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V V   V



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V  V  V
 

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V
Aislar, seleccionar y caracterizar cepas termotolerantes y resistentes a altas
concentraciones de alcohol de Saccharomyces cerevisiae para el mejoramiento de la
producción de aguardientes, teniendo como materia prima melaza de caña de azúcar y
residuos de la etapa de fermentación de caña de azúcar.

VVà 
àV  à

V

2V à tener melaza de caña de azúcar mediante la preparación, extracción del jugo,

clarificación, evaporación, cristalización y centrifugación
2V Aislar las cepas de Saccharomyces cerevisiae fermentadoras y de melaza de caña de
azúcar.
2V peterminar los parámetros de selección de las mejores cepas de Saccharomyces
cerevisiae.
2V Seleccionar las cepas de Saccharomyces cerevisiae termotolerantes y resistentes a
etanol del cultivo aislado de melaza de caña.
2V à tener cultivos axénicos de Saccharomyces cerevisiae
2V maracterizar morfológicamente las cepas aisladas de Saccharomyces cerevisiae.
2V ×reservar las mejores cepas de Saccharomyces cerevisiae.
V

V à à
V

×ara realizar el presente tra ajo nos hemos asado en pu licaciones científicas so re
rendimientos de producción de etanol.V

Los fenómenos relacionados con la tolerancia térmica y la tolerancia a etanol de los

microorganismos han sido investigados exhaustivamente. La temperatura optima de
crecimiento especialmente de saccharomyces cereviciae es de 30° a 35 °m (Hernández et al.,

, la temperatura afecta el crecimiento de manera nota le, principalmente porque los
microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido de
temperatura, según estudios realizados se ha reportado que la tolerancia a el etanol y altas
temperaturas son interactivos, porque las concentraciones altas de alcohol disminuyen la
temperatura optima de crecimiento y el aumento de la temperatura incrementa el efecto
inhi itorio de etanol por lo tanto afecta directamente al rendimiento (Sa-morreia y van Uden,

3; van Uden, 
;Laluce,  ;Banat et al., 
.

Los efectos tóxicos de la temperatura y el etanol están relacionados con alteraciones de la

permea ilidad de las mem ranas celulares, la desnaturalización de proteínas intracelulares,
así como la inhi ición del transporte de nutrientes (pAmore et al.,  0; Banet et al., 
.
El mecanismo de respuesta celular al estrés por temperatura y por etanol es esencialmente
similar (×iper,  5 y consiste en cam ios en la composición lipídica de las mem ranas y en
síntesis transitoria de proteínas (Thomas y Rose,   ; Benschoter e Ingram, 
. Entre las
estrategias para mejorar la tolerancia térmica se encuentran la selección de cepas, adaptación
de cepas mediante incu ación a temperaturas crecientes.
V
En Ecuador el uso de melaza como sustrato para la producción de saccharomyces cerevisiae
es utilizado para la o tención de aguardiente, existe alrededor de 
000 hectáreas cultivadas
de caña destinadas a la producción de azúcar. V V V
 de caña de azúcar
están destinadas a la producción de aguardiente y otros productos artesanales.

El total de aguardiente producido en el Ecuador es de 22.000 L/año V V V V V V
!V"VV #$ V " VVVde 0.3 g de etanol por cada gramo de azúcares a
35°m, pero a 40°m (cepas termotolerantes se o tiene 0.4g de etanol por cada gramo de
azúcares, lo que incrementaría el rendimiento a 2 .0  L/año.

Tomando en cuenta los datos citados anteriormente, se puede esta lecer que la ela oración
de aguardiente como e ida alcoholica es renta le en nuestro país y aunque no se pretende
competir con las grandes fá ricas productoras, se sugiere la optimización del proceso, con
la utilización de cepas de sacharomyces cerevisiae termotolerantes que produce mayor
cantidad de etanol con menor consumo de azucares, se economiza la materia prima por lo
tanto disminuyen costos de producción que generaran un incremento de ingresos de una
fa rica productora de aguardiente.

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V  àV àV
V
VV V
La caña de azúcar es una gramínea tropical, en cuyo tallo se forma y acumula un jugo rico en
sacarosa, compuesto que al ser extraído y cristalizado forma el azúcar.

