Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
1. PRINCIPIUL METODEI
5. SURSE DE EROARE
Teoretic, orice etapă din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare,
dar studiile au demonstrat că numai o parte din proceduri pot fi considerate
ca surse semnificative de eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea
soluţiei de testat şi a substratului cromogen şi absorbanta inerentă a plăcilor
de microtitrare. Acestea sunt totuşi probleme de fineţe pe care le pot
intampina pana şi cei cu experienţa în tehnica ELISA.
Urmează o trecere în revistă a condiţiilor de indeplinit şi posibilelor surse de
eroare:
• Toţi reactivii şi plăcile de microtitrare se aduc la temperatura camerei
inainte de utilizare;
• Deşi tehnica ELISA nu impune condiţii de sterilitate, sticlăria şi
consumabilele (vârfuri, cuve, etc.) trebuiesc să fie cât mai curate şi fară urme
de detergenţi;
• Concentraţia reactivului ce urmează a fi adsorbit pe suportul solid trebuie
determinată pentru fiecare cuplu suport-proteina şi pH-ul soluţiei trebuie să
fie unul adecvat.
• Blocarea situsurilor de legare nespecifică este o etapă foarte importantă în
protocol. Tamponul de blocare asigură atât saturarea suprafeţei godeului,
prevenind astfel fixarea anticorpilor de detecţie sau a conjugatului de faza
solida, cât şi inhibarea legării anticorpilor specifici la antigenul/anticorpul de
captura.
• Aranjamentul probelor în placă poate influenţa rezultatul determinării.
Pentru un protocol de mare precizie este bine să lăsam marginile
placii(randurile A şi H) libere pentru a măsura absorbanta plăcii iar probele de
control, pozitiv şi negativ, pot fi distribuite aleatoriu în zone diferite ale plăcii
(Caciagli şi Verderio, 2003).
• Diluţia probei pozitive cercetate trebuie să corespundă unei valori a
absorbantei semnificativ pozitive.
• Enzima utilizată în conjugat trebuie să aibe o specificitate ridicată şi un
randament ridicat în transformarea substratului. Este de asemenea important
ca problele de testat să nu conţină substanţe care ar putea intefera cu
stabilitatea sau activitatea enzimei.
• Concentraţia conjugatului enzimatic trebuie să corespundă celei mai mici
valori care asigură vizualizarea complexului format.
• Pentru rezultate mai bune, probele se lucrează în duplicat sau chiar
triplicat. Media valorilor absorbantei este folosită pentru determinarea
concentraţiei probei.
• Manevrarea bruscă a plăcii sau adăugarea prea rapidă a probelor,
tamponului de spălare în placă poate duce la desprinderea moleculei de
captură de pe suportul solid.
• Dacă folosiţi spălătorul automat, asiguraţi-vă că aparatul este potrivit
pentru tipul de placă folosit şi acordaţi atenţie adâncimii la care coboară acul
de spălare în placă. Setarea neadecvată a aparatului poate duce la aspirarea
anticorpilor de captura, zgarierea fundului plăcii sau chiar la stricarea
aparatului. Este de preferat să folosiţi spălătorul automat doar în cazul
folosirii unor kituri ELISA cumpărate al căror protocol prevede folosirea unui
astfel de aparat. Plăcile pregătire în laborator pot fi mai sensibile la mecanica
spălătorului automat şi astfel rezultatul protocolului are de suferit.
• In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spălare necesită o atenţie
deosita. Plăcile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specificaţi în
protocol şi supertanatul trebuie inlaturat cu grija pentru a nu desprinde
butonul celular. Adăugarea tamponului de spălare se va face intr-un mod
blând. La finalul unei etape de spălare, placa va fi agitată pentru
desprinderea butonulu celular şi celulele vor fi resuspendate în reactivul
aferent etapei următoare. Tamponul de spălare trebuie să fie ţinut pe gheata.
• Concentraţia soluţiei de captură va fi invers proporţională faţa de
concentraţia teoretica a soluţiei de testat pentru a prevenii legarea
conjugatului sau anticorpilor secundari la molecula de captura.
BIBLIOGRAFIE
1. Bianchi A.T.J., Moonen-Leusen H.W.M, van der Heijden P.J., Bokhout B.A.,
The use of a double antibody sandwich ELISA and monoclonal antibodies for
the assessment of porcine IgM, IgG and IgA concentrations, Veterinary
Immunology and Immunopathology, 44, 309-317, 1995
2. Caciagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds
in ELISA testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological
Methods, Volume 110, Issue 2, Pages 143-152, 30 June 2003
3. Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M., ELISA Techniques, Methods in
enzymology, voi 118,742-766, 1986
4. Eva Engval, Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in
enzymology, voi 70, p. 419-439, 1980
5. Heck F. C, Williams J. D., Pruett J. Interpretation of Spectrophotometric
Absorbance Values to Define Results of Enzyme-Linked Immunosorbent
Assays, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1980, p. 398-401
6. John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit
11.2 in Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34,1996
7. Kricka L.J., Selected strategies for improving sensitivity and reliability of
immunoassays, Clinical Chemistry, 40, 3, 347-357, 1994
8. Kuby J., Goldsby R., Kindt T., Osborne B., Immunology , 5th edition, 2003
9. Le Goff C, Thiaucourt F., A competitive ELISA for the specific diagnosis of
contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), Veterinary Microbiology, Volume
60, Issues 2-4, Pages 179-191,28 February1998
10. Lequin Rudolf M. , Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005
11. Michael Steinitz, Lea Baraz, A rapid method for estimating the binding of
ligands to ELISA microwells, Journal of Immunological Methods, 238, 143-150,
2000
12. Mire-Sluis A.R., Gaines-Das R., Thorpe R. Journal of Immunological
Methods, Volume 186, Issue 2, Pages 157-160, 26 October 1995
13. Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica în clinica şi experiment,
subcapitolul: Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viaţa Medicala
Romaneasca, Bucureşti, 2001 '
14. Osuchowski M. F., Remick D. G., The repetitive use of samples to measure
multiple cytokines:The sequential ELISA, Methods 38, 304-311, 2006
15. Plebani A., Avanzinia M. A., Massaa M. and Ugazioa A.G., An avidin-biotin
ELISA for the measurement of serum and secretory IgD, Journal of
Immunological Methods, Volume 71, Issue 2, Pages 133-140, 6 July 1984
16. Qian W., Yao D., et al., Immobilization of Antibodies on Ultraflat
Polystyrene Surfaces, Clinical Chemistry 46: 1456-1463, 2000
17. Satoh A., Kojima K., Koyama T., Ogawa H., Matsumoto I., Immobilization
of Saccharides and Peptides on 96-Well Microtiter Plates Coated with Methyl
Vinyl Ether-Maleic Anhydride Copolymer, Analytical Biochemistry, Volume
260, Issue 1, Pages 96-102, 15 June 1998
18. Sittampalam S., Smith W.C., et al., Application of experimental design
techniques to optimize a competitive ELISA, Journal of Immunological
Methods, 190, 151-161, 1996
19. Voller A., Bartlett A. and Bidwell D.E., Enzyme immunoassays with special
reference to ELISA techniques, Journal of Clinical Pathology,31, 507-520,
1978
20. Wilco de Jager, Ger T. Rijkers, Solid-phase and bead-based cytokine
immunoassay: A comparison, Methods, Volume 38, Issue 4, Pages 294-303,
April 2006
21. Yuzuru Hayashi et al. , An expression of within-plate uncertainty in
sandwich ELISA, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 36, 225-
229, 2004