choisi de considrer comme exemple un des mcanismes
les plus importants parmi les mcanismes deux substrats, le mcanisme ordonn
complexe ternaire qui peut tre crit comme suit, sous la forme d'une srie
d'quations :
k1
E + A EA
k 1
k2
EA + B EAB
k 2
EAB EPQ [6.4]
k3
EPQ EQ + P
k 3
k4
EQ E + Q
k 4
Aucune constante de vitesse n'est indique pour la troisime raction parce que
nous supposons que la vitesse de conversion de EAB en EPQ est suprieure celle
des tapes de fixation. Cette simplification entrane que les mesures l'tat station-
naire ne fournissent aucune information sur les isomrisations entre intermdiaires
qui sont uniquement des ractions de premier ordre. Pour analyser l'quation d'tat
stationnaire, il est ds lors, ncessaire de traiter EAB et EPQ comme une seule et
mme espce, mme s'il peut s'avrer plus instructif en regard du mcanisme de les
considrer comme des espces distinctes.
La premire tape de la mthode de KING et ALTMAN consiste incorporer le
mcanisme dans un schma circulaire qui renferme l'ensemble des espces de
l'enzyme et qui indique les ractions entre ces espces, comme prsent dans la
figure 6.6a pour notre exemple de mcanisme ordonn complexe ternaire. Toutes
les ractions doivent tre traites comme des ractions de premier ordre, ce qui
signifie que les ractions de second ordre, comme la raction E + A EA,
doivent tre caractrises par des constantes de pseudo-premier ordre ; ainsi dans
notre exemple, la constante de second ordre k1 est remplace par la constante de
pseudo-premier ordre k1 [ A ] en incluant la concentration de A.
Dans une deuxime tape, un profil central (figure 6.6b) est dessin qui correspond
l'ossature du schma ractionnel, dans ce cas il s'agit d'un carr. Il est alors
ncessaire d'identifier l'ensemble des profils qui
sont constitus de lignes appartenant au profil central uniquement,
connectent chaque paire de formes de l'enzyme et
ne contiennent aucune boucle ferme.
Chacun de ces profils renferme une ligne de moins que le nombre de formes de
l'enzyme ; dans l'exemple choisi, il existe quatre profils de ce type qui sont
reprsents dans la figure 6.6c.
k1[A]
E+A EA
k1
k4 k4[Q] k2 k2[B]
k3[P] EAB
EQ
k3 EPQ
a - Schma circulaire de la raction b - Profil central driv du schma
c - Ensemble complet des profils de KING-ALTMAN drivs du profil central
d - Exemples de profils qui ne satisfont pas les rgles exposes dans le texte
k1 k1 k1
k2 k4 k2 k4 k4 k2[B]
k3[P] k3 k3
e - Profils avec addition de flches de sorte que chacun se termine en E
et prcisant les constantes de vitesse
6.6 - La mthode de KING et ALTMAN pour driver les quations de vitesse
Chacun de ces profils orients correspond au produit des constantes de vitesse prsent
en dessous.
Dans cet exemple, l'application de ces rgles semble vidente, mais la situation
peut tre diffrente avec des mcanismes plus complexes et pour viter tout
malentendu il peut s'avrer utile de considrer trois profils errons, qui satisfont
uniquement deux rgles sur trois. Ces profils sont prsents dans la figure 6.6d.
Pour chaque forme de l'enzyme, des flches sont traces sur les lignes des profils
acceptables, de telle sorte que chaque profil conduit la forme considre de
l'enzyme sans considration pour l'endroit du schma o nous commenons. Ainsi,
pour la forme libre de l'enzyme E, les quatre profils de la figure 6.6c sont repr-
sents comme dans la figure 6.6e. Chaque profil est alors interprt comme un
produit de constantes de vitesse spcifies par les flches par rfrence au
mcanisme complet de la figure 6.6a, et l'ensemble des quatre profils est interprt
comme la somme de quatre produits de ce type. Par exemple, dans la figure 6.6e, le
premier profil donne le terme : k 1k 2 k 3 [ P ] , et l'ensemble complet des profils
conduisant E donne le terme : ( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ]) .
Cette somme devient alors le numrateur d'une expression qui reprsente la
fraction de la concentration totale d'enzyme [ E ]0 qui existe sous la forme E
l'tat stationnaire :
[E] ( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ])
= [6.5]
[ E ]0 D
En procdant exactement de la mme manire pour les trois autres formes de
l'enzyme, nous obtenons trois fractions supplmentaires :
[ EA ]
=
(k1k 2k 3 [ A ][ P ] + k1k 2k 4 [ A ] + k1k3k 4 [ A ] + k 2k 3k 4 [ P ][ Q ] ) [6.6]
[ E ]0 D
k1k 2 k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k 4 [ A ][ B ]

[ EAB ] + [ EPQ ] + k k k
1 3 4 [ P ][ Q ] + k k k
2 3 4 [ B ][ P ][ Q ]
= [6.7]
[ E ]0 D
[ EQ ]
=
(k1k 2k3 [ A ][ B ] + k 1k 2k 4 [ Q ] + k 1k3k 4 [ Q ] + k 2k3k 4 [ B ][ Q ] ) [6.8]
[ E ]0 D
Puisque ces quatre formes sont les quatre seules formes de l'enzyme, la somme de
ces quatre fractions doit tre gale 1, ce qui signifie que le dnominateur D dans
chacune des fractions doit tre la somme des numrateurs, c'est--dire la somme
des 16 produits obtenus partir des profils.
La vitesse de la raction est alors donne par (la somme des vitesses des tapes qui
gnrent un produit particulier) moins (la somme des vitesses des tapes qui
consomment le mme produit). Dans notre exemple, il existe une seule tape qui
gnre le produit P, (EAB + EPQ) EQ + P, et une seule tape qui consomme
P, EQ + P (EAB + EPQ), et donc :
d[ P ]
v =
dt
= k3 ( [ EAB ] + [ EPQ ] ) k 3 [ EQ ][ P ]
k1k 2 k3k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k3k 4 [ A ][ B ]
+ k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] + k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ]
[ E ]0
k k k k [ A ][ B ][ P ] k 1k 2 k 3k 4 [ P ][ Q ]
1 2 3 3
k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ]
=
D
=
(k1k 2k3k 4 [ E ]0 [ A ][ B ] k 1k 2k 3k 4 [ E ]0 [ P ][ Q ] ) [6.9]
D
Dans la plupart des cas, il est plus important de connatre la forme de l'quation de
vitesse dans des conditions d'tat stationnaire que de connatre son expression
dtaille en termes de constantes individuelles de vitesse. Il est donc commode
d'exprimer l'quation de vitesse sous la forme de coefficients qui permettent de
prdire directement les proprits exprimentales d'un mcanisme donn. Dans
notre exemple, l'quation de vitesse peut tre crite de manire simplifie :
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ])
v = [6.10]
D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ]
+ D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
o les coefficients prennent les valeurs suivantes :
N1 = k1k 2 k3k 4 ; N 1 = k 1k 2 k 3k 4 ; D0 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D1 = k1( k 2 + k3 )k 4 ;
D2 = k 2 k3k 4 ; D3 = k 1k 2 k 3 ; D4 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D5 = k1k 2 ( k3 + k 4 ) ;
D6 = k1k 2 k 3 ; D7 = k 2 k3k 4 ; D8 = ( k 1 + k 2 )k 3k 4 ; D9 = k1k 2 k 3 ; D10 = k 2 k 3k 4 .
6.3.3. La mthode de WONG et HANES
Bien que la mthode de KING et ALTMAN vite de gnrer au dnominateur de

l'quation de vitesse des termes qui seraient simplifis par la suite par soustraction, et
dispense ainsi d'un travail inutile (et des erreurs qui pourraient en dcouler), elle ne
permet pas d'viter les simplifications dans le numrateur. Dans l'quation [6.9], par
exemple, huit termes apparaissent initialement dans le numrateur qui se simplifient
par soustraction entre eux pour ne laisser que deux termes.
Il est surprenant que les deux termes du numrateur qui persistent, soient relati-
vement concis par rapport aux six qui ont disparus : le terme positif du numrateur
consiste dans le produit de la concentration totale d'enzyme, des concentrations des
substrats pour la raction directe et des quatre constantes de vitesse qui dcrivent
un cycle du mcanisme dans le sens direct ; le terme ngatif du numrateur
correspond au produit de la concentration totale d'enzyme, des concentrations des
substrats dans la raction inverse et des quatre constantes de vitesse qui dcrivent
un cycle du mcanisme dans le sens inverse. Cette situation apparat clairement si
nous reprsentons les flches correspondantes dans les profils d'une sorte de
mthode inverse de KING et ALTMAN, comme dans la figure 6.7.
k1[A] k1
6.7 - Mthode de WONG et HANES k4 k2[B] k4[Q] k2

pour dterminer le numrateur
de l'quation de vitesse k3 k3[P]
Cette proprit a t gnralise par WONG et HANES (1962) sous la forme d'une
rgle structurale pour le numrateur de l'quation de vitesse. Initialement, le profil
central est dessin, exactement comme dans la mthode de KING et ALTMAN

(figure 6.6b), mais ensuite ne sont considrs que les profils qui :
contiennent uniquement des lignes du profil central,
connectent chaque paire de formes de l'enzyme,
renferment une flche partant de chaque forme de l'enzyme,
renferment un seul cycle correspondant une raction complte dans le sens
direct ou dans le sens inverse.
Dans un mcanisme simple comme celui que nous avons considr jusqu' prsent,
le cycle consiste dans le profil central dans sa totalit. Cependant, dans les cas plus
complexes, des formes additionnelles de l'enzyme peuvent exister en dehors du
cycle catalytique : les lignes connectant celles-ci au cycle doivent avoir des flches
qui les conduisent au cycle. Finalement, nous crivons les termes du numrateur
comme une somme algbrique, de sorte que chaque profil qui accomplit la raction
directe donne un produit positif et chaque profil qui accomplit la raction inverse
donne un produit ngatif. Si le cycle convertit plus d'un quivalent stchio-
mtrique, il doit tre pondr de manire adquate. Si le cycle de la figure 6.6b
reprsente la raction 2A + 2B 2P + 2Q il sera incorpor dans l'quation de
vitesse avec un coefficient stchiomtrique de 2.
6.3.4. Modifications de la mthode de KING et ALTMAN
La mthode de KING et ALTMAN comme nous l'avons dcrite est utile et facile
appliquer n'importe lequel des mcanismes les plus simples. Cependant, les
mcanismes complexes ncessitent souvent d'identifier un grand nombre de profils.
La drivation est alors trs laborieuse et susceptible de gnrer des erreurs, et nous
pouvons aisment interprter incorrectement un profil ou crire des termes incor-
rects. Bien qu'en principe, il soit possible de calculer le nombre total de profils
(KING et ALTMAN, 1956 ; CHOU et al., 1979), cette procdure est laborieuse, sauf
pour les mcanismes simples, parce que des corrections sont ncessaires pour tous
les cycles du mcanisme. De plus, connatre le nombre de profils attendus peut
s'avrer sans utilit pour les trouver et ne diminue en rien la quantit de travail
ncessaire pour crire ces termes. En gnral, il est prfrable, pour les
mcanismes complexes, de chercher simplifier la procdure. VOLKENSTEIN et
GOLDSTEIN (1966) ont tabli certaines rgles pour raliser cela, dont les plus
simples sont nonces ci-dessous :
1. Si deux ou plusieurs tapes impliquent la conversion de la mme paire de formes
de l'enzyme, ces tapes peuvent tre condenses en une seule en additionnant les
constantes de vitesse pour les tapes parallles. Par exemple, si le mcanisme de
MICHAELIS et MENTEN est reprsent selon le schma de KING et ALTMAN
(figure 6.8a), uniquement deux profils doivent tre considrs, et
. Puisque ces deux ractions connectent la mme paire de formes de
l'enzyme, celles-ci peuvent tre additionnes comme dans la figure 6.8b. Le
profil central qui rsulte, devient le seul profil reprsentant le mcanisme et ainsi
les expressions pour [ E ] et [ EA ] peuvent tre drives immdiatement :
[E] k 1 + k 2
= [6.11]
[ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[ EA ] k1 [ A ] + k 2 [ P ]
= [6.12]
[ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
k1[A]
6.8 - Collapsus d'une paire d'tapes k1 k1[A] + k2[P]
parallles (a) connectant la mme E EA E EA
paire de formes de l'enzyme en addi- k2[P] k1 + k2
tionnant les constantes de vitesse k2
pour donner une seule tape (b) a b
2. Si le mcanisme renferme diffrentes espces d'enzyme qui possdent des pro-

prits identiques, la procdure est largement facilite en traitant ceux-ci comme
une seule espce. Par exemple, si un enzyme renferme deux sites actifs iden-
tiques, le mcanisme peut tre reprsent comme dans la figure 6.9a. Trait de
cette manire ce mcanisme ncessite 32 profils, mais si nous tirons parti de la
symtrie par rapport la ligne en pointills, comme prsent dans la figure 6.9b,
le traitement se simplifie et ncessite uniquement quatre profils, qui peuvent
encore tre simplifis en utilisant la rgle (1) concernant l'addition des tapes
parallles (figure 6.9c).
k2 k2
k1[A] 2 k1[A]
E EA E EA
k1 k1
k2 k1 k1[A] k3 k3[A] k4 2 k3 k3[A] 2 k4
k3[A]
EA EAA EA2
k3
b - Prise en compte de la symtrie
k4
2 k1[A] k3[A]
a - Mcanisme complet E EA EA2
k1 + k2 2 (k3 + k4)
c - Addition d'tapes parallles
6.9 - Simplification d'un modle complexe en utilisant les facteurs
statistiques pour remplacer des tapes identiques
Le mcanisme prsent en (a) est symtrique par rapport la ligne en pointills et
possde exactement les mmes proprits l'tat stationnaire que le mcanisme plus
simple prsent en (b).
En consquence, ce mcanisme ncessite uniquement deux profils et les

expressions pour les concentrations peuvent tre crites directement :
[E]
=
(
2 k 1 + k 2 k 3 + k 4 )( ) [6.13]
[ E ]0 ( )( ) ( )
2 k 1 + k 2 k 3 + k 4 + 4k1 k 3 + k 4 [ A ] + 2k1k 3 [ A ] 2
Les facteurs statistiques apparaissent toujours quel que soit l'avantage qui puisse
tre tir de la symtrie du profil central. Dans cet exemple, la raction E EA
peut se drouler de deux manires diffrentes, et donc la vitesse totale est la
somme de deux vitesses, donnant une constante de vitesse 2 k1 [ A ] qui corres-
pond au double de la constante de vitesse sur chacun des deux chemins indi-
viduels. La raction inverse EA E + A, d'un autre ct, peut se drouler
d'une seule manire et se caractrise par un facteur statistique de 1. Ainsi, sa
constante de vitesse reste k 1 .
3. Si le profil central consiste en deux ou plusieurs parties distinctes en contact au
niveau d'une seule forme de l'enzyme, il est commode de traiter sparment
chacune des parties. Un exemple simple de cette approche est fourni dans le cas
de substrats comptitifs (figure 6.10), dans lequel un seul enzyme catalyse
simultanment deux ractions distinctes avec des substrats diffrents.
EA' EA
k'1 k1[A]
6.10 - Mcanisme dans lequel
k'1[A'] k1
deux parties indpendantes
k'2 k'2 E k2 k2 sont connectes entre elles
k'3 k3[P] par l'intermdiaire d'une forme
k'3[P'] k3 unique de l'enzyme (dans ce
EP' EP cas, il s'agit de la forme E)
Dans ce cas, les expressions pour chacune des formes de l'enzyme sont le produit
des sommes correspondant aux moitis gauche et droite du profil central :
[E] ( k'1k'2 + k'1k'3 + k'2 k'3 )( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.14]
[ E ]0 D
[ EA ] ( k'1k'2 + k'1k'3 + k'2 k'3 )( k1k 2 [ A ] + k1k3 [ A ] + k 2 k 3 [ P ])
= [6.15]
[ E ]0 D
[ EP ] ( k'1k'2 + k'1k3' + k'2 k3' )( k1k 2 [ A ] + k 1k 3 [ P ] + k 2 k 3 [ P ])
= [6.16]
[ E ]0 D
[ EA' ] ( k1' k'2 [ A' ] + k1' k3' [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.17]
[ E ]0 D
[ EP' ] ( k1' k'2 [ A' ] + k'1k'3 [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
= [6.18]
[ E ]0 D
Le numrateur dans l'expression de [ E ] [ E ]0 est le produit de deux sommes :

la premire provient des profils qui conduisent E dans la moiti gauche du profil
central et elle apparat inchange dans les numrateurs pour EA et EP ; la seconde
somme provient des profils qui conduisent E dans la moiti droite du profil
central et elle apparat inchange dans les numrateurs de EA' et de EP'. L a
seconde somme du numrateur de EA provient de profils qui conduisent EA dans
la moiti droite du profil central et de mme pour EP. La premire somme du
numrateur de EA' provient des profils qui conduisent EA' dans la moiti gauche
du profil central et de mme pour EP'.
6.3.5. Ractions renfermant des tapes l'quilibre
Certains mcanismes sont assez importants pour justifier une analyse dtaille,
mais ils sont parfois tellement complexes que, mme en utilisant les mthodes
dcrites ci-dessus, ils gnrent des quations de vitesse trop compliques pour tre
manipules. Dans de tels cas, certaines simplifications doivent tre envisages et
des simplifications importantes peuvent souvent tre obtenues si certaines tapes,
telles les tapes de fixation de protons, sont supposes l'quilibre dans les con-
ditions d'tat stationnaire. Ces suppositions peuvent bien sr se rvler fausses lors
d'tudes plus approfondies, mais elles sont trs utiles en premire approximation.
CHA (1968) a dcrit une mthode pour l'analyse des mcanismes renfermant des
tapes l'quilibre qui est beaucoup plus simple que la mthode de KING et
ALTMAN parce que chaque groupe de formes de l'enzyme en quilibre peut tre
trait comme une seule espce. Par exemple, considrons le mcanisme de la
figure 6.11, pour un enzyme dans lequel la forme non-protonne E0 et la forme
protonne HE+ sont catalytiquement actives mais se caractrisent par des
constantes cintiques diffrentes (dans le traitement habituel de l'influence du pH
sur le comportement des enzymes que nous traiterons au chapitre 9, nous
supposerons qu'un seul tat de protonation de l'enzyme est actif, mais ici nous
supposons que EA0 et HEA+ peuvent ragir pour donner des produits sinon notre
exemple est trivial et ne peut tre utilis pour illustrer la mthode de CHA). Si
l'quilibre entre E0 et HE+ est maintenu au cours de l'tat stationnaire, les fractions
KE [H+]
des formes E0 et HE+ sont donnes respectivement par et
KE + [ H + ] KE + [ H + ]
de la forme composite E de l'enzyme, o [ H + ] reprsente la concentration d'ion
hydrogne et KE est la constante de dissociation de la fonction protonable sur la
forme libre de l'enzyme. La vitesse de fixation de A sur E0, qui est donne par
k [ E ][ A ] KE
k1 [ E 0 ][ A ] , peut alors s'crire sous la forme 1 et la fixation de A
KE + [ H + ]
k1' [ E ][ A ][ H + ]
sur EH+ peut de manire similaire s'crire ; la vitesse totale de
KE + [ H + ]
fixation de A sur les diffrentes formes de E est donne par

[ E ][ A ]( k1 KE + k1' [ H + ])
. En effet, les constantes individuelles de vitesse k1 et
KE + [ H + ]
k1 KE + k1' [ H + ]
k1' ont t remplaces par la constante de vitesse composite : de
KE + [ H + ]
manire plus gnrale, la constante de vitesse composite est la somme des cons-
tantes individuelles de vitesse, pondres par la fraction de la forme correspondante
de l'enzyme prsente dans le mlange l'quilibre. La libration de A partir de
l'espce composite EA et la conversion de la mme espce en produit peuvent tre
traites de la mme manire.
k'1 k'2
A + HE+ HEA+ HE+ + P
k'1
Etapes l'quilibre
KE KEA KE
k1 k2
A + E0 EA0 E0 + P
+ k1 + +
H+ H+ H+
6.11 - Traitement des tapes l'quilibre
Si les tapes de fixation de protons (tapes verticales dans l'exemple donn) sont traites
comme des quilibres, le mcanisme peut tre simplifi en traitant les groupes de formes
d'enzyme l'quilibre comme des espces uniques.
Tout ceci semble compliquer l'analyse plutt que de la simplifier, mais la rsultante
est que le mcanisme original qui aurait ncessit l'emploi de la mthode de KING
et ALTMAN a t remplac par un mcanisme plus simple pour lequel nous
connaissons dj la solution, c'est--dire le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN,
bien que les expressions pour les constantes de vitesse soient exceptionnellement
complexes. L'quation de vitesse peut donc tre crite immdiatement, en
k K + k1' [ H + ]
remplaant k1 dans l'quation [3.34] par 1 E et en procdant de la
KE + [ H + ]
mme manire pour k1 et k2.
La mthode de CHA est applicable tout mcanisme qui contient des tapes
l'quilibre. En gnral, n'importe quel nombre de formes d'enzyme en quilibre les
unes avec les autres peut tre trait comme une espce unique, et chaque constante
de vitesse ki pour un composant constitue un terme ki fi dans la somme donnant la
constante de vitesse pour l'espce composite, o fi reprsente la fraction du compo-
sant dans le mlange l'quilibre. Bien que la validit de cette mthode ait t mise
en question (SEGEL et MARTIN, 1988), TOPHAN et BROCKELHURST (1992) ont
dmontr que les objections mises n'taient pas fondes. L'analyse de ces auteurs
a plus d'un intrt, puisque, comme ils le font remarquer, d'autres auteurs ont
commis des erreurs similaires et qu'il est important de comprendre comment les
viter. Le point essentiel est que ds qu'une srie de ractions forme des cycles, il
est ncessaire de tenir compte de toutes les routes parallles qui connectent chaque
paire d'espces dans le mcanisme. Plus gnralement, quelle que soit la constante
de vitesse suppose pour une des tapes du mcanisme, il est essentiel que le
produit de tous les rapports de constantes de vitesse directe et inverse pour les
tapes connectant une paire d'espces doivent correspondre la constante
d'quilibre pour le processus net. Il devrait tre superflu d'ajouter que cette
constante d'quilibre doit tre la mme pour chaque voie parallle correspondant
la mme raction. Il s'ensuit qu'un cycle qui ne produit aucun changement net, tel
que le cycle E0 HE+ HEA+ EA0 E0 dans la figure 6.11 doit
avoir une constante nette d'quilibre gale 1. Le dfaut de comprhension de ce
principe a produit quelques ides fausses concernant la manire dont la
cooprativit cintique peut apparatre avec un enzyme monomrique avant qu'un
modle valable, que nous dcrirons dans le 9.5, ne soit dvelopp.
Une mise en garde doit toutefois tre faite au sujet de l'utilisation de la mthode de
CHA dans le cas de mcanismes qui renferment des chemins parallles de fixation,
tels que les mcanismes dans lesquels deux substrats, A et B, peuvent se fixer dans
n'importe quel ordre pour former le complexe ternaire EAB. Puisque l'quation de
vitesse pour un tel mcanisme est souvent trop complique pour tre manipule
aisment, la pratique courante consiste utiliser des quations drives en suppo-
sant que les tapes de fixation sont l'quilibre. D'un point de vue mcanique, il
n'existe pas plus de fondement cette hypothse qu'il n'en existe pour les
mcanismes un seul substrat ( 3.3.2) mais les quations rsultantes sont souvent
en accord avec l'exprience. Le problme provient du fait que les termes addition-
nels prsents dans la forme rigoureuse de l'quation de vitesse l'tat stationnaire
peuvent tre numriquement trs petits ou qu'ils peuvent varier en proportion avec
d'autres termes, si bien qu'ils sont quasiment impossibles dtecter comme l'ont
discut GULBINSKY et CLELAND (1968) dans leur tude de la galactokinase. Il
s'agit d'un point d'importance gnrale pour l'application correcte de l'analyse
cintique : plus d'un ensemble d'hypothses peut conduire la mme quation de
vitesse ou une famille d'quations de vitesse qui ne sont pas distinguables
exprimentalement ; il n'est donc pas possible d'utiliser la concordance des rsultats
exprimentaux avec une quation de vitesse comme critre pour valider les
hypothses utilises pour driver cette quation.
6.3.6. Analyse des mcanismes par inspection
Raisonnement topologique
Il est possible de penser en ralit, cela est tellement vident qu'il semble inutile
de le mentionner que le rle essentiel de la mthode de KING et ALTMAN dans
l'enzymologie moderne est de driver des quations de vitesse. Cependant, imposer

cette limite la mthode de KING et ALTMAN serait une erreur, parce qu'en dehors
du contexte de l'enseignement de l'enzymologie il est rare que nous ayons driver
des quations de vitesse et de nombreuses quations sont dj connues : de
nombreux exemples, la fois des quations de vitesse et de leur drivation,
peuvent tre trouvs dans les livres de PLAWMAN (1972), de SEGEL (1975) et de
SCHULZ (1994). La vritable importance de la mthode de KING et ALTMAN se
situe ailleurs, dans le fait qu'une fois familiaris avec cette mthode, l'utilisateur
peut dduire certaines conclusions sur les proprits d'tat stationnaire des
mcanismes enzymatiques sans avoir recours explicitement l'algbre, un procd
que WONG (1975) a appel avec justesse un raisonnement topologique.
Dans la mthode de KING et ALTMAN, chaque profil gnre un terme positif et
chaque terme apparat dans le dnominateur de l'quation de vitesse. Puisqu'il
n'existe aucun terme ngatif, aucun des termes ne peut s'liminer par soustraction et
donc chaque terme correspondant un profil rpertori doit apparatre dans
l'quation de vitesse. La seule exception cette rgle est que quelquefois le
numrateur et le dnominateur partagent un facteur commun qui peut alors s'liminer
par division, mais ceci a lieu uniquement s'il existe des symtries dans le mcanisme
de sorte que certaines constantes de vitesse apparaissent plus d'une fois.
Mcanismes avec des voies alternatives

Dans les mcanismes pour lesquels il n'existe aucune relation entre les constantes
de vitesse en plus de celles requises par la thermodynamique, il est prudent de
supposer qu'aucune simplification n'est possible entre le numrateur et le dnomi-
nateur et que donc chaque profil gnre un terme qui apparat dans l'quation de
vitesse. Considrons par exemple le mcanisme prsent dans la figure 6.11, mais
sans supposer que les tapes de fixation de protons soient l'quilibre : n'y a-t-il
pas certaines conclusions que nous puissions tablir au sujet de la manire dont
l'quation de vitesse diffre de celle tablie partir de l'hypothse de l'quilibre et
cela sans avoir driver l'quation ? Si aucune des tapes n'est l'quilibre, la
mthode de KING et ALTMAN doit gnrer des termes en [ A ] 2 et [ B ] 2 , puisque
nous pouvons facilement trouver des profils qui contiennent deux tapes de
fixation de A ou deux tapes de fixation de H+, par exemple le profil qui se termine
EA0 et qui consiste dans la raction E0 EA0 et HE+ HEA+ EA0.
Ainsi, simplement en inspectant le mcanisme, nous pouvons dduire que
l'quation de vitesse est du second ordre en [ A ] et en [ H + ] . Notons que cette
dduction peut tre faite sans rien crire sur le papier, ni dessiner les profils, ni
driver l'quation (bien que l'analyse serait facilite si nous rcrivions le
mcanisme sous une forme circulaire comme dans la figure 6.6a, de sorte que E0 et
HE+ n'apparaissent pas deux fois chacun).
Les tapes en cul-de-sac

A ct de sa valeur d'inspection pour tudier des mcanismes particuliers, la
mthode de KING et ALTMAN peut galement tre utilise pour tirer des conclu-
sions importantes et significatives sur les mcanismes en gnral. Considrons par
exemple l'effet de l'addition d'une tape au mcanisme de la figure 6.6a, dans
laquelle B se fixe sur EQ pour former un complexe cul-de-sac EBQ qui est inca-
pable de ragir autrement qu'en librant B pour reformer EQ, comme le montre la
figure 6.12. Pour chaque forme de l'enzyme dans le mcanisme original, c'est--
dire chaque forme l'exception de EBQ, chacun des profils de KING et ALTMAN
doit renfermer la raction EBQ EQ, et donc chacune des formes de l'enzyme
l'exception de EBQ doit avoir la mme expression que prcdemment sauf que
cette dernire est multiplie par k5. Puisque la seule voie pour former EBQ part de
EQ, il est vident que chaque profil pour EBQ doit tre le mme que pour EQ o la
raction EBQ EQ est remplace par EQ EBQ, et ainsi l'expression pour
EBQ doit tre la mme que celle pour EQ dans laquelle k5 est remplac par
k5 [ B ] , c'est--dire que le rapport [ EBQ ] [ EQ ] doit tre k5 [ B ] k 5 . Puisque
k5 k 5 est la constante d'association, cela signifie que ces tapes doivent tre
l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. L'quation de vitesse dans son
ensemble doit tre la mme que pour le mcanisme sans l'inhibition par le
complexe en cul-de-sac, except que tous les termes en EQ dans le dnominateur
k [ B ]
sont multiplis par 1 + 5 .
k 5
k1[A]
E EA
Une tape en cul-de-sac (conversion de EQ en k1
EBQ dans cet exemple) est toujours l'qui-
libre dans les conditions d'tat stationnaire.
k4 k4[Q] k2 k2[B]
Etape en cul-de-sac
k5 k3[P] EAB
6.12 - Mcanisme avec EBQ EQ EPQ
k5[B] k3
un complexe en cul-de-sac
Une simple rflexion montre que la conclusion n'est pas particulire au mcanisme
considr, mais qu'elle s'applique n'importe quel mcanisme qui renferme des
tapes en cul-de-sac, mme si celles-ci forment une srie, c'est--dire mme si plu-
sieurs tapes sont ncessaires pour connecter le complexe en cul-de-sac au reste du
mcanisme : dans un mcanisme donn, les ractions en cul-de-sac sont
l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. Nous pouvons comprendre en
terme de mcanisme (c'est--dire sans avoir recours l'algbre) pourquoi cette
conclusion s'applique, en prenant conscience que la raison pour laquelle les
ractions ordinaires l'tat stationnaire ne sont pas l'quilibre rside dans le fait
que le flux de ractifs est un processus de dsquilibre perptuel : l'apport constant
de ractifs d'un ct et l'limination des produits de l'autre. Cependant, il n'y a

aucun flux net des ractifs travers les ractions en cul-de-sac, et donc aucun
dsquilibre correspondant qui interfre avec l'tablissement d'un quilibre.
6.3.7. Drivation des quations de vitesse par ordinateur
La drivation des quations de vitesse, que se soit par la mthode de KING et

