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Institut Pasteur d’Algérie

PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION TECHNIQUES
MICROBIOLOGIQUES
K.RAHAL

A.BENSLIMANI

Edition Pirates
EDITIONS PIRATES

PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION : TECHNIQUES
MICROBIOLOGIQUES
1
Benslimani A. (EHS Dr Maouche).
Rahal K. (I.P.A)
BACTERIOLOGIE

HEMOBIOLOGIE
MYCOLOGIE

BACTERIOLOGIE
VIROLOGIE

PARASITOLOGIE
IMMUNOLOGIE
LES MANUELS DE BIOLOGIE
BIOLOGIE CLINIQUE
MOLECULAIRE
BIOCHIMIE
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

PRELEVEMENTS
PRELEVEMENTS
GENITAUX
COLLECTION : TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES
Benslimani A. (EHS Dr Maouche).
Rahal K. (I.P.A)

3
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

I-Sommaire
Préface P13

Principales abréviations P14

Introduction 15

Chapitre I-Généralités : 16

A-rappel anatomique et physiologique de l’appareil génital : 16

B-manifestations cliniques et agents microbiens : 19

1-Agents d’infections génitales chez l’adulte : 19

2-Agents d’infections génitales chez l’enfant : 25

C-épidémiologie microbienne des MST et infections génitales en Algérie 26

1-Chez l’homme : 26

2-Chez la femme : 29

3-Chez l’enfant : 33

Chapitre II- Techniques de prélèvements génitaux : 35

A-Préliminaires : 35

B-Technique de prélèvement : 37

I-Les écoulements génitaux : 37

1-Chez l’homme : 37

1-1-Le prélèvement urétral : 37

1-2-Le prélèvement pour spermoculture : 37

1-3-Urines et sécrétions prostatiques : 38

2-Chez la femme : 39

2-1-Prélèvements cervico-vaginaux : (7.10) 39

2-2-Prélèvement vulvaire 39

2-3-prélèvement à l’orifice de la glande de Bartholin (7.9) : 40

2-4-prélèvement du haut appareil génital : 40

2-5-prélèvement du stérilet : 40

3-Chez l’enfant 41

II-Les ulcérations et chancres génitaux : 42

1-Pour rechercher Treponema pallidum : 42

4
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Pour rechercher Haemophilus influanzae 42

3-Pour rechercher les corps de Donovan : 42

4-Pour rechercher l’herpès virus : 43

III-les autres prélèvements : 44

1-prélèvements complémentaires : 44

2-Ponction d’adénopathie satellite : 45

3-Les autres manifestations d’infection génitale : 45

C-Conservation et transport : 46

1-Neisseria gonorrhoeae : 46

2-Chlamydia trachomatis : 46

3-Mycoplasmes génitaux : 46

4-Trichomonas vaginalis et levure : 46

5-Haemophilus ducreyi : 46

Chapitre III-Analyse microbiologique de prélèvements génitaux 47

A-Ecoulements génitaux 47

I-Chez l’homme : 47

1-Prélèvement urétral : 47

1-1-Examens directs : 47

1-2-Cultures et techniques spécifiques : 47

1-2-1-Neisseria gonorrhoeae : 47

1-2-2-Germes banals : 48

1-2-3-Mycoplasmes génitaux : 49

1-2-3-1-La culture des Mycoplasmes par technique classique : 50

1-2-3-2 : La culture de Mycoplasmes par galerie Mycoplasma DUO (Sanofi Diagnostic Pasteur) : 51

1-2-4-Chlamydia trachomatis : 52

1-2-4-1-Recherche de chlamydia par IFD sur frottis de prelevement : 52

1-2-4-2- Recherche de Chamydia par culture : 54

1-2-4-3-Recherche de Chlamydia trachomatis par technique immuno-enzymatique : 57

2- Spermoculture : 58

2-1-Examens directs : 58

5
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
2-2-culture 58

3-Secrétions prostatiques 59

3-1-Examens directs : 59

3-2-Cultures 59

4-Orchi-épididymite : 59

5-Les sites extra-génitaux complémentaires : 60

5-1-Recherche de gonocoque dans les sites extra-génitaux : 60

5-2-Recherche de chlamydia trachomatis au niveau d’un frottis conjonctival par coloration Giemsa : 60

5-3-Ponctions d’adénopathies satellites : 60

II-Chez la femme : 62

1-Prélèvements cervico-vaginaux : 62

1-1-Généralités : 62

1-2-Etat frais et colorations simples (gram et bleu) : 64

1-3-Culture 66

2-Prélèvements vulvaires : 68

3-Prélèvement à l’orifice de la glande de Bartholin : 68

4-prélèvement du haut appareil génital chez la femme 69

4-1-prélèvement endo-utérins : 69

4-2-Prélèvement sous cœlioscopie ou pus chirurgicaux : 69

4-3-Recherche d’une tuberculose génitale : 70

B-Ulcérations et chancres génitaux : 71

I-Chancre syphilitique : 71

1-Examen au microscope à fond noir : 71

Le matériel : 71

Observation de l’échantillon : 71

Interprétation : 72

Les causes en seraient : 72

2-Examen par immunofluorescence directe : 72

3-Méthode de coloration (voir annexe B) : 72

II-Chancre Mou : 73

6
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
1-Examens directs : 73

2-Milieux de culture : 73

III-Donovanose : 74

1-Examens directs 74

2-Diagnostic bactériologique 74

IV-Ulcérations herpétiques : 75

1-Diagnostic par IFD : 75

Equipements et réactifs : 75

Mode opératoire : 75

Lecture : 75

2- Diagnostic par immuno-peroxydase : 75

3-Diagnostic par ELISA classique : 76

4-Diagnostic après culture 76

Lignées cellulaires utilisées : 76

Réactifs : 76

Mode opératoire : 76

Lecture 76

Typage des isolements d’HSV : 76

C- Autres manifestations d’infection génitale : 77

I-papillomes, condylomes et autres infections génitales à HPV : 77

II-Dermatose de la sphère génitale : 77

D-tests de diagnostic rapide : 78

I-frottis de pus urétral chez l’homme, coloré au gram : 78

II-détection des antigènes gonococciques par technique immuno-enzymatique de type ELISA : 78

III-confirmation immunologique d’une culture de N.gonorrhoeae sur gélose sélective d’isolement : 78

IV-le diagnostic de vaginose bactérienne à Gardnerella vaginalis : 78

V-Diagnostic d’une trichomonase vaginalis : 79

VI-Diagnostic d’une mycose vaginale : 79

VII-Détection des antigènes de chlamydia trachomatis 79

VIII-détection de cellules d’une lésion infectée par l’HSV : 80

7
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre IV : LECTURE ET DISCUSSION 80

A-Ecoulements génitaux : 80

I-Chez l’homme : 80

1-L’examen direct : 80

2-La culture 80

3-Si l’urétrite n’est pas gonococcique : 80

4-En cas d’urétrite chronique : 80

5-Pour trancher entre le diagnostic d’urétrite gonococcique et celui de prostatite : 80

6-La spermoculture : 82

II-Chez la femme : 83

2-1-L’agent isolé est un pathogène strict : 83

2-2-L’agent isolé est un pathogène opportuniste. 83

2-3-l’agent isolé est un commensal de la flore vaginale : 84

2-4-la place des anaérobies stricts : 85

2-5-Leucorrhées non infectieuses : 85

B-ulcérations et chancres génitaux dans les 2 sexes : 86

Chapitre V : Tests d’identification microbienne : 87

A-Neisseria gonorrhoeae 87

B-Gardnerella vaginalis : 87

C-Streptococcus agalactiae et listeria monocytogenes : 88

D-Candida Albicans : 88

E-Haemophilus ducreyi : 88

F-Mobiluncus : 89

Chapitre VI : Tests de sensibilité aux antimicrobiens 90

A-Cas des Mycoplasmes : 90

I-principe : 90

II-Mode opératoire : 90

1-Les antibiotiques : 91

2-Standardisation de l’inoculum 92

8
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Distribution de l’inoculum : 92

III-Lecture : 92

B-Cas d’Haemophilus ducreyi 93

I-Antibiotiques à tester : 93

II-Inoculum : 93

III-Mode opératoire et lecture : 93

Chapitre VII-Les sérologies 94

A-La sérologie syphilitique : 94

I-Principe : 94

1-des réactions non tréponèmiques: 94

2-des réactions tréponèmiques : 94

II-techniques : 95

1-la technique VDRL : 95

1-1-Matériel et réactifs : 95

1-2-Mode opératoire : 95

1ère Etape : Réaction qualitative : 95

2ème étape : réaction quantitative : 95

1-3-Lecture et interprétation : 95

2-Technique RPR : 96

2-1-Matériel et réactifs : 96

2-2-Mode opératoire 96

Test qualitatif : 96

Test qualitatif : 96

3-le TPHA : 98

3-1-Matériel et réactifs : 98

3-2-Mode opératoire : 98

Réaction qualitative : 98

Témoin négatif : 99

Témoin Positif : 99

La lecture : 100

Interprétation : 100

9
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
Réaction quantitative : 101

Lecture : 101

4-FTA-Abs ou réaction d’Immunofluorescence Absorbée : 102

4-1-Matériel et réactif : 102

4-2-Réactifs : 102

4-3-Mode opératoire : 102

4-4-Interprétation : 103

5-Technique détectant les IgM : 104

5-1-FTA-Abs IgM 19 S : 104

5-2-Méthode d’hémadsorption des IgM en phase solide : 104

5-3-Réaction de capture immuno-enzymatique des IgM (merciaDiagnostics) : 104

III-Interprétation des tests sérologiques : (22) 105

5-Technique détectant les IgM : 105

5-1-FTA-Abs IgM 19 S : 105

5-2-Méthode d’hémadsorption des IgM en phase solide : 105

5-3-Réaction de capture immuno-enzymatique des IgM (merciaDiagnostics) : 105

III-Interprétation des tests sérologiques : (22) 105

B-Sérologie de Chlamydia trachomatis : 106

1-Par IFI : 106

1-1-principe : 106

1-2-Equipements et réactifs : 106

1-3-Technique : 106

1-4-Lecture et interprétation : 107

1-5-Facteurs interférant sur la sensibilité et la spécificité de la technique : 107

2-Par immunoperoxydase : IPAZYMEChlamydia : 108

2-1-Principe : 108

2-2-Equipements et réactifs : 108

2-3-Technique : 108

2-4-Lecture et interprétation : 108

2-5-facteurs interférant sur la sensibilité et la spécificité de la technique : 109

10
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE
3-Par méthode ELISA : 110

3-1-Principe : 110

3-2-Mode opératoire : 110

3-3-Lecture et interprétation : 110

3-4-Sensibilité et spécificité : 110

C-Sérologie du virus herpétique : 111

1-Par IFI : 111

2-Autres techniques : 111

Chapitre VIII-Limites des techniques utilisées-Nouvelles techniques de diagnostic 112

Conclusion 115

Bibliographie 116

Annexe A 120

Annexe B 134

11
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

12
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Préface :
Nous, groupe de microbiologistes professionnels avons décidé de rédiger plusieurs fascicules
de techniques microbiologiques afin de faciliter le travail :

 Des microbiologistes en poste dans les laboratoires publics et privés.


 Des résidents en biologie ;
 Des techniciens biologistes et microbiologistes.
 Des stagiaires qui se trouvent dans les laboratoires de microbiologie.

Dans chaque fascicule de 50 à 100 pages, un seul sujet sera traité ; chaque fascicule sera mis
au fur et à mesure de sa parution, a la disposition des biologistes.

Ces techniques seront adaptées au contexte algérien, cependant nous traiterons également des
techniques appliqués dans les pays développés. Chacun, selon ses moyens, pourra ou non les
mettre en application.

Ces techniques devront être améliorées et par conséquent, seront réactualisées cinq ans après
leur parution

Les différents fascicules traiteront des sujets suivant :

 Etude cytobactériologique et biochimique du liquide céphalo-rachidien.


 Prélèvements génitaux.
 Prélèvements du tractus respiratoire ;
 Prélèvements oculaires, ORL, buccaux ;
 Examen cytobactériologique des urines ;
 Hémocultures ;
 Coprocultures ;
 Epanchements et sérosités ;
 Suppurations superficielles et profondes ;
 Sérologie bactérienne ;
 Technique d’étude de l’activité des antibiotiques in vitro et in vivo ;
 Hygiène hospitalière.
 Techniques de conservation des souches bactériennes ;
 Préparation et contrôle des milieux de culture ;
 Diagnostic bactériologique et sérologique de la diphtérie.

D’autres techniques pourront être rajoutées par la suite.

13
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Principales abréviations

Ac Anticorps
BCP Gélose au bromocrésol Pourpre
CMV Cytomégalovirus
CMP Chloramphénicol
CE Corps élémentaires
CR Corps réticulés
E.C.P Effet cytopathogéne
FR Facteur rhumatoïde
GN Gélose nutritive
GSF Gélose au sang frais
GSC Gélose au sang cuit
GC Gélose GC
GR Globule rouge
HIV Human immunodeficiency Virus.
HSV Herpes virus
HPV Papillomavirus
HCA Hôpital central de l’armée
IFD Immunofluorescence directe
LGV Lymphogranulomatose vénérienne.
LPS Lipopolysacharides.
MGG May Grunwald Giemsa
MH Mueller-Hinton
NR Nitrate –Réductase.
Nal Acide nalidixique
ONPG Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside
PVX Polyvitex
PAL Phosphatase Alcaline
P.U. Prélèvement urétral
PV Prélèvement vaginal
PN Polynucléaires
P20 et P100 Micropipettes de 20 ul et 100 ul
RM Test au rouge de méthyle
SVF Sérum de veau fœtal
TSA Trypto-caséine Soja Agar
TSB Trypto-caséine Soja Broth
TGY Tryptose glucose yeast
UNG Urétrite non gonococcique
VRS Virus respiratoire syncitial
VP Réaction de Voges Proskauer

14
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Introduction

F
ace à une infection génitale, le microbiologiques avec, le plus souvent des
médecin est orienté vers tel ou tel examens sérologiques.
agent étiologique par des
manifestations cliniques plus ou moins En effet, la diversité et l’intrication des
évocatrices. manifestations cliniques d’infection
Ainsi, la classique goutte urétrale matinale génitale, les imprévisibles associations de
caractérise l’infection gonococcique plusieurs agents pathogènes ( car « un
masculine. germe peut en cacher un autre ») ainsi que
De même des leucorrhées blanchâtres et le risque de résistance bactérienne
caillebottées font penser à priori à une plasmidique, font de ce type d’analyse une
mycose vaginale, alors qu’un écoulement étape primordiale dans la prise en charge
spumeux et verdâtre évoque plutôt une des infections génitales.
trichomonase. Par ailleurs, la majorité de ces infections
D’autres motifs de consultation, tel une ou sont des maladies sexuellement
plusieurs ulcérations génitales, des transmissibles qui font payer un lourd
condylomes ou encore une dermatose de la tribut à la société et dont le diagnostic
sphère génitale, orientent vers un certain étiologique correct passe obligatoirement
nombre d’agents étiologiques. par une analyse microbiologique
exhaustive.
Le médecin s’appui alors sur
l’interrogatoire et l’examen clinique Enfin, l’exploration des cas de stérilité, les
minutieux du patient, comme première infections génitales chez l’enfant et la
étape du diagnostic et point de départ du surveillance d’une grossesse sont des
choix thérapeutique. indications fréquentes de ce type d’analyse
biologique.
En effet, les infections génitales font
généralement l’objet d’une prescription de Ce manuel retrace les étapes du diagnostic
première intention, basée sur des de laboratoire des infections génitales.
algorithmes construits pour orienter le Le diagnostic des maladies sexuellement
diagnostic et le traitement des MST (en transmissibles sans manifestations
majorité, avec localisation génitale). cliniques d’infection génitale (SIDA,
Cependant, il reste souhaitable de faire Hépatites…) n’y sera pas abordé.
précéder le traitement antibiotique, de
prélèvements génitaux pour analyse

15
Chapitre I-Généralités :
A-rappel anatomique et physiologique de
l’appareil génital :

C
hez l’homme, l’appareil génital se  Exocol
confond avec le bas appareil urinaire.  Culs de sac antérieur, latéraux et
En effet, l’urètre de l’homme est long, postérieur.
comprend une portion antérieure ou distale qui  Cavité vaginale
traverse le corps spongieux et une portion  Clitoris
postérieure (traverse la prostate) et l’uretère  Petites lèvres
membraneux.  Grandes lèvres
Les secrétions prostatiques et le liquide La flore vaginale commensale varie en
séminal se déversent dans le canal urétral. fonction de l’âge, de l’état immunitaire, de la
Alors que les vésicules séminales, le canal période du cycle ovarien, de la prise d’anti-
déférent, l’épididyme et les testicules sont infectieux par voie locale et générale.
stériles, la flore génitale se localise au niveau Chez la femme en période d’activité sexuelle,
du gland et de l’urètre distal. la flore vaginale comprend bactéries Aéro-
Il s’agit d’une flore commensale poly anaérobies et autant de bactéries anaérobies
microbienne voisine des flores entériques et strictes par gramme de sécrétion vaginale.(12)
cutanée.(12-20). Certaines d’entre elles sont des saprophytes
Chez la femme : l’appareil génital est sans potentiel pathogène, d’autre sont
totalement distinct de l’appareil urinaire. pathogènes opportunistes.

Il comprend 2 étages : La flore endogène est composée en majorité de


lactobacillus acidophilus (flore de Doderlein) ,
1-L’étage supérieur, stérile est représenté par micro-organisme qui maintient grâce à son
métabolisme du glycogène un pH vaginal acide
 Ovaires et trompes de Fallope. (environ 4-4.5).
 Cavité utérine.
 Endocol. L’acidité du milieu vaginal et l’imprégnation
ostrogénique de la muqueuse entretiennent la
2-L’étage inferieur : prédominance de la flore de Doderlein.

Contaminé par une flore microbienne


abondante et variée, comprend :
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 1 : les agents de la flore génitale (15)

Flore urétral masculine Flore vaginale pendant la vie sexuelle active

Sans potentiel pathogène :


 Staphylococcus coagulase négative
 Entérocoques 1-flore aérobie :
 Neisseria saprophytes
 Entérobactéries (E coli)  Lactobacillus acidophilus
 Corynebacterium sp  Staphylococcus epidermidis
 Lactobacilles  Streptococcus viridans
 Acinetobacter Baumanii  Corynebacterium sp
 Gardnerella vaginalis  Neisseria saprophytes.
 Anaérobies strictes
 Mycoplasmes 2-flore anaerobie :
 Levures dont C Albicans
 Rarement mycobactéries  Veillonella
 Occasionnellement Staphylococcus  Bifidobacterium
coagulase (+).  Eubacterium

Avec potentiel pathogène

1-Flore aérobie :
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus B
 Streptococcus D
 Entérobactérie
 Pseudomonas aeruginosa
 Gardnerella vaginalis
 C Albicans et d’autres levures
 Mycoplasmes sp
 Listeria monocytogenes

2-Flore anaerobie
 Peptococcus
 Peptostreptococcus
 Bacteroides
 Clostridium perfringens
 Mobiluncus sp
 Prevotella sp
 Actinomyces sp

17
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 2 : Flore vaginale normale (23)

Groupe I : espèces bactériennes dont le portage est habituel : 98 à100 % des flores normales

Bactéries par gram de sécrétions  Lactobacillus sp (Bacille de Doderlein)


 Certaines corynebacteries
 Streptocoques viridans

Groupe II : espèces bactériennes dont le portage est fréquent : 5 à 30 % des flores normales.

Par gramme de sécrétion  Streptocoques du groupe B et D.


 Entérobactéries
 Anaérobies (Clostridium sp, Bacteroides,
peptococcus et peptostreptococcus,
fusobacterium, veillonalla).
 Staphylocoques coagulase + et-
 Gardnerella vaginalis et certaines
corynebacteries
 Candida sp
 Mycoplasmes

Groupe II : espèces bactériennes dont le portage est plus exceptionnel : des


flores normales.

Par gramme de sécrétion  Pneumocoques


 Haemophilus sp
 Streptocoques du groupe A
 méningocoques

Chez l’enfant de sexe masculin : non circoncis, Sur le plan physiologique, l’épithélium vaginal
on peut parfois retrouver une malformation est constitué d’une seule couche de cellules
telle un phimosis à l’origine d’infections uro- basales car non stimulé par les œstrogènes.
génitales
Privé de glycogène, son pH est alcalin ce qui le
Chez la petite fille : les organes génitaux rend favorable à l’implantation d’une flore
présentent des particularités anatomiques et mixte non spécifique :
physiologiques qui protègent mal contre le
développement d’infections.  Staphylococcus coagulase (-)
 Streptococcus alpha et non
Sur le plan anatomique on note la proximité de hémolytiques
l’anus par rapport à l’orifice génital, la béance  Entérobactéries
de l’orifice hyméneal, l’orientation verticale de  Corynebacterium sp
la vulve et le non développement des petites  Anaérobies strictes.
lèvres.

18
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-manifestations cliniques et agents microbiens :


1-Agents d’infections génitales chez l’adulte :
Le nombre de germes pouvant causer des Il y a progressivement remplacement de la
infections du tractus génital est élevé. flore habituelle du vagin par une flore mono
bactérienne envahissante dont la transmission
Ces agents sont très divers et font partie de 4 sexuelle devient même parfois
grands groupes de micro-organismes : possible.(15.28).
bactéries, virus, parasites et levures.
Chez l’homme, les infections génitales sont en
Leur manifestation clinique principale est général dues à des agents exogènes transmis
l’écoulement génital. par voie sexuelle. A noter cependant que
l’existence de pratiques homosexuelles doit
Chez la femme, la majorité des infections du
faire rechercher des infections à germes du
bas appareil génital sont dues à des agents
exogènes. Nombre d’entre eux sont acquis au tractus gastro-intestinal.
cours des rapports sexuels. A coté de ces agents d’écoulements génitaux,
Certain peuvent l’être par d’autres voies on distingue chez la femme comme chez
(curetage, curage, irritation, corps l’homme des micro organismes responsables
étrangers…). de manifestations a type d’ulcération génitales
(treponema pallidum, Haemophilus ducreyi)
Les infections génitales peuvent cependant être ou de condylomes génitaux.(papillomavirus).
causées par des agents de la flore endogène.
Le cas de la femme enceinte ou en travail
Ainsi les vulvo-vaginites bactériennes seraient mérite en motion particulière.
dues à la prolifération d’une entérobactérie (E
coli, proteus mirabilis.), d’un streptocoque En effet certains agents d’infection génitale
(groupe D ou B) ou encore d’un staphylocoque sont transmissibles à l’enfant avant ou pendant
et succédant en général à une antibiothérapie à la naissance et à l’origine de graves
pathologies infectieuses néonatales
large spectre et à l’utilisation régulière de
produits qui éliminent la flore de Doderlein. (méningites, pneumopathies, malformations).
(Spermicides). Enfin, des associations doubles voir triples,
Elles sont également l’apanage des patientes à d’agents infectieux, ne sont pas rares dans les
muqueuse génitale atrophique, fragilisée suite infections génitales sexuellement
à un déficit en œstrogènes (femmes transmissibles : gonocoques, chlamydia,
ménopausées et jeunes filles). trichomonas ainsi que les agents d’ulcérations
génitales tels treponema et Haemophilus
La disparition des lactobacilles est suivie par le ducreyi, peuvent très diversement associés : en
développement excessif de certaines bactéries matière de MST, un germe peut en cacher un
de la flore dont les propriétés invasives autre.
peuvent alors s’exprimer.

19
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 3 : Agents microbiens incriminés dans les maladies sexuellement transmissibles :

Agent étiologique Manifestations génitales Manifestations extra-génitales


Neisseria gonorrhoeae  Cervicite, urétrite  Rectite, pharyngite, conjonctivite
 Vaginite pré pubertaire  Périhepatite
 Epididymite, prostatite  Gonococcie généralisée (arthrite, dermatite,
 Bartholinite, endométrite tenosynovite)
 Salpingite. Chorioamniotite, stérilité.

Chlamydia trachomatis  Cervicite, urétrite  Rectite, conjonctivite


 Vaginite pré pubertaire  Trachome, perihépatite
 Epididymite, bartholinite  Stérilité, pneumopathie et otite moyenne du
 Endométrite, salpingite. nourrisson.
 Syndrome de Fiessenger-Leroy-Reiter.

Chlamydia trachomatis sérovar L1,  Lymphogranulomatose


L2, L3 vénérienne

Treponema pallidum  Syphilis  syphilis congénital

Haemophilus ducreyi  Chancre mou

Calymmatobacterium granulomatis  Donovanose

Gardnerella vaginalis  vaginose


Streptococcus agalactiae  Infections néonatales
 Méningites néonatales

Shigella spp, Salmonella spp,  Infections génitales


Campylobacter

Virus de l’herpes humain  Herpes génital  Herpes bucco-labial


 Herpes néonatal
 Méningite, rectite
Cytomégalovirus  Infections congénitales

Papillomavirus humain  Condylome acuminé


 Cancer du col utérin
VIH  SIDA et syndrome apparenté

VHB  Hépatite B

Trichomonas vaginalis  Vaginite urétrite

Candida Albicans  Vulvo-vaginite


 Balanoposthite

Mycoplasma hominis  Urétro-prostatite


 Vaginite, cervicite
 Syndrome inflammatoire pelvien
 Fièvre du post abortum

Ureplasma urealyticum  Urétrite non gonococcique Calculs urinaires-pyélonéphrite-stérilité Chorioamniotite-


 Urétro-prostatite avortements à répétition-nouveau né de faible poids de
 Epididymite et syndrome urétral naissance

20
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 4 : Répartition des agents d’infections génitales en fonction de leur mode de


transmission (13-16-23)

Modes de transmission Agents incriminés


Agents à transmission sexuelle certaine ou probable
Bactéries
Neisseria gonorrhoeae-chlamydia trachomatis
Ureaplasma urealyticum-Mycoplasma hominis et genitalum.
Gardnerella vaginalis-calymmatobacterium granulomatis
Treponema pallidum Haemophilus ducreyi

Levure :
Candida Albicans et autres levures

Parasites :
Trichomonas vaginalis

Virus :
HSV 2 et 1 – adénovirus –coxsackivirus
HPV des voies génitales : condylome accuminata type 16-11
HPV associé au carcinome cervical (surtout les types 16 et 18 , de même que de nombreux autres)

Certains agents d’infections génitales sont transmissibles de la mère à l’enfant


Instrumentation (curetage, curage) ; T.pallidum, virus HSV ;
Par contact avec la filière génitale N.gonorrhoeae, C trachomatis, HSV, HPV
Avant et pendant la naissance Streptococcus B, E coli et L monocytogenes

Agents transmis par d’autres voies


Instrumentation (curetage, curage) ; Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogènes
Et autres germes d’infections cutanées

Irritation vulvo-vaginale. Idem


Corps étrangers (stérilet) Actinomyces sp

Agents à transmission homosexuelle


Les habitudes et pratiques sexuelles conditionnent les sites potentiels d’infection
Ainsi, le pharynx et le région ano-rectale sont des sites du corps qui doivent faire l’objet d’une recherche d’agents de MST en cas de
pratique homosexuelle.
Dans ces cas, les germes du tractus gastro-intestinal peuvent être incriminés dans les MST avec pour certains d’entre eux des
manifestations génitales : Giardia lambia, entamoeba histolytica et cryptosporidium spp, de même que les pathogènes fécaux tels :
Salmonella, shigella, Campylobacter, microsporidium et des virus tels : CMV, HSV

21
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 5 : Agents d’infection génitales chez l’homme (17,20,33).

