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BIOCHIMIE

Introduction
Définition :

La biochimie est l’étude des constituants de la matière vivante et de leurs réactions.


 l’étude des réactions chimiques (complexes et catalysées) donnant naissance à la vie.
Vie = agencement de molécules inertes (ADN…) en un édifice capable de se reproduire.
 ensemble de réactions chimiques coordonnées d’une grande complexité.

Caractéristiques fondamentales de la chimie des être vivants :

- Présence de macromolécules
- Présence d’enzymes (catalyseurs très spécifiques) : extraordinaire efficacité et spécificité :
Réaction totale avec un rendement de 100% du produit nécessaire + accélération de la réaction
Les enzymes fonctionnent de manière coordonnée  régulation et rétrocontrôle possibles.
- Grande organisation de la cellule : tout est fonction des structures de la cellule, les réactions dépendent
de l’endroit où elles se déroulent (ex : respiration  membrane de la mitochondrie).
- Système ouvert : échanges de matières et de chaleur (énergie) avec l’extérieur  ∆E = ∆H – T∆S,
∆E<0.
- Le matériel génétique est commun à tous les être vivants : malgré une grande diversité des êtres
vivants, il existe des mécanismes communs (même schéma de fonctionnement chez tous les être
vivants), mais avec des variantes spécifiques pour les différents groupes. (ex : le même métabolite,
l’isoprène, sert à la constitution du caoutchouc chez l’hévéa et du stérol chez l’homme).

Constitution des être vivants :

Les êtres vivants sont constitués d’une sélection des différents atomes contenus dans la croûte terrestre.
Croûte terrestre :
O : 47% Fe : 4,5%
Si : 28% C,H,N : 1%
Al : 7,9%

Espèce humaine :
H : 63% N : 1,6%
O : 25,5% Ca, Cl, P <1%
C : 9,5%

Problème de l’origine de la vie :

Pourquoi l’être vivant s’est-il construit à partir du C alors que Si est beaucoup plus abondant dans la croûte
terrestre ?
- Le C a de nombreuses possibilités d’interactions avec O, H, N. (id pour Si)
- Le C peut faire des liaisons avec lui-même tandis que Si-Si est instable en milieu aqueux (formation de
silicates).
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Comment la vie est-elle apparue ?

Quand la vie est apparue sur terre, l’atmosphère était constituée de H2O, NH3, CH4, H2 + présence de
décharges électriques (orages).
En 1953, Stanley Miller reconstitue ces conditions in vitro, et, après une semaine, constate l’apparition de :
- gaz (CO, CO2), restes de gaz présents au départ
- molécules organiques typiques des cellules vivantes :
o acide acétique (CH3COOH)
o acide lactique, succinique
o acides aminés, éléments constitutifs des protéines (COO--RCH-NH 3+)
Il y a eu passage spontané de molécules organiques à des molécules organiques plus complexes intervenant
dans le processus de vie. Par associations, complexifications progressives, on est arrivés aux molécules qui
ont donné la vie.
Il y a différents types de molécules dans une cellule vivante :
Ex : E. Coli : H2O : 70%
Protéines : 15% Lipides : 2%
Acides nucléiques : 7% Molécules diverses : 2%
Glucides : 3% Ions : 1%

Chapitre 1 : L’eau
L’H2O est un élément déterminant dans le fonctionnement des organismes (de 60 à 70% de leur constitution) ;
elle est nécessaire à leur vie.
Pour une réaction, il faut toujours 35g d’eau/kg corporel par jour.

Propriétés :
C’est une molécule polaire, l’O est très électronégatif, il a tendance à attirer les électrons de la liaison OH
(angle de 104,5°).
Les forces intermoléculaires puissantes qui existent dans l’H2O sous sa forme liquide sont dues à une
distribution particulière des électrons dans la molécule. Chacun des 2 atomes H échange une paire d’électrons
avec l’atome O. Cette disposition des électrons dans la molécule lui donne son asymétrie.
L’O, le plus électronégatif, tend à attirer un électron célibataire des atomes H laissant leurs noyaux dépourvus
d’électrons (charges + et – apparaissent). Ainsi, bien que la molécule d’eau n’ait pas de charge nette, elle
forme un dipôle électrique.
Quand deux molécules d’eau se rapprochent l’une de l’autre, une attraction électrostatique se crée entre les
charges partielles négatives de l’O d’une molécule d’eau et les charges partielles positives de l’H d’une
molécule d’eau voisine. Ceci s’accompagne d’une redistribution des charges électroniques dans les deux
molécules, ce qui augmente de façon importante leur interaction. Ce type d’interaction électrostatique qui
possède une faible composante covalente est appelée liaison H.
En raison de la distribution presque tétraédrique des électrons autour de l’O, chaque molécule d’eau tend à
former des ponts H avec 4 molécules d’eau voisines. C’est cette propriété qui est responsable de la très grande
cohésion interne de l’eau liquide.

Les liaisons H sont beaucoup plus faibles que les liaisons covalentes. Elles se forment dans toutes les phases.
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La T° de fusion glace-eau est très élevée.


Les petites différences de nombre de liens H entre la glace (100%) et l’eau liquide (80%) paraissent
surprenantes lorsqu’on compare la rigidité de la glace à la fluidité de l’eau liquide. En fait, dans l’eau liquide,
les ponts H se font et se défont à très grande vitesse (vie de chaque liaison : 10-5s).

L’eau peut réagir avec toutes sortes de molécules qui contiennent des fonctions organiques (ponts H entre les
molécules d’eau et ces molécules). C’est un bien meilleur solvant que la plupart
des liquides courants.
- Beaucoup de sels cristallisés et d’autres composés ioniques se dissolvent aisément
dans l’eau, mais sont presque insolubles dans les liquides non-polaires tels que le
benzène ou le chloroforme.
- Une deuxième grande catégorie de substances aisément solubles dans l’eau est
représentée par des composés non ionisés, mais polaires, ces composés sont
hydrophiles :

Leur solubilité est due à la propension des molécules d’eau à contracter des ponts H avec
des groupes fonctionnels polaires : hydroxyles de sucres ou d’alcools, oxygène du carbonyle, des aldéhydes
ou des cétones. Si une molécule possède une de ces fonctions, elle est soluble dans l’eau (hydrophile). Une
molécule possédant une chaîne aliphatique (une longue chaîne carbonée) est hydrophobe.
L’eau disperse également de nombreux composés contenant des groupements apolaires (hydrophobes) sous
forme de micelles, pourvu que ces composés contiennent aussi des groupements fortement polaires. Ce type
de composés sont des composés amphipathiques (ex : oléate de sodium, savon).

Phénomène de solubilité des sels dans l’eau :

NaCl  Na+ + Cl- car Na+ peut réagir avec le dipôle de l’eau, Na+ s’entourant d’eau : solvatation.

Chaleur de vaporisation de l’eau : 540 cal/g à 40°C.


Elle est très élevée : l’eau à un rôle de régulateur thermique important et nécessaire pour le bon
fonctionnement des enzymes.
Exemple : dissipation de 1000 cal  T° d’un corps contenant un litre d’eau augmente de 1°C. S’il évapore 2g
d’eau sa T° retombe de 1°C  principe de la transpiration.

Chapitre 2 : Les lipides


Les lipides sont, par définition, des composés insolubles dans l’eau et solubles dans des solvants non polaires
(ex : benzène, tétrachlorure…). Ce sont les graisses et les huiles.

Classification :

* Saponifiables : lipides dont on peut faire l’hydrolyse par une base forte pour donner un sel d’acides gras (le
savon).
- contiennent très peu de groupements polaires, peu d’interactions avec l’eau : glycérides, cérides…
- contiennent des groupements polaires, interactions avec l’eau : phospholipides, sphingolipides…
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* Non saponifiables : la molécule ne possède pas de chaîne d’acides gras.


Terpènes
Prostaglandines
Stéroïdes

I. Les lipides saponifiables :


Possèdent au moins 1 acide gras.
Acide gras :

R : longue chaîne carbonée hydrophobe, fonction acide : tête hydrophile.

- Plus de 100 groupes sont synthétisés naturellement.


- Les acides gras se distinguent entre eux par la longueur de leur chaîne carbonée (généralement comprise
entre 4 et 36 C) et par leur degré d’insaturation (nombre et position des doubles liaisons).
Ex : saturé : pas de double liaison :

insaturé :

- Dans les acides gras insaturés, la position de C=C est souvent entre le 9è et le 10è C, mais il peut
exister des C=C à d’autres endroits.
- Presque tous les acides gras ont un nombre pair de C.
- Il existe deux fois plus de lipides insaturés que de saturés dans la nature.
- La chaîne peut prendre deux configurations différentes, selon que la liaison est cis (donne un coude)
ou trans.
- Une préparation d’acides gras saturés forme un solide à une température supérieure à celle des acides
gras insaturés de même nombre de C.
Ex : Palmitate (16 C), 63,1°C : solide à température ambiante
Palmitoléate (16C), -0,5°C : liquide à température ambiante
- A l’état libre, on ne rencontre les acides gras qu’en très petites quantités, en général on les retrouve
surtout à l’état estérifié.

A. Les glycérides :
Ester du glycérol et d’acides gras (1 à 3).

Glycérol (ou trialcool) :


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L’estérification d’un alcool et d’un acide donne un ester + de l’eau.


ROH + R´COOH  R´COOR + H2O
 Glycérol + 3 chaînes d’acides gras (R1, R2, R3)  Triglycéride + 3H20.

Triglycérides :

Si les 3 acides gras (R1, R2, R3) sont différents, on a un C asymétrique. C’est très important d’un point de vue
biochimique puisque les molécules ont des propriétés différentes selon qu’elles soient L ou D.

Saponification : clivage de la liaison ester, donc libération d’un acide gras.


 triglycéride + base forte  glycérol + savon (sels d’acide gras).

- Propriétés du savon : formation de micelles (têtes polaires=sels d’acides gras).

Les graisses vont réagir avec les chaînes hydrophobes et devenir solubles  élimination des graisses.

Les triglycérides représentent la famille des lipides la plus abondante et forment un matériel de réserve chez
les animaux. Les triglycérides se distinguent les uns des autres pas la nature et la position des 3 acides gras qui
estérifient le glycérol. Ceux qui comportent le même acide gras sur les trois positions du glycérol sont appelés
triglycérides simples, les autres, mixtes.
Les triglycérides sont peu solubles dans l’eau et ne tendent pas spontanément à former des micelles stables car
ils n’ont pas d’extrémité polaire.

Explication de l’existence de graisses ou d’huiles à T° ordinaire :


La conformation des acides gras saturés, dont la chaîne hydrocarbonée est flexible, est très variable à cause de
l’extrême liberté de rotation des simples liaisons. D’autre part, les acides gras insaturés présentent une ou
plusieurs angulations rigides dues aux doubles liaisons.

Graisses : saturation
Grande possibilité d’interactions de VdW (à courtes distances) entre
chaînes hydrophobes.  solide (animal ou végétal)
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Huiles : insaturations

Interactions de VdW diminuées par de mauvais contacts entre plusieurs


chaînes, donc moins de cohésion entre les molécules.  liquide (graisse
végétale). On a 80% d’acides gras insaturés.

Rôles Biologiques :
Les glycérides présentent plusieurs fonctions biologiques importantes :
- Ils contribuent à la structure des membranes cellulaires.
- Ce sont des formes de réserve et de transport des métabolites énergétiques. Chez les animaux, les
triglycérides sont accumulés sous forme de goutelettes dans des cellules spécialisées, les adipocytes.
- Ils jouent un rôle de protection à la surface de beaucoup d’organismes (phoques, pingouins…)

B. Les cérides :

Ce sont les cires, composés non polaires, résultant de l’estérification de monoalcools gras à longues chaînes
(16 à 34 C) ou de stérols par des acides gras supérieurs (14 à 36 C).

Chauffées, les cires sont molles et souples, mais elles durcissent en refroidissant.
Elles assurent un rôle de protection à la surface de la peau, de la fourrure (laine) et des plumes chez les
animaux, des feuilles et des fruits chez les végétaux (cuticule).
Elles sont très abondantes dans le plancton (matériel de réserve).
Ex : graisse de laine : lanoline
cire d’abeille : ester palmitique d’alcool gras
cire des feuilles : ester d’acides gras et d’alcools.

C. Les phospholipides (phosphoglycérides, glycérophospholipides)


Alcool + phosphate.

Constituants majeurs et caractéristiques des membranes cellulaires, on en trouve très peu ailleurs dans les
cellules.
Dans les phosphoglycérides, une des fonctions alcool primaire du glycérol (en R3) est estérifiée par de l’acide
phosphorique et non par un acide gras.

- 1ère estérification : ( à pH 7, le phosphate est ionisé)

- 2ème estérification : (avec deux acides gras dont la chaîne contient 16 à 18 C ; il en existe avec des
insaturations)
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C’est un intermédiaire de la biosynthèse des phosphoglycérides. Une troisième estérification nous donne les 6
phosphoglycérides majeurs des végétaux supérieurs et des animaux.

Nous avons :
* Phosphatidyléthanolamine :
CH3-CH2OH  NH2-CH2-CH2OH
éthanol éthanolamine

Encore appelée céphaline , ceci constitue une famille de lipides rencontrés en grande quantité dans les
membranes des cellules du cerveau et qui ont en général un rôle important dans toutes les membranes
cellulaires.

* Phosphatidylcholine :
Choline = Triméthyléthanolamine

Estérification au niveau de l’alcool de la


choline.

Encore appelée lécithine ; molécule


présente dans les membranes cellulaires
et notamment dans le cerveau. C’est une
famille de molécules différentes selon
les acides gras.
La lécithine est ajoutée au chocolat ou
aux préparations pour donner un aspect
onctueux.

* Phosphatidylsérine :
Sérine = acide aminé possédant un groupement alcool.

Estérification du groupement alcool de la sérine au niveau du phosphate.

* Phosphatidylglycérol :
Attention, le glycérol est très hydrophile et ses dérivés aussi. Ils sont des constituants de la membrane.

* Diphosphatidylglycérol :
Il s’agit de 2 phosphatidates liés entre eux par un glycérol, ce qui nous donne un cardiolipine.
Le squelette de la molécule de cardiolipide est formé de trois molécules de glycérol associées entre elles en 1-
3 par des liaisons phosphodiesters. Les hydroxyles des 2 glycérols externes sont estérifiés par des acides gras.

C’est un élément majeur dans les membranes internes des mitochondries. Il a été découvert et isolé dans le
muscle cardiaque riche en mitochondries, d’où son nom.
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* Phosphatidylinositol :
Estérification sur un polyalcool cyclique.
Inositol = Cycle de 6 C.

Le phosphatidate est lié à l’alcool cyclique au niveau du C1.

D. Les sphingolipides :
Aminoalcool + acide gras.
- lipides polaires et saponifiables
- lipides complexes dont la sphingosine, ou un aminoalcool, représente le squelette carboné.
- ce sont d’importants constituants des membranes cellulaires, tant animales (cerveau, tissus nerveux) que
végétales.
- ils contiennent 3 constituants fondamentaux : - 1 molécule d’acide gras (longue chaîne hydrophobe)
- 1 molécule de sphingosine
- 1 extrémité polaire

- La sphingosine :
Alcool aminé ou amino-alcool.

- La dihydrosphingosine :

- La céramide :
Cette fois, il n’y a pas estérification entre l’acide
gras et l’alcool, mais l’acide gras se fixe sur la
fonction amine, il y a formation d’une liaison amide.

La céramide est une intermédiaire dans la formation de tous les sphingolipides. On ne le trouve pas tel quel
dans la membrane.
Certains dérivés de la céramide sont construits par association avec un phosphate sous forme d’ester au niveau
del’alcool.

- Sphingolipide dérivé de cette forme :


* la sphingomyéline :
C’est le résultat de l’estérification du groupement 1-hydroxyl du
céramide par de la phosphorylethanolamine ou de la
phosphorylcholine.

La sphingomyéline est très importante au niveau du cerveau, c’est


un élément majeur des membranes entourant les fibres nerveuses.
Une gaine de myéline se forme et permet un isolement électrique,
la vitesse de conduction est donc plus grande.
Maladie : la sclérose en plaque. Les gaines de myéline sont
détruites suite à un défaut dans la production de sphingomyéline.
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- Dérivés de la céramide ne comportant pas de groupe phosphate :


* Glycosphingolipides neutres = CEREBROSIDES
Il s’agit de sphingolipides comprenant à leur extrémité polaire un ou plusieurs résidus osidiques (polaires).
Ils ne possèdent pas de groupement PO4.
Les plus simples sont des cérébrosides : leur groupement polaire est un ose lié par une liaison β-osidique à
l’hydroxyle libre du céramide.
Il n’y a pas estérification mais interaction directe entre cet alcool et l’alcool de l’ose (avec élimination d’eau) :
liaison osidique.
Différents oses : D-glucose, D-galactose, N-acétyl-D-galactosamine

Les cérébrosides sont des molécules qui sont par exemple impliquées dans des mécanismes de reconnaissance
entre cellules.
Ils composent 6% des lipides du cerveau.

* Glycosphingolipides acides = GANGLIOSIDES

Ils possèdent des sucres acides.


Plusieurs de leurs oses (récepteurs hormonaux) peuvent se lier entre eux ; un au moins est un ose portant une
fonction acide.
Ces oses peuvent être de type :
- galactose + acide
- N acétyl galactose
- N acétylneuraminique (NAN)

E. Implication des lipides saponifiables dans les membranes :


Triglycérides : cires : non polaires
Phosphoglycérides et sphingolipides : polaires
Ces lipides contiennent une partie hydrophile et une partie hydrophobe (voir photocopie table 12.2).
Malgré des formules chimiques très différentes, les conformations spatiales des lipides polaires sont fort
proches.

Structure des membranes cellulaires :


La membrane cellulaire est constituée d’une bicouche lipidique. Ces lipides sont
différents selon leur position (interne ou externe dans la membrane). La membrane
est une mosaïque fluide : les lipides bougent horizontalement. La membrane est asymétrique.
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La proportion de lipides et de protéines est variable (la membrane est spécialisée).


- 20% de lipides pour les membranes des mitochondries (peu isolant  échanges).
- 80% de lipides dans les gaines de myéline (isolant  peu d’échanges).
Il faut fournir de l’énergie à la cellule  beaucoup de transports  protéines de transport
Il y a une gaine isolante  peu d’échanges  surtout des lipides.

La proportion des différents lipides cités est très variable :


Ex : Animal Bactérie
(Erythrocyte) (E. coli)
Phosphatidyléthanolamine 18% 35%
Sphingomyéline 18% 0%

Propriétés de la membrane cellulaire :


- Imperméable aux ions car la partie interne est complètement hydrophobe, cependant il y a des protéines
spécifiques transporteuses d’ions.
- Laisse passer l’eau par effet de concentration même si l’eau a un caractère polaire.
- Perméable aux molécules hydrophobes polaires (telles que les hormones stéroïdes), car il y a des
interactions possibles avec la partie hydrophobe qui forme le cœur de la membrane.
- Isolant électrique (l’isolation augmente avec la quantité de lipides)
- Très fine (5-6 nm)
- Flexible, fluide
- Contient des protéines intrinsèques (à l’intérieur, traversant tout) et des protéines extrinsèques (à la surface).
Une protéine ayant une partie hydrophile ne peut pas se retourner car elle devrait traverser une zone
hydrophobe.
- Elle contient du cholestérol, molécule très rigide qui réduit la possibilité qu’ont les lipides de bouger les uns
par rapport aux autres.

Lorsqu’on agite un mélange de lipides polaires et d’eau, il y a formation de liposomes :

Petites vésicules formées de bicouches


lipidiques et contenant de l’eau.
Couche étanche (complètement
hydrophobe).
Les liposomes peuvent aussi interagir
avec la membrane cellulaire car ils
contiennent aussi une bicouche
lipidique.
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II. Les lipides non saponifiables :

Ils ne peuvent pas être hydrolysés par une base forte pour donner un sel d’acides gras.

A. Les stéroïdes :
- Ces sont des dérivés du cholestérol.
- Lipides solubles dans des solvants non polaires.
- Terminaison en –ol car il y a un groupement OH.

Cholestérol : Stéroïde animal le plus répandu.


- Structure compacte et rigide.
- Il est insoluble dans l’eau mais peut être extrait des
tissus par le chloroforme, le benzène, l’éther ou l’alcool
chaud.
- Il peut être estérifié par un acide gras : à ce moment il
est un céride (saponifiable).
- C’est un précurseur de nombreux autres stéroïdes
animaux :
 acide biliaire
 progestérone, hormone progestative
 œstrogène (β-oestradiol), androgène (testostérone), hormone sexuelle femelle ou mâle
 aldostérone, transfert membranaire d’ions
Les stéroïdes diffèrent par le nombre et la position des doubles liaisons, le type, le nombre et la position des
substituants, leur configuration α ou β par rapport au noyau (fonction de la position du OH par rapport au P du
cycle), et la configuration des cycles les uns par rapport aux autres.

B. Les terpènes :
Ils ont de longues chaînes carbonées et résultent de la polymérisation d’un hydrocarbure à 5C : l’isoprène ou
2-méthyl 1-3 butadiène.

Suivant le nombre d’unités isopréniques constitutives, on distingue les monoterpènes (2 u.i.), les
sesquiterpènes (3 u.i.), les di-tri-et tetraterpènes.