ALTMAN ou par toute autre mthode, est un processus purement mcanique et son
succs ou son chec dpend de notre capacit viter les erreurs plutt que de
notre aptitude prendre des dcisions intelligentes. Ce processus peut donc tre
implment dans une procdure assiste par ordinateur et un certain nombre de
programmes ont t dcrits pour la drivation d'quations de vitesse (RHOADS et
PRING, 1968 ; HURST, 1967, 1969 ; FISHER et SHCULZ, 1969 ; RUDOLPH et
FROMM , 1971 ; KINDELERER et AINSWORTH, 1976 ; CORNISH-BOWDEN, 1977 ;
OLAVARRA, 1986). Malheureusement tous ces programmes ont t crits en
FORTRAN ou dans d'autres langages qui ne sont plus couramment utiliss
aujourd'hui, mais leur adaptation des systmes modernes ne doit pas poser de
problme insurmontable une fois que la mthodologie est parfaitement comprise.
Pour implmenter la mthode de KING et ALTMAN sur un ordinateur, il est
commode de considrer le processus de drivation comme une srie d'oprations
sur un tableau de constantes de vitesse plutt que comme l'quivalent algbrique
d'un exercice de reconnaissance de profil, parce que l'interprtation de relations
gomtriques est trs difficile raliser avec un ordinateur. Le tableau 6.1 repr-
sente le mme exemple que celui que nous avons considr dans le 6.3.2, c'est--
dire celui de l'quation [6.4] et pour obtenir un produit correct des constantes de
vitesse pour un profil se terminant E, nous pouvons prendre la premire constante
de vitesse disponible pour chaque ligne du tableau l'exception de la premire,
c'est--dire k 1k 2 k 4 : l'omission de la ligne E assure que le produit ne contient
aucun terme correspondant la consommation de E et l'inclusion de toutes les
autres lignes assure qu'il y a exactement une tape dmarrant de chacun des autres
intermdiaires. Cependant, ceci est uniquement le premier de tous les produits
possibles. Pour obtenir les autres, nous remplaons la constante de vitesse de la
ligne EQ par chacune des autres possibilits dans cette ligne, ce qui donne
k 1k 2 k 3 [ P ] comme l'unique nouveau produit possible. Nous passons alors la
seconde position de la ligne prcdente, la ligne (EAB + EPQ) , et de nouveau,
nous choisissons toutes les possibilits partir de la ligne EQ , ce qui donne
k 1k3k 4 et k 1k3k 3 [ P ] . S'il y avait d'autres possibilits dans la ligne
(EAB + EPQ) , nous ferions de mme pour chacune d'entre elles, mais il n'y a
en aucune, et donc nous pouvons procder l'lment suivant de la ligne
EA en prenant toutes les possibilits partir des lignes (EAB + EPQ) et
EQ .
Tableau 6.1 - Drivation automatique des quations de vitesse

a - Matrice de constantes de vitesse
E EA (EAB + EPQ) EQ
E Aucun k1 [ A ] Aucun k 4 [ Q ]
EA k 1 Aucun k2 [ B ] Aucun
(EAB + EPQ) Aucun k 2 Aucun k3
EQ k4 Aucun k 3 [ P ] Aucun
b - Identification des produits cycliques
E? Cyclique ?
k 1 k 2 k 4 Oui Non
k 1 k 2 k 3 [ P ] Oui Non
k 1 k3 k 4 Oui Non
k 1 k3 k 3 [ P ] Oui Oui
k 2 [ B ] k 2 k 4 Oui Oui
k 2 [ B ] k 2 k 3 [ P ] Non Oui
k 2 [ B ] k3 k 4 Oui Non
k 2 [ B ] k3 k 3 [ P ] Non Oui
Au total, huit produits peuvent tre gnrs de cette faon, comme indiqu dans la
partie infrieure du tableau 6.1. Cependant, tous ceux-ci ne sont pas valables
puisque certains ne contiennent pas d'tape vers E et que certains sont cycliques.
En principe, il n'est pas ncessaire de vrifier si un produit renferme une tape vers
une espce cible puisque n'importe quel produit non-cyclique doit satisfaire cette
contrainte. Cependant, il est beaucoup plus facile de vrifier si le produit contient
une tape vers E que de vrifier si celle-ci est cyclique, puisqu'un produit qui
conduit E doit obligatoirement contenir au moins une constante de vitesse de la
colonne E. Il est donc prfrable d'liminer les produits qui ne renferment pas
une des constantes de vitesse de la colonne E avant de vrifier s'il n'y a pas de
produit cyclique. Dans le cas du tableau 6.1, la reconnaissance de produits
cycliques est triviale puisque le seul type de cycle possible dans ce mcanisme est
celui qui comprend la constante de vitesse caractristique de la direction directe et
de la direction inverse pour une mme tape, comme dans le terme k 1k3k 3 [ P ]
qui renferme les constantes de vitesse directe et inverse pour l'tape 3. Toutefois,
des cycles plus complexes peuvent faire partie de mcanismes plus compliqus, et
un programme devrait tre capable de les reconnatre.
Conceptuellement, la manire la plus simple (mais peut tre pas la plus efficace) de
dterminer si un produit est cyclique consiste dmarrer tour tour avec chacune
des constantes de vitesse contenue dans le produit et suivre au moins n 1 tapes
jusqu' ce que l'espce cible soit atteinte. Par exemple, considrons k 2 [ B ]k3k 4 et
commenons avec k 2 [ B ] : ceci provient de la colonne (EAB + EPQ) et donc
nous devons trouver la constante de vitesse dans la ligne (EAB + EPQ) qui est
k3 ; celle-ci se situe dans la colonne EQ et donc nous cherchons la constante
de vitesse dans la ligne EQ qui est k4 ; celle-ci est dans la colonne E et
donc le processus est termin avec succs en 3 tapes (3 = n 1 dans notre
exemple). Comme les deux autres lments dans ce produit avaient t tests dans
la vrification de k 2 [ B ] , il n'est pas ncessaire de les tester nouveau. Cependant,
si nous avions dmarr avec k3 la vrification ne serait pas passe par k 2 [ B ] et il
aurait donc t ncessaire de le tester sparment.
Cette mthode de vrification pour les produits cycliques peut sembler fastidieuse
mais nous devons tre prudents et ne pas tre sduits par la possibilit de prendre
des raccourcis qui ne garantissent pas toujours l'obtention de rsultats corrects. Par
exemple, pour de nombreux mcanismes, tout produit qui renferme plusieurs fois
la mme constante de vitesse ou qui renferme la fois les constantes de vitesse
directe et inverse pour la mme tape, est cyclique. Cependant, nous ne pouvons
pas supposer que cela est toujours vrai parce que certains types de symtrie dans le
mcanisme enzymatique peuvent entraner l'apparition plusieures reprises d'une
ou de plusieurs constantes de vitesse comme par exemple dans la figure 6.9a.
Certaines des mthodes publies pour l'analyse des mcanismes par ordinateur
(pas parmi celles cites ci-dessus) n'intgrent pas les prcautions ncessaires et
fournissent des rsultats incorrects pour de tels mcanismes. Aprs limination
des produits incorrects, la somme des autres termes donne l'expression pour
[ E ] [ E ]0 , comme dans l'quation [6.5] :
[E]
=
(k 1k 2k 4 + k 1k 2k 3 [ P ] + k 1k3k 4 + k 2 [ B ]k3k 4 ) [6.19]
[ E ]0 D
La conversion de cette quation dans l'quation [6.6], c'est--dire l'expression
correspondante pour [ EA ] [ E ]0 , ncessite maintenant d'analyser chaque produit
dans la somme pour identifier le chemin de EA vers E qu'il renferme et de
retourner les constantes de vitesse pour cette partie du produit tout en laissant le
reste inchang. Dans le cas de k 1k 2 k 4 , par exemple, le chemin de EA E
ncessite juste k 1 , celui-ci est remplac par k1 [ A ] . Le produit k 2 k 4 est laiss
inchang et le produit dans sa totalit est remplac par k 1 [ A ]k 2 k 4 . En ralisant
cette opration pour chaque produit l'un aprs l'autre et ensuite pour (EAB + EPQ)
et (EQ) fournit des quations quivalentes aux quations [6.6] [6.8]. Cette
approche fournit la base d'une mthode de drivation par ordinateur quivalente
la mthode de KING et ALTMAN. Le numrateur peut tre trait en appliquant le
mme type de logique que celle comprise dans les rgles de WONG et HANES
( 6.3.3) et il est alors ais d'obtenir l'quation complte de vitesse.
6.4. LES QUATIONS DE VITESSE
6.4.1. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire
Les mesures cintiques dans des conditions d'tat stationnaire ont dmontr leur
incontestable valeur pour permettre de distinguer les diffrents mcanismes rac-
tionnels dans les ractions de transfert de groupe. Le dveloppement des mthodes
cintiques reprsente un travail considrable en raison du nombre de possibilits et
des diffrences minimes qui existent entre les divers mcanismes cintiques.
SEGAL, KACHMAR et BOYER (1952) ont t parmi les premiers reconnatre l'im-
portance d'une approche systmatique, et ils ont driv les quations pour plusieurs
mcanismes. Ensuite, ALBERTY (1953, 1958) et DALZIEL (1957) ont fait largement
progresser le champ des connaissances relatives aux ractions de transfert et ils ont
introduit la plupart des mthodes dcrites dans ce chapitre.
Puisque toutes les mthodes d'analyse cintique dans des conditions d'tat station-
naire qui permettent de distinguer les diffrents mcanismes reposent sur la compa-
raison des quations compltes de vitesse, nous allons commencer par introduire
brivement ces quations et la procdure suivre pour les obtenir, avant de discuter
des mthodes d'analyse proprement dites. L'quation pour un mcanisme ordonn
complexe ternaire est prsente en premier puisqu'elle a t drive dans le 6.3.2
en utilisant la mthode de KING et ALTMAN (quation [6.10]) :
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ])
v = [6.20]
D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ]
+ D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
Cette quation contient treize coefficients, mais ceux-ci sont dfinis partir de
huit constantes de vitesse, de sorte qu'il doit exister des relations entre les coeffi-
cients qui ne sont pas explicitent dans l'quation. De plus, les coefficients n'ont pas
de signification mcanique apparente. De nombreux systmes ont t utiliss pour
rcrire les quations de vitesse dans des termes plus significatifs ; celui que nous
utilisons dans ce manuel est celui prconis par l'IUBMB (IUB, 1982), et drive de
la classification des constantes selon trois types introduite par CLELAND (1963) :
les vitesses limites, les constantes de MICHAELIS et les constantes d'inhibition. En
gnral, une constante de MICHAELIS KmA pour un substrat A correspond au Km
dans une raction un seul substrat et une constante d'inhibition KiA est lie aux
valeurs de Kic et de Kiu obtenues quand le substrat A est utilis comme un produit se
comportant en inhibiteur de la raction inverse (mais n'est pas obligatoirement
identique l'un de ceux-ci). Dans certaines circonstances, les constantes d'inhi-
bition correspondent d'authentiques constantes de dissociation des substrats et
dans ces cas, il est possible de mettre cette caractristique en vidence en utilisant
un symbole du type KsA plutt que KiA Si les concentrations relles de l'enzyme
sont connues, les vitesses limites peuvent tre converties en constantes catalytiques
et la dfinition des constantes de spcificit dcoule naturellement de la dfinition

expose pour les ractions un seul substrat ( 3.3.4).
Dans ce systme, l'quation [6.20] peut tre rcrite sous la forme suivante :
V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ]

KiA KmB KmP KiQ
v = [6.21]
[ A ] KmA [ B ] KmQ [ P ] [ Q ] [ A ][ B ] KmQ [ A ][ P ]
1+ + + + + +
KiA KiA KmB KmP KiQ KiQ KiA KmB KiA KmP KiQ
KmA [ B ][ Q ] [ P ][ Q ] [ A ][ B ][ P ] [ B ][ P ][ Q ]
+ + + +
KiA KmB KiQ KmP KiQ KiA KmB KiP KiB KmP KiQ
La comparaison avec les dfinitions donnes aprs l'quation [6.9] montre que les
paramtres cintiques doivent avoir les valeurs donnes dans le tableau 6.2. Bien
que cette quation semble complexe, elle renferme plus de rgularits qu'il n'ap-
parat au premier coup d'il. Les termes qui contiennent [ Q ] sont gnralement
similaires ceux qui contiennent [ A ] , alors que ceux qui contiennent [ P ] sont
similaires ceux qui contiennent [ B ] . L'quation dans son ensemble satisfait
videmment aux contraintes habituelles de respect des dimensions ( 1.2.5), mais il
est possible d'analyser cette quation en ignorant pour le moment le fait que toutes
les concentrations, constantes de MICHAELIS et constantes d'inhibition ont la mme
dimension : si nous supposons que [ A ] , KmA et KiA possdent une dimension
spciale A, [ B ] , KmB et KiB une dimension B (diffrente de A) , alors tous les
termes du dnominateur n'ont pas de dimensions ; n'importe quel ractif qui
apparat au numrateur d'un terme, soit sous la forme d'un terme de concentration,
soit sous la forme d'un indice, apparat galement dans le dnominateur.
6.4.2. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire
L'quation pour le mcanisme alatoire complexe ternaire dans des conditions

d'quilibre rapide est la suivante :
V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ]

KiA KmB KmP KiQ
v = [6.22]
[ A ] [ B ] [ P ] [ Q ] [ A ][ B ] [ P ][ Q ]
1+ + + + + +
KiA KiB KiP KiQ KiA KmB KmP KiQ
Il peut sembler surprenant que l'quation la plus simple corresponde au mcanisme
le plus complexe ; l'explication provient du fait que l'quation [6.22], au contraire
de l'quation [6.21], a t drive en supposant que toutes les tapes, hormis la
conversion des complexes ternaires EAB et EPQ, sont l'quilibre, une supposition
qui provoque la disparition de nombreux termes, y compris des termes qui renfer-
ment des concentrations au carr.
Tableau 6.2 - Dfinitions des paramtres cintiques pour un mcanisme ordonn
Mcanisme complexe ternaire Mcanisme enzyme modifi
k1[A] k1[A] EA
E EA E E'P
k1 k1
k4 k4[Q] k2 k2[B] k4 k4[Q] k2[P] k2
k3 EAB E'B k3
EQ E'E
k3[P] EPQ EQ k3[P]
k3k 4 [ E ]0 k 2 k 4 [ E ]0
V1
k3 + k 4 k2 + k4
k 1k 2 [ E ]0 k 1k 3 [ E ]0
V1
k 1 + k 2 k 1 + k 3
k3k 4 ( k 1 + k 2 )k 4
K mA
k1( k3 + k 4 ) k1( k 2 + k 4 )
( k 2 + k3 )k 4 k 2 ( k 3 + k 4 )
K mB
k 2 ( k3 + k 4 ) ( k 2 + k 4 )k3
k 1( k 2 + k3 ) ( k 1 + k 2 )k 3
K mP
( k 1 + k 2 )k 3 ( k 1 + k 3 )k 2
k 1k 2 k 1( k 3 + k 4 )
K mQ
( k 1 + k 2 )k 4 ( k 1 + k 3 )k 4
k 1 k 1
K iA
k1 k1
k 1 + k 2 k 3
K iB
k2 k3
k 1 + k 4 k2
K iP
k1 k 2
k4 k4
KiQ
k 4 k 4
Le tableau montre les relations entre les paramtres qui apparaissent dans les quations
[6.21] et [6.23] et les constantes de vitesse pour les tapes individuelles des deux
principaux mcanismes ordonns pour les ractions de transfert de groupe. Bien que
l'quation [6.23] ne contienne pas le paramtre KiA , il peut tre obtenu partir de l'iden-
KiAKmB K K
tit suivante : = mA iB .
KiP KmQ KmP KiQ
Selon cette supposition, KiA, KiB, KiP et KiQ sont respectivement les constantes de
dissociation des complexes EA, EB, EP et EQ ; KmP et KmQ sont respectivement les
constantes de dissociation pour la libration de P et de Q partir du complexe
EPQ. (Bien que KmA et KmQ n'apparaissent pas explicitement dans l'quation [6.22],
ils peuvent tre introduits puisque dans ce mcanisme A et B sont interchan-
geables, ainsi KmA K iB est identique KiA K mB et KiP K mQ est identique KmP KiQ. Ces
substitutions ne peuvent tre effectues dans l'quation [6.21] parce que le
mcanisme ordonn n'est pas symtrique vis--vis de A et de B ou vis--vis de P et
de Q, une complexit additionnelle qui explique la plus grande complexit de
l'quation [6.21]). Dans la limite des erreurs exprimentales, l'quation [6.22]
s'applique, que l'hypothse de l'quilibre rapide soit satisfaite ou non, et les
constantes de MICHAELIS ou les constantes d'inhibition ne peuvent donc pas tre
interprtes avec certitude comme des constantes de dissociation.
6.4.3. Mcanisme enzyme modifi
L'quation d'tat stationnaire pour un mcanisme enzyme modifi est la suivante :

V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ]

KiA KmB KiP KmQ
v = [6.23]
[ A ] KmA [ B ] [ P ] KmP [ Q ] [ A ][ B ]
+ + + +
KiA KiA KmB KiP KiP KmQ KiA KmB
[ A ][ P ] KmA [ B ][ Q ] [ P ][ Q ]
+ + +
KiA KiP KiA KmB KiQ KiP KmQ
o les paramtres cintiques sont galement dfinis dans le tableau 6.2. Dans sa
reprsentation en terme de coefficient, cette quation est identique l'quation
[6.20] sans la constante 1 et sans les termes [ A ][ B ][ P ] et [ B ][ P ][ Q ] du
dnominateur, mais les relations entre les paramtres sont diffrentes, et l'quation
[6.23] renferme le terme KiP KmQ alors que c'est le terme KmP KiQ qui serait attendu
par analogie avec l'quation [6.20].
6.4.4. Calcul des constantes de vitesse

partir des paramtres cintiques
Bien que le tableau 6.2 montre comment les paramtres cintiques des deux mca-
nismes ordonns peuvent tre exprims en termes de constantes individuelles de
vitesse, il ne donne pas les relations inverses. Dans le cas du mcanisme enzyme
modifi, aucune relation inverse unique n'existe, c'est--dire qu'il n'est pas possible
de calculer les constantes de vitesse partir de la mesure des paramtres cintiques,
parce qu'il existe une infinit d'ensembles de constantes de vitesse capables de
donner les mmes paramtres cintiques. Toutefois, pour le mcanisme alatoire
complexe ternaire une relation unique existe (CLELAND, 1963) qui est prsente
dans le tableau 6.3. Ces relations devraient cependant tre utilises avec prcaution
puisqu'elles supposent que la forme la plus simple du mcanisme s'applique, c'est-
-dire que cette approche ne tient pas compte de la prsence ventuelle de plus
d'tapes que ncessaire dans le modle minimum. Si l'un ou l'autre des complexes
binaires ou tertiaires s'isomrise, l'quation d'tat stationnaire a la mme forme,
mais l'interprtation des paramtres est diffrente et certaines des expressions du
tableau 6.3 ne sont plus valables.
Tableau 6.3 - Calcul des constantes de vitesse partir des paramtres cintiques
Constante Expression Constante Expression

de vitesse de vitesse
V1 V1 KiA
k1 k 1
KmA [ E ]0 KmA [ E ]0
V1( k 2 + k3 ) V1 V1 KiA
k2 k 2
k3 KmB [ E ]0 [ E ]0 ( V1 KiA V1 KmA )
V1 V1 KiQ V1( k 2 + k3 )
k3 k 3
[ E ]0 ( V1 KiQ V1 KmQ ) k 2 KmP [ E ]0
V1 KiQ V1
k4 k 4
KmQ [ E ]0 KmQ [ E ]0
Ce tableau est obtenu en rarrangeant les dfinitions prsentes dans le tableau 6.1 pour
les paramtres cintiques du mcanisme ordonn complexe ternaire. Un rarrangement
analogue des dfinitions pour un mcanisme enzyme modifi n'est pas possible.
Pour un mcanisme alatoire complexe ternaire, il est vident qu'aucune des

constantes de vitesse l'exception de celles pour la conversion des complexes
ternaires ne peut tre dtermine partir des mesures d'tat stationnaire si
l'hypothse de l'quilibre rapide est correcte (puisque ds que cette hypothse d'un
quilibre rapide est pose, la possibilit disparat d'extraire une information sur la
vitesse des tapes qui sont supposes l'quilibre). Cependant, si l'hypothse de
l'quilibre rapide est faite et que le mcanisme ne dvie pas de celui prsent dans
l'quation [6.22], il est ventuellement possible d'utiliser les techniques d'ajus-
tement paramtriques pour dduire l'information au sujet des constantes de vitesses
(CORNISH-BOWDEN et WONG, 1978).
6.5. LES MESURES DE VITESSE INITIALE

EN ABSENCE DE PRODUIT
6.5.1 Signification des paramtres
Si aucun produit n'est ajout au mlange ractionnel initial, l'quation pour la

vitesse initiale d'une raction suivant un mcanisme ordonn complexe ternaire
est obtenue partir de l'quation [6.21] en supprimant tous les termes qui contien-
nent [ P ] ou [ Q ] et en multipliant le reste par KiA KmB :
V1 [ A ][ B ]
v = [6.24]
KiA KmB + KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ]
La signification de ces paramtres et leur relation avec les paramtres d'une
quation de MICHAELIS et MENTEN un substrat devient apparente si l'quation est
examine pour des valeurs extrmes de [ A ] et de [ B ] . Si [ A ] et [ B ] sont
suffisamment grands pour que tout terme ne contenant pas les deux variables soit
ngligeable, l'quation se simplifie pour donner v = V1 : donc V1 a exactement la
mme signification que V pour une raction un seul substrat, c'est--dire qu'il
dfinit la vitesse limite lorsque l'enzyme est satur. Il faut noter cependant que dans
ce cas, satur signifie satur par les deux substrats . La constante catalytique,
k0 = V1 [ E ]0 , de la mme manire, a la mme signification que pour une raction
un seul substrat.
La signification des constantes de MICHAELIS est obtenue en considrant les
simplifications de l'quation dans les cas o la concentration d'un seul des deux
substrats est trs leve. Par exemple, si [ B ] est suffisamment grande pour que les
termes de l'quation ne contenant pas cette variable soient ngligeables, alors
l'quation [6.24] se simplifie pour donner une quation similaire celle de
MICHAELIS et MENTEN en terme de [ A ] , dans laquelle [ B ] n'apparat plus :
V1 [ A ]
v = [6.25]
KmA + [ A ]
et o KmA reprsente la constante de MICHAELIS limite pour le substrat A quand B
est saturant. Un argument exactement parallle montre que KmB est la constante de
MICHAELIS limite lorsque A est saturante. De manire plus gnrale, pour tout
mcanisme impliquant un nombre arbitraire de substrats, la constante de
MICHAELIS pour chaque substrat est dfinie comme la constante de MICHAELIS
limite pour ce substrat lorsque tous les autres substrats sont des concentrations
saturantes. Dans les quations ci-dessus, KiA est diffrent de K mA et sa signification
peut tre apprhende en considrant la situation o [ B ] tend vers zro (mais reste
diffrente de zro). Dans ce cas, le numrateur reste diffrent de zro mais tous les
termes en [ B ] du dnominateur sont ngligeables et l'quation se simplifie de la
manire suivante :
V1 [ B ]
[ A]
KmB ( kB [ B ])[ E ]0 [ A ]
v = = [6.26]
KiA + [ A ] KiA + [ A ]
Dans cette quation, kB = k0 KmB est la constante de spcificit pour B alors que,
de la mme manire, k A = k0 KmA est dfinie comme la constante de spcificit
pour A. Il dcoule que KiA est la constante vraie de dissociation de EA, parce que
quand [ B ] tend vers zro, la vitesse de la raction de B avec EA tend galement
vers zro ; il n'y a rien dans cette situation qui empche l'tape de fixation de A sur
E de s'approcher de l'quilibre et dans ce cas l'hypothse de MICHAELIS et MENTEN
d'un quilibre de fixation est entirement justifie. KiB n'apparat pas dans l'quation
[6.24] puisque B ne se lie pas l'enzyme libre. Ce paramtre apparat cependant
dans l'quation [6.21] pour le mcanisme rversible complet et sa grandeur
dtermine le rle inhibiteur de B sur la raction inverse. Bien que l'quation [6.24]
ne soit pas symtrique en A et B, puisque KiA KmB n'est pas gal KmA KiB, sa forme
est symtrique ; ds lors, la mesure des vitesses initiales en absence de produit ne
distingue pas A de B, c'est--dire qu'elle ne permet pas de dterminer lequel des
deux substrats se fixe en premier sur l'enzyme.
Il est intressant d'examiner les dfinitions des constantes de spcificit dans la
forme la plus simple d'un mcanisme enzyme modifi. A partir des dfinitions
donnes dans le tableau 6.2, la constante de spcificit pour A peut tre exprime
en fonction des constantes de vitesse de la manire suivante :
k1k 2
kA = [6.27]
k 1 + k 2
Il faut noter que cette dfinition inclut uniquement des constantes de vitesse de la
moiti de la raction qui implique A ; les constantes de vitesse pour les tapes qui
impliquent B sont absentes. De la mme manire, la constante de spcificit pour B
est indpendante des tapes qui impliquent A. En principe, donc, nous pouvons
penser que si le substrat B est remplac par un analogue B' dont la raction avec A
est catalyse par le mme enzyme, la valeur de kA sera inchange. Les tests appro-
pris ont t raliss avec trs peu d'enzymes, mais quand ils ont t raliss ces
tests n'taient en gnral pas en accord avec la prdiction. L'aspartate transaminase
(quation [6.3]), un des enzymes les plus tudis qui suit un mcanisme enzyme
modifi, et qui est parfois considr comme un archtype de ce type de mcanisme,
se comporte de la manire attendue (KATZ et WESTLEY, 1979), mais plusieurs
autres enzymes tudis par le mme groupe ne le font pas (JARABAK et WESTLEY,
1974 ; KATZ et WESTLEY, 1979, 1980). Avec d'autres enzymes, la variation de kA
avec la nature de B a souvent t considre comme une preuve que le mcanisme
enzyme modifi ne peut pas s'appliquer (par exemple, voir MORPETH et MASSEY,
1982).
Comment pouvons-nous expliquer cette contradiction ? Celle-ci implique-t-elle que

les relations du tableau 6.2 sont incorrectes ou qu'il y a une erreur dans les hypo-
thses faites pour les analyser ? WESTLEY et ses collgues dfendent l'ide que
l'erreur se situe dans l'hypothse implicite selon laquelle le mme enzyme substitu
est produit, avec les mmes proprits cintiques, quelle que soit la demi-raction
qui l'a produit. Ils considrent que l'enzyme conserve dans sa conformation, une
mmoire de la raction qui s'est droule, suffisamment longue pour modifier
les proprits cintiques de l'tape suivante. Il n'est pas ncessaire ici d'analyser
cette ide en dtails ; le point important est que les modles du comportement
enzymatique qui sont considrs dans ce manuel reposent communment sur les
cas les plus simples, alors que les enzymes rels peuvent se comporter de manire
plus complexe. Cela ne signifie pas que les modles simples ne sont pas utiles,
mais seulement qu'ils devraient tre considrs comme des points de dpart pour
analyser les mcanismes enzymatiques et non comme des descriptions compltes
de ceux-ci.
Comme nous en avons dj discut dans les chapitres 1 et 3, la dtermination des
paramtres cintiques peut tre ralise par ajustement paramtrique d'un
graphique de v en fonction de [ A ] pour diffrentes valeurs de [ B ] en utilisant
l'quation [6.24]. Certains logiciels de traitement des donnes permettent d'ajuster
les paramtres sur un ensemble de donnes coordonnes multiples. Nanmoins,
nous prsentons ci-dessous l'analyse graphique des donnes qui permet une
prsentation plus didactique du phnomne mme si un ajustement paramtrique
non-linaire fournit de meilleures estimations des paramtres.
6.5.2. Paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN
Si la concentration d'un des substrats est modifie en maintenant constante la

concentration du second substrat (sans pour cela que cette dernire ne soit ni trs
leve, ni trs faible), l'quation [6.24] conserve la forme de l'quation de
MICHAELIS et MENTEN vis--vis du substrat dont la concentration est modifie.
Par exemple, si [ A ] est modifie et que [ B ] est maintenue constante, les termes
qui ne renferment pas [ A ] sont constants et l'quation [6.24] peut tre rarrange
de la manire suivante, si [ P ] = 0 et si [ Q ] = 0 :
V1 [ B ]
[ A]
KmB + [ B ] V app [ A ]
v = = app [6.28]
KiA KmB + KmA [ B ] Km + [ A ]
+ [ A]
KmB + [ B ]
Les valeurs des paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN sont des fonctions
de [ B ] :
V1 [ B ]
V app = [6.29]
KmB + [ B ]
KiA KmB + KmA [ B ]

Kmapp = [6.30]
KmB + [ B ]
V1
[ B ]
V app KmA
= [6.31]
Kmapp KiA KmB
+[B]
KmA
Il faut noter que les expressions pour V app et V app Kmapp ont la forme d'une quation
de MICHAELIS et MENTEN vis--vis de [ B ] : cette proprit sera utilise ultrieu-
rement pour construire des graphiques secondaires ( 6.5.4).
Cette rduction de l'quation [6.24] une quation de MICHAELIS et MENTEN avec
des paramtres apparents est un cas particulier d'un type plus gnral de compor-
tement ayant une implication tendue en enzymologie. Il signifie que mme si une
raction implique deux ou plusieurs substrats, elle peut tre traite comme une
raction un seul substrat condition que la concentration d'un seul substrat varie.
Ceci explique l'importance de l'analyse cintique de ractions un seul substrat
dans des conditions d'tat stationnaire, mme si en ralit comparativement peu
d'enzymes ont un seul substrat.
6.5.3. Les graphiques primaires

pour les mcanismes complexe ternaire
Une exprience typique permettant de caractriser une raction en accord avec

l'quation [6.24] implique de raliser plusieurs sous-expriences, chacune une
valeur diffrente de [ B ] . Chacune de ces sous-expriences est traite comme une
exprience un seul substrat dans laquelle les paramtres apparents de MICHAELIS
et MENTEN sont dtermins en analysant la dpendance de la vitesse vis--vis de la
concentration de A, [ A ] . N'importe quelle mthode graphique introduite au
chapitre 3 peut tre utilise pour analyser ces donnes, avec pour seule diffrence
par rapport au cas d'un mcanisme un seul substrat que cette approche fournit des
paramtres apparents et non des paramtres rels. De tels graphiques sont appels
des graphiques primaires, pour les distinguer des graphiques secondaires dont
nous allons discuter dans le 6.5.4. Dans le texte ci-dessous, nous nous rfrerons
uniquement l'apparence des graphiques de [ A ] v en fonction de [ A ] , bien que
les autres graphiques soient galement illustrs dans les figures pour comparaison.
La figure 6.13 montre un ensemble typique de graphiques primaires pour un
enzyme qui obit l'quation [6.24]. Les droites se coupent en un point unique
pour lequel [ A ] = KiA et [ A ] v = ( KmA KiA ) V , qui se situe gauche de l'axe
des [ A ] v , mais peut tre au-dessus ou au-dessous de l'axe [ A ] selon les valeurs
relatives de KiA et de KmA . Ces coordonnes fournissent la valeur de KiA
directement, mais la dtermination des autres paramtres ncessite des graphiques
additionnels des paramtres apparents, comme discut dans le 6.5.4.
Pour le mcanisme alatoire complexe ternaire dans des conditions d'quilibre,

l'quation de vitesse complte [6.22], se simplifie aussi sous la forme de l'quation
[6.24] si les termes en [ P ] et [ Q ] sont omis. Donc les graphiques primaires sont
les mmes que ceux du mcanisme ordonn et il est impossible de dterminer
partir des mesures de vitesse initiale en absence de produit s'il existe un ordre
obligatoire de fixation des substrats.
[A]/v 1/v
0,5 0,5 1
2
1/KiA
1 10
0 1/[A]
1/V(1 KmA/KiA)
2
v
V
1 KmA/KiA)
10
10
KiA 0,5
0 [A]
(KmA KiA)/V V/(KmA KiA) 0 v/[A]
6.13 - Graphiques primaires pour des mcanismes squentiels

(sans tenir compte de la possible inhibition par le substrat)
Les droites sont marques par les valeurs de [ B ]/KmB (certaines valeurs sont omises pour
viter de surcharger la figure ; la srie complte des valeurs est la suivante : 0,5 ; 1 ; 2 ; 3 ;
5 ; 10). L'apparence de chacun des trois graphiques linaires couramment utiliss est
prsente dans la figure. Les graphiques primaires sont qualitativement similaires lorsque
[ B ] est modifies pour plusieurs valeurs de [ A ].
6.5.4. Les graphiques secondaires
L'analyse secondaire des donnes permet de dterminer les valeurs relles des
diffrents paramtres. Puisque les quations [6.29] et [6.31] ont la forme d'qua-
tions de MICHAELIS et MENTEN, les graphiques de V app ou de V app Kmapp en
fonction de [ B ] dcrivent des hyperboles rectangulaires passant par l'origine, qui
peuvent tre analyses en utilisant les graphiques linaires habituels. Ces gra-
phiques sont alors appels graphiques secondaires puisqu'ils reprsentent un
traitement supplmentaire des paramtres apparents obtenus partir des graphiques
primaires. Par exemple, les pentes des graphiques primaires de [ A ] v en fonction
de [ A ] (ou des ordonnes l'origine des graphiques de 1 v en fonction de
1 [ A ] ) donnent des valeurs de 1 V app , dont l'expression est obtenue en crivant

l'quation [6.29] de la manire suivante :
1 = KmB 1 + 1 [6.32]
V app V1 [ B ] V1
Un graphique de 1 V app en fonction de 1 [ B ] a donc la forme d'une droite dont la
pente vaut KmB V1 et dont l'ordonne l'origine vaut 1 V1 .
Un autre graphique secondaire est obtenu en utilisant Kmapp V app comme variable
dpendante. Le paramtre Kmapp V app correspond aux ordonnes l'origine des gra-
phiques de [ A ] v en fonction de [ A ] (ou aux pentes des graphiques de 1 v en
fonction de 1 [ A ] ) et son expression est obtenue en crivant l'quation [6.31] sous
la forme suivante :
Kmapp K K K
app
= iA mB 1 + mA [6.33]
V V1 [ B ] V1
Ainsi, un graphique secondaire de Kmapp V app en fonction de 1 [ B ] a donc la
forme d'une droite dont la pente vaut KiA KmB V1 et dont l'ordonne l'origine vaut
KmA V1 . Les quatre paramtres de l'quation [6.24], V1 , KiA , KmA et KmB
peuvent tre aisment calculs partir des graphiques reprsents dans la
figure 6.14.
1/Vapp Kmapp/Vapp
(pente du graphique (ordonne l'origine du
primaire de [A]/v graphique primaire de
en fonction de [A]) [A]/v en fonction de [A])
Pente = Pente =
KmB/V KiAKmB/V
KmA/V
1/V
1/KmB 0 1/[B] KmA 0 1/[B]