Type d’infections Symptômes Germes incriminés


urétrite aigue subaigüe ou  Ecoulement urétral purulent ou clair  N gonorrhoeae
chronique  Brulures mictionnelles  Chlamydia trachomatis
 Ureaplasma urealyticum
 Trichomonas vaginalis
 Herpesvirus (ulcérations intracanalaires)
 agents commensaux de l’urètre (urétrite subaigüe ou
chronique)

orchi-épididymite douleurs, fievre, écoulement, inflammation de


l’épididyme.  N gonorrhoeae
 Chlamydia trachomatis
 Anaérobies strictes
 Chez l’homosexuel : germes entériques.
 Evolution subaigüe : penser au BK.

Prostatite aigue, subaigüe ou aigue : douleur, fievre, dysurie aigue :


chronique chronique : infection urinaire récidivante  N gonorrhoeae
 C.trachomatis
Subaigüe ou chronique
 E coli- Bactéries entériques.

orchite aigue douleurs intenses, fievre, oedéme virus des oreillons

Balanite balano-posthite Erythème, prurit Candida Albicans

Chancre génital ou ulcération chancre localisé au niveau de la muqueuse  Tréponema pallidum


génitale avec ou sans adénopathie inguinale  Haemophilus ducreyi
associée fistulisée ou non.  C Trachomatis L1, L2, L3.
 calymmatobacterium granulomatis

vésicules génitales avec localisation à la muqueuse génitale parfois intra  HSV 1 et 2


ulcérations canalaire
lésions condylomateuses localisation au niveau du périnée et sur les  HPV surtout types 6.11 et 6
organes génitaux.

dermatoses des organes signes de grattage +++  Phtirius pubis


génitaux externes  Sarcoptes Scabei

22
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 6 : Agents d’infections génitales chez la femme (28,33) :

Types d’infections Symptômes Germes incriminés


Vulvite Erythème vulvaire, prurit vulvaire, écoulement germes banals (staph, strepto, haemophilus).
purulent levures
Mycoplasmes génitaux
Chlamydia trachomatis
N.gonorrhoeae
G vaginalis
Vers d’oxyure

Bartholinite Œdème et écoulement purulent de l’orifice de la N.gonorrhoeae


glande de Bartholin, douleurs, fièvre. H influanzae
Bactéries pyogènes
bactéries anaérobies strictes

Vaginite Ecoulement vaginal abondant, anormal Candida Albicans


Erythème vulvaire Trichomonas vaginalis
Brulures et / ou prurit vulvo-vaginal G vaginalis
Dysurie, brûlures mictionnelles. bactéries anaérobies strictes
Mycoplasma hominis
Ureaplasma urealyticum

Cervicite Ecoulement plus ou moins discret N.gonorrhoeae


douleurs pelviennes Chlamydia trachomatis
autres signes peu spécifiques Mycoplasma hominis
inflammation du col utérin Mycoplasma genitalium
complication : salpingite, péri hépatite, stérilité.

Inflammation pelvienne Endométrite N.gonorrhoeae et /ou C trachomatis (dissémination


Salpingite rétrograde).
Abcès tubaire
Abcès ovarien Anaérobies, bacilles gram négatif, streptococci. mycoplasmes
Peripéritonite (risque de GEU et de stérilité) après accouchement, dilatation du col, avortement)
infection sur stérilet et actinomycose utérine
Actinomyces : infection sur stérilet

Infection Post chirurgie Apres Hystérectomie Par exemple Cocci gram + aérobies
gynécologique  Cellulite pelvienne Bacilles Gram –
 Abcès pelvien Anaérobies (Peptostreptococcus)
Mycoplasmes génitaux.

Chorioamniotite Peut se manifester par une prématurité ou encore Bactéries anaérobies.


un tableau d’insuffisance respiratoire du nouveau Mycoplasmes génitaux.
né Streptococcus du groupe B.
E coli
Chlamydia trachomatis

Chancre génitale o ulcération Chancre localisé à la vulve avec ou sans Treponema pallidum
adénopathie inguinale fistulisée ou non. Haemophilus ducreyi
Chlamydia trachomatis L1.L2.L3.
Calymmatobacterium granulomatis

Vésicules en bouquets avec ou Localisation à la muqueuse génitale ou dans HSV 1 et 2


sans ulcérations l’urètre, brulures mictionnelles.

Condylome génitaux localisation à la vulve et au niveau du col signe de HPV : les types les plus fréquents sont 6-11-16.
exophytiques ou plats colpite et de cervicite à minima.

Dermatose des organes génitaux Signes de grattage ++++ Phtirius pubis et Sarcoptes scabei

23
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 7 : Les agents microbiens transmis de la mère à l’enfant

Stade d’infection Voie de transmission Agents incriminés


Bactéries
Listeria monocytogenes
Transplacentaire Treponema pallidum

Prénatal Virus
CMV, Rougeole, Parvovirus B19 et entérovirus

Parasites :
Toxoplasma gondii

Bactéries
 streptocoque B
 E coli
Ascendante  listeria monocytogenes
 C trachomatis
 Mycoplasmes génitaux

Virus
 CMV, HSV

Bactéries
Streptocoque B
Natale Au passage de la filière E coli
génitale C trachomatis
Listeria monocytogenes
N.gonorrhoeae

Virus
CMV, HSV, HPV, entérovirus, HBV, HIV

Post-natale Toutes les voies précédentes Tous les agents précédemment cités avec, en plus des
ou à partir de l’environnement agents de l’environnement y compris les BGN et les virus
tel VRS.

24
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Agents d’infections génitales chez l’enfant :


Le petit garçon peut présenter une infection préputiale ou une urétrite :

Les agents étiologiques habituels en sont :

 Candida Albicans
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus Beta-hémolytique et autres germes pyogènes ;
 Neisseria gonorrhoeae (abus sexuels, perversion dans la tranche 12-15 ans).

La fillette : les vulvites de la petite fille représentent une des préoccupation des pédiatres car elles son
souvent recidivantes.les agents incriminés sont :

1-Soit des agents à pouvoir pathogène connu, bactéries ou levures :

 Streptococcus pyogènes
 Streptococcus pneumoniae
 Haemophilus influanzae
 Neisseria gonorrhoeae qui fait évoquer l’abus sexuel
 Candida Albicans
 Autres : trichomonas vaginalis, chlamydia trachomatis (abus sexuels).

2-soit des agents commensaux ou saprophytes de la flore périnéale, retrouvé en culture mixte, souvent
associés à une oxyurose ou à un corps étranger intra-vaginal :

 Staphylococcus aureus
 E coli
 Klebsiella sp
 Proteus sp
 Anaérobies stricts

25
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

C-épidémiologie microbienne des MST et


infections génitales en Algérie
La fréquence d’isolement des agents d’infections génitales a été évaluée par de nombreuses
publications internationales.

En Algérie, quelques travaux rapportent les taux de prévalence des agents incriminés dans les urétrites
chez l’homme et les leucorrhées pathologiques chez la femme et ce, au cours de la dernière décade.

1-Chez l’homme :
dans les urétrites évaluées en milieu militaire entre 1990 et 1993 (NAIM thèse 1995) N gonorrhoeae
vient en 1ère position avec une prévalence de 17.47% à l’HCA et de 33.78 % à l’hôpital militaire de
Tindouf.

Il est suivi par C trachomatis pour lequel est rapportée une prévalence de 16.50 % à l’HCA et de 14.86
% à Tindouf.

Les autres agents d’urétrite masculine isolés au cours de ce travail sont rapportés dans le tableau 8 :

Tableau 8 : prévalence des germes pathogènes retrouvés dans les prélèvements urétraux
(M.NAIM ,1995) :

HCA Hôpital de Tindouf

Staphylococcus coagulase négative 11.65 % 2.70 %

streptococcus non groupable 8.73 0

Candida Albicans 4.85 9.45

Ureaplasma urealyticum 4.85 6.75

Trichomonas vaginalis 0.97 1.35

Gardnerella vaginalis 0.77 0

Haemophilus influanzae 0.38 0

Escherichia coli 0.38 0

HSV1 0.38 0

Nombre de prélèvements urétraux positifs 345 51

Total des prélèvements urétraux 515 74

26
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Les associations d’agents pathogènes dans les urétrites ne sont pas rares. Ainsi le professeur NAIM
rapporte dans sa thèse 36 cas (Tableau 9).

Tableau 9 : Associations microbiennes dans les prélèvements urétraux positifs (NAIM)

Associations HCA Hôpital de Tindouf

Chlamydia + gonocoque 2.32 % 3.95 %


Chlamydia + U.urealyticum 1.42 % 5.8 %
Chlamydia + C.Albicans 2.32 % 5.8 %
Gonocoque+ U.urealyticum 1.17 % 0
Gonocoque+ C.Albicans 0.29 % 3.95 %
TOTAL 26 cas sur 345 P. urétraux 10 cas sur 51 P. urétraux
positifs (7.5 %) positifs (19.6 %)

Pour ce qui concerne les associations « Urétrite-autre MST », le professeur NAIM rapporte 10 cas
parmi les échantillons étudiés (Tableau 10).

Tableau 10 : association urétrite –autre MST dans les PU positifs (NAIM) :

Associations HCA Hôpital de Tindouf

Chlamydia + chancre mou 0.58 % 0

chlamydia + syphilis 1.14 % 0

gonocoque + chancre mou 0.58 % 0


gonocoque + EBV 0 1.96 %
TOTAL 9 cas sur 345 PU (+) 1 cas sur 51 PU (+)

Toujours dans la population militaire, le chancre mou représenterait l’étiologie la plus fréquente des
ulcérations génitales. Ainsi ,80 % des cas diagnostiqués à l’HCA entre 1989 et 1998 seraient dus à cet
agent. Cette observation est corroborée par une étude plus ancienne réalisée dans la région de Tlemcen
sur 3 ans (1988-1991) et qui retrouve 76 % de cas de chancre mou (8).

Les données rapportées par NAIM concernent une population masculine à risque de MST, en
l’occurrence la population militaire.

Même si les chiffres obtenus ne reflètent pas fidèlement ce qui se passe dans la population masculine
algérienne, ils ont un intérêt certain dans l’évaluation de la place respective des agents de MST en
Algérie.

27
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

A noter que dans une récente publication (19), Naim et coll classent en pourcentages les étiologies des
urétrites en Algérie comme suit.

 Gonocoque : 25 %
 Chlamydia trachomatis : 17 %
 Mycoplasme sp : 7%
 Autres : 18 %.
 Indéterminée : 33 %

L’enquête prospective du Dr BELABED (thèse 1999) vient apporte un complément au travail du Pr.
Naim en évaluant la place des mycoplasmes dans les prélèvements génitaux chez l’homme.

Elle montre que les taux d’isolement des mycoplasmes génitaux dans les prélèvements masculins
(urètre, sperme) ne sont pas négligeables, avec un pourcentage plus élevé pour Ureaplasma
urealyticum. (Tableau 11)

Quant aux associations micro-organismes –mycoplasmes, BELABED a noté :

 2 associations bactérie-Mycoplasme sur 186 spermes analysés.


 8 associations bactérie –mycoplasme sur 70 PU analysés.

Tableau N°11 : Mycoplasmes génitaux chez l’homme (K.BELABED 1999) :

Nombre de nombre de Mycoplasma Nombre d’Ureaplasma


prélèvements hominis Urealyticum

Hommes 256 (PU+Sperme) 52 (20.31%) 88 (34.37%)

28
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Chez la femme :
Les études étiologiques prospectives ou rétrospectives concernant notre population féminine sont là
encore limitées.les agents microbiens retrouvés dépendent du type de population recrutée (exposée ou
non aux MST), des sites génitaux ayant fait l’objet de prélèvements (vaginal, cervical, endometrial) et
des techniques mises en œuvre.

Ainsi une étude rétrospective des résultats d’analyses microbiologiques de prélèvements vaginaux
pratiqués durant l’année 1990 à l’hôpital Parnet, a passé en revue des agents microbiens isolés dans
une série de 387 prélèvements effectués chez des femmes consultant pour des symptômes d’infection
génitale (5).

Le taux de positivité était de 31 % et les germes isolés se repartissent entre 50 % de bactéries, 35% de
levures et 15 % de trichomonas vaginalis.

Parmi les 120 PV « positifs »,24 % montraient une double association de germes : 4% à candida-
trichomonas vaginalis, 9% à bactérie-Trichomonas vaginalis, 11 % à candida-bactérie. A noter une
triple association E coli + candida Albicans+Trichomonas vaginalis

Les 196 germes isolés se répartissaient par ordre décroissant de fréquence comme suit :

Candida Albicans 68 Streptococcus de groupe A 1


Trichomonas vaginalis 28 Streptococcus de groupe F 1
E coli 26 Gardnerella vaginalis 1
Streptococcus de groupe B 22 Klebsiella oxytoca 1
Streptococcus de groupe D 18 Enterobacter sp 1
Streptococcus NG 10 candida Krusei 1
Staphylococcus aureus 9 Candida sp 1
Proteus mirabilis 4 Neisseria gonorrhoeae 0
Klebsiella pneumoniae 4
Une autre étude, cette fois prospective, a été réalisée en 1992 (HAREB et AZZAM, résultat non
publiés) sur le même type de population féminine consultant à l’hôpital de Parnet et a concerné 31
patientes.

L’analyse des prélèvements a comporté, en plus des agents bactériens aérobies, une recherche
systématique des bactéries anaérobies strictes. Le taux de positivité a été de 87 %.

Les agents microbiens isolés se répartissent comme suit :

Candida Albicans 6 Trichosporum cutaneum 1


Streptococcus de groupe B 4 E coli 1
candida Krusei 2 Streptococcus de groupe D 1
Saccharomyces cerevicae 2 Klebsiella pneumoniae 1
Actinomyces viscosus 2

29
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Les bactéries anaérobies strictes, au nombre de 21 souches, ont été isolées 11 fois seules ou associées
entre elles et 10 fois associées à l’un des agents précédemment cités.

Ces bactéries anaérobies strictes se repartissent comme suit :

 Propionibacterium acnes : 4
 Lactobacillus jensenii : 3
 Lactobacillus fermentum : 3
 Peptococcus spp : 2
 Streptococcus intermedius : 2
 Bacteroides spp : 1
 Non identifié : 6

Cette 2ème enquête s’est intéressée plus particulièrement aux anaérobies et à leur fréquence
d’isolement dans les prélèvements génitaux féminins.

A souligner que ces agents ont été souvent associés à des leucorrhées verdâtres, abondantes, fétides (4
fois sur 5), au port du stérilet (2 fois sur 3) et à des antécédents d’avortement (1 fois).

Par contre, aucune Gardnerella vaginalis n’a été isolée, ce qui est en contradiction avec les données de
la littérature qui associent fréquemment cette bactérie aux anaérobies stricts.

A travers ces 2 études, on peut apprécier l’importance de candida Albicans comme agent d’infection
génitale chez la femme. De même trichomonas vaginalis est souvent retrouvé.

Quant aux agents commensaux ou saprophytes de la flore vaginale, ce sont surtout les streptocoques,
staphylocoques et entérobactéries qui ont été le plus souvent incriminés.

Les bactéries anaérobies strictes agents de la flore vaginale normale, peuvent se multiplier
anormalement au dépend du reste de la flore si des conditions locales particulière sont présentes (Ex
stérilet).

A noter le très faible taux d’isolement de Gardnerella vaginalis, agent pourtant bien connu de vaginite
non spécifique.

Aucun gonocoque n’a été retrouvé, probablement en raison du type de recrutement des patientes
(population à bas risque de MST).

Enfin, les mycoplasmes génitaux n’ont pas été recherchés.

Nous rapportons également les résultats d’une autre étude microbiologique de prélèvements génitaux,
effectuée au HCA et qui a porté sur 1455 prélèvements positifs (19).

Dans cette enquête, C Albicans est en tête des étiologies avec 39.17% des cas.

Les autres agents isolés se classent loin derrière avec une fréquence d’isolement allant de 13.25% à
0.41 % (voir tableau n°12).

Ici encore, on peut noter que les streptocoques, Trichomonas et les entérobactéries restent les micro-
organismes les plus isolés après C .Albicans.

30
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Mycoplasmes, Chlamydia trachomatis et N gonorrhoeae ont été recherchés mais peu souvent
retrouvés.

Tableau N°12 : Nature et fréquence des germes retrouvés dans les prélèvements génitaux féminins
(Naim et coll, 2000)

Nombre Pourcentage
Candida Albicans 570 39.17
Streptococcus B 193 13.25
E coli 177 12.16
Trichomonas vaginalis 115 7.90
Ureaplasma urealyticum 102 7.01
Klebsiella sp 85 5.84
chlamydia trachomatis 58 3.98
proteus sp 54 3.71
staphylococcus sp 40 2.74
Mycoplasma hominis 22 1.51
Pseudomonas sp 18 1.20
Enterobacter sp 9 0.61
N gonorrhoeae 6 0.41
Acinetobacter sp 6 0.41

La thèse du Dr B ADDAD (1993) a eu pour objectif la détection d’agents réputés sexuellement


transmissibles.

Les autres agents responsables de symptômes de la sphère génitale mais peu ou non connus comme
sexuellement transmis, n’ont pas faits l’objet de recherche.

L’enquête rapporte les agents étiologiques suivants (tableau 13)

Tableau 13 : agents de MST isolés chez la femme Algérienne à Alger, Oran et Mostaganem
(ADDAD ,1993).

Echantillon n= Pourcentage de positivité


Neisseria gonorrhoeae 98 (population carcérale ou prostituée) 17.4 % (17 positifs)

HPV 432 51.6 % (223 positifs)


Chlamydi a trachomatis 1056 27 % (sérologie significative)
(223 positifs)

Syphilis (Sérologie+) 1056 1.5% (16 positifs)


HSV (Sérologie+) 1056 1.5% (16 positifs)
HIV (Sérologie+) 1056 0.5% (6 positifs)

31
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

A noter que, dans cette étude, des associations de MST on été fréquemment retrouvées,
particulièrement chez les femmes à haut risque (prostituées : 36% et incarcérées : 8.4%)

La place des mycoplasmes a été également évaluée par BELABBED dans un échantillon représentatif
de la population féminine algérienne (Tableau 14)

Tableau 14 : répartition des agents microbiens dans les prélèvements génitaux féminins (BELABED
,1999) :

Echantillon N 353 87
Type de prélèvement PV P. vulvaire
Levures 68 13
corynebacterium sp 45 7
trichomonas vaginalis 23 4
Haemophilus sp 22 2
streptococcus B 6 0
E coli 5 0
Streptococcus D 2 0
Klebsiella 2 0
Staphylococcus doré 1 0
streptococcus NG 3 1
N.gonorrhoeae 0 0
Mycoplasma hominis 82 17
U.urealyticum 112 30

Pour ce qui concerne l’isolement des mycoplasmes génitaux, les chiffres rapportés par BELABED
sont résumés à travers le tableau 15 :

Tableau 15 : Mycoplasmes génitaux

Sexe Nombre de prélèvements Nombre de M.hominis nombre d’U urealyticum


Femmes 440 (PV+P. vulvaire) 99 (22.50%) 142 (32.27%)

Quant aux associations de germes notés par BELABED, il apparait que :

 Sur 133 PV positifs, il ya eu 104 associations de mycoplasmes avec des bactéries ou des
levures (29.4% de l’ensemble des échantillons).
 Sur 21 P. vulvaires positifs, 9 sont des associations avec des mycoplasmes (10.34 % de
l’ensemble des échantillons).

32
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-Chez l’enfant :
Des données concernant l’infection génitale chez la fillette sont rapportées par une enquête étiologique
prospective effectuée en 1993 au niveau des consultations pédiatriques de l’hôpital Parnet et du CHU
Béni-Messous (A. Benslimani et coll, résultats communiqués durant le congrès maghrébin de
Pédiatrie, 1996).

Ainsi, 87 cas de vulvites symptomatiques (âge moyen des enfants : 6 an et demi) ont faits l’objet de
prélèvements microbiologiques et parasitologique.

80 cas sont revenus positifs (voir tableau 16).

43 cas : agents bactériens ou 14 cas : oxyure associé à un agent 23 cas oxyure


mycosiques bactérien ou mycosique seul

Entérobactérie : 15 Entérobactérie : 4
 7 E coli  2 E coli
 4 P mirabilis  1 P mirabilis
 2 S flexneri  1 S flexneri
 2 K pneumoniae Haemophilus influanzae : 3
Streptocoques : 11 Streptocoques : 3
staphylocoques : 8 staphylocoques : 2
Haemophilus influanzae : 3 C.Albicans :1
levures : 3
divers : 3

En définitive, même s’ils ne sont pas toujours représentatifs de la population générale, les différents
échantillons ayants fait l’objet des enquêtes rapportées, ont permis d’aboutir à certains résultats.

Chez une population masculine exposée au risque de MST (militaire), les UNG prédominent sur les
urétrites gonococciques.

A noter cependant que Neisseria gonorrhoeae vient en tête des étiologies d’urétrite, suivi de chlamydia
trachomatis.

Quant aux mycoplasmes génitaux, ils sont surtout représentés par Ureaplasma urealyticum

Par ailleurs 33 % des urétrites restent sans étiologie.

Enfin des associations de plusieurs agents d’urétrite sont souvent rapportées, de même que dans
associations d’urétrite avec d’autres MST.

Dans la population féminine, candida Albicans st l plus souvent isolé comme agent d’infection
génitale.

Trichomonas vaginalis est également souvent retrouvé.

Parmi les agents de la flore vaginale pathogène opportuniste, les streptocoques, staphylocoques et
entérobactéries sont régulièrement incriminés.

33
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Les agents spécifiques de MST, s’ils sont recherchés au sein d’une population féminine exposée au
risque (prostituée, incarcérées) sont dominés par chlamydia trachomatis, suivi de N .gonorrhoeae.

Quant aux mycoplasmes génitaux dans la population féminine, on note encore la prédominance
d’U.urealyticum sur M hominis.

Chez la petite fille, la vulvo-vaginite est fréquemment causée ou aggravée par une parasitose sous-
jacente : l’oxyurose.

A souligner cependant que ceci ne doit pas faire oublier la possibilité de l’abus sexuel qui doit être le
premier souci du pédiatre devant ce type d’infection.

34
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre II- Techniques de prélèvements


génitaux :
A-Préliminaires : (7.9.24)

Il serait souhaitable que tout laboratoire d’analyses médicales dispose d’une pièce (avec lavabo et
sanitaires) réservée aux prélèvements génitaux.

On doit y trouver :

 Une table d’examen gynécologique.


 Un éclairage.(scialytique).
 Des spéculums stériles métalliques (stérilisables) ou à usage unique.
 Des doigtiers à usage unique.
 Des gants à usage unique : le « préleveur » doit porter des gants chirurgicaux au moment
d’examiner le (ou la) patient (e) et d’effectuer les prélèvements génitaux.
 Des pipettes en plastique à usage unique, montées sur une poire permettant l’aspiration des
secrétions.
 Des spatules.
 Des écouvillons stériles.
 Des flacons stériles à large ouverture, en plastique (urines, sperme).
 Une paillasse équipée d’une arrivée de Gaz avec des pipettes Pasteur, tubes d’eau
physiologique stériles, une anse bactériologique.
 Des compresses stériles.
 Une fiche technique détaillant les précautions à prendre et les modalités de prélèvement doit
être affichée dans la salle.

Des équipements à disposer dans la salle de prélèvement ou à défaut à proximité sont :

 Microscope optique à fond clair.


 Un microscope à fond noir (si disponible).
 Lames et lamelles.
 Une étuve pour garder les milieux de culture à 37°C.
 Une jarre à CO2.

Au moment de la prise de rendez vous pour prélèvements génitaux ,une fiche de recommandations est
remise à la patiente.

Elle comporte :

 Pas de traitement antimicrobien local ou général depuis au moins 3 jours.


 Pas de toilette génitale depuis 6 h au moins.
 Pas de miction depuis 2 h au moins.
 Pas de rapports sexuels depuis 3 jours.

35
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 La femme doit se présenter immédiatement avant ou après les menstruations (sauf en cas
d’indication d’une culture de BK, qui doit être pratiquée sur sang menstruel).

La fiche de renseignements cliniques est primordiale et il serait souhaitable qu’elle soit remplie par le
médecin ou le gynécologue traitant. (Voir prototype en annexe A).

En pratique courante, les prélèvements génitaux féminins sont effectués par le gynécologue et
adressés au laboratoire d’analyse par le biais de la patiente.

Les prélèvements génitaux masculins sont en général pratiqués au laboratoire même.