Exemple :
Β-carotène (caroténoïdes) : précurseur de la vitamine A (= rétinol), elle-même précurseur du rétinal (molécule
importante dans le phénomène de la vision).
Précurseur = composé qui en précède un autre dans une séquence métabolique.
Le passage du rétinol au rétinal se fait par oxydation d’une fonction alcool en aldéhyde. Les doubles liaisons
du rétinal sont conjuguées : il y a délocalisation des électrons entre de nombreuses liaisons, ce qui permet une
excitation par la lumière. Il absorbe donc la lumière sous certaines longueurs d’ondes.
La carence en vitamine A entraîne un développement anormal des os et du système nerveux central, une
dégénérescence des reins et de différentes glandes (stérilité…).
Chez les adultes, un signe précoce de la carence en vitamine A est la cécité nocturne ou déficit d’adaptation à
l’obscurité.
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Les besoins en vitamine A chez l’homme sont < à 1mg par jour et sont très largement couverts par les
légumes verts et jaunes.

Rôle de la vitamine A dans le cycle de la vision chez les vertébrés :


Il y a une séquence de réactions moléculaires impliquant :
- l’absorption de l’énergie lumineuse par un pigment dans les cellules photoréceptrices de la rétine
- une initiation de l’impulsion nerveuse
- régénération d’une forme sensible à la lumière de ce pigment.
La rétine humaine contient deux types de cellules photoréceptrices sensibles à la lumière :
- cellules en bâtonnets adaptées à la perception des intensités lumineuses, mais pas à celle des couleurs.
Cellules impliquées dans la vision nocturne, et dont la fonction est altérée par la carence en vitamine A.
- cellules en cône, sensibles aux couleurs, et bien adaptée aux intensités lumineuses élevées.
Les cellules en bâtonnets contiennent des vésicules membranaires ayant la forme de disques empilés et
disposés parallèlement à la surface de la rétine. Recevant la lumière, ces vésicules servent de récepteurs
lumineux. Les bâtonnets transforment l’énergie lumineuse en énergie électrique vers le nerf optique par des
molécules photosensibles.

Environ la moitié du contenu protéique de la membrane de ces vésicules est formée d’hétéroprotéine
absorbant la lumière : la rhodopsine.
Elle est insoluble dans l’eau et peut être extraite des vésicules par des détergents.
La rhodopsine est formée d’une protéine, l’opsine, à laquelle est solidement fixé par une base de Schiffe au
rétinal, la forme aldéhique de la vitamine A.
Ce produit contient dans sa chaîne latérale quatre doubles liaisons entre atomes de carbone. Trois d’entre elles
sont sous forme trans et la quatrième, située entre C11 et C12 est sous forme cis.
Quand la rhodopsine est exposée à la lumière (quand un photon frappe le disque), la liaison 11-cis du cis-
rétinal subit une transformation donnant ainsi le trans-rétinal. Cette transformation, qui modifie la
configuration de la molécule n’est pas enzymatique, mais purement photochimique.
L’isomérisation du rétinal est suivie d’une série d’autres modifications moléculaires qui entraînent finalement
la dissociation de la rhodopsine décolorée et opsine et en trans-rétinal, ce qui provoque le déclenchement de
l’influx nerveux.

C. Les prostaglandines :
Ce sont des dérivés d’acides gras insaturés (arachidonate) à activité biologique de nature hormonale ou
régulatrice.
Molécules hydrophobes.
Il y a beaucoup de liaisons insaturées, ces molécules sont donc recourbées sur elles-mêmes.
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A faible dose, elles abaissent la pression sanguine et stimulent la contraction des muscles lisses (au niveau de
l’utérus par exemple). Ces molécules sont également impliquées dans les phénomènes inflammatoires.
Les anti-inflammatoires, du type « corticostéroïdes », empêchent la libération de l’arachidonate, ce qui
empêche la synthèse de prostaglandine et diminue donc l’inflammation.
L’aspirine bloque la synthèse des prostaglandines, ce qui a le même effet.

Complexes lipides/protéines :
C’est le système sanguin qui transporte les lipides dans l’organisme. Etant peu solubles dans l’eau, ils sont
transportés en association avec des protéines et forment ainsi les lipoprotéines.
Les chylomicrons, les plus grosses lipoprotéines (1µm) comportent essentiellement des triglycérides, énergie
de réserve (83%). Ils transportent les lipides de l’intestin vers d’autres tissus.

Classification :
Selon la densité plus grande s’il y a plus de protéines et moins de lipides.
- VLDL : Very Low Density Lipoprotein
- LDL : Low Density Protein. Elles véhiculent principalement le cholesterol (libre ou estérifié à un acide
gras). Sur la surface des cellules absorbant le cholestérol, il y a des récepteurs qui interagissent avec les LDL ;
les LDL déversent leur cholestérol à l’intérieur de la cellule car ils ont reconnu le signal (point de vue quantité
ou affinités avec le cholestérol). Le taux de récepteurs est très important : si les cellules ne possèdent pas à
LDL, le cholestérol se dépose n’importe où (ex :artères : risque d’infarctus). La quantité de récepteurs n’est
pas fixe, elle dépend des besoins.
- VHDL : Very High Density Lipoprotein.
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Les lipoprotéines ont deux rôles :


- Solubiliser les lipides hydrophobes
- Contenir des signaux qui régulent les mouvements des lipides particuliers entrant ou sortant des cellules
cibles particulières.
NB : Les lipides sont dégradés par des enzymes spécifiques : les lipases.

Chapitre 3 : Les glucides


Généralités :

- Ce sont de sucres ou hydrocarbures (hydrates de carbone). Leur formule générale est Cn(H2O)n.
- Ce sont les substances biochimiques qui apparaissent les premières au cours de la photosynthèse végétale et
ils représentent sous forme de sucre et d’amidon, une bonne partie de l’alimentation de l’homme, des animaux
et de nombreux micro-organismes.
- Avec les protides (matières azotées) et les lipides (matières grasses), ils constituent l’ensemble des trois
groupes majeurs dont la connaissance est essentielle pour la compréhension des structures biologiques.
- Ce sont les composés biologiques les plus répandus sur terre :
o glucose : 50% du C de la biosphère.
o chitine : cfr. carapace des insectes et des crustacés.
- La photosynthèse permet la formation de ces glucides (matière de réserve) à partir d’H2O et de CO2 (100
milliards de tonnes par an).
- En général, 50% de l’alimentation humaine est constituée de sucres. Dans les pays riches, la consommation
s’élève à 40kg de saccharose par habitant et par an.

Ose = monomère constituant des glucides.


= 1 molécule de sucre (de 3 à 8 C) + des fonctions organiques particulières (abondance de groupements
hydroxyles (alcool), de fonctions cétones ou aldéhydes).
Ose + aldéhyde = aldose
Ose + cétone = cétose
De façon générale, on peut définir les glucides comme des aldéhydes ou des cétones polyhydroxyles.
Tous les oses sont solubles dans l’eau car ils comportent des fonctions qui peuvent interagir avec l’eau
(groupements polaires).
Les oses sont réducteurs. Cela permet des dosages de la quantité de sucre.

On divise les glucides en 3 classes de complexité croissante :


- les oses ou monosaccharides contenant 3 à 7 C, rarement 8.
- les oligoholosides ou oligosaccharides : condensation d’un petit nombre d’oses par l’intermédiaire de
liaisons glycosidiques.
- les polyholosides ou polysaccharides : union de nombreux oses tels que le glycogène ou l’amidon. Ils
donnent des molécules chirales et des fonctions multiples :
o matériel de réserve d’énergie.
o élément de structure (cellulose, chitine…)
o ribose et désoxyribose (ARN et ADN)
o liens avec les protéines et les lipides (glycoprotéines et glycolipides, reconnaissance)
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Ex : (1) et (2) ne sont pas des glucides car ils ne disposent chacun que d’un seul groupement hydroxyl.

I. Les oses simples :


Ce sont les aldoses et cétoses de 3 à 8 C.
Les oses peuvent être classés selon le nombre de C de leur molécule :
o 3 C : trioses o 6 C : hexoses
o 4 C : tétroses o 7 C : heptoses
o 5 C : pentoses o 8 C : octoses(rare)

Ex :

Cétotriose Aldopentose Cétopentose

Les oses peuvent posséder un ou plusieurs (n) carbones asymétriques. Ils possèdent alors 2n isomères optiques
ou stéréoisomères qui ont des propriétés biologiques différentes.
Rappel :
- Les énantiomères sont images l’un de l’autre dans un miroir.
- Les préfixes renvoient à la forme globale de la molécule, et plus précisément à la configuration, à
l’arrangement des groupements autour du centre chiral.
- Lorsque des composés ne contiennent qu’un seul carbone asymétrique, les différences entre les propriétés
chimiques et physiques sont minimes. Ils se différencient toutefois nettement par une propriété physique
particulière, l’activité optique. Il s’agit, en l’occurrence de la capacité qu’a une solution d’énantiomère de
faire tourner le π de polarisation de la lumière.
- On les représente en projection de Fischer :
* le C le plus oxydé est au-dessus
* numérotation des C : le C le plus oxydé est le n°1
* on observe le C asymétrique le plus éloigné : D a le OH à droite
L a le OH à gauche

Exemple : le D-glycéraldéhyde fait tourner le π de polarisation vers la droite.


le L-glycéraldéhyde fait tourner le π polarisation vers la gauche.

D-glycéraldéhyde L-glycéraldéhyde
16

A. Les trioses
Glycéraldéhyde (aldose)
Dihydroxyacétone (cétose)
Pas de C asymétrique  pas de configuration L ou D.

B. Les tétroses
* Cétoses : D-érythrulose L-érythrulose

* Aldoses :

Diastéréoisomère Diastéréoisomère

Les L et les D sont épimères deux à deux, c'est-à-dire


c'est dire qu’ils ne se distinguent que par la position de leur OH
sur le deuxième carbone. Néanmoins, ils sont tout à fait différents d’un point de vues biologique.
Ici, il y a 2 carbones asymétriques, donc 4 stéréoisomères.
stéréoisomè
17

C. Les pentoses
* Cétoses : 2 C asymétriques, donc 4 stéréoisomères.
18

* Aldoses : 3 C asymétriques, donc 8 stéréoisomères.


19

II. Les oses cycliques :


5 C minimum.

A. Les aldoses
a) Le GLUCOSE (6C)
Aldohexose.
Structure du D-glucose
Le glucose est le plus commun des oses. Il figure à l’état libre dans le sang des animaux et sous forme de
polymère, il constitue entre autres l’amidon et la cellulose.
La formule du D-glucose définie en projection de Fischer est dite structure linéaire ou aliphatique, ou encore,
structure en chaîne ouverte. Cette structure n’apparaît qu’en solution et en très petite quantité.

Il existe également 2 formes cristallines du D-glucose, dite et ,caractérisées par des activités optiques
différentes. Les études de diffraction aux rayons x ont confirmé les indications chimiques d’après lesquelles l’
et le -D-glucose sont des structures contenant 1cycle de 5 C et de 1 O.
Glucose : α-D-glucose β-D-glucose

Le C1 est appelé carbone anomérique.


Conventions de la représentation
Représentation de Haworth :
- D si le CH OH est au-dessus du
- L si le CH OH est en-dessous du
- si le OH du C anomérique est en dessous du
- si le OH est au-dessus du
- C et C sont en avant du
- Haworth n’est pas une représentation spatiale réelle (cfr. forme chaise ou bateau)

Découverte de la structure cyclique du glucose


De façon générale, les aldéhydes et les cétones réagissent avec les alcools pour former, en présence d’un
catalyseur acide, des acétals.

La même opération avec le glucose ne produit qu’un hémiacétal. On en conclut que la fonction aldéhyde n’est
pas libre.
Explication :
La formation d’un hétérocycle par la chaîne linéaire du D-glucose peut être considérée comme le résultat
d’une réaction entre le groupement hydroxyl sur C5 et le groupement aldéhyde sur C1, pour donner un
hémiacétal.
20

Le glucose possède donc un hémiacétal interne. En conséquence, le C de l’aldéhyde devient chiral, donnant
naissance à 2 hémiacétals, l’ l’α ou du β-D-glucose.

Ces hémiacétals sont appelés anomères (formes isomères des oses qui ne diffèrent que par la configuration du
C carbonylé) et le C1 de la forme cyclique est appelé C anomérique.
Quand l’ l’α ou du β-D-glucose est dissous dans l’eau, le cycle s’ouvre (opération lente) et la structure linéaire
se forme. Cette réaction est réversible. Un équilibre s’établit entre la forme ouverte et les 2 formes cycliques.

Phénomène de mutarotation :
=consiste à passer de la forme α à la forme β.
Lorsqu’on cristallise du glucose dans le pyridine ou dans l’eau, le pouvoir rotatoire est différent. Le glucose
possède donc deux formes isomériques différentes, leurs propriétés chimiques et physiques différant :
α-D-glucose [α]d = +112°
β-D-glucose [β]d = +19°
Lorsque les isomères de l’α ou du β-D-glucose sont dissous dans l’eau, le pouvoir rotatoire de chacun d’eux
se modifie avec le temps et évolue vers une valeur commune pour laquelle [α]d = +52,7° (cela correspond a un
équilibre entre les deux anomères, la forme linéaire et les deux formes furanose).
Cette modification du pouvoir rotatoire est due à la formation d’un mélange des isomères, qui, à l’équilibre,
contient 32% d’α-D-glucose et 68% de β-D-glucose (forme la plus stable) plus 0,02% de la forme linéaire.
La réaction de passage d’un isomère à l’autre est appelée mutarotation.
Cette mutarotation se fait nécessairement par l’ouverture du cycle (passage par la forme linéaire), phénomène
limité aux molécules ou le OH du C anomérique est libre, c’est-à-dire où il n’y a pas de blocage de réaction.
Si la mutarotation est possible, il existe un pouvoir réducteur.

Passage de la forme de Fischer à la forme de Haworth :


Tout ce qui est à droite chez Fischer se retrouve en-dessous du plan chez Haworth.
D-glucose Glucose cyclique β-D-glucose(Haworth)
21

La cyclisation se fait avec élimination d’H2O. On peut aussi faire un hémiacétal entre le C1 et le C4, mais cette
forme est moins stable.

Il est nécessaire de faire la distinction entre des cycles à 5 et 6 sommets. On appelle les premiers des cycles
pyraniques (6) et les seconds des cycles furaniques par homologie avec les noyaux organiques pyrane et
furane.
Anomères à 6 sommets du glucose = glucopyranose
Anomères à 5 sommets du glucose = glucofuranose.

b) le RIBOSE (5C)
aldopentose.
Forme la + courante= furanose.

furanose
Le ribofuranose est la forme la plus stable (=forme furanose du glucose, qui est la moins stable), celle
présente dans les acides nucléiques.

B. Les cétoses

Le FRUCTOSE (6C)
Hexose.
Forme la + simple = furanose

Il est également possible de former un dérivé cyclique à 6 C.

La forme pyranose est plus sucrée que la forme furanose.


A chaud, c’est le furanose qui se forme préférentiellement.
rq : pas possible de former un cycle stable à partir d’un tétrose.

C. Autres aldohexoses
Le GALACTOSE et le MANNOSE.
Ce sont deux isomères structuraux du glucose.

D-galactose α-D-galactopyranose β-D-galactopyranose

D-mannose α-D-mannopyranose β-D-mannopyranose


22

III. Les osides


Si on fait réagir du glucose avec du méthanol, on obtient un méthyl-glucoside.

β-D-méthylglucose
Il n’y a plus de mutarotation possible car le passage à la forme linéaire n’est plus possible.

A. Les glucosides
Ils résultent de l’interaction d’un alcool et d’un alcool de l’ose.
Les aldopyranoses réagissent facilement avec les alcools en présence d’un acide minéral pour donner des
osides sous les deux formes anomères stables (car pas de mutarotation) α et β. Les osides sont des acétals
mixtes asymétriques, résultants de la réaction du C anomère de la forme hémiacétal intramoléculaire ou
pyranose de l’aldohexose avec l’hydroxyl fourni par un alcool. C’est ce qu’on appelle la liaison osidique.
Chez les osides, le C anomère est asymétrique.

Le METHYLGLUCOSIDE :
C’est le plus simple (glucose + HCl + méthanol (CH3OH))

β-D-glucose β-D-méthylglucopyranose

La mutarotation est abolie car le C anomérique est bloqué par le CH3. La liaison hémiacétal interne ne peut
plus être rompue, et il n’existe plus de pouvoir réducteur.

B. Les disaccharides ou diholosides


Ils résultent de l’association de deux monosaccharides par une liaison glycosidique.

a) le MALTOSE
C’est l’association de deux glucoses par condensation entre les fonctions alcools du C1 et du C4 de chaque
glucose.
α-D-glucopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranose = α maltose

Il y a deux carbones anomériques. Il s’agit d’une liaison osidique α(1-4).


La liaison glycosidique est établie entre le C anomère du premier cycle (α) et le C4 du deuxième cycle (α ou
β), le dernier possède donc un carbone anomère libre (à l’extrême droite de la figure), de sorte qu’il peut
exister une forme α ou β du maltose.
Comme il y a mutarotation, il existe toujours un pouvoir réducteur.
Le type de liaison (α ou β) est déterminé par le premier cycle.

b) le LACTOSE
Association d’un galactose β et d’un glucose α ou β.
β-D-galactopyranosyl-(1-4)- β-D-glucopyranose

Liaison β(1-4).
Le lactose se trouve à la teneur de environ 5% dans le lait.
23

Le C anomérique du glucose est libre. Le lactose est donc un réducteur dont l’hydrolyse fournit une molécule
de glucose et une molécule de galactose β. Il peut y avoir mutarotation.
La β galactosidase est un enzyme qui clive le lactose, mais pas une molécule identique qui aurait une liaison
α(1-4).

c) le SACCHAROSE
Association de glucose α et de fructose β (formation d’un acétal).
C’est un sucre ordinaire extrait de la canne à sucre ou de labetterave.
saccharose

α-D-glucopyranosyl (1-2) β-D-fructofuranoside

Terminaison en –ide car le C anomérique fait partie de la liaison.


La liaison entre les deux oses se fait par les deux C anomères. Il existe donc une seule forme de saccharose :
toute forme ouverte, aldéhydique ou cétonique, est impossible (plus de mutarotation). De ce fait, le saccharose
n’est pas réducteur.
L’enzyme invertase est capable d’hydrolyser le saccharose, on parle alors d’inversion du saccharose.
[α]D20 = 65,5° pour le saccharose
[α]D20 = 52,7° pour le glucose
[α]D20 = -92° pour le fructose

Remarque : pouvoir sucrant :


o Saccharose : 100
o Fructose : 170
o Saccharine : 40000
24

C. Les polysaccharides
Ce sont des substances de poids moléculaire très élevé, résultant de la polymérisation de plusieurs oses (de
100 à 1000) et de taille très variable.

Rôles : - matériel de réserve énergétique


- constituants de parois cellulaires (végétaux)
- lubrifiant de cartilages dans les articulations

Il existe deux types de chaînes : linéaires ou branchées (ramifiées).


Il y a aussi deux catégories de polysaccharides : les homopolysaccharides (un seul monomère répété
plusieurs fois) et les hétéropolysaccharides.

1. Les homopolysaccharides (homopolyoside)


a) l’amidon
C’est un matériel de réserve stocké notamment dans les graines et les racines des plantes.
Il est constitué de deux homopolymères : l’amylose (15%) et l’amylopectine (85%).
L’amylose
Comme la cellulose, elle est constituée d’unités de glucose (glucopyranose) liées entre elles par une liaison
α(1-4). Il y a environ 100 à 300 cycles de α-glucose.

L’amylopectine
C’est un matériel de réserve qui donne par hydrolyse du maltose puis du glucose.
La constitution des chaînes est donc analogue à celle de l’amylose mais la structure d’ensemble de la
molécule est beaucoup plus complexe.
Il y a plusieurs centaines de chaînes, comportant chacune 20 à 25 unités de glucose liées par des liens α(1-4),
ces chaînes étant réunies selon un schéma ramifié par des liaisons glycosidiques de type α(1-6) à une chaîne
principale entourée en hélice (6 résidus par tour d’hélice). Cela peut donner une molécule compacte et mener
à la formation de granules. Il y a environ un embranchement tous les 30 résidus.

b) le glycogène
Il est analogue à l’amylopectine mais en plus compact.
Il est produit et stocké par les animaux pour constituer une réserve énergétique (foie, muscles…). Il
correspond à l’amidon chez les cellules végétales.
25

Dans les c du foie, le glycogène se présente sous forme de gros granules qui sont en fait des amalgames de
granule +petites composées de molécules uniques, fortement ramifiées. Ils ont 1poids moléculaire de plusieurs
millions.
Tout comme l’amylopectine, le glycogène est un polyoside formé de D-glucose en liaison α(1-4). Il est
toutefois plus ramifié que l’amylopectine : les ramifications s’insèrent tous les 8 à 12 résidus de glucose par
une liaison α(1-6).
L’enzyme amylase est capable de cliver les liaisons α(1-4), mécanisme utilisé pour récupérer de l’énergie sous
forme de glucose.
- α amylase = endoglycosidase : capable de cliver à l’intérieur de la chaîne.
- β amylase = exoglycosidase : attaque la chaîne par l’extrémité.
Dans ce cas, α et β n’ont rien à voir avec le type de liaison clivée.
L’ α amylase se trouve dans la salive et le pancréas, et la β amylase se trouve dans les graines d’amidon
(système permettant la germination : fournit l’énergie pour le développement).
Les α et β amylases hydrolysent le glycogène en libérant du glucose et du maltose.

c) la cellulose
C’est le polysaccharide de structure de la paroi cellulaire le plus abondant du règne végétal (50% du C de la
biosphère).
C’est un polymère linéaire du D-glucose en β(1-4). Le type de liaison est la seule différence avec l’amylose,
mais cela a pour conséquence la formation de très longues chaînes (10000 glucoses).