 VV VV V

V
V V Es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido, sales y otros
compuestos solu les en álcali que normalmente están presentes en el jugo de la caña
localizada, así como los formados durante el proceso de manufactura del azúcar.
 VVVVVVVVVVVVVVVVVVVVV'

V àà V VVV V VV V VV V

ààV àV ààVV

ateria seca 

×roteínas 3
sacarosa 0-3
mà
×àETES
AYàRES Azúcares reductores 3-5
Sustancias disueltas 4-

(azúcares diferentes
Agua 
grasas 0.40
menizas 
malcio 0.4
màTEIpà pE magnesio 0.35

IERALES fósforo 0.0

potasio 3.
SALES àrgánicas 3.0-3.4
inorgánicas .5-4.5
Ácidos orgánicos -3
mà
×àETES
EàRES Aminoácidos .5-5.5
Almidones 0.00-0.050

VV  àààVV V V

Las melazas se o tienen como un su producto final en la ela oración de la caña de azúcar.
Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos termófilos dentro de la
melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan ien durante la dilución de las melazas.
V
 à V V
Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la o tención de etanol a nivel
industrial de ido a que es un microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es
exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol,
en la fermentación produce ajos niveles de su productos, es osmotolerante, capaz de utilizar
altas concentraciones de azucares.

  V Es una técnica que consiste en incrementar en una po lación mixta el
número de organismos de interés en relación al resto. pe esta forma se usca favorecer el
crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas
al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros.

Esto se logra mediante el empleo de sustratos específicos en el caso de Saccharomyces

cerevisiae, como es el extracto de malta reforzado que ayuda a mantener la fuerza selectiva
del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo uscado.

V×ara el proceso de selección la cepa de e cumplir ciertos factores como:

Un alto rendimiento, Una alta velocidad de transformación, mrecer en un medio con ajo costo,
pe e ser fácil de manejarla y transportarla.
V
  V En el aislamiento simplemente lo que se usca es o tener colonias separadas
con el fin de evaluar sus características macro y microscópicas y finalmente, si se considera de
interés proceder a su purificación y crio conservación.V
V
V La crio conservación es una técnica utilizada para mantener los
microorganismos de importancia en la industria o en un estudio en particular en condiciones
de ajas temperaturas con el fin de reducir su meta olismo normal hasta llevarlo a asal
(manteniendo el microorganismo via le por largo tiempo, preservando las estructuras
celulares con el fin de evitar el envejecimiento o evolución de un determinado
microorganismo, es decir sin cam ios en sus características (genéticamente esta les; además
mantener los cultivos puros, reduciendo las pro a ilidades de contaminación.


V àVàà à à

V


Và àVVà  VV VV VV V

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VV àV  VV VV VV à VVVV
V

  VVàV
V
V V  
V Simple según la orma Tà 03 03 Ȃ 0 y orma àficial
exicana
à
-42-SSA- 5 Be idas Alcohólicas
iV La muestra seleccionada para el análisis de e ser representativa del lote entero del
alimento y lo suficientemente grande para poder llevar a ca o todas las
determinaciones.
iV Transportar muestras de alimentos perecederos ajo refrigeración (2-
°m o en
congelación si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda
contaminar el alimento.
iV Reducir el tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra.
iV
uestras líquidas de en encontrarse homogéneas, emplearse de 00 a 500 ml.
iV à tención de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda
de isturí y pinzas, uso de isopos inertes estériles humedecidos en solución diluyente
estéril.
×ara determinar anaero ios estrictos se de e exponer lo menos posi le a la atmósfera
y usar líquidos de dilución con ajo potencial redox como el medio de Stuart (con
tioglicolato o medio enriquecido para clostridios (con cisteína.

 : majas petri, cooler, isopos esteriles para tomar las muestras


V  àV

V 
V
V
ERTàLA, Rodolfo; YATàRà, àsvaldo. Sistemas de cultivo y aspectos generales de
iorreactores mapitulo . Aspectos generales de los procesos de fermentación mapitulo 2.
(×arte de
onografías mientíficas. ×rograma Regional de pesarrollo mientífico y Tecnológico
de la àEA. Fecha de visita: 20 de septiem re de
200.http://www.science.oas.org/Sim io/m io_ind/cap_mi.pdf.
V

VVVVVVVVVVV àV

.V Inocular alícuotas de  ml de crema de levadura en un erlenmeyer de 50 ml

contenidas en 50 ml de caldo de mata reforzado
2.V Incu ar a 45°m con agitación (20rpm durante 5 a 20 horas hasta que la tur idez
indique evidencia de crecimiento celular
 
V Tomar muestras de los matraces con resultados de crecimiento positivo y realizar
diluciones seriadas hasta 0-5 con suero fisiológico ( g/L de amlV

VVVVVVVV

VVVV  àV

.V A partir de los cultivos diluidos efectuar siem ras por estriado so re agar malta.
2.V Incu ar las cajas a 35°m por 4
horasVVVVVVVV

VVVVVVVV

VVVV  V

.V Realizar una resiem ra por estriado en agar malta enriquecido con ampicilina
(300mg/L para inhi ir la flora competitiva que aun puede persistir.
2.V Incu ar las cajas a 35°m por 4
horas.