36
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-Technique de prélèvement :
I- Les écoulements génitaux :
1-Chez l’homme :
1-1-Le prélèvement urétral :
Apres nettoyage du méat urétral à la compresse stérile imbibée d’eau stérile , on procede comme suit :

 On utilise une anse bactériologique stérilisée et refroidie dans un tube d’eau physiologique
puis introduite à 3-4 cm dans le canal urétral.
En cas d’écoulement discret ou absent demander au patient de masser le trajet de l’urètre en
direction du méat pour ramener le maximum de sécrétions.
Le prélèvement peut aussi se faire à l’aide d’une pipette pasteur boutonnée ou d’un écouvillon
fin en alginate.
 Il ne faut jamais utiliser d’écouvillon classique.
 Il faut proscrire l’auto-prélèvement.
 Le pus urétral prélevé servira aux cultures et étalement sur lame (frottis).
 Chlamydia trachomatis : on ramène des cellules urétrales en introduisant u écouvillon type
CYTOBRUSH ou BACTOPICK à 2-3 cm dans le canal urétral et en le faisant pivoter.
L’écouvillon sera ensuite exprimé sur 2 lames pour IF.
Un second écouvillon du même type, destiné à la culture, sera plongé dans un milieu de
transport type 2SP. Une fois le liquide qu’il contient totalement exprimé dans le milieu,
l’écouvillon pourra être retiré du tube.
 Ureaplasma urealyticum : si l’écoulement urétral n’est pas franc, d’autres types de
prélèvement seront préférés (spermoculture, 1er jet urinaire).
 En cas de goutte abondante, on peut en prélever un échantillon sur un écouvillon en coton que
l’on exprime immédiatement dans le milieu A3.

1-2-Le prélèvement pour spermoculture :


Au 3ème jour d’abstinence sexuelle, le patient pratique sa miction matinale avant de réaliser une toilette
soigneuse :

 Lavage des mains à l’eau et au savon puis rinçage des mains à l’eau suivi d’alcool.
 Réaliser une toilette soigneuse des organes génitaux à l’aide d’eau et de savon, suivi d’un
rinçage abondant à l’eau.
 Se laver les mains une 2ème fois à l’eau et au savon, se rincer les mains à l’eau puis à l’alcool.
 Le prélèvement de sperme est recueilli après masturbation dans un flacon en plastique stérile
qui ne sera ouvert qu’au moment du prélèvement et pas avant.
 Refermer aussitôt le flacon et le remettre rapidement au personnel du laboratoire qui procédera
immédiatement aux examens microscopiques.

37
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-3-Urines et sécrétions prostatiques :


Le patient effectue une désinfection soigneuse des organes génitaux externes en utilisant du savon ou
du Dakin, suivi d’un abondant rinçage à l’eau. Le séchage se fait à l’aide de compresses stériles.

On distingue :

Le 1er jet urinaire (50 ml), pour la recherche de :

 Neisseria gonorrhoeae, dans le culot de centrifugation.


 Ureaplasma urealyticum et Mycoplasma hominis.
 Trichomonas vaginalis.

Le prélèvement selon la technique de MEARS-STAMEY (16) :

On prélève 4 échantillons

 N°1 : 1er jet urinaire : 10 ml (VB1)


 N°2 : le milieu du jet (VB2)
 N°3 : les secrétions prostatiques obtenus après massage prostatique (EPS)
 N°4 :10 premiers ml d’urine obtenus immédiatement après massage

Procédure :

 Il faut éviter toute contamination par le prépuce chez le sujet jeune non circoncis. Pour cela,
maintenir le méat bien dégagé pendant toute la procédure ;
 Il faut éviter toute contamination par le savon utilisé lors de la toilette.
 Nettoyer le gland avec du savon et rincer abondamment à l’eau stérile. Sécher le gland avec
une compresse stérile ;
 Recueillir les 10 premiers ml d’urine dans un tube stérile ;
 Pendant que le sujet continue à uriner, retirer le tube.
 Attendre qu’il urine approximativement 200 ml et insérer le 2ème tube pour y collecter les 10
ml du milieu du jet.
 Immédiatement après, le patient doit stopper sa miction et éliminer toute gouttelette d’urine du
méat urétral.
 Le patient se met alors en position genu-pectum et place un flacon stérile à large ouverture
sous le méat. Le médecin pratique un massage prostatique et les gouttes de liquide prostatique
tombent directement dans le flacon, sous la pulsion pratiquée par le médecin sur l’urètre
bulbaire (EPS).
 Apres collection des secrétions prostatiques, le patient urine et les 10 premier ml sont collectés
dans un 4ème flacon. (VB3).

Objectif de cette technique des 4 prélèvements : poser le diagnostic d’une prostatite, différencier une
urétrite d’une prostatite.

38
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Chez la femme :
2-1-Prélèvements cervico-vaginaux : (7.10)
Mettre en place un spéculum stérile non lubrifié mais seulement humidifié à l’eau tiède ;

Nettoyer soigneusement le col à l’aide d’une compresse stérile montée sur une pince et imbibée d’eau
stérile.

Utiliser des écouvillons stériles en coton ou en alginate.

Gonocoque, Trichomonas vaginalis, Mycoplasmes génitaux, germes banals et levures : prélever au


niveau de 3 sites du bas appareil génital :

 Site « 1 » : endocol.
 Site »2 » : cul de sac postérieur.
 Site « 3 » : vagin ou exocol.

Utiliser 3 écouvillons pour chacun des sites « 1 » et « 2 » et 1 seul écouvillon pour le site « 3 ».

Préciser le site de prélèvement par écrit sur chaque écouvillon :

 Gonocoque : un prélèvement au méat urétral, à l’écouvillon est complémentaire à la


recherche de N gonorrhoeae : presser l’urètre contre la symphyse pubienne et recueillir
l’écoulement directement sur l’écouvillon.
 Chlamydiae : prélever des cellules de l’endocol, utilisant un écouvillon spécial type
bactopick ou cytobrush.

2-2-Prélèvement vulvaire :
 Dans les cas ou les prélèvements cervico-vaginaux ne peuvent être effectués (vierge, prépubert,
hystérectomisée), le prélèvement vulvaire peut permettre la détection du ou des agents
d’infection génitale mais au prix d’un risque accru de contamination par la flore cutanéo-
muqueuse de voisinage.
 On recommande à la patiente d’éviter toilette vulvo-vaginale depuis 24 h et toute médication
locale ou générale depuis au moins 3 jours.
 Le prélèvement dans les zones inflammatoires de la région vulvaire , de préférence au sein des
secrétions purulentes. On prélève 4 écouvillons au moins (+ cytobrosse si recherche de
Chlamydia).

 Chez la petite, un scotch test vulvaire et anal doit être effectué à distance du prélèvement
vulvaire, dés le lever (expliquer la procédure à la mère et lui remettre 2 lames propres).
 Le matin, avant la toilette, mettre l’enfant en position genu-pectum .déplisser la marge anale et
appliquer un morceau de scotch transparent dessus.
 Puis décoller délicatement le scotch et le coller sur un lame de microscope.

39
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Mettre ensuite l’enfant en position génitale et appliquer cette fois un second morceau de scotch
sur l’orifice génital. De même le scotch , une fois délicatement décollé , est appliqué sur la
deuxième lame du microscope.
 Les lames seront examinées au microscope à l’objectif x10 et x40 , à lla recherche d’œufs
d’oxyures.

2-3-prélèvement à l’orifice de la glande de Bartholin (7.9) :


 Nettoyer la zone péri-orificielle ;
 Effectuer une pression douce de la glande ce qui lui fait sourdre du pus ;
 Prélever à l’écouvillon : 3 écouvillons en coton et 1 culturette anaérobie ;
 La contamination par la flore cutanée étant inévitable, il serait préférable de ponctionner à
l’aiguille la glande infectée, après désinfection cutanée minutieuse.

2-4-prélèvement du haut appareil génital :


Les prélèvements obtenus en cours d’un acte chirurgical (ex sous cœlioscopie) +sont ad6ressées -
dans un flacon stérile sans aucun milieu de transport : biopsie de l’endomètre, prélèvements tubo-
ovariens….

2-5-prélèvement du stérilet :
Le stérilet retiré est immédiatement placé dans un tube contenant 1 ml de Bouillon Schaedler ou
TGY pour recherche de bactéries anaérobies strictes.

40
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-Chez l’enfant
En cas de suspicion d’abus sexuel, après un examen clinique méticuleux par le médecin, les différents
sites génital, anal et pharyngé feront l’objet de prélèvements microbiologiques et tous les agents
infectieux pouvant être sexuellement transmis seront recherchés par les techniques les plus sensibles, y
compris par la culture.

C’est le cas par exemple pour chlamydia trachomatis, car les méthodes de détection des antigènes sont
moins sensibles chez l’enfant que chez l’adulte et leurs spécificité n’est pas de 100 %.

A noter aussi qu’un prélèvement sanguin est effectuer pour déterminer le profil sérologique précoce de
la victime vis-à-vis des agents sexuellement transmissibles bactériens et viraux, ces données étant
complétées par la suite par un second voir un 3ème prélèvement sanguin pour déterminer le profil
sérologique tardif de la victime (dossier médico-légal).

41
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

II-Les ulcérations et chancres génitaux :


(porter des gants chirurgicaux)

1-Pour rechercher Treponema pallidum :


 Nettoyer la lésion à l’aide d’une gaze imbibée d’eau physiologique ;
 Assécher la lésion avec une gaze sèche et en presser la périphérie pour en faire sourdre
une sérosité.
 A l’aide d’une anse bactériologique stérilisée ou encore en mettant en contact la lame avec
la lésion, on prélève un peu de la sérosité sur une lame pour microscopie ;
 Mettre rapidement la sérosité en suspension dans une goutte d’eau physiologique et
couvrir d’une lamelle : examiner immédiatement la préparation au microscope à fond noir.

2-Pour rechercher Haemophilus influanzae


 Nettoyer la ou les ulcérations avec une compresse stérile imbibée de sérum
physiologique ;
 Avec un vaccinostyle ou un écouvillon d’alginate de calcium, frotter les lésions sans faire
saigner.
 Prélever à l’écouvillon (coton ou dacron) , l’exsudât et le matériel cellulaire de la base de
l’ulcération (utiliser 2 écouvillons).
 Prélever par ponction à la seringue, le pus d’abcès de l’aine.
 L’exsudat est étalé sur 3 lames propres, dans une seule direction afin de maintenir
l’intégrité morphologique et les regroupements caractéristiques des bacilles de Ducreyi.
 Les colorations réalisées sont : au bleu de méthylène, au gram et au Giemsa.
 On effectue également un étalement sur des milieux de culture appropriés.

3-Pour rechercher les corps de Donovan :


L’agent responsable est un micro-organisme intra cellulaire appelé calymmatobacterium granulomatis.

Le diagnostic de la Donovanose est basé, non seulement sur le tableau clinique mais aussi sur la
détection de calymmatobacterium granulomatis ou corps de Donovan par des techniques cytologique
et histologique sur des frottis ou des empreintes de tissu colorés et examinés au microscope.

3-1-préparation pour examen cytologique :


 Prélever au bord de l’ulcération, un fragment de tissu granuleux propre ;
 Apres l’avoir débarrassé de la partie graisseuse, écraser ce fragment entre 2 lames ;
 Sécher le frottis ;
 Fixer dans le méthanol pendant 2 ou 3 mn ;
 Colorer au colorant de Leishman (voir Annexe B) ;

42
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-2-Préparation pour examen histologique :


 Le fragment de tissu biopsique, prélevé au bord de l lésion, mesure 3 à 5 mm d’épaisseur.
 Ce fragment est plongé dans un flacon renfermant un fixateur (ex Formol).
 Le flacon doit être correctement étiqueté et scellé par du papier adhésif, puis rapidement
adressé pour analyse histologique.

4-Pour rechercher l’herpès virus :


Le diagnostic des infections génitales à herpes simplex virus est habituellement clinique.

L’aide d’un laboratoire spécialisé se justifie lorsque le tableau clinique est atypique et qu’un
diagnostic différentiel avec le chancre mou s’impose, ou encore si un terrain particulier est signalé
(grossesse, affection immunosuppressive, traitement immunodépresseur…)

Le diagnostic direct est basé sur la culture du virus ou, plus rapidement, sur la technique
d’immunofluorescence directe aux anticorps monoclonaux.

4-1-prélèvement pour la culture du virus :


 Liquide de vésicule aspiré à la seringue ;
 Produit de grattage des pustules ;
 Ecouvillonnage vigoureux des ulcérations ;
 Chez la femme : écouvillon du col + autres lésions détectées.

Les prélèvements sont plongés individuellement dans 1 ml de milieu de transport (voir


composition en annexe B)

La conservation se fait à +4°C jusqu’à la culture et le délai ne doit pas dépasser 24 H.

Si ce délai est dépassé, l’échantillon est congelé à -70°C.

4-2-Prélèvement pour IFD :


On effectue un écouvillonnage de la base de la lésion à l’aide d’un écouvillon en coton, humidifiée
dans une goute d’eau distillée stérile.

Le prélèvement est immédiatement appliqué sur 2 alvéoles d’une lame pour IF séchée à l’air et fixée à
l’acétone.

43
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

III-les autres prélèvements :


1-prélèvements complémentaires :
1-1-Recherche de N gonorrhoeae au niveau des sites extra-génitaux :
La détection du gonocoque au niveau du pharynx et de l’anus est une recherche complémentaire
indispensable.

Elle a son importance dans la population homosexuelle et chez l’enfant victime d’abus sexuels.

Chez le nouveau né, une conjonctivite purulente doit faire suspecter une étiologie gonococcique.

 P. pharyngé : écouvillonnage du pharynx postérieur et des cryptes amygdaliennes.


 P. anal : insérer un écouvillon de coton sur 4-5 cm dans le canal anal tourner l‘écouvillon
pendant 10 secondes et retirer.
 P. conjonctival : on prélève à l’écouvillon les secrétions purulentes accumulées au niveau
de l’angle interne de l’œil.

1-2-recherche de Chlamydia trachomatis au niveau des sites extra-


génitaux :
 La recherche de Chlamydia trachomatis au niveau de la gorge et de l’anus et également
une recherche complémentaire, importante en cas de pratique homosexuelle et d’abus
sexuel.
 Chez le nouveau né, cet agent est responsable d’infections respiratoires et de
conjonctivites. Il sera recherché au niveau de prélèvements de l’arbre respiratoire et des
conjonctivites.
 a-gorge : écouvillonnage au niveau du pharynx postérieur et des cryptes
amygdaliennes.
 b-Rectum : insérer un écouvillon à 3 cm dans le canal anal et le faire tourner 10
secondes.
 c-chez le nouveau né
 Nasopharynx : écouvillonnage pharyngé par le biais d’un écouvillon à manche
flexible introduit par la narine.
Geste invasif : intubation et aspiration des secrétions trachéobronchiques (prélèvement
de meilleur qualité).

 Conjonctivite : racler les cellules épithéliales à l’écouvillon, au niveau de la


muqueuse conjonctivale de la paupière supérieure que l’on soulève et l’on
retourne.

44
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Ponction d’adénopathie satellite : (H ducreyi, T.pallidum, C trachomatis,


germes banals)

On distingue 3 situations :

 2-1-Ganglions de consistance molle, mobile : désinfecter le ganglion et ponctionner à


l’aiguille montée sur une seringue. Veuillez en chasser l’air.
 2-2-Ganglion induré : désinfecter le ganglion et ponctionner à l’aiguille montée sur une
seringue remplie de 1 ml de sérum physiologique, puis injecter le sérum dans le ganglion et ré
aspirer après massage du ganglion .chasser l’air.
 2-3-Ganglion fistulisée : désinfecter la fistule puis masser le ganglion pour en faire sourdre du
pus que l’on aspire à la seringue.

3-Les autres manifestations d’infection génitale :


3-1-Papillome et condylomes génitaux :
Le diagnostic en est clinique et histologique.

Tumeurs et tissus infectés : prélèvement se fait par excision ou curetage biopsique.

Cervicite et colpite : on prélève les cellules pavimenteuses par grattage à la spatule en bois ou à
l’écouvillon, au niveau de la jonction endocol-exocol.

3-2-Dermatoses génitales :
Leur diagnostic est essentiellement clinique.

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Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

C-Conservation et transport :
Dans le cas ou les prélèvements sont effectués à distance du laboratoire d’analyse, deux situations sont
possibles :

Transporter les prélèvements à température ambiante dans un délai ne dépassant pas 30 mn.

Utiliser des milieux de transport appropriés.

1-Neisseria gonorrhoeae :
On plonge l’écouvillon dans un milieu de Stuart modifié ou d’Amies au charbon. Ces milieux
pourront ainsi être gardés au maximum 12 h à t° ambiante (pas plus de 30°C) jusqu'à mise en culture.
Toute réfrigération est à proscrire.

2-Chlamydia trachomatis :
On utilise le milieu 2SP dans lequel l’écouvillon destiné à la culture est plongé. Le transport se fait
dans la glace.

3-Mycoplasmes génitaux :
Le prélèvement est acheminé le plus rapidement possible au laboratoire pour y être immédiatement
traité. Si le traitement est différé, on met en suspension le prélèvement dans un milieu de transport
liquide (A3 ou 2SP) lequel peut être gardé à +4°C moins de 24 h avant inoculation. Si on conserve
plus longtemps, la congélation du prélèvement à -70°C est nécessaire.

4-Trichomonas vaginalis et levure :


L’écouvillon de prélèvement est plongé dans 0.3 ml d’eau physiologique. Le transport se fait à
température ambiante (ne dépasse pas 2h).

Concernant T. vaginalis, pour une conservation de 24 h à température ambiante , on plonge


l’écouvillon dans un milieu AMIES.

5-Haemophilus ducreyi :
En cas de mise en culture différée, on utilise un milieu de transport tel un milieu à base de
Thioglycolate et d’Hémine et contenant de la L-glutamine et de l’albumine bovine.

Ce milieu ensemencé, est mis à +4°C (30).

46
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre III
Analyse microbiologique de prélèvements
génitaux
A-Ecoulements génitaux
I-Chez l’homme :
1-Prélèvement urétral :
A partir du produit de prélèvement on effectue :

 Deux frottis sur lame, à colorer au bleu de méthylène et au gram.


 Des isolements sur :
 1 gélose chocolat + 1 % de polyvitex ;
 1 milieu de Thayer-Martin ;
 1 gélose au sang frais.

 Un enrichissement sur milieu A3. (écouvillon de l’urètre) ;


 Deux spots sur lame pour IFD à l’anticorps monoclonal anti-Chlamydia trachomatis
(écouvillon type cytobrosse).

1-1-Examens directs :
 Frottis coloré au bleu de méthylène : rechercher des PN et des diplocoques intra et / ou
extracellulaires.
La présence de plus de 5 leucocytes par champs au grossissement X 1000 est fortement indicatrice
d’une urétrite chez l’homme.

 Frottis coloré au Gram : rechercher des diplocoques à gram négatif en « grains de café » intra et/ou
extra-leucocytaires.

1-2-Cultures et techniques spécifiques :


1-2-1-Neisseria gonorrhoeae :
La mise en culture doit être rapide, de préférence dans la salle de prélèvement même.

Elle se fait simultanément sur un milieu non sélectif et un milieu sélectif (voir composition en annexe
B).

Milieux enrichis polyvalents (non sélectifs) :

47
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Gélose chocolat enrichi au polyvitex à 1 %.


Ou
 Gélose avec supplément G : caractérisée par sa transparence, ce qui permet des le premier
examen, d’évaluer la pureté de la culture.

Milieu sélectifs :

 Milieu de THAYER MARTIN : c’est une gélose chocolat avec supplément d’enrichissement
et renfermant un mélange d’antibiotique et d’antifongique.
Ou
 Milieu avec supplément G et mélange inhibiteur.
Ou
 Milieu de THAYER MARTIN modifié (MTM) : Gélose GC + supplément d’enrichissement
+ Hémoglobine + V.C.A.T. (Vancomycine, Colistine, Amphotericine B et Triméthoprim).
Ou
 Milieu de MARTIN-LEWIS : identique au milieu de THAYER MARTIN modifié mais a
nystatine est remplacée par l’anisomycine à 10 ug/ml.
Ou
 Milieu NEW YORK CITY (N.Y.C) : permet également la culture rapide des mycoplasmes.

L’ensemencement doit se faire sur des milieux de culture préchauffés à 37 °C

Apres avoir roulé l’écouvillon de prélèvement sur un quadrant de gélose de la boite, l’inoculum est
étalé à l’anse de platine en utilisant la technique des quadrants pour obtenir des colonies isolées dans
le premier quadrant afin de vérifier la pureté de la culture et d’observer la forme des colonies.

L’incubation se fait immédiatement à 35°C-36°C, toujours en atmosphère humide contenant 5 à 10 %


de CO2 ou jarre à bougie, avec un morceau de coton humide).

La majorité des souches cultivent en 16 à 18 H, cependant les colonies pouvant être fines, une
deuxième lecture serait faite à la 48 éme heure. A noter cependant que les techniques d’identification
seront pratiquées sur la culture la plus jeune possible.

1-2-2-Germes banals :
Ils englobent les streptocoques, les staphylocoques, les Haémophilus, les entérobactéries et autres
agents bactériens pathogènes non spécifiques.
Aux milieux précédemment cités, on ajoute une gélose COLUMBIA avec 5% de sang frais.

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 h en atmosphère enrichie de 5-10 % de CO2.

48
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-2-3-Mycoplasmes génitaux :
La recherche de mycoplasmes génitaux se fait par la technique classique ou par galerie miniaturisé.

1-2-3-1-La culture des Mycoplasmes par technique classique :

Matériel et réactifs :

 Milieux de culture :
Milieu de transport A3.
Pour M.hominis : milieu de Hayflick liquide (M42) et milieu Hayflick solide (A7).
Pour U.urealyticum : milieu de Shepard liquide (U9) et milieu de Shepard solide (A7).
 Pipettes graduées de 1 et 2 ml stériles.
 Tubes de Kahn stériles avec bouchons.

Mode opératoire :

Titrage avant incubation de A3


0.1 Ml 0.1 Ml 0.1 Ml 0.1 Ml

0.3 ml de prélèvement ou
l’écouvillon
0.1 Ml
1 ml
U9

0.1 Ml 0.1 Ml 0.1 Ml 0.1 Ml

1 ml de milieu A3

0.1 Ml

1 ml
M42

49
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Culture apres incubation du milieu A3.

A3
20 ul 1 goutte

Gélose
A7

L’incubation :

 Des tubes se fait à 37°C pendant 1 à 4 jours ;


 De la gélose, à 37 °C sous 5 % de CO2 ou en anaerobiose,pendant 1 à 4 jours.

Lecture :

Le role pathogéne,lié à l’importance de la coloration in vitro par M.hominis ou U.urealyticum,


correspond à une dilution positive de donc à un titre >= 10 UCC/ml.

U.urealyticum :

 Milieu U9 U.urealyticum hydrolyse l’urée avec dégagement d’ammoniac donc alcalinisation


du milieu et virage du jaune au rouge framboise.
 Lecture des titres :UCC/ml=unité changeant de couleur par ml.

Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Interpretation

1er cas Vire au Pas de Pas de Pas de Présence


rouge virage virage virage d’U.uréalyticum
titre = 10 UCC/ml
2ème cas Vire au Vire au Pas de Pas de Présence
rouge rouge virage virage d’U.uréalyticum
titre = 10 UCC/ml
Titre faible
3ème cas Vire au Vire au Vire au Pas de Présence
rouge rouge rouge virage d’U.uréalyticum
titre=10 UCC/ml
Titre faible
4ème cas Vire au Vire au Vire au Vire au Présence
rouge rouge rouge rouge d’U.uréalyticum
titre=10 UCC/ml
Titre fort.

50
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

M.hominis :

 Milieu M42 ou BD : M.hominis hydrolyse l’arginine avec dégagement d’Ammoniac donc


alcalinisation du milieu qui vire ainsi du jaune orangé au rouge framboise. Si le tube vire au
rouge alors presence de M.hominis .
 La lecture est identique à celle de U.urealyticum
 Le titre significatif est T>= 10 UCC/ml .

Identification des mycoplasmes sur mileu solide (A7) :

On bserve la gélose à la loupe binoculaire : les colonies d’U.urealyticum sont petites , de couleur brun
noir et ont une forme de « pelote de laine ».

Les colonies de Mhominis ont l’aspect caracteristique d’œuf sur plat .

On denombre les colonies en gélose et on determine le nombre moyen de colonies par champ à
l’objectif X 10 :

 1-5 colonies : 10 UFC/ml


 5-15 colonies : 10 UFC/ml

Le seuil de pathogénicité admis est de 10 UFC/ml (10)

1-2-3-2 : La culture de Mycoplasmes par galerie Mycoplasma DUO (Sanofi Diagnostic


Pasteur) :

Composition :

La galerie Mycoplasma DUO comprend :

 Des flacons contenant 2 ml de milieu servant au recueil et au transport du prélèvement.


 Un flacon compte-gouttes contenant 15 ml de diluant.
 Une microplaque de 6 cupules contenant des substrats déshydratés pour l’identification et le
titrage différentiel des 2 espèces de Mycoplasmes.

Traitement du prélèvement :

 Répartition du diluant : avec le flacon compte-gouttes, on distribue 200 ul (4 gouttes) de


diluant dans les 3 cupules : U ≥ 10 D H≥10 .
 Répartition du prélèvement : bien décharger l’écouvillon dans 2 ml de suspension puis
distribuer cette dernière comme suit :
 4 gouttes dans les 3 cupules U, X, H ;
 1 goutte dans la cupule D.
 Avec une autre micropipette, distribuer 1 goutte du contenu de la cupule D dans la cupule
U ≥ 10 et 1 goutte dans la cupule H≥10 .
 Incubation : recouvrir la microplaque d’un film adhésif et l’incuber 48h à 37°C.

51
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Interprétation :

L’identification et le titrage reposent sur le virage au rouge des cupules suivantes :

 Cupule U : Présence d’U.urealyticum à titre faible : ≤10 UFC/ml .


 Cupules U et U ≥ 10 : Présence d’U.urealyticum à titre fort (≥10 ).
 Cupule H : Présence de M.hominis à titre faible : ≤10 UFC/ml .
 Cupules H et H ≥ 10 : Présence de M.hominis à titre fort (≥10 ).

1-2-4-Chlamydia trachomatis :
1-2-4-1-Recherche de chlamydia par IFD sur frottis de prelevement :

Principe :

Les chlamydia sont des bacteries intracellulaires strictes regroupées sous forme d’inclusions dans le
cytoplasme des cellules infectées.

En appliquant le prelevement directement sur la lame , ces inclusions intracellulaires sont éclatées ce
qui permet d’observer les bacteries au stades de CE et CR libres.

On utilise pour cela un anticorps monoclonal anti-chlamydia conjugué à l’isocyanate de fluoresceine.