KiAKmB
6.14 - Graphiques secondaires pour des mcanismes complexe ternaire
Le graphique de [B] V app en fonction de [B] s'applique aussi aux mcanismes enzyme
modifi.
L'quation [6.30] pour Kmapp dcrit galement une hyperbole rectangulaire, mais la
courbe ne passe pas par l'origine. Dans ce cas, Kmapp approche KA lorsque [ B ] tend
vers zro et approche KB lorsque [ B ] devient trs grand. Il s'agit donc d'une
hyperbole trois paramtres, qui ne peut pas tre reprsente sous une forme
linaire. Comme dans d'autres cas, Kmapp est un paramtre moins commode
utiliser que KmA V1 .
Il est galement possible de considrer B plutt que A en tant que substrat dont la
concentration est variable, et de tracer des graphiques de [ B ] v en fonction de
[ B ] diffrentes valeurs de [ A ] ; en effet, tant que l'ordre de fixation des
substrats n'a pas t dtermin, la dsignation des substrats est arbitraire. L'analyse
est identique et il n'est pas ncessaire de la dcrire une seconde fois. La seule
diffrence importante est que KiB n'apparat pas dans l'quation [6.24] mais que
KiA KmB KmA apparat chaque fois que KiB est attendu sur la base du simple
change entre A et B.
6.5.5. Graphiques pour les mcanismes enzyme modifi
Pour les mcanismes enzyme modifi, la vitesse initiale en absence de produit est
donne par l'quation suivante :
V1 [ A ][ B ]
v = [6.34]
KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ]
La caractristique la plus surprenante de cette quation est l'absence de constante
au dnominateur (le problme [6.4] la fin du chapitre explore l'origine de cette
absence). Cette caractristique induit un comportement aisment diffrentiable de
celui observ avec les mcanismes complexe ternaire lorsque la concentration
de l'un ou l'autre des substrats est modifie : par exemple, si [ A ] est modifie
pour une valeur constante de [ B ] , les valeurs apparentes des paramtres de
MICHAELIS et MENTEN sont les suivantes :
V1 [ B ]
V app = [6.35]
KmB + [ B ]
KmA [ B ]
Kmapp = [6.36]
KmB + [ B ]
V app = V1 [6.37]
Kmapp KmA
Bien que l'quation [6.35] soit identique l'quation [6.29], l'quation [6.36] est
plus simple que l'quation [6.30] et l'quation [6.37], contrairement l'quation
[6.31] ne montre aucune dpendance vis--vis de [ B ] . Cela signifie que, dans ce
cas, Vapp se comporte de la mme manire que pour les mcanismes complexe ter-
naire, mais que le paramtre V app Kmapp est indpendant de [ B ] et prend une valeur
constante V1 KmA . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] ou de
[ B ] v en fonction de [ B ] forment des sries de droites se coupant sur les axes de
[ A ] v ou [ B ] v comme le montre la figure 6.15. Le profil est aisment recon-
naissable par rapport celui des mcanismes complexe ternaire (figure 6.14) sauf
si KiA est beaucoup plus petit que KmA .
[A]/v 0,5
1/v 0,5
1
5
1
Pente =
KmA /V
2
0 1/[A]
5 v
5
KmA /V
0,5
KmA /V
0 v/[A]
0 [A]
6.15 - Graphiques primaires pour un mcanisme enzyme modifi
(en absence d'inhibition par le substrat)
Les valeurs indiques sur les droites sont les valeurs correspondantes de [B] /KmB.
L'apparence de chacun des trois types courants de graphique linaire est prsente. Les
graphiques primaires sont qualitativement similaires quand [B] varie pour diverses valeurs
de [A].
Le seul graphique secondaire utile pour les mcanismes enzyme modifi est celui
de [ B ] V app en fonction de [ B ] qui a les mmes pente et ordonne l'origine
que le graphique correspondant dans le cas des mcanismes complexe ternaire
(figure 6.14).
6.6. INHIBITION PAR LE SUBSTRAT
6.6.1. Pourquoi y a-t-il une inhibition par le substrat ?
L'analyse prsente dans le 6.5 n'est strictement valable que pour des concen-
trations faibles de substrat, puisqu'en effet, dans n'importe quel mcanisme raison-
nable, au moins un des quatre ractifs aura la capacit de se fixer fortement une
mauvaise forme de l'enzyme. Dans le mcanisme enzyme modifi, le substrat et
le produit qui ne possde pas le groupe transfr (respectivement dnomms Y et X
dans le symbolisme utilis prcdemment) pourraient se fixer la mauvaise forme
de l'enzyme libre ; dans le mcanisme squentiel alatoire, un des ractifs peut se

fixer un mauvais complexe binaire ; dans le mcanisme squentiel ordonn, le
second substrat ou le premier produit peut se fixer au mauvais complexe binaire.
Dans ce dernier cas, l'inhibition par le substrat peut avoir lieu soit dans la raction
directe, soit dans la raction inverse, mais pas dans les deux directions, puisque
seulement un des deux complexes binaires est disponible. Par souci pratique, nous
choisirons B comme le substrat responsable de l'inhibition dans chacun des
mcanismes, sachant que les rsultats peuvent facilement tre transposs l'autre
situation si cela est ncessaire.
6.6.2. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire
Le complexe non-productif EBQ impliqu dans le mcanisme squentiel ordonn a

t invoqu dans le 6.2. Il peut tre introduit dans l'quation de vitesse en mul-
tipliant chaque terme du dnominateur qui se rapporte EQ par 1 + ( k5 [ B ] k 5 ) ,
o k 5 k5 reprsente la constante de dissociation de EBQ. L'quation [6.24] s'crit
alors de la faon suivante :
V1 [ A ][ B ]
v = [6.38]
[ B ]
KiA KmB + KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ] 1 +
KsiB
o KsiB est la constante qui dfinit la force de l'inhibition. Il ne s'agit pas de la
constante de dissociation, k 5 k5 , parce que le coefficient [ A ][ B ] est driv non
seulement du complexe EQ mais galement du complexe ternaire (EAB + EPQ),
comme cela apparat clairement lors de la drivation de l'quation [6.20] dans le
6.3.2. En fonction des quantits relatives de ces deux complexes prsentes l'tat
stationnaire, KsiB peut tre approximativement gale k 5 k5 , ou elle peut tre
beaucoup plus grande. Donc, dans ce mcanisme, l'inhibition par le substrat n'est
pas ncessairement dtectable aux concentrations de substrat B qui sont
atteignables exprimentalement.
En accord avec l'quation [6.38], l'inhibition par le substrat n'est effective que
pour de fortes concentrations de A, c'est--dire qu'elle est exacerbe par A, et
ressemble donc l'inhibition anti-comptitive. Les graphiques primaires de [ B ] v
en fonction de [ B ] sont paraboliques, avec un point d'intersection commun situ
KiA KmB
[B] = . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] sont
KmA
linaires mais n'ont aucun point d'intersection. Ces graphiques sont illustrs dans la
figure 6.16.
[A]/v [B]/v 0,5

0,5
25 1
1 2
10 10
2
5
[A]
[B]
[A]
[B]
6.16 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques
primaires pour les mcanismes complexe ternaire
6.6.3. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire
Dans le mcanisme alatoire complexe ternaire, la concentration de EQ est nulle

en absence de Q si l'hypothse de l'quilibre rapide est valable. Puisque B ne peut
pas se fixer une espce qui n'existe pas, l'inhibition par le substrat n'a pas lieu
avec ce mcanisme sauf si Q est ajout. Si l'hypothse de l'quilibre rapide n'est pas
vrifie, aucune raison n'empche l'existence d'un phnomne d'inhibition par le
substrat, mais sa nature est difficile prdire cause de la complexit de l'quation
de vitesse. Dans ce type de mcanisme, EBQ n'est pas un complexe cul-de-sac,
puisqu'il peut tre form partir de EB ou de EQ, et ne doit pas ncessairement
tre en quilibre avec l'un de ces complexes.
6.6.4. Mcanisme enzyme modifi
Dans le mcanisme enzyme modifi, le complexe non-productif EB rsulte de la

fixation de B sur E (ou de la fixation de Y sur E dans le symbolisme du 6.2).
Il constitue un complexe cul-de-sac et peut tre incorpor dans l'quation de vitesse
en multipliant les termes qui contiennent E dans le dnominateur de cette quation
par 1+ ( [ B ] KsiB ) , o KsiB reprsente la constante de dissociation de EB.
L'quation [6.34] prend alors la forme suivante :
V1 [ A ][ B ]
v = [6.39]
[ B ]
KmB [ A ] + KmA [ B ] 1 + + [ A ][ B ]
KsiB
En accord avec cette quation, l'inhibition est la plus efficace quand [ A ] est
faible, et donc elle ressemble une inhibition comptitive. Les graphiques
primaires de [ B ] v en fonction de [ B ] sont paraboliques, avec un point
d'intersection commun situ sur l'axe [ B ] v , c'est--dire pour [ B ] = 0 . Les

graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] sont linaires, sans point
d'intersection, mais les droites de chaque paire se coupent une valeur positive de
[ A ] , c'est--dire droite de l'axe [ A ] v . Ces graphiques sont illustrs dans la
figure 6.17.
[A]/v 0,5 [B]/v [A]
0,5
2 1
5
10 2
5
[B] 10
0 [A] 0 [B]
6.17 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques
primaires pour les mcanismes enzyme modifi
6.6.5. Valeur diagnostique de l'inhibition par le substrat
L'inhibition par le substrat peut premire vue apparatre comme une complication
inutile dans l'analyse des donnes cintiques. En ralit, elle est trs informative,
puisqu'elle accentue la diffrence de comportement prdite entre les mcanismes
complexe ternaire et les mcanismes enzyme modifi et qu'elle est gnralement
simple interprter. Comme, en principe, un substrat se fixe plus fortement la
bonne forme de l'enzyme qu' la mauvaise, l'inhibition par le substrat est rarement
suffisamment importante pour perturber l'analyse dcrite dans le 6.5. L'inhibition
par un substrat obtenue pour une concentration faible de l'autre substrat fournit une
preuve positive de l'existence d'un mcanisme enzyme modifi. Par contre,
l'observation d'une valeur de V app Kmapp qui soit indpendante de la concentration
de l'autre substrat (q. [6.37]) ne constitue qu'un argument ngatif pour l'existence
d'un mcanisme enzyme modifi, puisqu'un tel comportement est galement
observ dans un cas spcial de mcanisme squentiel o la variation attendue
V app Kmapp n'est pas dtecte.
Dans un mcanisme ordonn complexe ternaire, l'inhibition par le substrat permet
d'identifier le substrat qui se fixe en second sans avoir recours des tudes
d'inhibition par le produit.
6.7. INHIBITION PAR LE PRODUIT
Les tudes d'inhibition par le produit font partie des mthodes les plus utiles pour
la dtermination de l'ordre de fixation des substrats et de l'ordre de libration des
produits, puisqu'elles sont la fois trs informatives et faciles comprendre.
A condition qu'un seul des produits soit ajout au mlange ractionnel, le terme du
numrateur qui correspond la raction inverse doit tre gal zro (except dans
les ractions un seul produit, qui ne sont pas courantes). Le seul effet d
l'addition du produit, est l'augmentation de la valeur du dnominateur de l'quation
de vitesse, qui se traduit par une inhibition de la raction directe.
La question de savoir si un inhibiteur particulier agit comme un inhibiteur comp-
titif, anti-comptitif ou mixte n'a pas de rponse absolue, puisque cela dpend du
substrat dont la concentration est considre comme une variable. Une fois que ce
choix est ralis, cependant, la rponse est directe : le dnominateur de l'quation
de vitesse peut tre spar en termes constants et variables, selon que ceux-ci
contiennent ou non la concentration du substrat variable ; l'expression de V app
dpend des termes variables, alors que l'expression de V app Kmapp dpend des
termes constants, comme dans le 6.5. Comme nous l'avons dcrit dans le 5.2 et
rsum dans le tableau 5.1, les diffrents types d'inhibition sont classs selon qu'ils
affectent V app Kmapp (inhibition comptitive), V app (inhibition anti-comptitive) ou
les deux (inhibition mixte). Ainsi un produit se comporte comme un inhibiteur
comptitif si sa concentration apparat seulement dans les termes constants, comme
un inhibiteur anti-comptitif si elle apparat dans les termes variables et comme un
inhibiteur mixte si elle apparat dans les termes constants et variables. Si le produit
ne peut se combiner qu'avec une seule forme de l'enzyme, uniquement des termes
linaires en concentration sont possibles, et donc l'inhibition est linaire ; mais
l'inhibition non-linaire devient possible si le produit peut galement se fixer sur
une mauvaise forme de l'enzyme pour donner un complexe de type cul-de-sac.
Ces principes peuvent tre illustrs en utilisant comme exemple un mcanisme
ordonn complexe ternaire dans des conditions o P est ajout au mlange
ractionnel en absence de Q, et o A est le substrat dont la concentration est
variable. L'quation complte de vitesse est l'quation [6.21], mais elle peut tre
simplifie en liminant les termes qui renferment [ Q ] , et en rarrangeant le
dnominateur D de sorte que les termes qui contiennent [ A ] soient spars des
autres termes. Une fois cela ralis, le dnominateur peut tre crit de la manire
suivante :
KmA [ B ] KmQ [ P ] [ A ] [ B ] KmQ [ P ] [ B ][ P ]
D = 1+ + + 1+ + + [6.40]
KiA KmB KmP KiQ KiA KmB KmP KiQ KmB KiP
Partie constante Partie variable

Comme dans cette expression, la fois la partie constante et la partie variable

contiennent [ P ] , le produit P agit comme un inhibiteur mixte lorsque la concen-
tration de A est modifie. Une analyse similaire montre que lorsque B est le sub-
strat dont la concentration est modifie, la fois P et Q se comportent comme des
inhibiteurs mixtes. Cependant, lorsque nous considrons l'inhibition par Q lorsque
A est le substrat variable, les rsultats sont diffrents parce que le dnominateur de
l'quation [6.21] ne contient aucun terme dans lequel [ A ] et [ Q ] soient multi-
plis l'un par l'autre, bien que [ Q ] apparaissent dans des termes qui ne contiennent
pas [ A ] :
K [ B ] [ Q ] KmA [ B ][ Q ] [ A ] [ B ]
D = 1 + mA + + + 1 + [6.41]
KiA KmB KiQ KiA KmB KiQ KiA KmB
Partie constante Partie variable

Dans ce cas, Q se comporte comme un inhibiteur comptitif vis--vis de A. Ces
rsultats ainsi que ceux correspondant aux mcanismes enzyme modifi, sont
rsums dans le tableau 6.4. Les types d'inhibition prdits pour le mcanisme ala-
toire complexe ternaire sont considrs dans le problme 6.5 la fin du chapitre.
Tableau 6.4 - Inhibition par le produit
dans les deux types principaux de mcanismes ordonns
Type d'inhibition
Produit Substrat variable Complexe ternaire Enzyme modifi
P A Mixte Mixte
(anti-comptitive) (pas d'inhibition)
Mixte Comptitive
P B (mixte) (comptitive)
Comptitive Comptitive
Q A (comptitive) (comptitive)
Mixte Mixte
Q B (anti-comptitive) (pas d'inhibition)
Ce tableau montre le type d'inhibition attendu pour chaque combinaison de produit et de
substrat variable. Les descriptions entre parenthses montrent comment le type d'inhibition
est modifi lorsque le substrat constant est prsent une concentration saturante.
Pour des concentrations leves du substrat constant, ces types d'inhibition par
le produit sont modifis parce que les termes de l'quation de vitesse qui ne
contiennent pas la concentration du substrat constant deviennent ngligeables. La
partie constante de l'quation [6.40], par exemple, ne contient aucun terme en
[ B ][ P ] , et donc devient indpendante de [ P ] si [ B ] est grande ; la partie
variable, d'un autre ct, contient un terme en [ B ][ P ] et en consquence reste
dpendante de [ P ] lorsque [ B ] est grande : ceci implique que lorsque A est le
substrat dont la concentration est modifie, l'inhibition par le produit P devient une
simple inhibition anti-comptitive lorsque la fixation de B s'approche de la
saturation. La mme analyse applique l'quation [6.41] montre que le terme

constant continue dpendre de [ Q ] lorsque [ B ] est grande ; ainsi Q reste un
inhibiteur comptitif vis--vis de A lorsque la fixation de B s'approche de la
saturation. Ces rsultats, ainsi que ceux correspondants obtenus pour les autres
combinaisons de substrats et de produits sont prsents dans le tableau 6.4.
Il est ais de prdire les caractristiques de l'inhibition par le produit pour n'importe
quel mcanisme. La mthode la plus fiable consiste tudier la forme de l'quation
complte de vitesse, mais il est gnralement possible d'obtenir les rsultats par
inspection du mcanisme en utilisant la mthode de KING et ALTMAN, comme
dcrit dans le 6.3.6. Pour chaque combinaison de produit et de substrat variable,
il faut rechercher le profil de KING et ALTMAN qui donne un terme contenant la
concentration de produit mais pas la concentration de substrat variable ; si cela est
possible, la concentration de produit doit se trouver dans la partie constante du
dnominateur et il doit y avoir une composante comptitive dans l'inhibition. Il faut
alors chercher dans un profil de KING et ALTMAN un terme qui contienne la fois
la concentration du produit et celle du substrat variable ; si cela est possible, la
concentration de produit doit apparatre dans la partie variable du dnominateur et
il doit y avoir une composante anti-comptitive dans l'inhibition. En disposant
de cette information, il devient simple de dterminer le type d'inhibition. En
recherchant le profil de KING et ALTMAN utilisable, il faut se rappeler que les
tapes de libration du produit sont irrversibles si le produit en question n'est pas
prsent dans le mlange ractionnel.
Dans une raction deux produits, l'inhibition anti-comptitive est largement
limite au cas mentionn, l'inhibition par le premier produit dans un mcanisme
squentiel comptitif quand la saturation par le second substrat est atteinte. Elle
devient plus commune dans les ractions gnrant trois produits et plus, et a lieu
avec au moins un des produits dans tous les mcanismes ordonns complexe
ternaire de ce type ( 6.9).
6.8. PRPARATION DES EXPRIENCES
La mise au point d'une exprience pour tudier une raction deux substrats en
absence de phnomne d'inhibition repose sur des principes similaires ceux
utiliss pour l'tude des inhibitions simples ( 5.7). Les valeurs des constantes de
MICHAELIS et des constantes d'inhibition pour les diffrents substrats ne sont
videmment pas connues l'avance, et des tests prliminaires doivent tre raliss.
Quelques expriences ralises dans des conditions o la concentration d'un des
substrats est modifie pour deux concentrations donnes de l'autre substrat, une
aussi grande que possible et une aussi faible que possible, devraient permettre de
dterminer la gamme de concentrations dans laquelle se situe la valeur du Km pour
le premier substrat. Une fois cette gamme connue, des concentrations de substrats
peuvent tre slectionnes pour la dtermination prcise de la valeur des para-

mtres cintiques. Les concentrations du second substrat peuvent tre slectionnes
de manire similaire sur la base de l'exprience inverse. A chaque concentration du
substrat fixe les concentrations du substrat, qui est modifi, devraient s'tendre
idalement de 0,2 Kmapp jusqu' 10 Kmapp ou jusqu' la concentration la plus leve
qu'il soit possible d'atteindre exprimentalement, comme dans les expriences
d'inhibition imaginaires dcrites dans le tableau 5.3 ( 5.7). Il n'est pas ncessaire
d'avoir les mmes valeurs de concentration du substrat variable aux diffrentes
concentrations du substrat fixe. Toutefois, il est utile d'avoir des ensemble bass
approximativement sur une grille (comme dans le tableau 5.3), parce que cela
permet de porter en graphique les donnes d'une mme exprience de deux
manires diffrentes, o chaque substrat est son tour dsign comme le substrat
variable . Notons cependant que les termes variable et constant sont
choisis arbitrairement et sont particulirement utiles pour l'analyse des rsultats et
en particulier pour dfinir ce que nous dsignons par comptitif , anti-
comptitif dans les ractions plusieurs substrats.
La prparation des expriences d'inhibition par le produit pour les expriences
plusieurs substrats ne ncessite aucune discussion particulire autre que celle
donne dans le 5.8 pour les tudes des inhibitions simples. Il devrait tre suffisant
de souligner que les expriences doivent tre ralises de telle sorte qu'elles
permettent de rvler l'existence de composantes significatives d'inhibition comp-
titive ou anti-comptitive.
6.9. UN EXEMPLE SIMPLE D'TUDE D'UN ENZYME DEUX

SUBSTRATS ET DEUX PRODUITS : LA CRATINE KINASE
Le traitement cintique des ractions enzymatiques impliquant plusieurs substrats

et plusieurs produits en conditions d'tat stationnaire est compliqu. Nanmoins,
comme nous en avions dj discut au 3.3.6, les quations de vitesse d'un m-
canisme enzymatique peuvent tre simplifies si les tapes de fixation/dissociation
des substrats et des produits sont traites comme tant en quilibre rapide vis--vis
de la raction chimique. Cette situation est couramment dnomme situation de
quasi-quilibre . Le mcanisme cintique de la cratine kinase suit un tel mca-
nisme et peut servir pour initier les tudiants la drivation des quations de
vitesse de mcanismes enzymatiques complexes mais galement pour la ralisation
de travaux pratiques.
La cratine kinase (CK) est un enzyme dimrique que l'on trouve chez l'homme,
essentiellement dans les muscles et dans le cerveau. Il catalyse la phosphorylation
de la cratine pour former la phosphocratine, qui est utilise pour le stockage et le
transport d'nergie chimique.
Le mcanisme cintique de la cratine kinase est un mcanisme complexe

ternaire dans lequel la fixation des substrats et des produits suit un ordre alatoire
(MORRISON et JAMES, 1965 ; MORRISON et CLELAND, 1966) (dans de nombreux
ouvrages ce mcanisme est appel mcanisme squentiel bi-bi-alatoire en quasi
quilibre qui correspond une nomenclature tablie par CLELAND (1963)).
Il peut tre simplement reprsent par le schma de la figure 6.18 o A reprsente
le complexe MgATP, B reprsente la cratine, P reprsente la phosphocratine et Q
reprsente le complexe MgADP. Les constantes K1, K2, K3, K4, K6, K7, K8 et K9 sont
les constantes de dissociation des diffrents complexes qui s'crivent de la faon
suivante pour la partie gauche du systme.
[ E ][ A ]
K1 =
[ EA ]
[ EA ][ B ]
K2 =
[ EAB ]
[6.42]
[ E ][ B ]
K3 =
[ EB ]
[ EB ][ A ]
K4 =
[ EAB ]
Les constantes de dissociation pour les complexes impliquant P et Q s'crivent de
la mme manire.
A B P Q
K1 K2 K6 K7
EA k5 EP
E E
EAB k5 EPQ
EB EQ
K3 K4 K8 K9
B A Q P
6.18. Mcanisme ractionnel de la cratine kinase
La cintique des ractions catalyses par la cratine kinase peut tre dcrite par un
mcanisme complexe ternaire squentiel o la fixation des substrats et des produits est
alatoire et en tat de quasi-quilibre. Le schma est dessin selon la procdure introduite
par CLELAND. L'hypothse du quasi-quilibre simplifie la drivation des quations de vitesse.
Dans le cas o les quilibres de dissociation des substrats et des produits sont en
quilibre rapide, nous pouvons utiliser les lois de la thermodynamique pour simpli-
fier l'criture de l'quation de vitesse. En effet, dans un systme l'quilibre, la
variation d'nergie libre entre deux tats du systme ne dpend pas du chemin
ractionnel suivi et correspond la somme des variations d'nergie libre des diff-
rentes tapes se succdant sur un chemin donn. Les parties gauche et droite du
mcanisme de la cratine kinase, correspondant aux tapes de fixation des substrats
et des produits, peuvent tre considres comme deux systmes l'quilibre et nous
pouvons crire :
DG + DG = DG + DG
1 2 3 4 [6.43]
qui peut aussi s'crire :
RT ln K1 + RT lnK 2 = RT ln K3 + RT ln K 4 [6.44]
Aprs simplification, nous obtenons l'quation suivante :
ln ( K1 K 2 ) = ln ( K3 K 4 ) [6.45]
et finalement : K1 K 2 = K3 K 4 [6.46]
Cette dernire quation est trs utile pour crire l'quation de vitesse. Si, par souci
de simplification, nous considrons que [ P ] = [ Q ] = 0 , l'quation de conservation
de l'enzyme peut s'crire comme suit :
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ] + [ EB ] + [ EAB ]
[ A ] [ B ] [ A ][ B ]
= [ E ] 1 + + + [6.47]
K1 K3 K1 K 4
= [ E ]D
[ A ] [ B ] [ A ][ B ]
o D = 1 + + + [6.48]
K1 K3 K1 K 4
La vitesse de la raction s'crit :
v = k5 [ EAB ]
[ E ][ A ][ B ]
= k5 [6.49]
K1 K 4
[ E ]0 [ A ][ B ]
= k5
D K1 K 4
Si nous dfinissons la vitesse limite de la raction directe comme V1 = k5 [ E ]0 ,
nous pouvons crire :
V [ A ][ B ]
v = 1 [6.50]
D K1 K 4
A partir de cette quation de vitesse, il est alors possible d'analyser la cintique de
la raction en utilisant par exemple la linarisation selon la mthode introduite par
LINEWEAVER et BURK ( 3.5.2.1) :
1 = 1 K1 K 4 D = 1 K1 K 4 + K 4 + K1 + 1 [6.51]

v V1 [ A ][ B ] V1 [ A ][ B ] [ B ] [ A ]
Si [ B ] est fixe, alors nous avons :

1 = 1 1 K1 K 4 + K + 1 K 4 + 1 [6.52]
3
v [ A ] V1 [ B ] V1 [ B ]
Un graphique primaire de 1 V1 en fonction de 1 [ A ] (graphique primaire en

double inverse) ayant l'allure d'une droite peut tre trac pour chaque concentration
de B (figure 6.19).
1/v [B]1
[B]
[B]2
[B]3
[B]4
1 0 1/[A]

K1
6.19 - Reprsentation du graphique primaire en double inverse
pour diffrentes concentrations de B
Les droites pour chaque concentration de B se croisent toutes en point, dont

l'abscisse permet de dterminer K1, comme nous le dmontronsci-dessous. Pour
deux droites obtenues deux concentrations distinctes de B, [ B ]1 et [ B ]2 , nous
pouvons crire :
K K K
y1 = x 1 1 4 + K3 + 1 4 + 1
V1 [ B ]1 V1 [ B ]1
[6.53]
1 K1 K 4 1 K4
y2 = x + K3 + + 1
V1 [ B ]2 V1 [ B ]2
Au point d'intersection, y1 = y2, ce qui nous permet d'crire :

K1 K 4 1 K K4
x 1 + 1 4 = 0 [6.54]
V1 [ B ]1 [ B ]2 V1 [ B ]1 [ B ]2
qui se simplifie pour donner : x K1 K 4 + K 4 = 0 [6.55]
d'o nous obtenons la valeur de l'abscisse de l'intersection :
K4
x = = 1 [6.56]
K 4 K1 K1
Un graphique secondaire dans lequel la V app pour chaque [ B ] (figure 6.20),

correspondant l'intersection de chaque droite avec l'ordonne, permet alors de
dterminer les autres paramtres du modle. En rptant cette procdure avec le
systme fonctionnant en sens inverse, c'est--dire en fixant [ A ] = [ B ] = 0 et en
faisant varier [ P ] et [ Q ] , il est
1 possible de dterminer k 5 et les

Vapp constantes de dissociation inter-
K4 venant dans la partie droite du

V schma de la figure 6.18.
1

V
1 0 1

K4 [B] 6.20 - Graphique secondaire
En accord avec la relation de HALDANE ( 3.6.3), la constante d'quilibre globale

de la raction peut tre calcule de la manire suivante :
VK K
K = 1 6 7 [6.57]
V1 K1 K 2
6.9.1. Application pratique de la mesure des paramtres

pour la cratine kinase
La cratine kinase et les diffrents enzymes utiliss pour la ralisation des systmes
coupls, sont des enzymes disponibles commercialement. Ces expriences peuvent
donc servir pour la ralisation de travaux pratiques pour les tudiants. L'tude des
ractions catalyses par la cratine kinase permet de se familiariser avec les sys-
tmes enzymatiques complexes, mais galement avec l'utilisation de systmes
coupls. En effet, la raction catalyse par la cratine kinase, n'implique pas de
variation de signal spectroscopique facilement exploitable pour suivre la cintique
de la raction. La solution ce problme consiste utiliser un systme coupl qui
va lier la raction de conversion ATP/ADP la conversion NADred /NADox. La
conversion NADred /NADox donne lieu une variation importante de l'absorbance
340 nm caractrise par un M = 6 200M1 cm1 (voir 4.1.1) qui peut donc facile-
ment tre suivie par spectrophotomtrie.
Le systme coupl choisi pour suivre la raction directe implique deux enzymes
qui catalysent deux ractions successives. La pyruvate kinase utilise l'ADP et le
phosphonolpyruvate pour former du pyruvate et de l'ATP. Ensuite, la lactate
dshydrognase rduit le pyruvate en lactate et oxyde le NADred en NADox. Les
substrats de ces deux enzymes doivent tre utiliss des concentrations finales de
l'ordre de 1 mM pour le phosphonolpyruvate et de 0,3 mM pour le NADred. Le
systme coupl ne doit pas limiter la vitesse de l'ensemble du systme. L'ADP doit
tre converti en ATP aussitt qu'il est produit et ne doit donc pas s'accumuler. Il en
va de mme pour le NADred qui doit tre consomm simultanment la production
d'ATP. De plus la raction doit tre suffisamment rapide pour permettre une
mesure aise de la vitesse initiale. Il faut donc vrifier l'efficacit du systme
coupl et dterminer sa vitesse afin de choisir la quantit adquate d'enzyme. La
concentration de cratine kinase doit tre aussi leve que possible dans les limites
de saturation du systme coupl. Il faut que la vitesse de disparition du NADred soit
proportionnelle la quantit de cratine kinase prsente dans le mlange
ractionnel.
Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprtables, il est nces-
saire mesurer la vitesse initiale de la raction directe pour des concentrations de
cratine allant de 1 20 mM pour diffrentes concentrations d'ATP allant de 1,5
12 mM. Les mesures de vitesse sont toutes effectues 25C, dans un tampon
50 mM Tris/HCl pH 7,1 contenant 5 mM d'actate de magnsium (le Mg2+ est
ncessaire au fonctionnement de la cratine kinase, car les substrats de l'enzyme
sont les complexes MgATP et MgADP (voir 4.4)), 0,5 mM de dithiothreitol (qui
permet la rduction de la fonction thiol dans le site actif de la cratine kinase) et
0,5 mM d'EGTA (un agent chlateur des mtaux lourds, en particulier du Zn2+, qui
sont des inhibiteurs de l'enzyme).
Pour tudier la raction inverse, il est ncessaire d'utiliser un second systme
coupl. Dans ce cas, l'ATP produit par la cratine kinase est utilis, d'abord par
l'hexokinase. En prsence de glucose, cet enzyme convertit l'ATP en ADP et trans-
forme le glucose en glucose 6-phosphate. Le glucose 6-phosphate est alors utilis
par un second enzyme, la glucose 6-phosphate dshydrognase qui l'oxyde en
6-phosphogluconate tout en rduisant le NADox en NADred. Ce second systme a
l'avantage d'utiliser le mme signal spectroscopique que le premier. L'utilisation de
ce systme ncessite les mmes mises au point que celles dcrites pour le systme
pyruvate kinase/lactate dshydrognase. Pour obtenir des graphiques primaires et
secondaires interprtables, il est ncessaire de mesurer la vitesse initiale de la
raction directe pour des concentrations de phosphocratine, allant de 0,25
5,0 mM pour diffrentes concentrations d'ADP allant de 0,05 1,0 mM.
6.10. Ractions trois substrats et plus
Les mthodes pour l'tude des ractions impliquant plus de deux substrats sont une
extension logique de celles dcrites dans les paragraphes prcdents ; elles ne
ncessitent donc pas une prsentation aussi dtaille que celle faite pour les
ractions deux substrats. Les ractions de ce type ne sont ni rares, ni ngligeables
en biochimie elles comprennent par exemple le groupe des ractions catalyses
par les aminoacyl-ARNt synthtases et dans ce paragraphe nous soulignerons

quelques points importants, en mettant essentiellement l'accent sur les carac-
tristiques qui n'ont pas t traites dans les cintiques deux substrats.
Les ractions trois substrats n'ont pas automatiquement trois produits en effet,
des ractions trois substrats et deux produits sont courantes mais pour maintenir
notre discussion dans des limites raisonnables, nous considrerons uniquement le
cas d'une raction trois substrats A, B et C et trois produits P, Q et R. Si le
mcanisme est branch (c'est--dire que certaines tapes peuvent avoir lieu de
manire alatoire), l'quation complte de vitesse renferme des termes de
concentration levs au carr et ventuellement des puissances suprieures, mais
si aucune dpendance de haut ordre n'est observe, la forme la plus gnrale de
l'quation de vitesse en absence de produit est la suivante :
V1 [ A ][ B ][ C ]
v = [6.58]
K ABC + KBC [ A ] + K AC [ B ] + K AB [ C ] +
KmC [ A ][ B ] + KmB [ A ][ C ] + KmA [ B ][ C ] + [ A ][ B ][ C ]
dans laquelle V1 est la vitesse limite quand les trois concentrations de substrats sont
extrapoles jusqu' saturation. KmA , KmB et KmC sont les constantes de MICHAELIS
pour les trois substrats quand la concentration des deux autres substrats est satu-
rante, et K ABC , KBC , K AC et K AB sont des produits de constantes de MICHAELIS
et d'autres constantes avec des significations particulires qui dpendent du
mcanisme considr, mais qui sont analogues au produit KiA KmB que l'on trouve
dans l'quation [6.24].
L'quation [6.58] s'applique dans son intgralit si la raction se droule par l'inter-
mdiaire d'un complexe quaternaire EABC qui se trouve dans des conditions d'tat
stationnaire ou d'quilibre avec l'enzyme libre E et avec tous les autres complexes
binaires et ternaires, c'est--dire EA, EB, EC, EAB, EBC et EAC. En plus de ce
mcanisme totalement alatoire en quilibre rapide, une gamme d'autres mca-
nismes quaternaires complexes est possible, dans lesquels l'ordre de fixation est
totalement ou partiellement obligatoire. Le cas extrme est celui du mcanisme
ordonn dans lequel il y a un seul complexe binaire, EA, et un seul complexe
ternaire, EAB, entre E et EABC. Les cas intermdiaires plausibles sont ceux dans
lesquels il y a deux complexes binaires et un complexe ternaire, par exemple EA,
EB et EAB ou ceux dans lesquels il y a un complexe binaire et deux complexes
ternaires, par exemple EA, EAB et EAC.
La classification des mcanismes deux substrats en mcanismes complexe
ternaire et mcanismes enzyme modifi peut tre tendue aux mcanismes trois
substrats, mais avec une gamme plus large de possibilits. Le type extrme de
mcanisme enzyme substitu est celui dans lequel uniquement des complexes
binaires sont forms et dans lequel chaque tape de fixation du substrat est suivie
par une tape de libration d'un produit. Alternativement, une raction trois
substrats et trois produits peut combiner des aspects des deux types de mcanismes,
de sorte que deux molcules de substrats peuvent se fixer pour former un complexe
ternaire partir duquel un premier produit est libr avant que le troisime substrat
ne puisse se fixer. Par exemple, avec la plupart des aminoacyl-ARNt synthtases,
l'acide amin et l'ATP ragissent avec l'enzyme pour librer du pyrophosphate et
former un complexe ternaire compos de l'enzyme, de l'acide amin et de l'AMP ;
ce complexe ragit alors avec l'ARNt pour terminer la raction. Dans le cas de la
thronyl-ARNt synthtase, l'isolement d'un tel complexe (ALLENDE J.E. et al.,
1964) a permis de raliser une analyse cintique qui a confirm l'interprtation
initiale (ALLENDE C.C. et al., 1970). Depuis lors, de nombreuses tudes similaires
ont t ralises avec d'autres enzymes du mme groupe.
Il est clair que le nombre de mcanismes possibles est trs grand, et mme si
certains peuvent tre exclus parce qu'ils ne sont pas plausibles chimiquement (une
limination qui n'est pas toujours faite) il reste encore environ dix huit mcanismes
possibles trois substrats et trois produits (dont la liste t tablie par WONG et
HANES, 1969) sans considrer les complications possibles de formation de com-
plexes non-productifs et d'isomrisation. Il est donc particulirement important de
prendre en compte la plausibilit chimique des mcanismes dans l'tude cintique
des ractions trois substrats. De plus, condition que la vitesse semble obir
l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour chacun des substrats considrs spar-
ment, la pratique habituelle consiste utiliser des quations de vitesse drives en
supposant que toutes les parties alatoires du mcanisme sont dans un tat de
quasi-quilibre et que toutes les parties ordonnes sont l'tat stationnaire. Ceci
empche videmment l'apparition de termes d'ordre lev dans l'quation de vitesse
et fournit un argument pour l'utilisation de la mthode de CHA ( 6.3.6).
D'un point de vue cintique, les diffrents types de mcanisme gnrent des qua-
tions de vitesse comparables l'quation [6.58] mais qui diffrent entre elles par
l'absence de certains termes au dnominateur, comme l'a fait remarquer en premier
FRIEDEN (1959). Par exemple, pour le mcanisme illustr dans la figure 6.21 il est
vident que la constante et les termes en [ A ] et [ B ] sont absents du dnomi-
nateur de l'quation de vitesse (parce qu'il est impossible de trouver un profil de
KING et ALTMAN qui ne contienne aucun terme de concentration ou qui contienne
uniquement [ A ] ou uniquement [ B ] : voir 6.3.6). Ainsi l'quation de vitesse
pour ce mcanisme s'crit comme suit :
V1 [ A ][ B ][ C ]
v = [6.59]
K AB [ C ] + KmC [ A ][ B ] + KmB [ A ][ C ] + KmA [ B ][ C ] + [ A ][ B ][ C ]
Pour n'importe quelle concentration de substrat variable et dans des conditions o
la concentration des deux autres substrats est maintenue constante, cette quation a
la forme d'une quation de MICHAELIS et MENTEN, avec des constantes apparentes
qui sont prsentes dans le tableau 6.5. Comme d'habitude, le comportement de
Kmapp est trop complexe pour tre utilis directement, mais celui des deux autres
paramtres est trs informatif.
R B
E EA
a ER EAB
E'P
Q
E'C
E'
ECQ P
A B P C Q R
b
E EA EAB E'P E' E'C EQR ER E