Les fibres de cellulose sont très différentes de l’amidon point de vue structure : chaîne linéaire, structure
plane. Les fibres interagissent entre elles par lien H et par des interactions de VdW entre les C, du fait de la
proximité des groupements. Ces interactions entraînent rigidité et résistance (bois).
Le tube digestif de la plupart des mammifères ne sécrète pas d’enzymes capables d’hydrolyser les liaisons
β(1-4), ils n’assimilent donc pas la cellulose (les α et β amylases ne conviennent pas). Seuls les ruminants
utilisent la cellulose comme aliment grâce à des bactéries du rumen qui synthétisent des cellulases, capables
d’hydrolyser la cellulose en D-glucose (assimilable).

d) la chitine
C’est un élément majeur de l’exosquelette (carapace) des insectes et des crustacés. Chez ces derniers, la
dureté de la carapace provient de l’incorporation de CaCO3 dans la matrice de chitine.
La chitine est un homopolymère de N-acétyl-D-glucosamine (glucose modifié) à liaison β(1-4) (semblable à
la cellulose).
26

2. Les hétéropolysaccharides (hétéropolyosides)


Il en existe une très grande variété.

a) acide hyaluronique.
Il s’agit de l’association d’acide β-D-glucoronique et de β-N-acétylglucosamine par une liaison β(1-3).

Rôle : c’est une substance fondamentale du tissu conjonctif des vertébrés qui se trouve comme lubrifiant dans
le liquide synovial des articulations (genoux) et dans l’humeur vitreuse de l’œil.
Grâce aux charges, il y a répulsion entre les chaînes et les polymères glissent les uns sur les autres. Les
groupements carboxyliques (COO-) lui permettent de se dissoudre dans l’eau en donnant des solutions
extrêmement visqueuses. Cette viscosité est contrôlée par le clivage des chaînes grâce à des enzymes
spécifiques.

b) mucopolysaccharides acides
ils sont formés à base d’acide hyaluronique.
Ils contiennent 2 types d’oses alternés (répétition d’un groupement de 2oses) dont 1 au moins possède un
groupement acide (carboxyl ou sulfurique).
Ils sont constitués de sucres possèdant des charges, ils ont un aspect de gel.

c) chondroïtines
ces polymères peuvent fixer des cations responsables de la calcification. Ils sont généralement associés à des
protéines par l’intermédiaire d’alcools.

d) eparines
Ce sont des molécules très chargées formant des fibres chargées qui interviennent dans les phénomènes de
coagulation.

3. Les protéoglycanes et peptidoglycanes


a) protéoglycanes
Association d’hétéropolysaccharides et de protéines.
Formation de chaînes protéiniques avec des fibres latérales. Parfois, ces protéines se fixent elles-mêmes sur
une chaîne d’hétéropolysaccharide.
La fixation du sucre se fait au niveau de certains acides aminés qui portent :
- des fonctions amides (aspargine, glutamine)
- des fonctions alcools (thréonine, sérine)
27

b) peptidoglycanes
C’est une armature rigide qui forme la paroi bactérienne sur laquelle viendra se fixer divers organites selon les
bactéries.
Il s’agit d’une liaison entre des petits peptides et des sucres.
Ex : muréine : N-acétyl-D-glucosamide lié en (1-4) à l’acide N-acétyl-muranique.
Sa structure résulte de la répétition d’une unité de base, la muropeptide. Les muropeptides sont reliés entre
eux par des liaisons peptidiques, ce qui confère à la bactérie une paroi rigide (protection physique).
Une ensyme, le lysozyme, présent dans les larmes, clive les liaisons entre les sucres de la muréine ce qui
entraîne la destruction de la paroi bactérienne et donc de la bactérie.

Chapitre 4 : Les protéines


Généralités :
Les protéines sont des polypeptides d’origine naturelle dont la masse moléculaire dépasse 5000 D. Cela
dépend de toute évidence des acides animés qui les composent.
Ces macromolécules sont très diverses quant à leurs propriétés physiques (des enzymes solubles dans l’eau à
la kératine des cheveux insoluble, aux écailles et aux cornes…) et remplissent une vaste gamme de fonctions
biologiques.
Les protéines ont une structure et une taille parfaitement définies et des modifications extérieures peuvent
changer complètement leur fonction. Elles possèdent un contenu d’information, l’ordre des acides aminés est
important.
Il existe entre 20000 et 50000 protéines différentes dans une cellule d’eucaryote.

Il y a deux catégories :
- les protéines fibreuses, insolubles : -collagène : structure de l’os (avec du CaPO3)
-kératine : structure du cheveu, de l’épiderme.
- les protéines globulaires, solubles, qui ont le plus souvent un rôle enzymatique : -hémoglobine
-lysosyme

Fonctions :
1) Catalyse enzymatique : les enzymes sont des catalyseurs protéiques capables de multiplier les vitesses
de réaction par des facteurs allant jusqu’à 1012.
2) Transports et stockage : beaucoup de petites molécules et d’ions circulent dans le sang et sont amenés
à l’intérieur des cellules par des protéines auxquelles ils sont liés.
Ex : l’hémoglobine est une protéine transporteuse d’O2.
3) Fonctions mécaniques : les protéines remplissent souvent un rôle structural.
Une protéine fibreuse, le collagène, présente dans la peau, les tendons, les cartilages, les os, les dents,
fournit à ces tissus une grande résistance à la traction.
Les membranes enveloppant les cellules et les organites cellulaires sont aussi constitués partiellement
de protéines dont le rôle est à la fois structural et fonctionnel.
4) Mouvement : la contraction musculaire résulte de l’interaction entre deux types de filaments
protéiques : l’actine et la myosine.
28

5) Protection : les anticorps sont des protéines aidées chez les mammifères par le complément, un
complexe de protéines intervenant dans la destruction de cellules étrangères (immunoglobuline).
6) Message : des hormones contrôlent la croissance et la différenciation (cytokines).
7) Antigel : chez des poissons de l’Arctique, certaines protéines n’ont pas d’autre fonction que d’éviter le
gel du sang.

Composition des protéines


Les protéines sont insolubles dans les solvants organiques.
Si l’on chauffe des protéines dans de l’HCl 6M, leur hydrolyse libère les acides aminés qui les composent.
C’est en faisant bouillir de l’os avec de l’HCl puis en milieu basique que les 1er chercheurs ont obtenus de la
gélatine, en dénaturant le collagène.
Si on continue l’expérience en milieu HCl, on arrive finalement à un acide aminé appelé glycocolle ou sucre
de colle (= glycine).
Os  (HCl)  collagène  (base)  gélatine  (HCl)  glycocolle.
De la même manière, l’hydrolyse de la soie donne de la sérine.
Protéine= succession d’acides aminés.
Comprendre la structure chimique d’une protéine implique la détermination de la structure de ces acides
aminés.
Forme générale de l’acide aminé
29

On a remarqué que tous les acides aminés contiennent de l’azote.

R : variable, cela justifie la diversité des protéines.


C : asymétrique, il y a donc 2 formes possibles : L et D
Tous les acides aminés des protéines sont de forme L, sauf s’ils ont été synthétisés autrement que par les voies
de la biosynthèse. Dans la muréine, il y a cependant association d’acides aminés L et D, mais c’est très rare.
Certains acides aminés n’ont pas de C asymétrique (ex : glycine) alors que d’autres peuvent en avoir 2 ou plus
(ex : isoleucine, mais il n’en existe qu’une seule forme dans la nature).
Toutes les protéines sont constituées de séquences linéaires d’acides aminés réunis par des liaisons
peptidiques entre la fonction amine d’un acide aminé et la fonction carboxylique de l’acide aminé précédent.
Cette liaison est formée lors d’une réaction de condensation qui exige un apport d’énergie.
Cette condensation fait perdre leur acidité ou basicité au groupement carboxyle et amine qui interviennent
dans la formation de la liaison.
Les acides aminés peuvent donc constituer des copolymères par formation de liaisons peptidiques avec perte
d’une molécule d’eau.

Chacune de ces liaisons peptidiques constitue un pivot autour duquel 2 acides aminés adjacents peuvent
tourner l’un par rapport à l’autre.
Il existe des acides aminés qui possèdent un groupement – CH2-SH (ex : cystéine). Il peut y avoir des
groupements entre acides aminés par ponts disulfures. Ces ponts stabilisent la protéine.
Ex : cystéine + cystéine = cystine
30

20 acides aminés différents interviennent dans la synthèse des protéines.


Dans de nombreuses protéines, certains acides aminés sont modifiés après leur incorporation, mais pas lors de
la synthèse de la protéine.
Ex : dans le collagène, un groupement hydroxyle (OH) vient s’ajouter à plusieurs résidus de proline, ce qui
conduit à des résidus d’hydroproline.
Les acides aminés sont généralement hydrophobes ; certains sont hydrophiles.
La charge portée par l’acide aminé et sa tendance à interagir avec l’eau sont très importantes.
Il est utile de classer les acides aminés selon qu’ils soient :
- polaires ou non polaires
- aromatiques ou aliphatiques
- acides ou basiques

Structure du résidu (ou chaîne latérale, cf premier schéma) R :


1.Chaînes latérales à caractère aliphatique :
(totalement hydrophobe)
CH3
Glycine : -H (polaire) Leucine : -CH2-CH (non polaire)
CH3
Alanine : -CH3 (non polaire)

CH3
Valine : -CH (non polaire) Isoleucine : -CH-CH2-CH3 (non polaire)
CH3 CH3

2.Proline :
(la structure complète de l’acide aminé est décrite)

3.Chaînes latérales comportant un groupement alcool :


(hydrophiles)

Sérine :(polaire) Thréonine :(polaire)

4.Chaînes latérales à caractère aromatique :


(hydrophobe/hydrophile)
Phénylalanine : (non polaire) Groupement hydrophobe. Le gros groupement R va avoir des conséquences sur
l’orientation.

Tyrosine : (polaire) Groupement essentiellement hydrophobe.

Tryptophane : (non polaire) Groupement hydrophobe.

5.Chaînes latérales contenant un atome de soufre :


Cystéine : -CH2-SH (polaire)
31

Les groupements thiols peuvent faire des liens disulfure entre eux, ce qui constitue un élément de stabilité.

Méthionine : -CH2-CH2-S-CH3 (non polaire)


Pas de ponts.

6.Chaînes latérales à caractère acide :


Hydrophiles.
Acide aspartique : -CH2-COO- (acide)
COO- = fonction carboxylique.
Acide glutamique : -CH2-CH2-COO- (acide)

7.Acides de l’acide aspartique et de l’acide glutamique :

Asparagine
Glutamine

8.Chaînes latérales à caractère basique :


Lysine ( NH+3 = groupement amine )
Arginine
Histidine

Nomenclature:

Acide amine Symbole à Symbole à 1


3 lettres lettre
Alanine Ala A
Arginine Arg R
Asparagine Asn N
Acide Asp D
Aspartique
Cystéine Cys C
Glutamine Gln Q
Acide Glu E
glutamique
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Ile I
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Methionine Met M
Phenylalanine Phe F
Proline Pro P
Serine Ser S
Thréonine Thr T
Tryptophane Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V
32

Structure générale:
Projection de Fischer pour un acide aminé de la série L :

Comportement acido-basique des acides aminés simples


De nombreuses molécules biologiques possèdent plus d’un groupement dissociable. Or, la dissociation d’un
groupement donné peut avoir de fortes conséquences sur la tendance des autres groupements à se dissocier.
Les acides aminés, puisqu’ils contiennent à la fois des carboxyles et des fonctions amines, illustrent ce
phénomène.
Dans l’eau, le groupement carboxyl tend à se séparer d’un proton alors que le groupement amine fixe un
proton. Les acides aminés portent donc à la fois une charge « - » et une charge « + » en solution proche du
pH neutre. Dans cet état, on les appelle des zwitterions (ions dipolaires).
(Certains acides aminés ont une troisième fonction ionisable. Ce sont des zwitterions)

On peut faire une courbe de titrage des acides aminés.

Titrage des acides aminés :


On peut étudier le comportement dipolaire des acides aminés en examinant leur titration.
Soit par exemple, une solution d’alanine dans laquelle les 2 groupements sont sous leur forme acide.
L’addition de NaOH entraîne des variations du pH dans la solution.
pKa de l’amine= 9,69
pKa de l’acide= 2,34
pH isoélectrique= point auquel on va commencer à enlever les H+ à l’amine, les 2 charges se trouvent sur
33

l’acide aminé. Au pH isoélectrique le nombre de charges « + » est égal au nombre de charges « - » , les acides
aminés ne migrent pas dans le champ électrique, c’est le point de stabilisation de l’électrophorèse

Chaque acide aminé va avoir une courbe différente, en fonction du groupement R.


Exemple : l’alanine

Au fur et à mesure que l’on ajoute de la soude, on atteint un premier palier qui correspond à la dissociation de
l’acide carboxylique.
(1) Au début, les deux groupements sont sous leur forme acide, ils sont protonés et l’acide aminé est alors un
acide diprotique.

A la suite de l’addition de NaOH, un des groupement est presque complètement déprotoné et la molécule ne
porte plus de charge nette. On a deux formes en présence.

( effet tampon)
(2) On a en solution

( effet tampon)

Rappel :
-COOH = acide faible, donc réaction d’ionisation.

H2O + RCOOH  RCOO- + H3O+


Kéq = KC = [RCOO-] [H3O+] / [H2O] [RCOOH]
Ka = [H2O] KC = [RCOO-] [H3O+] / [RCOOH]

pH = - log [H3O+]
pKa = - log Ka
pH = pKa - log[RCOO-] / [RCOOH]

Si [RCOO-] = [RCOOH], alors pH = pKa.


En titrant l’acide aminé, on détermine sa constante de dissociation. On peut même faire le titrage sur des
protéines entières.

Utilité du titrage :
- détermination du pKa des acides aminés.
- détermination du pH isoélectrique.

Si on hydrolyse la protéine, au fur et à mesure on titre de plus en plus de fonctions.


Quand on titre une grande protéine, tous les acides et les bases sont liés par des liens peptidiques.
Quand on hydrolyse, on « libère » ces liens.

Rappel :
Peptide = petite chaîne d’acides aminés (~10)
Protéine = grand peptide
La longueur d’un peptide est très variable (de 50 à plusieurs milliers d’acides aminés).
34

Niveaux de structure d’une protéine :


Il apparaît que la structure bien propre à chaque protéine définit la fonction de cette même protéine, elle joue
donc un rôle fondamental.
On détermine la structure d’une protéine à plusieurs niveaux :
- structure primaire : détermine la séquence des acides aminés, encore appelée séquence protéique.
- structure secondaire : hélice α ou feuillet β
- structure tertiaire : détermine la forme de la protéine.
- structure quaternaire : assemblage des sous-unités.
I. Structure primaire :

A. Séparation et purification des protéines :

Pour déterminer la séquence d’acides aminés, il est indispensable de purifier la protéine.


La 1er étape de cette purification exige souvent de séparer ces molécules des solutés de faible masse molaire.
On obtient un certain degré de séparation par des procédés basés sur les propriétés physiques des protéines
(charge électrique, taille moléculaire, solubilités différentielles dans divers solvants…).
Finalement, on parvient à un degré élevé de pureté grâce à leur affinité spécifique pour certains composés
fixés sur un support solide (chromatographie).

A. Comment séparer les protéines des molécules de faible masse molaire ? Par dialyse.
Les molécules de protéine ont une masse molaire élevée qui dépasse 5000D. Elles seront donc retenues par
une membrane de cellophane qui permet le libre passage de molécules plus petites (membrane semi-
perméable).
Cette perméabilité sélective fonde le procédé de dialyse qui consiste à placer la solution (protéines + petites
molécules) dans un « boudin » en une sorte de cellophane (sac à dialyse) qu’on plonge dans un grand volume
de solution tampon (pH = 7). Les petites molécules diffusent au travers du sac dans le tampon environnant,
tandis que les protéines restent emprisonnées dans le sac

C’est une méthode applicable pour les protéines globulaires.


On peut progressivement diluer les petites molécules, les protéines restent dans le sac. Et on peut effectuer
plusieurs fois ce procédé si on place le sac dans un tampon propre.

B. Comment séparer les protéines entre elles ?


a. Tamisage moléculaire (chromatographie)
La séparation des protéines selon leur taille peut s’effectuer grâce à l’infiltration sur gel.
Cette technique repose sur la diffusion des molécules de protéine à travers les pores d’une matrice de gel
placée dans une colonne (tamis moléculaire).
Les grosses molécules vont plus lentement que les petites, il y a donc séparation. Après un certain temps, on
procède à une chromatographie.
Un gel couramment utilisé est le dextran, un polymère du glucose sous forme de très petites billes poreuses.
35

b. Séparation selon la charge globale de la protéine (chromatographie)


Il s’agit d’une chromatographie sur un support possédant des groupements chargés à un certain pH. Ce
procédé est valable pour les protéines possédant des chaînes latérales chargées et se base sur le principe de la
chromatographie échangeuse d’ions.
- On place dans la colonne un support comportant un système SO3- par exemple.
On sait qu’à un pH, la charge globale dépend de tous les groupements, c’est une fonction de la séquence
d’acides aminés (voir titrage des acides aminés).
- On s’arrange pour que la charge globale de la protéine voulue soit positive à un pH déterminé. Donc, elle
s’accroche par interaction électrostatique. Une autre protéine n’est pas positive à ce pH et n’est donc pas
retenue ( séparation).
- En faisant varier le pH d’élution, la protéine se détache du support SO3- et on peut la prélever à la sortie.
 Il faut faire en sorte que les molécules sortent de manière séquentielle.

c. Séparation selon la taille et la charge (électrophorèse)


C’est un procédé efficace de séparation basé sur le mouvement de protéines électriquement chargée dans un
champ électrique (E).
Cette méthode consiste à établir un gel d’une certaine porosité (gel acrylamide), aux bornes duquel on soumet
une certaine différence de potentiel (ddp). Les protéines se déplaceront en fonction de la charge de leurs
acides aminés. Plus la protéine est grosse, et plus elle va être retardée. A charges égales, on aura beaucoup
plus de petites protéines que de grosses.
Si on arrête l’électrophorèse, on aura une séparation selon la taille et la charge. Il y a moyen de retrouver une
protéine bien précise.
36

B. Détermination de la séquence des acides aminés :

La structure et les propriétés des peptides dépendent de façon importante de la séquence des acides aminés
dans la chaîne peptidique.
En 1953, F. Sanger a déterminé la séquence des 53 résidus (acides aminés) que contient l’insuline.

A) Composition en acides aminés :


Il faut déterminer le nombre de résidus de chaque type dans la molécule de protéine (cfr analyse en acides
aminés).
Si l’on chauffe les protéines pendant 24h à 110°C dans de l’HCl 6M, leur hydrolyse libère les acides aminés
qui les composent. Les liaisons peptidiques sautent, on a tous les acides aminés de la protéine.
Ensuite on effectue une chromatographie par échange d’ions (basée sur le comportement acido-basique des
protéines, lié au radical R propre à chaque protéine) afin de séparer les acides aminés.
Cette méthode repose sur l’interaction électrostatique entre une molécule chargée et une particule stationnaire
d’une résine échangeuse d’ions portant une charge de signe opposé. La force de l’attraction entre la molécule
et la particule de résine dépend de la charge de la molécule, et par conséquent, du pH de la solution.
L’interaction peut être modifiée au cours du processus en faisant varier le pH ou la concentration de la
solution saline d’éluant (voir plus haut). On libère ainsi progressivement les différents acides aminés

20 pics correspondant
aux 20 acides aminés.
Profil caractéristique
avec position
standard des acides
aminés.
En mesurant la
surface en dessous de
chaque pic, on peut
connaître le
pourcentage de
l’acide aminé par
rapport aux autres.
37

B) Détermination des acides aminés terminaux :

a) Acide aminé NH2 terminal


C’est le premier acide aminé.
Le réactif de Sanger, le fluoro-2,4-dinitrobenzène (FDNB) ou 2-4dinitrofluorobenzène ne réagit qu’avec une
amine, et peut donc servir à l’identification des résidus N terminaux.
Il va servir de marqueur.
On va totalement hydrolyser la chaîne polypeptidique qui a fixé ce système. Il va y avoir clivage de toutes les
liaisons peptidiques mais la liaison C-N entre le réactif et le premier acide aminé est conservé.
On va donc pouvoir isoler le premier acide aminé associé au réactif de Sanger.
On a en solution : réactif de sanger

Réactif accroché a une protéine, le lien se rompt et le


réactif « pars » avec le premier a.a.

Si le 1er acide aminé est par exemple l’alanine (R = H), alors on a du 2,4dinitrophényalanine.
On détermine l’acide aminé par chromatographie : les conditions standardisées (T° et pH) permettent de
connaître la position des acides aminés ayant réagi dans la distribution des pics.
On soumet le tout à une chromatographie et il apparaît un pic à l’endroit correspondant à l’acide aminé fixé au
groupement réactif. Dés lors, on peut déterminer l’acide aminé.
Ce nouveau pic est d’autant plus facile que le dinitrophényalanine est coloré.
Si on trouve plusieurs acides aminés terminaux par cette méthode, on peut conclure que la protéine n’est pas
pure.
b) Acide aminé carboxyl (COOH) terminal
C’est le dernier acide aminé.