Equipement et réactif :

 Lames dépolies ;
 Lamelles
 Acétone
 Lames de controle
 Anticorps monocloaux
 Microscope à épifluorescence avec objectif X 40 et X 100 ;
 Réfrigérateur.
 Congélateur à – 20 °C.

Technique :

 Au moment du prelevement, bien appliquer l’ecouvillon directement (sans tromper dans aucun
milieu ) sur les puits d’une lame téflonnée ou à l’interieur d’un cercke gravésur une lame
ordinaire ;
Le frottis ne doit pas etre trop epais.
 Marquer le nom du malade sur la lame ( ou le N° du malade);
 Laisser secher le frottis à la temperature du laboratoire ;
 Fixer à l’acetone 10 mn à +4°C ;
 Si la technique est temporisée ,conserver les lames à – 20 °C dans du papier Joseph ;
 Recouvrir le frottis avec 30 ul d’anticorps monoclonal anti-Chlamydia trachomatis specifique
de l‘espece , marqué à la fluorescéine ;
 Incuber la lame 15 mn à temperature ambiante en chambre humide ;
 Laver la lame à l’eau distillé pendant 20 secondes ;
 Secouer délicatement la lame pour éliminer l’excés d’eau et laisser sécher à l’air.

52
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Monter dans une solution tampon Phosphates-glycérol (50 :50) poser une lamelle sur le puits
et examiner au microscope à fluorescence à l’objectif X40 ou X100.
 Toujours inclure un témoin positif et un témoin négatif.

Lecture

Les corps elementaires apparaissent de couleur vert pomme sur fond de cellules colorées en rouge.

 Commencer par lire les lames de contrôle + et –.


 Verifier le nombre de cellules du frottis(n) ;
 Si n<20 cellules, le signaler et redemander un 2ème prelevement.
 Resultat + : au moins 5 CE sur tout le frottis.
 Resultat - :resultat à confirmer par un 2ème prelevement
 Les differents types de résultats :
 0 CE : résultat négatif (si le nombre de cellules est suffisant) ;
 5 CE : résultat positif (confirmer par un 2ème prelevement) ;
 10 A 100 CE :résultat positif modéré ;
 >100 CE :résultat positif élevé++++

Sensibilité et specificité :

Sensibilité diminuée par :

 Netoyage insuffisant des secretions du col ;


 Grattage insuffisant des cellules épithéliales de l’endoco ;
 Anticorps monoconal de qualité insuffisante.

Spécificité dimminuée par

 Reactions croisées avec peptostreptococcus,N.gonorrhoae,S.aureus.


 Artefacts et bacteries inracellulaires :Faux CE.

N.B : il existe dans le commerce des coffrets pour IFD Chlamydia avec lame, témoin (+) , Témoin (-
), écouvillon et fixateur.

53
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-2-4-2- Recherche de Chamydia par culture :

Principe :

Les chamydia sont des bacteries à métabolisme intracellulaire obligatoire.

C’est la culture sur cellules sensibles qui represente la méthode de reference dans le diagnostic positif
des infections à chlamydia.

L’ecouvillon de prélevement est imperativement plongé dans un flacn renfermant le milieu de


transport 2SP.

Les flacons sont congelés à -70°C ou au maximum 24 h à +4°C.

Réactifs, milieux et équipements :

Réactifs et milieux :

 Prélèvement génitaux conservés à -70°C ou 24 h maximum à +4°C ;


 Milieu EAGLE MEM (entretien des cellule) ;
 Milieu de HANKS ;
 Trypsine ;
 Cycloheximide solution mére (actidione) ;
 Glucose à 10 % ;
 EAGLE enrichi (apres inoculation) ;
 Tampon 2SP ;
 Milieu de conservation des souches : « 4SP » ;
 Bleu de trypan ;
 Souche de contrôle : souche de reference entretenue au laboraoire ou souche de
ch.trachomatis isolée d’un malade.

Equipements :

 Flacons pastiques de 75 cm2 pour culture cellulaire (type COSTAR) ;


 Plaques de 24 puits pour culture cellulaire ;
 Lamelles rondes en verre de 1 cm de diamètre ;
 Cellules de Malassez ;
 Billes de verre de 2 mm de diamètre ;
 Pipettes plastiques stériles de 1.5 et de 10 ml ;
 Seringues de 5 ml ;
 Agitateur de tubes type Vortex ;
 Centrifugeuse de plaques 24 puits, pouvant atteindre 1500 g ;
 Etuve à 37 °C et à atmosphère de 5-10% CO2 ;
 Microscope à équipement pour fluorescence ;
 Congélateur à -70°C ;
 Réfrigérateur à +4°C.

54
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Mode opératoire :

Entretien des cellules McCoy :

Utiliser les flacons « COSTAR » de 75 cm2 ;

 Y maintenir les cellules à 37°C sous 5 % de CO2 dans le milieu de croissance EAGLE ;
 Des que le tapis cellulaire est continu, procéder à la trypsination :
 Rejeter le milieu EAGLE.
 Laver rapidement le tapis cellulaire au HANKS ;
 Ajouter 10 ml de trypsine –laisser agir 1 min ;
 Rejeter la trypsine, tapoter le flacon, le tapis cellulaire commence à se détacher ;
 Verser quelques ml de EAGLE dans le flacon pour inactiver l’enzyme. Les cellules
sont mises en suspension par agitation modérée et peuvent être transférées dans un
autre flacon ;

Préparation des plaques pour l’isolement de Chlamydia :

 Numération au bleu de Trypan, des cellules trypsinées ;


 Ajustement à 10 cellules par ml ;
 Dépôt de 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque type COSTAR de 24
puits contenant chacun une lamelle ronde ;
 Incubation de la plaque 24 h à 37°C sous 5% CO2 pour constitution d’une monocouche
cellulaire sur les lamelles.

Inoculation des prélèvements génitaux ;

 Décongeler les prélèvements à 37°C ;


 Ajouter 1 ml de EAGLE et quelques billes de verre stériles dans chaque flacon de
prélèvement ;
 Agiter vigoureusement sur agitateur VORTEX pendant au moins 1 mn ;
 Jeter le milieu de culture des puits de la plaque ;
 Répartir chaque suspension infectieuse dans 4 puits à raison de 0.5 ml par puits ;
 Centrifuger la plaque pendant 1 h à 30°C et à 1500g ;
 Incuber la plaque 2h à 37°C sous 5 % de CO2 pendant 48 h ;
 Un contrôle positif sera introduit dans chaque série.

Techniques de révélation de chlamydia trachomatis :

Coloration au MGG :

Apres 48 h :

 Récupérer une lamelle par prélèvement ;


 Laver la lamelle dans une solution de PBS ;
 Fixer 10 mn dans l’alcool méthylique ;
 Colorer 20 mn dans le mélange suivant :
 MAY GRUNWALD GIEMSA 1 ml
 GIEMSA 2 ml
 TAMPON GIEMSA 17 ml

55
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Rincer dans ‘eau distillée


 Sécher la lamelle ;
 La déshydrater dans des bains successifs d’Acétone, Acétone-Toluène et Toluène ;
 Lecture au microscope à l’objectif x40 ou x100 à l’immersion ;

Techniques d’IF :

Plus sensible que la précédente surtout quant le nombre d’inclusions est peu élevé.

 Recouvrir les lamelles d’un AC monoclonal anti-Chlamydia marqué à l’isothiocyanate de


fluorescéine ;
 Lire au microscope à épifluorescence à l’objectif x40 ou x100 à l’immersion ;
 Les inclusions apparaissent en vert pomme sur fond rouge ;

Technique d’amplification par passages sur une couche cellulaire neuve :

Apres 48h, si le résultat demeure douteux, on réalise un 2ème cycle ;

Recueil des cellules restantes du prélèvement douteux entre 48 et 72 h ;

 Jeter la moitié du milieu EAGLE ;


 Gratter les cellules des lamelles restantes avec une spatule métallique stérile ;
 Récupérer l’inoculum et l’agiter au vortex avec bile de verre.
 Traitement des cellules comme le prélèvement de départ.

Précautions à prendre :

 Utiliser impérativement le milieu de transport 2SP pour le recueil des prélèvements génitaux ;
 Vérifier la qualité des supports plastiques pour les cultures cellulaires ;
 Respecter une concentration maintenue en 5 % de CO2, de l’atmosphère d’incubation car une
concentration supérieure acidifierait trop les milieux d’où réduction de la sensibilité des cellules
en cultures ;
 Vérifier la confluence des cellules au moment de l’inoculation car il y a risque de perte de
sensibilité des cellules dans le cas contraire ;
 Vérifier l’humidification des étuves à CO2 pour éviter une dessiccation des plaques d’où
changement de pH.

Interprétation

Quant technique d’IFD et culture de chlamydia sont effectués simultanément, les 2 résultats sont
rendus en même temps :

Résultats identiques

 2(+) : infection à chlamydia


 2(-) : résultat négatif
 Résultats discordants : 1 résultat (+) dans l’un des 2 tests indique une infection à chlamydia.

56
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-2-4-3-Recherche de Chlamydia trachomatis par technique immuno-enzymatique :

Principe :

C’est la détection immunologique de l’antigène de Chlamydia trachomatis, soit à l’aide d’anticorps


monoclonaux spécifiques du genre, soit par des anticorps polyclonaux préparés sur lapin.

La plupart des tests disponibles détectent les lipopolysacharides (LPS) de Chlamydia, qui sont extraits
des cellules du prélèvement par la chaleur ou l’utilisation d’une solution détergente.

Les tests immuno-enzymatiques nécessitent un personnel moins expérimenté que dans la méthode par
IF et permettent de détecter des chlamydia viables ou non.

Ils n’exigent pas de précaution dans la conservation et le transport du prélèvement.

WELLCOZYME Chlamydia

 Détection de l’antigène du genre chlamydia en EIA un temps avec amplification enzymatique.


 Utilisation d’un anticorps monoclonal anti-LPS spécifique du genre chlamydia, conjugué à un
enzyme : PAL
 Anticorps monoclonal adsorbé sur les parois des microcupules (microplaques sécables 12 x 8)
 Extraction préalable 4 mn à 100°C
 Méthode Sandwich en 1 temps
 Résultat en 2h40
 Confirmation par neutralisation.

CHLAMYDIAZYME ABBOTT :

Révélation de l’antigène du genre chlamydia grâce à un anticorps polyclonal : immunoglobuline anti-


lapin marqué par une Péroxydase.

57
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2- Spermoculture :
2-1-Examens directs :
 Deux frottis sur lame, colorés au bleu de méthylène et au gram : noter la présence de
polynucléaires et de germes
 Un état frais à la recherche de Trichomonas vaginalis.

2-2-culture :
Elle est effectuée à partir du sperme non dilué et dilué au 1/100ème.

Tableau 17 : étapes de la Spermoculture

Sperme Germe isolé Milieux ensemencés T°, durée et atmosphère


d’incubation
Non dilué N.gonorrhoeae 1 milieu de THAYER 37°C 48 h sous 5 à 10 %
MARTIN CO2+humidité
Gardnerella v 1 gélose MH au sang humain 37°C 48 h sous 5 à 10 % CO2
Levures 1 gélose sabauraud + CMP 30°C 72h
Mycoplasmes Mettre 0.3 ml de sperme dans (voir paragraphe 1-2-3)
1 tube de milieu A3

Dilué au Germes banals Etaler 100 ul de cette dilution


1/100ème à l’aide d’un râteau sur
(10 ul de  1 gélose au sang frais
sperme + 1ml  1 gélose Hektoen 37°C 48h sous 5-10% CO2
d’eau 37°C 24h
physiologique)

NB: les anaérobies (à recherché dans le sperme non dilué) et les Chlamydia (à rechercher dans le
sperme dilué dans le milieu 2SP) sont rarement incriminés.

58
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-Secrétions prostatiques :
Nous rappelons que le diagnostic de prostatite se base sur l’analyse microbiologique de 4
échantillons :

 VB1 :1er jet urinaire.


 VB2 : milieu du jet urinaire.
 EPS : sécrétion prostatique par massage de la prostate.
 VB3 : urine post-massage.

3-1-Examens directs :
Examen cytologique de chaque échantillon d’urine avec dénombrement des leucocytes par mm3
(cellule Malassez).

Frottis sur lame de chacun des 4 échantillons VB1, VB2, EPS et VB3 à colorer au Gram, à la
recherche de germes.

3-2-Cultures
Une quantité de 0.1 ml de chaque échantillon est étalé à l’aide d’un râteau, sur la surface d’une gélose
sèche on utilise pour chaque échantillon : 1 GN, 1 GSF,1 GSC,1 BCP. GN et BCP sont incubés 24 h à
37° Cependant 48h avec lecture à 24 et 48 h.

4-Orchi-épididymite :
Tableau 18 : sites à prélever en cas d’orchi-épididymite

Sites de Tests effectués T°, durée, conditions d’incubation


prélèvement
Urètre Voir P.41 paragraphe 1 Voir P.41 paragraphe 1

Culot de -Ex Directs : Gram + Giemsa


centrifugation
du 1èr jet -Culture :
urinaire  Milieu de THAYER-MARTIN  37° 48 h sous CO2
 Gélose chocolat +  37° 48 h sous CO2 +
o 1 % de PVX o Atmosphere humide.
 Columbia + sang frais  37° 48 h + O2
 Columbia + sang frais  37° , 2 à 5 j , + O2
 Culture : 6 tubes de LJ  37° lecture 28/42/72 j

59
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

5-Les sites extra-génitaux complémentaires :


5-1-Recherche de gonocoque dans les sites extra-génitaux :
 Les examens directs sont inutiles.
 La culture est effectuée sur milieu de THAYER MARTIN et gélose chocolat + 1 % Polyvitex
incubés 48 h sous CO2 et humidité.

5-2-Recherche de chlamydia trachomatis au niveau d’un frottis


conjonctival par coloration Giemsa :
 A partir du prélèvement, confectionner un frottis sur lame de microscope.
 Sécher l’étalement à l’air.
 Le fixer au méthanol pendant 5 mn
 Sécher à l’air.
 Couvrir de Giemsa fraichement préparé.
 Colorer 1 h.
 Laver à l’éthanol à 95 %.
 Sécher.
 Examiner au microscope à fond clair : les inclusions intra-cytoplasmiques des cellules
épithéliales sont colorées en bleu, le cytoplasme est gris et les noyaux des cellules sont roses.

5-3-Ponctions d’adénopathies satellites :


Effectuer :

Un état frais au microscope à fond noir (recherche de tréponèmes, s’il existe un chancre suspect)

3 frottis sur lame, colorés au bleu de méthylène (leucocytes) et au gram et Giemsa (H.ducreyi, autres
germes).

Une culture sur :

 GN, GSF, GSC, GSC+PVX


 Columbia + sang en aérobiose
 Columbia + sang en anaérobiose.
 Une culture spécifique pour H.ducreyi.

60
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Tableau 19 : analyse microbiologique d’un prélèvement urétral et sites complémentaires :

Sites de Support de Eléments ou germes recherchés Examens effectués


prélèvement prélèvement

A l’anse Polynucléaires Un frottis coloré au bleu de


bactériologique Diplocoques en grains de café méthylène
Canal urétral intra et / ou extracellulaires un frottis coloré au gram
A l’anse Neisseria gonorrhoeae culture :
bactériologique  1 chocolat + 1% polyvitex
 1 milieu de Thayer Martin
 Incuber sous CO2 à 37 °C +
humidité pendant 24 h.

Germes banals (staph, Strepto, 1 GSF incuber sous CO2 à 37°C 24 h


BGN...)

1 écouvillon Ureaplasma urealyticum Ecouvillon dans milieu A3 (voir P42 1-2-3)

Cellules urétrales 1 cytobrosse Chlamydia trachomatis Voir paragraphe 1-2-4

Autres prélèvements : Neisseria gonorrhoeae Etalement du culot de centrifugation sur :


 1 gélose chocolat + 1% polyvitex
 1 milieu de THAYER MARTIN
Incuber 48 h sous CO2 + humidité à 37 °.

1er jet d’urine


Trichomonas vaginalis  Etat frais et examen à x40
 Frottis coloré au MGG
 Culture sur milieu de Diamond
Mycoplasmes Culot de centrifugation dans le milieu A3 (P
42 paragraphe 1-2-3)
 Neisseria gonorrhoeae Culture de sperme à l’état pur et dilué au
Spermoculture  Mycoplasmes 1/100ème (voir P 52)
 Germes banals
 Levures
Gélose chocolat + polyvitex et milieu de
Pharynx/Anus (écouvillon) Neisseria gonorrhoeae THAYER MARTIN incuber 48 h sous CO2
+ humidité à 37°C.

61
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

II-Chez la femme
1-Prélèvements cervico-vaginaux :
1-1-Généralités :
Nous réceptionnons pour chaque patient 7 écouvillons simples + 1 écouvillon type cytobrosse
(cytobrush).

Les 7 écouvillons sont étiquetés comme suit :

3 « endocol », 3 « cul de sac postérieur », 1 « vaginal ».

Endocol :
Les 3 écouvillons sont repartis comme suit :

1 écouvillon pour confectionner 2 frottis colorés au bleu de méthylène et au gram

1 écouvillon pour ensemencer

 1 gélose chocolat + 1 % de polyvitex à incuber 48 h sous CO2 à 37°C.


 1 gélose de Thayer-Martin à incuber sous CO2 à 37°C.
 1 gélose MH + sang humain à incuber 48 h sous CO2 à 37°C.
 1 gélose Sabauraud + Chloramphénicol à incuber 3 j à 30°C.

1 écouvillon pour recherche de Mycoplasmes génitaux.

Cul de sac postérieur :


Les 3 écouvillons sont répartis comme suit :

1 écouvillon pour confectionner :

 2 frottis colorés au bleu de méthylène et au gram


 1 état frais (trichomonas vaginalis).

1 écouvillon pour ensemencer :

 1 gélose MH + sang humain à incuber 48 h sous CO2 à 37°C.


 1 gélose au sang frais à incuber 24h à 37°C.
 1 gélose au sang cuit à incuber 24h à 37°C.
 1 gélose Sabauraud + Chloramphénicol à incuber 3 j à 30°C.

1 écouvillon pour recherche de Mycoplasmes génitaux.

62
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Vagin :
L’écouvillon servira à :

Etat frais à la recherche de trichomonas vaginalis, de levures et de clue-cells.

Complété éventuellement par un frottis à colorer au MGG ainsi qu’une culture de Diamond et de
Roiron.

L’écouvillon de type cytobrosse sera réservé à la recherche de Chlamydia trachomatis.

63
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-2-Etat frais et colorations simples (gram et bleu) :


Endocol :
 Bleu : note l’abondance des leucocytes et des hématies ;
Vérifie la rareté des cellules épithéliales.
 Gram : recherche la présence de diplocoques gram(-) intra et/ou extra-leucocytaires :

La présence de plus de 10 PN/champ est une assez bonne indication de l’existence d’une cervicite
mucco-purulente, le plus souvent à N.gonorrhoeae et/ou chlamydia trachomatis

Cul de sac postérieur


Etat frais : recherche de Trichomonas vaginalis : apparait comme un élément plus grand qu’un PN,
plus petit qu’une cellule épithéliale, caractérisé par la mobilité de ses flagelles et le sautillement de sa
membrane ondulante sur un coté de l’organisme.

Recherche d’une mobilité en vol de moucheron (Mobiluncus).

Recherche de levures : cellules rondes à ovoïdes, de 4 um de diamètre, bourgeonnantes.

Bleu : note l’abondance des leucocytes, une flore vaginale normale renferme moins de 5 leucocytes
par champs.

Recherche la présence d’hématies, de cellules épithéliales et de Clue-cells.

Gram
Evalue l’équilibre de la flore vaginale : on classe les flores vaginales en 4 types :

Flore de type I : à prédominance lactobacillaire.

Flore de type II : Lactobacilles présents mais flore de substitution sans type morphologique
prédominant.

Flore de type III : lactobacilles rares et flore de substitution avec un type morphologique prédominant.

Flore type IV : lactobacilles absents, flore totalement substituée.

La cytologie vaginale est variable selon le stade du cycle menstruel. Ainsi on distingue :

 La période proliférative : qui se situe au milieu du cycle et durant laquelle les cellules
vaginales éliminées dans les leucorrhées sont nombreuses, à noyau pycnotique et acidophiles
alors que les polynucléaires y sont peu nombreux.
 La période sécrétoire : qui se situe avant les règles et durant laquelle les polynucléaires sont
éliminés en abondance et les cellules vaginales sont basales ou intermédiaires.

Permet de détecter certains agents pathogènes :

 Levures bourgeonnantes à gram positif avec filaments pseudo mycéliens.

64
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Cocci à gram négatif intracellulaire (Neisseria).


 Bacilles à gram négatif, incurvés en coup d’ongle.

Permet de détecter les Clue cells ou cellules indicatrices :

Ce sont des cellules vaginales desquamés, recouvertes de multitude de coccobacilles gram variable,
qui correspondent à Gardnerella vaginalis.

Cet aspect de clue cells s’accompagne d’une raréfaction en lactobacilles de la flore vaginale.

Vagin :
Etat frais sur une goutte de prélèvement avec une goutte d’eau physiologique. Mettre entre lame et
lamelle et examiner au microscope : recherche de T.vaginalis, levure et Clue cells.

65
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-3-Culture
Neisseria gonorrhoeae
 L’ensemencement se fait sur :
1 milieu enrichi : gélose chocolat + 1% de polyvitex.
1 milieu sélectif de Thayer Martin
 A noter que d’autres milieux équivalents peuvent être utilisés.
 L’incubation se fait à 37 °C, toujours en atmosphère humide contenant 5 à 10 % de CO2
(sachet générateur de CO2 ou jarre à bougie).
 La majorité des souches cultivent en 16 à 18 h, cependant les colonies peuvent être fines, une
deuxième lecture sera faite à la 4ème heure. A noter cependant que les techniques
s’identification seront pratiquées sur la culture la plus jeune possible.

Chlamydia trachomatis : voir paragraphe 1-2-4.

Mycoplasme hominis, mycoplasme genitalum et Ureaplasma urealyticum :


voir paragraphe 1-2-3.

Gardnerella vaginalis :
 L’isolement du germe par culture est facultatif puisque le diagnostic positif de vaginose à
G.vaginalis est posé par l’association de plusieurs critères (voir lecture en P.72)
 Cette bactérie donnant une beta hémolyse sur sang humain, on peut effectuer un isolement sur
gélose Columbia ou MH au sang humain frais.
 L’incubation se fait à 37°C sous 5 % CO2 pendant 48 h.

Germes banals :
 Ils englobent les streptocoques, les staphylocoques, les Haémophilus, les entérobactéries et
autres agents bactériens pathogènes non spécifiques.
 On ensemence une gélose base ou COLUMBIA avec 5% de sang frais et une gélose au sang
cuit (chocolat).
 L’incubation se fait à 37°C pendant 24 h en atmosphère enrichie de 5-10 % de CO2.

Mobiluncus sp :
Les 2 espèces M.curtesi et M.mulieris sont souvent retrouves dans les vaginoses, en association avec
des anaérobies .leur association avec des anaérobies .leur isolement se fait sur gélose COLUMBIA +
5% sang de cheval ou de mouton. L’incubation se fait en
anaérobiose pendant 3-5 j au minimum.

Levures :
on ensemence le milieu de sabauraud additionné de chloramphénicol, milieu gélosé incliné en tube
ainsi que le même milieu avec actidione. L’incubation se fait à 30°C pendant 72 h.

66
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Trichomonas vaginalis :
 La culture de ce parasite est la méthode de diagnostic actuellement la plus sensible. Les
milieux utilisés actuellement sont ceux de Diamond et de Roiron.
 La culture se fait mieux en anaérobiose, en 2-4 jours.

Tableau 20 : procédures techniques pour prélèvements cervico-vaginaux :

Sites de Nombre Germes recherchés Examens effectués


prélèvement d’écouvillons
Endocol
1 écouvillon Réservé aux examens directs  1 frottis coloré au bleu de
méthylène.
 1 frottis coloré au gram

1 écouvillon Ensemencer
 Neisseria gonorrhoeae  1 chocolat + 1% polyvitex
 Mycoplasmes  1 milieu de Thayer Martin
 Germes banals  1 gélose MH + Sang humain
 Levures  1 Sabauraud + Chloramphénicol.
 1 Sabauraud + CMP + Actidione.

1 écouvillon  Mycoplasmes génitaux Recherche et titrage de mycoplasmes (voir


P.42 paragraphe 1-2-3)

1 écouvillon  1 état frais


Réservé aux examens directs  1 frottis coloré au bleu de
méthylène.
 1 frottis coloré au gram
1 écouvillon Ensemencer
 Gardnerella v  1 gélose MH + Sang humain
 Germes banals  1 gélose au sang frais.
 Levures  1 gélose au sang cuit.
 1 Sabauraud + Chloramphénicol.
 1 Sabauraud + CMP + Actidione.

1 écouvillon  Mycoplasmes génitaux Recherche et titrage de mycoplasmes (voir


P.42 paragraphe 1-2-3)

Vagin 1 écouvillon  Trichomonas vaginalis  Etat frais + frottis coloré au MGG


 Culture sur milieu de Diamond et
Roiron.

Endocol Cytobrosse  Chlamydia trachomatis  Voir page 46 paragraphes 1-2-4.

67
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Prélèvements vulvaires :
Tableau 21 : analyse microbiologique de prélèvements vulvaires

Ecouvillons Germes recherchés Tests effectués incubation

1 écouvillon Flore lactobacillaire  1 frottis coloré au bleu de méthylène


Clue-cells  1 frottis coloré au gram …………………..
 1 état frais

1 écouvillon Neisseria gonorrhoeae  1 gélose chocolat +1% PVX  37°C 48h/5%CO2


+ humidité
 1 milieu de Thayer- martin  37°C 48h/5%CO2

Gardnerella vaginalis  1 gélose MH ou Columbia + sang 37°C 48h


humain
Germes banales  1 gélose au sang cuit 37°C 24 à 48h
 1 gélose au sang frais

1 écouvillon Levure  1 Sabauraud + Chloramphénicol. 30°C 72 h


 1 Sabauraud + CMP + Actidione.
1 écouvillon riche Chlamydia trachomatis  Voir paragraphes 1-2-4.
en cellules

1 écouvillon Mycoplasmes génitaux  (voir paragraphe 1-2-3)

Les examens directs renseignent très peu sur l’agent responsable de la vulvite.
Ils peuvent détecter : Trichomonas vaginalis, Levures bourgeonnantes.