6.21 - Exemple d'un mcanisme trois substrats et trois produits, prsent
(a) sous la forme explicite d'une srie d'tapes et (b) dans le symbolisme de CLELAND
Nous discuterons uniquement le comportement de V app Kmapp , mais il est gale-

ment instructif d'examiner les expressions de V app et de les comparer avec celles
des quations [6.24] et [6.34]. Avec [ A ] variable, V app Kmapp augmente avec [ B ]
mais est indpendant de [ C ] ; avec [ B ] variable, V app Kmapp est constant, ind-
pendant de [ A ] et de [ B ] . Ceci distingue immdia-tement A et B de C, mais ne
distingue pas ces deux substrats l'un de l'autre. A et B peuvent tre distingus en
considrant l'effet de l'addition d'un seul produit.
Bien que l'quation de vitesse ne renferme aucun terme en [ A ] uniquement, elle
renferme un terme en [ A ][ P ] si P est ajout au mlange ractionnel. Des termes
en [ A ][ Q ] ou en [ A ][ R ] ne peuvent cependant pas tre gnrs par addition de
Q ou de R, et l'addition d'aucun des trois produits ne peut gnrer un terme en
[ B ][ P ] , [ B ][ Q ] ou [ B ][ R ] . En traitant [ P ] comme une constante, nous
pouvons, dans la terminologie de WONG et HANES (1969), dire que l'addition de P
rappelle dans l'quation de vitesse, le terme en [ A ] manquant. D'un autre ct, Q
et R ne peuvent pas rappeler le terme en [ A ] et aucun des trois produits ne peut
rappeler le terme en [ B ] . La consquence pratique de ceci est que si P est prsent
dans le mlange ractionnel, V app Kmapp pour [ B ] variable devient dpendant de
[ C ] , mais V app Kmapp pour [ A ] variable reste indpendant de [ C ] quel que soit
le produit prsent.
L'inhibition par le produit dans les ractions trois substrats et trois produits obit
des principes similaires ceux prsents dans le 6.7, avec la caractristique
additionnelle que l'inhibition anti-comptitive devient un phnomne relativement
commun : elle a lieu avec au moins une paire de substrat-produit dans tous les
mcanismes ordonns. Pour les mcanismes que nous venons de discuter, par
exemple, Q doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de A et de B, parce que,
en absence de P et de R, tous les profils de KING et ALTMAN prsentant une dpen-
dance en [ Q renferment galement le produit [ A ][ B ] . De manire similaire, R
doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de C.
Cette brve discussion de quelques points importants dans l'tude des mcanismes
d'enzymes trois substrats, ne peut tre considre autrement que comme une
simple introduction au vaste sujet que ces mcanismes constituent. Pour plus
d'information, nous vous renvoyons des revues spcialises comme celle de
WONG et HANES (1969) et celle de DALZIEL (1969). DIXON et WEBB (1979)
discutent de l'utilisation d'change d'isotopes ( 6.7) dans le cas de ractions trois
substrats, bien que les commentaires de DALZIEL (1969), concernant des sources
possibles d'erreur, doivent tre pris en compte.
L'analyse des ractions quatre substrats a t introduite par ELLIOTT et TIPTON
(1974). Elle suit des principes similaires celle des ractions trois substrats.
Tableau 6.5 - Constantes apparentes pour un exemple
de mcanisme trois substrats
Substrat V
app V app K mapp
variable K mapp
V1 [ B ][ C ] V1 [ B ] ( K AB + K mA [ B ] ) [ C ]
A
K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ] K AB + K mA [ B ] K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ]
V1 [ A ][ C ] V1 [ A ] ( K AB + K mB [ A ] ) [ C ]
B
K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ] K AB + K mB [ A ] K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ]
V1 [ A ][ B ] V1 K mC [ A ][ B ]
C
K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ] K mC K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ]
Ce tableau donne les expressions pour les valeurs apparentes des paramtres de l'quation
de MICHAELIS et MENTEN pour une raction trois substrats qui obit l'quation [6.59]
PROBLMES
6.1 - L'hydrolyse progressive de la liaison (1 4) glucosidique de l'amylose

est catalyse par deux enzymes, l'a-amylase et la b-amylase. Dans le cas
de l'a-amylase, le nouveau groupe rduit obtenu adopte la mme
configuration (avant une mutarotation) que celle rencontre dans le
polymre de dpart. Par contre, dans le cas de la b-amylase, le nouveau
groupe form adopte la configuration b. Proposer des mcanismes de

raction pour les ractions de transfert de ces deux groupes qui
permettent d'expliquer ces observations.
6.2 - En 1978, PETERSEN et DENG ont observ que lorsque la laccase de Rhus
vernicifera catalyse l'oxydation de l'hydroquinone par l'oxygne mol-
culaire, la vitesse de la raction augmente indfiniment alors que la
concentration des deux substrats augmente selon un rapport constant,
sans arriver saturation. Afin d'expliquer ces rsultats, ces deux scien-
tifiques ont propos un mcanisme de substitution de l'enzyme dans
lequel l'oxydation initiale de l'enzyme par l'oxygne se droule en une
tape, suivie d'une seconde tape dans laquelle l'enzyme est rgnr,
avec comme rsultat la rduction de l'enzyme oxyd par l'hydroquinone.
Expliquer pourquoi ce mcanisme rend compte de l'impossibilit des
substrats saturer l'enzyme.
6.3 - Driver une quation de la vitesse initiale en absence de produits ajouts
pour une raction qui obit un mcanisme complexe ternaire
ordonn avec A qui se lie en premier et B en second. Nous supposerons
que les tapes de la fixation des deux substrats sont l'quilibre. Pour
ce mme mcanisme, quelle est la diffrence de forme entre cette
quation et une quation l'tat stationnaire ? Quelle serait l'apparence
des graphiques primaires de [ B ] v en fonction de [ B ] ?
6.4 - La vitesse d'une raction catalyse par un enzyme deux substrats est
mesure en fonction de la variation des concentrations de [ A ] et de [ B ]
tout en gardant le rapport [ A ] [ B ] constant. Quelle sera la forme atten-
due du graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] si la raction obit :
a - un mcanisme complexe ternaire,
b - un mcanisme enzyme modifi ?
6.5 - Quelle sera le profil d'inhibition par le produit attendu pour un enzyme
qui obit un mcanisme complexe ternaire alatoire en quilibre
rapide ?
6.6 - Considrer une raction deux substrats A et B qui suit un mcanisme
enzyme substitu. Sans driver l'quation de vitesse complte, dter-
miner le type d'inhibition attendu dans le cas d'un inhibiteur qui se fixe
dans une raction en cul-de-sac la forme libre de l'enzyme qui fixe B
mais qui n'affecte pas l'autre forme de l'enzyme libre (on suppose
qu'aucun des produits n'est prsent).
6.7 - Les symboles de DALZIEL (1957) sont encore utiliss assez souvent dans
la littrature. Dans ce systme, l'quation serait crite sous la forme
suivante :
[ E ]0 f f f
= f 0 + 1 + 2 + 12
v S1 S 2 S1S 2
dans laquelle [ E ]0 et v ont la mme signification que dans ce livre, S1 et
S 2 reprsentent [ A ] et [ B ] respectivement et f 0 , f 1 , f 2 et f 12 sont
des constantes qui sont parfois appeles coefficients de DALZIEL. Quelles
sont les valeurs de ces constantes en terme de symboles utiliss dans
l'quation [6.8] ? A quel point (exprim en termes de coefficients de
DALZIEL) les droites obtenues en portant S1 v en fonction de S1 pour
diffrentes valeurs S2 se croisent-elles ?
6.8 - Considrer une raction trois substrats et trois produits :
A+B+C P+Q+R
qui obit un mcanisme complexe quaternaire dans lequel les
substrats se fixent et les produits sont relchs dans l'ordre indiqu dans
l'quation ci-dessus. La vitesse initiale en l'absence de produits peut tre
obtenue partir de l'quation [6.42] en supprimant un terme. Rpondre
aux questions suivantes (sans driver l'quation de vitesse complte) :
a - Quel terme de l'quation doit tre supprim ?
b - Quel produit, s'il y en a un, rappelle ce terme dans l'quation de
vitesse ?
c - Quel produit se comporte comme un inhibiteur anti-comptitif (en
absence des deux autres produits) indpendamment de la variation
de la concentration du substrat ?
d - Quel produit se comporte comme un inhibiteur comptitif quand A
est le substrat variable ?
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE
DES MCANISMES ENZYMATIQUES
7.1. ECHANGE ISOTOPIQUE ET EFFETS ISOTOPIQUES
Il n'est certainement pas exagr de considrer que l'utilisation d'isotopes a jou un

rle aussi important dans le dveloppement de la biochimie classique que le spectro-
photomtre. Aucune des voies mtaboliques connues aujourd'hui n'aurait pu tre
lucide sans l'utilisation d'isotopes. Aujourd'hui, la spectrophotomtrie joue encore
un rle important dans l'tude de la cintique enzymatique plus que dans d'autres
domaines de la biochimie, mais si l'utilisation d'isotopes est moins courante, il existe
toujours quelques applications importantes qui doivent tre considres. Avant de
discuter de ce point, il est important de souligner que les deux principales classes
d'application d'isotopes ne sont pas simplement diffrentes l'une de l'autre, mais
qu'elles sont diamtralement opposes.
L'change isotopique, et toutes les autres utilisations d'isotopes des fins de
marquage, reposent sur l'hypothse que la substitution isotopique d'un atome dans
une molcule n'affecte pas les proprits chimiques de cette dernire, et que tout effet
sur ses proprits cintiques est suffisamment faible pour tre nglig dans l'analyse :
le marquage isotopique est uniquement utilis comme une mthode d'identification
de certaines molcules dans un ensemble de molcules identiques. D'un autre ct,
l'analyse des effets isotopiques repose sur l'hypothse qu'il existe des diffrences
mesurables entre les proprits cintiques ou d'quilibre de molcules substitues par
des isotopes. Il est vident que ces deux hypothses ne peuvent pas tre correctes
simultanment, mais en pratique, cette contradiction ne pose pas de problme puis-
que des conditions peuvent tre choisies dans lesquelles chacune de ces hypothses
est valable. En ralit, les diffrences exprimentales entre les deux types d'applica-
tion sont considrables, comme le montre le tableau 7.1. La nature nous a gnreu-
sement fourni deux isotopes lourds d'hydrogne, l'lment le plus abondant, qui
peuvent tre utiliss pour tudier les effets isotopiques. Ces effets dpendent des
diffrences relatives de masse atomique ( 7.6 et 7.7), et celles-ci sont les plus
grandes pour les lments les plus lgers. Des isotopes radioactifs de trois lments
(hydrogne, carbone, phosphore) parmi les plus importants lments biologiques sont
galement disponibles, alors que des isotopes radioactifs de l'azote et de l'oxygne se
manifestent par leur absence : bien que cette absence ait des consquences srieuses
pour l'tude du mtabolisme, elle est moins importante pour l'change d'isotope en
tant que sonde cintique des mcanismes enzymatiques, car presque toutes les mol-
cules offrent la possibilit de raliser le marquage d'un carbone ou d'un hydrogne
loign du site de la raction.
Tableau 7.1 - Utilisations cintique d'isotopes
Condition Marquage isotopique Effets isotopiques

Localisation d'une Eloign du site Liaison ractionnelle :
substitution ractionnel effets isotopiques primaires
Liaison voisine de la liaison raction-
nelle : effets isotopiques secondaires
Solvant : effets isotopiques du solvant
Etendue de la substitution Trace 100% (idalement*)
Proprit utiles des isotopes Radioactivit Masses atomiques diffrentes
3
Isotopes typiques H, 14C, 32P 2
H, 3H
* La substitution avec 3H est uniquement possible des niveaux de traces. Ceci signifie
que les expriences qui ncessitent la saturation de l'enzyme avec des molcules
substitues ne sont pas possibles avec 3H.
L'utilisation d'isotopes dans des applications autres que cintiques n'est pas obliga-
toirement en accord avec les gnralisations donnes dans ce tableau. Par exemple les
isotopes lourds de l'oxygne (17O et 18O) ont t utiliss avec succs pour tudier la
strochimie de ractions de substitution sur les atomes de phosphore, mais puisque ces
isotopes ne sont pas radioactifs ils ont t dtects par d'autres mthodes, comme la
rsonance magntique nuclaire (JARVEST, LOWE et POTTER, 1981) ou par spectromtrie de
masse (ABBOTT et al., 1979), qui ne sont pas suffisamment sensibles pour tre utilises
avec des quantits en trace de marqueur isotopique.
7.2. PRINCIPES DE L'CHANGE D'ISOTOPE
Dans l'tude du mcanisme des ractions enzymatiques, l'analyse des vitesses

initiales de raction plusieurs substrats dans les directions directe et inverse, et en
prsence ou en absence de produits, limine gnralement de nombreux chemins
ractionnels possibles et donne une bonne ide des caractristiques gnrales du
mcanisme, mais elle ne rvle habituellement pas l'existence d'un chemin alter-
natif si celui-ci contribue de manire ngligeable la vitesse globale. Davantage
d'information est alors ncessaire pour obtenir une image reprsentative de la
raction dans son ensemble. Mme si un mcanisme clair merge des mesures de
vitesse initiale et d'inhibition par le produit, il est utile de pouvoir confirmer
indpendamment sa validit. La technique importante d'change d'isotope permet
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES 239
souvent d'apporter cette vrification. Elle a t introduite pour l'tude des

cintiques enzymatiques par BOYER (1959), bien que le principe fondamental ait
t propos plus tt par MCKAY (1938) : mme si, par dfinition, une raction
chimique est l'quilibre quand sa vitesse nette est gale zro, les vitesses
unidirectionnelles de certaines tapes ou de certains groupes d'tapes peuvent tre
mesures au moyen de traceurs isotopiques. L'utilisation de traceurs non-
isotopiques est encore plus ancienne, remontant l'investigation de l'oxydation des
acides gras par KNOOP (1904), mais, bien que des traceurs chimiques, comme le
groupe phnyle, puissent fournir une information qualitative importante,
l'utilisation de traceurs dans les expriences cintiques n'a t possible qu'avec
l'apparition des isotopes.
Utiliser la cintique des ractions d'changes d'isotopes, il est ncessaire de faire
deux hypothses importantes. Elles sont habituellement vrifies et souvent simple-
ment sous-entendues, mais il est aussi bien de les noncer clairement afin d'viter
tout malentendu. La premire hypothse est qu'une raction impliquant des subs-
trats radioactifs suit le mme mcanisme que la raction normale, avec les mmes
constantes de vitesse. En d'autres termes, les effets isotopiques ( 7.6 et 7.7) sont
supposs ngligeables. Cette supposition est gnralement vraie, condition que
3
H (Tritium) ne soit pas le marqueur radioactif. Mme dans ce cas, les effets
isotopiques pourront tre ngligs si l'atome 3H n'est pas directement impliqu dans
la raction ou dans la fixation du substrat sur l'enzyme. La seconde hypothse est
que les concentrations de toutes les espces radioactives soient si faibles qu'elles
n'ont aucun effet perceptible sur les concentrations des espces non marques.
Cette hypothse peut habituellement tre satisfaite et constitue un point important
car, dans ce cas, les espces marques peuvent tre ignores dans le calcul des con-
centrations des espces non-marques, simplifiant ainsi considrablement l'analyse.
L'change d'isotopes est plus facilement compris l'aide d'un exemple, comme celui
prsent dans le schma de la figure 7.1, qui reprsente le transfert d'un atome
radioactif (reprsent par un astrisque) de A* vers P* dans le mcanisme ordonn
complexe ternaire. Puisque cet change implique que A* se fixe E, il ne peut se
raliser que si la concentration de E est suffisante.
k1 k1[A]
EA* E EA
k1[A*] k1
k2 k2[B] k4 k 4[Q] k2 k2[B]
k3 k3[P]
EA*B EAB
EP*Q EQ EPQ
k3[P*] k3
7.1 - Echange isotopique dans un mcanisme ordonn complexe ternaire

Le schma montre les tapes ncessaires pour le transfert du marqueur de A* P*.
La raction d'change doit donc tre inhibe par des concentrations leves de A ou
de Q, puisque ces molcules sont en comptition avec A* pour se fixer sur E. Les
effets de B et P sont plus subtils : d'un ct, la raction d'change implique la fixation
de B sur EA*, et donc ncessite la prsence d'une concentration finie de B. D'un
autre ct, si B et P sont prsents des concentrations trs leves, l'enzyme existera
principalement sous la forme du complexe ternaire, (EAB + EPQ), et il n'y aura donc
plus de E libre pour fixer A*. On s'attend alors ce que des concentrations leves de
B et de P inhibent l'change, et il n'est pas difficile de montrer que cette prdiction se
vrifie. Les vitesses d'change des concentrations d'intermdiaires peuvent tre
crites de la faon habituelle et leur valeur fixe zro en accord avec l'hypothse de
l'tat stationnaire :
d [ EA*]
= k1 [ A*][ E ] ( k 1 + k 2 [ B ])[ EA*] + k 2 [ EA * B ] = 0 [7.1]
dt
d [ EA * B ]
= k 2 [ B ][ EA*] ( k 2 + k3 )[ EA * B ] + k 3 [ P*][ EQ ] = 0 [7.2]
dt
Celles-ci constituent une paire d'quations simultanes dont [ EA*] et [ EA * B ]
sont les inconnues. La solution pour [ EA * B ] , avec [ P*] fixe zro, est la
suivante :
k1 k 2 [ A*][ B ][ E ]
[ EA * B ] = [7.3]
k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ]
La vitesse initiale d'change v* est donne par k3 [ EA * B ] :
k1 k 2 k3 [ A*][ B ][ E ]
v* = [7.4]
k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ]
Cette dernire quation est indpendante de toute hypothse concernant l'effet des
ractifs marqus radioactifs sur la raction non marque, mais avant de pouvoir
l'utiliser, il est ncessaire d'obtenir une expression pour [ E ] qui puisse y tre
insre. Comme nous l'avons indiqu plus haut, le traitement est grandement
simplifi si nous supposons que les concentrations des ractifs non marqus ne sont
pas affectes par la prsence de faibles quantits des espces marques ; de cette
manire la valeur de [ E ] est la mme que s'il n'y avait pas de marquage. Si
l'exprience est ralise avec la raction non marque dans des conditions d'tat
stationnaire, l'expression pour [ E ] drive dans le 6.3.2 doit tre utilise, mais
l'utilisation de celle-ci conduit des expressions complexes et n'est heureusement
pas ncessaire. Il y a deux faons d'viter les complications : soit nous pouvons
tudier l'change d'isotopes avec la raction non-marque dans ces conditions
d'quilibre, comme nous en discutons dans le 7.3, ou, plutt que des vitesses
relles d'change, nous pouvons discuter des rapports de ces vitesses, comme il en
est question dans le 7.5.1. La mthode l'quilibre est de loin la meilleure
mthode connue et la plus largement utilise des deux, mais les deux mthodes
reprsentent des mthodes puissantes et utiles.
7.3. ECHANGE D'ISOTOPES L'QUILIBRE

Si la raction non-marque est l'quilibre, la concentration d'enzyme libre dans le
mcanisme ordonn complexe ternaire est donne par :
[ E ]0
[E] = [7.5]
k1 [ A ] k1 k 2 [ A ][ B ] k1 k 2 k3 [ A ][ B ][ P ]
1+ + +
k 1 k 1k 2 k 1k 2 k 3
Les quatre termes du dnominateur font rfrence aux quatre espces d'enzymes,
E, EA, (EAB + EPQ) et EQ, et chacun est dans un rapport d'quilibre appropri
vis--vis du prcdent, comme par exemple [ EA ] [ E ] = k1 [ A ] k 1 . Cette qua-
tion ne contient pas le terme [ Q ] car, si l'quilibre doit tre maintenu, uniquement
trois parmi les quatre concentrations de ractif sont ncessaires. N'importe laquelle
des concentrations [ A ] , [ B ] ou [ P ] peut tre remplace par [ Q ] , comme le
montre l'identit suivante :
k k k k [ P ][ Q ]
Keq = 1 2 3 4 = [7.6]
k 1k 2 k 3k 4 [ A ][ B ]
Par exemple, si nous souhaitons examiner les effets de l'augmentation dans un
rapport constant des concentrations de B et de P, [ B ] et [ P ] , pour quelques
valeurs donnes de [ A ] et de [ Q ] , il serait appropri de remplacer [ P ] par [ Q ]
en utilisant l'quation [7.6]. Si cela est fait, la substitution de l'quation [7.5] dans
l'quation [7.4] donne la vitesse d'change d'isotope l'quilibre chimique :
k1 k 2 k3 [ E ]0 [ A*][ B ]
v* = [7.7]
k1 [ A ] k1 k 2 [ A ][ B ] k 4 [ Q ]
1 +
k 1
+
k 1k 2
+
k4
[
k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ] ]
Puisque le numrateur de cette quation est proportionnel [ B ] alors que le
dnominateur est du second degr en [ B ] , il est vident qu'elle a la mme forme
que l'quation pour l'inhibition d'un enzyme un seul substrat, l'quation [5.38].
Ainsi, puisque [ B ] et [ P ] varient de 0 jusqu' la saturation, la vitesse d'change
augmente jusqu' un maximum et ensuite diminue jusque zro.
Les quations pour toute autre raction d'change peuvent tre drives de faon
similaire. Dans le mcanisme ordonn complexe ternaire, l'change entre B* et
P* ou Q* n'est pas inhib par A car des concentrations saturantes de A n'liminent
pas EA du systme, mais, au contraire, amnent sa concentration un maximum.
Des rsultats similaires sont obtenus avec la raction inverse (comme il est
logiquement attendu pour un systme l'quilibre, puisque dans un tel systme la
vitesse directe de n'importe quelle tape est la mme que la vitesse inverse) :
l'change partir de Q* est inhib par un excs de P, mais l'change partir de P*
n'est pas inhib par excs de Q.
Le mcanisme alatoire complexe ternaire diffre du mcanisme ordonn par le

fait qu'aucun change ne peut tre compltement inhib par le substrat qui n'est pas
impliqu dans l'change. Par exemple, si B est prsent en excs, le chemin par-
ticulier pour l'change de A* en P* considr plus haut est inhib car E est limin
du systme, mais l'change n'est pas compltement inhib car une voie alternative
existe : des concentrations leves de B, A* peut entrer dans des ractions
d'changes en se fixant sur EB pour donner EA*B. Puisque le comptage de la
radioactivit peut tre ralis de manire trs sensible, il est possible de dtecter
des chemins ractionnels mineurs par les mthodes d'change d'isotopes.
7.4. ECHANGE D'ISOTOPES

DANS DES MCANISMES ENZYME MODIFI
L'change d'isotope permet une simplification utile des mcanismes enzyme

modifi car il permet d'tudier uniquement une moiti de la raction la fois
(figure 7.2). Ce mcanisme a la mme forme que le mcanisme complet, avec P* et
A* remplaant respectivement B et Q, mais les cintiques sont plus simples car les
constantes de vitesse sont les mmes pour les deux moitis de la raction. Ce type
d'change reprsente une diffrence qualitative majeure entre les mcanismes
enzyme modifi et les mcanismes complexe ternaire, parce que dans les mca-
nismes complexe ternaire aucun change ne peut avoir lieu si le systme n'est pas
complet. Cette mthode de distinction entre les deux types de mcanismes a t
utilise et discute (DOUDOROFF, BOUKER et HASSID, 1947 ; KOSHLAND, 1955)
bien avant l'introduction de l'change
A d'isotopes comme une technique cintique.
EA
E E'P
7.2 - Echange isotopique

A*
P dans un mcanisme enzyme modifi
Notons qu'avec ce type de mcanisme,
l'change d'isotope peut avoir lieu mme si le
EA*
E'P* E'P mlange ractionnel est incomplet, c'est--dire
qu'il n'est pas ncessaire que le second
P* substrat ou le second produit soit prsent.
La possibilit d'tudier uniquement certaines parties d'un mcanisme est particuli-

rement intressante dans le cas de mcanismes enzyme modifi plus complexes,
impliquant trois substrats ou plus. Dans de tels cas, toute simplification des cinti-
ques est videmment la bienvenue, et cette approche a t utilise avec un certain
succs, par exemple par CEDAR et SCHWARTZ (1969) dans l'tude de l'asparagine
synthtase.
Cette capacit qu'ont de nombreux enzymes de catalyser des ractions partielles,

implique que les expriences d'change d'isotopes ncessitent des enzymes mieux
purifis que les expriences conventionnelles pour que les rsultats soient valables.
La raison de cette ncessit est simple. Supposons que nous tudions l'aspartate
transaminase, qui catalyse la raction suivante (que nous avons prsent avec plus
de dtails dans l'quation [6.3]).
Glutamate + Oxaloactate 2-oxoglutarate + Asparate [7.8]
La prsence dans la prparation d'enzyme de faibles quantits d'enzymes conta-
minants comme par exemple d'autres transaminases, a peu d'importance si nous
suivons la raction complte car il est improbable qu'un de ces contaminants soit
capable de catalyser la raction complte. Toutefois, l'change entre le glutamate et
le 2-oxoglutarate reprsente un autre problme, en particulier si nous utilisons une
mthode trs sensible de dosage, et nous devons nous assurer qu'aucune autre
transaminase n'est prsente si nous voulons obtenir des informations sur l'aspartate
transaminase. Bien que cet avertissement s'applique en particulier aux enzymes qui
oprent par un mcanisme enzyme modifi, il n'est pas inutile d'apporter une
mme attention la puret de la prparation d'enzyme lors de l'tude d'autres
enzymes, mme si ceux-ci ne sont pas susceptibles de catalyser des ractions par-
tielles ; comme nous en avons discut la fin du 6.2.3, il pourrait y avoir plus
d'enzymes qui ragissent selon un mcanisme enzyme modifi que ce qui n'est
gnralement accept.
7.5. ECHANGE D'ISOTOPES HORS QUILIBRE
7.5.1. Rapports de flux chimiques
Comme nous l'avons not ci-dessus, les quations de vitesse pour l'change d'iso-
topes deviennent trs compliques si la raction non-marque n'est pas maintenue
l'quilibre durant l'change. Nanmoins, il y a une bonne raison pour tudier des
ractions enzymatiques qui ne sont pas l'quilibre. A l'quilibre chimique il est
impossible de dmler les effets dus la fixation du substrat de ceux dus la
libration du produit, et, sauf si l'enzyme est capable de catalyser une demi-raction
( 7.4), nous sommes obligs de considrer la raction entire. L'change d'isoto-
pes hors d'quilibre, par contre, permet d'isoler et d'examiner sparment la partie
d'un mcanisme qui est responsable d'un change en particulier.
L'tape cruciale pour faire de la mthode d'change d'isotopes hors quilibre une
technique utile, sans se laisser attirer par une complexit sans espoir, a t franchie
par BRITTON (1966). Il a ralis que mesurer et comparer des transferts simultans
entre un ractif et deux autres limine en grande partie la complexit des expres-
sions de vitesse en divisant l'une par les deux autres. Cela s'explique par le fait que
les caractristiques mcaniques, en dehors de la partie du mcanisme responsable

des deux changes, affectent les deux vitesses de la mme manire et, par cons-
quent, n'affectent pas leur rapport.
Cette ide peut tre illustre en considrant un mcanisme capable de convertir
deux substrats en un produit P, comme le montre le schma suivant :
A B P
v1 v2 v3
E EA E'P E' [7.9]
v1 v2 v3
Celui-ci peut reprsenter une raction complte, avec (E' identique E) ou il peut
simplement reprsenter le fragment d'un schma plus large dont le reste peut tre
arbitrairement compliqu sans que cela n'affecte l'analyse, condition qu'il ne
comporte aucune voie alternative de conversion de A + B en P. Supposons main-
tenant que nous avons P* doublement marqu de faon telle qu'il soit possible de
mesurer simultanment la conversion de A* et de B. Puisqu'il n'est pas ncessaire
de mentionner explicitement les marqueurs pour driver les quations, ils seront
omis : il est suffisant de se rappeler que lorsque nous nous rfrons une
conversion unidirectionnelle de, par exemple, P en A, l'existence d'un marqueur
adquat est implicite. Dans ce contexte, il est conventionnel de considrer une
vitesse unidirectionnelle de ce type comme un flux, mais malheureusement cette
distinction entre vitesses et flux est assez diffrente (presque oppose) de celle
utilise dans l'analyse du contrle mtabolique ( 10.4). Pour cette raison, nous
utiliserons ici le terme plus long de flux chimique recommand par l'IUPAC (1981)
pour dsigner une vitesse unidirectionnelle, et nous utiliserons le symbole
F (X Y) pour reprsenter le flux chimique de X vers Y.
Le flux chimique de P vers E'P est clairement donn par v 3 = k 3 [ E' ][ P ] .
Nanmoins, cela ne reprsente pas le flux chimique de P vers B, et encore moins
celui de P vers A, parce que toutes les molcules de E'P produites par la fixation de
P sur E' ne continuent pas dans la mme direction de la raction et ne librent pas
B ; quelques-unes retournent pour rgnrer E' et P. En outre, certaines molcules
de EA produites par la libration de B partir de E'P retournent galement vers E'
et P (avec la capture d'une molcule diffrente de B) au lieu de librer A. Il est
immdiatement vident que si le mcanisme est celui illustr par le schma de la
figure 7.2, le flux chimique de P vers B est suprieur au flux chimique de P vers A,
mais nous pouvons placer cela sur une base quantitative en considrant les proba-
bilits chaque point du mcanisme de continuer dans la mme direction ou de
s'inverser. Pour une molcule E'P produite par la fixation de P sur E', cette proba-
bilit est donne par v 2 ( v 2 + v3 ) car il n'y a que deux solutions possibles, soit la
continuation vers EA + B ou le retour vers E' + P, qui se droulent respectivement
aux vitesses v2 et v3. Ainsi, le flux chimique de P vers B est :
F ( P E' P ) F ( E' P B ) v v k k [ E ][ P ]
F( P B ) = = 2 3 = 2 3 [7.10]
F ( P E' P ) + F ( E' P B ) v 2 + v3 k 2 + k3
Pour calculer le flux chimique de P vers A, nous notons premirement que