* 1ère méthode (chimique)


Réduction de la fonction COOH en un alcool CH2OH.
Après hydrolyse et chromatographie, le nouveau pic = amino-alcool qui migre différemment de l’acide aminé
puisque la charge est différent

* 2ème méthode (enzymatique)


L’enzyme, exopeptidase ou protéase, provoque le clivage des liaisons peptidiques terminales.
Si on prend le carboxypeptidase, on favorise le clivage sélectif à partir de la dernière liaison peptidique en
amont du COOH.
On arrête l’hydryle (si on est dans de bonnes conditions) et on récupère le dernier acide aminé libre (que l’on
peut identifier par chromatographie) et la chaîne intacte (n-1 acides aminés).
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L’enzyme n’agit pas de la même façon (à la même vitesse) sur toutes les chaînes, ce qui fait que l’on ne peut
pas déterminer toute la séquence.

C) Détermination de la séquence complète d’acides aminés : méthode d’Edman

a) Méthode
On fait réagir la protéine avec le réactif d’Edman , le phénylisothiocyanate. Celui-ci se fixe sur le premier
acide aminé et on a un phénylthiocarbonyl.

Le réactif peut réagir avec le NH2 terminal, formant une liaison très sensible à l’hydrolyse.
L’hydrolyse est ménagée en condition anhydre mais acide à 100°C, on forme un cycle qui contient le premier
acide aminé + la chaîne restante.
On peut récupérer le premier acide aminé de la chaîne car il n’y a pas
de clivage.
Il y a clivage de la liaison peptidique adjacente, on forme un
hydantoïne.
Si cela se fait dans des conditions ménagées, toutes les liaisons
peptidiques restent intactes sauf la première. Par chromatographie, on
peut identifier l’hydantoïne ;
Le reste de la chaîne est récupérable pour une nouvelle expérience.

De manière récurrente, on peut ainsi arriver à éliminer acide aminé par


acide aminé du côté NH2. Il faut faire au préalable des standards tel que
la dinitrophényl-glycine afin de connaître leur position dans la
distribution des pics sous de mêmes conditions de température et de
pH.
Il est important de savoir que cette méthode ne fonctionne qu’un
39

certain nombre de fois (~30) car le rendement n’est pas de 100% (95-96%) : certaines chaînes n’ont pas
réagi :
- 96% du 1er acide aminé
- 96% du 2e acide aminé + quelques % du 1er acide aminé
- 96% du 3e acide aminé + quelques % du 1er acide aminé + quelques % du 2e acide aminé.
De plus, on ne doit pas détruire les liaisons à l’intérieur de la chaîne. Mais comme il existe des liaisons plus
faibles, il peut arriver que la chaîne casse, libérant des –NH2 terminaux. Les réactifs réagissent donc avec
deux chaînes qui ne devraient en former qu’une.
 Il est difficile de contrôler l’enzyme de manière telle qu’il n’hydrolyse qu’un seul acide aminé. A chaque
étape, il existe un risque (limité) d’hydrolyser un peptide supplémentaire ou d’obtenir une réaction
incomplète. Ce risque cumulé devient significatif après environ 30 acides aminés.
Solution : On forme des peptides d’environ 30 acides aminés par clivage contrôlé de la protéine purifiée. On
forme ainsi des peptides bien définis et parfaitement les mêmes pour les mêmes protéines.

b) Fragmentation spécifique de la chaîne polypeptidique


De nombreuses protéines contiennent des centaines de résidus (acides aminés), et il est impossible de réaliser
le séquençage en une seule fois, à cause de l’incertitude accumulée d’étape en étape.
Il est donc opportun de couper d’abord la protéine en fragments plus petits et plus faciles à traiter.
Les petits peptides obtenus sont séparés par chromatographie.
De plus, la protéine peut comporter des ponts disulfure entre des résidus de cystéine appartenant à des
segments différents de la chaîne.
Ces liaisons doivent être rompues pour permettre la poursuite du séquençage.
Il est donc indispensable de trouver des moyens de cliver la protéine de manière spécifique et reproductible.

* Méthode enzymatique :
On fait appel aux enzymes protéolytiques (protéases), qui clivent les liens peptidiques à l’intérieur de la
chaîne.
Ex : - trypsine : clive les liens peptidiques en aval (du côté COOH) d’une arginine ou d’une lysine
exclusivement. Comme ces deux acides aminés sont peu représentés, il y a peu de fragments.
Ceci est un exemple d’intérêt de connaître le pourcentage de chaque acide aminé dans la protéine.
- chymotripsine
- pepsine

* Méthode chimique :
Il n’existe pas toujours tous les 30 acides aminés un acide aminé ad hoc pour l’utilisation des enzymes. On
utilise alors du bromure de cyanogène (CNBr) pour cliver la molécule au niveau des méthinonines (aa soufré).
On obtient un lactone (homosérine lactone) par cyclisation de la méthionine.

c) Reconstitution du polypeptide
On a soumis les peptides à la méthode d’Edman pour déterminer leur séquence d’acides aminés.
Le problème est maintenant de retrouver l’ordre de ces peptides dans la protéine.
40

Il faut pour cela au moins 2 ensembles de séquences peptidiques obtenues par 2 méthodes de clivage
différentes. Ces séquences se chevauchent puisque les différents réactifs ne clivent pas au niveau des mêmes
acides aminés, ce qui permet de retrouver les acides aminés communs (zones homologues).
Ex : On a déterminé l’acide aminé NH2 terminal (leucine : L) et l’acide aminé COOH terminal (arginine : R).
On a clivé au niveau des E et on a obtenu :
NIR, LARE, RCHE, CHE, STLAVE, CE
Puis on a clivé au niveau des A et des C et on a obtenu :
VENIR, REC, HEC, ESTLA, HERC, LA
 LA RECHERCHE C’EST L’AVENIR
d) Ponts disulfures
La présence de ces ponts pose problème lors de la détermination de la séquence des acides aminés. Il faut les
cliver avant le séquençage. On va les oxyder.
Ex : insuline :
2 chaînes polypeptidiques liées entre elles par des L.S., et existence de L.S. intra-chaîne.
L’activité de la protéine est dépendante de la présence des L.S., et leur position est parfaitement définie.

Pour cliver les L.S., on fait réagir avec l’acide performique. Les cystéines sont oxydées en SO3-. Cette
méthode est irréversible.
La position des ponts S est déterminée par une méthode que nous ne verrons pas.
L’oxydation de groupements SH libres à la surface de certaines protéines peut amener 2 molécules à
s’associer par covalence en formant un pont disulfure. Ce processus est biologiquement néfaste et les cellules
possèdent des agents réducteurs pour prévenir ou inverser une telle réaction.

C. Conclusions :
- les chaînes de protéines ne sont pas ramifiées mais linéaires
- les seules liaisons covalentes d’une protéine sont les liens peptidiques et les ponts disulfures (exception : le
collagène).
- il n’y a pas de périodicité dans l’ordre des acides aminés ; il est parfaitement défini et à priori arbitraire
- des protéines d’espèces différentes ayant la même fonction ont des séquences analogues mais ne sont pas
entièrement identiques (il existe des homologies).
Les histones sont une exception ne présentant que très peu d’évolution d’une espèce à l’autre. Cela prouve
que la fonction des histones est très précise, et que toute mutation à leur niveau est létale.
- la séquence est cruciale pour la fonction de la protéine.

D. Les glyco-protéines :
Les protéines ne sont pas uniquement un enchaînement d’acides aminés, il peut y avoir des modifications
après assemblage.
Les glycoprotéines ont des oses fixés à la chaîne d’acides aminés. Elles jouent un rôle de reconnaissance, et
donc beaucoup de protéines de la surface des cellules contiennent des oses.
* N-oligosaccharides : fixés sur un acide aminé qui possède un groupement amide (aspargine, glutamine)

* O-oligosaccharides : fixés sur un acide aminé qui possède un groupement alcool (thréonine, sérine).
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Toutes les protéines exportées sont glycosylées. Le rôle de l’ose est très important pour la fonction et la
spécificité de la protéine.
Ces oses font partie de la structure primaire de la protéine.
Ex : les différents groupes sanguins dépendent d’une différence d’oses.

II. Dénaturation des protéines – Structure spatiale :


Reployée dans l’espace d’une manière très spécifique, la protéine possède une fonction qui lui est propre.

Dénaturation
= faire perdre à la protéine sa configuration spatiale correcte, ce qui est différent du clivage du lien peptidique.
La modification de la structure entraîne une perte des caractéristiques biologiques de la protéine.
La dénaturation se fait par des températures supérieures à 50-60°C, un milieu acide, un agent dénaturant
(l’urée ou un détergent comme le dodécylsulfate de sodium (SDS)) à concentration élevée.
La plupart des molécules protéiques ne conservent leur activité biologique qu’à l’intérieur d’étroites limites de
pH et de température.
Lors de la dénaturation, les chaînes polypeptidiques restent intactes, donc la structure primaire reste intacte.
Exemples :
- Cuire un œuf = dénaturation de l’albumine (irréversible)
- Fromage = dénaturation d’une protéine de lait, la caséine, qui précipite en milieu acide (irréversible)

Conclusion : Ce qui est important est que la séquence en acides aminés d’une chaîne polypeptidique contient
l’information nécessaire pour lui imposer sa conformation native, et que cette conformation native détermine
son activité biologique.
La dénaturation des protéines n’est pas toujours irréversible : le reploiement de la protéine peut restaurer une
activité biologique (ce qui est très rare), mais elle ne peut jamais créer une activité biologique qui n’existait
pas dans la protéine native.

Expérience d’Anfinsen (1953) :


Il montre qu’il y a moyen d’avoir une
dénaturation réversible.
Ex : la ribonucléase, enzyme qui hydrolyse les
ARN (clive les liaisons ester) contient 8
cystéines et donc 4 ponts disulfures qui
contribuent à stabiliser sa conformation.
On fait agir le mercaptoéthanol (HS-CH2-
CH2OH) qui va cliver les ponts disulfures de
manière réversible (pas comme l’acide
performique). La protéine conserve sa forme
initiale.
Si on ajoute de l’urée 8 molaires (agent
dénaturant) qui rompt les liens H, la protéine
perd toute structure, donc toute activité
biologique.
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Anfinsen a fait réagir une protéine dans une solution contenant du mercaptoéthanol et de l’urée. Il a ensuite
laissé la protéine se débarrasser de ses substituants (mercapto et urée), par dialyse.
On retrouve alors une protéine qui possède toutes ses propriétés initiales d’un point de vue configuration et
activité. Il y a donc eu un choix qui s’est fait spontanément pour reprendre sa forme initiale, ce qui démontre
bien que l’information est inscrite dans la séquence de la protéine (il n’y a pas de moule pour former la
structure), et que, de plus, il n’existe qu’une seule configuration.
La forme initiale correspond à un minimum d’énergie.
Dans le cas de la ribonucléase, il y a 8 cystéines, donc 105 (=7.5.3.1) possibilité de recombinaison, mais une
seule donne la configuration correcte.
Or, on obtient près de 100% de protéines correctes !
On ne connaît pas le mécanisme qui, à partir d’une séquence, donne une configuration spatiale déterminée.
Mais on sait que ce n’est pas aléatoire. Si cela l’était, il faudrait 1,6.1027 années pour constituer une protéine
de 100 acides aminés (on estime que 3 directions spatiales sont possibles, ce qui donne 3100 configurations
spatiales possibles, avec 10-3 secondes pour assembler 2 acides aminés).
On arrive à diluer le mercapto sans diluer l’urée, et dans ce cas, les ponts disulfures se reforment mais ne sont
pas corrects.
Cela est dû à la manière dont se fait la synthèse des protéines : pas en un bloc, mais acide aminé par acide
aminé à partir de l’acide aminé NH2 terminal, et la configuration apparaît au fur et à mesure de la synthèse.
Pour l’expérience d’Anfinsen, la protéine se renature, mais dans beaucoup de cas, différentes parties de la
protéine interagissent et la configuration initiale n’est pas retrouvée.

III. Structure secondaire des protéines :


Motifs dus aux interactions à courtes distances entre acides aminés de la protéine.
Certaines protéines, comme la kératine des cheveux et des plumes, sont fibreuses et s’organisent en structure
linéaire ou en feuillets, sur un schéma de pliage régulier, répétitif.
D’autres, en particulier la plupart des enzymes, s’organisent en une conformation globulaire, compacte,
presque sphérique.
La structure de la kératine est suffisamment régulière pour diffracter un R.X. qui révèle les distances entre les
éléments régulièrement répétés du motif de pliage.
Expérience de Pauling-Corey (1939) :
Pauling et Corey ont travaillé sur des morceaux de protéines (peptides). Ils ont étudié la diffraction de R.X.
sur des cristaux de peptides et ont fait des modèles, ce qui a donné une idée de la position et de la distance des
atomes les uns par rapport aux autres.
Longueur des liens :
C-N : 1,47 Ǻ
C=N : 1,27 Ǻ
Peptidique : 1,32 Ǻ  ne correspond ni à la liaison simple, ni à la liaison double… Il y a donc résonance.
Il existe des formes de résonance, ce qui produit une liaison pseudo-double, qui est intermédiaire entre une
liaison simple et une double.
Les atomes de la liaison C-O-N-H sont dans un même plan, car le caractère de double liaison limite la
possibilité de rotation autour de la liaison C-N.
Pauling et Corey furent les 1er à établir que la liaison peptidique est plane et rigide.
Au niveau de la chaîne polypeptidique, on a donc des plans (liens peptidiques) qui peuvent tourner les uns par
rapport aux autres (autour des liaisons C-C et N-C qui ne font pas partie de la double liaison).
43

Cette restriction structurale limite à 2formes essentielles les différents motifs de pliage que peut présenter une
protéine : structure α et structure β.

a) l’hélice α:
L’hélice est une succession de plans orientés différemment.
C’est une hélice droite (à pas droit), avec les radicaux R des acides aminés vers l’extérieur.
La distance entre 2 pas de l’hélice est de 0,54 nm, et la distance entre les carbones de 2 acides aminés dans
la chaîne est en moyenne de 0,15 nm.
Il y a reploiement de la chaîne polypeptidique en hélice.

Par tour d’hélice, il y a 3,6 acides aminés.


L’hélice est stabilisée par un grand nombre de liens H, entre le groupement –N-H d’un résidu et le
groupement –C=O du 5e résidu le suivant dans la chaîne (liaison H tous les 4 aa).
La chaleur (agitation thermique) dénature l’hélice en rompant les liens H.
Certains acides aminés provoquent une stabilisation de l’hélice
D’autres rompent la structure (ex :proline) et provoquent un coude dans la chaîne. La proline peut se trouver
qu’en fin d’hélice car elle a une liaison rigide entre ses groupements amine et acide.
La déstabilisation est souvent due à des interactions entre les chaînes latérales voisines.
Ex : des acides aminés aromatiques qui ont une chaîne latérale très volumineuse (ex : la phénylalanine)
Ex : une série de charges (peut dépendre du pH) entraînant une répulsion électrostatique (entre charges de
même signe).
Une chaîne polypeptidique polyglutaminique (constituée uniquement d’acide glutaminique) aura, à pH
basique, des résidus sous forme COO- (qui se repoussent), tandis qu’à pH acide ils seront sous forme COOH,
et il y aura donc une chaîne
Le pourcentage d’hélice peut être mesuré par le pouvoir rotatoire.

À pH physiologique, cette molécule ne possède donc pas d’hélice


44

Les hélices α se retrouvent essentiellement dans les protéines fibreuses (ex : kératine, qu’on peut trouver dans
les cheveux), liées entre elles par des ponts S-S. (mais peut exister aussi dans les protéines globulaires)
La solidité des fibres est dû au nombre de ponts S-S (ex : carapace des tortues contient 18% de cystéines).
Ces protéines sont généralement insolubles dans l’eau car les chaînes latérales (ala,ile,phe) sont hydrophobes.
Lorsqu’on observe la diffraction des RX par un fil de soie (protéine= fibroïne), on observe une périodicité de
0,35 nm au lieu de 0,15 nm de la structure
C’est la mise en évidence de la structure
La structure peut être modifiée pour donner la structure : si on chauffe un cheveu (60°), la diffraction des
RX montre aussi une périodicité de 0,35 nm.

b) les feuillets (plans) plissés β :


- la structure β est constituée d’une chaîne polypeptidique en extension complète, au maximum autorisé par
les angles de rotation autour des liaisons C-C et N-C.
- la distance entre 2 acides aminés est de 0,35 nm, ce qui montre que c’est une forme beaucoup moins
compacte, beaucoup plus étendue que la structure en hélice
- les liaisons H interviennent entre chaînes polypeptidiques adjacentes et non à
l’intérieur d’une même chaîne (chaînes parallèles ou anti-parallèles).
- la structure en feuillets plissés β est stabilisée par les interactions avec d’autres
chaînes.
- les groupements R sont situés alternativement au-dessus et en-dessous du plan,
ils doivent donc être petits (ex : ala, gly). De plus, un trop gros groupement R
empêcherait la formation de liens H.
- il y a peu de ponts disulfures.
Le passage de la structure β à la structure α est possible, par chauffage. Ce
passage est transitoire
Ex : la « permanente » dans les cheveux (minivagues) :
- rupture des ponts disulfures par un mercaptant (souvent dérivé du
mercaptoétanol).
- passage de la structure β à la structure α de la kératine par chauffage.
- torsion des cheveux par placement de bigoudis.
- reformation des ponts S-S par évaporation du mercaptant, mais ils ne se
refont pas au même endroit à cause de la torsion.
- la structure β réapparaît par refroidissement des cheveux. Toutefois, une
tension est maintenue par les ponts disulfures.

On peut trouver les feuillets plissés dans les protéines en feuillets ou globulaires.

Rq : Structure de collagène :
On la trouve dans les cartilages, les os, les dents…
Ce n’est ni une structure α ni β, mais des hélices organisées de manière caractéristique, très compacte.
Cette structure est maintenue par des liaisons covalentes entre des lysines et des hydroxylysines  pas de lien
disulfure.

Une protéine peut posséder à certains endroits une structure α, et à d’autres une structure β, ce qui provoque
l’existence de tournants dans sa configuration. Souvent, on trouve une proline dans le tournant.
45

Les tournants font partie des éléments importants de la structure secondaire. D’ailleurs, lorsqu’on compare
deux protéines ayant la même fonction chez deux espèces différentes, les principales ressemblances dans la
séquence des acides aminés se trouvent au niveau des tournants.
La proportion d’hélices α et de feuillets β est très variable et dépend de la protéine, donc de sa séquence en
acides aminés.
Ex : ribonucléase, protéine globulaire (124 acides aminés) : 26% α, 35% β
myoglobine, protéine globulaire (153 acides aminés) : 78% α, 0% β.

En résumé : La structure secondaire de la protéine consiste en un motif de pliage régulier, répétitif (tels que
les hélices α et les feuillets β), stabilisé principalement par des liens H et S-S entre des groupements
peptidiques proches les uns des autres dans la séquence.

IV. Structure tertiaire


La structure tertiaire est le reploiement de toute la chaîne dans l’espace, principalement pour les protéines
globulaires.
Elle intègre les interactions à courtes et à longues distances. Des acides aminés très éloignés dans la structure
primaire peuvent être très proches dans la structure secondaire et donc interagir.
Une divergence dans la structure primaire n’implique pas toujours une différence dans la structure tertiaire.
La structure tertiaire contient souvent des hélices α, ou des plans plissés β.

* la myoglobine
Protéine globulaire qu’on trouve dans les cellules musculaires et qui fixe l’O2.
C’est la première protéine dont la structure tertiaire a été déterminée par diffraction de RX par Kendrew, en
1950.
En effet, la cristallisation des protéines est difficile, et le déchiffrage du diagramme de diffraction encore plus.
Il a du faire réagir la protéine avec des atomes lourds en des endroits déterminés, et ils ont servi de repères.
Il a observé une structure très compacte, comportant 8 segments en hélices α reliés par de courts segments non
hélicoïdaux (mais pas des feuillets plissés β).
Ces courts segments n’ont pas de structure particulière, mais ils sont très importants, car ce sont eux qui
contiennent les coudes qui déterminent l’orientation des hélices α.
- la chaîne polypeptidique est formée de 153 acides aminés.
- la chaîne se reploie par des tournants (proline).
- elle possède un groupement hème (tétrapyrol + Fe²+) dans une zone hydrophobe.
C’est donc une hémoprotéine, qui est composée de l’apoprotéine (la chaîne telle
qu’elle est synthétisée) et d’un groupement prosthétique (qui vient s’ajouter par
après), dans ce cas-ci, l’hème.
- tous les groupements non polaires se trouvent à l’intérieur de la protéine et
l’essentiel des groupements polaires se trouve à l’extérieur, en contact avec le solvant (l’eau), sauf les
histidines qui se trouvent de part et d’autre de l’hème (à l’intérieur).
Elles empêchent la fixation intempestive du CO malgré son affinité pour l’hème.
Hème : le Fe possède ici 6 possibilités de liaison (6e-) : 4 avec l’hème, et 2, perpendiculaires au plan de
l’hème.
46

Ce sont des liaisons coordinatives. Sur l’une d’elles se fixe l’O2, l’autre est le point d’ancrage de l’hème dans
la protéine, lié à l’atome de Fe par une histidine (n° 85).
La seconde histidine (n° 64) est située de l’autre côté de l’hème mais n’y est pas liée. Elle augmente très
fortement la sélectivité de capture de l’O2 par effet stérique.
Sur l’hème isolé, le CO se fixe 2500 fois mieux que l’O2.
Quand l’hème est dans la myoglobine, la fixation diminue par encombrement stérique dû à la deuxième
histidine. Le CO reste donc toxique mais est moins violent (dans la myoglobine, le CO ne se fixe « que » 200
fois mieux que l’O2).
L’oxydation de Fe2+ (ferreux) en Fe3+ (ferrique) n’a pas lieu car le contact avec l’eau est empêché grâce à la
poche hydrophobe entourant l’hème. En l’absence de la protéine, l’hème libre est très rapidement oxydé par
l’oxygène en Fe(III), état où l’oxydation est irréversible.
La partie protéique de la myoglobine (sans hème), l’apoprotéine, stabilise l’hème dans l’état Fe2-, lequel est
capable d’oxygénation réversible.