3-Prélèvement à l’orifice de la glande de Bartholin :


Tableau 22 : Analyse microbiologique de pus de bartholinite

Germes recherchés Milieux ensemencés T°, durée et atmosphère d’incubation


Neisseria gonorrhoeae 1 gélose chocolat +1% PVX 37° 48H sous CO2
1 milieu de Thayer- martin 37° 48H sous CO2
H.influanzae Gélose au sang cuit 37° 24H sous CO2

Bactéries pyogènes Gélose au sang frais 37° 24H sous CO2


Bactéries anaérobies Columbia + sang frais 37° 2 à 5 j sous O2
Columbia + sang frais 37° 2 à 5 j sous O2

68
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

4-prélèvement du haut appareil génital chez la femme


4-1-prélèvement endo-utérins :
Sont indiqués dans l’endométrite, la salpingite et l’avortement septique.

Tableau 23 : analyse microbiologique d’un prélèvement endo-utérin :

Germes recherchés Milieux ensemencés T°, durée et atmosphère


d’incubation

Neisseria gonorrhoeae  1 gélose chocolat +1% PVX 37° 48H sous CO2
 1 milieu de Thayer- martin

Haemophilus spp  2 géloses TSA (ou Columbia) + 5 % de 37° 48 h


streptocoques A germes sang de cheval (frais et cuit)
banals

Bactéries anaérobies strictes  2 géloses Columbia + 5 % sang de  37 ° 2 à 5 j


mouton  1 boite en aérobiose
 1 boite en anaérobiose

4-2-Prélèvement sous cœlioscopie ou pus chirurgicaux :


Tableau 24 : analyse microbiologique de pus prélevé sous cœlioscopie :

Germes recherchés Milieux ensemencés T°, durée et atmosphère


d’incubation

Neisseria gonorrhoeae  1 gélose chocolat +1% PVX 37° 48H sous CO2
 1 milieu de Thayer- martin

Haemophilus spp streptocoques  2 géloses TSA (ou Columbia) + 5 % 37° 24 à 48 h


A germes banals de sang de cheval.

Bactéries anaérobies strictes


 2 géloses Columbia + 5 % sang de  37 ° 2 à 5 j
mouton  1 boite en aérobiose
 Enrichissement sur TGY bouillon ou  1 boite en anaérobiose
sur milieu Schaedler + Vit K3  37 °C 2 à 5 j en
anaérobiose

Mycoplasmes génitaux (voir P.42 paragraphe 1-2-3)

Chlamydia trachomatis Voir page 46 paragraphes 1-2-4.

69
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

4-3-Recherche d’une tuberculose génitale :


Technique ancienne, peu sensible : c’est la recherche de BK dans le sang menstruel :

Effectuer 4 à 6 écouvillons au niveau de l’endocol.

Décontaminer comme suit :

 Introduire 6.4 ml d’une solution de NAOH 6 % dans chaque écouvillon


 Laisser agir 10 mn
 Neutraliser avec 3.6 ml d’une solution d’HCL à 4 %.
 Mettre immédiatement chaque écouvillon en culture sur Lowenstein Jensen.

Recherche de BK dans une Biopsie de l’endomètre ou le liquide péritonéal

(Voir fascicule tuberculose).

EN RESUME
Tableau 25 : Tableau récapitulatif des germes incriminés dans les infections génitales
féminines :

Germes recherchés Milieux ensemencés T°, durée et atmosphère


d’incubation
Neisseria gonorrhoeae 37° 48H sous CO2 +
 1 gélose chocolat +1% PVX humidité
 1 milieu de Thayer- martin
Gardnerella vaginalis 37°C 48h
 1 gélose MH ou Columbia + sang humain

Germes banales
 1 gélose au sang cuit 37°C 24 à 48h atmosphère ordinaire
 1 gélose au sang frais
Mobiluncus sp et  Columbia + 5 % sang frais  37 ° 2 à 5 j
bactéries anaérobies  1 boite en aérobiose
strictes  1 boite en anaérobiose

Levure  1 Sabauraud + Chloramphénicol. 30°C 72 h atmosphère ordinaire


 1 Sabauraud + CMP + Actidione.

Mycoplasmes génitaux (voir P.42 paragraphe 1-2-3)

Chlamydia trachomatis Voir page 46 paragraphes 1-2-4.

70
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-Ulcérations et chancres génitaux :


I-Chancre syphilitique :
La syphilis est une MST dot la manifestation génitale est l’apparition, 10 jours à 3 mois après contact
infectant, d’un chancre primaire à la porte d’entrée du germe, en général la muqueuse génitale.

L’agent Treponema pallidum, est détectable au niveau du chancre grâce au microscope a fond noir.

La période d’installation du chancre, de 2 à 5 semaines, est appelée syphilis primaire.

Les autres étapes de la maladie non traitée, ne s’accompagnent pas de manifestations génitales
(syphilis latente, secondaire et tertiaire).

La détection des anticorps sériques est une étape obligatoire dans le diagnostic de cette maladie et les
techniques mises à la disposition des laboratoires différent par leur sensibilité et leurs spécificités.

1-Examen au microscope à fond noir :


Le matériel :
 Microscope à fond noir : dans ce type de microscope, « seuls les rayons lumineux tangentiels
à l’organisme ou aux particules, entrent sous un angle oblique dans l’objectif du microscope
en donnant à ces particules un aspect brillant sur fond noir.
Le microscope doit être placé de préférence dans une chambre noire
 Lames dégraissées dans un bain acide-alcool.
 Lamelles.
 Huiles à immersion.
 Gaze.
 Eau physiologique.
 Anse bactériologique.

Observation de l’échantillon :
 Mettre quelques gouttes d’huile à immersion sur le condenseur d’un microscope à fond noir
préalablement réglé.
 Placer la lame (avec la préparation) sur la platine et amener le condenseur jusqu'à ce qu’il y ait
contact entre la goutte d’huile et la face inferieure de lame. Ne pas mettre d’huile sur la
lamelle.
 Eviter soigneusement la formation de bulles d’air dans l’huile, à la face inferieur de la lame.
 La mise au point sur l’échantillon se fait à l’objectif X10.
 Régler la lumière a son maximum (vis latérale placée dans le condensateur) puis régler le
condenseur en montant ou descendant jusqu’à l’obtention du plus petit diamètre de lumière.
 Examiner à l’objectif X 40 à sec la totalité de la lame.
 Treponema pallidum est un micro-organisme caractérisé par une morphologie, une taille et des
mouvements évocateurs. Il est fin (0.25 um-0.30 um de diamètre) , mesurant 5 à 20 um de

71
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

long, avec 6 à 14 spires réguliers d’amplitude identique. Il est doué d’une mobilité en « tire-
bouchon » associée à un mouvement d’ondulation vers la moitié du corps. Contrairement à cet
agent, les autres spirochètes atypiques sont plus épais et plus courts avec une spire lâche et une
mobilité différente.

Interprétation :
 La présence de tréponèmes de morphologie et de mobilité caractéristiques de l’espèce
pallidum constitue un diagnostic positif de la syphilis primo-secondaire.
 Un examen négatif au microscope à fond noir n’exclue pas le diagnostic de syphilis.

Les causes en seraient :


 Une antibiothérapie préalable ;
 Un nombre insuffisant de micro-organismes dans la lésion (sensibilité < 50 %) ;
 Un chancre en voie de cicatrisation ;
 Un chancre d’autre étiologie ;

Quelque soit le résultat de l’examen au microscope à fond noir, une sérologie de la syphilis est
obligatoire (voir paragraphe sérologie).

2-Examen par immunofluorescence directe : (34)


Le diagnostic de syphilis peut aussi se faire par immunofluorescence directe à l’aide d’un anticorps
anti-treponema marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine :

 On confectionne un frottis sur lame pour IF, à partir de la sérosité du chancre ;


 La préparation sur lame est séchée à l’air ;
 Fixer à l’acétone et au méthanol ;
 Recouvrir la préparation de globuline anti –T Pallidum marquée à la fluorescéine ;
 Incuber à 37°C en chambre humide ;
 Laver à l’eau distillée ;
 Examiner au microscope à fluorescence : T pallidum apparait fluorescent
 Sensibilité et spécificité supérieure à l’examen à l’état frais.

3-Méthode de coloration (voir annexe B) :


Elles sont applicables aux spirochètes en général. Ce sont la coloration de Giemsa, la coloration de
Vago et l’imprégnation argentique de Fontana-Tribondeau.

72
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

II-Chancre Mou :
L’agent du chancre mou, Haemophilus ducreyi, présente des exigences nutritives complexes imposant
la préparation de milieux de culture très riches.

Le diagnostic de certitude en est difficile, d’autant que l’examen microscopique de frottis du chancre
n’est pas d’une grande aide.

1-Examens directs :
A partir des prélèvements, on confectionne 3 frottis sur lame pour la coloration au bleu de méthylène,
au gram et au Giemsa.

Le bacille de ducreyi apparait comme un bacille à gram négatif, trapu, à bouts arrondis, à coloration
bipolaire. Les bacilles apparaissent groupés en bancs de poisson, les longues chainettes étant rarement
observées.

Les prélèvements doivent être mis en culture immédiatement (donc dés leur obtention) et l’incubation
doit être faite sous CO2.

2-Milieux de culture :
On utilise en parallèle :

Deux milieux solides : 1 gélose base GC enrichie et 1 gélose chocolat à base de milieu MH enrichi de
sérum de veau fœtal

Un milieu liquide : du sérum de veau fœtal.

On procède comme suit :

5 milieux sont ensemencés pour chaque patient :

 2 milieux non sélectifs : gélose base GC enrichie et gélose chocolat enrichie.


 2 milieux sélectifs : MH + Vancomycine et GC base + Vancomycine.
 1 milieu liquide fait de sérum de veau fœtal.

Les milieux gélosé sont incubés 48 à 72 h avant la 1ère lecture.

Le sérum de veau fœtal est incubé 24 h avant la 1ère lecture.

L’incubation se fait en atmosphère microaérophiles, humidifiée, à une température comprise entre 33°
et 35°C.

Le CO2 peut être fourni par :

 La méthode de la cloche à bougie.


 Le sachet Gaspack générateur de CO2.
 L’étuve à CO2.
 La culture avec Gaspack sans catalyseur.

73
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

L’humidité est produite par un tampon de coton imbibé d’eau physiologique.

La durée d’incubation des cultures est d’au moins 48 h avant la lecture. Si aucune culture n’est
décelée, il faut conserver les boites 5 jours avant de les considérer comme négatives.

Après 24 h, on examine le milieu liquide : un précipité blanc granuleux au fond du tube est prélevé à
l’aide d’une pipette pasteur et étalé sur une lame puis coloré au bleu de méthylène et au gram.

Les bacilles de ducreyi apparaissent disposés sous forme de chaines de vélo.

On ensemence alors les milieux solides à partir de cet enrichissement. Le milieu liquide est réexaminé
après 48 h.

III-Donovanose :
1-Examens directs :
 Le frottis sur lame du prélèvement est coloré à la coloration de Leishman :
 Recouvrir la lame avec le colorant de leishman pendant 7 à 10 mn ;
 Eliminer le colorant par lavage à l’eau courante ou au PBS (PH 7.0-7.2) et recouvrir d’eau
pendant 2 ou 3 mn.
 Sécher à l’air chaud ;
 Lecture : on détecte des coccobacilles dans les vacuoles cytoplasmiques à l’intérieur de
certaines cellules mononuclées.
« Les bactéries colorés ressemblent à des épingles de sureté fermés »

2-Diagnostic bactériologique
Il n’existe pas de technique d’isolement de cet agent, ni de technique valable de sérologie.

74
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

IV-Ulcérations herpétiques :
1-Diagnostic par IFD :
Equipements et réactifs :
 Microscope à fluorescence
 Lame pour immunofluorescence.
 Acétone.
 Anticorps monoclonaux HSV1 et HSV2 conjugués à la fluorescéine.
 PBS—Eau distillée ---liquide de montage.

Mode opératoire :
 Le prélèvement est immédiatement appliqué sur 2 alvéoles d’une lame pour IF.
 Fixer à l’acétone.
 Si le prélèvement a été plongé dans un milieu de transport , on centrifuge pour concentrer les
cellules en suspension (500 tours/ mn pendant 5 mn) puis on étale les culots sur 2 alvéoles
d’une lame pour IF et on fixe à l’acétone.
 Ajouter 1 goutte d’anticorps monoclonal anti – HSV 1 dans l’alvéole 1.
 Ajouter 1 goutte d’anticorps monoclonal anti – HSV 2 dans l’alvéole 2.
 Incuber 30 mn à 36 °C en chambre humide.
 Laver 3x dans le PBS pendant 10 mn à chaque fois.
 Rincer dans l’eau distillée pendant 2 mn.
 Laisser sécher- monter avec un liquide de montage (50 % glycérol – 50 % PBS).
 Examiner à la recherche d’une immunofluorescence intracellulaire.

Lecture :
 Si (+) : coloration vert pomme fluorescente des cellules positives.
 Si (-) : coloration rouge orangée des cellules négatives.

N.B : on peut utiliser un anticorps monoclonal reconnaissant les antigènes communs à HSV1 et
HSV2, ce qui permet de détecter seulement le frottis qui contient de l’Hérpesvirus.

2- Diagnostic par immuno-peroxydase :


 Préparer l’échantillon comme pour une IFD.
 Mettre un anticorps polyclonal anti-HSV ou des anticorps monoclonaux anti-HSV1 et anti-
HSV1
 Incuber 45 mn à 36 °C et laver
 Ajouter un anticorps anti-globine de lapin et anti-globine de lapin ou anti-globine de souris
marqué à la peroxydase de Raifort.
 Incuber 45 mn à 36 °C.
 Laver

75
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Traiter à la diamiobenzidine.
 Observer au microscope ordinaire : la présence de granules brun rouge signe un résultat
positif. (Sensibilité et spécificité similaire à celles de l’IFD)

3-Diagnostic par ELISA classique :


Avec capture de l’antigène : le fond des puits d’une plaque de micro titrage est recouvert d’anticorps
polyclonal anti-HSV.

 On dépose l’échantillon dans les puits.


 On procède à un lavage.
 On ajoute l’anticorps monoclonal de souris marqué à la biotine.
 On rajoute le conjugué streptavidine-peroxydase de Ralfort puis le substrat chromogène.

Avec amplification du complexe antigène-anticorps :

 Le fond du puit est recouvert d’anticorps monoclonal de souris


 On ajoute l’échantillon.
 On ajoute un conjugué à la phosphatase alcaline : l’antigène est immobilisé.
 L’enzyme est mise en présence du substrat.
 Le produit est traité par un amplificateur d’où réaction colorée.

4-Diagnostic après culture


Lignées cellulaires utilisées : ce sont :
 Les cellules diploïdes de rein humain.
 Les fibroblastes de poumon embryonnaire humain.
 Les cellules VERO (rein de singe).

Réactifs :
 Milieu de culture (annexe)
 Solution tampon (PBS + 5% SVF).

Mode opératoire :
 Les cellules sont cultivées jusqu’à obtenir une monocouche cellulaire dans les tubes pour
culture de tissus.
 Retirer le milieu de culture et inoculer 2 tubes par échantillon de prélèvement (0.25 ml de
prélèvement mélangé au Vortex).
 Laisser 1 h d’absorption à 36° C en position horizontale.
 Ajouter 2 ml de milieu complet (+ 2% SVF) par tube.
 Incuber à 36 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2.
 Examiner les tubes au microscope stéréoscopique tous les jours pendant 7 jours à la recherche
d’un ECP.

76
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Lecture
On note la présence de cellules arrondies qui se détachent en grappes du support, avec un aspect
réfringent. Des foyers de nécrose cellulaire peuvent s’observer avec, en bordure, les cellules multi
nucléés (syncitia) »

Typage des isolements d’HSV :


 Rejeter le milieu des tubes ;
 Ajouter 1 ml de solution tampon (PBS + 5 % de SVF) ;
 Gratter les cellules puis centrifuger la suspension cellulaire 5 mn à 500g ;
 Déposer 1 goutte du culot dans 2 alvéoles d’une lame pour IF.
 Sécher à l’air ;
 Fixer dans l’acétone à -20 °C pendant 10 mn ;
 1 alvéole + Ac monoclonal anti-HSV1 ; alvéole + Ac monoclonal anti-HSV2 ;
 Incuber 30 mn à T° ambiante en chambre humide ;
 Laver 3 x 5 mn au PBS (agitation mécanique) ;
NB : on peut utiliser un anticorps monoclonal reconnaissant les antigènes communs à HSV1 et
HSV2, ce qui permet de détecter seulement les cellules infectés par l’Hérpesvirus.
 Monter avec le liquide de montage (50 % glycérol : 50 % PBS) et une lamelle ;
 Examiner au microscope à fluorescence au grossissement x400.

C- Autres manifestations d’infection génitale :


I-papillomes, condylomes et autres infections génitales
à HPV :
 Un frottis coloré à la coloration de PAPANICOULAOU permet de diagnostiquer les
néoplasies cervicales mais est peu sensible pour détecter une infection cervicale à HPV peu ou
asymptomatique.
 La détection d’antigène des sérotypes les plus courants de HPV (HPV-6 ,HPV-16 et HPV-18)
se fait par technique IFD ou immuno-enzymatique à l’aide d’anticorps monoclonaux marqués
respectivement à l’isothiocyanate de Fluorescéine et à la PAL ou à la peroxydase de Raifort.
 A noter que ces techniques manquent de sensibilité et de spécificité.
 La seule méthode fiable pour mettre en évidence et typer une infection HPV est l’hybridation
de l’acide nucléique. L’apparition en est réservée aux laboratoires de recherche.

II-Dermatose de la sphère génitale :


Elles sont de diagnostic essentiellement clinique, complété éventuellement par des examens
mycologiques. (Intertrigo mycosique).

77
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

D-tests de diagnostic rapide :


Certains tests pratiqués sur les prélèvements génitaux permettent de poser le diagnostic positif avant
les résultats des cultures, souvent laborieuses et longues.

I-frottis de pus urétral chez l’homme, coloré au gram :


Diplocoque à gram (-) en «grain de café » intra et / ou extra-leucocytaire = urétrite gonococcique.

II-détection des antigènes gonococciques par technique


immuno-enzymatique de type ELISA :
Exemple : GONOZYME ABBOTT

 Avantage : rapidité (4 h).


 Hautement sensible et spécifique.
 Inconvénient : non applicable aux échantillons extra-génitaux.
 Ne permet pas d’évaluer l’antibio-résistance.
 Cette technique ELISA a été améliorée dans la durée du test (2h30) et la sensibilité par
l’utilisation d’anticorps monoclonaux.

III-confirmation immunologique d’une culture de


N.gonorrhoeae sur gélose sélective d’isolement :
 Elle utilise des anticorps monoclonaux ;
 Elle n’exige pas une purification préalable de la souche ;
 Elle est hautement sensible et spécifique.
 Elle se fait par réaction de fluorescence, de coagglutination ou enzymatique ;
 Elle est applicable aux prélèvements extra-génitaux (33).

IV-le diagnostic de vaginose bactérienne à Gardnerella


vaginalis :
Peut être posé seulement par l’examen microscopique d’un frottis d’écoulement vaginal, montrant un
aspect de clue cells.

Ce critère de diagnostic est accessible aux pays sous développés, ou la culture reste ainsi
facultative.(23).

En général, on peut poser le diagnostic de vaginose à Gardnerella vaginalis si 3 critères des 4 suivants
sont respectés :

 PH vaginal > = 4.5.

78
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Test à la potasse positif : on dépose 1 goutte d’hydroxyde de potassium (KOH) à 10 % , sur


des secrétions vaginales (aspirés à la pipette plastique ou prélevés à la spatule), il se dégage
alors une odeur d’amine (ou de poisson).
 Ecoulement abondant avec disparition des lactobacilles.
 Présence de Clue-cells au gram.

V-Diagnostic d’une trichomonase vaginalis :


L’examen d’une goutte de leucorrhée entre lame et lamelle à l’objectif x 40 montre une mobilité
caractéristique de trichomonas vaginalis.

VI-Diagnostic d’une mycose vaginale :


L’examen à l’état frais d’un fragment de pertes caillebottées montre de nombreuses levures
bourgeonnantes avec filaments pseudo-mycéliens, au sein d’une forte réaction inflammatoire : mycose
vulvo-vaginale.

VII-Détection des antigènes de chlamydia trachomatis


Dans un frottis de prélèvement vaginal par IFD à l’anticorps monoclonal (p.65) ou par la méthode
immuno-enzymatique rapide à partir d’un prélèvement endo-cervical ou endo-utérin :

Pour cette dernière, on distingue 3 méthodes dans le commerce : (33)

1-Surecell Chlamydia Test :


 Détecte les LPS spécifiques d’espèce de Chlamydia, qui sont extraits au moyen de solutions
fournies par le fabriquant.
 Fixés sur une membrane, ils sont traités à l’anticorps monoclonal marqué à la péroxydase.
 Il y’a virage de couleur ;
 Application : P. cervicaux, P. urétraux, urines, œil.

2-Clearview chlamydia test (21) :


 Extraction des LPS chlamydiens à l’aide d’une solution tampon à 80 °C ;
 Mélange : extrait LPX + particules de latex sensibilisées aux anticorps monoclonaux anti-LPS.
 Migration du complexe extrait-latex par capillarité sur une bandelette, vers une zone linéaire
ou sont immobilisés d’autres anticorps monoclonaux anti chlamydia.
 Si l’extrait renferme des chlamydias, une ligne apparait, traduisant la liaison du complexe AC-
AG chlamydiens avec l’anticorps anti-chlamydia ;
 Test simple (1h) , appliqué exclusivement aux prélèvements endo-cervicaux

3-Test pack Chlamydia (33) :


 Extraction des LPS chlamydiens ;
 Immobilisation sur un disque (+ réactif) qui sera traité par un anticorps anti-chlamydia
 Virage au rouge (+), pas de virage au rouge (-) ;

79
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Application exclusive aux prélèvements endo-cervicaux.

VIII-détection de cellules d’une lésion infectée par


l’HSV :
On peut aussi utiliser la méthode ELISA rapide , moins sensible que la méthode ELISA classique :

 Extraire l’antigène de l’HSV à l’aide d’un tampon ;


 Mettre l’extrait sur un dispositif fourni par un fabriquant ;
 L’antigène est immobilisé sur une membrane ;
 Traiter à l’anticorps monoclonal anti-HSV + peroxydase + substrat ;
 Lecture : tache colorée sur membrane.

80
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre IV : LECTURE ET DISCUSSION


A-Ecoulements génitaux :
I-Chez l’homme :
L’examen direct :
D’un frottis d’écoulement urétral coloré au gram, montrant des diplocoques à gram – en grains de café
intra et/ou extra leucocytaires, suffit à poser le diagnostic d’urétrite gonococcique.

La culture
De N gonorrhoeae permet cependant de procéder à la recherche immédiate d’une pénicillinase et de
préconiser ou de contre indiquer la prescription d’une pénicilline.

Si l’urétrite n’est pas gonococcique :


Il faut effectuer une recherche étiologique complète des agents pathogènes spécifiques (chlamydia
trachomatis, trichomonas vaginalis) et commensaux (Ureaplasma urealyticum, levures).
Ne pas oublier la possibilité d’une urétrite par vésicule herpétique intra-canalaire.

En cas d’urétrite chronique :


L’écoulement est souvent discret et séreux : la présence de plus de 5 leucocytes par champ au
grossissement x 1000 évoque une urétrite.

L’analyse microbiologique de l’écoulement aboutit souvent à la culture de bactéries commensales ou


saprophytes d’incrimination délicate. On se base sur le critère de culture abondante et monomorphe de
tels agents.

Pour trancher entre le diagnostic d’urétrite gonococcique et


celui de prostatite :
Si le problème se pose, on se base sur la numération bactérienne de 4 spécimens ( 3 d’urine et 1 de
sécrétion prostatiques) prélevés par la méthode de STAMEY :

VB1 : 1er jet urinaire VB2 : Milieu du jet.

EPS : sécrétion prostatiques per-massage prostatique.

Interprétation : (16)

81
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Si VB2 stérile VB1 supérieur à VB3 (d’1log) : Urétrite antérieure

VB1 très inférieur à VB3 Prostatite

VB1=VB3 :c’est la numération de l’EPS qui permet de trancher entre urétrite et


prostatite :
 EPS supérieur à VB1 : prostatite aigue
 EPS inferieur à VB1 : urétrite

Si VB2 supérieur à On administre au patient Nitrofurantoin 100 mg toutes les 6 h ou Peni orale 250 mg
10 bact/ml toutes les 6 h.
(ces antibiotiques ne diffusent pas dans la prostate donc ne modifient pas la
numération microbienne dans l’EPS).
sous ce traitement antibiotique , on refait la procédure de prélèvement avec culture
immédiate des échantillons EPS et VB3.
puisque les urines sont cette fois stérilisées par l’antibiotique, la présence de
bactéries dans EPS et VB3 même à faible concentration signe la prostatite
bactérienne.

La spermoculture :
La culture de sperme non dilué recherche des agents microbiens que l’on incrimine facilement :
gonocoque, Gardnerella, levures, mycoplasmes à condition que le protocole de prélèvement soit
correctement suivi et qu’il y’ai corrélation avec l’examen direct.

La culture de sperme dilué au 1/100permet d’incriminer un agent de la flore locale (staph, strepto,
entérobactéries…). Les chiffres relevés dans la littérature sont variables : la plupart des auteurs
préconisent un seuil de positivité de 3000 à 5000 germes totaux par ml de germe.(30)

82
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

II-Chez la femme :
La culture des boites de culture doit se faire en passant en revue :

 Les données cliniques


 Les données des examens microscopiques
 La nature de pathogène strict ou opportuniste du ou des agents isolés.

1-On doit retrouver une corrélation entre les signes cliniques,


les examens microscopiques et les cultures.
2-L’incrimination du ou des agents isolés dépend étroitement
de la nature du pathogène strict ou opportuniste de ce ou ces
agents.
On distingue plusieurs situations :

2-1-L’agent isolé est un pathogène strict :


Sa présence ne peut être mise sur le compte d’une contamination endogène (par la flore vaginale) ou
exogène (souillure de laboratoire)

Une infection associant plusieurs pathogènes stricts n’est pas exclue (gonocoque+Gardnerella
vaginalis)

Ces agents sont :

 Neisseria gonorrhoeae.
 Trichomonas vaginalis
 Chlamydia trachomatis

2-2-L’agent isolé est un pathogène opportuniste.