F (P EA) est le mme que F (P B), donn dans l'quation [7.10]. Nous avons
galement besoin du flux chimique inverse F (EA P) qui peut tre calcul de
faon similaire de la manire suivante :
v 2 v3 k k [ EA ][ B ]
F ( EA P ) = = 2 3 [7.11]
v 2 + v3 k 2 + k3
Ensuite, le flux chimique de P vers A est construit d'une faon analogue celui
utilis pour l'quation [7.10] : c'est le flux chimique de P vers EA multipli par la
probabilit que la molcule de EA, une fois forme, libre A plutt que de retour-
ner vers P :
F ( P EA ) F ( EA A )
F( P A ) =
F ( EA A ) + F ( EA P )
v 1v 2 v 3
= [7.12]
v 2 v3
( 2 3 ) 1 v + v
v + v v +
2 3
k 1k 2 k 3 [ E ][ P ]
=
k k [ B ]
( k 2 + k3 ) k 1 + 2 3
k 2 + k3
A ce point, nous pouvons tre tents par le dsespoir : si l'expression pour un flux
chimique dans un mcanisme simple trois tapes est aussi complique que cela, et
qui plus est avant d'avoir substitu la concentration de E dans le but de produire
une quation utilisable, quel espoir peut-il y avoir d'obtenir des quations mani-
pulables pour des mcanismes de rel intrt ? Le point essentiel est qu'en dpit de
la complexit de ces quations, si nous examinons chacune d'elle isolment, elles
se simplifient considrablement si nous divisons l'une par l'autre pour obtenir
l'expression d'un rapport de flux chimiques.
Cela deviendra plus clair dans un moment, mais au pralable, nous devons nous
dbarrasser d'une seconde question qui se posera probablement en relation avec des
expressions du type de l'quation [7.12] : ne serait-il pas dans l'ordre des choses
de commencer par multiplier numrateur et dnominateur de l'quation [7.12] par
k2 + k3, et ensuite de distribuer les termes entre parenthses ? Cela s'avre tre une
tentation laquelle il faut rsister : la simplification potentielle apporte par ce
procd est en ralit tellement lgre qu'elle peut tre nglige, et si des expres-
sions de flux chimique sont laisses dans leur forme non simplifie, il est facile
(avec la pratique) de reconnatre par inspection visuelle la raison de la prsence de
chaque terme dans l'quation, alors que cette logique est obscurcie en appliquant la
simplification. De plus, les quations dans leur forme non-simplifie sont pratiques
pour comparer les unes aux autres. Ainsi, il est vident en les observant que l'qua-
tion [7.12] diffre de l'quation [7.10] uniquement par le facteur k1 au numrateur
et par le second terme entre parenthses au dnominateur. Le rapport de flux

chimique peut donc s'crire sous la forme :
F( P B ) k 2 k3 [ B ]
= 1+ [7.13]
F( P A ) k 1( k 2 + k3 )
Les caractristiques marquantes de cette quation sont que [ A ] , la concentration
du substrat qui se fixe en premier dans la raction directe, n'apparat pas, et qu'elle
exprime une simple dpendance linaire vis--vis de [ B ] , la concentration du
substrat qui se fixe en second.
Les conclusions qui peuvent tre tires partir de l'quation [7.13] dpendent de
certaines hypothses. La raction peut progresser dans le sens A + B donne P ou
dans le sens P donne A + B ou elle peut tre l'quilibre. Les concentrations [ A ] ,
[ B ] et [ P ] peuvent prendre n'importe quelle valeur et tre exprimes en valeurs
absolues ou en valeurs relatives. Le recyclage de E' en E peut tre extrmement
simple (c'est--dire qu'il peut s'agir de la mme espce) ou il peut tre arbi-
trairement compliqu (pour autant qu'il n'implique pas de chemin alternatif de
conversion de A + B en P.) Cela signifie galement qu'aucune hypothse n'est faite
concernant l'obissance de la raction globale au modle de MICHAELIS et MENTEN
ou toute autre quation de cintique simple. Si d'autres ractifs sont impliqus, ils
peuvent participer dans n'importe quel ordre et peuvent tre entremls avec les
tapes prsentes dans l'quation [7.9] ; par exemple, la place de la raction une
tape qui est prsente, la fixation de B sur EA peut tre un processus trois tapes
dans lequel un autre substrat C se fixe galement et un autre produit Q est libr.
Les ractions en cul-de-sac, qu'elles fassent ou ne fassent pas partie du fragment de
raction correspondant la conversion de A + B en P, n'ont aucun effet sur la
forme du rapport des flux chimiques. Il s'ensuit ds lors que la mesure du rapport
des flux chimiques fournit une mthode remarquablement puissante d'tude des
questions spcifiques d'ordre de fixation en s'affranchissant d'autres caractristi-
ques complexes des mcanismes.
Il est vident, par des considrations de symtrie, que l'quation [7.13] ne peut pas
s'appliquer au cas o A et B peuvent se fixer l'enzyme dans un ordre alatoire,
puisqu'il ne serait pas possible dans ce cas que le rapport des flux chimiques
dpende d'un substrat mais pas de l'autre. L'analyse du mcanisme alatoire com-
plet complexe ternaire montre que cela est correct, et que quand A et B se fixent
dans un ordre alatoire, le rapport des flux chimiques partir de P se caractrise
par une dpendance hyperbolique vis--vis des deux concentrations de substrat :
un exemple d'un tel comportement est fourni par des expriences ralises avec
la phosphofructokinase de muscle de lapin (MERRY et BRITTON, 1985). De plus
amples dtails sur la thorie de ces expriences peuvent tre obtenus ailleurs
(CORNISH-BOWDEN, 1981).
L'hexokinase D de foie de rat fournit l'exemple d'un enzyme se comportant de la
manire la plus simple (GREGORIOU, TRAYER et CORNISH-BOWDEN, 1981.) Bien
que les cintiques n'obissent pas au modle de MICHAELIS et MENTEN vis--vis

du glucose et qu'en consquence les expriences conventionnelles d'inhibition par
le produit soient difficiles analyser, des mesures des flux chimiques du glucose
6-phosphate vers l'ATP et le glucose ont donn les rsultats prsents dans la
figure 7.3 : exactement les rsultats attendus sur la base de l'quation [7.13] si le
glucose est le substrat qui se fixe en premier.
F (Glucose-6P ATP) 12
F (Glucose-6P Glucose) 10
a 8
0
0 1 2 3 4 5 6
[ATP] (mM)
F (Glucose-6P Glucose) 2
F (Glucose-6P ATP)
1
b
0
0 5 10 15 20 25 50
[Glucose] (mM)
7.3 - Mesures de flux chimiques pour l'hexokinase D
La figure montre les donnes de GREGORIOU, TRAYER et CORNISH-BOWDEN (1981) pour le
transfert simultan de 32P vers l'ATP et de 14C vers le glucose partir de glucose6-phos-
phate marqu avec le 14C et le 32P. La thorie prdit une variation du rapport des flux
chimiques avec la concentration du substrat qui se fixe en second dans une raction
ordonne, mais aucune variation avec le substrat qui se fixe en premier, comme le montrent
respectivement les parties (a) et (b) de la figure.
7.5.2. Cintiques d'isomrisation
Nous pourrions supposer que les types les plus simples d'exprience cintique
seraient appropris avec les isomrases (qui incluent les mutases, les racmases, les
pimrases), puisque ces enzymes catalysent d'authentiques ractions un
substrat et un produit. Nanmoins, les isomrases prsentent une difficult spciale
qui est vidente quand elle est souligne, mais qui peut facilement tre nglige :
il est impossible de raliser des expriences conventionnelles d'inhibition par le
produit avec ces enzymes car une raction ne peut pas tre irrversible si la
solution contient simultanment le substrat et le produit. Par consquent, le terme
ngatif du numrateur dans l'expression de la vitesse ne peut pas tre nglig, et
l'hypothse cruciale qui permet de simplifier la plupart des quations cintiques
jusqu'au point de permettre l'utilisation des mthodes graphiques et statistiques
conventionnelles, est invalide.
Cette limitation est particulirement srieuse pour les isomrases cause d'une
caractristique mcanique importante de ces enzymes, qui peut tre plus raison-
nablement ignore avec d'autres enzymes. Dans chaque mcanisme, nous pouvons
postuler qu'il pourrait y avoir une tape obligatoire d'isomrisation de l'enzyme,
c'est dire que la forme libre de l'enzyme qui est libre la fin de la raction peut
tre diffrente de la forme implique dans la premire tape, de sorte qu'une iso-
mrisation de l'enzyme est ncessaire pour complter le cycle. Toutefois, dans une
raction impliquant plusieurs substrats et produits, il n'y a pas de raison particulire
pour supposer l'existence d'un tel phnomne : si nous examinons le mcanisme
enzyme modifi de l'quation [6.3], par exemple, il n'y a aucune de raison de
supposer que le processus chimique soit facilit par l'introduction d'une telle tape.
Par contre, dans le cas d'une isomrase, les avantages d'une telle tape sont plus
clairs. Par exemple, une mutase, c'est--dire un enzyme qui catalyse le mouvement
d'un groupe d'une position une autre dans la mme molcule, peut facilement tre
imagine comme une protine existant sous deux formes, chacune complmentaire
de l'un des deux ractifs, mais qui peut rapidement commuter entre ces deux tats.
Ainsi, une partie essentielle de l'tude mcanique d'une isomrase doit tre de
dterminer si celle-ci opre de cette manire ; dans leur argumentation ALBERY et
KNOWLES (1987) vont jusqu' dire qu'aucune investigation cintique d'un enzyme
ne peut tre considre comme complte tant que des expriences n'ont pas t
conduites afin de dterminer si les tapes limitantes dans des conditions de
saturation (par le substrat) dpendent de la modification du substrat ou de la
conversion de l'enzyme libre. Ce point de vue est certainement justifi avec les
isomrases, mme s'il peut paratre exagr avec d'autres enzymes.
Les cintiques conventionnelles ne permettent pas de rpondre cette question. Si
nous appliquons la mthode de KING et ALTMAN au mcanisme d'une raction un
substrat et un produit impliquant une isomrisation de l'enzyme :
P
k1 k2 k3
E+A EA E' E
k1 k2 k3 [7.14]
cela n'est pas immdiatement apparent, parce que l'quation de vitesse contient un
terme en [ A ][ P ] , qui pourrait tre dtectable par des techniques ordinaires :
k1 k 2 k3 [ E ]0 [ A ] k 1k 2 k 3 [ E ]0 [ P ]
v =
( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 )[ A ] + ( k 1 + k 3 )k 2 [ P ] + k1 k 2 [ A ][ P ]
[7.15]
Toutefois, la technique ordinaire en question est l'inhibition par le produit, qui,
comme nous l'avons mentionn plus haut, est impossible dans des conditions
d'irrversibilit de la raction avec un enzyme un seul produit. Le problme
semble toujours tre accessible l'analyse par des techniques ordinaires si nous
mesurons la vitesse en variant [ A ] et [ P ] dans un rapport constant, comme par
exemple en fixant [ P ] = r [ A ] ou r est une constante, car dans ce cas l'quation de
vitesse prend une forme simple avec un seul terme au numrateur :
( k1 k 2 k3 k 1k 2 k 3r )[ E ]0 [ A ]
v = [7.16]
[ ]
( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 ) + ( k 1 + k 3 )k 2 r [ A ] + k1 k 2 r [ A ] 2
Cette quation n'a pas la forme standard pour une inhibition par le substrat (qua-
tion [5.38]), et, en principe donc, si l'isomrisation de l'enzyme a lieu, la vitesse
doit passer par un maximum quand elle est tudie en fonction des concentrations
des deux ractifs, varies dans un rapport constant. Toutefois, l'observation d'un
maximum dans une gamme accessible de concentrations, dpend des constantes de
vitesse. Un cas est vident : si k3 et k3 sont toutes les deux trs grandes, alors E et
E' ne sont pas distinguables cintiquement, de sorte que le mcanisme devient
quivalent au mcanisme ordinaire une tape de MICHAELIS et MENTEN, et le
terme en [ A ] 2 n'est pas dtectable.
BRITTON (1973), cependant, a mis en vidence une seconde possibilit qui est
moins vidente et qui reste surprenante et non-intuitive, mme aprs en avoir
vrifi l'algbre : le terme en [ A ] 2 devient galement indtectable si k1 et k2 sont
toutes deux trs grandes, ce qui signifie qu'il est impossible de dtecter si l'isom-
risation de l'enzyme libre limite la vitesse pour des concentrations leves de
substrat. Mme si elle est dtectable, BRITTON (1973) a montr que n'importe quel
ensemble particulier de paramtres observs est consistant avec deux ensembles
diffrents de constantes de vitesse, l'un donnant plus d'importance l'isomrisation
de l'enzyme que l'autre. En rsum, l'analyse de ce type de cintiques, exprimes
par les quations [7.15] et [7.16], reste ambigu sur l'importance de l'isomrisation
de l'enzyme. Cette analyse a rcemment t conteste par REBHOLZ et NORTHROP
(1993), qui affirment que BRITTON a fait plusieurs erreurs algbriques ; leur criti-
que est toutefois sans fondements (CORNISH-BOWDEN, 1994 ; BRITTON, 1994), et
ne doit pas tre considre davantage.
7.5.3. Perturbation par un traceur
La perturbation par un traceur est une technique d'change d'isotope qui limine le
type de problmes d'interprtation discut dans le 7.5.2. Considrons une raction
d'isomrisation qui suit le mcanisme reprsent par l'quation [7.14]. Dans un
mlange l'quilibre entre des ractifs marqus A* et P*, E et E' existent dans de
telles proportions que les flux chimiques de A* vers P* et de P* vers A* sont
gaux. Si un large excs de A non marqu est ajout un tel mlange l'quilibre,
la raction rsultante de A vers P perturbera l'quilibre entre E et E', de telle faon
qu' la limite E disparat entirement du mlange ractionnel, ne laissant aucune
forme d'enzyme capable de ragir avec A*, alors que E' reste disponible pour ragir
avec P*. Ainsi, la seule direction possible pour la raction marque est de P* vers
A*. Il s'ensuit alors, que si l'isomrisation de l'enzyme survient comme dans l'qua-
tion [7.14], modifier le systme avec un ractif non-marqu dplacera la raction
entre ractifs marqus de l'quilibre dans une direction oppose celle dont il
dplacera la raction entre ractifs non-marqus. Une analyse similaire d'un mca-
nisme de MICHAELIS et MENTEN deux tapes sans isomrisation de l'enzyme ne
prsente pas un tel effet, parce que A et P ragissent avec la mme forme d'enzyme
libre, et qu'aucun quilibre entre des formes diffrentes de l'enzyme ne peut tre
perturb. Dans ce cas, l'addition de ractifs non-marqus n'a aucun effet sur
l'quilibre entre ractifs marqus.
Dans des cas plus complexes, l'isomrisation de l'enzyme peut provoquer un
dplacement de la raction entre ractifs marqus dans la mme direction que la
raction entre ractifs non-marqus. Nous avons tacitement suppos dans la
discussion des ractions d'isomrisation que le produit P rsulte du rarrangement
des atomes du substrat A en une structure diffrente. Cela n'est pas obligatoirement
le cas, et cela n'est mme pas probable. Avec une mutase, par exemple, E et E'
peuvent reprsenter des phosphoenzymes diffrents, de sorte que le complexe
enzyme-substrat est un biphosphate o le groupe phosphoryle qui apparat sur P
provient de E et non de A. Le transfert d'un groupe phosphoryle marqu de A
ncessite deux cycles catalytiques, de A vers E' au cours du premier cycle, et de E
vers P au cours du second. Puisque le second cycle ncessite la participation de A
non-marqu, le processus en entier peut uniquement se drouler dans la mme
direction que la raction entre ractifs non-marqus, quoique trs lentement,
cause du manque de E pour ragir avec A*. Il s'ensuit que si une exprience de
perturbation par un traceur est ralise en utilisant du 32P comme marqueur, il y
aura une perturbation faible dans la direction de la raction non marque, alors que
si le mme systme est tudi en utilisant du 1 4 C ou du 3H, il y aura une
perturbation plus importante dans la direction oppose. La phosphoglucomutase du
muscle de lapin se comporte exactement en accord avec ces prdictions (BRITTON
et CLARKE, 1976.)
Plus rcemment, la mthode de perturbation par un traceur a t utilise dans
des tudes dtailles des cintiques de la proline racmase (FISHER, ALBERY et
KNOWLES, 1986) et de la triose-phosphate isomrase (RAINES et KNOWLES,1987) ;
encore une fois, les rsultats constituent une preuve d'un effet important de
l'isomrisation de l'enzyme sur la cintique de la raction.
7.6. LA THORIE DES EFFETS ISOTOPIQUES CINTIQUES
7.6.1. Effets isotopiques primaires
Pour la plupart des applications, nous pouvons considrer que les diffrents iso-
topes d'un lment ont exactement les mmes proprits thermodynamiques et
cintiques. En effet, l'utilisation d'isotopes radioactifs comme traceurs, sur laquelle
une grande partie de la biochimie moderne, s'est construite, repose prcisment sur
cette hypothse. Nanmoins, elle n'est pas exactement correcte, et dans des rac-
tions o l'tape limitante implique la rupture d'une liaison entre l'hydrogne et un
atome plus lourd, les diffrences de proprits entre les isotopes d'hydrogne
deviennent suffisamment grandes pour tre l'origine de srieuses erreurs si celles-
ci ne sont pas prises en compte. Ce phnomne a des consquences positives et
ngatives. La consquence ngative est que lors de l'utilisation de 3H comme un
traceur radioactif, nous devons avoir la prudence de nous assurer que celui-ci est
loign du site de raction. En pratique, ceci est gnralement facile raliser, car
loign signifie simplement spar par au moins deux atomes ; nanmoins,
cette prcaution ne doit pas tre nglige.
Energie C1H Energie C2H
Etat de transition Etat de transition
Etat fondamental Etat fondamental
4,8 kJ.mol1
Longueur de liaison Longueur de liaison

7.4 - Interprtation lmentaire des effets isotopiques primaires
Puisque essentiellement toutes les molcules se trouvent dans leur niveau de vibration le
plus bas aux tempratures ordinaires, et que cet tat est plus bas d'environ 4,8 kJ mol1
pour une liaison C2H que pour une liaison C1H, la liaison C2H ncessite un apport
suprieure d'nergie de 4,8 kJ mol1 pour atteindre l'tat de transition.
La consquence positive des effets isotopiques sur les cintiques est qu'ils peuvent
tre utiliss pour obtenir des informations mcaniques qui seraient difficiles
obtenir d'une autre faon. A cause de cet aspect utile, nous donnerons une brve
description de leur origine dans cette section. Il sera invitablement simplifi, mais
des prsentations plus rigoureuses ont t faites par JENCKS (1969) et BELL (1973).
L'nergie d'une liaison C H en fonction de la distance sparant les deux atomes
dpend uniquement des nuages d'lectrons entourant les deux atomes et est la
mme pour tous les isotopes du carbone et de l'hydrogne. Cependant, comme la
liaison vibre, les nergies disponibles sont quantifies, et les niveaux quantiques
spcifiques disponibles pour une liaison dpendent des masses des atomes vibrants,
c'est dire que ceux-ci sont diffrents pour diffrents isotopes. Cela ne serait pas
important si la temprature tait suffisamment grande pour que les liaisons dans un
chantillon donn aient des nergies vibrationnelles distribues de manire ala-
toire entre les diffrents tats. A des tempratures ordinaires, quasiment toutes les
liaisons C H se trouvent dans leur tat vibrationnel fondamental, qui ne
correspond pas au minimum rel de la courbe d'nergie potentielle, mais l'nergie
au point zro de la liaison, qui reflte le fait que la vibration persiste mme au zro
absolu. Il en dcoule que l'tat fondamental pour une liaison C 2H se trouve un
niveau d'nergie environ 4,8 kJ mol1 plus bas (plus profond dans ce puits de
potentiel) que pour une liaison C 1H.
En premire approximation, nous pouvons supposer que lorsqu'une liaison C H
est rompue au cours de l'tape limitante d'une raction, l'tat de transition de la
molcule est celui dans lequel la liaison qui doit tre rompue, est tire jusqu'au
point o elle a perdu un degr de libert de vibration, mais o toutes les autres
liaisons sont dans leur tat fondamental. Ceci sous-entend que l'tat de transition
est le mme pour C 2H et pour C 1H mais, comme l'tat de base est plus bas pour
C 2H, il faut 4,8 kJ mol1 d'enthalpie d'activation en plus pour l'atteindre, comme
l'illustre la figure 8.2. En insrant cette valeur dans l'quation [1.45], nous obtenons :
DH
1
k 1H e 4 ,8 kJ mol
= e
RT
= ( DH + 4 ,8 kJ mol 1
[7.17]
k 2H ) RT

e RT
qui vaut environ 6,9 298 K (25C). Dans les limites o ce modle simple s'ap-
plique, nous prvoyons que les ractions impliquant la rupture de liaisons seront
peu prs sept fois plus lentes pour les liaisons C 2H que pour les liaisons C 1H.
Le type d'effet isotopique que nous venons de considrer est appel un effet isoto-
pique primaire et dans la thermologie communment utilise, nous pouvons dire
que les calculs nous amnent prvoir que l'effet isotopique primaire du deutrium
pour une liaison C H devrait tre d'environ 7. Des calculs similaires indiquent que
l'effet isotopique correspondant pour le tritium vis--vis du proton devrait tre
d'environ 16,5, et que tout les autres effets isotopiques primaires (comme par
exemple pour 17O compar 16O) devraient tre bien infrieurs. Ces calculs sont
sujets d'importantes erreurs, car la thorie complte de l'origine des effets

isotopiques sur les cintiques est beaucoup plus complique que nous ne l'avons
dcrite ci-dessus. Toutefois, il apparat que les effets du deutrium et du tritium
dvient souvent de manire consistante des valeurs prdites, mais elles sont
toujours relies entre elles par la relation suivante (SWAIN et al., 1958) :
1, 442
k 1H k1
= H [7.18]
k 3H k 2H
7.6.2. Effets isotopiques secondaires

En discutant la raison des effets primaires d'isotopes, nous avons suppos que la
conversion de l'tat fondamental en un tat de transition affecte uniquement la
liaison qui est tire dans la raction, mais cette vision est trop simpliste. En ralit,
la molcule entire est affecte, mais dans des proportions qui diminuent rapide-
ment mesure qu'on s'loigne du site de raction. Pour les liaisons adjacentes
celle qui est rompue, les niveaux d'nergie de vibration sont un peu plus proches
les uns des autres pour les diffrents isotopes qu'ils ne le sont dans l'tat fondamen-
tal. Ainsi, alors que les diffrences isotopiques s'liminent presque entirement,
une faible diffrence rsiduelle persiste dans l'enthalpie d'activation entre 1H et 2H.
Celle-ci provoque une faible diffrence dans la vitesse, appele un effet isotopique
secondaire. De tels effets sont typiquement de l'ordre de 1,3, c'est--dire que les
ractions impliquant un 2H fix l'un des atomes ragissant sont typiquement
environ 30% plus lentes que les ractions correspondantes impliquant 1H.
La grandeur de ces effets isotopiques secondaires les rend plus difficiles mesurer
que les effets primaires, et probablement pour cette raison, ils ont t assez peu
utiliss en enzymologie. Ils peuvent cependant fournir des informations mca-
niques utiles, difficilement accessibles par d'autres mesures. De nombreux mca-
nismes proposs la fois pour des ractions chimiques ordinaires et pour des
ractions catalyses par des enzymes, impliquent un changement de coordination
du carbone (comme par exemple le passage d'un tat ttradrique un tat trigonal)
quand l'tat de transition est form, et ce changement peut tre dtect comme un
effet isotopique secondaire par la substitution isotopique d'un atome d'hydrogne
fix l'atome de carbone qui est impliqu dans la raction, mme si la liaison
C H, responsable de l'effet isotopique n'est pas modifie par la raction. Ce type
d'approche a t utilis, par exemple, dans l'tude de la -galactosidase (SINNOTT
et SOUCHARD, 1973).
7.6.3. Effets isotopiques sur les quilibres
Essentiellement les mmes arguments s'appliquent aux effets isotopiques sur les
quilibres qu'aux effets isotopiques secondaires : les effets de substitutions iso-
topiques sur les niveaux d'nergie s'oprent dans des directions opposes sur les
deux cts d'un l'quilibre, et, bien qu'ils ne puissent pas exactement s'annuler
mutuellement, l'effet net est normalement faible, et les effets isotopiques sur les
quilibres sont typiquement proches de 1.
7.7. EFFETS ISOTOPIQUES PRIMAIRES

SUR LES CINTIQUES ENZYMATIQUES
La mesure des effets isotopiques a trouv une utilisation croissante dans les tudes
d'enzymes comme moyen d'tude des mcanismes. La thorie essentielle est pr-
sente dans un article de NORTHROP (1977), et dans d'autres articles parus dans ce
mme ouvrage, et une application trs fournie de cette thorie l'tude de la triose-
phosphate isomrase a t dcrite par ALBERY et KNOWLES (1976.)
Bien que l'analyse dtaille puisse devenir trs complique, l'ide de base est
suffisamment simple pour tre rsume dans un texte lmentaire. Il peut tre
prsent en rfrence au mcanisme de MICHAELIS et MENTEN trois tapes de
l'quation [3.87], discut dans le 3.6, pour lequel les dfinitions de la constante
catalytique et de la constante de spcificit, dj introduite dans l'quation [3.99a,b]
sont les suivantes :
k 2 k3
k0 = [7.19]
k 2 + k 2 + k3
k1 k 2 k3
kA = [7.20]
k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3
avec des expressions similaires pour la raction inverse, donnes par les quations
[3.100a,b]. Puisque les expriences ralises dans des conditions d'tat stationnaire
permettent uniquement de dterminer les quatre paramtres de MICHAELIS et
MENTEN, alors que le mcanisme comprend six constantes de vitesse, il pourrait
sembler impossible de dterminer les contributions relatives des diffrentes cons-
tantes de vitesse prsentes dans les quations [7.19] et [7.20] partir de ces
expriences. Toutefois, la possibilit d'effectuer des mesures avec des ractifs
isotopiquement marqus permet de complter utilement ces rsultats. Si nous faisons
l'hypothse raisonnable qu'une substitution isotopique faite dans une liaison qui est
rompue lors de la raction va vraisemblablement produire un effet isotopique
primaire dans l'tape chimique, mais avec des effets isotopiques faibles ou nuls sur
les tapes de fixation, nous pouvons prvoir des effets isotopiques substantiels sur k2
et k2, mais des effets ngligeables sur les autres constantes de vitesse. Ceci sous-
entend que les rapports des constantes catalytiques et des constantes de spcificit
pour les ractifs contenant 1H et 2H peuvent tre crits comme suit, o l'exposant D
(deutrium) indique 2H et o l'absence d'exposant fait rfrence 1H :
k0 k ( k D + k 2D + k3 )
= 2D 2 [7.21]
D
k0 k 2 ( k 2 + k 2 + k3 )
kA k 2 ( k 1k D2 + k 1k3 + k 2D k3 )
= [7.22]
k AD k 2D ( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
Si aucun effet isotopique n'est observ avec les constantes de vitesse pour la
fixation, le rapport des effets isotopiques sur k2 et k2 doit tre gal l'effet isoto-
pique sur l'quilibre pour la raction globale. Par simplicit, nous considrerons
que l'effet isotopique sur l'quilibre est exactement gal l'unit, mais comme ce
dernier est de toute manire mesurable indpendamment, l'analyse qui suit peut tre
facilement corrige pour prendre en compte les effets sur l'quilibre si cela est
ncessaire. En supposant que k 2 k 2D = k 2 k D2 , l'quation [7.21] peut tre rar-
range pour donner une expression du rapport k3 ( k 2 + k 2 ) en termes de l'effet
isotopique mesur sur k0 et des effets isotopiques inconnus sur k2 et k2 :
k0
1
k3 k0D
= [7.23]
k 2 + k 2 k 2 k0

k 2D k0D
Etant donn que k 2 k 2D est inconnu, la valeur de ce rsultat peut sembler douteuse.
Nanmoins, mme si la valeur exacte est inconnue, la thorie brivement prsente
dans le 7.6.1, associe au large ensemble d'informations exprimentales dont
nous disposons concernant les effets isotopiques dans les systmes chimiques, nous
donnent une bonne ide de la gamme de valeurs probables. Ainsi, si nous
supposons une valeur de 7, il est clair qu'un effet isotopique mesur de l'ordre de 7
(ou plus) sur k0 fournit une preuve solide que l'tape chimique est suffisamment
lente pour contribuer de manire apprciable aux cintiques observes saturation,
alors qu'une valeur de l'ordre de 1 indique que c'est la libration du produit qui
limite la vitesse.
Des arguments similaires peuvent tre appliqus l'quation [7.22], mais dans ce
cas, la grandeur de l'effet isotopique sur la constante de spcificit kA fournit une
mesure de l'importance relative de l'tape chimique en comparaison non pas avec k3
uniquement, mais avec k 1 et k3. Bien que cette analyse soit quelque peu plus
complique que pour k0, elle a l'avantage de pouvoir tre applique 3H aussi bien
qu' 2H, alors que les effets isotopiques de 3H sur k0 ne peuvent pas tre mesurs,
car un enzyme ne peut pas tre satur par une espce qui est uniquement prsente
sous forme de traces.
Si l'quation [7.18], la relation entre les effets isotopiques de 2H et 3H, pouvait tre
considre comme fiable, elle fournirait un moyen pour s'affranchir de la difficult
rencontre dans cette analyse qui est due au fait que la valeur exacte de k 2 k 2D est
inconnue. La comparaison des effets isotopiques mesurs pour les deux isotopes
permettrait de la calculer. Malheureusement, il n'est pas clair si cette relation
s'applique suffisamment prcisment aux ractions enzymatiques pour qu'un tel

calcul offre un avantage dans l'analyse plus qualitative suggre plus haut.
Les effets isotopiques du solvant sont considrs comme des effets environnemen-
taux, et sont traits dans le 8.8.
PROBLMES
7.1 - La saccharose glucosyltransfrase catalyse les ractions suivantes :

glucose 1-phosphate + fructose sucrose + phosphate inorganique
En absence la fois de sucrose et de fructose, l'enzyme catalyse l'change
rapide de 32P entre le glucose 1-phosphate et le phosphate inorganique
marqu. Cet change est inhib fortement et de manire comptitive par
le glucose. L'enzyme est un catalyseur plutt mauvais pour l'hydrolyse
du glucose 1-phosphate. Proposer une explication pour ces rsultats.
7.2 - La mthode dcrite dans le 7.7 fournit des informations concernant les
grandeurs relatives des constantes de vitesse pour les tapes de fixation
et pour l'tape chimique du mcanisme tudi. Une substitution chimique
dans la liaison ractive devrait galement modifier les constantes de
vitesse pour l'tape chimique. Pourquoi ce type de substitution ne peut-il
tre utilis pour obtenir le mme type d'information que celle obtenue par
substitution isotopique des substrats ? Pourquoi la mthode dpend-elle
de la substitution isotopique ?
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT
SUR LES ENZYMES
8.1. EFFET DU PH SUR LES CINTIQUES ENZYMATIQUES
Parmi les nombreux problmes rencontrs lors des premires tudes des cintiques
enzymatiques, le plus important tait certainement labsence de comprhension de
leffet de la concentration en ion hydrogne, H+. En solution aqueuse, la concen-
tration de proton varie entre 1 M et 1014 M, une gamme extrmement large qui est
communment exprime laide dune chelle logarithmique, pH = log [ H + ] ,
de manire rduire la taille des chiffres manipuls. Tous les enzymes sont profon-
dment influencs par le pH, et aucun progrs substantiel na pu tre ralis jusqu
ce que MICHAELIS et ses collaborateurs fassent du contrle du pH une opration de
routine de toute tude enzymatique srieuse. Le concept de tampon pour contrler
la concentration de proton libre et lchelle de pH qui permet de lexprimer, ont t
introduits par SRENSEN (1909), dans une publication dmontrant limportance de
la concentration de lion hydrogne dans les tudes enzymatiques. MICHAELIS,
cependant, avait dj commenc travailler dans cette direction (voir MICHAELIS,
1958) et ce nest que peu de temps aprs quapparu le premier papier dune longue
srie sur les effets du pH sur les enzymes (MICHAELIS et DAVIDSON, 1911). Bien
quil existe encore certains dsaccords concernant linterprtation des effets du pH
sur la cintique enzymatique, limportance pratique du pH reste immuable : il est
impossible denvisager une tude cintique sans contrle adquat du pH.
Leonor M ICHAELIS (1875-1949)