Remarque :
- le pourcentage d’homologie entre la structure primaire de myoglobines d’espèces différentes peut être très
différent (lapin-poulet : ~65%), mais les structures tertiaires sont quasiment identiques. En effet, les
homologies portent sur les acides aminés des tournants, les différences sur les acides aminés des hélices α.
- il n’existe pas de similitudes de structure spatiale entre des protéines différentes qui comportent un hème,
car leur fonction est différente et que la structure spatiale détermine le rôle de la protéine (exemple de
molécule contenant un groupe hème : les cytochromes).

* Stabilisation de la structure tertiaire :


Le repliement se fait de manière à maintenir les groupements hydrophobes à l’intérieur de la molécule, el les
groupements hydrophiles à l’extérieur, en contact avec le solvant.
Le pliage d’une chaîne polypeptidique en une structure ordonnée, compacte, s’accompagne d’une forte
diminution de l’entropie, ce qui est un désavantage thermodynamique. Le pliage d’une protéine est maintenu
par un grand nombre d’interactions faibles, qui agissent de façon coopérative.
* Liaisons H (entre acides aminés)
-NH --- O=C-
donneur accepteur
Energie de liaison : ~10-20 kJ/mole
Faible énergie, mais nombreuses liaisons.
Une liaison H résulte de l’interaction électrostatique entre un atome d’hydrogène lié par covalence à un atome
électronégatif possédant un doublet libre.
L’atome d’H est partagé inégalement entre le groupement donneur et l’accepteur.
Les liaisons H sont très directives, elles ont une force maximale quand les 3 atomes qui y participent sont
alignés. Peuvent facilement être rompues par l’urée (molécule très polaire) par formation d’un lien H entre
l’urée et la protéine.
Urée :
47

La dénaturation par l’urée rend les molécules insolubles, car les groupements hydrophobes qui étaient à
l’intérieur se retrouvent à l’extérieur.

* Liaisons électrostatiques :
Ex : R-COO---- N+H3-R, lien entre glu et lys.
Acide base
Energie de liaison : ~12-20 kJ/mole

* Liaisonss hydrophobes de type Van der Waals :


Liaison entre acides aminés possédant des radicaux hydrophobes (val, ileu)
Elément principal de la stabilité de la protéine.
Energie : ~12-15 kJ/mole.
Le pliage d’une protéine en une conformation globulaire compacte préserve les groupements apolaires du
contact avec l’eau et ces liens sont donc le plus souvent situés à l’intérieur de la molécule.
Les liaisons hydrophobes peuvent être rompues par des agents tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium).
SDS : CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3- Na+

Le SDS fait des liaisons hydrophobes avec la protéine, et lui ajoute donc sa charge négative. La protéine
dénaturée est polaire et reste soluble.

* Liaisons disulfures :
Voir plus haut.

V. Structure quaternaire
La structure quaternaire est la disposition spatiale dans le cas où la protéine possède plusieurs sous-unités.
Chaque sous-unité a bien entendu sa propre structure tertiaire.

* l’hémoglobine : (4 sous-unités)
Son rôle est de fixer l’O2 au niveau des poumons et de le véhiculer dans le sang des vertébrés jusqu’aux
endroits où il est nécessaire (muscles, cerveau…).
Dans l’eau, on peut dissoudre 5ml d’O2 par litre, tandis que dans le sang, on peut dissoudre 250 ml d’O2 par
litre !

Structure :
4 chaînes polypeptidiques : 2 sous-unités α et 2 β.
Les 4 chaînes sont maintenues ensemble dans une disposition particulière par des interactions covalentes.
Le structure tertiaire de la myoglobine, des chaînes α et des chaînes β est très semblable, et elles possèdent
toutes trois un groupement hème. Mais en fait, il n’y a que 21 acides aminés sur 150 qui sont identiques. Les
acides aminés conservés sont, comme on s’y attend, situés aux tournants.
remarque : oxyhémoglobine = hb qui a fixé de l’O2
désoxyhémoglobine = hb sans O2
48

Courbes de fixation de l’O2 sur la myoglobine et sur l’hémoglobine :

Les deux protéines sont complémentaires.


Aux basses pressions partielles en O2, l’affinité de l’hb pour l’O2 est très faible (courbe sigmoïde), alors que la
fixation commence très tôt (hyperbole). Ceci est dû à la structure quartenaire de l’hb. La conséquence est que,
dans les muscles, où il n’y a pas beaucoup d’O2, l’hb du sang cède sont oxygène à la mb des muscles.
Quand l’hb fixe son 1er O2, la structure quaternaire change. Il y a rotation des 2 sous-unités α par rapport aux
autres et rupture de 8 liaisons électrostatiques. Il s’ensuit une différence dans la facilité de fixer l’O2 : le
premier a une fixation difficile et elle est de plus en plus facile pour les suivants.
L’hb est donc une protéine allostérique : l’affinité pour son substrat est modifiée par
une interaction à distance du site actif.
L’espace qui existe entre les sous-unités est plus important dans la déoxyhémoglobine
que dans l’oxyhémoglobine. Une molécule, le biphosphoglycérate (BPG), vient se fixer
dans ce trou. C’est un agent du changement de configuration très important pour le
processus.
Il favorise la fixation d’O2 aux basses
pressions partielles. C’est le BPG qui, par
sa présence, empêche la fixation du
premier O2.
En altitude par exemple, le corps réagit à la diminution de la
pression partielle en O2 de l’atmosphère par une augmentation de
la concentration de BPG dans le sang.
Le pH intervient aussi dans le phénomène : si le pH est acide,
l’affinité de l’hb pour l’O2 diminue. C’est le cas par exemple dans
les muscles lors d’un effort (acide lactique)

VI. Rôle des protéines, fonctions


* Activité enzymatique :
49

Enzyme : protéine (mais pas seulement : l’ARN est une enzyme aussi) très spécialisée, catalyseur de réactions
chimiques à l’intérieur de cellules vivantes.
Leur mise en évidence est assez récente. Au 18ème siècle, Réaumur étudie le fonctionnement de la digestion :
de la viande enfermée dans une capsule en métal ingurgitée par un vautour ressort intacte, tandis qu’elle
devient liquide si la capsule est percée de trous.
 Il existe donc un autre mécanisme que le broyage qui intervient dans la digestion.
1926, Summer isole pour la 1er fois une enzyme : l’uréase (qui clive l’urée).
Les enzymes peuvent cliver d’autres molécules.
Dans ce cas, elles portent comme nom le suffixe « ase » derrière le nom du substrat attaqué :
Une protéine est attaquée  protéase
Un lipide  lipase
Un ARN  ARNase ou RNase
Un ADN  ADNase.
Les enzymes affectent la cinétique (vitesse de la réaction), en diminuant l’énergie d’activation (Ea).

Pour une réaction AB, v = k[A], avec k, qui est la constante de vitesse de la réaction.
k suit la loi d’Arrhénius : k = exp(-Ea/RT).
k varie en fonction de la température, et est inversement proportionnel à l’Ea.
L’activité des enzymes est liée à la structure de celles-ci, et donc à la spécificité des acides aminés du site
actif.
Influence de la température sur la vitesse :
50

La température optimale de fonctionnement des enzymes est souvent 37°.


Il existe une température critique, en dessous de laquelle la vitesse est une exponentielle, et une au-dessus de
laquelle la vitesse chute rapidement, ce qui correspond à une dénaturation de l’enzyme.
Influence du pH sur la vitesse :

Les différents enzymes sont actifs à des pH spécifiques.


Le pH optimal est dû aux structures primaires, secondaires, tertiaires, quaternaires. Toute variation du pH
provoque une modification de la structure, donc une perte de la fonction enzymatique.
Cofacteurs :
Les cofacteurs sont des éléments absolument nécessaires à l’activité enzymatique, mais qui ne font pas partie
de l’enzyme lui-même.
Cofacteurs de type inorganique : ions Mg2+, Mn2+, Fe2+, Zn2+, Na+…
Cofacteurs de type organique : coenzymes complexes, FAD, NAD+…

L’enzyme a un optimum d’activité pour une certaine concentration de cofacteur.


Site actif constitué par un reploiement de la chaîne polypeptidique.
La myoglobine peut être comparée à un enzyme, mais n’en est pas, car l’hème ne lui est pas attaché. Dans ce
cas, le site actif se trouve à l’endroit où il y a l’hème.
Les cofacteurs interagissent au niveau du site actif.
Tant que les cofacteurs ne sont pas dans le site actif, il est incomplet.

Saturation du site actif:


Les réactions enzymatiques sont saturables. Dépendance de la concentration en substrat.
Courbe hyperbolique.
La saturation de la réaction est déterminée par la quantité d’enzyme mise en jeu. Si on rajoute des enzymes, la
vitesse redémarre.
Il y a une vitesse max : A(vmax)/2 . [substrat] = Km
Km = constante de Michaelis= elle donne la demi-vitesse maximum pour une [substrat] .
C’est une caractéristique du couple enzyme/substrat.
Km petit implique une activité élevée.

Spécificité :
La spécificité de l’enzyme s’explique par la spécificité des sites actifs. A un enzyme donné correspond un
substrat précis (jeu de clé et de serrure). Il y a donc reconnaissance du substrat par le site actif.
51

Chapitre 5 : Les acides nucléiques (ADN, ARN)


Les acides nucléiques constituent le matériel génétique (ADN, ARN) et le support de l’information génétique
(ADN).

Structure des acides nucléiques


Ce sont des chaînes d’oses liés par groupements phosphates. Une base est fixée sur l’ose.
Toute l’information se trouve dans la séquence des bases.

* le sucre :
C’est un pentose : soit du désoxyribose (ADN), soit du ribose (ARN).

Notation : les C de l’ose sont


notés « ’ » pour ne pas les
confondre avec ceux de la base.

* les bases
L’ADN, comme l’ARN, comporte deux grands types de bases azotées :
- les pyrimidines (bases pyrimidiques)
- les purines (bases puriques)

Les puriques :
Elles sont composées de deux hétérocycles (contenant des C et des N).
Ce sont la guanine et l’adénine.
Molécules aromatiques : doubles liaisons conjuguées.  mouvement d’e-
Ces molécules absorbent la lumière de l’UV.
Le N9 est le site de fixation de la base sur l’ose.
52

Les pyrimidiques :
Elles sont composées d’un seul hétérocycle.
Ce sont la cytosine, l’uracile (exclusivement pour l’ARN)
l’ et la thymine (principalement dans l’ADN).
l’
Il y a une tautomérie, qui met en évidence le caractère aromatique de la molécule.
Le N1 est le site de fixation de la base.

* Les nucléosides
Base + ose.
Liaison entre le N9 de la base purique et le C1 du pentose.
Liaison entre le N1 de la base pyrimidique et le C1 du pentose.
 C’est une liaison β N glucosidique.

Liaison β N glucosidique

* Les nucléotides
Ester phosphorique de nucléoside.
Le P est en position 5’ de l’ose, ou parfois 3’. La base est une molécule organique.
Exemple de nucléotides :
53

Il existe également des nucléosides di- et triphosphates, qui sont tous des nucléotides.
Exemple de ribonucléoside 5’ triphosphate : adénosine triphosphate (=ATP).

*
anhydride d’acide : liaison entre deux acides. C’est un lien plus énergétique que le lien ester. Il y a donc
stockage d’énergie.

Absorption de la lumière UV par l’ADN ou l’ARN.

Ce type de graphique, avec un minimum à 230nm et un maximum à 260 nm, est caractéristique des acides
nucléiques.
Cette absorption est essentiellement due aux bases (cycle aromatique).
Chaque base a un spectre d’absorption caractéristique.

* La liaison phosphodiester
Segment d’ARN ou d’ADN = succession de nucléotides liés entre eux par des liens
phosphodiesters (liaison entre 2 esters= diester).
Les chaînes de nucléotides ont une polarité, il faut donc définir le sens dans lequel la
synthèse se fait (5’-3’). On donne toujours la séquence dans le sens 5’-3’.
Dans l’ADN, il y a 2 chaînes de polarité inverses.

Extrémité 5’ car 5e carbone


qui a la liaison…
( et inversement pour 3’
54

* Méthodes pour cliver de longues chaînes d’acides nucléiques :

1. Les méthodes chimiques :


Il s’agit de l’hydrolyse acide ou basique totale de la chaîne en ses composantes par rupture de toutes les
liaisons entre les nucléotides.
- L’hydrolyse acide (ARN et ADN) :
On traite un acide nucléique en milieu acide très concentré (HCl 12M). Il y a rupture de toutes les liaisons
entre bases et sucres. Après l’hydrolyse, on obtient du phosphate et des bases. C’est une méthode brutale.

- L’hydrolyse basique ménagée (ARN seulement) :


On traite une molécule d’ARN à 25°C avec une solution NaOH 0,3M. Il y a clivage des liens phosphodiester.
Il y a passage par un intermédiaire qui ne se forme que par la présence d’OH sur le C2 (c’est pourquoi cette
méthode ne convient pas pour l’ADN). Il reste les nucléosides 2’ ou 3’ phosphates.
Cette technique permet de séparer l’ADN de l’ARN.
55

2. Les méthodes enzymatiques :


Elles sont spécifiques à l’ADN ou à l’ARN ou à l’ADN et l’ARN.
Dans le cas d’enzymes qui clivent un acide nucléique, on parle de nucléase : ribonucléase ou
désoxyribonucléase.
- L’exonucléase (ADN-ARN) :
Elle clive les liaisons phosphodiesters à l’extrémité de la chaîne.
Si la chaîne est parcourue dans le sens 5’-3’, on obtient des nucléosides 3’ phosphates (cas de la
phosphodiesterase produite par la rate).
Dans le sens 3’-5’, on obtient des nucléosides 5’ phosphates (cas de la phosphodiesterase des venins de
serpent).
- L’endonucléase (ADN-ARN) :
Elle clive les liaisons au milieu de la chaîne.
Certaines n’ont aucune spécificité quant à la séquence des bases (ribonucléase et désoxyribonucléase
pancréatique), tandis que d’autres sont spécifiques d’une certaine séquence (endonucléase de restriction).
L’enzyme qui clive l’ARN ne clive pas l’ADN et vice versa.
Les endonucléases de restriction font partie de du système immunitaire protégeant l’ADN des bactéries contre
des parasites, les bactériophages ou phages.
Les enzymes de restriction ont été découverts grâce à l’étude de Mr Arber, à propos du fait que les virus
bactériophages ne s’attaquent qu’à certaines bactéries et pas à d’autres.
56

La bactérie se défend contre le phage en fabriquant des enzymes capables de cliver l’ADN de celui-ci, mais
pas son propre ADN.
Elles reconnaissent une séquence particulière de l’ADN du parasite, le site de restriction.
C’est souvent un palindrome.
Ex : dans le cas de EcoRI :

Pour empêcher sa propre destruction, la bactérie possède, sur certains nucléotides de son ADN, des
groupements méthyles, et l’enzyme ne reconnaît plus le site.

 L’ADN :

• Généralités
Quoique l’ADN ait été découverte par Mischer en 1869, son rôle génétique n’a été mis en évidence qu’en
1944 par des études de Mr Griffith sur des bactéries pathogènes, les pneumocoques.
Les pneumocoques, agents de la pneumonie, sont normalement entourés d’une capsule de polysaccharides qui
les protège contre les mécanismes de défense de l’hôte, et contribue donc à les rendre infectieux.
Il existe des souches S (ou lisses) qui possèdent cette capsule et sont donc pathogènes, et des souches R (ou
rugueuses), qui ont perdu leur capsule et sont inoffensives.
Une injection de S morts chez des souris n’a aucun effet.
Une injection de R vivants n’a aucun effet non plus.
Par contre, Griffith constate en 1928 que l’injection de S morts et de R vivants est mortelle pour la souris, et il
retrouve dans son cadavre des S vivants. Un facteur transformant est donc passé des S inactivés aux R et les a
transformés en S virulents.
En 1933, Alloway constate qu’en culture, on peut transformer des pneumocoques R en S par l’addition
d’extraits non purifiés de pneumocoques S.
Mac Leod et Griffith, en 1944, ont montré que la même transformation peut être obtenue en ajoutant à une
culture de pneumocoques R seulement l’ADN purifié à partir d’une souche S.
Ces quatre hommes ont donc démontré que l’information génétique se trouve dans l’ADN.
57

1949-1953 : Chargaff et ses collaborateurs appliquèrent les méthodes chromatographiques quantitatives à la


séparation et au dosage des 4 bases présentes dans les hydrolysats d’ADN de différentes origines.
Conclusions :
1. Les ADN provenant de différents tissus d’un même individu ont la même composition en bases.
2. La composition en bases de l’ADN varie d’une espèce à une autre.
3. La composition de l’ADN d’une espèce donnée ne change ni avec l’âge, ni avec l’état nutritionnel, ni
avec l’environnement extérieur.
4. Dans presque tous les ADN étudiés, le % de A = le % de T et le % de G = le % de C. Il y a donc
complémentarité.
5. Le % de A + le % de G = le % de T + le % de C. Le pourcentage des bases puriques est le même que
celui des bases pyrimidiques.

Rémi Thomas : étude de l’effet hyperchrome.


Thomas mesure l’absorbance de l’ADN en fonction de la température, à une longueur d’onde égale à 260nm,
qui correspond au maximum d’absorbance.
Il observe un saut d’absorbance, c’est l’effet hyperchrome.
La courbe varie avec la composition en bases de l’ADN.
Quand on chauffe, on sépare les brins d’ADN. Leur comportement change, et l’absorption augmente.

Franklin étudie la diffraction de RX.


Elle met en évidence deux périodicités :
- une de 0,34nm (entre deux bases)
- une de 3,4nm (sur un tour, ce qui correspond à 10 tours)

Franklin, Watson et Crick : Toutes ces données (équivalence des bases, effet hyperchrome, diffraction des
RX) leur permettent d’élaborer un modèle stérique précis de la structure de l’ADN.
Ce modèle, toujours utilisé aujourd’hui, explique les propriétés physiques et chimiques de l’ADN.
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• Structure de l’ADN
- Le modèle est constitué de deux chaînes polynucléotidiques hélicoïdales droites enroulées autour d’un
même axe pour faire une double hélice.
- Les deux chaînes sont anti-parallèles, c’est-à-dire que leurs ponts phosphodiesters s’orientent en sens
inverse les uns par rapport aux autres (3’-5’ et 5’-3’).
- Les deux chaînes sont complémentaires, les bases de chaque brin se superposent à l’intérieure de la double
hélice, leurs plans étant parallèles entre eux et perpendiculaires aux grands axes de l’hélice, tandis que les
plans des cycles de désoxyribose sont parallèles à l’hélice.
Les bases d’un brin s’apparient dans un même plan aux bases de l’autre de manière à former entre elles des
liaisons H à courte distance (0,28 à 0,30 nm).
Les liaisons possibles sont : A = T (2 liens H) et G ≡ C (3 liens H).
Ceci explique pourquoi la proportion de purines (G + A) est égale à celle des pyrimidines (C + T) et qu’il y a
autant de A que de T et de G que de C.
- Les bases se superposent à une distance de 0,34 nm de centre à centre. Comme il y a en moyenne 10 bases
par tour complet de la double hélice (dans le cas de la structure B de l’ADN, c’est-à-dire l’ADN en solution),
la périodicité est de 3,4 nm.
- Les bases hydrophobes, relativement insolubles, sont étroitement superposées à l’intérieur de la double
hélice, tandis que les résidus hydrophiles des pentoses et les groupements phosphates chargés électriquement
sont à la périphérie, orientés vers l’eau.
Les bases hydrophobes, aromatiques, possèdent des électrons délocalisés et il y a interaction entre les nuages
électroniques des cycles. Ainsi, la double hélice est stabilisée par des liaisons H entre les bases, mais aussi par
des interactions hydrophobes entre les bases superposées à l’intérieur.
On observe dans la structure de la double hélice un sillon mineur et un sillon majeur, c’est-à-dire un
espacement moins important entre les deux brins au niveau des liens H qu’ailleurs.

• Dénaturation de l’ADN
Le nombre de liaisons H entre les différentes bases explique l’effet hyperchrome : lorsqu’on chauffe l’ADN,
on arrive à une température de fusion où les deux brins se dissocient (déstabilisation de la double hélice).
C’est ce qui crée l’augmentation d’absorbance, car les bases qui faisaient des liens H sont maintenant libres, la
position des électrons est modifiée et ils sont plus facilement délocalisés, donc, excités. Mais puisque le
nombre de liens H entre G et C est supérieur à celui qu’il y a entre A et T, la stabilité, et donc la température
de fusion, et donc l’effet hyperchrome d’un ADN composé de G et C sont plus élevés.
59

On remarque dans les ADN naturels des interactions plus fréquentes avec les enzymes de transcription et de
réplication au niveau des zones riches en A et T.
La dénaturation de la double hélice en deux brins monocaténaires est réversible.
La renaturation est d’une extrême précision.