Il peut exister en portage dans la flore génitale.

2 situations :

A- On l’incrimine à partir d’un seuil de 10 UFC/ml de sécrétion génitale :


C’est le cas de Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalum et Ureaplasma Urealyticum.

B- On, l’incrimine devant une association de 3 signes cliniques sur 4 :


 Leucorrhée homogène et grisâtre.
 Test à la potasse positif (Sniff Test).
 PH vaginal > 4.5
 « Clue-cells » à l’examen direct à l’état frais

83
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

C’est le cas de Gardnerella vaginalis.

Cette bactérie peut également être incriminée simplement par l’examen


microscopique, après coloration de gram, d’un frottis du prélèvement

Dans ce cas, on quantifie les différents morphotypes bactériens observés


(lactobacilles, Gardnerella, prevotella, Mobiluncus). Le score du frottis (ou Nugent)
est obtenu en pratiquant la somme des scores des différents morphotypes bactériens. Il
va de 1 à 10 et permet de distinguer la flore vaginale en 3 groupes :

Groupe I (score compris entre 0 et 3) : flore normale flore lactobacillaire


prédominante.

Groupe II (score compris entre 4 et 6) : flore intermédiaire lactobacilles peu


abondants : association avec d’autres morphotypes en quantité relativement limitée :
flore vaginale altérée mais n’est pas en faveur d’une vaginose bactérienne.

Groupe II (score compris entre 7 et 10) : Disparition des lactobacilles remplacés par
une flore monomorphe composée d’innombrables petits bacilles à gram négatif ou à
gram variable avec présence de Clue-cells :flore évocatrice de vaginose bactérienne.

2-3-l’agent isolé est un commensal de la flore vaginale :


2 situations :

A- A la faveur d’un déséquilibre de la flore vaginale, motivé par la prise d’antibiotique,


l’utilisation de cosmétique ou de tampon intra-vaginal, le port d’un stérilet ou encore
un diabète, cet agent se retrouve largement prédominant dans la flore et peut examiner
son pouvoir pathogène : c’est le cas des entérobactéries, staphylocoques,
streptocoques, Haemophilus, ainsi que les levures genre Candida.

B- En raison d’une grossesse en cours, certains agents de la flore vaginale sont


potentiellement dangereux pour le nouveau né qu’ils exposent au risque de méningite
purulente ou de septicémie néonatale : c’est le cas de streptococcus B et de Listeria
monocytogenes,2 germes dont il faut détecter le portage chez la femme enceinte.

Dans une vaginite à bactérie pathogène opportuniste (BPO), le tableau clinique est souvent
évocateur : les leucorrhées sont épaisses et jaunâtres et des signes urinaires sont fréquemment
associés. Le frottis de pertes montre une forte réaction inflammatoire, la disparition des
lactobacilles et la présence presque exclusive de l’agent.

On exige a la culture une nette prédominance quantitative de la bactérie suspectée.

Pour ce qui concerne Staphylococcus aureus, il aurait été incriminé dans des tableaux de choc
toxique chez la femme utilisant des tampons intra vaginaux contaminés. (10).

84
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-4-la place des anaérobies stricts :


Dans la vaginite non spécifique, les bactéries anaérobies strictes seraient souvent associées à
Gardnerella vaginalis. Ce sont entre autres.

Peptococcus perotii, peptococcus asacharolyticus, Bacteroides bivius, bacteroides


capillosus.(10).

Leur rôle est évoqué par :

 L’odeur aminée caractéristique de poisson pourri, libéré au sniff test et évoquant la


présence d’anaérobies.
 L’augmentation de leur concentration dans les secrétions vaginales (prouvée par la
chromatographie en gaz liquide des secrétions vaginales)
 La guérison sous Metronidazol, antibiotique agissant essentiellement sur les
anaérobies stricts.

Dans les infections sur stérilet, dont l’actinomycose utérine représente le tableau le plus
insidieux et le plus grave (évolution vers l’abcès tubo-ovarien), la présence d’un sterilet, un
écoulement vaginal malodorant avec douleurs au bas ventre, une fièvre et à l’examen direct
des leucorrhées, des amas de bacilles à gram positif, filamenteux et rigides, plus ou moins
ramifiés, évoquent fortement le diagnostic. (10)

2-5-Leucorrhées non infectieuses :


On retrouve :

A l’examen direct :

 De très nombreuses cellules épithéliales


 Des polynucléaires assez nombreux
 De très nombreux lactobacilles

A la culture : la présence presque exclusive de lactobacilles (10).

Scores bactériologiques selon Nugent et col (28)

Score Lactobacilles spp Gardnerella et Mobiluncus


Bacteroides
0 ++++ 0 0

1 +++ + +/++

2 ++ ++ +++/++
3 + +++
4 0 ++++

85
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-ulcérations et chancres génitaux dans les 2


sexes :
Le diagnostique différentiel passe par l’ensemble des tests identifiant les agents microbiens incriminés
dans ce type de lésion (voir le diagnostic des différents agents)

On peut avoir une association de plusieurs infections au niveau d’une ulcération génitale.

La démarche systématique consistera en :

 Une sérologie syphilitique et un examen au microscope à fond noir.


 Une culture pour recherche d’H ducreyi
 Un examen de frottis d’ulcération par IFD pour recherche d’HSV ;
 Un examen microscopique pour recherche de Donovanose.

Tableau 26 : éléments d’orientation clinique face à une ulcération :

Etiologie Aspect Induration Douleur Adénopathies Signes Diagnostic


inguinales généraux positif

Syphilis Erosion cartonnée non multiples, rares au examen


T.pallidum (quelques indolores, stade microscopique
Incubation 21 j mm à 2 mobiles primaire au microscope
à 3 mois cm) à fond noir
sérologie
syphilitique

Chancre mou pustule rare oui unilatérales, rares frottis coloré


H ducreyi ulcération douloureuses au gram, bleu,
incubation 3 j à bubon pouvant Giemsa
10 j fistuliser.

LGV papule rare oui uni ou bilatérales fréquents IFD


C.trachomatis vésicule douloureuses Culture
L1, L2, L3 ulcération pouvant fistuliser cellulaire
incuba= 3 à 12 j sérologie

Donovanose Bourgeons ferme non non non frottis coloré


C.granulomatis charnus au MGG
incuba= 1 à 3 ulcères
mois

86
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre V : tests d’identification


microbienne :
A-Neisseria gonorrhoeae
Gélose chocolat + polyvitex et milieu de Thayer martin : repérer les colonies oxydase +,suspectes :
fines, grises à blanches, transparentes à opaques, convexes à plates , cultivant en 24H mais plus
grosses (3mm) en 48 h avec souvent différents morphotypes et ne poussant pas sur GN.

Confirmer par une galerie d’identification :

Du genre Neisseria :

 Coccis en diplocoques à gram négatif.


 Oxydase positive, catalase positive
 Aérobie stricte.

D’espèce gonorrhoeae :

 Pas de culture sur GN


 Tests de fermentation sucrée : (voir méthodes en Annexe B) : Glucose (+)-Maltose (-)-
Fructose(-)-Saccharose(-).
 Nitrate réductase (-)
 ONPG (-)
 Glu-Amp (-) Pro-Amp (-)

Rechercher une Béta-lactamase par le test du trèfle (29)

B-Gardnerella vaginalis :
Gélose base riche (Columbia ou MH) + 5 % sang humain frais : repérer les colonies de petites taille,
bombées, luisantes et régulières, béta-hémolytique, cultivant en 48 h, ne poussant pas sur GN.

Faire une galerie d’identification

 Gram : coccobacilles à gram négatif, fins et courts, très proches des corynebacteries.
 Oxydase (-), catalase(-).
 Aéro-anaerobie.
 Test à l’hippurate +
 Sensible au SPS, sensible au métronidazole à 50 ug.
 Résistant à la colistine 10 ug.
 Compléter la galerie par Api 20 STREP, API ZYM.
 Identification par IFD sur colonies, avec comme conjugué, un anticorps polyclonal anti-
Gardnerella vaginalis adsorbé sur corynebacterium sp et lactobacillus sp : Test rapide, sensible
(95 %) mais peu spécifique.

87
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

C-Streptococcus agalactiae et listeria


monocytogenes :
Gélose au sang frais : repérer les petites colonies hémolytiques et faire l’identification.

Streptococcus B :
 Cocci à gram + en chainettes
 Catalase (-)
 Camp test (+)
 Sérogroupe B de Lancefield.

Listeria
 Bacille à gram +, asporulé
 Mobile à 28 °C, immobile à 37°C.
 Oxydase (-)
 Catalase (+).
 Aéro-anaerobie facultatif.
 NR (-).
 VP(+) et RM(+)
 Esculine (+).

D-Candida Albicans :
 Sabauraud + chloramphénicol : repérer les colonies blanches, crémeuses de Candida.
 Test de filamentation : les levures bourgeonnent en présence de sérum humain en 3 h à 37°C
(voir Annexe B).
 Chlamydosporulation : les levures forment des chlamydospores sur milieu PCB incubé une
nuit à 30°C.
 Ces 2 tests confirment le diagnostic d’espèce Albicans.
 S’ils sont négatifs, on procède à l’identification d’espèce par la galerie biochimique ou
Auxanogramme.

E-Haemophilus ducreyi :
Gélose GC enrichie ou gélose chocolat enrichie : les colonies sont jeunes grisatres, surélevées,
granulaires et glissant le long de la gélose à l’anse. Elles sont polymorphes et donnent l’impression
d’une culture contaminée.

L’identification passe par les tests suivants : (voir mode opératoire en Annexe B)

 Oxydase (+) sur Chlorhydrate de TMPD.


 Réduction des nitrates (+).

88
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Exigence en hémine : par le test à la porphyrine.


 PAL (+).
 Catalase (-), Indole (-), Uréase (-).

F-Mobiluncus :
 Gélose au sang incubée 4 jours en anaérobiose à 37°C : on repère les colonies petites
translucides.
 Identification : bacilles à gram négatif plus ou moins incurvés, anaérobies strictes, mobiles
oxydase (-) catalase (-).

89
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre VI : Tests de sensibilité aux


antimicrobiens
Les tests de sensibilité seront exposés de façon exhaustive dans le fascicule « technique d’étude de
l’activité des antibiotiques in vitro et in vivo » en cours de rédaction et qui devra paraitre dans la
même série « techniques microbiologiques ».

Le fascicule « standardisation de l’antibiogramme à l’échelle nationale selon les recommandations de


l’OMS, édition 2001 » décrit les différentes techniques de l’antibiogramme appliquée aux
streptocoques, staphylocoques, haémophilus, entérobactéries, ainsi qu’à Neisseria gonorrhoeae. (9)

A-Cas des Mycoplasmes : (3.4.26)

« Les conditions habituelles de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques ne sont pas applicables
aux mycoplasmes. Leurs exigences nutritionnelles et surtout la très petite taille de leurs colonies font
que les méthodes de diffusion en gélose ne peuvent être utilisées.

L’étude des concentrations minimales inhibitrices (CMI) représente la méthode de référence


inapplicable en pratique quotidienne.

Il n’existe donc pas de techniques d’étude véritablement standardisées. »

On relève ainsi une extrême variabilité des CMI et pourcentages de résistance révélés dans la
littérature. (4)

I-principe :
La technique décrite ici, utilise des microplaques disponibles dans le commerce.

Il s’agit du système SIR MYCOPLASMA, antibiogramme des mycoplasmes urogénitaux (diagnostic


pasteur) qui a pour principe l’inhibition métabolique.

La croissance des mycoplasmes étant révélée par leur activité métabolique qui conduit à
l’alcalinisation du milieu de culture, le milieu vire au rouge (alcalin) si le germe est résistant à
l’antibiotique testé et il reste jaune si le germe est sensible.

II-Mode opératoire :
La miniplaque comprend 02 rangées de 8 cupules dans lesquelles sont déposés les différents
antibiotiques qui sont réhydratés au moment de la distribution de l’inoculum.

Les concentrations d’antibiotiques dans les cupules étant voisines des concentrations critiques, on peut
classer les souches testées en sensible, intermédiaire ou résistante pour chaque antibiotique. (4).

90
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

1-Les antibiotiques :
Choisis sont ceux habituellement actifs contre les mycoplasmes :

 Témoin de croissance sans antibiotique.


 Doxycycline : 4 et 8 mg/l.
 Minocycline : 4 et 8 mg/l.
 Lymecycline : 4 et 8 mg/l.
 Josamycine : 2 et 8 mg/l.
 Erythromycine : 1 et 4 mg/l.
 Clindamycine : 2 mg/l.
 Pristinamycine : 2 mg/l.
 Ofloxacine : 1 et 4 mg/l.

SCHEMA DE LA MINIPLAQUE

O O Tc TC
DIAGNOSTICS PASTEUR
S.I.R MYCOPLASMA

O O DO4 DO8

Date :……………………………..
M.hominis
U.ureaplasma
PATIENT REF
O O MNO4 MNO8

O O LM4 LM8

O O JM4 JM8

O O E1 E4

O O CM2 PT2

O O OFX1 OFX4

91
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Standardisation de l’inoculum
Pour obtenir l’inoculum de 10 à 10 UCC/ml, on fait une préculture du milieu de transport
ensemencé avec le prélèvement. Cette incubation pendant 16 à 20 h à 37°C conduit à une
multiplication des mycoplasmes jusqu'à un titre maximum de 10 à 10 UCC/ml.

Une dilution au 1/100 de cette culture permet d’obtenir un inoculum calibré

On dilue

 Pour U urealyticum : 20 ul de bouillon enrichi, dans 2 ml du milieu de Shepard ou U9.


 Pour M hominis : 20 ul de bouillon enrichi, dans 2 ml du milieu de Hayflick ou M42.

3-Distribution de l’inoculum :
 Distribuer 100 ul (3 gouttes de pipette pasteur) dans chaque cupule de la plaque SIR
MYCOPLASMA ;

 Recouvrir 2 gouttes d’huile de paraffine (ou de vaseline) et mettre à incuber à 37° C pendant
24-48 h.

III-Lecture :
L’interprétation de l’antibiogramme se fait dés que les cupules témoins de la croissance (Tc) virent du
jaune au rouge.

Une lecture à 48 h permet de déceler les résistances à faible niveau :

 Cupule jaune →sensible


 Cupule rouge→ résistant
 Cupule à faible concentration = rouge Et cupule à forte concentration = jaune→ Intermédiaire

NB : pour clindamycine et Pristinamycine (une seule concentration), 2 réponses seulement sont


possible : sensible ou résistant.

92
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-Cas d’Haemophilus ducreyi


On utilise la technique de détermination des CMI par méthode des dilutions en milieu solide (33).

Le milieu utilisé est le MH enrichi de 5 % de sang de cheval laqué, 0.1 % de glucose, 0.01 % de
glutamine et de 0.025 % de L-cystéine.

Un autre milieu plus simple et mieux adapté est le milieu MH (ou GC) + 1% d’hémoglobine + 5 % de
sérum de veau fœtal + 1 % Supplément HD (voir composition en annexe B).

I-Antibiotiques à tester :
Sulfamethoxazol et Triméthoprim, seuls et en association.

 Tétracycline ;
 Chloramphénicol ;
 Erythromycine ;
 Streptomycine ;
 Ciprofloxacine ;
 Ceftriaxone ou Cefotaxime.

II-Inoculum :
Il est préparé dans du TSB pour obtenir 10 UFC/ml (Préparation d’une suspension correspondant à
l’étalon 0.5 de l’échelle Mc Farland puis dilution dans le TSB au 1/10).

III-Mode opératoire et lecture :


Les étapes du mode opératoire et l’interprétation des CMI sont identiques à celles décrites pour les
bactéries courantes (9.32).

93
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre VII-Les sérologies


A-La sérologie syphilitique : (22,33)

I-Principe : on distingue 2 sortes de réactions sérologiques :


1-des réactions non tréponèmiques: c'est-à-dire utilisant comme antigène la
cardiolipine et détectant des anticorps de type IgG et IgM anti-lipides formées très précocement en
cours d’infection en réponse au matériel lipidique provenant des tissus infectés et de la paroi cellulaire
des tréponèmes. Ces réactions sont :

 VDRL: VENERAL DISEASE RESEARCH LABORATORY, test à lecture microscopique.


 RPR : RAPID PLASMA REAGIN, test à lecture macroscopique.

Elles sont presque identiques sur les plans sensibilité et spécificité.

2-des réactions tréponèmiques : c'est-à-dire utilisant comme antigène, treponema


pallidum. Ces réactions sont :

 TPI : treponema pallidum Immobilisation ou Test de Nelson : technique de référence,


couteuse et non applicable dans les laboratoires de routine.
 FTA-Abs : réaction d’immunofluorescence absorbée.
 MHA-TP ou TPHA : réaction de microhémagglutination ou Treponema pallidum
hémagglutination Assay.

94
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

II-techniques :
1-la technique VDRL :
1-1-Matériel et réactifs :
 Sérum frais ou sérum inactivé ou plasma.
 Eau physiologique.
 Solution tamponnée à pH6.
 Antigène VDRL : stable, conservable en suspension colloïdale pendant 12 mois donc prêt à
l’emploi. Il est gardé au réfrigérateur (3 à 10°C) mais il doit être ramené à la température du
laboratoire 30 mn avant son utilisation.
 Lames de verre avec zones circulaires creusées dans l’épaisseur du verre.
 Agitateur de plaques avec minuterie.
 Microscope optique à fond clair avec objectif au grossissement x 100.

1-2-Mode opératoire :
1ère Etape : Réaction qualitative :
 Distribuer 50 ul de sérum ou plasma sur une zone circulaire de la lame de verre.
 Ajouter 12 ul d’antigène prêt à l’emploi, réchauffé à température ambiante.
 Placer la plaque sur agitateur pendant 6 mn.
 Lire immédiatement au microscope avec objectif sec.
 Prévoir dans chaque série un témoin positif connu et un témoin antigène ou l’eau
physiologique remplace le sérum du malade.

2ème étape : réaction quantitative :


 Préparer des dilutions de sérum au ½,¼, 1/8,1/16,1/32…… avec de l’eau physiologique.
 Pratiquer la réaction sur chaque dilution du sérum.
 Noter la dilution la plus élevée donnant une réaction positive.

1-3-Lecture et interprétation :
 La lecture se fait au microscope (x100).
 Elle est facilitée par l’addition de charbon ou de particules de latex , ce qui donne des
agglutinations colorées.
 Le titre des anticorps anti-Tréponema est l’inverse de la plus forte dilution donnant une
agglutination.

95
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Technique RPR :
2-1-Matériel et réactifs :
« RPR Card Kit « : il renferme

 La suspension d’antigène.
 Une aiguille calibrée (0.9 mm)
 Une bouteille de plastique distribuant l’antigène.
 Des cartes plastifiées avec des cercles gravés.
 Des pipettes plastiques jetables pour 50 ul de volume.
 Bâtonnets de bois ou de plastique.

Appareil rotatif (100 tours/mn) avec minuterie.

Solution saline.

Un sérum non réactif pour syphilis.

2-2-Mode opératoire
Test qualitatif :
 Déposer à la pipette 50 ul de sérum dans un cercle de la carte, en étalant la goutte sur a totalité
du cercle avec l’autre bout de la pipette ou avec un bâtonnet. Utiliser une pipette et un
bâtonnet neufs à chaque échantillon.
 Laisser tomber une seule goutte (50 ul) de la suspension d’antigène sur le cercle-ne pas agiter.
 Placer la carte (10 tests par carte) sur l’appareil rotatif sous un couvercle contenant un
morceau de coton mouillé (humidificateur).
 Faire tourner le temps indiqué par le fabricant.
 Lire à l’œil nu sous une source de lumière, immédiatement après la rotation en faisant tourner
et basculer la carte.
 Noter les résultats :
Positifs : agglutination petites ou grandes (floculation)
Négatif : pas d’agglutination ou très faible rugosité
 Titrer les sérums positifs.

Test qualitatif :
 Pour chaque sérum à tester, utiliser 5 cercles de la carte (une rangée).
 Déposer 50 ul de solution saline dans les cercles 2, 3, 4,5 et ne pas étaler.
 Déposer 50 ul d sérum dans les cercles 1 et 2.
 Mélanger la solution saline et le sérum dans le cercle 2 en faisant aller et venir 5 ou 6 fois le
mélange dans une pipette. Eviter les bulles.
 Transférer 50 ul du cercle 2 (dilution ½) au cercle 3 et mélanger puis transférer 50 ul du
cercle 3 (¼) au cercle 4 et mélanger puis transférer 50 ul du cercle 4 (1/8) au cercle 5 (1/16),
mélanger et rejeter 50 ul.

96
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 A l’aide d’un bâtonnet, étaler la plus haute dilution (cercle 5) jusqu’au bord du cercle. Avec
le même bâtonnet, effectuer la même manipulation dans les cercles 4.3.2 et 1.
 Laisser tomber une seule goutte de suspension antigénique par cercle pour les 5 cercles
1.2.3.4.5.
 Placer la carte sur le dispositif rotatif sous un couvercle avec un humidificateur et faire
tourner le temps indiqué par le fabricant.
 Lire les réactions à l’œil nu sous une source de lumière.
 Noter la plus haute dilution une réactivité.
 Si la dilution 1/16 est toujours réactive, continuer le test comme suit :

 Préparer une dilution du sérum au 1/16ème :100 ul de sérum sont additionnées à 1.5 ml de
solution saline. Mélanger
 Déposer 50 ul de sérum non réactif dans les cercles 2, 3,4 et 5 d’une carte.
 Déposer 50 ul de la dilution 1/16 du sérum dans les cercles 1 et 2
 Mélanger dans le cercle 2 en évitant les bulles.
 Transférer 50 ul du cercle 2 (dilution 1/32) au cercle 3 et mélanger transférer 50 ul du
cercle 3 (1/64) au cercle 4 (1/128) et mélanger. Transférer 50 ul du cercle 4 (1/128) au
cercle 5 (1/256). Mélanger et rejeter 50 ul.
 Etaler jusqu’au bord du cercle et avec le même bâtonnet, en partant du cercle 5 au
cecle1.
 Lâcher 1 goutte par cercle de suspension antigénique pour les 5 cercles 1.2.3.4.5.
 Placer la carte sur un dispositif rotatif sous un couvercle avec humidificateur et faire
tourner le temps indiqué par le fabriquant.
 Lire les réactions à l’œil nu sous une source de lumière immédiatement après la rotation
en faisant tourner et basculer la carte.
 Le titre d’anticorps est l’inverse de la plus haute dilution de sérum donnant une
agglutination.

97
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-le TPHA :
3-1-Matériel et réactifs :
Diluant d’absorption : mélange dans du PBS :

 D’ultrasonicat de membrane de GR de mouton ou de bœuf.


 D’extrait de testicule de lapin normal.
 D’ultrasonicat de tréponèmes souche de Reiter.
 De sérum de lapin normal.
 D’autres facteurs : en fonction du fabricant.

Ce diluant est utilisé pour absorber les sérums des malades et pour réparer les dilutions de travail des
GR sensibilisées et non sensibilisées.

 Globules rouges sensibilisées (lyophilisées) : suspension à 2.5 % de GR de mouton, tannées,


formolés, sensibilisées par un ultrasonicat de treponema pallidum.
 Globules rouges non sensibilisées (lyophilisées) : suspension à 2.5 % de GR de mouton,
tannées, formolés, non sensibilisées++ par un ultrasonicat de treponema pallidum.
 Un sérum témoin positif (lyophilisé) : on le réhydrate avec 1 ml de diluant de reconstitution.
 Le titre de ce témoin ne doit pas varier d’une dilution (en plus ou en moins) par rapport au titre
établi par le commerçant.
 Une pipette compte gouttes calibrée à 25 ul par goutte (ou une P 25) et une P100.
 Microplaque de 96 puits, en plastique à fond en U.

3-2-Mode opératoire :
Réaction qualitative :
Déposer pour chacun des sérums à tester 25 ul de diluant d’absorption dans les puits 1.3.4 et 5 de la
rangée correspondante et 100 ul dans le puit 2.

 Ajouter 25 ul de sérum dans le puit 1 (dilution ½).


 Mélanger et transférer 25 ul du puit 1 dans le puit 2 (dilution 1/10)
 Mélanger et transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 4 (dilution 1/20)
 Mélanger et transférer 25 ul du puit 4 dans le puit 5 (dilution 1/40)
 Changer d’embout et transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 3 (1/20) mélanger et rejeter 25 ul
du puit 3.
 Faire la même procédure pour chaque sérum du malade
 Couvrir la plaque de micro-titrage et incuber 30 mn à T° ambiante.
 Additionner des hématies :
 Préparer les dilutions de travail des hématies sensibilisées et non sensibilisées :
 1 volume de suspension de GR + 5.5 volumes de diluant adsorbant (dilution 1/6.5)
 Ajouter 75 ul de GR non sensibilisées dans tous les puits n°3 de la plaque.
 Ajouter 75 ul de GR sensibilisées dans tous les puits n°4 et n°5 de la plaque.
Dilution finale (puits 3 et 4) = 1/80
Dilution finale (puits 5) = 1/160

98
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Puits 1 2 3 4 5
Diluant d’absorption (ul) 25 100 25 25 25
Sérum du patient 25 25 - 25 25

- - 25 - -
Recouvrir la microplaque incuber 30 mn à température ambiante
GR non sensibilisés (ul) - - 75 - -
GR sensibilisés (ul) - - - 75 75

Témoin négatif :
1 puits : 25 ul de diluant absorbant + 75 ul de suspension de GR sensibilisées.

1 puit : 25 ul de diluant absorbant + 75 ul de suspension de GR non sensibilisées.

Diluant d’absorption (ul) 25 25


GR sensibilisées (ul) 75 -

GR non sensibilisées (ul) - 75

Témoin Positif :
 Porter 25 ul de diluant absorbant dans les 5 puits d’une rangée
 Ajouter 25 ul de sérum témoin réhydraté (1/80) dans le puit 1 (1/160)
 Mélanger et transferer 25 ul du puit 1 dans le puit 2 (1/320) ,puis du puit 2 dans le puit 3 (1/640)
puis du puit 3 dans le puit 4 (1/1280) puis du puit 4 dans le puit 5 (1/2560).
 Ajouter 75 ul de suspension de GR sensibilisées dans les 5 puits

Les dilutions finales du témoin (+) sont : 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5210 et 1/10240.