Leonor MICHAELIS est n Berlin. Comme HENRI, lextraordinaire fertilit de son esprit la
conduit lexcellence dans de multiples domaines.
Aprs avoir pass un an dans le laboratoire de Paul ERLICH, il tudie la mdecine clinique
et sintresse au contrle de la concentration de lion hydrogne et son influence sur les
proprits des solutions de protines et denzymes. Il dveloppe lutilisation de llectrode
hydrogne pour mesurer les effets de la concentration en proton sur lactivit des
enzymes. Il ralise ces travaux la mme poque que le danois Sren SRENSEN, mais ce
dernier publie ses conclusions (1909) plus rapidement que MICHAELIS et se voit accorder la
priorit sur ces travaux. Nanmoins, MICHAELIS dmontre que la dpendance au pH de la
catalyse enzymatique ressemble celle de la dissociation dun acide faible. Il dmontre
galement que le point isolectrique des protines nest pas uniquement une rfrence
dans la variation des proprits lectriques de la protine mais quil correspond
galement un minimum ou un maximum pour dautres proprits comme la solubilit
ou la viscosit. Il dveloppe une mthode dlectrophorse qui permet de dterminer le pI.
Sa matrise dans ce domaine le conduit devenir lun des leaders de lpoque dans ltude
des ractions catalyses par des enzymes. Les quelques annes qui ont prcd la
premire guerre mondiale ont t trs productives. Sa fameuse publication ralise avec
Maud MENTEN ntait quune parmi les 94 publications, dont 5 livres, quil a produites entre
1910 et 1914. Plusieurs de ses travaux sont rgulirement cits et notamment son livre,
Die Wassertoffionen-konzentration, est lpoque un ouvrage de rfrence sur le pH et
les tampons. En 1920, il passe trois annes comme professeur de biochimie Nagoya, au
Japon et se rend ensuite aux Etats-Unis o il meurt en 1949. Il est rest scientifiquement
actif jusqu sa mort, notamment dans le domaine de ltude des radicaux libres.
Cela peut paratre surprenant que ce soient les enzymologistes qui aient attir
lattention sur limportance de contrler la concentration de protons et aient intro-
duit lutilisation de tampons. Nous pouvons donc nous demander quelles sont les
proprits spciales des enzymes qui rendent impratif de contrler le pH alors
quaucun besoin ne stait fait sentir dans ltude dj bien dveloppe lpoque
de la cintique chimique. A lexception de la pepsine et de la phosphatase alcaline,
les enzymes qui ont t le plus largement tudis sont actifs en solution aqueuse
des valeurs de pH comprises entre 5 et 9. Dans cette gamme, les concentrations de
proton et dion hydroxyde varient dans la gamme de 105 109 M, qui corres-
pondent de trs faibles variations, et qui sont donc trs sensibles la prsence
dimpurets. Des extraits cellulaires et des prparations brutes denzyme sont en
gnral, bien tamponnes par les enzymes et par les polylectrolytes prsents sous
la forme dimpurets, mais ces tampons naturels sont limins lorsque les enzymes
sont purifis et doivent tre remplacs par dautres tampons. Jusqu ce que ce fait
soit reconnu, peu de progrs tait possible. Cette situation contraste avec celle
rencontre en chimie : peu de ractions sont tudies en solution aqueuse et parmi
celles-ci, nombreuses sont celles qui sont tudies des valeurs de pH, trs leves
ou trs faibles, dans des conditions o les concentrations de proton ou dion
hydroxyde sont suffisamment leves pour tre considres comme constantes. En
consquence, les premires tudes de cintique chimique ont peu souffert du
manque de comprhension du pH.
Le type le plus simple deffet du pH sur les enzymes impliquant un seul groupe
acide ou un seul groupe basique, nest pas diffrent du cas gnral dinhibition ou
dactivation hyperbolique qui a t considr dans le 5.6.3. Conceptuellement, la
protonation du groupe basique dun enzyme est simplement un cas spcial de
fixation dun groupe effecteur sur un site spcifique et il nest ds lors nul besoin
de rpter la rsolution des quations pour ce cas simple. Nanmoins, il existe
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES 259
plusieurs diffrences entre les protons et les autres effecteurs qui rendent utiles
dexaminer sparment la fixation des protons. Premirement, quasiment tous les
enzymes sont affects par les protons, de telle sorte que les protons sont des
effecteurs beaucoup plus importants que nimporte quel autre effecteur. Ils sont
beaucoup plus petits que nimporte quel autre compos chimique et nont aucun
effet strique ; cela signifie que certains phnomnes, telle linhibition non-comp-
titive pure ( 5.2.2), sont courants avec les protons alors quils sont particulire-
ment rares en gnral. La concentration de proton peut tre mesure et contrle
sur une gamme beaucoup plus grande que celle accessible tout autre effecteur et
donc nous pouvons nous attendre observer nimporte quel effet possible. Finale-
ment, les protons se fixent normalement sur de nombreux sites sur un enzyme, de
sorte quil est souvent insuffisant de considrer la fixation sur un seul site.
8.2. LES PROPRITS ACIDE-BASE
8.2.1. Les quilibres dionisation
Dans leurs cours de chimie et de biochimie, les tudiants sont confronts plusieurs
dfinitions des acides et des bases. Pour comprendre les proprits des enzymes et
de la plupart des autres molcules biologiques, il est prfrable de considrer la
dfinition propose par BRNSTED (1923) : un acide est une espce ayant tendance
perdre un proton, alors quune base est une espce ayant tendance fixer un
proton.
Mise part limportance prpondrante quelle accorde au proton, cette dfinition
prsente lavantage de se rfrer une espce , et donc elle inclut les atomes
aussi bien que les molcules. Une manire dexprimer cette dfinition est de
considrer quun acide est un donneur de proton sous la forme :
AH A + H + [8.1]
quand AH est un acide neutre, ou sous la forme :
BH + B + H+ [8.2]
+
quand BH est un acide cationique. De la mme manire, une base est dfinie
comme un accepteur de proton. Les formes A et B dans les quations [8.1] et [8.2]
sont des bases et sont gnralement dsignes comme les bases conjugues de
lacide correspondant.
Pour les ractions biochimiques qui se droulent en solution aqueuse, il est impor-
tant de noter que leau participe la raction de dissociation. En effet en solution
aqueuse, la raction dcrite par lquation [8.1] scrit de la manire suivante pour
un acide possdant un seul groupe ionisable :
AH + H2O A + H3O + [8.3]
Il sagit dune raction acide-base o lacide HA ragit avec une base, H2O, pour
donner la base conjugue de lacide, A, et lacide conjugu de la base, lion H3O+.
Le proton hydrat, H3O+, est appel lion hydronium.
La dissociation de leau a t mise en vidence par des mesures de conductivit
lectrique de leau pure. Langlais Henry CAVENDISH, avait remarqu que la
conductivit de leau tait fortement augmente si on dissolvait du sel dans celle-ci.
Mais, cest Svante ARRHENIUS que nous devons la thorie de la dissociation des
ions en phase aqueuse et linterprtation de ces mesures de conductivit lectrique.
Selon sa thorie, un courant lectrique est transmis travers une solution aqueuse
parce que les sels se dissocient en ions de charges opposes et se dplacent dans la
solution, transportant ainsi les charges lectriques. Ainsi, une charge lectrique est
transfre travers une solution parce que les cations sont attirs par la cathode et
se dplace dune rgion entourant lanode vers une rgion entourant la cathode, et
de la mme manire, les anions sont attirs par lanode et se dplacent dune rgion
entourant la cathode vers une rgion entourant lanode. Si leau pure ne contenait
pas dions, cette conductivit lectrique serait nulle. Quand de leau, la plus pure
possible, est prpare par des distillations successives, la conductivit lectrique
approche une valeur limite qui est environ gale celle dune solution dacide
chlorhydrique 1 107 M. Ainsi leau pure ne contient pas simplement des mol-
cules de H2O mais elle contient galement des ions hydronium une concentration
de 1 107 moles par litre ( 25C) et des ions hydroxyde la mme concentration.
Leau est une molcule amphiprotique, cest--dire une substance capable la fois
de donner et daccepter un proton, qui agit donc simultanment comme un acide et
comme une base. Leau pure a donc la proprit de se dissocier en ions hydronium,
H3O+, et hydroxyde, OH (q. [8.4]). Cest un exemple dautoprotolyse puisque
cest une molcule deau qui, agissant comme un acide, fournit un proton une
autre molcule deau, agissant comme une base qui fixe le proton :
H2O + H2O H3O + + HO [8.4]
+
Bien que ce soit lion hydronium, H3O , qui soit prsent dans leau et qui confre
celle-ci ses proprits acides, il est habituel dutiliser le symbole H+ la place de
H3O+ et de parler dion hydrogne plutt que dion hydronium, une pratique que
nous suivrons dans la suite de notre manuel. Lactivit de lion hydrogne joue un
rle central dans de nombreux processus biologiques et sa valeur varie sur une
large gamme. Cette large gamme de valeurs justifie lutilisation dune chelle
logarithmique, lchelle de pH. Ainsi plutt que dutiliser lactivit de lion
hydrogne, il est habituel dutiliser le pH, qui est dfinit comme moins le
logarithme dcimal de lactivit de lion hydrogne .
pH = log a [ H + ] [8.5]
Il faut noter que, pour des solutions trs dilues, lactivit peut tre assimile la
concentration et donc par souci de simplification, le pH est dfini dans la plupart
des manuels de biochimie en terme de concentration dion dhydrogne :
pH = log [ H + ] [8.6]
Nous suivrons galement cette pratique en insistant sur le fait quil est bon de se
rappeler dans certaines circonstances que la dfinition exacte du pH est base sur
lactivit. Selon cette dfinition [8.6], le pH dune solution contenant 1 mole dions
hydrogne par litre, a un pH de 101 cest--dire zro.
Lquilibre de dissociation de leau peut tre caractris par une constante
dquilibre :
[ H + ][ OH ]
K = [8.7]
[ H 2O ]
o [ H 2 O ] reprsente la concentration de leau dans la solution. Puisque, comme
nous lavons dj mentionn ci-dessous, la concentration (lactivit) de leau dans
une solution dilue est quasiment identique celle de leau pure, il est habituel
domettre ce terme dans lexpression des quilibres de dissociation pour des solu-
tions dilues. Ainsi le produit de la constante K et de [ H 2 O ] est assimil une
constante KW, dnomme le produit de dissociation de leau et nous pouvons
rcrire lquation [8.7] sous la forme :
KW = [ H + ][ OH ] [8.8]
Cette quation montre qu une temprature donne le produit de la concentration
dion hydrogne et de la concentration dion hydroxyde est une constante. La
valeur de KW est de 1 1014 M2 25o C, en accord avec les concentrations de
1 10 7 M des ions hydrogne et hydroxyde mesures dans leau pure (voir ci-
dessus). Une solution neutre contient autant dions hydrogne que dions hydro-
xyde, alors quune solution lgrement acide, contenant 10 fois plus dions
hydrogne quune solution neutre, contiendra 10 fois moins dions hydroxyde.
Tout comme la raction de dissociation de leau, la raction de dissociation dun
acide contenant un seul groupe ionisable, est caractrise par une constante
dquilibre. La raction rversible dcrite par lquation [8.3] est caractrise par
une constante de dissociation :
[ H 3O + ][ A ]
K = [8.9]
[ HA ][ H 2 O ]
Si nous considrons uniquement des solutions dilues, lactivit de leau est proche
de celle de leau pure dont la valeur est gale 1. Toutefois, dans la pratique, les
constantes dquilibre de dissociation sont exprimes en termes de concentration.
Cette simplification persiste et lquilibre de dissociation peut tre exprim en
terme de constante dacidit :
[ H 3O + ][ A ] [ H + ][ A ]
Ka = K [ H 2 O ] = [8.10]
[ HA ] [ HA ]
La valeur de la constante dacidit, Ka, est une mesure de laffinit pour le proton
des paires acide-base, HA/A et H2 O/OH, et donne ainsi une mesure de la force
dun acide ou dune base par rapport leau. Les acides sont classs en fonction de
cette force relative. Ceux dont la constante de dissociation est infrieure 1 ne
sionisent que partiellement en solution et sont appels des acides faibles (Ka < 1).
Ceux dont la constante de dissociation est suprieure 1 sont compltement ioniss
en solution (Ka > 1). Ainsi, une solution 0,1 M dun acide fort comme lacide chlo-
rhydrique contient 0,1 M dion hydrogne. Par contre, une solution dun acide
faible, comme lacide actique, qui nest pas compltement dissoci, contient une
concentration dion hydrogne plus faible quune solution dacide fort une con-
centration identique.
La force dune base peut galement tre estime par une mesure de sa constante de
dissociation, Kb, mais celle-ci est rarement utilise. Afin dhomogniser les mesures,
on utilise pour classer les bases, la constante de dissociation de leur acide conjugu :
[ B ][ H + ]
Ka = [8.11]
[ BH + ]
Les acides et les bases faibles sont celles dont la constante Ka est comprise entre
1 et 1014 M.
De la mme manire que le pH est dfini partir de la concentration de proton,
le pKa dun acide ou dune base est dfini comme moins le logarithme dcimal de
la constante de dissociation de lacide .
[ A ][ H + ]
pKa = log Ka = log [8.12]
[ AH ]
La relation entre le pH et les concentrations dun acide et de sa base conjugue
prsentes dans une solution peut aisment tre obtenue en rarrangeant cette quation :
[ A ]
log Ka = log + log [ H + ] [8.13]
[ AH ]
En se rappelant la dfinition du pH donne dans lquation [8.6], nous obtenons
lquation dHENDERSON-HASSELBALCH, qui donne le pH dune solution dacide
ou de base faible partir du pKa et des concentrations de la forme acide (AH dans
lexemple choisi) et de la forme base [ A ] prsentent dans la solution :
[ A ]
pH = pKa + log [8.14]
[ AH ]
Cette quation montre que pour un compos ne contenant quun seul groupe ioni-
sable, les concentrations de la forme acide et de la forme base seront identiques
lorsque le pH sera gal au pKa. La forme de la courbe de titrage prsente dans la
figure 8.1 qui montre la relation entre le pH et la fraction de forme ionise de la
molcule, [ A ] ([ A ] + [ AH ]) , indique que dans une rgion correspondant
pH = pKa 0,5, le pH est relativement insensible laddition ou llimination

dions hydrognes. Ce phnomne est dnomm effet tampon et un acide ou une
base faible un pH proche de son pKa constitue un tampon.
pH 14
12
10
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
[A]/([A]+[AH])
8.1 - Effet tampon
La figure montre la variation du pH en fonction du rapport des concentrations de la forme
base et de la forme acide dune molcule portant un seul groupe ionisable dont le pKa = 4,5
(trait en pointills). La zone grise stendant sur la gamme de pH = pKa 0,5, correspond
une variation du rapport [ A ] /([ A ] + [ AH ]) allant de 0,25 0,75.
8.2.2. Les tampons
Les tampons sont couramment utiliss pour maintenir un systme aqueux un pH

constant. En absence de tampon, nimporte quel processus biochimique qui
consomme ou libre des protons modifie la concentration dion hydrogne dans la
solution et donc son pH. Nous avons vu dans le chapitre 3 que lignorance de ce
phnomne a pos des problmes de reproductibilit aux premiers enzymologistes.
Afin de simplifier le traitement des quations, il est utile de rduire les deux
variables [ A ] et [ AH ] une seule variable :
[H+] [ AH ]
R = = [8.15]
Ka [ A ]
Comme la concentration de protons, la variable R est plus pratiquement reprsente
sur une chelle logarithmique.
pR = log R [8.16]
Cette chelle correspond lchelle de pH avec le point zro dplac la valeur du

pKa de lacide.
pR = pH pKa [8.17]
Le degr de dissociation de lacide, a, peut tre facilement exprim en fonction de
cette variable R :
[ A ]
a = = 1 [8.18]

[ A ] + [ AH ] 1+ R
Les tampons ont t dfinis par VAN SLYKE (1922) comme des substances qui, par
leur prsence en solution, augmentent la quantit dacide ou de base qui doit tre
ajoute pour provoquer une variation du pH dune unit. Lefficacit dun tampon,
cest--dire sa capacit rsister au changement de pH nest pas infinie et peut tre
dfinie par le pouvoir tampon molaire, soit partir de a, soit partir de R :
B = da [8.19a]
dpH
d ( R + 1 ) 1 d ( R + 1 ) 1 dR 1 dR
B = = = [8.19b]
dpH dR dpH ( R + 1 ) 2 dpH
En utilisant la drivation suivante :
dR = R ln10 [8.20]
dpH
le pouvoir tampon molaire dun acide ou dune base simple est donn par
lquation suivante :
B = R ln 10 [8.21]
( R + 1 )2
Cette fonction B (quation [8.21]) a un maximum R = 1 dont la valeur est
donne par :
ln10
Bmax = [8.22]
4
Il est donc possible de dfinir le pouvoir tampon molaire relatif, b, en divisant
lquation [8.21] par lquation [8.22] :
b = 4R [8.23]
( R + 1 )2
La forme de cette fonction est reprsente dans la figure 8.2. Elle a une valeur
maximale de 1 pR = 0 et diminue symtriquement de part et dautre.
1
Pouvoir tampon molaire relatif
0,8
0,6
0,4
0,2
0 2 4 6 8 10 12 14 pH
4 2 0 2 4 6 8 pR
8.2 - Pouvoir tampon molaire relatif
La courbe a t calcule partir de lquation [8.23] pour une molcule une seul groupe
ionisable de pKa = 4,5.
8.2.3. Les proprits acide-base des protines
Dans la dfinition des acides et des bases (voir 8.2), BRNSTED utilise le terme
espce , qui inclut les ions aussi bien que les molcules. Malheureusement, les
biochimistes ont, par convention, class les groupes ionisables rencontrs dans les
protines en fonction des proprits des acides amins dans leur tat compltement
non-charg. Ainsi, laspartate et le glutamate, qui sont largement responsables des
proprits basiques des protines dans des conditions physiologiques, sont commu-
nment classs comme des acides . Parmi les acides amins dits basiques,
lhistidine peut agir comme un acide ou comme une base dans des conditions
physiologiques, la lysine agit principalement comme un acide et larginine est
quasiment sans importance dans la dfinition des proprits acide-base des
protines, puisquelle ne perd son proton qu des valeurs de pH, suprieures 12.
Dun autre ct, deux des acides amins gnralement classs comme neutres, la
cystine et la tyrosine, contribuent de manire significative aux proprits acide-
base des protines. Si le but de la terminologie standard tait de compliquer les
discussions de ces proprits, un meilleur rsultat naurait pas pu tre obtenu. Bien
que nous ne proposions pas de modifier lappellation communment utilise de ces
groupements, il est bon de garder ce point en mmoire lorsque nous nous int-
ressons aux mcanismes catalytiques des enzymes. A cet usage, nous proposons
dans la figure 8.3 une tentative de classification plus rationnelle, qui na quasiment
rien de commun avec celle qui est gnralement rencontre dans les manuels de
biochimie et qui est base sur la dfinition de BRNSTED.
}
3,4 C-terminal (carboxylate)
4,1 Aspartate (carboxylate) Basique
4,5 Glutamate (carboxylate)
6,3 Histidine (imidazole) Principalement basique
N-terminal (ammonium) 7,5 Principalement acide
}
Cystine (thiol) 8,3
Tyrosine (phnol) 9,6 Acide
Lysine (ammonium) 10,4
Arginine (guanidinium) > 12 Aucun (voir texte)
1 3 5 7 9 11 13 pH
8.3 - Groupes ionisables dans une protine
Quelques-uns des groupes inclus dans la figure 8.3 comme le groupe carboxylique
C-terminal ou le groupe -amin de la lysine, ont des valeurs de pKa si loignes
de 7 quil semble improbable que ces groupes contribuent aux proprits catalyti-
ques des enzymes. Nanmoins, les valeurs de pKa donnes dans la table sont des
valeurs moyennes pour des groupes se trouvant dans un environnement typique,
mais ces valeurs peuvent varier normment par rapport aux valeurs de pKa de
groupes individuels dans des environnements particuliers, comme ceux rencontrs
dans les sites actifs de certains enzymes. Les valeurs de pKa de ces groupes peuvent
tre perturbes . Un exemple frappant est celui de la pepsine, qui a un point
isolectrique de 1,4. Puisque cet enzyme renferme quatre groupes qui sont chargs
positivement pH acide, il doit y avoir au moins quatre groupes avec des valeurs
de pKa bien infrieures celles communment rencontres pour des groupes
carboxyliques. Bien que lenzyme renferme une srine phosphoryle, celle-ci ne
peut expliquer quen partie la faible valeur du point isolectrique et il doit y avoir
au moins trois groupes carboxyliques perturbs. Une explication possible repose
sur lide que si deux groupes acides sont placs proximit lun de lautre, ltat
une fois proton de cet ensemble de deux groupes devrait tre beaucoup plus stable
que les tats deux fois protons et deux fois dprotons.
Comme nous venons de le voir, une protine contient en gnral un nombre
important dacides amins acides et basiques. Puisque ces acides amins ont la
capacit de sioniser, les protines sont considres comme des polylectrolytes,
cest--dire que se sont des molcules qui contiennent un trs grand nombre de
groupes ionisables, acides et bases. Le titrage de ces molcules est plus
complexes que celui dacides un seul groupe ionisable, car les pKa des groupes
acides-bases ne sont gnralement pas indpendants. La charge ionique qui
rsulte de la dissociation dun proton influence la dissociation ultrieure des
autres protons, modifiant ainsi la valeur du pKa de ces groupes. Exprimen-
talement, le titrage de ces macromolcules permet dobtenir une courbe donnant
le nombre de protons fixs sur la macromolcule, J, en fonction du pH de la
solution, en prenant comme point de rfrence (pH = 0) ltat de la macro-
molcule dans lequel le nombre de protons fixs correspond au nombre
maximum de protons qui peut tre fix (figure 8.4).
J 40
35
30
25
20
15
10
10
15
20
2 4 6 8 10 12 pH
8.4 - Courbe de titrage dune protine
La valeur de J reprsente la charge nette de la protine qui dpend du nombre de protons
fixs. Le pH pour lequel la charge nette est gale zro correspond au point isolectrique
de la protine. La courbe a t calcule pour une protine contenant 7 Asp, 14 Glu,
1 C-terminal, 12 His, 3 Tyr, 19 Lys, 4 Arg, et 1 N-terminal en utilisant les valeurs typiques de
pKa pour les diffrents acides amins qui sont prsentes dans la figure 8.3.
8.2.4. Analyse sur la base des constantes de dissociation des groupes
Linterprtation de ces courbes peut nanmoins savrer complexe. Considrons

par exemple, le titrage dune substance simple contenant deux fonctions acide-
base, comme la glycine. Les deux sites de fixation des protons ne sont pas qui-
valents, puisquil sagit dune part dune fonction acide carboxylique et dautre part
dune fonction amide. Leffet du pH sur lactivit de nombreux enzymes peut, en
premire approximation, tre interprt en terme dun modle simple, introduit par
MICHAELIS (1926), dans lequel seulement deux groupes ionisables sont considrs
comme dans le cas de la glycine. Dans ce cas, lenzyme est reprsent comme un
di-acide, HEH, avec deux groupes diffrents, comme prsent dans la figure 8.5. Si
les sites de fixation ne sont pas indpendants, les 4 constantes de dissociation dans
la figure 8.5 sont toutes dif-
EH + H+
K11 K22 frentes les unes des autres.
HEH E2 + 2 H+
K12 K21 8.5 - Dissociation dun acide amin ou dun

HE + H+ enzyme possdant deux groupes ionisables
En utilisant les constantes de dissociation telles quelles sont dfinies dans la

figure 8.5, les concentrations des diffrentes formes de lenzyme peuvent tre
dtermines en fonction du pH.
K
[ EH ] = [ HEH ] 11+ [8.24a]
[H ]
K12
[ HE ] = [ HEH ] [8.24b]
[H+]
K11 K 22 K K
[ E 2 ] = [ HEH ] + 2
= [ HEH ] 12 + 212 [8.24c]
[H ] [H ]
Deux points sont notables lorsque nous considrons ces relations. Premirement,
bien que K11 et K21 dfinissent la dissociation dun proton partir du mme groupe,
EH porte une charge ngative supplmentaire par rapport HEH et donc il est
moins acide, cest--dire que K11 > K21 ; pour la mme raison, K12 > K22. Deuxime-
ment, la concentration de E2 est la mme, quelle soit dfinie partir de la voie
passant par EH ou de celle passant par HE ; les deux expressions exprimant
[ E 2 ] dans lquation [8.24c] sont quivalentes, cest--dire que K11K22 = K12K21.
La constante dquilibre pour la dissociation de deux protons est donne par le pro-
duit des constantes de dissociation et doit donc tre indpendante du chemin suivi.
Il en dcoule quil ny a que trois constantes indpendantes puisque la connais-
sance de trois de ces constantes fournit automatiquement la valeur de la quatrime.
Si la concentration totale dacide est donne par :
[ E ]0 = [ HEH ] + [ EH ] + [ HE ] + [ E 2 ] [8.25]
[ E ]0
alors [ HEH ] = [8.26a]
K11 + K12 K11 K 22
1+ +
[H+] [ H + ]2
K11
[ E ]0
[H+]
[ EH ] = [8.26b]
K +K K K
1 + 11 + 12 + 11 + 222
[H ] [H ]
K12
[ E ]0
[ H+]
[ HE ] = [8.26c]
K +K K K
1 + 11 + 12 + 11 + 222
[H ] [H ]
K11 K 22
[ E ]0
[ H + ]2
[ E2 ] = [8.26d]
K +K K K
1 + 11 + 12 + 11 + 222
[H ] [H ]
Ces quatre expressions montrent comment les concentrations des diffrentes espces
varient avec la concentration de protons libres et donc avec le pH ; un ensemble
typique de courbes est prsent dans la figure 8.6, pour des valeurs arbitraires de
constantes de dissociation.
1
Concentration de la forme de l'enzyme
E2
HEH
0,8
EH
0,6
0,4
0,2
HE
0
4 5 6 7 8 9 10 pH
8.6 - Concentrations relatives des diffrentes formes de lenzyme en fonction du pH
Les courbes sont calcules pour un enzyme HEH dont les constantes de dissociation pour
les deux groupes ionisables sont les suivantes : pK11 = 6,1, pK12 = 6,9, pK21 = 7,0, pK22 = 7,8.
8.2.5. Analyse sur la base des constantes de dissociation molculaires
Dans une exprience relle, il est impossible de dfinir les courbes aussi prci-
sment que celles de la figure 8.5, parce quil nest pas possible destimer la valeur
des quatre constantes de dissociation. La raison de cette impossibilit rside dans le
fait que le rapport [ EH ] [ HE ] = K11 K12 est une constante et est donc ind-
pendant de [ H + ] . Ainsi, aucune variation de [ H + ] ne produira un changement
de [ EH ] qui ne sera pas accompagn dun changement proportionnel de [ HE ] .
Il est par consquent impossible de savoir quelles sont les contributions
respectives de EH et de HE une proprit mesure.
Pratiquement, nous devons donc traiter EH et HE comme une seule espce, dont
la concentration est donne par :
K +K
[ E ]0 11 + 12
[H ]
[ EH ] + [ HE ] =
K11 + K12 K11 K 22
1+ +
[H+] [ H + ]2 [8.27]
[ E ]0
=
[H+] K11 K 22
+1+
K11 + K12 ( K11 + K12 )[ H + ]
Cette quation peut tre crite sous la forme :
[ E ]0
[ EH ] + [ HE ] = [8.28]
[H+] K2
+1+
K1 [H+]
si deux nouvelles constantes, K1 et K2, sont dfinies comme suit :
([ EH ] + [ HE ])[ H + ]
K1 = K11 + K12 = [8.29]
[ HEH ]
K11 K 22 K 22 K 21 [ E 2 ][ H + ]
K2 = = = [8.30]
K11 + K12 K 22 + K 21 [ EH ] + [ HE ]
Ces constantes sont appeles les constantes de dissociation molculaires , pour les
distinguer des constantes microscopiques de dissociation de chacun des groupes,
K 11, K 12, K 21 et K22. Elles prsentent lavantage pratique de pouvoir tre mesures,
alors que les constantes microscopiques ne le sont pas.
Des expressions pour [ HEH ] et pour [ E 2 ] peuvent galement tre crites en
terme de constantes molculaires de dissociation :
[ E ]0
[ HEH ] = [8.31]
K1 K1 K 2
1+ +
[ H + ] [ H + ]2
[ E ]0
[ E2 ] = +
[8.32]
[H ] 2
[H+]
+ +1
K1 K 2 K2
8.2.6. Les fonctions pH de MICHAELIS
Les quations [8.28], [8.31] et [8.32] expriment les concentrations des diffrentes
formes ioniques de lenzyme en fonction de la concentration totale denzyme,
[ E ]0 . Les dnominateurs de ces quations sont des fonctions ne dpendant que de
la concentration en proton libre et des constantes molculaires K1 et K 2 , qui sont
appeles les fonctions pH de MICHAELIS :
[ E ]0
[ HEH ] = [8.33a]
f
[ E ]0
[ HE ] + [ EH ] = [8.33b]
f
[ E ]0
[ E2 ] = [8.33c]
f 2
2
o les fonctions de MICHAELIS, f, f et f , sont donnes par les expressions
suivantes :
K1 KK
f = 1+ + 1 2 [8.34a]
[ H + ] [ H + ]2
[H+] K2
f
= 1+ + [8.34b]
K1 [H+]
2 [ H + ] [ H + ]2
f = 1+ + [8.34c]
K2 K1 K 2
8.2.7. Les courbes en cloche
Nous allons prsent examiner en dtails lquation [8.28] parce que de nombreux
enzymes se caractrisent par un profil dactivit en fonction du pH qui a la forme
dune courbe en cloche. Les courbes reprsentant les concentrations relatives des
espces HE et EHont cette forme caractristique (fig. 8.6). La figure 8.7 repr-
sente un ensemble de courbes en cloche pour diffrentes valeurs de (pK2 pK1).
1
Fraction de l'enzyme
dans la forme ionise une fois
0,8
0,6
0,4
0,2
1 0 1 2 3 4 5
0
4 6 8 10 12 pH
8.7 - Courbes en cloche
Les courbes ont t calcules partir de lquation [8.28] avec pK1 = 6,0 et pK2 allant de
5,0 11,0. Les chiffres indiqus dans la figure reprsentent les valeurs de pK2 pK1, la
quantit qui dtermine la forme de cette courbe. (Notons que le plateau aux alentours du
maximum est plus aplati pour les diffrences de pKa les plus importantes).
Notons que les formes de ces courbes ne sont pas toutes identiques : le maximum
forme un plateau lorsque la valeur de (pK2 pK1) augmente, alors que le profil
ressemble un V invers lorsque cette valeur diminue ou devient ngative. La
valeur du maximum est infrieure 1 sauf si la valeur de (pK2 pK1) est suprieure
3. En consquence, les valeurs de pH pour lesquelles [ EH ] + [ HE ] prend
une valeur quivalant la moiti de sa valeur maximale ne correspondent pas pK1
et pK2. La relation entre la largeur mi-hauteur de la courbe et la valeur de
(pK2 pK1) est donne dans le tableau 8.1. Ce tableau permet de convertir les
mesures du pH pour lesquelles la valeur de lordonne est gale la moiti de sa
hauteur maximale en valeurs de pKa molculaire. Nanmoins, mme si les valeurs
de pK1 et pK2 sont estimes correctement, les valeurs des constantes individuelles
de dissociation restent indtermines, sauf si des arguments de plausibilit sont
invoqus, qui impliquent des hypothses invrifiables (DIXON, 1976)
Tableau 8.1 - Relation entre la largeur mi-hauteur et la valeur de pK2 pK1
pour des profils de pH ayant des formes de courbe en cloche
La mthode la plus pratique pour calculer la diffrence de pKa partir de la largeur mi-
hauteur est celle suggre par DIXON (1979) : elle dfinit la largeur mi-hauteur comme
2 log q ; alors pK2 pK1 = 2 log (q 4 + 1/q).
Largeur pK2 pK1 Largeur pK2 pK1 Largeur pK2 pK1

mi-hauteur mi-hauteur mi-hauteur
1,14* 2,1 1,73 3,1 3,00
1,2 1,27 2,2 1,88 3,2 3,11
1,3 0,32 2,3 2,02 3,3 3,22
1,4 0,17 2,4 2,15 3,4 3,33
1,5 0,51 2,5 2,28 3,5 3,44
1,6 0,78 2,6 2,41 3,6 3,54
1,7 1,02 2,7 2,53 3,7 3,65
1,8 1,22 2,8 2,65 3,8 3,76
1,9 1,39 2,9 2,77 3,9 3,86
2,0 1,57 3,0 2,88 4,0** 3,96
* La largeur mi-hauteur de la courbe dfinie par lquation [8.28] ne peut pas tre
infrieure 1,14.
** Lorsque la largeur mi-hauteur est suprieure 4, la diffrence de pKa ne diffre pas de
cette largeur par plus de 1%.
Bien que le tableau 8.1 autorise des valeurs ngatives de (pK2 pK1), celles-ci sont
seulement possibles si la libration des protons est cooprative, cest--dire si la
perte dun proton par un groupe augmente la tendance de lautre groupe perdre
son proton. Ce comportement nest pas impossible, mais pour des raisons lectro-
statiques celui-ci est improbable. En ralit, la plus petite valeur que (pK2 pK1)
puisse prendre sans impliquer de cooprativit est +0,6, qui correspond une
largeur mi-hauteur de 1,53. En pratique donc, des courbes en cloche plus abruptes
que cela sont trs rares.
8.3. LEFFET DU PH SUR LES CONSTANTES