1°) Expérience de Mehselson et Stahl :


On fait une culture de bactéries (A), dans un flacon qui contient un milieu très simple. Les bactéries ont
besoin d’azote pour vivre (fabriquer leurs bases azotées).
Dans ce cas-ci, la seule source d’azote est le NH4Cl (isotope 14N).
On extrait l’ADN et on analyse sa densité. On utilise pour cela l’équilibre de sédimentation sur un gradient de
CsCl.Le gradient de CsCl est obtenu par centrifugation dans un tube d’une solution 8M de CsCl. Lorsque
l’ADN est présent lors de la centrifugation, il migre dans le gradient de densité jusqu’à ce qu’il y ait un
équilibre de densité entre l’ADN et le CsCl. L’ADN se concentre en une bande stable dont la position est telle
que la densité de l’ADN est égale à la densité du CsCl à cet endroit.

Si on refait la même expérience en nourrissant les bactéries A avec du NH4Cl contenant du 15N, la bande
d’ADN se trouve plus bas dans le tube.
Si on mélange de l’ADN 14N avec de l’ADN 15N, on obtient deux bandes distinctes.

2°) Principe de renaturation :


Si on chauffe de l’ADN 14N et de l’ADN 15N a 95°, puis qu’on laisse refroidir, on obtient en plus des deux
bandes originelles, une bande intermédiaire correspondant à l’association des fibres 14N avec des fibres 15N
(hybride 14N/15N)

Il y a réassociation spontanée.
Ce phénomène n’a lieu que si les ADN proviennent d’une même bactérie (donc si les brins sont homologues).
En effet, si on utilise l’ADN d’une bactérie A et celui d’une bactérie B, on n’observe pas de bande
intermédiaire après chauffage.
 La renaturation n’a lieu que pour des fibres complémentaires.

• Réplication semi-conservative
On cherche à savoir si la réplication de l’ADN (synthèse d’une nouvelle molécule d’ADN partir d’une
molécule originelle) est conservative ou semi-conservative.

Si elle est conservative, une des deux cellules filles hérite de l’ADN originel tandis que l’autre reçoit un ADN
synthétisé de novo.
60

Si elle est semi-conservative, une des fibres parentales se retrouve dans chaque cellule fille, tandis que son
homologue est synthétisée de manière complémentaire.

3°) Expérience de Meselson et Stahl :


On place des bactéries nourries au 14N dans un milieu de 15N. Après une
génération (~20 min), on extrait l’ADN. On ne trouve dans le produit de la
centrifugation qu’une bande intermédiaire, tandis que les deux bandes
originelles ne sont pas présentes. On a donc eu un brin conservé et contenant
du 14N et un brin synthétisé contenant du 15N.
Après la deuxième génération, on trouve deux bandes : 15N et 14N/15N.

Remarque :
Les ADN ne sont pas tous sous forme de doubles brins. Ceci n’est vrai que
pour les individus autonomes. Par exemple, les ADN viraux sont sous la
forme d’un simple brin. Pour se reproduire, ils doivent infecter une bactérie et
passent alors par une phase double brin indispensable lors de la traduction de
l’ADN.

• Longueur des acides nucléiques


La longueur varie très fort selon le type d’organisme. Elle va de 80 nucléotides pour les ARN de transfert à
plusieurs milliards pour l’ADN humain.
Ex: ADN de :
- virus (SV40) = 5,1 kb (kilo bases = 1000 bases azotées)
- bactériophage = 48,6 kb
- bactérie (E.coli) = 4000 kb
- levure = 13500 kb
- homme = 2.900.000 kb

Pour l’homme, cela représente une longueur de 1m par cellule. Comme nous sommes diploïdes, il faut
multiplier ce chiffre encore par deux.
Comme notre corps est constitué d’à peu près 1013 cellules, nous possédons chacun 2.1010 km d’ADN. Par
comparaison, la distance terre-soleil est de 1,44.108 km.
Remarque :
61

Comme pour les protéines, on peut parler pour l’ADN de structure primaire, secondaire, tertiaire.
La structure primaire correspond à la séquence des nucléotides.
La structure secondaire correspond à la double hélice (ponts H), et à la disposition des résidus selon les
interactions hydrophiles.
La structure tertiaire de l’ADN est un enroulement de la double hélice en une super hélice.

• Code génétique
Chaque acide aminé d’une protéine est codé par trois nucléotides, qui forment un codon. Ce qui est dés lors
important pour l’information est la succession, la séquence des codons, et donc des nucléotides.
Certains acides aminés sont codés par plusieurs codons.
Le code génétique est universel à quelques rares exceptions près.

• Détermination de la séquence des nucléotides de l’ADN


C’est sur les ARNt que le problème a tout d’abord été résolu, car ils possèdent des chaînes relativement
courtes et peuvent être isolés sans trop d’impuretés.
Il existe différentes techniques.
La première chose à faire est de cliver l’ADN pour en isoler un fragment afin de déterminer sa séquence.
On s’arrange en général pour avoir un ADN monocaténaire comprenant entre 300 et 500 nucléotides.
Le clivage doit être précis et parfaitement reproductible.

Méthode de séquençage de Sanger :


A l’aide d’un enzyme de restriction, on clive l’ADN.
Pour déterminer sa séquence, le brin va être englobé dans un vecteur (ADN support). Ce vecteur a une
séquence connue et se situe en amont du segment que l’on veut séquencer.

On fabrique un oligonucléotide (~40 nucléotides), l’amorce (ou primer), tel que ce fragment amorce puisse
s’associer à l’ADN du vecteur.
Ce primer possède une extrémité 3’OH libre et permet à l’ADN polymérase de commencer la synthèse d’une
nouvelle chaîne sur modèle du vecteur.

Les brins de l’amorce et du vecteur sont complémentaires.


L’ADN polymérase est un enzyme capable de faire la synthèse de l’ADN à partir de nucléotides. Il ajoute un
nouveau nucléotide (à groupement P) à l’extrémité 3’OH. Il y a formation d’un lien phosphodiester.

Pour faire cette synthèse, l’ADN polymérase a besoin des 4 désoxyribonucléosides triphosphates dATP-
dCTP-dGTP-dTTP (on note en général dNTP), car la synthèse se fait en copiant la fibre au fur et à mesure. Il
y a donc élongation de la chaîne en tenant compte de la base qui se trouve en face (T-A, A-T, G-C, C-G).
ADNn + dNTP  ADNn+1 + PP.

Expérience de Sanger :
Il donne à l’enzyme un réactif qui ne lui permet pas de continuer la chaîne. Il va synthétiser un petit fragment
et puis s’arrêter.
Réactif : didéoxynucléotide.
Il ne possède pas le groupement OH nécessaire pour la formation d’une liaison phosphodiester.
62

On peut avoir du didATP, du didCTP, du didGTP ou du didTTP selon la base.


Sanger met à disposition de l’enzyme le fragment d’ADN et le primer, les 4 désoxynucléotides et une petite
quantité d’un des quatre didéoxynucléotides (ex : didATP). On obtient alors un mélange de petites chaînes
dont la longueur permet de déterminer l’emplacement du didnucléotide. Si on refait l’expérience avec les
autres didnucléotides, et en faisant attention à la proportion didnucléotide/dnucléotides, on parvient à
déterminer la séquence des nucléotides dans les segments d’ADN.
Pour visualiser toutes les chaînes, on fait une électrophorèse des quatre expériences à la fois (4 pistes).
Rappel : électrophorèse = migration des fragments grâce à leur charge en fonction de leur taille dans un gel
acrylamide (support poreux). Il y a séparation car les petites molécules y passent plus rapidement que les
grosses qui sont retardées ;
L’électrophorèse est assez précise pour qu’on fasse la différence entre deux segments ne se distinguant que
par une seule base.
Si on a pris soin de fournir de l’ATP marqué au 32P, il suffit alors de comparer la position relative des bandes
formées par chaque chaîne sur un film (autoradiographie).

Synthèse :
(ADN)n + dNTP  (ADN)n+1 + PP.

PP = pyrophosphate

H2O – PP  2Pi

Pi = phosphate inorganique ou orthophosphate.

 L’ARN
Il existe différents types d’ARN :
- l’ARN messager est une copie du gène de l’ADN.  impliqué dans la transcription.
- l’ARN ribosomial peut avoir trois tailles différentes : 5S, 16S et 23S. S = unité svedberg, en rapport avec
le coefficient de sédimentation. Donne un chiffre qui est proportionnel à la taille.
Ils s’associent avec des protéines pour former les ribosomes.
- l’ARN de transfert est, avec l’ARN ribosomial  impliqués dans la traduction.
- Petits ARN (ARNs, ARNu,…)

La synthèse de l’ARN se fait à partir de précurseurs (ATP, GTP, UTP, CTP) et sur base d’un modèle d’ADN.
Elle se fait dans le sens 5’-3’.
(ARN)n + NTP  (ARN)n+1 + PP
La synthèse est plus simple que pour l’ADN puisqu’il n’y a qu’une seule chaîne.
63

Chapitre 6 : Le métabolisme énergétique

• Définition
Ensemble des transformations, des processus biochimiques qui s’accomplissent dans tous les tissus de
l’organisme vivant pour édifier les structures cellulaires, emmagasiner ou libérer de l’énergie (dépense
énergétique, échanges, nutrition…).

Dans la cellule, on distingue deux grandes classes bioénergétiques :


- l’anabolisme : Ensemble des réactions qui provoquent la synthèse de macromolécules à partir de
métabolites plus petits et d’énergie.
Ex : synthèse de l’ADN à partir de nucléotides et d’énergie,
synthèse de protéines à partir d’acides aminés et d’énergie…

- le catabolisme : Ensemble des réactions qui provoquent la dégradation de macromolécules complexes pour
donner des molécules plus petites et simples avec une production d’énergie.

L’anabolisme récupère une partie de l’énergie libérée par le catabolisme.

• Rappel des notions de thermodynamique


- Système ouvert :
Système qui échange matière et énergie avec l’extérieur. Les systèmes biologiques sont des systèmes ouverts.

- Entropie :
∆S > 0.
Il y a augmentation de l’entropie, du désordre, pour qu’un système ouvert évolue spontanément.
Attention, il faut prendre en compte toutes les variables !
Exemple : passage de l’œuf au poussin.

Poussin= + ordonné que l’œuf. On aurait donc tendance à croire qu’il y a eu baisse de l’entropie (∆S<0) ,
alors qu’il s’agit bien là d’un système ouvert évoluant spontanément.
Mais si on considère le système dans son ensemble,
Œuf → poussin + CO2 + H2O + chaleur
et le bilan est tel que ∆S > 0.
La vie ne se maintient qu’en produisant une augmentation de l’entropie de l’environnement.

- Energie libre de Gibbs :


∆G = ∆H + T∆S
∆G < 0 : réaction exergonique, qui peut se produire spontanément. (exothermique)
∆G > 0 : réaction endergonique, qui ne peut se produire spontanément. (endothermique)
64

∆G = 0 : réaction à l’équilibre.

Dans les conditions standard (concentrations = 1mol/l), on définit la variation d’énergie libre standard ∆G°,
qui est une constante.
Les enzymes ne peuvent catalyser que les réactions spontanées (∆G°<0).

Pour une réaction A+B ↔ C + D


Kéq = [C]éq [D]éq
[A]éq [B]éq
∆G = ∆G° + RT lnKéq
Donc, à l’équilibre,
∆G° = -RTlnKéq = -RT 2,03 logKéq

Dans quel sens va aller la réaction ?


Kéq ∆G° Sens
1000 -4,08 kcal/mol →
1 0 Équilibre
0,001 4,08 kcal/mol ←
Les variations d’énergie libre sont additives :
A→B ∆G° > 0 = 2 kcal/mol
B→C ∆G° < 0 = -8 kcal/mol
A→C ∆G° < 0 = -6 kcal/mol
C’est le couplage des réactions qui rend l’ensemble possible.

Attention: ∆G change au cours de la réaction, tandis que ∆G° reste constante.


Pour les réactions qui se passent dans une cellule, on a défini ∆G°’, qui tient compte des protons en solution
aqueuse à pH=7 :
∆G°’ = ∆G° ± 2,03 RT m log[H+]
+ si H+ est un réactif, - si H+ est un produit.
m est le coefficient des protons (des H+).
Exemple :
Transformation de glucose-1-phosphate en glucose-6-phosphate par la phosphaglucomutase.
On part de [G1P] = 10-1M.
A l’équilibre, [G1P] = 4,5.10-3M, et [G6P] = 96.10-3M
Kéq = [G6P]/[G1P] = 96.10-3/4,5.10-3 = 21,3
∆G° = -2,03 RT log(Kéq)
= -2,03.1,98.298.log(21,3)
= -1,8 kcal/mol
65

• Transport d’énergie
Les cellules ont besoin d’énergie pour la fabrication des macromolécules et le mouvement en général.
L’énergie libre libérée par les réactions énergétiques est transportée sous une forme particulière, l’ATP (ou
l’un des autres nucléosides triphosphates, GTP…).
ATP :

L’ATP possède deux types de liens avec les phosphates : 1 liaison ester (•) et 2 liaisons anhydrides (*). Ces
dernières sont dites riches car elles contiennent beaucoup d’énergie.
ATP + H2O ↔ ADP + Pi ∆G°’ = -7,3 kcal/mol
Pi = phosphate inorganique ou orthophosphate :

Formes de résonance du Pi

ATP + H2O ↔ AMP + PP ∆G°’ = -7,3 kcal/mol


PP = pyrophosphate :

L’équivalence de la variation d’énergie libre pour ces deux réactions est due au fait que c’est dans les deux
cas une liaison anhydride qui est rompue.

ATP + AMP ↔ 2 ADP


Adénylate kinase
Les molécules d’ATP, ADP et AMP sont convertibles.
L’énergie libre est beaucoup plus basse dans l’AMP et l’ADP que dans l’ATP, ce qui entraîne une
redistribution des charges et ces deux molécules sont plus stables.
66

Catabolisme :
AMP + PP ou ADP + Pi → ATP + H2O
La reformation d’ATP est désavantagée à cause de la stabilité de l’AMP et de l’ADP, ainsi qu’à cause des
répulsions électromagnétiques qui existent entre les charges des O portés par les groupements phosphates.

En 1940, Fritz Liebmann affirme que les aliments (lipides, oses…) peuvent être transformés par oxydation.
Cette oxydation permet le passage ADP → ATP. (défavorable thermodynamiquement)

Remarque :
Les transports actifs sont des passages sélectifs de métabolites à travers les membranes. Ils nécessitent de
l’énergie (consommation d’ATP par rupture des liaisons anhydrides).

• Réactions permettant à la cellule de se procurer de l’énergie


Il existe plusieurs mécanismes qui fournissent de l’ATP.

- Fermentation lactique :
Réaction anaérobie (sans présence d’O2).
Formation de lactate (ou acide lactique) CH3CHOHCOOH

- Fermentation alcoolique :
Réaction anaérobie.
Formation d’éthanol C2H5OH.
On connaît la fermentation depuis l’Antiquité par la fabrication du vin et de la bière, mais elle n’a été
comprise que récemment.
Pasteur a été le premier à découvrir que c’est un organisme, la levure qui se trouve sur la peau des raisins, qui
est la cause de ce phénomène.
Ensuite, ce sont les frères Bruckner qui ont découvert par hasard que la fermentation pouvait être obtenue à
l’aide d’extraits de levure (pas uniquement de l’organisme tout entier  mais des fragments).

- Respiration cellulaire :
Réaction aérobie (avec présence d’O2).
C’est le cycle de Krebs, qui est utilisé par les animaux.
Il y a formation de CO2 et d’eau.

Chacun de ces mécanismes commence par un tronc commun, qui est appelé glycolyse.

 Glycolyse
La glycolyse est un processus qui permet à la cellule, par la transformation du glucose en pyruvate par une
série d’étapes, de récupérer de l’énergie.
67

Glucose (6C)  pyruvate (3C)  fermentation lactique (ou alcoolique)

Ou

 cycle de Krebs  CO + H O + ATP


(= cycle de l’acide citrique)
Lors de la glycolyse, il y a production d’ATP.
Pour cellule eucaryote : glycolyse dans cytosol et cycle de Krebs dans mitochondries.
La glycolyse peut être décomposée en 2 parties :
- les étapes préparatoires
- les étapes où il y a formation de liaisons riches, donc récupération d’énergie (ATP)

La formule finale de la glycolyse est la suivante :

Bilan réactionnel de la glycolyse

 Etapes préparatoires de la glycolyse (schéma de Embder –Meyerhof 1925)

Elles mettent en forme les molécules pour la récupération d’énergie.

1. ATP + α-D-glucose → ADP + α-D-glucose-6-P

o ∆G très négatif.
o On ajoute un phosphate au glucose, ce qui coûte un ATP.
o Enzymes : hexokinase (dans le cas de la levure) ou glucokinase (dans le cas du foie).
o L’α-D-glucose est un aldose.

2. α-D-glucose ↔ α-D-fructose-6-P ( = isomérisation )

o L’α-D-fructose-6-P est un cétose. On passe donc d’un cycle à 6C à un cycle à 5C.


o Enzyme : une isomérase, la glucoisomérase.
68

3. α-D-fructose-6-P + ATP → α-D-fructose-1-6-diphosphate + ADP ( = phosphorylation )

o ∆G négatif.
o Catalysé par la 6-phosphofructokinase.
o La 6-phosphofructokinase est une enzyme qui est régulateur : son activité dépend de façon complexe
de la vitesse de la réaction. Son activité augmente en présence d’AMP et d’ADP mais diminue s’il y
a un excès d’ATP.

4. α-D-fructose-1-6-diP ↔ glycéraldéhyde-3-P + dihydroxyacétone-3-P.

o Clivage du fructose-1-6-diP en 2 trioses phosphate au niveau des C3 et C4.


o Des 2 trioses phosphate, seul le glycéraldéhyde-3-P est directement dégradé dans les étapes
suivantes de la glycolyse.
o Enzyme : aldolase.

5. dihydroxyacétone-3-P ↔ glycéraldéhyde-3-P. ( = isomérisation des trioses )

o Le dihydroxyacétone-3-phosphate est réversiblement transformé en glycéraldéhyde-3-P par un


enzyme. Il est alors utilisable par la glycolyse.
o Enzyme : triose phosphate isomérase.
o Cette réaction a été découverte par le marquage radioactif d’un des carbones du glycéraldéhyde-3-P.
Si on l’ajoute à de la levure, on remarque la formation de fructose-1-6-diphosphate possédant 2C
marqués (la réaction 4 peut se faire dans les deux sens).
69

Les étapes qui ont été décrites jusqu’ici étaient des étapes de préparation. On y a consommé deux ATP sans
produire d’énergie.

- Etapes énergétiques de la glycolyse :

Seul le glycéraldéhyde-3-P y est utilisé, mais comme il y a transformation du dihydroxyacétone en


glycéraldéhyde, il faut compter toutes les réactions qui vont suivre en double.

6. glycéraldéhyde-3-P + Pi + NAD+ ↔ NADH + H+ + 1-3-diphosphoglycérate.

oxydation-phosphorylation du GAP
o C’est la première réaction où on récupère une partie de l’énergie.
o Il y a formation d’un intermédiaire portant 2 P non équivalents (liaisons ester et anhydre). La liaison
anhydre d’acide est riche en énergie.
o C’est une réaction rédox : la réaction de phosphorylation est oxydative, tandis que le NAD+ est
réduit en NADH.
o Le NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide) intervient comme accepteur d’électrons. C’est un
coenzyme d’oxydoréduction. (Rem : un coenzyme est une molécule indispensable au
fonctionnement de la réaction. Il agit au niveau du site actif de l’enzyme. Il est transformé par la
réaction mais sera régénéré à un autre moment. Il faut aussi noter que les enzymes n’ont pas tous
besoin d’un coenzyme)
o Enzyme : D-glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (GAPDH)

NAD+

NADH
70

7. 1-3-diphosphoglycérate + ADP ↔ 3-phosphoglycérate + ATP

o Le clivage de la liaison anhydride libère beaucoup d’énergie.


o L’énergie venant du clivage est suffisante pour former une liaison riche dans l’ATP.
ADP + Pi ↔ ATP + H2O ∆G° = 7,3 kcal/mol
Il y a donc couplage entre le clivage de la liaison anhydride et la formation d’ATP.
C’est la première molécule d’ATP formée dans le processus de glycolyse. Mais comme on
avait 2 trioses, on a récupéré déjà deux ATP.
o Enzyme : phosphoglycérate kinase.

8. 3-phosphoglycérate ↔ 2-phosphoglycérate

o Transfert du P de la position 3 à la position 2.


o Enzyme : phosphoglycerate mutase.

9. 2-phosphoglycérate ↔ phosphoénol pyruvate + H2O

o Donne naissance à une liaison phosphate riche en énergie par perte d’une molécule d’eau.
o Réaction rédox à l’intérieur de la molécule : C2 est oxydé tandis que C3 est réduit.
o Enzyme : énolase.
71

10. phosphoénol pyruvate + ADP ↔ pyruvate + ATP

o Tautomérie énol-cétone (la cétone est le plus stable).


o Clivage d’une liaison riche libérant beaucoup d’énergie, permettant de former l’ATP.
o Enzyme : pyruvate kinase.
o Remarque : ???

- Bilan global de la glycolyse :

Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 pyruvate + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

Remarque : puisqu’il y a utilisation des deux triglycérides dans les étapes énergétiques de la glycolyse, il faut
y multiplier par 2 les équations 6 à 10.
Pour 2 ATP consommés, il y a donc 4 ATP produits. Ce n’est donc pas un processus très efficace.