Puits 1 2 3 4 5

Diluant d’absorption (ul) 25 25 25 25 25

Contrôle positif (ul) au 1/80ème 25 25 25 25 25

Diluant du contrôle positif 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560


GR sensibilisées (ul) 75 75 75 75 75
Dilutions finales 1/640 1/1280 1/2560 1/5210 1/10240

Agiter la plaque avec précaution

99
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Couvrir d’un papier adhésif

Incuber à température ambiante pendant au moins 2 h jusqu'à 24 h.

La lecture :
Se fait à l’œil nu : on détecte l’aspect du dépôt constitué de GR.

 Résultat négatif : absence d’hémagglutination : on observe un point rouge, bien limité au fond de
la cupule.
 Résultat positif : aspect d’hémagglutination : on note un léger voile rose au centre de la cupule
avec un contour plus foncé.
 Résultat douteux : les GR sédimentent en formant un halot au centre de la cupule et un contour
granuleux en périphérie.

Interprétation :
Sérum positif hémagglutination avec hématies sensibilisées et absence d’hémagglutination avec
hématies non sensibilisées.

Sérum négatif absence d’hémagglutination avec GR sensibilisées et GR non sensibilisées.

Résultat douteux refaire le test

Hémagglutination avec GR non sensibilisées refaire le test après absorption avec diluant
d’hémadsorption si le problème persiste : faire FTA abs.

100
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Réaction quantitative :
 Porter 25 ul de diluant dans les puits 1 et 3 à 10 d’une même rangée de plaque.
 Porter 100 ul dans le puit 2.
 Ajouter 25 ul de sérum dans le puit 1 (1/2).
 Mélanger et transférer 25 ul du puit 1 dans le puit 2 (1/10)
 Mélanger et transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 4 (1/20).
 Faire de même dans les puits restants et rejeter 25 ul du puit 10
 Changer d’embout : transférer 25 ul du puit 2 dans le puit 3 (1/20),mélanger et rejeter 25 ul du
puit 3.
 Incuber la plaque 30 mn à la T° ambiante.
 Ajouter 75 ul de suspension de GR non sensibilisées dans le puit 3 et 75 ul de suspension de
GR sensibilisées dans les puits 4 à 10.
Les dilutions finales vont de 1/8 à 1/5120.
Les témoins positif et négatif sont traités de la même façon que dans la réaction qualitative.

Puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluant d’absorption 25 100 25 25 25 25 25 25 25 25
(ul)
Sérum du malade 25 25 25 25 25 25 25 25 25
(ul)
Dilutions du sérum 1/2 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
du malade
25
(1/20)
Incuber la
INCUBER LA PLAQUE A LA TEMPERATURE AMBIANTE PENDANT AU MOINS 30 mn plaque à T°
ambiante au
moins 30 mn
GR non sensibilisées 75
(1/80)
GR sensibilisées 75 75 75 75 75 75 75 (1/5120)
(1/80) (1/160) (1/320) (1/640) (1/1280) (1/2560)

 Agiter la plaque avec précaution


 Couvrir d’un papier adhésif
 Incuber à température ambiante pendant au moins 2 h , jusqu’à 24 h.
 Témoin positif et négatif : procéder de la même façon que pour la réaction qualitative.

Lecture :
Les résultats correspondant à la plus haute dilution du sérum donnant une réaction positive.

101
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

4-FTA-Abs ou réaction d’Immunofluorescence Absorbée :


4-1-Matériel et réactif :
 Une étuve réglée à 35-36°C.
 Un microscope à fluorescence.
 Un bain marie réglé à 56°C.
 Des lames pour examens microscopiques à fluorescence avec 10 alvéoles ou 16 alvéoles.
 Des lames 25 mm X 60 mm.
 Pipette automatique réglable de 25 à 100 ul.

4-2-Réactifs :
Antigène Treponema pallidum : suspension lyophilisée de Tréponema pallidum (souche Nichols).

La suspension est réhydratée et mélangée au vortex. On distribue 20 ul de la suspension dans les


alvéoles d la lame.

On laisse sécher à l’air pendant au moins 5 mn.

On fixe la lame dans l’acétone pendant 10 mn et on laisse sécher à l’air. Ces lames peuvent ainsi être
conservées ainsi à -20°C ou, à la plus basse température , enveloppées dans du papier aluminium.

A noter que les lames prêtes à l’emploi (avec antigène préfixé) sont disponibles dan le commerce.

Réactif absorbant : suspension de treponema souche Reiter obtenue par culture, présentée sous forme
lyophilisée ou à l’état liquide.

Conjugué : globuline anti-humaine conjuguée à la fluorescéine, anti-IgG, A, M : dont le titre doit être
confirmé au laboratoire.

Il est conservé en aliquotes de 0.3 ou 0.4 ml à -20°C au moins.

Liquide de montage : 1 volume de PBS pour 9 volumes de Glycérine.

Sérum témoin positif : dans chaque série, il faut introduire un témoin (+) ou mieux 2 témoins (+).

Fortement (+) : fluorescence intense à la dilution ai 1/5e dans le PBS ou le liquide d’absorption.

Limite ou faiblement (+) : fluorescence faible à la dilution préconisée.

4-3-Mode opératoire :
 Chauffer les témoins et les sérums des malades à 56 °C pendant 30 mn.
 Diluer chaque sérum au 1/5e dans du liquide d’absorption (25 ul de sérum dans 100 ul de
liquide d’absorption, dans les puits d’une microplaque).
 Bien mélanger.
 Distribuer 30 ml de chaque sérum dilué (malades et témoins) dans les alvéoles de lames.
 Ajouter 30 ul de PBS dans une des alvéoles et 30 ul de liquide d’absorption dans un autre
(témoin(-)).

102
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Mettre les lames dans une chambre humide et incuber à 35-36°C pendant 30 mn.
 Plonger les lames dans un bain de PBS et rincer pendant 5 mn-répéter le rinçage plusieurs fois
en renouvelant le PBS.
 Rincer les lames dans l’eau distillée.
 Faire sécher délicatement en tamponnant les lames avec du papier filtre.
 Diluer le conjugué dans le PBS et distribuer 30 ul dans chaque alvéole.
 Incuber et rincer comme précédemment ;
 Déposer quelques gouttes du liquide de montage sur la lame et recouvrir d’une lamelle de
même taille ;
 Examiner les lames immédiatement au microscope à fluorescence en commençant d’abord par
les témoins (+).

4-4-Interprétation :
On interprète comme suit :

 Négatif : on n’observe pas de fluorescence.


 Douteux : une légère fluorescence est visible mais moins intense que celle du témoin faible.
 1+ : intensité de fluorescence modérée, inférieure à celle du témoin fort.
 2+ et 3+ : intensité de fluorescence modérée, inferieure à celle du témoin fort ;
 4+ : forte fluorescence, équivalente ou supérieure à celle du témoin fort.

103
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

5-Technique détectant les IgM :


5-1-FTA-Abs IgM 19 S :
On sépare les IgM des IgG par :

 Filtration sur gel


 Ultracentrifugation ;
 Chromatographie d’affinité ;
 Autres techniques : ex : utilisation du 2 mercaptoEthanol ;
Apres, séparation, l’activité des anticorps de fraction 19S IgM est mesurée par la méthode
FTA-Abs.
Cette technique a l’avantage d’une haute spécificité mais a l’inconvénient de sa difficulté.

5-2-Méthode d’hémadsorption des IgM en phase solide :


(IgM solide phase hémadsorption Assay SPHA): (DIAGAST).

 Un anticorps monoclonal anti IgM est fixé dans les puits d’une plaque de microtitration;
 Le sérum du patient dilué de façon appropriée (1/25) est ajouté à ces puits ;
 Incubation ;
 Puis on ajoute dans les puits les GR de mouton sensibilisées à un antigène purifié extrait de
Treponema pallidum ;
 Lecture : sérum positif hémagglutination.

5-3-Réaction de capture immuno-enzymatique des IgM


(merciaDiagnostics) :
Anticorps de lapin anti-IgM, fixé sur la surface interne des puits d’une microplaque ;

Le sérum du patient dilué de façon approprié (1/50) est ajouté à ces puits ;

Incubation ;

Révélation par l’addition dans les puits d’un mélange :

« Antigène purifié de Treponema pallidum-anticorps monoclonal-complexe streptavidine-


peroxydase »

Le complexe formé est détecté par réaction colorée qui se produit en présence du substrat
tetraméthylbenzine : coloration bleu+/- intense en fonction de la quantité des IgM anti-Treponema
sériques.

104
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

III-Interprétation des tests sérologiques : (22)


La recherche de la syphilis doit comporter au moins une réaction qualitative de chacun des 2 groupes
(réactions non spécifiques et réactions spécifiques) , le plus souvent VDRL et TPHA.

Si l’une des réactions ou les 2, sont positives, elles seront quantifiées et éventuellement complétées par
des tests de confirmation.

Les situations classiques observées sont :

 VDRL (-) TPHA (-) : Syphilis exclue sauf contamination récente.


 VDRL (+) TPHA (+) : Syphilis récente ou ancienne prouvée par d’autres tests
IgM (+) : syphilis primaire ou secondaire.
IgM (-) : syphilis latente ou évoluant vers le stade tertiaire.
 VDRL (-) TPHA (+) : cicatrice sérologique probable (faire autres tests :TPI, FTA-Abs et
IgM).
 VDRL (+) TPHA (-) : Faire absolument les autres réactions (TPI et FTA-Abs il peut s’agir de
fausses réactions positives (grossesse, maladies auto-immune)

105
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

B-Sérologie de Chlamydia trachomatis : (21,32,33)

1-Par IFI :
1-1-principe :
On détecte les IgG, IgA ou IgM spécifiques anti-Chlamydia trachomatis en mettant en contact le
sérum du patient avec un antigène spécifique de Chlamydia trachomatis.

Le complexe antigène est révélé par une anti-immunoglobuline G,A ou M fluorescente.

1-2-Equipements et réactifs :
Lame avec antigène préfixé :

L’antigène correspond à 1 sérovar donné de chlamydia trachomatis


Il peut être préparé :
A partir de sacs vitellins d’œufs de poule embryonné ;
A partir d’une culture cellulaire.
L’antigène préparé puis traité, est fixé sous forme de spot sur la lame.
Certains laboratoires commercialisent des lames prêtes à l’emploi.

Sérum du patient : décanté puis décomplémenté 30 mn à 56 °C , conservé 2 jours à +4°C ou congelé à


-20 °C.

PBS

Anti-Ig humaine totale marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine, diluée au demi dans du Glycérol
bi-distillé et conservé à +4°C.

Microplaque stérile

Embouts stériles et micropipettes

Etuve réglée à 37°C.

Microscope à épifluorescence.

1-3-Technique :
 Diluer le sérum du malade de demi en demi dans du PBS ;
 Déposer une goutte de chaque dilution sur chaque spot d’une lame sèche.
 Commencer le dépôt des spots à partir de la dilution 1/128ème .
 Incuber la lame 30 mn à 37°C en chambre humide ;
 Laver 2 fois pendant 5 mn à chaque fois, au PBS.
 Déposer, sans sécher, une goutte d’anti-Ig humaine totale marquée à l’isothiocyanate de
fluorescéine, après dilution au 1/100ème dans du PBS + bleu d’Evans (1/10000e).
 Incuber 30 mn à 37°C en chambre humide.

106
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

 Laver 2 fois pendant 5 mn à chaque fois, au PBS.


 Lecture au microscope à fluorescence.

NB pour toutes les Ig à détecter, les incubations sont effectuées à 37°C sauf pour les IgM (température
du laboratoire).

1-4-Lecture et interprétation :
Spot positif : inclusions intra-cytoplasmiques fluorescentes ou CE fluorescents parfaitement ronds et
réguliers.

Titre d’anticorps obtenu :

IgG : titre significatif :

 Supérieur à 32 dans les urétrites.


 Supérieur à 64 dans les cervicites.
 Supérieur à 128 dans les salpingites.

IgA et IgM spécifiques :

Très fugaces.

 Persistent 1 à 2 mois après le début de l’infection.


 Rarement observé dans les infections localisées (urétrite, cervicite).
 Recherché dans les infections pelviennes.
 Eliminer d’abord un éventuel facteur rhumatoïde.
 Titre > = 8 mais à confirmer (2ème prélèvement).
 Nouveau né : IgM (+) implique « infection ».
 IgM (-) et IgG = 4 X le titre maternel implique « infection ».

1-5-Facteurs interférant sur la sensibilité et la spécificité de la


technique :
Sur la sensibilité : les congélations/décongélations répétées altèrent les IgM. Garder les sérums à
+4°C. Après le test, les congeler.

Sur la spécificité :

 Bruit de fond fluorescent.


 Spécificité des conjugués IgG et surtout IgM : a tester sur des sérums de référence.
 Présence de FR sérique ou d’anticorps anti-nucléaires : faux positifs en IgM ;
 Réactions croisées avec chlamydia pneumoniae.

107
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-Par immunoperoxydase : IPAZYMEChlamydia :


2-1-Principe : l’antigène se présente sous forme d’inclusions intracellulaire, dans des cellules
fixées sur les spots d’une lame pour immunofluorescence.

Les IgG, IgA ou IgM sont détectées par le biais d’une immunoperoxydase.

2-2-Equipements et réactifs :
 Lame avec cellules infectées (souche de chlamydia trachomatis L2) préfixées en spots
 Sérum du patient
 Tampon PBS.
 Anti-IgG, IgM ou IgA marquée à la peroxydase (conjugué).
 Substrat chromogène.
 Microscope photonique objectif x20.

2-3-Technique :
1ère étape :

 Diluer le sérum du malade de ½ en ½ dans du PBS.


 Déposer une goutte de chaque dilution sur chaque spot.
 Incuber 45 mn à 37°C.
 Laver la lame au tampon PBS.
 Sécher doucement sur papier absorbant.

2ème étape :

 Recouvrir les spots de conjugué.


 Incuber 45 mn à 37°C.
 Laver.

3ème étape :

 Ajouter le substrat chromogène : 15 mn à T° ambiante.


 Laver.

2-4-Lecture et interprétation :
 Monter la lame avec liquide de montage.
 Lire au microscope photonique objectif x20
 Interprétation : Réaction (+) si précipité bleu à bleu intense dans la cellule infectée.
Interprétation identique à celle de l’IFI.

108
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

2-5-facteurs interférant sur la sensibilité et la spécificité de la


technique :
Sur la spécificité :

 Présence d’anticorps anti-nucléaires ;


 Présence d’anticorps anti-mitochondries ;
 Réaction croisées avec anticorps anti-chlamydia psittaci et anti-Acinetobacter calcoaceticus.

109
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

3-Par méthode ELISA :


3-1-Principe :
Les anticorps spécifiques sont détectés par contact avec un antigène chlamydien fixé sur un support, le
plus souvent le fond des cupules des plaques de microtitration avec barrettes amovibles ou peignes.

Les complexes antigène-anticorps sont révélés par un anti-Ig marqué à l’enzyme.

3-2-Mode opératoire :
L’enzyme utilisée est la phosphatase alcaline.

Elle est utilisée dans tous les tests actuellement commercialisés.

Ces tests différent par :

 La durée du test (de 1 h à 1h30).


 La spécificité d’espèce des anticorps détectés.
 La spécificité de genre des anticorps détectés.

3-3-Lecture et interprétation :
 Visuellement par comparaison d’une intensité de coloration des échantillons avec un
calibrateur (Kit immunocombs EIA).
 Au spectrophotomètre.

3-4-Sensibilité et spécificité :
 Cas d’une sérologie précoce : Elisa moins sensible que IFI
 ELISA ne détecterait pas les anticorps correspondants à certains sérovar de chlamydia
trachomatis.
 Réactions croisées avec anticorps anti C. pneumoniae.

110
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

C-Sérologie du virus herpétique :


1-Par IFI :
 Des cellules fibroblastiques humains ou des cellules VERO infectés avec HSV1 et HSV2 ,
sont déposées sur les alvéoles des lames pour IF et fixées à l’acétone.
 On dilue les sérums de malade de demi en demi.
 On distribue les différentes dilutions dans les alvéoles.
 On incube les lames 30 mn à 36 °C en chambre humide.
 On applique dans chaque alvéole une globuline de mouton ou de chèvre anti-humaine marqué
au fluorochrome ;
 On incube encore 30 mn à 36°C en chambre humide.
 On lave au tampon PBS et on rince à l’eau distillée.
 Apres séchage, monter avec un liquide de montage et examiner à la recherche d’une
fluorescence intracellulaire.
 Le titre d’anticorps anti-herpétiques correspond à l’inverse de la plus forte dilution de sérum
donnant une fluorescence intracellulaire.
 On utilise 2 sérums témoins positif et négatif, mis en présence de cellules infectées et non
infectées.

2-Autres techniques :
1. Technique immuno-enzymatique :
2. Technique de Western Blot :
3. Technique de neutralisation.

111
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Chapitre VIII
Limites des techniques utilisées-Nouvelles
techniques de diagnostic (6.13.17.28.32)

Une analyse microbiologique exhaustive de Actuellement, des trousses de détection par


prélèvements génitaux passe par la détection amplification génique ont été développées. Ont
de tous les agents microbiens susceptibles peut distinguer 3 systèmes parmi ceux
d’être incriminés dans les manifestations actuellement disponibles :
cliniques ayant motivé l’analyse. Cela exige du
laboratoire chargé d’effectuer ce type  COBAS Amplicor CT/NG (roche
d’examen de disposer d’équipements et de diagnostic system) : basé sur le
réactifs spécifiques et couteux, souvent hors de principe de la PCR.
portée des laboratoires polyvalents moins
spécialisés.  LCX Probe System (Abbott
Diagnostics Laboratory): base sur le
Afin de permettre a ces laboratoires de réaliser principe de la LCR (Ligase Chain
le diagnostic étiologique complet des Reaction)
affections génitales, il faut mettre à leur portée
des techniques plus simples, plus rapides et au  TMA Gen-probe System : Basé sur le
meilleur prix de revient. principe de la TMA (transcription-
mediated Amplification) c'est-à-dire
De plus elles devront être caractérisées par une l’amplification isotherme d’ARNr
sensibilité et une spécificité optimales que après action d’une reverse-
l’outil de biologie moléculaire semble transcriptase et d’une ARN
actuellement à même de satisfaire. polymérase.
Dans le cas des infections génitales à Ces techniques de Biologie moléculaire,
chlamydia trachomatis et à Neisseria hautement sensibles et spécifiques, trouvent
gonorrhoeae, des tests de détection des acides leur meilleur domaine d’application dans les
nucléiques à ces agents directement dans les échantillons tels les liquides articulaires, les
échantillons prélevés, ont été mis au point. tissus et le sperme.
Les prélèvements génitaux sont introduits dans Chez la femme, plusieurs évaluations des
u milieu de transport spécifique et peuvent être techniques de biologie moléculaire appliquées
conservés à +4°C pendant moins d’une au diagnostic de Chlamydia trachomatis ont
semaine. prouvé la supériorité de l’Amplicor CT par
rapport à la culture, avec une sensibilité de
On distingue comme technique :
95.5 % vs 86 % et une spécificité de 100 %
Le système Gen-Probe (USA) qui utilise le pour les 2 techniques.
principe de l’hybridation en milieu liquide à
A noter aussi une durée considérablement
l’aide d’une sonde complémentaire des ARNr.
réduite de l’analyse, limitée à 4-5 h seulement
(2).

112
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

En définitive, les nouvelles techniques de TEST » (Biomed Diagnostics, San José, CA).
détection appliquant l’outil de biologie C’est un milieu sélectif, fongicide et
moléculaire semblent plus sensibles et aussi bactéricide, enrichi de protéase-peptone. Il
plus spécifiques que la culture. détecte de l’ordre de 4 organismes /ml et peut
se conserver 1 an à T° ambiante. Ce test in
Elles ont l’avantage d’être utilisables dans les vitro a démontré des capacités uniques comme
urines, ce qui facilite l’acceptabilité des milieu de transport et de culture. Sa procédure
prélèvements lors des programmes de offre une grande simplicité d’application et de
dépistage. De plus, les résultats sont obtenus détection de ce parasite.
plus rapidement.
Par ailleurs des méthodes de diagnostic sans
Leur principal inconvénient reste leur cout culture ont été décrites. Elles mettent en
encore élevé, ce qui les limite à certains évidence l’antigène directement dans le
laboratoires seulement.(2.32) prélèvement génital par IF, agglutination Latex
et ELISA, avec une grande sensibilité (> 90 %)
Dans le cas des Uréthrites gonococciques, une
(6).
excellente détection des gonocoques serait
obtenue quand les prélèvements sont Les méthodes sans culture : différentes
ensemencés directement sur des systèmes avec méthodes sans culture peuvent être utilisées
incubation incorporée (self contained pour diagnostiquer les infections du tractus
incubation Systems) tels les JEMBEC génital, incluant les techniques sérologiques,
PLATES. l’agglutination au latex, les techniques
d’hybridation d’acide nucléique, les techniques
Le système JEMBEC , qui génère sa propre d’amplification et EIA.
atmosphère de CO2 par le biais de la tablette
de bicarbonate de Sodium incorporé, est Les vaginoses bactériennes (VB) incriminent
inoculé par une strie en « N ». La même de nombreux micro-organismes.
procédure est utilisée pour les levures,
streptococci et Mycoplasmes. Un des milieux A coté du gram, les VB peuvent être
gélosés utilisé est la gélose Columbia base diagnostiqués par une augmentation du rapport
+5% de sang de mouton + colistine + acide succinic/Lactic acid dans les sécrétions
nalidixique.(34) vaginales, détecté par la chromatographie Gaz
liquide Directe.
Pour prévenir le risque d’infection néonatale à
Streptococcus du groupe B , on en effectue un Actuellement une technique d’hybridation
dépistage chez la femme enceinte entre la 35ème (Affirm VPIII Microbial Identification
et la 37ème semaine de gestation. Test/Firme Becton Dickinson Microbiology
Systems) est disponible dans le commerce pour
Pour cela, un écouvillon de la zone péri-anale diagnostiquer la vaginose bactérienne, de
est roulé sur une gélose sélective (mélange Nal même que les infections du Tractus génital
+ colistine) puis plongé dans un bouillon causées par Candida spp et Trichomonas
d’enrichissement TODD HEWITT + sang + vaginalis.
Genta +Nal, à partir duquel on effectuera
ensuite des subcultures, à la recherche du La sensibilité et la spécificité de cette
streptocoque B. (13,17). technique sont intéressantes.

T.vaginalis peut être cultivé sur milieu de A partir d’un seul prélèvement et en 1 h. ce test
Diamond. Il existe cependant un test de différencie les 3 causes majeures de vaginite.
détection de ce parasite : le « INPOUCH TV

113
Techniques microbiologiques
BACTERIOLOGIE

Dans le diagnostic sérologique de la syphilis, l’acide nucléique d’H ducreyi sont


la technique du Western Blot met en évidence actuellement disponibles dans les laboratoires
des IgG ou des IgM anti –T pallidum par de recherche.
immuno-transfert.
Anticorps monoclonal marqué à la
Les antigènes de T.pallidum sont séparés par fluorescéine, permettant la mise en évidence
électrophorèses en gel et transfères sur feuille d’H ducreyi dans les prélèvements cliniques.
de Nitrocellulose. Cette technique est ensuite La fiabilité de la technique est encore en cours
découpée en bandes lesquelles seront incubées d’évaluation.
avec le sérum à tester.
Utilisation d’anticorps monoclonaux pour
Les anticorps sériques sont alors révélés après titrage radio-immunologique avec transfert :
traitement par un conjugué marqué par une application à la confirmation d’isolement d’H
enzyme. ducreyi par culture (en cours d’évaluation).

Une réaction positive consistera en la mise en PCR (à évaluer) (14.33)


évidence des anticorps dirigés contre au moins
3 sur 4 antigènes majeurs de T pallidum. (33) Dans le diagnostic biologique des infections à
papillomavirus, l’hybridation de l’acide
Diagnostic des infections herpétiques : des nucléique est la seule méthode fiable pour
techniques de biologie moléculaire, ont été détecter et typer une infection à HPV.
mise au point pour le diagnostic des infections
asymptomatiques à Hérpesvirus. Les techniques d’hybridations utilisées sont :

Elles pourront être utilisées chez les femmes  Technique de Southern : méthode de
enceintes asymptomatiques, contaminées juste référence.
avant l’accouchement de même que dans la  Hybridation in situ sur filtre.
surveillance des nouveaux nés exposés à  Hybridation par « Dot Blot ».
l’infection.
Actuellement, l’amplification par PCR, de
L’ADN viral est détecté directement par certaines séquences cibles de l’ADN fait
hybridation avec des sondes radio-marquées ou l’objet de travaux de recherche.(33)
marquées à la biotine. A noter cependant que
les techniques de PCR restent plus sensibles.
(33)

Dans le diagnostic du chancre mou, de


nouvelles techniques détectant l’antigène et

114
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Conclusion
Une analyse microbiologique correcte et fiable de prélèvements génitaux exige
la détection de tous les agents microbiens susceptibles d’être à l’origine des
symptômes de l’infection génitale.

Or les laboratoires qu’ils soient hospitaliers ou de ville, sont en majorité, peu


dotés, en matière d’équipements et de réactifs, pour satisfaire une telle exigence.

Ils se limitent en général, à la détection d’un ou deux agents pathogènes stricts,


ignorant les microorganismes qui nécessitent des techniques de diagnostic
particulières et couteuses.

Par ailleurs, ils incriminent de façon abusive des agents de la flore commensale
génitale, faciles à cultiver et qui n’ont souvent aucun rapport avec l’infection.

Il s’en suit une antibiothérapie inadéquate, loin d’être inoffensive.

De part sa complexité, l’analyse microbiologique de prélèvements génitaux reste


don un défi quotidien pour le laboratoire car sa fiabilité passe par la maitrise de
toutes les étapes techniques allant de la qualité du prélèvement à l’expression
des résultats.

115
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

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Techniques microbiologiques
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119
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

ANNEXE A

120
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

MILIEUX DE CULTURE ET TECHNIQUES


Neisseria gonorrhoeae :
Milieu de transport Amies :
formule pour 1 litre

 Charbon pharmaceutique neutre 10.0 g.