VVVVVVV

'VVVV à V

.V pel cultivo puro o tenido en la fase anterior seleccionar las mejores colonias y aplicar
el método de perlas para conservación
2.V molocar en los crioviales de 0 a 20 perlas las cuales serán conservadas.
3.V La temperatura adecuada para la conservación de la cepa es de 4°m
'
V   VV à V
V VVVVV
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     VVV
V
  V  V
V monsiste en el repique periódico del cultivo
V en un medio nutritivo fresco. El intervalo
 V de transferencia varía con el
microorganismo, de iendo considerarse el
medio adecuado para cada especie. Una vez
desarrollados los cultivos se mantienen a 4
°m durante lapsos que oscilan entre 5 días
y 2 meses, aunque presentan algunos
inconvenientes.
V
V monsiste en cu rir completamente el
V cultivo después de su desarrollo en medio
   VVVV V sólido, con una capa de aceite mineral o
vaselina estéril. Los cultivos en esta forma
se pueden conservar a temperatura
 am iente o aún mejor en heladera por
períodos de varios años.
V
V Es una técnica de elección, ya sea para
V cortos o largos períodos de tiempo.
V La técnica involucra el crecimiento del
V cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en
V general en esta etapa las células son más
V resistentes a los daños por congelación y
descongelación.
Las células a congelar pueden ser
resuspendidas directamente en un agente
crioprotector o se puede agregar el mismo
como aditivo al medio de cultivo. El más
empleado es glicerol al 0.

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ൌ ൌ ʹͲͲ ܷ‫ܥܨ‬ൗ݈݉
ܸ‫݊݁݉ݑ݈݋‬ ͳͲͲߤ݈

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"V 20 200
V

"V >300 _

"V Inconta le (Velo espeso _

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V VV VV !V 

  à VV V #VVV V V

"V molonias cremosas de orde irregular, opacas, lisas, planas, color eige y
con un pequeño orde color lanco.
"V Las colonias de esta cultivo se o servan como un velo dispuesto so re la
V caja de petri, se o servan algunas colonias separadas muy pequeñas, su
característica es de orde no muy definido, opacas, lisas y planas,
V"V Las colonias de estos cultivos se o servan como un velo dispuesto so re
V la caja de petri muy espeso, que no permite o servar ninguna morfología
en las colonias

VVVVV !V 
V V

à  àV"V VV

V

à servación a 0x
En este enfoque se o servan un cúmulo de color morado,
algunas un poco dispersas, por sus características alargadas
podemos determinar que el microorganismo que se cultivo y
creció corresponde a la Levadura Saccharomyces cerevisiaeV

à servación a 40x mon este lente podemos o servar la morfología de las

levaduras las colonias son redondas d color eige
rillante se presentan en colonias unitarias aisladas

!V 
 c
 

2V Aunque existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más
efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona productora de
aguardiente donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales
seleccionadas en nuestro caso fueron o tenidas de los propios fermentadores donde
se produce el aguardiente; ya que se cree que las levaduras que se encuentran en una
microzona son:
iV Específicas del área.
iV Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona
iV Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar.
iV Responsa les, al menos parcialmente, de las características únicas de los productos
o tenidos.

2V La muestra o servada al microscopio nos confirma la ausencia de contaminación en el

cultivo de algún tipo de microorganismo que nos pudiesen ha er alterado los medios
ya que se o servan solo levaduras.
 2V Se esta leció que la ampicilina es un uen agente de control en las fermentaciones ya
que inhi ió la flora acompañante en la melaza y la levadura no fue afectada en la
producción de iomasa
2V ×ara evaluar la termotolerancia de los cultivos, la cepa fueron sometida a
temperaturas superiores a las de crecimiento normal (35m a los cuales la cepa creció
optimizando su tolerancia a (45 m

ù
V à à
V
2V mon el o jetivo de estudiar las condiciones para un adecuado crecimiento de la Y V

, se diseñó un experimento de tipo ioreactor productor de iomasa usando
como parámetro principal la influencia de la temperatura y sustrato a fermentar en el
crecimiento micro ianos
2V En nuestro proyecto se cumplió con el o jetivo de producción de iomasa
compro ando que esta es una vía facti le para los procesos industriales y una
alternativa para la reducción de las impurezas químicas que se pueden crear en
procesos en los que se utilice la síntesis organica
2V ×ara compro ar la termoresistencia de las cepas aisladas se seleccionó, de la caja con
mejor y mayor crecimiento, una colonia apropiada la cual fue sometida a una
temperatura de 4°m (superior a la T de crecimiento, o servándose crecimiento de
esta lo cual afirma la hipótesis de termotolerancia
V
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V  à
V
.V http://www. iologia.edu.ar/microind/Seleccion,20
antenimiento...VVV
2.V http://micro iologos. logspot.com/200_05_0_archive.html
3.V http://repositorium.sdum.uminho.pt/ itstream/
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4.V La caña de azúcar como materia prima para la producción de Alcohol Autor:
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V 
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V
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