CINTIQUES ENZYMATIQUES
8.3.1. Hypothses sous-jacentes
Les courbes dactivit en cloche qui sont souvent observes pour les paramtres
enzymatiques V et V Km peuvent tre expliques par une simple extension de la
thorie de lionisation dun acide dibasique (le traitement du K m est plus com
plexe, comme nous le verrons). Le mcanisme fondamental est prsent dans la
figure 8.8. Lenzyme libre est encore trait comme un acide dibasique, H2E, avec
deux constantes de dissociation, KE1 et KE2, et le complexe enzyme substrat H2EA
se dissocie de manire similaire, impliquant galement deux constantes de
dissociation, KEA1 et K EA2. Uniquement le complexe ionis une fois, HEA, est capa-
ble de ragir pour former les produits. Comme nous allons partir de maintenant
travailler uniquement avec des constantes de dissociation molculaire, il nest plus
ncessaire de faire la distinction entre les deux formes possibles denzyme ionis
une fois, cest--dire que HE fait rfrence aux deux espces qui sont reprsentes
par HE et EH dans la figure 8.5 et dans les quations prcdentes. Il en va de
mme pour le complexe enzyme-substrat HEA.
A + H2E H2EA
KE1 KEA1
k1 k2
A + HE HEA HE + P
k1
KE2 KEA2
A + E2 EA2
8.8 - Enzyme avec deux groupes ionisables
Seules les espces dissocies une fois sont supposes disposer dune activit catalytique.
Avant de continuer, nous souhaitons faire remarquer au lecteur que le schma de la

figure 8.8 comprend plusieurs suppositions implicites qui peuvent constituer des
simplifications. Premirement, lomission de ltape de fixation du substrat pour
H2E et E2 implique que les tapes de fixation de protons sont des culs-de-sac, de
sorte quelles peuvent tre traites comme des quilibres ( 6.3.5). Nanmoins,
dans la plupart des cas, il nexiste aucune justification relle pour supposer que le
substrat ne puisse pas se fixer directement sur diffrentes formes ioniques de

lenzyme et donc lhypothse est faite dans le but de simplifier le systme plutt
que de reprsenter la ralit. Si ces tapes sont incluses dans le mcanisme, les
tapes de fixation des protons ne sont pas des culs-de-sac et elles ne peuvent tre
traites comme des quilibres que si elles sont supposes trs rapides par rapport
aux autres tapes de la raction. Cela constitue une hypothse raisonnable, la
simple vue de la nature de la raction, mais qui nest pas toujours vrai, en
particulier si la raction de fixation de protons implique un changement obligatoire
de conformation de la protine.
Deuximement, le schma de la figure 8.8 implique aussi que la raction cata-
lytique comprend uniquement deux tapes, comme dans le mcanisme simple de
MICHAELIS et MENTEN. Si nous postulons lexistence de plusieurs tapes, o
chaque intermdiaire est capable de fixer ou de librer des protons, la forme de
lquation de vitesse nest pas affecte, mais linterprtation des rsultats exp-
rimentaux devient plus complique puisque chaque constante de dissociation
mesure exprimentalement est la moyenne des valeurs pour les diffrents inter-
mdiaires, pondre en faveur des formes prdominantes (comparez avec leffet de
lintroduction dune tape supplmentaire dans le mcanisme simple de
MICHAELIS et MENTEN, 3.6).
Finalement, il nest pas toujours vrai que seul le complexe HEA puisse catalyser la
raction chimique et donner les produits, mais cest une supposition vraisemblable
pour de nombreux enzymes puisque lactivit de la plupart des enzymes tend vers
zro pour des valeurs extrmes de pH.
8.3.2. La dpendance au pH des paramtres V et V /Km
Si nous considrons que le schma de la figure 8.8 est une reprsentation satisfai-
sante dun mcanisme rel, nous pouvons tablir les quations de vitesse qui en
dcoulent. Sil ny a pas dtape dionisation et que HE et HEA sont les seules
formes de lenzyme, le mcanisme correspond un mcanisme ordinaire de
MICHAELIS et MENTEN, caractris par lquation de vitesse :
k 2 [ E ]0 [ A ] V [ A ]
v = = [8.35]
k 1 + k 2 Km + [ A ]
+ [ A]
k1
dans laquelle V = k [ E ] et K = ( k + k ) k sont des paramtres indpendants
2 0 m 1 2 1
du pH. Dans le modle de la figure 8.8, cependant, lenzyme libre nexiste pas
uniquement sous la forme HE et le complexe enzyme-substrat nexiste pas
uniquement sous la forme HEA. Lquation complte de vitesse a la mme forme
que celle de lquation [8.14], cest--dire :
V [ A]
v = [8.36]
Km + [ A ]
mais les paramtres V et K m ne sont pas quivalent V et Km ; au contraire, ces

paramtres sont des fonctions de la concentration en proton, [ H + ] .
La drivation de lquation de vitesse peut tre effectue dans le cas de lhypothse
dun tat stationnaire en utilisant la procdure dcrite dans le 3.3.2. Cette procdure
est toutefois facilite par lutilisation des fonctions pH de MICHAELIS. Ainsi, dans le
cas du modle [8.8], lquation de conservation de lenzyme (quation [3.25]) scrit
de la manire suivante :
[ E ]0 = [ H 2 E ] + [ HE ] + [ E 2 ] + [ H 2 EA ] + [ HEA ] + [ EA2 ] [8.37]
Cette forme contient six termes de concentrations, mais en utilisant les fonctions pH
de MICHAELIS [8.34b], nous pouvons lcrire plus simplement sous la forme
suivante :
[ E ]0 = [ HE ] f E + [ HEA ] f EA

[8.38]

o f E et f EA reprsentent respectivement les fonctions pH de MICHAELIS corres-
pondant lquation [8.34b] pour lenzyme libre et pour le complexe enzyme-
substrat.
[H+] K
f E = 1 + + E+2 [8.39a]
KE 1 [H ]
[ H + ] KEA 2
f EA = 1+ + [8.39b]
KEA1 [ H + ]
En utilisant, lhypothse dun tat stationnaire (quation [3.27]) :
d [ HEA ]
= k 2 [ HE ][ A ] ( k 1 + k 2 )[ HEA ] = 0 [8.40]
dt
nous obtenons une expression reliant [ HE ] et [ HEA ] (quation [3.29]) :
k1
[ HEA ] = [ HE ][ A ] [8.41]
( k 1 + k 2 )
et nous pouvons rcrire lquation de conservation de E (quation [8.38]) sous la
forme suivante :
k1
[ E ]0 = [ HE ] f E +
[ A ] f EA [8.42]
( k 1 + k 2 )
Nous obtenons une expression simple reliant la concentration de la forme libre de
lenzyme la concentration totale denzyme, qui peut scrire sous une forme
similaire lquation [3.31] :
[ E ]T
[ HE ] = [8.43]
D
k1
o D = f E +
[ A ] f EA [8.44]
( k 1 + k 2 )
En appliquant la suite de la procdure dcrite dans le 3.3.2, nous obtenons une

quation de vitesse qui a la mme forme que celle de lquation [3.33] :
k1 [ E ]0 k 2 [ E ]0
v = k2 [ A ]0 = [8.45]
k 1 + k 2 D k 1 + k 2
f E + f EA [ A ]
k1
En utilisant les expressions pour les paramtres V et Km donnes ci-dessus, nous
obtenons des expressions pour V et V Km qui ont une forme similaire celle des
quations [8.28] et [8.33b] :
V
V = V = [8.46]
f EA [ H ] KEA 2
+
1 + +
KEA1 [ H + ]
V V
V = Km =
Km
[8.47]
Km fE
[H ] +
KE 2
1 + +
KE 1 [ H + ]
Il faut noter que le comportement vis--vis du pH de V reflte lionisation du com-
plexe enzyme-substrat, alors que celui de V Km reflte lionisation de lenzyme
libre (ou du substrat libre, voir 8.4). Quel que soit le cas, la dpendance au pH suit
une courbe en cloche du type de celle dont nous avons discut dans le prcdent.
8.3.3. Les paramtres indpendants du pH et

leur relation avec les paramtres apparents
La relation entre les paramtres rels et les paramtres indpendants du pH qui

viennent dtre introduits est similaire celle qui relie les valeurs relles et les
valeurs attendues que nous avons considres dans le traitement de la fixation non-
productive ( 5.8.1) ; mais elle est galement similaire la distinction faites entre
valeurs apparentes et relles (respectivement) dans de nombreux contextes. Ceci
peut sembler inconsistant : pourquoi disons-nous que les valeurs relles des para-
mtres de MICHAELIS et MENTEN dans une exprience dinhibition sont celles qui
sappliquent en absence dinhibiteur, alors que dans une tude de la dpendance au
pH, ce sont les valeurs qui sappliquent un pH particulier ?
Il serait raisonnable desprer une plus grande consistance dans ces appellations,
mais cela crerait plus de problmes que den rsoudre et, comme dans dautres
domaines, il est prfrable de sacrifier la consistance au pragmatisme. En thermo-
dynamique, par exemple, nous dfinissons ltat standard de la plupart des espces
en solution une concentration de 1 M, mais nous faisons une exception pour le
solvant en fixant sa concentration standard gale la concentration laquelle il se
trouve ; en biochimie, mais pas en chimie, nous tendons ces considrations au
proton, en admettant que les constantes dquilibre et les variations standards

dnergie de GIBBS ont beaucoup plus de sens lorsquelles sont dfinies pour un
tat standard pH 7 (pour une discussion plus dtaille de ce point, voir ALBERTY
et CORNISH-BOWDEN, 1993.)
En appliquant cette ide la dpendance au pH des paramtres de MICHAELIS et
MENTEN, nous rencontrons une diffrence importante entre le proton et les autres
inhibiteurs. Pour la plupart des inhibiteurs, il est parfaitement possible dtudier la
raction en absence de linhibiteur, et parfaitement raisonnable, donc, de dfinir les
paramtres rels comme ceux qui sappliquent dans ce cas. Il nest pas possible,
par contre, dobserver une raction catalyse par un enzyme en absence de protons,
et le fait que les protons activent les enzymes aussi bien quils ne les inhibent (alors
que les autres effecteurs de lactivit enzymatique inhibent plus souvent quils
nactivent) signifie que nous ne pouvons mme pas dterminer le comportement en
absence de proton par extrapolation. Finalement, en biochimie, toutes les distinc-
tions entre constantes et variables sont plutt des questions de pragmatisme que des
lois imposes par la nature et lexception de quelques constantes physiques
fondamentales, cette remarque sapplique pour la plupart des constantes en
science : mme en chimie-physique, la temprature par exemple, ne fait pas partie
de la dfinition dun tat standard et donc les constantes dquilibre varient
avec la temprature.
8.3.4. La dpendance au pH de Km
La variation de K m avec le pH est plus complexe que celle des autres paramtres,
puisque sa valeur dpend des quatre valeurs de pKa :
[H+] K
K m 1 + + E+2
K m f E KE 1 [ H ]
Km = = [8.48]

f EA [ H ] KEA 2
+
1 + +
KEA1 [ H + ]
Nanmoins, il est possible en principe dobtenir les 4 valeurs de pKa en portant en
graphique log K m en fonction du pH et en appliquant la thorie dveloppe par
DIXON (1953a). Pour comprendre ce graphique, il est prfrable de considrer
K m comme V divis par V Km , cest--dire de considrer log K m comme
log V log (V Km ) . Ainsi, une analyse de la manire dont log V et log (V Km )
varient avec le pH permet de comprendre naturellement la manire dont le Km
varie avec le pH. Il apparat clairement que, pour des concentrations leves de
proton (valeurs faibles de pH), lquation [8.46] se simplifie pour donner
V = V KEA1 [ H + ] et que pour des concentrations faibles (valeurs leves de pH),
elle se simplifie pour donner V = V [ H + ] KEA 2 . Si les valeurs de KEA1 et de KEA2
sont significativement diffrentes lune de lautre, il existe galement une rgion
intermdiaire dans laquelle V V . Il sensuit que le graphique de log V en fonction

du pH devrait avoir la forme prsente dans la partie suprieure de la figure 8.9,
correspondant approximativement trois segments linaires se coupant
pH = pKEA1 et pH = pKEA2. Le comportement de V Km prsent dans la partie
centrale de la figure 8.9 est similaire, except que les intersections sont localises
pH = pKE1 et pH = pKE2. En dpit de la complexit de lquation [8.18], le
graphique de log Km en fonction du pH sobtient simplement par soustraction, et sa
forme est reprsente dans la partie infrieure de la mme figure 8.9.
logV
pKEA1 pKEA2
pH
log(V/Km)
pKE1 pKE2
pH
pKEA1
log(Km)
pKEA2
c
pKE1
pKE2
pH
8.9 - Interprtation des profils de pH en accord avec la thorie de DIXON (1953a)
Bien que les graphiques du logarithme de nimporte lequel des paramtres cintiques donne
toujours des courbes lisses, comme le montre les courbes en pointills, elles peuvent tre
utilement interprtes comme si elles taient constitues de segments de droites.
(a) Des variations de la pente du graphique de log V en fonction du pH refltent des ioni-
sations dans le complexe enzyme-substrat ; (b) des variations de la pente du graphique de
log (V /Km) en fonction du pH refltent des ionisations dans lenzyme libre ; (c) en principe
toutes les ionisations affectent Km dune manire qui est le plus facilement rationalise en
considrant le graphique de log Km comme le graphique de log V log( V /Km).
Le graphique correspond approximativement une srie de segments de droite,

chacun ayant une pente de + 1, 0 ou 1 (des pentes de + 2 et de 2 sont galement
possibles, bien que lon nen trouve pas dans la figure 8.9). En suivant ces
segments de droite gauche sur le graphique, chaque augmentation de pente
indique le pKa dun groupe dans lenzyme libre, soit pKE1 ou pKE2, et chaque
diminution indique le pKa dun groupe dans le complexe enzyme-substrat, soit
pKEA1 ou pKEA2.
Les graphiques prsents dans la figure 8.9 sont idaliss, dans le sens o les
valeurs de pKa sont bien spares les unes des autres (par au moins une unit de
pH) et o les donnes couvrent une gamme suffisamment large de pH pour que les
quatre changements de pente soient facilement observables. Dans une exprience
relle, il serait inhabituel davoir des donnes prcises sur une gamme suffisam-
ment large pour estimer les quatre valeurs de pKa. Toutefois, linterprtation dun
changement de pente reste valable mme si seulement une partie du graphique est
disponible.
8.3.5. Prparation des expriences
Afin de fournir des informations significatives sur le mcanisme ractionnel, les

courbes de dpendance au pH devraient faire rfrence aux paramtres de lqua-
tion de MICHAELIS et MENTEN ou dune autre quation qui dcrit le comportement
chaque pH. (Mieux encore, elles devraient faire rfrence des tapes indivi-
duelles identifies dans le mcanisme, bien que cela ne soit pas souvent ralisable).
En dautres termes, une srie de vitesses initiales devrait tre mesure pour chaque
valeur de pH, telle que V et V Km puissent tre dtermines pour chaque valeur de
pH. La dpendance de v au pH na que peu de valeur cause des effets compen-
satoires sur V et sur V Km qui peuvent rendre trompeuses toutes les valeurs de pKa
obtenues partir de ces mesures. Ainsi, les mesures des effets du pH devraient
suivre les mmes principes que les mesures des effets sur lenzyme de la variation
de nimporte quel paramtre environnemental, comme la temprature, la force
ionique, les concentrations dinhibiteur et dactivateur
La caractrisation prliminaire du comportement dun enzyme en fonction du pH
est parfois ralise dune manire qui est encore moins utile que celle qui consiste
mesurer la variation de v avec le pH, en mesurant lavancement de la raction aprs
un temps fixe en fonction du pH. Fort heureusement il est de plus en plus rare de
trouver des rsultats publis sous cette forme, mais dans la littrature ancienne, des
informations potentiellement intressantes sont rendues totalement inutilisables
cause dune telle pratique exprimentale (voir INOUYE et al., 1966). Au mieux, une
mesure de lavancement de la raction un temps fixe, peut donner une indication
de la vitesse initiale, mais cette estimation risque dtre complique par la variation
de la courbure (quelle quen soit la cause, par exemple linactivation de lenzyme)
entre les diffrentes expriences.
8.4. IONISATION DU SUBSTRAT

De nombreux substrats sionisent dans la gamme de pH utilise pour les exp-
riences de cintique. Si le substrat sionise, il est ncessaire de se demander si les
valeurs observes de pKa se rapportent des groupes de lenzyme ou du substrat.
La thorie de ce cas, est la mme que pour lionisation de lenzyme et la thorie
prsente ci-dessus doit seulement tre lgrement modifie. La dpendance de V
au pH, et la diminution de la pente des graphiques de log Km en fonction du pH, se
rapportent toujours au complexe enzyme-substrat ; mais la dpendance de V Km
au pH, et les augmentations de la pente dans les graphiques de log K m en fonction
du pH peuvent se rapporter soit lenzyme libre, soit au substrat libre. Dans
certains cas, il est possible de choisir parmi ces deux interprtations en utilisant un
substrat qui ne sionise pas. Par exemple (figure 8.10a), la dpendance de kcat Km
au pH pour lhydrolyse de lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanylglycine cata-
lyse par la pepsine se caractrise par des valeurs de pKa de 1,1 et de 3,5, parmi
lesquelles la dernire pourrait tre attribue un groupe du substrat. Cette inter-
prtation a t confirme en considrant un substrat qui ne sionise pas, lactyl-L-
phnylalanine-L-phnylalaninamide : la dpendance au pH de la raction avec ce
dernier se caractrise par une valeur de pKa,1 essentiellement identique, de 1,05,
mais par une seconde valeur de pKa,2 plus leve, de 4,75 (figure 8.10b), qui se
rapporte probablement lionisation dun groupe de lenzyme.
8.5. EFFETS COMPLEXES DU PH
Une des raisons principales des tudes de dpendance au pH est de mesurer les
valeurs de pKa et partir de l, de dduire la nature chimique des groupes de len-
zyme qui participent la catalyse. Bien que cette pratique soit largement rpandue,
elle demande plus de prcautions quil ny parat, parce que les traitements simples
des effets du pH reposent sur des hypothses qui ne sont pas toujours vrifies.
KNOWLES (1976) a discut de manire critique les hypothses qui sont couram-
ment faites lors de linterprtation des profils de pH et a montr comment on peut
tre amen en tirer des conclusions errones ; sa revue devrait tre lue par
quiconque sintresse srieusement aux effets du pH sur les enzymes.
Ce ne sont pas seulement les hypothses quantitatives qui sont suspectes ; linter-
prtation qualitative dun profil de pH peut aussi tre trompeuse. Par exemple, bien
quune courbe en cloche puisse indiquer la ncessit pour deux groupes dexister
dans une forme ionique particulire, comme nous en avons discut dans les 8.3 et
8.4, ce nest pas la seule possibilit : dans certaines circonstances un groupe unique
impliqu dans diffrents tats dionisation dans deux tapes distinctes de la rac-
tion peut donner un comportement similaire (DIXON, 1973 ; CORNISH-BOWDEN,
1976a).
kcat/Km 300
(M1s1)
200
a - Ac-Phe-Phe-Gly
100
pK1 pK2
kcat/Km
(M1s1) 20
b - Ac-Phe-PheNH2
10
pK1 pK2
0
0 1 2 3 4 5 6 pH
8.10 - Dpendance au pH du paramtre kcat /Km pour les ractions dhydrolyse
catalyses par la pepsine, (a) de lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanylglycine et
(b) lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanin-amide (CORNISH-BOWDEN et KNOWLES, 1969)
La courbe en cloche obtenue rsulte dans ce cas dun changement dtape limitante
avec le pH (JENCKS, 1969) et au moins une des valeurs de pKa ne correspond
aucun groupement chimique. Ce type de pKa est gnralement appel pKa cintique
et ne donne aucune indication prcise quant au groupement impliqu dans le
mcanisme ractionnel. Dautres complications sont que la protonation ou la d-
protonation dun seul groupe dans ltat totalement actif peut conduire une perte
partielle dactivit, et que la perte totale de lactivit peut ncessiter plus dune
protonation ou dprotonation. Pour une discussion plus dtaille de ces effets com-
plexes du pH, nous renvoyons nos lecteurs larticle de TIPTON et DIXON (1979).
8.6. EFFETS DE LA TEMPRATURE SUR LES RACTIONS

CATALYSES PAR DES ENZYMES
8.6.1. Dnaturation thermique
En principe, le traitement thorique discut dans le 2.5 de la dpendance la

temprature des ractions chimiques simples sapplique galement aux ractions
catalyses par des enzymes, mais en pratique, il y a plusieurs complications qui

doivent tre correctement apprhendes si une information utile doit tre obtenue
partir de mesures dactivit enzymatique en fonction de la temprature.
Premirement, tous les enzymes se dnaturent lorsquils sont chauffs au-del des
tempratures physiologiques, et la conformation des enzymes est altre, souvent
irrversiblement, entranant une perte de leur activit catalytique. La dnaturation
est un processus chimiquement complexe, qui nest encore que partiellement com-
prise, et nous donnerons ici un compte-rendu simplifi de ce phnomne. Nous
limiterons notre discussion la dnaturation rversible, nous supposerons quun
quilibre existe en permanence entre la forme dnature et la forme active de len-
zyme, et quil nexiste quune seule espce dnature. Cependant, nous insistons
sur le fait que la limitation au cas rversible est motive par la simplification du
traitement et non pas parce que les effets irrversibles sont ngligeables dans la
pratique. Lexemple discut dans le 8.6.2 traitera dune dnaturation irrversible,
mais de manire qualitative.
La dnaturation rversible nimplique pas la rupture de liaisons covalentes, mais
seulement de liaisons de faible nergie, comme par exemple de liaisons
hydrognes, qui sont impliques dans le maintien de la conformation active de
lenzyme. Bien quune liaison hydrogne soit beaucoup moins forte quune liaison
covalente (environ 20 kJ mol1 pour une liaison hydrogne par rapport environ
400 kJ mol1 pour une liaison covalente), la dnaturation implique gnralement la
rupture de nombreuses liaisons de faible nergie. Plus exactement, elle implique le
remplacement de nombreuses liaisons hydrogne intramolculaires par des liaisons
hydrognes entre la molcule denzyme et les molcules du solvant. Lenthalpie
standard dune raction de dnaturation, DH ' , est souvent trs leve, typique-
ment entre 200 et 500 kJ mol1, mais la rupture de nombreuses liaisons de faible
nergie saccompagne dune augmentation considrable du nombre de conforma-
tions accessibles par la molcule denzyme, et donc la dnaturation se caractrise
aussi par une entropie standard de raction, DS' , trs leve.
Leffet de la dnaturation sur les constantes de vitesse observes peut
E' tre visualis en considrant lexemple simple dun enzyme actif E en
quilibre avec une forme inactive E', comme prsent dans le schma
K de la figure 8.11.
k
A+E E+P 8.11 - Mcanisme simple de dnaturation rversible de lenzyme
Par souci de simplicit, la raction catalytique est reprsente comme une simple
raction de second-ordre avec une constante k, telle que nous lobservons habituel-
lement pour de faibles concentrations de substrat. La constante dquilibre pour la
dnaturation varie avec la temprature en accord avec lquation de VANT HOFF
( 2.5.2) :
RT ln K = DG ' = DH ' TDS ' [8.49]
o R est la constante des gaz parfaits, T est la temprature absolue et DG' , DH '
et DS' sont respectivement lnergie standard de GIBBS, lenthalpie standard et
lentropie standard de la raction. Cette relation peut tre rarrange pour donner
une expression de K :
DS ' DH '

K = e R RT [8.50]
La constante de vitesse k pour la raction catalytique peut tre dfinie par
lquation dEYRING :
DG '
k T
k = B e RT [8.51]
h
o DG' est lnergie de GIBBS dactivation. La vitesse de la raction catalytique
est donne par v = k [ E ][ A ] , mais pour utiliser cette quation, la concentration
[ E ] de lenzyme actif doit tre exprime en termes de la concentration totale
[ E ]0 = [ E ] + [ E' ] et ainsi,
k [ E ]0 [ A ]
v = [8.52]
1+ K
La constante de vitesse observe, kobs, peut alors tre assimile k ( 1+ K ) , et elle
varie avec la temprature en accord avec lquation suivante :
k BT DG o'
exp

h RT
k obs = [8.53]
DS o' DH o'
1 + exp
R RT
Aux tempratures faibles, quand DS ' R est petit par rapport DH ' RT , le
terme exponentiel du dnominateur est insignifiant, et donc kobs varie avec la
temprature de la manire ordinaire prdite par lquation dEYRING. A des
tempratures suprieures DH ' DS ' , nanmoins, le dnominateur augmente
fortement avec la temprature et la vitesse de la raction diminue et tend
rapidement vers zro.
8.6.2. L optimum de temprature
Bien que le modle soit simplifi, il montre pourquoi lquation dEYRING ne dcrit
pas le comportement des ractions enzymatiques hautes tempratures. Dans la
littrature ancienne, il tait habituel de rapporter loptimum de temprature des
enzymes, et cela se rencontre encore occasionnellement de nos jours. Cependant, la
temprature laquelle kobs est maximum na aucune signification particulire,
puisque le dpendance la temprature des ractions catalyses par les enzymes
varient souvent avec les conditions exprimentales. En particulier, plus longtemps
le mlange ractionnel est incub avant lanalyse et plus l optimum de
temprature est bas (figure 8.12). Cet effet s'explique parce que la dnaturation est
souvent une raction lente, de telle sorte quelle ne peut tre correctement traite
comme un quilibre. Lavancement de la dnaturation ds lors augmente avec le
temps dincubation. Ceci ne devrait nanmoins plus poser de problmes avec les
techniques exprimentales modernes, puisque dans les mesures en continu, les
processus dpendants du temps sont aisment mis en vidence.
Avancement de la raction (%)
Vitesse 4 1 min
15
(%/min)
2 2 min
4 min
7 min
0 70
10 0 20 40 60 Temprature (C)
60
50
40
30
5
20
10
0
0
0 2 4 6 8 Temps (min)
8.12 - Effet de linactivation par la chaleur sur la dpendance la temprature
des vitesses des ractions catalyses par un enzyme
Si la vitesse initiale est considre comme la vitesse moyenne mesure pendant une
priode fixe, comme par exemple 1, 2, 4 ou 7 minutes (indique par les lignes en pointills),
la dpendance la temprature aura lallure dune courbe en cloche passant par un
maximum une temprature qui varie avec la priode utilise, comme illustr dans linsert.
8.6.3. Application de lquation dEYRING aux enzymes

A cause de la dnaturation, les tudes de la dpendance la temprature des
enzymes peuvent habituellement tre ralises uniquement dans une gamme troite
de temprature, approximativement entre 0 et 50C et mme dans cette gamme
plusieurs piges doivent tre vits. Premirement, la dpendance la temprature
de la vitesse initiale donne habituellement un graphique dARRHNIUS non-
linaire, partir duquel peu dinformation utile peut tre obtenue. De tels gra-
phiques constituent la plupart du temps des artfacts (voir par exemple SILVIUS,
READ et MCELHANEY, 1978), et un minimum requis pour raliser une tude
srieuse de la dpendance la temprature ncessite de mesurer une srie de
vitesses chaque temprature, de sorte que les graphiques dARRHNIUS peuvent
tre tracs pour chacun des paramtres du modle de MICHAELIS et MENTEN, V, Km
et V Km . Ces graphiques sont galement souvent non-linaires, et il existe
plusieurs explications possibles ce phnomne par exemple, un changement de
la conformation de lenzyme, la prsence de lenzyme sous la forme dun mlange
disoenzymes, un effet de la temprature sur le substrat de sorte quil est
dangereux de tirer des conclusions partir de la forme du graphique dARRHENIUS

moins que celui-ci ne puisse tre corrl avec dautres effets de la temprature,
mesurables indpendamment. MASSEY, CURTI et GANTHER (1966), par exemple,
ont observ des variations nettes environ 14C de la pente des graphiques
dARRHENIUS pour loxydase des acides amins D ; la mme temprature, dautres
techniques, telle que la sdimentation de vitesse et la spectroscopie dabsorbance
dans lUV, indiquaient un changement de conformation de lenzyme. Dans un tel
cas, il est raisonnable dinterprter le comportement cintique comme une cons-
quence de ce changement de conformation.
En gnral, peu dimportance est accorde aux tudes de la dpendance la
temprature de quelque paramtre de MICHAELIS et MENTEN que ce soit sans que
la signification de ce paramtre en termes de mcanisme catalytique ne soit
connue. Si K m est une fonction de plusieurs constantes individuelles de vitesse, sa
dpendance la temprature sera trs vraisemblablement une combinaison com-
plexe deffets compensatoires, et donc peu significative ou sans intrt ; par contre,
si K m est selon toute vraisemblance quivalent une constante de dissociation, sa
dpendance la temprature peut fournir des informations thermodynamiques
utiles au sujet de lenzyme.
La majorit des nergies de GIBBS dactivation pour les ractions catalyses par
des enzymes qui ont t publies, ont peu de valeur, mais il serait faux de suggrer
quaucune information utile ne peut tre obtenue partir de ce genre dtude ; si
elles sont ralises avec discernement, une information trs utile pour la com-
prhension du mcanisme catalytique peut tre obtenue. Une tude classique est
celle ralise par BENDER, KZDY et GUNTER (1964) sur l-chymotrypsine. Ce
travail diffre en de trs nombreux points des tudes typiques de la dpendance la
temprature. Il incluait des preuves convaincantes de lidentification des tapes
particulires qui taient ainsi tudies dans le mcanisme de la raction, il
comparait les rsultats obtenus avec de nombreux substrats, il se rapportait un
enzyme dj trs bien connu, et il tait correctement interprt en terme de chimie.
8.7. EFFETS DE LA PRESSION SUR LES RACTIONS

CATALYSES PAR DES ENZYMES
8.7.1. Effets de la pression sur les quilibres et les vitesses de raction
Dj en 1914, BRIDGMAN avait dmontr quune pression de 700 MPa induisait la

dnaturation des protines du blanc duf dune manire similaire mais nanmoins
diffrente, celle observe lors dune augmentation de la temprature (BRIDGMAN,
1914). Depuis ces premires tudes, ltude des effets de la pression sur les
macromolcules sest dveloppe et il est clair quune caractrisation complte des
proprits thermodynamiques et cintiques dun systme passe par ltude des
effets de la pression qui permet de dterminer les variations de volume que subit le
systme lors dune raction.
Les effets de la pression 1 sont gouverns par le principe de LE CHATELIER qui dit
quun systme lquilibre soumis une perturbation, ragit dune manire qui
tend minimiser les effets de cette perturbation. Une augmentation de la pression
favorise donc la rduction du volume du systme. Lquation [2.18] indique que
lnergie libre dun systme dpend du produit de la pression et du volume. A
temprature constante, la variation de volume, qui est dfinie comme la diffrence
entre le volume final et le volume initial, est donne par lquation suivante :
ln K
DV = V p VA = DG = RT [8.54]
p T p T
Une expression similaire peut tre obtenue pour la constante de vitesse k dun
processus lmentaire, qui relie k aux paramtres dactivation, avec DV repr-
sentant la diffrence entre le volume de ltat de transition et celui de ltat fonda-
mental. Les valeurs de DV et de DV peuvent tre obtenues en portant en graphique
respectivement ln K ou lnk en fonction de la pression, p.
Les tudes de leffet de la pression sur des systmes biologiques sont moins
courantes que celles de leffet de la temprature, dune part parce quelles nces-
sitent un quipement moins courant quun bain thermostatique et dautre part parce
que les concepts de base des effets de la pression sur les ractions chimiques et sur
la structure des macromolcules sont moins bien apprhends, que ceux des effets
de la temprature. Cependant, ltude des effets de la pression prsente lavantage
que cette dernire naffecte que le volume du systme tudi, contrairement la
temprature qui affecte la fois lnergie interne et le volume du systme.
Linterprtation des volumes de raction et dactivation est gnralement prsente
en termes de contributions intrinsques et de contributions du solvant. Des effets de
compensation peuvent alors masquer certains changements et compliquer lanalyse
de ractions complexes comme les ractions enzymatiques. Les contributions
intrinsques peuvent rsulter de changements dans la densit de compaction de la
protine ou de la formation ou de la rupture de liaisons covalentes. La formation
des liaisons covalentes a un DV de lordre de 10 mL mol1, alors que les valeurs
de DV pour les changes de liaison ou les changements dangles sont pratiquement
nulles. Les variations de volume provenant de modifications de la densit de
compaction sont difficiles mesurer mais sont considres comme faibles. Ainsi en
absence de formation ou de rupture de liaisons covalentes, les contributions les
plus importantes proviennent de changements de ltat dhydratation des interac-
tions non-covalentes.
1. Dans le systme international (S.I.) lunit de pression est le Pascal et typiquement

la pression est exprime en mgaPascals (MPa). En pratique, diffrentes units de
pressions sont couramment utilises : 1 MPa est quivalent 10 bars et 9,87 atm.
8.7.2. Effet de la pression sur les interactions non-covalentes
Un facteur important qui contribue aux variations de volume des macromolcules