 Chlorure de sodium 3.0 g
 Phosphate dissodique 1.15 g
 Phosphate monosodique. 0.2 g
 Chlorure de potassium 0.2 g
 Thioglycolate de sodium. 1.0g
 Chlorure de Calcium. 0.1 g
 Chlorure de magnésium. 0.1g
 Agar 4.0 g

Mettre en suspension 20 g dans 1 litre d’eau distillée puis dissoudre complètement par ébullition et
distribuer en tubes à vis ou en flacons.

Mettre en agitation lente de façon à maintenir le charbon en suspension

Stériliser à l’autoclave 15 mn à 121°C.

Refroidir immédiatement dans l’eau froide pour conserver le charbon en suspension uniforme.

Milieux de transport prêt à l’emploi


 TGV-AER-Diagnostic Pasteur.
 Portagerm-Biomerieux
Gélose chocolat enrichie :
Elle est composée de :
 Gélose base GC (formule pour 1 litre)
 Peptone 15g
 Amidon de mais 1g
 Phosphate dissodique 4 g
 Phosphate monopotassique 1 g
 Chlorure de sodium 5 g
 Agar 10 g
 Hémoglobine : poudre desséchée d’hémoglobine bovine (OXOID, GIBCO, DIFCO, BBL)

121
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

 Isovitalex (BBL) ou supplément poly vitaminique (Pasteur) ou Polyvitex (Biomérieux) ou


supplément B (Difco) ou milieu d’enrichissement C.V.A (GIBCO).

Mettre en suspension 36 g de gélose base GC dans 500 ml d’eau distillée, agiter, porter à ébullition,
autoclaver et refroidir les solutions autour de 50-55°C.

Ajuter l’hémoglobine au milieu, puis ajouter 10 ml d’Isovitalex (ou autre milieu d’enrichissement) à
ce mélange agiter distribuer en boites de Pétri.

Gélose avec supplément G :


Elle est composée de :

 Gélose base GC
 Supplément G additionné à la gélose base à la concentration de 15 à 20 %.

Composition du supplément G :

 Sérum de cheval 330 ml


 Extrait de levure 200 ml
 Extrait globulaire 470 ml
 Glucose 1.3 g

Milieu de THAYER-MARTIN
Gélose chocolat enrichie en supplément (1%) et additionné d’un mélange d’antibiotique et
d’antifongique ou mélange VCN

A 100 ml de gélose « chocolat » en surfusion, refroidie à 50°C, on ajoute 1 ml de supplément et 1 ml


de mélange inhibiteur. Ceci aboutit à une gélose renfermant :

Colistine methanesulfonate 7.5 ug/ml

Nystatine 12.5 ug/ml

Vancomycine 3 ug/ml

Milieu de THAYER-MARTIN modifié


Gélose GC + hémoglobine + supplément d’enrichissement + mélange d’antibiotique et d’antifongique
(VCNT ou VCAT). (1 ampoule pour 1 L)

Milieu de New York City (N.Y.C)


 Gélose base GC
 Sang laqué de cheval : lyser le sang de cheval défibriné par congélation-décongélation
successives.
 Mélange inhibiteur VCAT
 Supplément à l’autolysat de levures (OXOID) : 1 ampoule renferme :

122
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

 Autolysat de levure 5.0 g


 Bicarbonate de Sodium 0.075 g
 Glucose 0.5 g

On additionne 1 ampoule à 500 ml de milieu GC.

Mettre en suspension 18 g de base GC dans 430 ml d’eau distillée.

Agiter et porter à ébullition, autoclaver.

Ramener à 50-55 °C.

Ajouter 50 ml de sang laqué de cheval.

Ajouter une ampoule de VCAT (OXOID) et une ampoule de supplément à l’autolysat de levure.

Agiter et distribuer en boite de Pétri.

8-Conservation des milieux de culture pour


Gonocoque :(33)
Veillez à respecter un volume suffisant de milieu (au moins 20 ml) par boite 90 mm.

 Pré-sécher correctement les milieux (une nuit à T° ambiante ou 1 heure à 35° - 37°C,
couvercle entre ouvert)
 Conserver jusqu'à 3 semaines au réfrigérateur en sacs plastiques scellés.
 Tester une souche témoin de gonocoque pour vérifier l’aptitude du milieu à la culture.

9-Méthodes d’étude des fermentations sucrées :


9-1-Sur gélose CTA (Cystine-Trypticase-Agar)
La gélose coulée en boite est additionnée de chaque sucre à une concentration de 1 %, en présence
d’un indicateur de pH (pourpre de Bromocrésol).

La souche à tester est inoculée en spot central dans chaque boite.

Cette méthode a été abandonnée au profit de techniques rapides, sensibles et plus spécifiques.

Ses limites :

 Ses réactions faussement positives dues à la contamination par d’autres bactéries.


 Réactions faussement négatives dues à des bactéries provenant de cultures de plus de 24 H.

9-2-méthode de Kellogg et Turner, modifiée par Brown : (34)


 Décharger 2 anses pleines (3mm) de l’isolement, dans un tube stérile contenant 0.3-0.4 ml de
solution de solution BB (Buffered Balanced Salt).

123
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

 Dans 5 autres tubes stériles, introduire respectivement 0.05 ml de solution stérile à 20 % de


glucose ,maltose, saccharose et lactose (1 sucre par tube),puis 0.1 ml de BBS par tube .
 Le cinquième tube ne renfermant que 0.1 ml de BBS et aucun sucre, servira de témoin négatif.
 Introduire ensuite 0.05 ml de suspension bactérienne dans chacun des 5 tubes
 Bien mélanger et incuber 4 h au bain marie à 37°C.
 Un virage de la coloration, du rouge au jaune, indique une réaction positive.

9-3-Autres méthodes hors culture :


Carbodisques imprégnées de sucre et de rouge de phénol + solution tampon, galerie MINITEK, galerie
Diagnostic Pasteur, Galerie Api NH.

10-méthodes de mise en évidence d’enzymes


bactériennes spécifiques :
10-1-technique de mise en évidence de l’ONPG :
 La technique consiste à révéler la O-Nitrophényl-B-galactosidase à partir du substrat O-nitro-
phényl-B-D-galactopyranoside, intégré dans un disque papier ou un comprimé.
 On me en suspension les colonies prélevées à partir d’une gélose chocolat, dans 0.25 ml d’eau
physiologique stérile.
 La suspension doit être d’une opacité correspondante à 4-5 de la gamme de Mc Farland.
 Ajouter stérilement le disque ou le comprimé d’ONPG.
 Fermer le tube et l’incuber 4 h au bain marie à 37°C ou 18 h à l’étuve.
 Le virage du milieu d’incolore à jaune, signe une réaction positive.

10-2-Technique de mise en évidence des enzymes


γ-glutamylaminopeptidase (GLU-AMP) et
hydroxyprolylaminopeptidase (PRO-AMP).
 Ces enzymes permettent de différencier 4 espèces de Neisseria : N.gonorrhoeae,
N.meningitidis, N.lactamina, N.cinerea.
 Les substrats correspondants sont intégrés chacun dans un comprimé.
 On met en suspension les colonies prélevées à partir d’une gélose chocolat dans 0.25 ml d’eau
physiologique stérile afin d’obtenir une suspension laiteuse (4-5Mc Farland)
 Ajouter stérilement le disque de substrat dans chaque tube.
 Fermer les 2 tubes et les incuber 4 h au bain marie à 37°C.
 Apres incubation, on révèle en ajoutant 3 gouttes de solution de bleu solide dans les 2 tubes.
 Le virage du milieu, du jaune clair à l’orange, atteste une réaction positive.

124
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Chlamydia trachomatis
Milieu de transport SACCHAROSE-PHOSPHATE
(2SP) :
 K2HPO4 2.1 g
 KH2PO4 1.1 g
 Saccharose 68.5 g
 Eau distillée 1000 ml

Stériliser par filtration pH final 7.2

Cette solution peut se conserver congelée pendant des mois à -20 °C.

Ajouter stérilement à 90 ml de cette solution :

 Sérum de veau fœtal 10 ml


 Gentamicine 10 mg
 Vancomycine 10 mg
 Amphotericine B 0.5 mg

Conserver à +4°C pendant 2 semaines ou -20°C pendant des mois.

125
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Mycoplasmes génitaux
1-le milieu A3 :
Milieu de base :
 Bouillon trypticase 2.3 g
 NaCl 1.5 g
 KH2PO4 0.06 g
 Eau distillée 275 ml

PH : 5.5

Autoclaver le milieu à 120 °C pendant 15 mn.

Milieu complet :
 Milieu de base 275 ml
 Sérum de cheval 20 ml
 Extrait de levures à 25% 5 ml
 L-Cystéine (HCL) 1 % 3 ml
 Pénicilline G 200000 U/ml 3 ml

Distribuer 2.7 ml dans les tubes d 9 cm de haut sur 1 cm de diamètre

Le milieu U9 :
Milieu de base :
 Bouillon trypticase 2.3 g
 NaCl 1.5 g
 KH2PO4 0.06 g
 Eau distillée 275 ml

Milieu complet :
 Milieu de base 275 ml
 Sérum de cheval 20 ml
 Extrait de levures à 25% 5 ml
 Urée à 10 % 1.5 ml
 L-Cystéine (HCL) 1 % 3 ml
 Rouge de phénol 1 % 1.4 ml
 Pénicilline G 200000 U/ml 3 ml

Répartir 50 à 100 ml en flacons stériles.

126
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

3-le milieu M42


Milieu de base :
 Mycoplasma broth Base (Oxoid) 25 g
 Bacto-Tryptone (Difco) 10 g
 Bacto-peptone (Difco) 5 g
 Eau distillée 1230 ml

Complement
 Extrait de levure à 25 % 50 ml
 Sérum de poulain (30 mn à 56 °) 200 ml
 Ampicilline 1 g
 Glucose à 25 % 40 ml
 Arginine à 10 % 40 ml
 CVA (Gibco) ou Isovitalex 20 ml
 Rouge de phénol à 0.5 % 10 ml
 Acétate de thallium 15 ml
 Chauffer 3 minutes au bain marie
 Ph final: 6.0

Repartir 50 ou 100 ml en flacons stériles.

4-Le Milieu A7
Milieu de base :
 Mycoplasma broth Base (Oxoid) 53.3 g
 Agar purifié (Oxoid) 26.0g
 Eau distillée 2100 ml

Complement
 Sérum de poulain (non chauffé) 200 ml
 Extrait de levure à 25 % 120 ml
 Arginine à 10 % 2.5 ml
 Ampicilline 1 g
 Urée à 10 % 31.5 ml
 L.Cystéine à 4% 9.0 ml
 Glucose à 25 % 22.5 ml
 Sulfate de manganèse (stérile) 12.5 ml

(1.05 g dans 20 ml d’eau distillée, filtrer)

Couler dans des boites de pétri de 5 cm de diamètre.

127
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Haemophilus ducreyi
1-Gélose pour gonocoque additionné de sérum de veau
fœtal :
 Gélose base GC
 1 % hémoglobine bovine
 1 % Isovitalex (BBL) ou autre supplément poly vitaminique (Gibco)
 5 % sérum de veau fœtal
 3 mg/l Vancomycine.

Peser 36 g de gélose base GC, dissoudre dans 450 ml d’eau distillée (dans 1 flacon d’1 litre).

Dans un 2ème flacon, peser 10 g de poudre d’hémoglobine dans 500 cc d’eau distillée.

Chaque milieu est porté à ébullition puis autoclavé séparément.

Ramener la température à 55°C, ajouter 10 ml de liquide d’enrichissement (Isovitalex) au milieu GC


ainsi que 30 ml d’une solution à 100 mg de Vancomycine.

Ajouter 50 ml de sérum de veau fœtal, puis la solution d’hémoglobine.

Mélanger et couler en boites de Pétri.

Conserver entre 2° et 8°C dans des sacs en plastique fermés.

2-Gélose CHOCOLAT MH au sang de cheval enrichi :


 Gélose Mueller Hinton
 5 % de sang de cheval stérile.
 1 % Isovitalex
 5 % de sérum de veau fœtal
 3 mg/l de Vancomycine

Dissoudre 38 g de milieu MH dans 900 ml d’eau distillée. Mélanger et porter à ébullition. Autoclaver
puis ramener à 80°C au bain marie. Ajouter 50 ml de sang de cheval. Mélanger puis ramener à 50-
55°C dans un autre bain marie.

Ajouter 50 ml de sérum de veau fœtal, 10 ml d’Isovitalex et 3 ml de Vancomycine (100 mg/l).


Mélanger et distribuer en boites de Pétri. Conserver entre 2°C et 8°C.

128
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

3-Giemsa
Colorant :
Dissoudre 0.5 g de poudre de Giemsa dans 33 ml de méthanol pur sans trace d’acétone. Mélanger et
conserver à T° ambiante. Préparer une dilution de travail en ajoutant 1 ml de cette solution mère à 40
ml de diluant.

Diluant :
Préparer un tampon phosphate à 67 mmol/l, pH 7.2 de la manière suivante : mélanger 72 ml d’une
solution contenant 9.5 g de dihydrogénophosphate de disodium par litre à 28 ml d’une solution
contenant 9.2 g de phosphate monosodique par litre. Ajouter 900 ml d’eau distillée.

Coloration :
Le frottis de prélèvement, séché à l’air, fixé au méthanol absolu pendant au moins 5 mn puis séché de
nouveau, est recouvert de la solution de Giemsa pendant 1 heure.

On rince ensuite la lame à l’alcool éthylique à 95 % puis on la sèche et on procède à l’examen


microscopique. (31)

129
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

4-Tests biochimiques d’identification d’H ducreyi


Réduction des nitrates :
 Préparer une suspension bactérienne dense (étalon 3 de Mc Farland) dans 0.04 ml d’eau
distillée.
 Ajouter 0.04 ml d’une suspension de Nitrate de sodium à 0.5 g/l et 0.04 ml de tampon
phosphate pH 6.8 à 0.025 mol/l.
 Incuber 1 h au bain-marie à 37°C.
 Ajouter ensuite 0.06 ml d’une solution d’acide sulfanilique à 8g/l dans l’acide acétique à 5
mol/l et 0.06 ml d’α-naphtylamine à 5 g/l dans l’acide acétique à 5 mol/l.
 Agiter le tube et lire après 2 minutes.
 Lecture : la présence d’une coloration rose indique que le test est positif.

Exigences en hémine :
On pratique le test à la porphyrine.

Faire une suspension bactérienne dense dans 0.5 ml de solution à 2 mmol/l de chlorhydrate d’acide δ-
aminolévulinique dans un tampon phosphate pH 6.9 à 0.1 mol/l contenant 0.8 mmol/l de sulfate de
magnésium.

Incuber 4 h au bain marie à 37°C.

Exposer le substrat à la lumière d’une lampe de Wood (LO=360 nm) en chambre noire

Lecture : une fluorescence rouge indique la présence de porphyrine c'est-à-dire l’absence d’exigence
en hémine. (Résultat(-) avec H ducreyi).

PAL
 Faire une suspension bactérienne dense (étalon 3 à l’échelle de Mc Farland) dans un tube
contenant 0.5 ml de phosphate disodique sans phénol à 0.3 g/l dans un tampon citrate-
hydroxyde de sodium de Sorensen, pH 5.6 à 0.01mol/l.
 Incuber le tube 4 h au bain marie à 37°C.
 Ajouter 4 gouttes de 2.6-dibromoquinone-4-chlorimide à 5 g/l dans le méthanol.
 Agiter.
 Laisser reposer 15 mn à T° ambiante.
 Ajouter 0.3 ml de n-butanol.
 Agiter et laisser reposer 5 mn.
 Lecture : une coloration bleu –violet de la couche de butanol indique une réaction positive.

130
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Trichomonas vaginalis :
1-milieu de ROIRON (Biodiagnostic)
Formule pour 1 litre :

 NaCl 6.0 g
 KCl 0.1 g
 Ca Cl2 0.1 g
 NaHCO3 0.1 g
 Peptone (protéose n°3)(Difco) 2.0 g
 Maltose 5.0g
 Extrait de foie (Bacto-Liver)(Difco) 2.0g
 Acide ascorbique 1.0g
 Extrait de Liebig-peser dans un petit erlenmeyer et diluer dans un peu d’eau 3.0 g
 Asparagine-chauffer dans un peu d’eau
 Ajuster le ph à 6.0 -6.6.
 Repartir en flacons de 500 ml.
 Stériliser à l’autoclave.
 Porter 3 jours au réfrigérateur à +4°C pour permettre la précipitation complète.
 Centrifuger à 3500 t/mn pendant 20 mn.
 Autoclaver.
 Ajouter pour 500 ml
 Sérum de cheval 100 ml
 Streptomycine 1g
 Pénicilline 1 000 000 UI
 Le milieu (4.5 ml) est distribué dans des tubes de 9.5 sur 1 cm de large, bouchés avec un
bouchon à vis en aluminium.

2-Milieu de DIAMOND :
Formule pour 1litre :

 Trypticase 20.0 g
 Extrait de levure 10.0 g
 Maltose 5.0 g
 Chlorhydrate de L- cystéine 1.0g
 Acide L ascorbique 0.2 g
 Hydrogénophosphate de dipotassium 0.8 g
 Dihydrogénophosphate de potassium 0.5 g
 Gélose 0.5 g

Mettre en suspension et dissoudre 38 g de poudre dans 900 ml d’eau distillée.

Apres autoclavage, ramener la T° du milieu à 50 °C et ajouter 100 ml de sérum de bœuf ou de mouton


et 0.1 g/l de chloramphénicol.

131
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Gardnerella vaginalis :
Le test à la potasse :
Mélanger un échantillon de sécrétion vaginale avec une goutte de KOH sur une lame et porter à
proximité des narines, à la recherche d’une odeur caractéristique de « poisson pourri » (volatilisation
des polyamines type cadavérine et putrésceine produits par les bactéries anaérobies).

Corps de Donovan
Colorant de Leishman :
Solution mère :
 Poudre de Leishman 1.5g
 Méthanol 1000 ml

Solution de travail
 Solution mère 1 partie.
 Eau peptonée 2 parties.

Ajouter la poudre de leishman au méthanol et bien mélanger au moyen de plaques de billes de verre.

Laisser reposer la solution mère 24 h à la température ambiante.

Préparer chaque jour une solution de travail fraiche en diluant une partie de la solution mère dans 2
parties d’eau distillée tamponnée avec 3.76 g/l d’Hydrogénophosphate de di-sodium et 2.10 g/l de
Dihydrogénophosphate de potassium pH 7.0 -7.2.

Candida Albicans
Test de filamentation :
Emulsionner une colonie dans 0.5 ml de sérum de cheval ou de sérum humain.

Incuber 4h à 37°C

Lire en présence d’un témoin négatif : C Albicans montre des hyphes latéraux courts.

132
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Treponema :
Coloration de Vago :
 Réaliser un frottis du prélèvement pathologique, ne pas fixer.
 Recouvrir la lame d’une solution fixée de mercurochrome à 2 % pendant 3 à 5 mn.
 Laver à l’eau distillée ;
 Colorer pendant 5 mn avec une solution filtrée de vert de méthyle à 2%.
 Laver à l’eau distillée, laisser sécher.
 Examiner à l’objectif 100 : les tréponèmes apparaissent en violet clair sur un fond presque
incolore.

Préparation des réactifs :


 Solution de mercurochrome à 2 % : Ajouter 1 g de mercurochrome broyé très finement (ou de
rhodochrome) à 50 ml d’eau distillée tiède. Agiter et laisser reposer puis filtrer. Conserver en
flacon brun en filtrant de temps à autre.

 Solution de vert de méthyle à 2 % : broyer très finement (important) 1 g de vert de méthyle dans
un mortier. Ajouter 50 ml d’eau distillée tiède. Agiter et laisser reposer puis filtrer. Conserver en
flacon brun en filtrant de temps à autre.

Ces réactifs se conservent environ un mois.

Coloration de Fontana-Tribondeau (imprégnation


argentique) :
 Fixer le frottis séché 2 mn au liquide de Ruge ;
 Laver à l’eau ;
 Mordancer à chaud avec une solution de tanin à 5 % d’eau ;
 Imprégner à chaud pendant 30 secondes avec une solution de Nitrate d’argent ammoniacal.
 Laver à l’eau et sécher.
 Examiner à l’immersion : les spirochètes apparaissent colorés en brun noir.

133
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

ANNEXE B

134
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Nom du Gynécologue :………………………………………………………………….. Date : …………………………………………………………………..

Nom du service : ………………………………………………………………….. N° : …………………………………………………………………..

Fiche de renseignements pour prélèvements génitaux féminins

(À remplir par le gynécologue)

Nom : ………………………………………………..Prénom :……………………………………………….. Age :………………………………………………..

Adresse : ……………………………………………….. Profession………………………………………………..

Enceinte ……………………………………………….. De combien ……………………………………………….. (Semaines, mois)

Contraception : orale : ……………………………………………….. Stérilet : ………………………………………………..

Antécédents médico-chirurgicaux : ……………………………………………………………………………………………............................................

Antécédents Obstétricaux : ……………………………………………………………………………………………..........................................................

Date du début des troubles : ……………………………………………………………………………………………..................................................

Circonstances de survenue :

 Rapport sexuel ...................jours avant les troubles.


 Traitement antibiotique ou hormonal 
 Post partum 
 Manœuvre instrumentale :
 Curetage : 
 Pose d’un stérilet : 
 Autres : précisez …………………………………………………………..............................…...................................

Si leucorrhée préciser :

 Aspect : ............................. Couleur : .............................


 Odeur : ............................. Abondance: .............................

Signes cliniques accompagnateurs

 Fièvre  Dysurie Pollakiurie 


 Brulures mictionnelles Prurit vulvaire  Dyspareunie

Traitement antérieur :
……………………………………………………………………………………………..............................…...................................

Dignes cliniques chez le partenaire : Oui Non

Si oui lesquels : ……………………………………………………………………………………………..............................…..............................................

Examen gynécologique :

Toucher vaginal : Douloureux indolore

Aspect du col : …………………………………………………………………………………………….................................................................................

135
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Au verso de la fiche de renseignements cliniques, une fiche d’analyse, réservée au laboratoire permet
de suivre les étapes techniques :

Endocol Cul de sac Vagin


postérieur

Examens directs :
 Leucocytes :
 Cellules épithéliales
 Bactéries
 Clue-cells
 Levures

Cultures :
 Germes banals
 N gonorrhoeae
 Gardnerella v.
 Levures
 Mycoplasmes génitaux

136
Techniques microbiologiques
PRELEVEMENTS GENITAUX

Expression des résultats :


Hôpital : MALADE
Laboratoire : N° :
Biologiste : Nom :
Prénom :
Age :
Service :

EXAMENS CYTO-BACTERIOLOGIQUE DE PRELEVEMENTS GENITAUX

SIGNES CLINIQUES

Pertes génitaux 
Ecoulement urétral 
Ulcération génitale 
Tumeur(s) génitale(s) 
Autres……………….

SIGNES GENITAUX
Endocol  Vulve  Endomètre 
Exocol  Glande de Bartholin  Pièce biopsique 

Cul de sac vaginal  Urètre  Autre ……….


Vagin 
Examens directs Endocol Exocol Cul de Vagin Vulve glande de urètre autres
sac Bartholin
vaginal
Polynucléaires
Clue-cells
Trichomonas v
Lactobacilles
Bactéries
Levures

GERMES IDENTIFIES

N.gonorrhoeae :  Mycoplasma : 
Trichomonas vaginalis :  Levure : 
Treponema pallidum :  Autre : 
Chlamydia trachomatis : 

INTERPRETATION

ABSENCE D’INFECTION GENITALE 


INFECTION GENITALE A :…………………………….

137
Molluscum contagiosum Treponema pallidum-Haemophilus ducreyi-Agent de Donovan-
Papillomavirus Chlamydia trachomatis

EXAMEN GYNECOLOGIQUE Ulcération génitales


Tumeurs génitales

VULVITE VAGINITE CERVICITE ENDOMETRITE SALPINGITE


Suppuration

SITES DE Lésions vulvaires glandes Cul de sac Endocol endo- Endocol


de Bartholin postérieur Paroi Endocol utérin stérilet endo-utérin
PRELEVEMENT
vaginal produit de curetage P tubaire
Biopsie pus P péritonéaux
d’endométrite

EXAMENS Leucocytes Lactobacilles Leucocytes


bactéries Trichomonas v bactéries Leucocytes Leucocytes
DIRECTS
Levure bactéries bactéries
Clue cells

Levures Trichomonas v N gonorrhoeae N gonorrhoeae


N gonorrhoeae
Staphylocoques SBH Levures Chlamydia Bacteries pathogénes
AGENTS Bacteries pathogénes
N gonorrhoeae H Gardnerella v trachomatis opportunistes
RECHERCHES influanze Gardnerella v Mycoplasmes génitaux
opportunistes
Chlamydia
Chlamydia
Œufs d’oxyures trachomatis
trachomatis
Mycoplasmes BK
Mycoplasmes BK

PRELEVEMENTS GENITAUX FEMININS


Examen de l’appareil uro-génital

Ulcération
Urétrite aigue Urétrite subaigüe Prostatite Orchi- Condylomes
génitale
ou chronique épididymite

Fond de l’ulcère
Urètre Urètre 1er jet Urètre 1er jet adénopathie
urinaire-urine urinaire-sperme
SITES DE Urètre anus et satellite
post massage- Biopsie
PRELEVEMENT pharynx
sperme

Polynucléaires
Polynucléaires Polynucléaires T pallidum
PN Diplocoques Bactéries Polynucléaires Bactéries Bactéries
gram – intra ou Bactéries
EXAMENS extra cellulaire
DIRECTS T vaginalis
N.gonorrhoeae Papillomavirus
N.gonorrhoeae Anaérobies Treponema
Ureaplasma strictes pallidum
urealyticum Staphylocoques Haemophilus
N.gonorrhoeae Staphylocoques Entérobactérie ducreyi
Anaérobies
Trichomonas .v Entérobactérie Gardnerella v Trichomonas .v
strictes
AGENTS Chlamydia. Calymmatobactri
Chlamydia Staphylocoques
RECHERCHES Trachomatis um granulomatis
trachomatis Entérobactérie
Ureaplasma Gardnerella v
urealyticum

PRELEVEMENTS GENITAUX MASCULINS