De plus, le NAD+ utilisé dans diverses étapes de la glycolyse est présent en petites quantités dans la cellule. Il
doit être régénéré sans arrêt à partir de NADH. Ce processus sera différent selon qu’on se trouve en milieu
aérobie ou anaérobie.

Fermentations :
Les fermentations sont obligatoires en milieu anaérobie. C’est d’ailleurs uniquement dans ces milieux qu’elles
interviennent. Il en existe plusieurs, mais nous n’étudierons que les deux plus importantes. Elles ont pour
objet de réoxyder le NADH en transformant le pyruvate.

- La fermentation lactique :
pyruvate + NADH + H+ ↔ lactate (acide lactique) + NAD+

La réduction du pyruvate en lactate est dans ce cas la dernière étape de la glycolyse. Elle permet de régénérer
le NADH en NAD+, mais aussi d’utiliser le pyruvate, donc de tirer la réaction n°10 vers la droite.
Enzyme : lactate déshydrogénase.
72

Remarque : en cas d’effort musculaire important et de courte durée, tout l’O2 environnant est consommé, on
se retrouve en milieu anaérobie et la fermentation lactique a lieu qui permet d’avoir tout de même de
l’énergie. Le lactate diffuse à travers la membrane et correspond à un déchet qui est éliminé par le sang. Si
l’effort est trop intense, la concentration de lactate dans le sang est très élevée et on a une crampe.
Le lactate est retransformé ultérieurement en glucose au niveau du foie.

- La fermentation alcoolique :
Ce type de fermentation a lieu dans des organismes comme la levure de bière. Ils fermentent le glucose
(pyruvate) en éthnanol et CO2. C’est une réaction enzymatique.

Première étape : réaction de décarboxylation.


pyruvate → CO2 + acétaldéhyde (éthanal)

o Comme le CO2 se dégage, la réaction est poussée vers la droite. Elle est irréversible.
o Enzyme : décarboxylase pyruvique.

Seconde étape : transformation de l’aldéhyde en alcool.


acétaldéhyde + NADH + H+ ↔ éthanol + NAD+

o L’éthanol est excrété par la cellule, ce qui tire la réaction vers la droite.
o L’acétaldéhyde est réduit en éthanol aux dépens de NADH.
o Enzyme : alcool déshydrogénase.

L’éthanol et le CO2 remplacent l’acide lactique comme produit finaux de la fermentation par rapport à la
fermentation lactique.
La réaction globale peut s’écrire :

Remarques sur la glycolyse :


1. Démarrage de la réaction :
La réaction n°6 ne peut se faire qu’en présence d’une quantité suffisante de NAD+. En cours de glycolyse, le
NAD+ est régénéré par fermentation, mais, au début, il n’y a pas encore de pyruvate pour la fermentation. Il
doit donc exister un autre moyen de fabriquer du NAD+. Il s’agit d’une amorce latérale.
73

Cette amorce utilise le dihydroxyacétone phosphate formé en 4.


Dihydroxyacétone-3-P + NADH + H+ ↔ glycérophosphate + NAD+

L’enzyme qui catalyse cette réaction est la déshydrogénase du glycérophosphate (glycérophosphate-3-P-


déshydrogénase). Il est peu actif et ne fonctionne que quand la concentration de dihydroxyacétone est élevée.
Cet enzyme est contrôlé par le taux de NAD+ formé. Dés que le NAD+ est présent en quantité suffisante, la
réaction s’arrête (= rétrocontrôle).

2. Détours empruntés par la glycolyse pour récupérer de l’énergie :


1) L’équation globale des réactions 6 et 7 est :
glycéraldéhyde-3-P → 3 phosphoglycérate

La cellule ne fait pas cette réaction directement, bien qu’elle soit thermodynamiquement très favorable. Elle
passe par un détour qui lui permet de récupérer de l’ATP.
Réaction n°6 : ∆G°’ = 1,5 kcal/mol
Réaction n°7 : ∆G°’ = (-11,5 + 7,3) kcal/mol = 4,2 kcal/mol

On pourrait faire l’analogie entre ces réactions chimiques et l’utilisation de l’énergie d’une chute d’eau. Plutôt
que de laisser passer l’eau par son trajet normal (10 kcal), on préfère la faire monter un petit peu (1,5 kcal)
pour l’amener vers une chute beaucoup plus brusque (11,5 kcal) dont on pourra utiliser l’énergie.

Le couplage entre ces deux réactions :


 oxydation du groupement aldéhyde en groupement carbonyle
 formation d’ATP
est indispensable au bon fonctionnement de la glycolyse.
74

2) On observe le même type de couplage dans les réactions 9 et 10.


Il y a oxydation dans la réaction n°9, mais c’est une réaction d’oxydoréduction interne : le C2 est oxydé tandis
que le C3 est réduit. ( voir réaction n°9 page 70 )

Réaction n°10 : rupture d’une liaison riche.


Preuve qu’il y a une liaison riche dans le phosphoénol pyruvate : l’hydrolyse de celui-ci en énolpyruvate a un
∆G°’ = -14 kcal/mol.
Phosphoénol pyruvate + H2O → énolpyruvate + H2PO4

Ce dégagement d’énergie est dû à l’instabilité de l’énolpyruvate qui donne immédiatement du pyruvate par
tautomérie énol-cétone. On pourrait donc décomposer la réaction n°10 en deux réactions.

3. Couplage de réactions :
Il y a couplage lorsque deux réactions ont lieu simultanément. Un découplant est un agent qui interfère avec
ce couplage.

Il y a un couplage entre l’élimination du P sur le 1,3 diphosphoglycérate et la fixation d’ATP (réaction n°7).
Il existe des agents découplant cette réaction.
Exemple : le groupement arsenic peut prendre la place du groupement P .
En solution, il y a formation d’arséniate : HAsO42- est très semblable à HPO42-.
Dans la réaction n°6, à partir de l’aldéhyde, on a formation d’un dérivé ressemblant au dérivé normal, mais
qui n’est pas capable de former de l’ATP par après.
L’enzyme qui catalyse cette réaction est le glycéraldéhyde-3-P-déshodrygénase. Cela prouve que, malgré sa
spécificité, un enzyme peut se tromper.
glycéraldéhyde-3-P + HAsO42- + NAD+ → CH2O P -CHOH-COOAsO42- + NADH + H+

Le CH2O P -CHOH-COOAsO42 est instable et se décompose naturellement en CH2O P -CHOH-COO-.


75

4. Bilan énergétique de la glycolyse + la fermentation lactique :


Comparaisons :
a) Combustion totale du glucose (oxydation totale) :
C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O
∆G°’ = -686 kcal/mol

b) Transformation du glucose en lactate :


C6H12O6 → 2 CH3CHOHCOO-
∆G°’ = -47 kcal/mol soit ~7% du maximum

c) Glycolyse + fermentation :
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 CH3CHOHCOO- + 2 ATP + 2 H2O
Récupération de 2 ATP ou 14,6 kcal/mol, soit ~30% du rendement de la transformation en lactate ou 2% du
rendement de la combustion.

L’énergie est dissipée en chaleur.


Le processus vu ici n’est donc pas très efficace puisque seulement 2% du maximum sont récupérés.

5. Voies d’entrée de différents oses dans la glycolyse :

1. Le glycogène :
C’est un matériel de réserve.
Il est transformé en glucose 1P par la phosphorylase, et ensuite en glucose 6P par la phosphoglucomutase. Il
peut alors entrer dans la glycolyse.
76

2. Le fructose :
Il y a deux possibilités :
a. fructose + ATP → fructose 6P + ADP
C’est une réaction qui se produit dans les muscles et dont l’enzyme est l’hexokinase.

b. fructose + ATP → fructose 1P + ADP


Réaction qui se fait dans le foie.
Fructose 1P → glycéraldéhyde (non phosphorylé) + dihydroxacétone 3P.
Le dihydroxyacétone 3P peut entrer dans la glycolyse, mais le glycéraldéhyde doit encore être transformé.
Glycéraldéhyde + ATP → glycéraldéhyde 3P + ADP
Enzyme : kinase.
3. Le mannose :
Le mannose est un épimère du glucose (il diffère de celui-ci par la position d’un OH).
Mannose → mannose 6P
Mannose 6P → fructose 6P

4. Le galactose :
Le galactose a une voie très particulière d’entrée dans la glycolyse.
C’est un épimère du glucose.
Le galactose sera transformé en galactose 1P.
Galactose + ATP → galactose 1P + ADP (hexokinase)
Le galactose 1P est lui-même transformé en glucose 1P par un processus cyclique faisant intervenir l’UMP,
l’UDP galactose et l’UDP glucose.

UMP (undine monophosphate)

UDP galactose

UDP glucose

Le cycle : ???

Ensuite, le glucose 1P est transformé en glucose 6P (isomérase) qui peut rentrer dans la glycolyse.

Remarque : ce processus est fort compliqué. On pourrait imaginer un chemin direct depuis le galactose 1P
jusqu’au glucose 1P, mais l’enzyme nécessaire à cette réaction n’existe pas.
77

Le cycle de Krebs ou oxydation aérobie du glucose :


Comme nous l’avons vu, en milieu anaérobie, la production d’ATP à partir de glucose est modeste. Nous
allons voir que l’oxydation aérobie du glucose (aussi appelée respiration cellulaire ou cycle de Krebs) produit
beaucoup plus d’ATP.

En milieu aérobie, la dégradation du glucose ne s’arrête pas au stade lactate, mais continue jusqu’à ce que les
produits de la glycolyse soient complètement oxydés.
L’oxydation aérobie consomme évidemment de l’oxygène (O2) et produit du CO2 et de l’H2O. Dans ce
processus, on va produire 38 ATP, ce qui constitue bien sûr un meilleur rendement que celui de la
fermentation.

Expériences qui ont montré que l’on avait affaire à un processus cyclique :
En 1935, Szent-Gyorgyi étudie la consommation d’O2 par des fragments de muscles de pigeons. Il obtient la
courbe suivante : après 20 minutes, la consommation d’O2 cesse d’augmenter.

Par contre, s’il ajoute un jus de muscle pressé, la consommation reprend.

Szent-Gyorgyi analyse alors le jus pour trouver la molécule qui est à la base de ce phénomène. Il détecte du
succinate, un acide à 4C.
Il en ajoute à ses morceaux de muscles et la consommation d’O2 reprend, mais de façon beaucoup trop
importante pour que ce soit simplement dû à une oxydation du succinate.

A la place de 3/2 O2, il constate une consommation de 70 à 100 oxygènes. Il en déduit que le
succinate a un rôle catalytique.

Szent-Gyorgyi continue ses recherches et trouve qu’on peut avoir le même type de phénomène avec des sels
de :
l'acide fumarique : l’acide oxaloacétique (= oxaloacétate) : l’acide malique :

Szent-Gyorgyi montre qu’il existe un rapport entre la quantité d’oxygène consommée et la production de
CO2 : CO2/O2 = 1.
Ce rapport est caractéristique de l’oxydation des glucides :
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O

Hans Krebs recherche des autres molécules ayant un rôle catalytique dans cette réaction. Il découvre le citrate
(sel de l’acide citrique), qui possède 6C.

Pyruvate + oxaloacétate + muscle → citrate.

Krebs découvre des inhibiteurs, en particulier le malate (sel de l’acide malique).

En présence de malate, il n’y a plus consommation d’O2 mais accumulation d’acétoglutarate :


78

Il découvre aussi une série d’enzymes qui sont capables de transformer tous ces acides les uns en les autres.
De toutes ces informations, Krebs va déduire que le processus de transformation du pyruvate est cyclique et
que tous les acides nommés plus haut y interviennent. Le citrate fait la jonction entre la glycolyse et la
respiration.

Le cycle de Krebs :
Le cycle de Krebs se déroule dans la mitochondrie de la cellule.
glycolyse cycle de Krebs
Glucose → pyruvate → CO2 + H2O + ATP

Entrée du pyruvate dans le cycle :


Le pyruvate doit subir une oxydation avant de pouvoir entrer dans le cycle.
pyruvate + NAD+ +CoASH → CO2 + thioster + NADH +H+

- acétyl coenzyme A cofacteur. Il est formé d’un acide aminé, d’un nucléotide diphosphate et d’un
groupement thiol. Il y a une liaison riche (thioester).
- on écrit CoA-SH parce que le SH est réactif (on le met en évidence).
- rappel : lien ester = élimination d’eau entre un alcool et un acide :
ROH – R’COOH → RCOOR’ + H2O
- c’est une décarboxylation oxydative
pyruvate → acide acétique → acétyl Co A
décarboxylation-oxydation lien thiester avec thiol

- cette réaction est irréversible. Elle constitue une étape obligatoire pour faire rentrer les glucides (par la
voie du pyruvate) dans le cycle.
- ici, le pyruvate est encore oxydé, tandis que dans les fermentations, le pyruvate était réduit.
- enzyme : déshydrogénase pyruvique (enzyme très complexe et crucial pour la régulation du cycle).

Le cycle :
Il comporte 9 étapes :
Les C marqués d’une étoile sont marqués radioactivement, afin que l’on puisse les suivre à la trace au fil
des réactions.

1. oxaloacétate + acétyl Co A + H2O → citrate + CoASH + H+


79

o Condensation de l’actéyl CoA et de l’oxaloacétate


o On remarque que le CoA-SH est régénéré. Il y a eu utilisation de l’énergie du lien thioester pour
former une liaison covalente.
o Le citrate est une molécule symétrique.
o Enzyme : citrate synthase
o Cette réaction se décompose en deux étapes :
i. oxaloacétate + acétyl CoA → citryl CoA

ii. hydrolyse de la liaison thioester :


citryl CoA + H2O → citrate + CoASH + H+

2. citrate ↔ cis-aconitate ↔ isocitrate

o Formation en deux étapes de l’isocitrate.


o Une molécule d’eau a changé de place pour former une molécule asymétrique.
o L’équilibre aurait tendance à privilégier le citrate, mais l’utilisation de l’isocitrate pousse la réaction
vers la droite.
o Enzyme : aconitase pour les deux étapes.
o L’aconitase possède un atome de fer qui joue un rôle important dans la reconnaissance du
groupement carbonyl. L’aconitase manipule le citrate comme s’il était asymétrique, alors qu’il est
symétrique. Cela est dû à la présence de sites prochiraux dans le citrate.
o Le produit final est un seul des 4 isomères possibles de l’isocitrate.

3. isocitrate + NAD+ ↔ oxalsuccinate + NADH + H+

o Réaction d’oxydoréduction. L’isocitrate est oxydé en présence de NAD+.


o Enzyme : isocitrate déshydrogénase.

4. oxalsuccinate + H+ → CO2 + α-cétoglutanate


80

o Réaction de décarboxylation. On passe d’une molécule à 6C à une molécule à 5C.


o Enzyme : isocitrate déshydrogénase.
o Premier CO2 éliminé dans le cycle. Ce CO2 ne provient pas du pyruvate nouvellement entré dans le
cycle mais bien de l’oxaloacétate.

5. α-cétoglutanate + NAD+ + CoASH → CO2 + NADH + H+ + succinyl CoA

o Décarboxylation oxydative. Formation d’un lien riche (thioester).


o 2 cofacteurs : NAD+ et CoASH.
o Réaction irréversible.
o Enzyme : αcétoglutarate déshydrogénase.
o Le second CO2 éliminé ne provient pas non plus d’un pyruvate.

6. succinyl CoA + GDP + Pi ↔ GTP + CoASH + succinate

o On récupère l’énergie de la liaison thioester pour former une molécule équivalente à l’ATP, le GTP
(formation d’un lien anhydride).
o Enzyme : succinate thiokinase ou succinyl CoA synthétase selon qu’on regarde cette réaction dans
un sens ou dans l’autre, mais c’est bien sûr le même enzyme.
81

o On peut imaginer de décomposer cette réaction en deux étapes couplées :


i. clivage :
∆G°’ = -8 kcal/mol
ii. GDP + Pi ↔ GTP + H2O
∆G°’ = 7,3 kcal/mol

 ∆G°’ = -0,7 kcal/mol


o La conversion du GTP en ATP est possible :
GTP + ADP ↔ GDP + ATP

7. succinate + FAD ↔ fumarate + FADH2

o Le succinate subit une réaction d’oxydoréduction.


o Enzyme : succinate déshydrogénase.
o Le FAD (flavine adénine dinucléotide) est un accepteur de protons, un cofacteur oxydant. Il a une
structure similaire au NAD : nucléotide + pseudo-nucléotide (car ose linéaire au lieu de cyclique). Il
possède deux doubles liaisons, ce qui lui permet de fixer effectivement deux H. Le FAD peut être
considéré comme attaché à l’enzyme, et n’est donc pas libre comme le NAD.

8. fumarate + H2O ↔ L-malate

o On passe d’une molécule symétrique à une molécule asymétrique par addition d’eau.
o Enzyme : fumarase. L’activation de l’enzyme est stéréospécifique car elle ne forme et ne déshydrate
que le stéréoisomère L du malate.

9. L-malate + NAD+ ↔ NADH + H+ + oxaloacétate

o ∆G°’ > 0. Cette réaction ne se fait donc pas spontanément en milieu libre, mais comme
l’oxaloacétate est directement consommé, la réaction est poussée vers la droite.
o Enzyme : malate déshydrogénase.
82

Bilan du cycle :

Ceci est le bilan d’un tour du cycle de Krebs.


Pour chaque groupe acétyl entrant dans le cycle, 2C sont éliminés sous forme de CO2. Ces C ne sont pas ceux
introduits par le groupement acétyl (observé grâce au marquage). Quatre paires d’atomes d’hydrogène sont
fournies par les déshydrogénations enzymatiques (3 sont utilisées pour réduire le NAD+ et une pour réduire le
FAD).

Remarques :
- Il faut plusieurs tours de cycle pour que tous les C de l’acétyl CoA soient sous forme de CO2.
- La raison de ce mécanisme compliqué est qu’il permet de récupérer de l’énergie (ATP, GTP) mais
aussi qu’il permet des réactions chimiques complexes (oxydation du pyruvate, du méthyl) dans des
conditions ménagées.
- On n’a pas encore vu le rôle de l’O2 dans la respiration qui doit pourtant être aérobie. Les atomes
d’oxygène du CO2 produit ne sont pas ceux de l’O2 inspiré.
- Les cofacteurs doivent encore être régénérés. Il y a production d’un NADH dés l’entrée du cycle et de
trois autres ensuite, plus un FADH2 .
- La récupération d’énergie paraît faible jusqu’ici : seulement 1 GTP et 2 ATP de la glycolyse
récupérés, alors qu’on sait que 38 ATP sont produits.

En fait, la réponse à tous ces problèmes (utilisation de l’O2, régénération des cofacteurs, formation d’ATP) se
situe dans des mécanismes annexes au cycle.
83

Mécanismes annexes au cycle de Krebs :


Nous n’allons en voir qu’un seul :

Chaîne respiratoire, chaîne de transport d’électrons :


Ces mécanismes nous permettront de comprendre la régénération (réoxydation) des cofacteurs et la
récupération de l’énergie.
Il existe un couplage très étroit entre le cycle de Krebs et la chaîne de Warburg.

Engelhardt :
Comment expliquer la production d’ATP par l’oxydation aérobie du glucose ?
Il étudie la respiration sur des globules rouges, et observe la production d’ATP in vivo, mais seulement en
présence d’O2. Il établit donc un parallélisme entre la ventilation et la production d’ATP. Par contre, in vitro,
si les globules rouges sont lysé, il n’observe pas de production d’ATP, même en présence d’O2. De plus, si on
ajoute de l’ATP, celui-ci est consommé. En fait, en lysant les globules rouges, il a libéré des ATPases qui
clivent l’ATP.

Kalckar :
Quand on lyse, on a dans l’extrait une ATPase. Kalckar va détruire l’activité biologique de cet enzyme. Pour
cela, il va utiliser un enzyme qui réagit plus vite que l’ATPase.

On prend l’hexokinase dont le Km (= 10-6M) est plus petit que le Km de l’ATPase (= 10-2M). Si son Km est
plus petit, il aura consommé tout l’ATP avant que l’ATPase n’aie le temps de interagir.
Km = concentration à la demi vitesse maximum.
L’hexokinase est facilement dosable. Sa présence empêche le masquage de la production d’ATP, car elle
catalyse la réaction suivante :
glucose + ATP ↔ glucose 6 P + ADP

Kalckar montre ainsi qu’il y a une grande production d’ATP, même in vitro. En mesurant la concentration de
glucose 6 P, il a établi un rapport
P(fixé sur glu)/O(absorbé) = 2,5
Or on connaît l’oxydation du pyruvate :
pyruvate + 5/2O2 → 2 H2O + 3CO2

∆G°’ = -280 kcal/mol


Kalckar observe la production de 12,5 ATP (= 2,5 P par O × 5/2 O2) par pyruvate, donc 25 par glucose.
Thermodynamiquement, plus de 12,5 ATP pourraient être produits : 12,5 × 7,3 = 91 kcal/mol.
Pourtant, si on n’observe que le cycle de Krebs, on voit la formation que d’un GTP. D’où viennent les autres ?

Keelin :
Keelin était un parasitologue. Etudiant les moustiques, il les colle avec de la glu sur une lame de microscope.
Il constate alors que les pattes changent de couleur quand le moustique se débat. Il fait des observations au
microspectroscope (ancêtre du spectrophotomètre, composé d’un microscope et d’un prisme) et remarque des
bandes dans le spectre d’absorption.
Au repos :
Le muscle est oxygéné (présence d’O2)  la molécule
colorée est sous la forme oxydée
84

Agitation :
Le muscle n’est pas fort oxygéné  forme réduite de la
molécule  3 raies nettes dans le vert.