est li lhydratation des interactions lectrostatiques. Quand un ion est form en
solution, les molcules deau qui lentourent sont attires par lion (interactions
ion-diple), un phnomne connu sous le nom dlectrostriction et qui conduit
une rduction du volume du systme. Pour la solvatation dun ion portant une seule
charge, la variation du volume est de lordre de 10 mL mol1. La dissociation
dune molcule neutre en deux ions saccompagne ainsi dune variation de volume
de lordre 20 mL mol1, qui correspond au volume dionisation de leau pure.
Le phnomne dlectrostriction est proportionnel au carr de la charge de lion et
donc, la variation de volume est plus importante pour les ions plusieurs fois
chargs. Sur la base de ces informations, nous pouvons conclure que les inter-
actions lectrostatiques dans les macromolcules sont affaiblies lorsque la pression
augmente. Par exemple, la chymotrypsine est inactive de manire rversible par
une augmentation de pression cause de la dissociation dun pont salin dans la
rgion du site actif (HEREMANS et HEREMANS, 1989).
Un second facteur est li leffet de la pression sur les liaisons hydrogne.
Des tudes ralises avec des composs modles indiquent que les liaisons hydro-
gne sont stabilises par une augmentation de la pression (VAN ELDIK et al., 1989),
en raison dune rduction des distances inter-atomiques. Nanmoins, des ractions
impliquant des changes entre des liaisons hydrogne existantes se caractrisent
par une trs faible variation de volume (VAN ELDIK et al., 1989).
Finalement, la formation dinteractions hydrophobes saccompagne dune augmen-
tation de volume (DV > 0) et ces interactions sont donc affaiblies par une augmen-
tation de la pression. Nanmoins, limportance de cet effet dpend du modle
tudi et varie entre + 1 et + 20 mL mol1 pour un groupe CH2. Dautre part les
interactions par empilage des cycles aromatiques sont caractrises par un volume
de raction ngatif et sont donc stabilises par une augmentation de pression.
8.7.3. Effets de la pression sur les ractions enzymatiques
Ltude des changements de volume dans les diffrentes tapes dun processus
catalytique fournit des donnes complmentaires celles obtenues par dautres
mthodes. Toutefois, la variation du volume dactivation pour les ractions enzy-
matiques impliquant plusieurs tapes peut tre complexe et inclure des change-
ments de volume dans ltape qui dtermine la vitesse mais aussi dans ltape de
fixation du substrat et dans toutes les tapes qui prcdent ltape limitant la
vitesse.
Une tude dtaille des variations de volume accompagnant les diffrentes tapes
dune raction enzymatique a t ralise pour la raction de conversion du
fumarate (F) en L-malate (M) catalyse par la fumarase (BUTZ et al., 1988). Cette
raction suit un mcanisme ractionnel simple :
E+F EF EM E+M [8.55]
La formation des tats de transition des ractions de fixation des ractifs sur
lenzyme saccompagne dune rduction du volume du systme alors que la for-
mation de ltat de transition partir du complexe enzyme-substrat ou du complexe
enzyme-produit saccompagne dune augmentation du volume (figure 8.13). Ces
variations peuvent sexpliquer par lexistence dun changement de conformation de
lenzyme qui permet au substrat de pntrer dans le site actif. De plus, des
molcules deau sont libres parce que lorientation correcte du substrat dans le
site actif implique la formation de paires dions qui rsultent dune augmentation
du volume en passant de ltat de transition au complexe EF ou EM. Finalement le
volume dactivation pour la raction de conversion du fumarate en L-malate au sein
du complexe enzyme-substrat a un volume suprieur celui du systme de dpart.
Cette augmentation additionnelle du volume associe lhydratation du fumarate et
la dshydratation du L-malate, indique que ltat de transition a un volume plus
grand. Dans ce systme, le volume passe par un maximum ou un minimum dans les
tats de transition, alors que le volume des complexes enzyme-substrats est
similaire celui de lenzyme libre. Il faut nanmoins noter que les changements de
volume au cours de la raction enzymatique sont faibles par rapport au volume
total de lenzyme (environ 0,3%).
Volume 40
(mL.mol1)
[EA][EB]
20
V2 V2
0
E+A E+B
EA EB
20
V1 V1 V3 V3
40
60 [EA] [EB]
8.13 - Effets de la pression sur une raction enzymatique
Les variations de volume pour les deux tapes de fixation des substrats et des produits et
pour la raction chimique sont celles mesures pour la raction de conversion du fumarate
en L-malate. La figure est dessine partir des donnes de BUTZ et al. (1988).
8.8. EFFETS ISOTOPIQUES DU SOLVANT
Bien que les effets isotopiques aient t traits dans le chapitre 7 ( 7.6 et 7.7), les
effets dus la substitution isotopique du solvant (SCHOWEN, 1972) sont discuts ici
puisquil est plus appropri de les considrer comme des effets de lenvironnement,
en particulier parce que les processus rellement responsables des effets isoto-
piques du solvant sont les mmes que ceux qui dterminent le comportement du
pH, cest--dire les quilibres impliquant les hydrons dfinition 2. Ltude de ces
effets partage galement quelques autres proprits avec les tudes de dpendance
la temprature, tant exprimentalement simple raliser, mais difficile inter-
prter correctement sauf si ltape tudie du mcanisme est clairement identifie.
Une simple mesure de la vitesse de la raction dans 1H2O et dans 2H2O ne rvle
quasiment rien du mcanisme, mais la mesure de la vitesse en fonction de la
fraction molaire de 2H2O dans des mlanges isotopiques de composition varie peut
tre beaucoup plus informative. Navement, nous pourrions nous attendre ce que
la valeur dune constante de vitesse dans de tels mlanges puisse tre obtenue par
interpolation linaire entre les valeurs mesures dans 1H2O et dans 2H2O, mais la
dpendance est presque toujours non-linaire, et la forme de la courbe peut rvler
des informations sur le mcanisme.
Considrons un mlange de 1H2O et de 2H2O dans lequel la fraction molaire de
2
H2O est n, de telle sorte que le rapport [ 2H 2 O ] [ 1H 2 O ] est gal n ( 1 n ) .
Pour un hydron changeable dans une molcule de ractif AH, le rapport
deutron proton sera aussi donn par [ 2H 2 O ] [ 1H 2 O ] = n ( 1 n ) si les cons-
tantes dquilibre pour les protons et les deutrons sont les mmes. Une slection
sexercera cependant de telle sorte que le rapport rel est f n ( 1 n ) o est le
facteur de fractionnement pour la position changeable. De tels changes
dhydrons peuvent se drouler non seulement dans les molcules de ractifs
mais galement dans ltat de transition de la raction : dans cet tat de transition
il existe un rapport similaire deutron/proton, f n ( 1 n ) o f reprsente le
facteur de fractionnement pour la mme position changeable. La vitesse totale
de la raction est alors donne par la somme des vitesses pour les espces
protones et deutres de telle sorte que la vitesse est proportionnelle
2. En chimie, dans la plupart des cas, le terme proton est utilis pour dsigner la
fois le noyau 1H et le noyau de nimporte lequel des isotopes de lhydrogne, mais
cette pratique nest plus satisfaisante lorsquil sagit de discuter les effets des
isotopes de lhydrogne. Dans les contextes o une plus grande prcision est
ncessaire, la Commission de Chimie Organique Physique de lIUPAC (1988) a
recommand le terme hydron pour dsigner nimporte quel noyau dhydrogne
sans aucune considration pour lisotope, rservant le terme proton pour le
noyau 1H et le terme deutron pour le noyau 2H. Nous suivrons cette recom-
mandation dans la suite de cette section.
n n qui peut scrire plus simplement sous la forme

1 + f 1 + f

( 1 n ) ( 1 n )
(1 n + f n) . Il en dcoule que la constante de vitesse observe k

pour une
(1 n + f n) n
fraction molaire n de 2H2O peut tre exprime comme une fonction de n et de la

constante de vitesse ordinaire k0 dans l1H2O pure :
k0 ( 1 n + nf )
kn = [8.56]
1 n + nf
Jusqu prsent nous navons considr quun seul hydron, mais une molcule
typique denzyme contient un grand nombre dhydrons changeables, chacun
pouvant en principe contribuer leffet isotopique du solvant. Si tous les hydrons
(incluant les deux hydrons prsents dans chaque molcule de solvant) schangent
indpendamment, de telle sorte que la distribution des protons et des deutrons
peut tre calcule simplement partir des lois de la statistique, les effets de tous les
hydrons sont multiplicatifs et lquation [8.56] peut tre gnralise sous la forme
de lquation de GROSS-BUTLER :
k 0 ( 1 n + nfi )
kn = [8.57]
( 1 n + nfi )
dans laquelle les deux produits sont appliqus lensemble des hydrons chan-
geables du systme.
A la vue du grand nombre dhydrons changeables, et donc du grand nombre de
terme dans chacun des produits de lquation [8.57], cette quation peut paratre
dsesprment trop complique pour fournir des informations utiles. Cependant,
une simplification importante rsulte de deux considrations. Premirement, les
effets isotopiques lquilibre sont normalement petits ( 7.6.3), parce que les
effets sur les niveaux dnergie se compensent largement entre les deux cts dun
quilibre. Cela signifie que la plus large part ou la totalit des facteurs de frac-
tionnement i, dans le dnominateur de lquation [8.48] sont proches de lunit.
Deuximement, pour les hydrons qui ne sont pas directement affects lors de la
raction, ces effets sannulent lors de la comparaison de ltat fondamental avec
ltat de transition, en grande partie pour les effets isotopiques secondaires
( 7.6.2) et compltement pour les hydrons les plus loigns. Cela signifie que les
facteurs de fractionnement du numrateur de lquation [8.57] sont aussi proches
de lunit. A la fin, donc, la plus grande partie des contributions lquation [8.57]
viennent dun petit nombre dhydrons qui sont modifis dans ltat de transition, et
une bonne approximation est obtenue en crivant lquation comme suit :
k n = k 0 ( 1 n + nfi ) [8.58]
o le produit est calcul pour les hydrons dont les valeurs de f sont significa-

tivement diffrentes de lunit (les autres peuvent toujours tre incluses mais elles
naffectent pas les rsultats). Pour un tat de transition impliquant un hydron,

lquation donne une dpendance linaire de kn sur n ; pour un tat de transition
impliquant deux hydrons, lquation donne une dpendance quadratique Donc
dans les cas les plus simples, la forme de la courbe mesure fournit un moyen de
compter les hydrons impliqus dans ltape limitant la vitesse de la raction. Pour
cette raison, ce type dexprience est souvent appel un inventaire de protons ou plus
prcisment un inventaire dhydrons.
La prudence simpose pour tendre cette thorie plus avant, puisque plusieurs
hypothses ont t ncessaires pour obtenir lquation [8.57] et dautres encore
pour obtenir lquation [8.58]. De plus, la thorie a t dveloppe pour une
constante lmentaire de vitesse, mais dans les applications enzymatiques, elle doit
souvent tre applique des grandeurs moins fondamentales. Beaucoup dautres
complications peuvent surgir dans les ractions enzymatiques, de sorte quen
aucune manire les effets isotopiques lquilibre ne sont pas toujours ngli-
geables ou que les ractions dans 2H2O ne sont pas toujours plus lentes que dans
1
H2O. Une tude des effets isotopiques du solvant sur lactivit de lhexokinase D
(POLLARD-KNIGHT et CRONISH-BOWDEN, 1984) offre des exemples de chacune de
ces exceptions : faibles concentrations de glucose la raction est environ 3,5 fois
plus rapide dans 2H2O que dans 1H2O, et puisque cet effet isotopique inverse
persiste (et mme augmente) pour de faibles concentrations de MgATP, il doit
avoir un effet sur lquilibre.
PROBLMES
8.1 - Pour un enzyme dont le Km dpend dun seul groupe ionisable, avec des
valeurs de pKa, pKE dans lenzyme libre et pKEA dans le complexe
enzyme-substrat, lquation [8.48] se simplifie sous la forme suivante :
( K E + [ H + ])
K m = K m .
( K EA + [ H + ])
a - A quel pH le graphique de Km en fonction du pH prsente-t-il un point
dinflexion ?
b - A quel pH le graphique de 1 Km en fonction du pH prsente-t-il un
point dinflexion ? [Si vous avez des difficults admettre ce rsultat,
calculez K m et 1 Km plusieurs valeurs de pH dans la gamme com-
prise entre 3 et 10, en supposant que pKE = 6,0 et que pKEA A = 7,0, et
tracez les graphiques de ces paramtres en fonction du pH. Pour une
discussion des principes qui sont lorigine de ce problme, voir
FERSHT (1985)].
8.2 - Linterprtation dun graphique de log K m en fonction du pH est simpli-
fie en utilisant la relation log Km = logV log (V Km ) dans laquelle K m, V
et V Km sont non seulement des grandeurs possdant des dimensions

mais ont des dimensions diffrentes. Cette relation viole-t-elle les rgles
discutes dans le 1.2 et si cela est le cas, jusqu quel point lanalyse
dcoulant de la figure 8.9 est-elle incorrecte ?
8.3 - Un profil pH en cloche se caractrise par des valeurs dordonnes pour
les demi-maxima des valeurs de pH gales 5,7 et 7,5. Estimer les
valeurs de pKa molculaires. Sil existe une raison indpendante de
penser que la valeur du pKa dun groupe est gale 6,1, que pouvons-
nous dduire au sujet du pKa des trois autres groupes ? [Ce problme est
moins trivial quil napparat premire vue].
8.4 - Dessiner un schma plus raliste de la dpendance au pH de lactivit
dun enzyme en modifiant le schma de la figure 8.8 comme suit :
a - permettre au substrat et au produit de se fixer sur les trois formes de
lenzyme libre et supposer que les constantes de vitesse pour ces
ractions de fixation sont indpendantes de ltat de protonation ;
b - En supposant que le processus catalytique est une raction trois
tapes dans lequel chaque tape est rversible et dans lequel la
seconde tape, la conversion entre HEA et HEP, se droule pour les
complexes une seule fois protonn, et en supposant que toutes les
ractions de protonation sont lquilibre dans les conditions dtat
stationnaire, utiliser la mthode de CHA ( 6.) pour driver une
expression de K m en fonction de la concentration dion hydrogne.
La solution a une apparence complexe qui peut tre simplifie en
dfinissant f ([ H + ]) =
1 . Dans quelles circonstances
+
[H ] K2
1+ +
K1 [H+]
Km est-il indpendant du pH ? Si ce paramtre est indpendant du pH
quelle valeur prend-il ?
8.5 - Les mesures suivantes de V une temprature T ont t ralises pour
une raction catalyse par un enzyme sur une gamme de temprature
dans laquelle aucune inactivation thermique ne peut tre mise en
vidence. Ces donnes sont-elles consistantes avec linterprtation selon
laquelle V est donn par k 2 [ E ]0 o [ E ]0 est constante et k 2 est la cons-
tante de vitesse pour une tape simple du mcanisme ?
T (C) V (mM min1) T (C) V (mM min1)

5 0,32 30 11,9
10 0,75 35 19,7
15 1,67 40 30,9
20 3,46 45 46,5
25 6,68 50 68,3
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE
9.1. FONCTION DES INTERACTIONS COOPRATIVES

ET ALLOSTRIQUES
9.1.1. Cycles futiles
S'il est clair que tous les organismes vivants ncessitent un contrle efficace des
processus mtaboliques afin de permettre des changements ordonns tout en vitant
une progression catastrophique vers lquilibre thermodynamique, il est moins
vident de raliser que les enzymes dcrites dans les chapitres prcdents ne sont
pas capables de fournir le degr de contrle ncessaire.
La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate fournit une
excellente illustration de ce problme essentiel permettant de discuter des propri-
ts de lenzyme qui sont ncessaires pour quune rgulation efficace soit possible.
La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate ncessite de
lATP :
Fructose 6-phosphate + ATP Fructose-1,6-biphosphate + ADP [9.1]
Cette raction est catalyse par la phosphofructokinase et constitue la premire
tape de la glycolyse qui soit unique cette voie mtabolique cest--dire qu'elle
ne fait partie daucune autre voie mtabolique. Elle reprsente donc une tape
adapte pour la rgulation de la glycolyse, et, bien qu'aujourd'hui ( 10.5) la
recherche dun site unique de rgulation dune voie mtabolique soit considre
comme une simplification, il ne fait aucun doute que la phosphofructokinase
contribue de manire importante au contrle de la glycolyse dans la plupart des
cellules.
Dans des conditions physiologiques la raction catalyse par la phosphofructo-
kinase est essentiellement irrversible, et comme le fructose 1,6-biphosphate doit
tre convertit en fructose 6-phosphate lors de la noglucogense, une raction
diffrente doit tre utilise, une raction hydrolytique catalyse par la fructose
biphosphatase :
Fructose 1,6-biphosphate + H2O Fructose 6-phosphate + Pi [9.2]
Cette raction est aussi quasiment irrversible. Lexistence de deux ractions irr-
versibles parallles revt une grande importance dans le contrle mtabolique : elle
signifie que la direction du flux entre les deux mtabolites peut tre dtermine par
une rgulation diffrentielle de lactivit des deux enzymes. Une simple raction
rversible ne pourrait pas tre contrle de cette manire, parce quun catalyseur ne
peut pas modifier la direction du flux dune raction, qui est dtermin uniquement
par des considrations thermodynamiques. Les catalyseurs modifient uniquement
la vitesse laquelle lquilibre est atteint.
Si la phosphofructokinase et la fructose biphosphatase se comportaient de manire
non-contrle, en catalysant les ractions la mme vitesse, il ny aurait aucune
conversion nette du fructose 6-phosphate et du fructose 1,6-biphosphate, mais une
hydrolyse continue de lATP, qui conduirait ventuellement la mort de lorga-
nisme. Cette situation est connue sous le nom de cycle futile. Pour lviter, soit les
deux processus doivent avoir lieu dans des cellules diffrentes (ou dans des
compartiments cellulaires diffrents), soit les deux enzymes doivent tre contrls
de manire telle que lun nest actif que lorsque lautre est inhib. De nombreux
cycles potentiels sont contrls par la compartimentation, mais ce nest pas tou-
jours possible et donc un contrle alternatif est ncessaire. Cest par exemple le cas
de tissus comme le foie qui catalysent la fois la glycolyse et la noglucogense.
Le terme cycle futile a t dlaiss dans les trois dernires dcennies, en raison
de la dcouverte de lexistence de nombreux cycles et parce que ceux-ci ne sont
pas ncessairement prjudiciables la cellule. Comme nous en discuterons dans le
10.9.2, les cycles entre formes actives et inactives des enzymes peuvent cons-
tituer un mcanisme extrmement sensible de rgulation de lactivit catalytique
qui compense trs largement le faible cot d lhydrolyse de lATP. Mme
lorsque le rsultat principal dun cycle est de produire de la chaleur, il peut diffici-
lement tre qualifi de futile sil permet un animal sang chaud de maintenir
la temprature ncessaire la vie ou sil permet au bourdon de voler (et de col-
lecter le nectar) par temps froid.
9.1.2. Mcanismes de rgulations de lactivit enzymatique
Dans le contexte cellulaire, il est vident que lactivit des protines et des en-
zymes en particulier, doit tre strictement rgule de sorte que ceux-ci remplissent
leur fonction au bon moment et au bon endroit. Tout dabord, il faut rappeler que
lactivit dun enzyme est dtermine par sa structure et donc par sa squence.
Nanmoins lactivit biologique des protines peut tre rgule diffrents niveaux
et par diffrents mcanismes. Il est possible de distinguer des mcanismes extrin-
sques de rgulation, qui nagissent pas directement sur lactivit dun enzyme
donn, et des mcanismes intrinsques qui modifient directement lactivit dun
enzyme donn.
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE 295
Un premier mode de rgulation extrinsque de lactivit dun enzyme consiste

dans lexistence au sein dun mme organisme, de multiples formes dun mme
enzyme, qui sont appeles des isoenzymes. Lexpression diffrentielle de ces
isoenzymes dans des tissus distincts ou des organelles distincts ou des stades
diffrents du dveloppement fournit un moyen simple de rguler dans le temps et
dans lespace une activit enzymatique. Les isoenzymes sont des protines
homologues qui catalysent dans un mme organisme la mme raction chimique,
mais dont les paramtres cintiques et les mcanismes intrinsques de rgulation
sont diffrents.
Comme nous lavons vu dans le chapitre 3, lactivit dun enzyme dpend de sa
concentration. Le mcanisme le plus vident de rgulation de lactivit consiste
donc dans la rgulation de la concentration de la protine. Une diminution ou une
augmentation de la quantit denzyme, entrane une modification de lactivit
puisque celle-ci est directement proportionnelle la concentration denzyme. La
quantit d'un enzyme prsente dans une cellule un moment donn dpend de la
balance entre la synthse et la dgradation de cette protine. La biosynthse des
protines est contrle aux diffrents stades de la transcription, de la traduction
ou de leurs modifications post-traductionnelles mais la dgradation cellulaire des
protines est galement un processus rgul dont la vitesse est module notam-
ment par la nature de lacide amin N-terminal. La complexit des machineries
cellulaires impliques dans les processus de synthse et de dgradation des pro-
tines implique que ce mode de rgulation est lent. Il ne permet pas une cellule
de ragir rapidement un changement de conditions, mais il permet certainement
une rgulation long terme.
Plusieurs modes de rgulation intrinsques de lactivit des enzymes permettent
une adaptation plus rapide un changement intervenant dans les conditions cellu-
laires. Un premier type de modification directe de lactivit de lenzyme consiste
dans la modification covalente et rversible de la protine. Les proprits cata-
lytiques de nombreux enzymes sont affectes par la modification covalente dun
groupe de la protine, comme par exemple la fixation dun groupe phosphate.
Gnralement ces modifications sont elles-mmes catalyses par un enzyme
(kinase) et les ractions inverses sont catalyses par un autre enzyme (phos-
phatase). Celles-ci permettent de restaurer ltat initial de la protine.
Un second mode de rgulation intrinsque de lactivit est lactivation protoly-
tique. Ce mode dactivation irrversible permet de convertir la forme inactive
dun enzyme en une forme active. Il est largement utilis dans la production de
protases dont lactivit doit s'exercer lextrieur de la cellule, comme dans le
cas des enzymes digestives (trypsine, chymotrypsine) ou des enzymes de rgula-
tion de la coagulation du sang ou de lapoptose.
Finalement, lactivit enzymatique peut tre rgule par la fixation dun ligand
sur la protine. Nous avons dj discut des mcanismes dinhibition mais il
existe galement un mcanisme de contrle allostrique reposant sur la fixation

dune petite molcule sur un site distinct du site actif qui induit un changement
de lactivit de lenzyme. La rgulation par la fixation de petites molcules
reprsente un moyen important de contrle de lactivit de nombreux enzymes
dont nous allons discuter dans ce chapitre.
9.1.3. Inadquation de lquation de MICHAELIS et MENTEN

pour dcrire les mcanismes de rgulation
Nous devons maintenant nous demander si un enzyme qui obit aux lois ordinaires
de la cintique enzymatique peut tre rgul suffisamment prcisment pour viter
les cycles futiles. Pour un enzyme qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN,
v = V [ A ] ( Km + [ A ]) , un simple calcul montre que la vitesse est gale 0,1
quand [ A ] = Km 9 et quelle est gale 0,9 V quand [ A ] = 9 Km . En dautres
termes, une norme augmentation de la concentration de substrat, 81 fois, est
ncessaire pour provoquer une augmentation modeste de la vitesse de 10% 90%
de la vitesse limite.
Un rsultat essentiellement similaire est obtenu pour linhibition simple. Supposons
quune raction soit inhibe de manire comptitive en accord avec lquation
V [ A]
v= . Le rapport des vitesses en prsence (n ) et en absence
[ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
Km + [ A ]
(n0) dinhibiteur peut scrire v = qui a une valeur de 0,1
v0 [ I ]
Km 1 + + [ A]
Kic
[ A] Kic [ A ]
quand [ I ] = 9 Kic 1 + et de 0,9 quand [ I ] = 1 + : encore une
Km 9 Km
fois, une variation de la concentration de 81 fois est ncessaire pour balayer la
gamme allant de 10% 90% de la vitesse limite.
Mme si nous considrons leffet de deux ou de plusieurs inhibiteurs agissant
en parallle, la mme conclusion quantitative simpose : une grande variation de
lenvironnement a des effets modestes sur la vitesse de la raction. Cest pourtant
exactement loppos de ce qui est ncessaire pour une rgulation efficace du
mtabolisme ; dun ct la concentration des principaux mtabolites doit tre main-
tenue dans des limites troites, et dun autre ct les vitesses de raction doivent
tre susceptibles de varier normment probablement plus que la gamme allant
de 10 90% que nous venons d'voquer en rponse des fluctuations
lintrieur de ces limites troites.
9.1.4. La cooprativit
Clairement, les lois ordinaires de la cintique enzymatique sont inadaptes pour

permettre le contrle ncessaire du mtabolisme. Au contraire, de nombreux
enzymes qui semblent jouer un rle important dans la rgulation mtabolique
prsentent la proprit de rpondre avec une exceptionnelle sensibilit aux chan-
gements de concentration des mtabolites. Cette proprit est connue sous le nom
de cooprativit, parce quelle peut tre considre comme provenant dune
coopration entre les sites actifs denzymes polymriques. Comme illustr dans
la figure 9.1, le graphique de la vitesse en fonction de la concentration de substrat
prsente une forme sigmode (en forme de S) caractristique, trs diffrente des
hyperboles rectangulaires dcrivant lquation de MICHAELIS et MENTEN. Il faut
noter en particulier que la partie la plus pentue de la courbe est dcale par rapport
lorigine, vers une concentration positive, typiquement une concentration com-
prise dans la gamme des concentrations physiologiques du mtabolite concern. Un
thme majeur de ce chapitre est dexaminer les thories qui ont t proposes pour
rendre compte de la cooprativit ou, en dautres termes, pour expliquer la forme
des courbes telles que celles de la figure 9.1. Evidemment, avant dappliquer une
de ces thories un exemple exprimental de courbe sigmode, chacun devrait
sassurer que celle-ci est relle et non un artfact, comme dans le cas prsent dans
le 7.5.2 et discut en dtails par DUGGLEBY (1994).
v/V 1 Hyperbolique (MICHAELIS-MENTEN)
0,8
0,6 v/V 1 MICHAELIS-MENTEN

Sigmodal
(cooprative)
0,4 0,5
cooprative
0,2
0
2 1 0 1 log[A]
0
0 2 4 6 8 10
[A] (units arbitraires)
9.1 - Comparaison dune courbe hyperbolique de la vitesse en fonction
de la concentration de substrat avec deux courbes sigmodes (coopratives),
calcules avec des coefficients de HILL (voir 9.2.1 ci-dessous) de 2 et de 4
Il faut noter que toutes ces courbes sont sigmodes quand elles sont retraces comme une
fonction du log [ A ] (insert) mais les courbes coopratives sont plus pentues.
9.1.5. Interactions allostriques
La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate illustre un autre

aspect important de la rgulation mtabolique, nommment que les produits
immdiats et ultimes dune raction sont habituellement diffrents. Bien que lATP
soit un substrat de la phosphofructokinase, leffet de la glycolyse dans sa totalit
est de produire de lATP, et cela en trs grande quantit si nous considrons que la
glycolyse est une voie menant au cycle des acides tricarboxyliques et aux
phosphorylations oxidatives. Donc, lATP doit tre considr comme un produit de
la glycolyse, mme sil est un substrat de lun des principaux enzymes rgulant la
glycolyse. En consquence, linhibition ordinaire par le produit de la phospho-
fructokinase fonctionne de manire oppose ce qui est ncessaire pour une
rgulation efficace. Pour permettre un apport constant dnergie mtabolique, la
phosphofructokinase doit galement tre inhibe par le produit final de la voie
mtabolique, lATP, comme cest le cas dans la ralit.
Ce type dinhibition ne peut toutefois pas se raliser par les mcanismes habituels,
cest--dire par lintermdiaire de la fixation de linhibiteur agissant comme un
analogue du substrat. Dans un certain nombre de cas, cela entranerait un effet
oppos celui recherch ; dans dautres cas, le produit final de la voie mtabolique
peut avoir une ressemblance structurale limite avec les ractifs de lenzyme
rgul ; par exemple, lhistidine partage peu de similarits structurales avec le
phosphoribosyl-pyrophosphate, son prcurseur mtabolique. Pour permettre une
inhibition ou une activation par des effecteurs appropris la voie mtabolique, de
nombreux enzymes rguls ont acquis des sites pour la fixation de linhibiteur qui
sont distincts des sites catalytiques. MONOD, CHANGEUX et JACOB (1963) ont pro-
pos que ceux-ci sappellent des sites allostriques, du Grec signifiant une forme
diffrente 1, pour mettre en vidence la diffrence structurale entre substrat et effec-
teur, et que les enzymes qui possdent de tels sites sappellent des enzymes
allostriques.
De nombreux enzymes allostriques sont galement coopratifs, et vice versa.
Cette dualit nest pas surprenante puisque les deux proprits sont importantes
pour la rgulation mtabolique, mais elle ne signifie pas que les deux termes sont
interchangeables : ces deux termes dcrivent deux proprits diffrentes qui
devraient tre clairement distingues. Dans de nombreux cas, elles ont t iden-
tifies sparment : la cooprativit de lhmoglobine tait connue depuis plus de
60 ans lorsque leffet allostrique du 1,2-biphosphoglycrate a t dcrit ; le
premier enzyme dans la voie de biosynthse de lhistidine a t un des premiers
enzymes allostriques reconnus, mais aucune phnomne de cooprativit na pu
tre observ.
1. La traduction littraire est un autre solide , mais une forme diffrente trans-
met mieux lide essentielle que linhibition ne rsulte pas dune quelconque simi-
larit structurale entre le substrat et leffecteur.
9.2. LE DVELOPPEMENT DE MODLE

EXPLIQUANT LA COOPRATIVIT
9.2.1. Lquation de HILL
Il est souvent pratique dexprimer le degr de cooprativit dun enzyme en terme

de lquation suivante :
V [ A ]h
v = [9.3]
K0h,5 + [ A ]h
Celle-ci est connue sous le nom dquation de HILL, puisquune quation similaire
avait t propose par HILL (1910) pour dcrire de manire empirique la fixation
cooprative de loxygne sur lhmoglobine. Le paramtre V joue le mme rle que
la vitesse limite dans lquation de MICHAELIS et MENTEN, et est connu sous le
mme nom. Par contre, bien que K0,5 comme K m dans lquation de MICHAELIS et
MENTEN, dfinit la valeur de la concentration de substrat [ A ] pour laquelle
v = 0,5 V, ce paramtre ne doit tre ni appel constante de MICHAELIS, ni dsign
par le symbole Km, parce que ceux-ci font spcifiquement rfrence lquation de
MICHAELIS et MENTEN, et que lquation [9.3] nest pas quivalente lquation
de MICHAELIS et MENTEN (sauf dans le cas trivial o h = 1). Lquation de HILL
est souvent crite avec le symbole K0h,5 remplac par une constante qui nest pas
leve la puissance h : bien que cette pratique ne pose aucun problme pratique
dutilisation de lquation, elle a le dsavantage de produire une constante qui a les
dimensions d'une concentration leve la puissance h, laquelle il est difficile de
donner une interprtation physique.
HILL considrait son quation comme purement empirique et dniait toute signi-
fication physique au paramtre h, qui est maintenant couramment appel le
coefficient de HILL. Bien que lon trouve parfois des tentatives de driver cette
quation partir dun modle, il est prfrable de sen tenir son exemple. Lqua-
tion de HILL, avec une valeur entire de h, peut correspondre au cas limite dun
modle physique de fixation de substrat, mais le h obtenu exprimentalement est
rarement un nombre entier, et, sauf dans les limites de modles ralistes, ne doit
pas prendre une valeur entire. Il est donc incorrect de traiter ce paramtre comme
une estimation du nombre de sites de fixation du substrat sur lenzyme, bien que
pour certains modles, il fournisse une valeur maximale pour ce nombre. Les
valeurs typiques de h pour lhmoglobine sont denviron 2,7, alors que le nombre
de sites de fixation de loxygne (nombre qui tait inconnu de HILL) est de quatre.
Si lquation [9.3] est rarrange comme suit :
v = [ A ]h [9.4]
V v K0h,5
le rapport v ( V v ) peut tre considr en absence de mesure directe de la

fixation comme une mesure du rapport [ EA ] [ E ] , et si nous prenons le
logarithme de chaque ct de lquation, nous obtenons :
v
log = h log [ A ] h log K0 ,5 [9.5]

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C O L L E C T I O N G R E N O B L E S C I E N C E S

DIRIGE PAR JEAN BORNAREL

Directeur scientifique de Grenoble Sciences

Comit de lecture pour Cintique enzymatique

Grenoble Sciences reoit le soutien du Ministre de l'ducation nationale,

Ralisation et mise en pages : Centre technique Grenoble Sciences

Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques

Dans le contexte post-gnomique actuel, la recherche en biologie doit faire face

mcanisme ractionnel au niveau atomique. Ainsi, la cintique enzymatique est un

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constitutifs. Ce processus implique gnralement la rupture ou la formation de

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synthtises dans la loi d'action de masses tablie par GULDBERG et WAAGE

1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires

Le mcanisme d'une raction dcrit comment la raction se droule. Pour un grand

1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction

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En considrant que [ P ] = 0 au temps t = 0, nous obtenons une valuation de la

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0,4 log v a 0,4 log v b

1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse

Tableau 1.1 - Caractristiques de ractions d'ordre 0, 1 et 2

du graphique [A] 4 1.100 4

La connaissance des dimensions des constantes de vitesse permet de vrifier trs

1.2.6. Les ractions rversibles

De nombreuses ractions sont rversibles et les deux sens de la raction doivent

qui peut tre rarrange pour donner :

1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre

De cette manire [ P ] [ P ] = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t [1.30]

Le graphique de GUGGENHEIM est insensible aux dviations des cintiques par

micro-informatique a progressivement transform et amlior l'analyse des donnes

[ A ] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100

[ A ] (mM) 10 20 50 100 10 20 50 100

1.2 - Vrifiez les affirmations suivantes concernant les dimensions en suppo-

1.3 - KZDY, JAZ et BRUYLANTS (1958) et S WINBOURNE (1960) suggrrent

2.1. LA THERMODYNAMIQUE ET SES LIMITES

Dans le premier chapitre, nous avons discut de ltude de la cintique des

2.2. CONCEPTS GNRAUX DE LA THERMODYNAMIQUE

2.2.1. tats du systme

2.1 - Description thermodynamique de lunivers

Ltat dun systme thermodynamique est dcrit par un nombre restreint de

2.2.2. Un processus est un vnement au cours duquel

2.3. LES LOIS DE LA THERMODYNAMIQUE

2.3.1. Loi de conservation de lnergie

La conservation de lnergie est un principe universel. La premire loi de la

Dans lanalyse thermodynamique, il est particulirement important de considrer

2.3.2. La dfinition de lentropie et du critre de spontanit

Le premier principe de la thermodynamique tablit que lnergie est conserve lors

Selon lquation [2.9], lentropie du systme peut diminuer au cours dun

2.3.3. La dfinition statistique de lentropie

La relation quantitative entre lentropie et le dsordre a t tablie pour la premire

Ce principe est souvent appel la troisime loi de la thermodynamique.

2.3.4. Lentropie dans les systmes vivants et les ractions couples

Conformment la deuxime loi de la thermodynamique, lentropie 1 est relie