Keelin met ainsi en évidence des protéines (les cytochromes « c ») présentes dans les mitochondries des
cellules du muscle. Ces cytochromes ont un petit poids moléculaire et comportent un groupement hème
apparenté à l’hème de l’hémoglobine.
La découverte des cytochromes a permis la compréhension des phénomènes d’oxydoréduction de la
récupération d’énergie.
Ce sont des éléments capitaux de la récupération d’énergie.

Les cytochromes sont oxydés lors de la respiration cellulaire. Ils sont placés dans la membrane interne de la
mitochondrie (la majorité des enzymes du cycle de Krebs sont situés dans la matrice).
On peut facilement isoler les cytochromes c dans les muscles de pigeon.

Spectre d’absorption du cytochrome :


oxydé :
réduit : ------

Oxydé : pic à 400 nm et bandes à 600 nm.


Réduit : pics à 400, 500 et 600 nm.
Rem : la troisième bande présente in vivo est due à un autre cytochrome.

Dans l’hème, on a un changement de l’état d’oxydation du fer. On passe de Fe2+ à Fe3+. Le cytochrome va
donc permettre de faire des réactions rédox grâce aux hèmes.

La structure et les fonctions du cytochrome sont très différentes de celles de la myoglobine malgré la présence
d’un groupement hème. En effet, dans la myoglobine, l’atome de Fe ne change pas d’étage d’oxydation.

Il existe plusieurs sortes de cytochromes , c, c1, a, b, a3, qui diffèrent par leur groupement hème.

L’ensemble forme les différents éléments de la chaîne respiratoire, ou chaîne de transfert d’électrons. La
chaîne respiratoire est donc un édifice complexe de protéines, mais aussi un ensemble de processus qui
contiennent des cytochromes de tous types. La chaîne permet la réoxydation de NADH et FADH2 (produits
dans le cycle de Krebs et la glycolyse), et régénèrent donc NAD+ et FAD, qui sont nécessaires à l’oxydation
aérobie du glucose.

A l’autre extrémité de la chaîne, on a la réduction de l’oxygène moléculaire :


½O2 → H2O
On voit enfin où se situe le rôle de l’O2. Il intervient dans l’oxydation du NADH en NAD+ et donc dans la
chaîne de transport d’électrons (chaîne respiratoire).
85

Nous avons affaire à un processus indirect, réversible.

Toutes ces réactions ont lieu dans la mitochondrie, où sont situés les cytochromes.
La mitochondrie est un organite cellulaire de environ 1µm de large. Il en existe ~2000 dans chaque cellule, et
plus dans les cellules musculaires.
Elle possède une membrane externe et une membrane interne formant des crêtes, le tout entourant une
matrice. Les deux membranes ont des rôles différents. Les réactions de la chaîne respiratoire ont lieu au
niveau de la membrane interne tandis que les enzymes du cycle de Krebs se trouvent dans la matrice et ceux
de la glycolyse dans le cytosol.

Membrane externe :
La membrane externe est constituée de lipides
lipides et de protéines. Elle a une perméabilité sélective due à ses
pores : elle est perméable aux ions et aux molécules de petit poids moléculaire (PM < 10000). La composition
du cytosol et de l’espace inter-membranaire
membranaire est ainsi quasi identique.
id

Membrane interne :
La membrane interne a une grande teneur en protéines (80%), et contient peu de lipides (20%). Elle est
imperméable aux ions et aux petites molécules, sauf quand elles sont transportées de manière active. La
chaîne respiratoire fait partie intégrante de cette membrane.

Matrice :
La matrice contient, outre les enzymes du cycle de Krebs, l’ADN de la mitochondrie ainsi que les ribosomes,
des acides aminés et tous les enzymes nécessaires à la synthèse des protéines.
86

La chaîne respiratoire :
Pour se représenter les chaînes respiratoires, on imagine des ensembles complexes. La structure fine de ces
complexes est encore mal connue et on la représentera par une boîte noire.

Complexe I : NADH-ubiquinone réductase.


Réoxydation du NADH par un transfert de protons sur le coenzyme Q. Dans ce complexe, on a un cofacteur :
FMN (flavine mononucléotide diphosphate, autre forme du FAD).
Il est aussi important de remarquer la présence du FeS.
Au sein du complexe, on a donc :

Enzyme : NADH réductase.

Le complexe FMN-FeS est ancré dans le membrane tandis que Q et QH2 sont libres. Le Q peut donc passer
d’un complexe à l’autre.
Q est un coenzyme, il est nécessaire au bon fonctionnement du complexe I et sera régénéré par le complexe
III.
Ubiquinol : QH2
Ubiquinone : Q-

Complexe III : Ubiquinol-cytochrome c réductase.


L’atome de Fe change d’étage d’oxydation : il passe de +2 à +3.

Au sein du complexe, on a :

On réduit le cytochrome c1. Cela se fait par un transport d’électrons et non plus de protons comme dans les
complexes I et II. En effet, le Fe change d’état d’oxydation. C’est ce phénomène qui donne son nom à la
chaîne de transport d’électrons. Il faut remarquer ici que 2 protons sont libérés.

Complexe IV : Cytochrome oxydase.


Réoxydation du cytochrome et réduction de l’O2 en H2O.
Au sein du complexe, on a :

Complexe II : Succinate-ubiquinone réductase.


Oxydation du FAD en FADH2 par l’intermédiaire de Q qui sert donc de charnière. Le cofacteur FAD fait lui-
même partie du complexe, mais il est représenté séparément pour simplifier.
En fait, on a :
87

La succinate déshydrogénase (enzyme du cycle de Krebs, étape n°7) intervient ici.

Remarques :
- La chaîne respiratoire constitue une grande partie des protéines qui se trouvent dans la membrane
mitochondriale interne.
- Le complexe IV est le seul possédant des molécules capables de réagir avec l’oxygène moléculaire.
- Il est important que le processus ne génère pas d’ion superoxyde :
O2 + e- ↔ O2- qui est très réducteur. C’est là l’avantage d’un passage direct de O2 à H2O.
Bilan au niveau des chaînes respiratoires :
NADH + H+ ↔ NAD+ + H2O (complexes I, III et IV)
FADH2 + ½ O2 ↔ FAD + H2O (complexes II, III et IV)

Pourquoi parle-t-on de transfert d’électron ?

FADH2 ↔ FAD + 2H+ + 2e- (cfr ce qui se passe aux complexes II et III)

Comme on transfère 2H+, on doit aussi transférer 2e-.

On peut calculer l’énergie que représente un tel phénomène :


∆G°’ = -nF∆E◦’ où n est le nombre d’électrons transférés.

On a deux couples d’oxydoréduction :


88

NAD+ + H+ + 2e- ↔ NADH ∆E◦’ = -0,32V


½ O2 + 2H+ + 2e- ↔ H2O ∆E◦’ = +0,82V

 ∆E◦’ = 0,82V –(-0,32V) = 1,14V


 ∆G°’ = -23,062 × 1,14 × 2 = -52,6 kcal/mol

Pour chaque production d’une mole de NAD+ (par réoxydation de NADH), on a libération de 52,6 kcal.
Dans le cas du FAD, (réoxydation du FADH2), ∆G°’ = -43,4 kcal/mol.

Nous avons donc affaire à un processus qui libère beaucoup d’énergie, ce qui permet bien sûr une
récupération d’énergie.

NADH/NAD+
0,42V 18 kcal/mol  1 ATP
cyt b
0,18V 8,3 kcal/mol  1 ATP
cyt c
0,54V 24,9 kcal/mol  1 ATP
O2

Dans chacun des complexes, on a libération d’énergie  production d’ATP  formation de 3 ATP par
NADH + H+ réoxydé. Dans le cas du FADH2, on a seulement 2 ATP, qui sont produits au niveau des
complexes III et IV, mais pas du complexe II (∆G°’ est trop faible).

Le bilan est donc :


Réoxydation de 4 NADH + H+ et de 1 FADH2  ∆G°’ = -251 kcal/mol.
On peut comparer cela avec l’oxydation complète du pyruvate (∆G°’ = -280 kcal/mol)
Il y a donc récupération d’environ 90% de l’énergie au niveau des chaînes respiratoires. En fait, c’est un
gradient de protons qui permet de récupérer de l’ATP.

Comment les ATP sont-ils produits ?

Hypothèse chimiosmotique de Mitchell :


Il explique la production d’ATP à partir de réactions d’oxydoréduction et de la structure des mitochondries.
89

Il y a un pompage des protons par les complexes et ils sont envoyés dans l’espace inter-membranaire grâce à
l’énergie libérée par l’oxydation. Il y a accumulation des protons à cet endroit puisque la membrane interne
est perméable aux petites molécules et aux ions : [H+] augmente.
Au niveau du complexe II, deux protons sont expulsés. En fait, tous les complexes en expulsent.

L’énergie nécessaire à la synthèse d’ATP est produite par l’apparition d’un gradient de protons entre l’espace
inter-membranaire et la matrice. Ce gradient permet la synthèse d’ATP grâce à un système appelé ATP
synthétase. Les protons repassent dans la matrice et il y a rééquilibrage des charges.

L’oxydation du NADH expulse 11H+, tandis que celle du FADH2 expulse 8H+. Pour synthétiser une molécule
d’ATP, il faut fournir entre 3 et 4 protons. En entrant dans la matrice, ces protons permettront de former
respectivement 3 et 2 ATP.

L’ATP synthétase est constituée de deux éléments : F0 et F1.


F0 : 3 sous-unités. C’est une pompe à protons, qui transporte activement les H+ dans la matrice.
F1 : 5 sous-unités. Synthétise l’ATP (ADP + Pi ↔ ATP + H2O).

L’accumulation des protons (apparition d’un gradient) correspond donc à une accumulation d’énergie. Il y a
apparition d’une « force proton-motrice ».

Processus de transfert :
nH+int → nH+ext.

∆G = RT ln([H+]nint/[H+]next) = 2,03 nRT (pHext – pHint)

Il apparaît à la membrane un potentiel puisqu’on a un appauvrissement de H+ à l’intérieur (apparition d’une


charge -) et un enrichissement à l’extérieur. C’est un potentiel de membrane :

∆G = -nF∆Φ où ∆Φ = Φext - Φint


∆GT = -nF∆Φ – 2,03 nRT ∆pH

∆p = ∆Φ – (2,03 RT/F)∆pH ∆p : variation d’énergie pas mole de protons


= ∆Φ – 0,050∆pH
= 0,14 – 0,059(-1,4) = 224V (valeurs à 25°C)

 ∆G°’ = -5,2 kcal/mol. C’est l’énergie qu’il faut fournir pour amener les protons dans l’espace inter-
membranaire. Donc, l’énergie récupérable lorsqu’ils passent dans l’autre sens.
Or, il faut 7,3 kcal/mol pour produire 1 ATP. Donc, pour produire 3 ATP, il faut au moins 4 électrons.

Arguments en faveur de l’hypothèse de Mitchell :


1) On isole les mitochondries et on les traite au détergent. Il y a perturbation des bicouches lipidiques de la
membrane interne et elle est partiellement dissoute.
Les H+ accumulés dans l’espace inter-membranaire peuvent donc traverser la membrane sans passer par
l’ATP synthétase et on observe effectivement que l’ATP n’est plus produit.
90

b) Utilisation d’un découplant comme le dinitrophénol.

Le dinitrophénol est une molécule lipophile (peut donc se dissoudre dans la membrane) qui peut être chargée
(capable de fixer des protons).
En présence du découplant, la synthèse d’ATP cesse car le dinitrophénol peut transporter des H+ et passer à
travers la membrane interne de la mitochondrie.
Remarque : Il existe des découplants naturels qui ont le même rôle. Exemple : un animal qui hiberne n’a pas
besoin de beaucoup d’énergie mais doit tout de même maintenir sa température. Une protéine est présente
dans les mitochondries pendant l’hibernation qui dissipe le gradient de protons en chaleur. Cette protéine
disparaît une fois l’hiver passé.

c) Raker montre les rôles respectifs de F0 (transport des H+) et F1 (synthèse d’ATP).
Il utilise pour cela les utlrasons : en agitant violemment la membrane par ultrasons, on parvient à cliver des
parties de cette membrane. Ces petits morceaux de membrane se ressoudent pour former de petites vésicules.
Ces vésicules, isolées, sont traitées par de l’urée (agent dénaturant doux, qui respecte l’activité locale), ce qui
a pour effet de séparer les entités F0et F1.

Les F0 ont encore un rôle de transporteur d’H+ tandis que les F1 qui sont isolés peuvent jouer le rôle
d’ATPases. En effet, puisqu’il n’y a plus d’énergie pour faire aller la réaction dans le sens de la production
d’ATP, il y a dégradation de l’ATP jusqu’à atteinte de l’équilibre entre ATP et ADP.

On peut reconstituer l’entité complète F0/F1 et montrer qu’elle a à nouveau un rôle d’ATP synthétase.
91

Remarques :
La mitochondrie sert de lieu de synthèse de l’ATP (ATP qui servira dans le cytosol) à partir de l’ADP
provenant du cytosol. Il faut donc faire circuler l’ADP dans un sens et l’ATP dans l’autre.
L’ATP et l’ADP sont transférés au travers de la membrane interne par des translocases. Ce sont des protéines
spécialisées qui ont aussi un rôle régulateur. Il s’agit d’un transport actif car il nécessite l’intervention d’une
protéine.

La translocase se trouve dans la membrane interne. Elle peut fixer l’ADP ou l’ATP et subit alors une
permutation qui amène l’ATP à l’extérieur ou l’ADP à l’intérieur. Elle a une affinité différente pour l’ADP ou
l’ATP selon sa position. Cela est dû à la polarité de la membrane et à la charge différente de l’ATP et l’ADP.
Ainsi, on évite qu’une molécule ne traverse la membrane dans le mauvais sens. L’échange est équitable : il y a
autant d’ADP qui rentrent que d’ATP qui sortent.

Bilan total de la synthèse d’ATP au cours de l’oxydation aérobie du glucose :

glucose

glycolyse G + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 pyruvate + 2 ATP + 2(NADH + H+) + 2H2O
↓ 2 (NADH + H+) + 2 (1/2 O2) + 6Pi + 6 ADP → 2 NAD+ + 6 ATP + 2H2O
pyruvate

acétyl CoA

pyruvate + 5(1/2 O2) + 15 Pi + 15 ADP → 3CO2 + 15 ATP + 17 H2O


cycle de Krebs
+ chaînes resp. en effet : 4 NADH → 12 ATP
1 FADH2 → 2 ATP
1 GTP → 1 ATP
×2 car il y a 2 pyruvate par glucose  30 ATP !
CO2 + H2O

Le bilan global est donc de 38 ATP !

Bilan global (glycolyse – cycle de Krebs – chaînes respiratoires)

C6H12O6 + 6O2 + 38 ADP + 38 Pi → 6CO2 + 38 ATP + 44 H2O

La combustion du glucose :
Glucose + 6O2 → 6CO2 + 6H2O
produit 686 kcal/mol.
L’oxydation aérobie du glucose permet de récupérer 38 ATP, soit 272 kcal/mol. Le rendement est donc de
40%.
La récupération d’énergie est partielle, le reste de l’énergie est dissipée en chaleur.

Pourtant, si on ne considère que l’oxydation du pyruvate, ∆G = -280 kcal/mol et 30 ATP sont récupérés, soit
251 kcal/mol. Le rendement est de ~90%, ce qui est exceptionnel !
92

On voit donc que la partie glycolyse du processus est peu efficace, l’essentiel des ATP étant récupérés à partir
du cycle de Krebs. Le processus efficace (cycle de Krebs) se serait ajouté par après au processus de glycolyse
primitif au cours de l’évolution.
Cependant, le processus de fermentation est toujours présent dans les cellules pratiquant la respiration. En
effet, dans certaines conditions (effort musculaire très violent), la cellule peut se retrouver en anaérobie, et
c’est alors que la fermentation lactique intervient.

Tous ces processus (glycolyse, cycle de Krebs, oxydation aérobie) sont parfaitement régulés. Ils font appel à
des rétrocontrôles dont l’action est réversible.

Régulation des processus de glycolyse et de désoxydation aérobique :

Glucose

phosphofructukinase (1) Fructose 1-6 diP

déshydrogénase pyruvique (2) Pyruvate

Acétyl CoA
Citrate synthétase (3) ↓
Citrate

Cycle de Krebs

Succinyl CoA

NADH
FADH2

Chaîne respiratoire

ATP

Ce système subit un rétrocontrôle et l’ATP sert d’élément régulateur au niveau de plusieurs enzymes.
(1) est inhibé par un excèse d’ATP : son activité ralentit, et donc l’ensemble du processus ralentit.
(2) est aussi inhibé par un excès d’ATP. Son activité diminue aussi en présence d’un excès d’acétyl CoA. Le
+
(2) est en fait un complexe enzymatique qui est sensible à la concentration en ATP et au rapport NADH/NAD
(reflet de la saturation des chaînes respiratoires) par la phosphorylation d’une sérine.
(3)est contrôlé par la concentration de succinyl CoA (problème au niveau du cycle de Krebs) et de NADH
(problème au niveau de la chaîne respiratoire).

Les navettes :
93

La glycolyse est localisée dans le cytosol et le cycle de Krebs dans la mitochondrie. Cependant, le NADH ne
va jamais passer la membrane interne de la mitochondrie. Il existe un système de navettes qui permettent de
faire passer le pouvoir réducteur du NADH du cytosol à la matrice.
Il en existe plus exactement de 2 types, suivant le type de cellule.

- Navette du glycérophosphate :
Cette navette se rencontre dans les cellules de muscle, de cerveau…
Dans le cytosol, on a :
dihydroxyacétone-3-P + NADH + H+ ↔ NAD+ + glycérophosphate-3-P

Enzyme : glycérophosphate déshydrogénase.


Remarque : c’est la même réaction qui permet de lancer la glycolyse en anaérobie en absence de NAD+ et
jusqu’à obtention d’une concentration suffisante de celui-ci.
En aérobie, on a le transfert du glycérophosphate (du cytosol vers la matrice) et oxydation à l’intérieur de la
matrice.
Dans la matrice :
glycérophosphate + FAD ↔ FADH2 + dihydroxyacétone
( voir schéma précédent )

Enzyme : glycérophosphate déshydrogénase. Ce n’est pas le même enzyme que plus haut : celui-ci utilise le
FAD comme cofacteur.

Ensuite, il y a retour du dihydroxyacétone dans le cytosol et réoxydation du FADH2 par les chaînes
respiratoires dans la matrice.
Rappel : FADH2 → 2ATP alors que NADH → 3ATP.
Dans les tissus utilisant ce type de navette, on rencontre donc un bilan déficient de 2 ATP (ici, le bilan total
est de 36 ATP).

- Navette malate-aspartate :
Présente dans les cellule de foie.
94

L’oxaloacétate ne peut pas passer à travers la membrane, ce qui complique le mécanisme. On a une
transamination.

Oxydo-réduction :
oxaloacétate + NADH + H+ ↔ NAD+ + malate

Transamination : (passage amine → cétone et en même temps cétone → amine)


glutamate + oxaloacétate ↔ α-cétoglutarate + aspartate

On a une transamination dans le cytosol et dans la mitochondrie.

Dans le bilan total de la glycolyse, il faut tenir compte de cette navette mais pas au point de vue de l’ATP car
ici, on n’utilise plus du FAD mais bien du NAD. Le bilan est donc bien de 38 ATP…

Transformation des lipides :

Le cycle de Krebs ne fonctionne pas qu’à base d’oses. C’est un processus général qui peut transformer
d’autres molécules, par exemple les lipides.
En effet, notre réserve énergétique est essentiellement constituée de graisses. Les lipides peuvent fournir les
ATP dont la cellule a besoin (lipide ~9 kcal/g ; ose ~4kcal/g).
Un adulte possède ~130000 kcal sous forme de graisses et 600 kcal sous forme d’oses.

Les lipides de réserve sont des triglycérides (glycérol + acides gras) :


95

- 1ère étape : clivage du lipide en glycérol et acides gras.


Se produit au niveau de l’intestin qui produit des lipases (clivent des liaisons ester).
Il existe 3 types de lipases : celles qui clivent au niveau du C1, celles qui clivent au niveau du C2, et celles qui
clivent au niveau du C3.
Les acides gras sont véhiculés vers le foie, où ils sont oxydés en CO2. Le glycérol s’intègre au processus de
glycolyse.

- 2ème étape : oxydation de l’acide gras.L’oxydation se fait par étapes : élimination de 2C à la fois.

Expérience de Kraft :
Il donne à manger à des lapins des dérivés d’acides gras contenant des groupements facilement
reconnaissables et observe les résidus dans les excréments.

Si n est pair, on retrouve dans l’urine du phenylacétate :

Si n est impair, on retrouve du benzoate :

Ceci ne s’explique que par le fait que les acides gras sont clivés par 2C.

Exemples : ???
n=3
n=4

Soit un acide gras contenant nC et un groupement acide.

1) formation d’un Acétyl CoA : molécule activée.


Pour faire cette réaction, on a bien assez d’énergie provenant de
ATP → AMP + PP
Or, H2O + PP → 2Pi (enzyme : pyrophosphatase)
On obtient de l’AMP et pas de l’ADP. Pourquoi ?
Décomposons la réaction :
a)
b)
2) Formation d’une double liaison.
3) On ajoute de l’eau, suppression de la double liaison.
4) Réaction d’oxydation avec comme cofacteur NADH.